BR112015023054B1 - Vacinação de animais de companhia para induzir uma resposta imunológica protetora contra infestações por carrapatos e a transmissão de agentes patogênicos por carrapatos - Google Patents

Abstract

VACINAÇÃO DE ANIMAIS DE COMPANHIA PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNOLÓGICA PROTETORA CONTRA INFESTAÇÕES POR CARRAPATOS E A TRANSMISSÃO DE AGENTES PATOGÊNICOS POR CARRAPATOS Composições tanto da proteína aquaporina do carrapato bovino, Rhipicephalus microplus, quanto uma construção de ácido nucléico incorporando uma sequência de ácido nucléico codificando esta proteína aquaporina são eficazes para induzir uma resposta imunológica protetora contra outras espécies de carrapatos em animais não-bovinos. A proteína aquaporina R. microplus é antigênica e pode ser ministrada como uma vacina proteica, ou, como alternativa, a construção de ácido nucléico pode ser utilizada como uma vacina de DNA. A indução da resposta imunológica reduz ou elimina consideravelmente a infestação de animais não- bovinos tratados por outros carrapatos além do carrapato bovino, particularmente o carrapato vermelho do cão, Rhipicephalus sanguineus. Além disso, uma vez que os carrapatos são vetores de uma variedade de agentes patogênicos, a redução na incidência da infestação por carrapatos conferida pelas vacinas pode simultaneamente reduz a incidência de doenças causadas por esses agentes patogênicos em animais suscetíveis.

Description

Antecedentes da Invenção Campo da Invenção

[001] A invenção refere-se a métodos para controlar e prevenir infestações por carrapatos em animais não-bovinos tratados, incluindo cães domésticos, que adicionalmente protegem os animais contra a transmissão de agentes patogênicos por carrapatos. As composições da vacina são preparadas a partir da proteína aquaporina do carrapato de bovinos, Rhipicephalus microplus, ou a partir de uma construção de ácido nucléico compreendendo uma sequência de ácido nucléico codificando esta proteína aquaporina. Descrição do Estado da Técnica

[002] Os carrapatos representam um risco considerável à saúde e bem-estar dos animais de sangue quente como vetores para um grande número de agentes patogênicos, inclusive parasitas protozoários, vírus e bactérias. Por exemplo, o carrapato vermelho do cão, Rhipicephalus sanguineus, é o principal reservatório e vetor da erliquiose canina, uma doença fatal provocada pelo agente patogênico bacteriano intracelular transmitido pelo sangue, Ehrlichia canis, e a babesiose canina, causada pelos parasitas protozoários intraeritrocitários Babesia canis e Babesia gibsoni. A erliquiose canina ocorre no mundo inteiro e é endêmica nos Estados Unidos, infectando cães de todas as raças e idades. Os gatos e humanos também podem ser infectados por E. canis. O carrapato vermelho do cão também pode transmitir febre maculosa das Montanhas Rochosas a seres humanos. Os carrapatos também são portadores de diversos outros agentes de doenças contagiosas transmitidas pelo carrapato, como o vírus da encefalite transmitida por carrapatos, o vírus da febre hemorrágica da Criméia e do Congo, o vírus das ovelhas de Nairobi, Borrelia burgdorferi (o agente da doença de Lyme), Theileria parva (o agente da febre da Costa Oriental), e parasitas do gênero Babesia (incluindo os agentes da babesiose ou febre do gado em bovinos), bem como outros efeitos prejudiciais que possuem impactos consideráveis na medicina humana e veterinária.

[003] Atualmente, os esforços para controlar essas pragas se baseiam principalmente no uso de pesticidas. No entanto, um aumento na resistência dos carrapatos aos acaricidas e inseticidas aprovados ameaça os esforços para controlar essas pragas nos Estados Unidos e em outros lugares.

[004] Como consequência da difusão de linhagens resistentes a pesticidas desses e outros carrapatos e moscas, existe uma necessidade cada vez maior de se desenvolverem ferramentas aprimoradas para o controle dos mesmos. Foram feitas tentativas em utilizar meios imunológicos de controle através da tecnologia de vacina. Foi alcançado certo êxito na identificação de determinados antígenos protetores de parasitas artrópodes como sendo possíveis candidatos à vacina, mas somente alguns poucos vieram a uso comercial, mais notadamente a vacina BM86 para o carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Apesar desses avanços, persiste, contudo, a necessidade de vacinas para parasitas artrópodes e, em particular, vacinas que possam ser usadas contra carrapatos, inclusive o carrapato vermelho do cão.

Sumário da Invenção

[005] Descobrimos que composições tanto da proteína aquaporina do carrapato bovino, Rhipicephalus microplus, quanto uma construção de ácido nucléico incorporando uma sequência de ácido nucléico codificando esta proteína aquaporina são eficazes para induzir uma resposta imunológica protetora contra outras espécies de carrapatos em animais não-bovinos. A proteína aquaporina R. microplus é antigênica e pode ser ministrada como uma vacina proteica, ou, como alternativa, a construção de ácido nucléico pode ser utilizada como uma vacina de DNA. Nesta última modalidade, as construções de ácido nucléico são ministradas a um paciente animal de modo que a proteína aquaporina seja expressada in vivo dentro das células do animal vacinado. A indução da resposta imunológica reduz ou elimina consideravelmente a infestação de animais não- bovinos tratados por outros carrapatos além do carrapato bovino, particularmente o carrapato vermelho do cão, Rhipicephalus sanguineus. Além disso, uma vez que os carrapatos são vetores de uma variedade de agentes patogênicos, a redução na incidência da infestação por carrapatos conferida pelas vacinas pode simultaneamente reduz a incidência de doenças causadas por esses agentes patogênicos em animais suscetíveis.

[006] De acordo com esta descoberta, é um objetivo desta invenção oferecer vacinas protetoras contra outros carrapatos diferentes do carrapato bovino, R. microplus, em animais não-bovinos.

[007] Outro objetivo da invenção é oferecer vacinas protetoras que controlem e previnam infestações por carrapatos de espécies diferentes do carrapato bovino, e em animais diferentes de bovinos.

[008] Um objetivo adicional da invenção é oferecer vacinas protetoras contra o carrapato vermelho do cão, R. sanguineus, em animais.

[009] Ainda outro objetivo da invenção é oferecer vacinas protetoras contra o carrapato vermelho do cão, R. sanguineus, em animais de companhia, incluindo cervos, cavalos, cães e gatos domésticos.

[010] Ainda outro objetivo da invenção é oferecer vacinas protetoras que controlem e previnam infestações em animais por carrapatos, e, dessa forma, reduzir ou eliminar a incidência de doenças causadas por agentes patogênicos carregados pelos carrapatos.

[011] Ainda outro objetivo da invenção é oferecer vacinas protetoras que controlem e previnam infestações em caninos pelo carrapato vermelho do cão, R. sanguineus, e, dessa forma, reduza ou elimine a incidência da erliquiose canina causada por Ehrlichia canis, e a babesiose canina causada pelos parasitas protozoários Babesia canis e Babesia gibsoni.

[012] Outros objetivos e vantagens da presente invenção se tornarão prontamente aparentes a partir da descrição seguinte.

