BRPI0705676A2 - uso do imunomodulador plasmidial expressando uma proteìna de estresse micobacteriana para o controle de micoses - Google Patents

Abstract

USO DO IMUNOMODULADOR PLASMIDIAL EXPRESSANDO UMA PROTEìNA DE ESTRESSE MICOBACTERIANA PARA O CONTROLE DE MICOSES A presente invenção trata da utilização de uma construção de DNA contendo o gene da proteína de choque térmico ("heat shock protein" ou HSP)de micobactéria no preparo de uma composição medicamentosa ou biofármaco a ser usada para a prevenção, tratamento e/ou cura de micoses em seres humanos e animais. As micobactérias são do género Mycobacterium e osimunomoduladores obtidas codificam proteínas de estresse micobacteriana de diferentes tamanhos. Os imunomoduladores plasmidiais podem ser usados de maneira isolada ou combinada em formulações medicamentosas/vacinais destinadas ao controle de doenças causadas por fungos, tais comoCandídíase, Histoplasmose, Coccidioidomicose, Bíastomicose, Sporotricose, Cryptococose, Aspergilose e Paracoccidíoidomicose ou Pbmicose, especialmente as provocadas pelo gênero Paracoccidíoides, principalmente a espécie Paracoccidíoides brasiliensis.

Description

"USO DO IMUNOMODULADOR PLASMIDIAL EXPRESSANDO UMAPROTEÍNA DE ESTRESSE MICOBACTERIANA PARA O CONTROLE DEMICOSES"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção trata da utilização de uma construção de DNAcontendo o gene da proteína de choque térmico ("heat shock protein" ou HSP)de micobactéria no preparo de uma composição medicamentosa ou biofármacoa ser usada para a prevenção, tratamento e/ou cura de micoses em sereshumanos e animais. As micobactérias são do gênero Mycobacterium,principalmente as espécies M. tuberculosis, M. Ieprae ou M. bovis BCG e osimumoduladores obtidos codificam proteínas de estresse micobacteriana dediferentes tamanhos, tais como a HSP10 (10 KDa), HSP65 (65 KDa),HSP70 (70 KDa). Particularmente, a HSP utilizada é uma proteína de estressemicobacteriana de 65 KDa de Mycobactenum Ieprae e a construção de DNA deinteresse é denominada simplesmente de imunomodulador DNA-HSP65. Opresente pedido de patente destina-se a uma composição empregada naprodução do biofármaco para utilização em doenças causadas por fungos, taiscomo Candidíase, Histoplasmose, Blastomicose, Sporotricose, Cryptococose,Aspergilose, Coccidioidomicose e Paracoccidioidomicose ou Pbmicose,especialmente as provocadas pelo gênero Paracoccidioides, principalmente aespécie Paracoccidioides brasiliensis.

Tal composição medicamentosa apresenta interesse para a indústriafarmacêutica para a manufatura de medicamentos para uso humano eveterinário destinados ao controle de micoses.

ESTADO DA TÉCNICA

A Paracoccidioidomicose (Pbmicose) é uma micose endêmica daAmérica Latina, sendo o Brasil o país que apresenta o maior número de casosrelatados (Brummer, E. e col. Paracoccidioidomycosis: an update. Clin.Microbiol. Rev., 6: 89-117, 1993; Coutinho, Z. e col., Paracoccidioidomycosismortality in Brazil (1980-1995). Cad. Saúde Pública, 18:1441-1454, 2002) epode ser utilizada como modelo de infecção fúngica. Estimativas mostram quecerca de dez milhões de pessoas possam estar infectadas pelo fungo Pb,agente etiológico causador da Pbmicose (Coutinho, Z. e col.,Paracoccidioidomycosis mortality in Brazil (1980-1995). Cad. Saúde Pública,18:1441-1454, 2002). A infecção por este patógeno pode ocorrer pela inalaçãode conídios produzidos na sua fase de micélio a uma temperatura próxima daambiente (23°C). Quando estes pequenos propágulos atingem os pulmões,encontram uma temperatura capaz de induzir a sua transformação para a fasede levedura, a 36°C, ocasionando a doença (Restrepo, A. The ecology ofParacoccidioides brasiliensis: a puzzle still unsolved. Med. Vet. Mycol., 23: 323-334, 1985; McEwen1 J. G. e col., Experimental murine paracoccidioidomycosisinduced by the inhalation of conidia. Med. Vet. Mycoi 25:165-175, 1987).Recentemente foi finalizada a análise do transcriptoma deste patógeno,indicando diferenças transcricionais entre as fases de micélio e levedura(Felipe, M. S. e col., Transcriptional profiles of the human pathogenic fungusParacoccidioides brasiliensis in mycelium and yeast cells. J . Biol. Chem. 2005Jul 1 ;280(26):24706-14. Epub 2005 Apr 22).

Geralmente, a Pbmicose é classificada em: i) Pbmicose infecção,onde os pacientes não desenvolvem a doença, mas são encontradas célulasfúngicas em granulomas nos pulmões e fígado; e ii) Pbmicose doença,encontrada em duas formas, uma aguda e uma crônica. A aguda écaracterizada pelo envolvimento do sistema retículo endotelial e na crônica, oprincipal órgão acometido é o pulmão (Brummer, E. e col.Paracoccidioidomycosis: an update. Clin. Microbiol. Rev., 6: 89-117, 1993).