Breve Descrição dos Desenhos

[013] A Figura 1A mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) do fragmento da proteína aquaporina, Contig 12018, descrito aqui, o qual foi isolado a partir de R. microplus. A Figura 1B mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) do fragmento da proteína aquaporina como clonada no e produzida pelo vetor de expressão pPICZalphaA em Pichia pastoris conforme descrito em Guerrero et al. (patente U.S 8.722.063, expedida em 13 de maio de 2014). Os aminoácidos da proteína aquaporina de carrapato são sublinhados (aminoácidos 92 a 290 da SEQ ID NO: 2), enquanto que os aminoácidos extras que não são de origem do carrapato, mas do vetor, não são sublinhados (aminoácidos 1 a 91 e 291 a 317 da SEQ ID NO: 2). A Figura 1C mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) do fragmento da proteína aquaporina como clonada no e produzida pelo vetor de expressão de vacina de DNA pcDNA4mycHis C conforme descrito em Guerrero et al. Os aminoácidos da proteína aquaporina do carrapato são sublinhados (aminoácidos 1 e 3 a 198 da SEQ ID NO: 3), enquanto que os aminoácidos substituídos/extras que não são de origem do carrapato não são sublinhados (aminoácidos 2 e 199-226 da SEQ ID NO: 3). Embora os aminoácidos substituídos/extras não sejam de origem de carrapato, eles estão presentes na estrutura do produto de proteína final usado na vacina no Exemplo.

[014] A Figura 2A mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 5) do cDNA de R. microplus codificando o fragmento de proteína aquaporina isolado da Figura 1A e inclui uma região 5’ não-traduzida. A região traduzida codificando para o fragmento de proteína aquaporina isolado da Figura 1A é sublinhada e corresponde aos nucleotídeos 348 a 947 da sequência. A Figura 2B mostra a sequência de nucleotídeos da aquaporina (SEQ ID NO: 6) como clonada no vetor de expressão em P. pastoris pPICZalphaA, conforme descrito em Guerrero et al. A sequência sublinhada (nucleotídeos 274 a 870) corresponde à sequência de nucleotídeos da região de codificação da Figura 2A acima, exceto que os três nucleotídeos no terminal 3’ foram removidos. A sequência de nucleotídeos ilustrada inclui nucleotídeos proporcionados em vetor extras, opcionais (nucleotídeos 1 a 273 e 871 a 954, não sublinhados), que codificam para os aminoácidos extras que não são de origem de carrapato. A Figura 2C mostra a sequência de nucleotídeos da aquaporina (SEQ ID NO: 7) como clonada no vetor de expressão de DNA pcDNA4mycHis C, conforme descrito em Guerrero et al. A sequência sublinhada (nucleotídeos 4 a 598) corresponde à sequência de nucleotídeos da região de codificação da Figura 2A acima, exceto que o segundo tripleto de códons foi alterado de AAG para GAG, e os cinco nucleotídeos do terminal 3’ foram removidos. A sequência de nucleotídeos ilustrada inclui nucleotídeos extras proporcionados em vetor de expressão de vacina de DNA, opcionais (1 a 3 e 599 a 684, não sublinhados), dos quais os nucleotídeos do terminal 5’ codificam para os aminoácidos extras que não são de origem de carrapato. A sequência de nucleotídeos correspondendo aos nucleotídeos 4 a 598 da SEQ ID NO: 7 também é apresentada como a SEQ ID NO: 8 (em que os nucleotídeos extras do vetor de expressão de vacina de DNA não estão incluídos).

[015] A Figura 3 mostra uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 9) codificando o fragmento de proteína aquaporina isolado da Figura 1A, em que a região de codificação ou traduzida da sequência de nucleotídeos da Figura 2A (nucleotídeos 348 a 942) foi otimizada para aperfeiçoar a tradução em P. pastoris.

[016] A Figura 4 mostra o sucesso de muda dos tratamentos com sangue processado em “pool” alimentado por tubos capilares a carrapatos R. sanguineus, conforme descrito no Exemplo 1.

Definições

[017] Os seguintes termos são empregados na presente invenção:

[018] Clonagem. A seleção e propagação (a) do material genético de um único indivíduo, (b) um vetor contendo um gene ou fragmento de gene, ou (c) um único organismo contendo um tal gene ou fragmento de gene.

[019] Vetor de clonagem. Um plasmídeo, vírus, retrovírus, bacteriófago ou sequência de ácido nucléico que é capaz de se replicar uma célula hospedeira, caracterizado por um ou um pequeno número de sítios de reconhecimento de endonuclease de restrição nos quais a sequência pode ser cortada de maneira predeterminada, e que contém um marcador adequado para uso na identificação de células transformadas, por exemplo, utilização de uracila, resistência à tetraciclina, resistência à ampicilina. Um vetor de clonagem pode ou não possuir os recursos necessários para operar como um vetor de expressão.

[020] Códon. Uma sequência de DNA de três nucleotídeos (um tripleto) que codifica (através do mRNA) para um aminoácido, um sinal de início traducional, ou um sinal de terminação traducional. Por exemplo, os tripletos de nucleotídeos TTA, TTG, CTT, CTC, CTA e CTG codificam para o aminoácido leucina, enquanto que TAG, TAA e TGA são sinais de parada traducional, e ATG é um sinal de início traducional.

[021] Complemento ou Sequência Complementar. O produto do emparelhamento de bases complementares no qual a purina se liga com pirimidinas, como ocorre nas duas cadeias de polinucleotídeos do DNA (adenina com timina, guanina com citosina) e entre os nucleotídeos do RNA mensageiro e DNA durante a transcrição.

[022] Sequência de Codificação de DNA. Uma sequência de DNA que é transcrita e traduzida em um polipeptídeo in vivo quando colocada sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. Os limites da sequência de codificação são determinados por um códon de início no terminal 5’ (amino) e um códon de parada de tradução no terminal 3’ (carbóxi). Uma sequência de codificação pode incluir, mas não se limita a sequências procarióticas e cDNA de mRNA eucariótico. Um sinal de poliadenilação e a sequência de terminação de transcrição estarão geralmente localizados em 3’ para a sequência de codificação.

[023] Sequência de DNA. Uma série linear de nucleotídeos conectados uns aos outros por ligações fosfodiéster entre os carbonos nos 3’ e 5’ das pentoses adjacentes.

[024] Expressão. O processo pelo qual passa um gene estrutural para produzir um polipeptídeo. A expressão requer tanto a transcrição do DNA quanto a tradução do RNA.

[025] Vetor de Expressão. Um replicon, tal como um plasmídeo, vírus, retrovírus, bacteriófago ou sequência de ácido nucléico que é capaz de se replicar em uma célula hospedeira, caracterizado por um sítio de reconhecimento de endonuclease de restrição no qual a sequência pode ser cortada de maneira predeterminada para a inserção de uma sequência de DNA heteróloga. Um vetor de expressão tem um promotor posicionado à montante do sítio no qual a sequência é cortada para a inserção da sequência de DNA heteróloga, o sítio de reconhecimento sendo selecionado de modo que o promotor seja operativamente associado à sequência de DNA heteróloga. Uma sequência de DNA heteróloga é “operativamente associada” ao promotor em uma célula quando a RNA polimerase, que se liga à sequência promotora, transcreve a sequência de codificação no mRNA, que é então, por sua vez, traduzido para a proteína codificada pela sequência de codificação.

[026] Proteína de Fusão. Uma proteína produzida quando dois genes heterólogos ou fragmentos dos mesmos codificando para duas proteínas diferentes não encontrados fusionados juntos na natureza são fusionados juntos em um vetor de expressão. Para a proteína de fusão corresponder às proteínas separadas, as sequências de DNA separadas devem ser fusionadas juntas para corrigir o quadro de leitura traducional.

[027] Gene. Um segmento de DNA que codifica uma proteína ou polipeptídeo específico, ou RNA.

[028] Genoma. O DNA inteiro de um organismo. Ele inclui, entre outras coisas, os genes estruturais codificando para os polipeptídeos da substância, bem como sequências operadoras, sequências promotoras e sequências de ligação e interação com ribossomos.

[029] DNA Heterólogo. Uma sequência de DNA inserida dentro de ou conectada a outra sequência de DNA que codifica para polipeptídeos não codificados na natureza pela sequência de DNA à qual ela está unida. Variações alélicas ou eventos de mutação de ocorrência natural não dão origem a uma sequência de DNA heteróloga conforme definida aqui.

[030] Hibridização. O emparelhamento ou anelamento de regiões de fita única de ácidos nucléicos umas às outras para formar moléculas de fita dupla.

[031] Nucleotídeo. Uma unidade monomérica de DNA ou RNA que consiste de uma porção açúcar (pentose), um fosfato e uma base heterocíclica nitrogenosa. A base é ligada à porção açúcar por meio do carbono glicosídico (carbono 1’ da pentose) e essa combinação de base e açúcar é um nucleosídeo. A base caracteriza o nucleotídeo. As quatro bases de DNA são adenina (“A”), guanina (“G”), citosina (“C”) e timina (“T”). As quatro bases de RNA são A, G, C e uracila (“U”).

[032] Fago ou bacteriófago. Vírus bacteriano, muitos dos quais incluem sequências de DNA encapsuladas em um envoltório de proteína ou membrana (“capsídeo”). Em um organismo unicelular, um fago pode ser introduzido por um processo chamado transfecção.

[033] Plasmídeo. Uma sequência de DNA de fita dupla não-cromossômica compreendendo um “replicon” intacto, de modo que o plasmídeo seja replicado em uma célula hospedeira. Quando o plasmídeo é colocado dentro de um organismo unicelular, as características desse organismo podem ser alteradas ou transformadas como resultado do DNA do plasmídeo. Uma célula transformada por um plasmídeo é chamada de “transformante”.

[034] Polipeptídeo. Uma série linear de aminoácidos conectados um ao outro por ligações peptídicas entre os grupos alfa-amino e carbóxi dos aminoácidos adjacentes.

[035] Promotor. Uma sequência de DNA dentro de uma sequência de DNA maior definindo um sítio ao qual a RNA polimerase pode se ligar e iniciar a transcrição.

[036] Quadro de Leitura. O agrupamento de códons durante a tradução do mRNA em sequências de aminoácidos. Durante a tradução, o quadro de leitura apropriado deverá ser mantido. Por exemplo, a sequência de DNA pode ser traduzida por meio do mRNA em três quadros de leitura, cada um dos quais fornece uma sequência de aminoácidos diferente.

[037] Molécula de DNA Recombinante. Uma sequência de DNA híbrida compreendendo pelo menos duas sequências de DNA, a primeira sequência não sendo normalmente encontrada junta na natureza com a segunda.

[038] Sítio de Ligação Ribossômica. Uma sequência de nucleotídeos de mRNA, codificada por uma sequência de DNA, à qual os ribossomos se ligam de modo que a tradução possa ser iniciada. Um sítio de ligação ribossômica é necessário para que ocorra a tradução eficiente. A codificação da sequência de DNA para um sítio de ligação ribossômica é posicionada em uma sequência de DNA maior a jusante de um promotor e à montante de uma sequência de início traducional.

[039] Códon de Início. Também chamado de códon de iniciação, é o primeiro tripleto de mRNA a ser traduzido durante a síntese de proteínas ou peptídeos e precede imediatamente o gene estrutural sendo traduzido. O códon de início é geralmente AUG, mas algumas vezes também pode ser GUG.

[040] Condições de Hibridização Restritivas. O termo “condições restritivas” ou “condições de hibridização restritivas” inclui referência a condições sob as quais uma sonda irá se hibridizar para sua sequência alvo, a um grau detectavelmente maior do que para outras sequências (por exemplo, de pelo menos 2 vezes sobre o fundo). As condições restritivas são dependentes da sequência e irão divergir em circunstâncias diferentes. Mediante o controle da restrição das condições de hibridização e/ou lavagem, podem ser identificadas sequências alvo que são 100% complementares à sonda (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições restritivas podem ser ajustadas para permitir certa falta de correlação nas sequências, de modo que graus menores de similaridade sejam detectados (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda possui menos de aproximadamente 1000 nucleotídeos de comprimento, opcionalmente menos de 500 nucleotídeos de comprimento. Tipicamente, as condições de hibridização restritivas compreendem hibridização em formamida 50%, NaC1 1 M, SDS 1% a 42oC, e uma lavagem em 0,1xSSC de 60 a 65oC. Entende-se também que, devido aos avanços na PCR e sequenciamento do DNA, abordagens que focam na questão da identidade e homologia gênica podem ser determinadas por abordagens baseadas em sequência em vez de por hibridização.

[041] Gene Estrutural. Uma sequência de DNA que codifica através de seu RNA modelo ou mensageiro (mRNA) uma sequência de aminoácidos característica de um polipeptídeo específico.

[042] Substancialmente Puro. A condição de um composto, tal como uma proteína ou um nucleotídeo, estar livre de células ou ser separado de outros componentes que interfeririam na, ou que teriam um efeito qualitativo substancial sobre a atividade do composto ou em um substrato no qual o composto atua.

[043] Transformar. Alterar de maneira herdável as características de uma célula hospedeira em resposta ao DNA estranho a essa célula. Um DNA exógeno foi introduzido dentro da parede celular ou protoplasto. O DNA exógeno pode ou não ser integrado (ligado de forma covalente) ao DNA cromossômico que constitui o genoma da célula. Em procariotas e alguns fungos, por exemplo, o DNA exógeno pode ser mantido em um elemento epissomal, tal como um plasmídeo. Com respeito à maioria das células eucarióticas, uma célula transformada estavelmente é aquela em que o DNA exógeno foi integrado em um cromossomo de modo que ele seja herdado por células filhas através da replicação dos cromossomos. Esta estabilidade é demonstrada pela capacidade da célula eucariótica em estabelecer linhagens celulares ou clones compostos de uma população de células- filhas contendo o DNA exógeno.

[044] Transcrição. O processo de produzir mRNA a partir de um gene estrutural.

[045] Tradução. O processo de produção de um polipeptídeo a partir de mRNA.

[046] Vacina. Define-se aqui “vacina” em seu sentido amplo para designar qualquer tipo de agente biológico em uma forma administrável capaz de estimular uma resposta imunológica protetora em um animal inoculado com a vacina. Para os fins desta invenção, a vacina pode compreender uma ou mais das proteínas (antigênicas) imunogênicas ou construções de ácido nucléico codificando essas proteínas. Descrição Detalhada da Invenção

[047] Na descrição a seguir, a nomenclatura usada para definir as proteínas e peptídeos é a especificada por Schroder e Lubke ["The Peptides," Academic Press (1965)] em que, de acordo com a representação convencional, o N- terminal aparece à esquerda e o C-terminal à direita. Quando o resíduo de aminoácido possui formas isoméricas, ele é a forma L do aminoácido que é representado aqui, salvo indicação clara em contrário.

[048] A proteína imunogênica que é utilizada aqui é um fragmento de proteína aquaporina do carrapato de bovinos, R. microplus. Este fragmento de proteína aquaporina, bem como as sequências de ácido nucléico codificando essa proteína aquaporina, são descritos em Guerrero et al., o pedido de patente U.S de no de série no. 13/479,486, depositado em 24 de maio 2012, cujos conteúdos são incorporados por referência aqui. Guerrero et al. também revela que este fragmento de proteína aquaporina, e construções de ácido nucléico compreendendo a sequência de ácido nucléico codificando esta proteína aquaporina, podem ser usadas como vacinas para controlar e prevenir infestações de R. microplus em animais de fazenda tratados, incluindo bovinos. Descobrimos agora que a mesma proteína aquaporina de R. microplus, e as construções de ácido nucléico incorporando a sequência de ácido nucléico codificando esta proteína aquaporina, não são eficazes somente para induzir uma resposta imunológica protetora contra o carrapato bovino em animais bovinos, mas também para induzir uma resposta imunológica protetora contra outras espécies de gado em outros animais não-bovinos. Em particular, descobrimos que a proteína aquaporina ou construções de ácido nucléico são eficazes para induzir uma resposta imunológica protetora contra o carrapato vermelho do cão, R. sanguineus, em uma variedade de animais, de preferência cervos (inclusive o veado-da-cauda-branca), cavalos, cães e gatos domésticos. Além do mais, sem a limitar a isto, imagina-se que a proteína aquaporina ou as construções de ácido nucléico sejam eficazes para induzir uma resposta imunológica protetora contra outros carrapatos, incluindo Ixodes holocyclus (carrapato da paralisia Australiano), I. ricinus, I. pacificus, I. hexagonus, I. canisuga, Rhipicephalus turanicus, Dermacentor variabilis (carrapato do cão americano), D. andersoni, D. reticulates, Amblyomma americanum (carrapato- da-estrela-solitária), A. maculatum e Otobius megnini.

[049] O fragmento de proteína aquaporina do carrapato de bovinos, R. microplus, foi isolado, substancialmente livre de outras proteínas ou componentes celulares que estão normalmente presentes nas células do carrapato, de modo que a proteína aquaporina seja a única proteína ou peptídeo significativo na amostra e possa ser usado de maneira eficaz como uma vacina. Além do mais, a proteína foi produzida na forma recombinante como descrito em Guerrero et al. e aqui adiante. O termo “isolado” engloba não apenas proteínas que foram recuperadas de células de ocorrência natural, mas também proteínas recombinantes e proteínas sintetizadas. Os fragmentos de proteína aquaporina, incluindo recombinantes, são imunogênicos, eficazes para induzir uma resposta imunológica protetora contra outros carrapatos além do carrapato de bovinos, cuja resposta é mediada por humores, isto é, anticorpos, e/ou processos celulares.

[050] O fragmento de proteína aquaporina isolado de R. microplus foi sequenciado, e sua sequência de aminoácidos é ilustrada na Figura 1A. A sequência de aminoácidos do fragmento de proteína aquaporina isolado corresponde à SEQ ID NO: 1. O fragmento de proteína aquaporina isolado tem um peso molecular calculado de 21.2 kDa baseado na sequência de aminoácidos. Além do mais, ao utilizar proteínas recombinantes, o fragmento de proteína aquaporina pode ser modificado para auxiliar na clonagem no vetor selecionado, e a proteína expressa pode adicionalmente incluir sequências de aminoácidos terminais adicionais, opcionais, do vetor (não de origem do carrapato). Por exemplo, a Figura 1B mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) do fragmento da proteína aquaporina como clonada no e produzida pelo vetor de expressão pPICZalphaA em Pichia pastoris conforme descrito em Guerrero et al. A sequência sublinhada da Figura 1B corresponde à sequência de aminoácidos da Figura 1A, exceto que o aminoácido C- terminal (L) do fragmento isolado foi removido para auxiliar na clonagem do gene da aquaporina no plasmídeo. A sequência de aminoácidos também inclui aminoácidos opcionais, extras, do vetor de clonagem. Os aminoácidos da proteína aquaporina de carrapato são sublinhados (aminoácidos 92 a 290 da SEQ ID NO: 2), enquanto que os aminoácidos extras que não são de origem do carrapato não são sublinhados (aminoácidos 1 a 91 e 291 a 317 da SEQ ID NO: 2). A Figura 1C mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) do fragmento da proteína aquaporina como clonada no e produzida pelo vetor de expressão de vacina de DNA pcDNA4mycHis C também conforme descrito em Guerrero et al. A sequência sublinhada corresponde à sequência de aminoácidos da Figura 1A acima, exceto que o aminoácido 2 foi alterado (de K para E) e os dois aminoácidos C- terminais (PL) do fragmento isolado foram removidos para auxiliar na clonagem do gene da aquaporina no plasmídeo. Assim, os aminoácidos 3 a 198 da SEQ ID NO: 1 são comuns a cada uma das sequências de aquaporina das Figuras 1A, B e C. A sequência de aminoácidos da Figura 1C também inclui aminoácidos opcionais do vetor de expressão de vacina de DNA. Os aminoácidos da proteína aquaporina do carrapato são sublinhados (aminoácidos 1 e 3 a 198 da SEQ ID NO: 3), enquanto que os aminoácidos alterados/extras que não são de origem do carrapato não são sublinhados (aminoácidos 2 e 199 a 226 da SEQ ID NO: 3). A sequência de aminoácidos correspondendo somente aos aminoácidos 1 a 198 da SEQ ID NO: 3 também é apresentada como a SEQ ID NO: 4 (os aminoácidos extras do vetor de expressão de vacina de DNA não estão incluídos).

[051] Considera-se que a proteína aquaporina de R. microplus pode ser sintetizada por qualquer método adequado bem-conhecido pelos versados na técnica da síntese de peptídeos, tais como técnicas de fase exclusivamente sólida, técnicas de fase sólida parcial, condensação de fragmento ou adição de solução clássica. Por exemplo, sem se limitar a isto, métodos de síntese de fase de solução adequados são descritos por Finn e Hoffman [In "Proteins," Vol. 2, 3rd Ed., H. Neurath and R. L. Hill (eds.), Academic Press, New York, pp. 105-253 (1976)], enquanto métodos de síntese de fase sólida são descritos por Barany e Merrifield [In "The Peptides," Vol. 2, E. Gross and J. Meienhofer (eds.), Academic Press, New York, pp. 3-284 (1979)], e métodos de síntese de fase sólida gradual são descritos por Merrifield [J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963)], sendo o conteúdo de cada um dos quais incorporado neste para fins de referência. No entanto, a proteína é preferivelmente produzida por técnicas de DNA recombinante que são particularmente adequadas para uso em grande escala. Sem se limitar às mesmas, sequências de nucleotídeos codificando a proteína que são preferidas para uso em técnicas de DNA recombinante são descritas em detalhes abaixo. A proteína sintética pode ser obtida transformando um micro-organismo usando um vetor de expressão incluindo um promotor ou operador, ou ambos, juntamente com o gene estrutural da aquaporina e fazendo com que tais micro-organismos transformados expressem a proteína.

[052] O gene que codifica o fragmento de proteína aquaporina de R. microplus também foi isolado e suas sequências de ácido nucléico de cDNA são ilustradas na Figura 2A. A sequência de ácido nucléico da região traduzida do cDNA codificando o fragmento de proteína aquaporina corresponde aos nucleotídeos 348-947 da SEQ ID NO: 5. A Figura 2A também inclui uma região 5’ não- traduzida (não sublinhada). Como usado aqui, o termo sequências de ácido nucléico isoladas se referem a sequências que foram substancialmente separadas dos outros ácidos nucléicos ou componentes celulares que estão normalmente presentes nas células do carrapato, de modo que as sequências de codificação da aquaporina sejam as únicas sequências significativas na amostra que podem ser usadas para expressar ou produzir a proteína em uma célula hospedeira como descrito abaixo. O termo abrange não somente sequências de ácido nucléico que foram recuperadas a partir de células de ocorrência natural, mas também sequências de ácido nucléico recombinantes ou clonadas, e sequências de ácido nucléico sintetizadas. As sequências de ácido nucléico podem ser recuperadas a partir de células de R. microplus, por exemplo, por meio da construção de uma biblioteca de cDNA ou DNA genômico e varrendo em busca do ácido nucléico da proteína aquaporina usando as sequências reveladas como sondas. No entanto, em uma modalidade preferida, as sequências são sintetizadas usando técnicas estabelecidas para síntese ou amplificação de DNA automatizada. Como usado aqui, as sequências de ácido nucléico da proteína aquaporina abrangem qualquer uma ou ambas as fitas de codificação ou seu complemento.

[053] Como observado acima, a sequência de aminoácidos do fragmento de proteína aquaporina pode ser modificada para auxiliar na clonagem no vetor selecionado, e pode adicionalmente incluir sequências de aminoácidos terminais adicionais, opcionais, do vetor (não de origem do carrapato). Assim, a sequência de ácido nucléico pode ser modificada para refletir essas alterações. Por exemplo, a Figura 2B mostra a sequência de nucleotídeos da aquaporina (SEQ ID NO: 6) como clonada no vetor de expressão em P. pastoris pPICZalphaA, conforme descrito em Guerrero et al. A sequência sublinhada da Figura 2B (nucleotídeos 274 a 870) corresponde à sequência de nucleotídeos da região de codificação da Figura 2A acima, exceto que os três nucleotídeos do terminal 3’ (nucleotídeos 945 a 947 da Figura 2A) foram removidos para auxiliar na clonagem do gene no plasmídeo. A sequência de nucleotídeos ilustrada inclui nucleotídeos proporcionados em vetor extras, opcionais (nucleotídeos 1 a 273 e 871 a 954, não sublinhados), que codificam para os aminoácidos extras que não são de origem de carrapato (aminoácidos 1 a 91 e 291 a 317 da SEQ ID NO: 2). A Figura 2C mostra a sequência de nucleotídeos da aquaporina (SEQ ID NO: 7) como clonada no vetor de expressão de DNA pcDNA4mycHis C, conforme descrito em Guerrero et al. A sequência sublinhada (nucleotídeos 4 a 598) corresponde à sequência de nucleotídeos da região de codificação da Figura 2A acima, exceto que o segundo tripleto de códons (nucleotídeos 351 a 353 da Figura 2A) foi modificado de AAG para GAG, e os cinco nucleotídeos do terminal 3’ (nucleotídeos 943 a 947 da Figura 2A) foram removidos, para auxiliar na clonagem do gene no plasmídeo e melhorar a tradução. Assim, os nucleotídeos 354 a 942 da SEQ ID NO: 5 são comuns a cada uma das sequências de codificação da aquaporina das Figuras 2A, B e C. A sequência de nucleotídeos ilustrada inclui nucleotídeos extras proporcionados em vetor de expressão de vacina de DNA, opcionais em ambas as extremidades 3’ e 5’ (1 a 3 e 599 a 684, não sublinhados), dos quais os nucleotídeos do terminal 3’ codificam para os aminoácidos extras que não são de origem de carrapato (aminoácidos 200 a 226 da SEQ ID NO: 2). A sequência de nucleotídeos correspondendo aos nucleotídeos 4 a 598 da SEQ ID NO: 7 também é apresentada como a SEQ ID NO: 8 (em que os nucleotídeos extras do vetor de expressão de vacina de DNA não estão incluídos). Além disso, por causa da degeneração do código genético, existe um conjunto finito de sequências de nucleotídeos que podem codificar para uma dada sequência de aminoácidos. Consequentemente, os ácidos nucléicos podem ser idênticos em sequência à sequência que é de ocorrência natural, ou podem incluir códons alternativos que codificam o mesmo aminoácido que é encontrado na sequência de ocorrência natural. Adicionalmente, os ácidos nucléicos podem incluir códons que representam substituições conservadoras dos aminoácidos, como são bem conhecidas na técnica. Ademais, por causa da degeneração do código genético, diferentes espécies podem preferencialmente usar códons diferentes para codificar para o mesmo aminoácido e podem existir diferenças significativas na abundância do tRNA. A tradução de proteínas recombinantes geralmente pode ser aprimorada otimizando-se o uso de códons para os códons preferidos usados pela espécie de expressão. Por exemplo, na levedura P. pastoris, o aminoácido arginina é codificado pelo tripleto de nucleotídeos de AGA aproximadamente 10 vezes mais frequentemente do que pelo tripleto de nucleotídeos de CGG. Espera-se que a substituição dos tripletos CGG por AGA em uma região de codificação de proteína de R. microplus usada em um sistema de expressão de P. pastoris recombinante aprimore os níveis de expressão de proteína recombinante. Entende-se que todas tais sequências equivalentes são variantes operáveis das sequências reveladas, uma vez que todas dão origem à mesma proteína aquaporina (isto é, a mesma sequência de aminoácidos) durante a transcrição e tradução in vivo, e, portanto, são englobadas na presente invenção. Sem se limitar a isto, exemplos de sequências de códons otimizados que seriam apropriadas para aprimorar a tradução do fragmento da proteína aquaporina em P. pastoris são ilustrados na Figura 3. A sequência da Figura 3 (SEQ ID NO: 9) corresponde à região traduzida ou de codificação da sequência de nucleotídeos da Figura 2A (nucleotídeos 348 a 942) que foi otimizada para aprimorar a tradução em P. pastoris. Sequências de DNA que contêm similaridade de sequência significativa com as regiões de codificação da sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 5 também são abrangidas pela invenção. Como definido aqui, duas sequências de DNA contêm similaridade de sequência significativa quando pelo menos 85% (de preferência pelo menos 90% e, mais preferivelmente, 95%) dos nucleotídeos corresponderem ao comprimento definido da sequência. Sequências que são significativamente similares podem ser identificadas em um experimento de hibridização com sondas sob condições de hibridização restritivas como é conhecido na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, ou DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I e II (Ed. D. N. Glover), IRL Press, Oxford, 1985.

[054] Qualquer uma ou combinações das sequências de ácido nucléico de cDNA isoladas codificando a proteína aquaporina de R. microplus podem ser clonadas em qualquer vetor adequado para uso subsequente ou como uma vacina de DNA ou para a produção de proteína aquaporina de R. microplus recombinante. Para uso como uma vacina de DNA, as construções de ácido nucléico compreendendo as sequências de ácido nucléico codificando a proteína aquaporina de R. microplus são administradas a um paciente animal de modo que a proteína seja expressada in vivo dentro das células do animal vacinado. De modo similar, quando o objeto é a produção da proteína recombinante, as construções de ácido nucléico são usadas para a transformação de um microorganismo e fazem com que tal micro-organismo transformado expresse a proteína in vitro.

[055] Uma variedade de vetores é adequada para uso na presente invenção, e são selecionados para serem operáveis como vetores de clonagem ou vetores de expressão na célula hospedeira selecionada, embora vetores de expressão sejam preferidos. Diversos vetores são conhecidos pelos indivíduos peritos na técnica, e a seleção de um vetor apropriado e uma célula hospedeira é uma mera questão de escolha. Os vetores podem, por exemplo, serem bacteriófagos, plasmídeos (incluindo plasmídeos linearizados ou circulares), vírus ou híbridos dos mesmos, tais como os descritos em Sambrook et al. (ibid) ou Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc, 1995), os conteúdos de cada um dos quais sendo por meio deste incorporados para fins de referência. Além disso, os vetores podem ser vetores sem fusão (isto é, aqueles que produzem as proteínas da invenção não fusionada a qualquer polipeptídeo heterólogo), ou, como alternativa, vetores de fusão (isto é, aqueles que produzem as proteínas fusionadas a um polipeptídeo codificado em vetor). Evidentemente, as proteínas de fusão variariam com o vetor específico escolhido. De acordo com uma modalidade preferida, e particularmente para aplicações como vacinas de DNA, os vetores são vetores de expressão eucarióticos, mais preferivelmente plasmídeos. Plasmídeos particularmente preferidos para uso na presente invenção incluem plasmídeos comercialmente disponíveis por meio da Invitrogen Inc., Carlsbad, CA tanto para a vacina de DNA quanto para os protocolos de vacina proteica recombinante. Os vetores pcDNA 4/myc 5.1 kb são designados para superprodução de proteínas recombinantes em células de mamíferos. Este plasmídeo contém um promotor imediato do citomegalovírus humano (CMV) para expressão de alto nível, um epítopo c-myc e uma marca de peptídeo de ligação a metal 6Xhis para facilitar a purificação e verificação de proteína, e uma região codificadora do gene marcador de resistência ao antibiótico Zeocina para fins de seleção. Os plasmídeos preferidos usados para produzir proteína recombinante são pPICZ e pPICZα da Invitrogen Inc. Ambos os plasmídeos contêm o promotor do gene AOX1 para expressão de alto nível induzível por metanol em Pichia pastoris, um epítopo c-myc e uma marca de peptídeo de ligação a metal 6Xhis para facilitar a purificação e verificação de proteína, e uma região codificadora do gene marcador de resistência ao antibiótico Zeocina para fins de seleção. O pPICZα também contém um sinal de secreção do fator α de Saccharomyces cerevisiae.

[056] Independentemente do vetor específico utilizado, vários sítios podem ser selecionados para inserção das sequências de nucleotídeos isoladas. Estes sítios são geralmente designados pela enzima de restrição ou endonuclease que os corta.

[057] O sítio específico escolhido para inserção das sequências de nucleotídeos selecionadas no vetor para formar um vetor recombinante é determinado por uma variedade de fatores. Estes incluem o tamanho e a estrutura da proteína a ser expressada, a suscetibilidade da proteína desejada à degradação enzimática pelos componentes da célula hospedeira e contaminação por suas proteínas, características de expressão, tal como a localização dos códons de início e parada, e outros fatores reconhecidos pelos versados na técnica. Nenhum desses fatores isoladamente controla de maneira absoluta a escolha do local de inserção para um determinado polipeptídeo. Em vez disso, o sítio escolhido reflete um equilíbrio desses fatores, e nem todos os sítios podem ser igualmente eficazes para uma dada proteína.

[058] As sequências de nucleotídeos compreendendo o gene de codificação de fragmento de proteína aquaporina de R. microplus podem ser inseridas no vetor desejado por técnicas conhecidas. Se, no entanto, o vetor for servir como um vetor de expressão, o vetor deverá ter um promotor eficaz para expressão na célula hospedeira selecionada, e as sequências de DNA devem ser inseridas no vetor a jusante do promotor e operacionalmente associadas ao mesmo (isto é, o promotor deverá ser reconhecido pela RNA polimerase da célula hospedeira). Além disso, o vetor deve ter uma região que codifica para um sítio de ligação a ribossomo posicionado entre o promotor e o sítio no qual a sequência de DNA é inserida de modo a ser operativamente associado à sequência de DNA da invenção uma vez inserido (no quadro de leitura traducional correto com a mesma). O vetor deve ser selecionado para proporcionar uma região que codifica para um sítio de ligação a ribossomo reconhecido pelos ribossomos da célula hospedeira na qual o vetor deverá ser inserido. O vetor deverá conter um terminador com sequências não—traduzidas 3’ necessárias para terminação do RNA, estabilidade e/ou adição de cauda poli(A) (se for eucariótico). Como alternativa, qualquer uma ou todas as sequências de controle acima podem ser ligadas à sequência de codificação antes da inserção no vetor.

[059] Para uso em vacinações de animais, o fragmento de proteína aquaporina de R. microplus isolado ou as construções de ácido nucléico compreendendo as sequências de ácido nucléico codificando esta proteína tipicamente serão formulados em conjunto com um veículo ou diluente aceitável do ponto de vista farmacêutico, como é conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a solução salina fisiológica, óleo mineral, óleos vegetais, carboximetil celulose aquosa ou polivinilpirrolidona. O indivíduo perito na técnica reconhecerá que tais veículos serão, sem dúvidas, compatíveis com a proteína ou construções de ácido nucléico. A solução salina tamponada com fosfato (PBS) é preferida. Uma vez que a aquaporina pode se precipitar na presença de tampões aquosos, tal como a PBS, em uma modalidade preferida, a aquaporina é armazenada em um solvente apolar ou óleo. Uma variedade de solventes apolares são adequados para uso na presente invenção, embora um solvente preferido seja composto de 50 mM de NaH2PO4, pH 8.0, 300 mM de NaCl, 2 mM de beta- mercaptoetanol, 0,4% p/v de OTG (octol-beta-D-1- tioglicopiranosídeo), 300 mM de imidazol e glicerol 50%. A concentração e quantidade da proteína ou construções de ácido nucléico na composição final podem variar, dependendo do uso e tipo desejado de resposta necessária, e do animal hospedeiro. Em todo caso, a proteína ou construções de ácido nucléico devem ser proporcionados em uma quantidade eficaz para induzir a resposta preferida, conforme determinado pelos testes de rotina. Adjuvantes apropriados, como conhecido na técnica, também podem ser incluídos na formulação. Como descrito aqui, os adjuvantes incluem agentes (um composto ou combinação de compostos) capazes de aprimorar um ou ambos de uma resposta de imunidade humoral (anticorpos) ou uma resposta de imunidade mediada por célula no animal tratado contra o carrapato-alvo. Sem ter a intenção de se limita aos mesmos, adjuvantes adequados incluem, sem restrição, um ou mais dentre óleo mineral, óleos vegetais, sais de alumínio, tal como alume, adjuvantes do tipo água-em-óleo, tal como o adjuvante incompleto de Freund, emulsões do tipo óleo-em-água, tal como MF59 (Novartis, Suíça), lipossomas, virossomas, micropartículas ou nanopartículas ou grânulos de materiais de matriz biocompatíveis, tal como (mas sem restrição a) ágar ou poliarilato, adjuvantes à base de saponina (tal como QA-21 ou QS-21 comercializados pela Antigenics, Lexington, MA), agonistas de receptor do tipo “toll” (TLR), tal como lipídeo 3-O-desail-4’-monofosforil A (MPL) e sequências imunoestimuladoras (ISS) de DNA microbiano, imidazoquinolinas, completos estimuladores do sistema imunológico (ISCOMs e ISCOMATRIXs), e outros agentes, tais como os descritos por Leroux-Roels (2010. Vaccine. 285:C25- C36, cujo conteúdo é incorporado por meio deste para fins de referência). De acordo com uma modalidade opcional, outros agentes imunogênicos conhecidos usados em vacinas convencionais para o animal de interesse também podem ser incluídos na formulação. Por exemplo, agentes imunogênicos adicionais podem ser uma forma atenuada ou inativada de um patógeno, ou subunidades do mesmo. Sem ter a intenção de se limitar aos mesmos, estes patógenos incluem, por exemplo, um ou mais dentre os vírus da raiva, Borrelia burgdorferi, vírus da cinomose canina, parvovírus canino, adenovirus canino, coronavírus canino, vírus da herpes canino, Giardia spp., Leptospira interrogans, Babesia canis, Hepatozoon canis, Dipylidium caninum e Isospora spp.

[060] O fragmento de proteína aquaporina de R. microplus imunogênico ou as construções de ácido nucléico compreendendo as sequências de ácido nucléico codificando esta proteína são ministrados em uma quantidade eficaz para reduzir ou eliminar a incidência de infestação do animal tratado, com o carrapato alvo específico, particularmente, mas sem se limitar ao carrapato vermelho do cão, R. sanguineus. Como observado aqui anteriormente, a administração da proteína aquaporina R. microplus, ou as construções de ácido nucléico compreendendo as sequências de ácido nucléico codificando esta proteína (de modo que as sequências de ácido nucléico sejam expressadas e a proteína codificada seja produzida in vivo nas células do animal vacinado), estimulam uma resposta imunológica no animal. Assim, como usado aqui, uma “quantidade eficaz” da proteína aquaporina de R. microplus ou as construções de ácido nucléico compreendendo as sequências de ácido nucléico codificando esta proteína, é preferivelmente definida como uma quantidade que irá induzir uma resposta imunológica protetora contra o carrapato alvo, que pode ser uma dentre a produção de anticorpos contra a proteína ou uma resposta imunológica mediada por células contra o carrapato, ou ambos, em um animal tratado se comparado a um animal controle não-tratado. Em uma modalidade preferida, uma resposta imunológica pode ser demonstrada pela produção de anticorpos contra a proteína aquaporina de R. microplus, por uma redução significativa na porcentagem de animais infestados com o carrapato alvo, por uma redução significativa no número médio de carrapatos-alvo nos animais, ou por uma redução significativa no número de ovos viáveis produzidos pelos carrapatos-alvo presentes nos animais, todos em animais vacinados se comparado com um grupo controle não vacinado (medido em um nível de confiança de pelo menos 80%, de preferência medido em um nível de confiança de 95%). A quantidade eficaz real irá, sem dúvidas, variar com o componente de vacina específico (vacina proteica ou vacina de DNA), com o animal particular de interesse e sua idade e tamanho, e com a via de administração, e pode ser prontamente determinada de forma empírica por um perito na técnica usando um ensaio de dose- resposta de antígeno. A título de exemplo e sem se limitar a isto, para vacinas ministradas a animais pequenos (como cães e gatos) por injeção subcutânea ou intramuscular, ou com um dispositivo sem agulha, considera-se que doses típicas da vacina proteica (proteína aquaporina de R. microplus) podem ser maiores do que10 µg de proteína/animal/dose, de preferência entre aproximadamente 50 a 150 µg de proteína/animal/dose, enquanto que doses típicas de vacina de DNA (construções de ácido nucléico) podem ser maiores do que 100 µg de construção de DNA/animal/dose, de preferência entre aproximadamente 300 a 800 µg de construção de DNA/animal/dose.

[061] As vacinas (proteína aquaporina R. microplus ou as construções de ácido nucléico compreendendo as sequências de ácido nucléico codificando esta proteína) podem ser usadas para o tratamento de um amplo espectro de animais selvagens ou domesticados, variando desde animais de estimação e animais de companhia a animais de fazenda e animais domésticos ou selvagens de grande porte. Sem se limitar às mesmas, as vacinas são preferivelmente usadas para o tratamento de cervídeos, equinos, caninos e felinos, e particularmente cervos (incluindo o veado-da-cauda- branca), cavalos, cães e gatos domésticos. As vacinas podem ser ministradas de maneira eficaz em qualquer momento após o animal atingir imunocompetência. As vacinas podem ser ministradas ao paciente animal por qualquer via conveniente que permita uma resposta imunológica. No entanto, a injeção parenteral (por exemplo, subcutânea, intravenosa ou intramuscular) é preferida, com a injeção intradérmica sendo particularmente preferida para administração das vacinas de DNA e a injeção intramuscular sendo particularmente preferida para administração das vacinas proteicas. Os produtos de vacina também poderiam ser administrados usando um dispositivo sem agulha. A vacina pode ser administrada em uma única dose ou em uma pluralidade de doses. Dependendo das condições de criação, a vacina pode ser ministrada em múltiplas doses, com a escolha do tempo certo sendo determinada prontamente pelo técnico no assunto.

[062] Quando as construções de ácido nucléico forem empregadas na produção da proteína aquaporina de R. microplus recombinante, pode-se empregar uma variedade de sistemas de expressão de vetor-célula hospedeira. Linhagens de levedura, particularmente Pichia pastoris, são preferidas. No entanto, a nova invenção descrita aqui pode ser aplicada a numerosas células hospedeiras que seriam desejáveis. Linhagens hospedeiras podem ser de origem bacteriana, fúngica, vegetal, de linhagem celular de insetos ou levedura. A determinação do sistema de vetor- hospedeiro mais apropriado cabe ao técnico no assunto na técnica.

[063] As construções de DNA podem ser introduzidas na célula hospedeira apropriada por diversos métodos descritos na literatura técnica e científica. A transformação das bactérias ou levedura pode ser realizada usando técnicas padrão descritas em Sambrook et al., (ibid). Técnicas para transformação de fungos filamentosos podem incluir as que são descritas por Goosen et al. [Handbook for Applied Mycology, Arora, Elander & Mukerji, eds. (1992) pp. 151195] e May et al. [Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Kinghorn and Turner, eds. (1992) pp. 127]. Em geral, construções de DNA lineares ou circulares podem ser introduzidas na célula hospedeira por técnicas utilizando fusão de protoplastos, polietileno glicol, lipossomas, acetato de lítio, eletroporação, dano físico, bombardeio biolístico, ou transformaçao mediada por Agrobacterium.

[064] Transformantes bem-sucedidos podem ser isolados usando marcadores, contidos nos vetores de expressão, que conferem um traço selecionável à célula hospedeira transformada. Estes podem incluir seleção nutricional relacionada à utilização do substrato (tal como crescimento em meio contendo acetamida) ou prototrofia de um produto de crescimento necessário (tal como arginina, leucina ou uracila). Marcadores selecionáveis dominantes tais como, resistência à ampicilina, G418, higromicina, e fleomicina, e Zeocina (uma composição de bleomicina e fleomicina, Invitrogen, Grand Island, NY)] também são úteis na seleção de transformantes que tomaram a construção de DNA introduzida.

[065] A construção de DNA pode ser replicada de forma autônoma ou integrada no genoma da célula hospedeira. A integração tipicamente ocorre por recombinação homóloga (por exemplo, marcador selecionável de arginina integrando- se no gene da arginina cromossômico) ou em um sítio cromossômico não-relacionado a quaisquer genes na construção de DNA. A integração pode ocorrer tanto por um evento de cruzamento (cross-over) único quanto duplo. Também é possível ter qualquer número desses tipos de integração e replicação ocorrendo no mesmo transformante.

[066] O exemplo a seguir pretende apenas ilustrar adicionalmente a invenção e não tenciona limitar o escopo da invenção, o qual é definido pelas reivindicações.

Exemplo 1

[067] O fragmento de proteína aquaporina recombinante de R. microplus foi preparado como descrito no Exemplo 1 de Guerrero et al. (pedido de patente U.S de no de série 13/479,486, mencionado acima). Antes do uso, a proteína aquaporina recombinante foi armazenada em uma solução salina tamponada com fosfato composta de 50 mM de NaH2PO4, pH 8.0, 300 mM de NaCl, 2 mM de beta-mercaptoetanol, 0,4% p/v de OTG (octol-beta-D-1-tioglicopiranosídeo), 300 mM de imidazol e glicerol 50%. A proteína antigênica Bm86Texas recombinante de R. (Boophilus) microplus foi obtida a partir da clonagem do antígeno de proteína Bm86 a partir de uma cepa causal do Texas de R. microplus conhecida como Deutsch. Cada um dentre a proteína aquaporina recombinante e os antígenos Bm86Texas foi adjuvado com Montanide ISA 61 VG (adjuvante to tipo água-em-óleo, Seppic, Paris) em doses de 2 mL contendo 100 ug da proteína recombinante.

[068] Três grupos de veado-da-cauda-branca que nunca tiveram contato com carrapatos (n=4 por grupo) receberam 1,0 mL ou da vacine de proteína aquaporina recombinante, vacina Bm86, ou uma vacina controle na 1a semana. Os cervos foram alojados na LSU Idelwild Research Station em Clinton, La. Cada cervo foi vacinado no 1o dia, e coletou-se o sangue de cada animal nos intervalos mostrados na Tabela 1. O sangue das coletas da 3a semana dos grupos controle, aquaporina de Bm86Texas foi usado para preparar o soro e alimentar a carrapatos no seguinte estudo in vitro. As amostras de sangue individuais dentro dos grupos de tratamento foram processadas em “pool” nos ensaios de alimentação a carrapato.

[069] Quatro grupos de carrapatos R. sanguineus (n = 10 ninfas por grupo) foram parcialmente alimentados em ratos por 2 dias antes da alimentação de tratamento com sangue das amostras sanguíneas coletadas do cervo. Os grupos experimentais foram alimentados com tubos microcapilares de vidro de 50 μL contendo os tratamentos de sangue processado em “pool”. O grupo de carrapatos controle se alimentou somente dos ratos. Ninfas realizaram subsequentemente o repasto sanguíneo nos ratos. As ninfas foram colocadas em câmaras ambientais a 26°C a uma umidade de 92% e monitoradas quanto ao sucesso da muda até 21 dias após o repasto sanguíneo. Os grupos de carrapatos eram menores do que n=10 no momento da colocação da câmara. Mortes devido às técnicas de manuseio foram experimentadas em cada grupo e mortes adicionais também ocorreram dentro de 48 horas de alimentação do sangue vacinado. Os grupos foram reduzidos aos seguintes tamanhos: aquaporina (n=6), Bm86 (N=7), controle vacinado (n=9), e controle de carrapatos (n=9).

[070] Os dados para o sucesso da muda dos carrapatos foram analisados usando um teste do qui-quadrado de probabilidade exata; houve diferenças significativas no sucesso da muda dos quatro grupos (p=0,0255) com a maioria da significância associada ao grupo ARS-1 tendo mais mortes do que o esperado. Os resultados são apresentados na Figura 4. Apenas 50% dos carrapatos alimentados com sangue de cervo vacinado com proteína aquaporina sobreviveram ao processo de muda. Isto é comparado com os grupos vacinados controle de sangue e Bm86, ambos os quais tiveram um índice de muda/sobrevivência de 100%. O grupo controle de carrapato teve um índice de muda/sobrevivência de 90% (Figura 4).

[071] O sangue do cervo também foi amostrado nos intervalos ilustrados na Tabela 1 e o soro separado foi coletado para análise por ELISA para determinar a produção de anticorpos em cervos vacinados para a proteína aquaporina ou os antígenos BM86. Para a ELISA, os soros de cada grupo foram processados em “pool” de acordo com o dia da coleta. Placas de microtitulação foram cobertas com a proteína aquaporina ou o antígeno Bm86 (50 por poço de um antígeno de 1 μg / ml de solução em tampão carbonato de sódio 20 mM, pH 9.6), e incubadas durante a noite a 4°C. O bloqueio com soroalbumina bovina 2% em PBS-T foi seguido de lavagem cinco vezes com PBS pH 7.4. As placas foram incubadas por 45 min a 37°C com 100 μL por poço de soro bovino imunizado diluído a 1:100 em PBS. Após a lavagem, 50 μl de conjugado peroxidase Anti-IgG bovino (Sigma, St. Louis, MO) diluídos a 1:20.000 foram adicionados e aplaca incubada por 30 min à temperatura ambiente. Após incubação e lavagem de 50 μl do substrato cromogênico, o- fenilenodiamina (1,0 mM) foi adicionada e a reação foi interrompida após 15 min pela adição de 50 μl de NaOH (0.2 M). Um leitor de microplaca foi usado para avaliar os resultados com a absorbância ajustada para 490 nm. Os resultados são ilustrados na Tabela 1 e demonstram a produção de anticorpos específica aos antígenos.

[072] Entende-se que a descrição detalhada anterior é apresentada meramente a título de ilustração e que modificações e variações podem ser feitas na mesma sem divergir do conceito inventivo e escopo da invenção.

Claims (6)

1. Uso de uma proteína aquaporina imunogênica de Rhipicephalus microplus e um veículo farmaceuticamente aceitável CARACTERIZADO pelo fato de que é na preparação de um medicamento para reduzir infestações por carrapato em animais não-bovinos, em que o referido medicamento é uma composição de vacina, onde a referida proteína aquaporina está em uma quantidade eficaz para estimular uma resposta imunológica ao referido carrapato no referido animal não- bovino; em que a referida proteína aquaporina compreende os aminoácidos 3 a 198 da SEQ ID NO:1, aminoácidos 1 a 199 da SEQ ID NO: 1 e da SEQ ID NO: 4.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido animal é selecionado dentre o grupo que consiste de caninos, felinos, equinos e cervídeos.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido animal é selecionado dentre o grupo que consiste de gatos domésticos, cães domésticos e cervos.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido animal é um cão doméstico.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido carrapato é o carrapato vermelho do cão, Rhipicephalus sanguineus.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida composição de vacina adicionalmente compreende um adjuvante.

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