As principais drogas utilizadas no tratamento da Pbmicose sãoutilizadas em associação trimetropim/sulfametoxazol, itraconazol e cetoconazole, para as formas graves, inclui o uso de anfotericina B, sendo esta a droga deescolha para o tratamento da maioria das micoses sistêmicas. Algumascaracterísticas apresentadas por esta molécula, tais como amplo espectroantifúngico, atividade fungicida e raros episódios de resistência, contribuempara o sucesso clínico desta droga. Porém, a anfotericina B apresenta sériosefeitos toxicológicos. Esses efeitos são comumente classificados em agudos,acompanhados por febre, vômito e dores de cabeça, ou subagudos,caracterizado por insuficiência renal (Ostrosky-Zeichner1 L. e col., AmphotericinB: time for a new "gold standard" Clin Infect Dis. 1;37(3):415-25, 2003).

As diversas composições medicamentosas usadas em diferentesmodalidades terapêuticas para a Pbmicose disponíveis atualmente diminuem aquantidade de fungos no organismo, permitindo a recuperação da imunidadecelular, restabelecendo o equilíbrio entre parasita e o hospedeiro, obtendo-seassim uma "cura aparente", impossibilitando a erradicação do Paracoccidioidesbrasiliensis (Pb) (Shikanai-Yasuda, M. A, e col., Guidelines inparacoccidioidmycosis Rev Soc Bras Med Trop. May-Jun; 39(3):297-310, 2006).

O que motivou a presente invenção foi o fato do Brasil ser o país queapresenta o maior número de casos registrados desta micose e as formulaçõesmedicamentosas utilizadas para o seu controle não estarem baseadas na curacompleta ou verdadeira dessa doença. Dessa maneira, a procura por umanova alternativa de controle, que fosse mais segura e mais eficaz, objetivou apresente invenção, a qual está baseada na utilização de uma construção deDNA contendo o gene da proteína de choque térmico de micobactéria,principalmente a HSP65 no preparo de uma composição medicamentosa oubiofármaco a ser usada para a prevenção, tratamento e/ou cura de micoses emseres humanos e animais, devido suas propriedades imunogênica eimunoterapêutica contra a infecção e/ou doença já estabelecida. Além disso, oefeito antifúngico deste agente terapêutico gênico plasmidial mostra ser amplo,tornando-o indicado para o controle de outras micoses e/ou doenças causadaspor fungos, como por exemplo, Candidíase, Histoplasmose, Coccidioidomicose,Blastomicose, Sporotricose, Cryptococose, Aspergilose, o que ampliada suaaplicabilidade em formulações medicamentosas destinadas ao tratamento deum número significativo de pacientes com infecções fúngicas tanto no Brasilcomo no mundo.

O principal problema relacionado com o uso de uma formulaçãomedicamentosa no tratamento da Pbmicose é a "cura aparente", no qual asdrogas utilizadas no combate do Pb diminuem a quantidade de fungos noorganismo, permitindo a recuperação da imunidade celular e restabelecendo oequilíbrio entre parasita e o hospedeiro, não ocorrendo, entretanto, aerradicação do Pb, conforme descrito anteriormente.

Outro problema relacionado ao controle de Pb está na ocorrência decasos onde se observa uma adaptação do fungo ao organismo, o qual nãodesenvolve a doença mesmo estando infectado (Pbmicose infecção). Ainfecção por Pb, normalmente, se estabelece após a inalação de conídios e,quando estes pequenos propágulos atingem os pulmões, encontram umatemperatura capaz de induzir a sua transformação para a fase de levedura,ocasionando a doença. O fungo uma vez dentro do macrófago (células comalto poder microbicida), tem a habilidade de sobreviver e crescer no seuinterior. O sistema de defesa imunitário do homem toma conhecimento dapresença dos fungos e estabelece uma resposta contra os mesmos,caracterizada por uma reação inflamatória crônica denominada granuloma, eque tem a finalidade de circunscrever e delimitar a infecção. Nessas condições,o Pb pode sobreviver por anos em estado de latência e o indivíduo infectadopode não manifestar a doença, o que caracteriza o caso da Pbmicose infecção,citada anteriormente. A doença se manifesta quando há um desequilíbrio dessarelação mútua e freqüentemente está associada com estados de depressão daresposta imunológica. Casos de imunossupressão estão associados aindivíduos com AIDS, alcoólatras e desnutridos, entre outros.

De maneira geral, durante a infecção com Pb, o sistema imunológicodos animais fica alterado e não responde de maneira apropriada contra oagente agressor, permitindo o crescimento do fungo e o estabelecimento dadoença. Nessas condições estabelecidas pela presença do Pb, a utilização denovas formulações medicamentosas e novos procedimentos terapêuticos,através da administração de imunomoduladores, permitiria uma mudança namodulação na resposta imunológica, criando condições para que o próprioindivíduo ou hospedeiro combata o Pb, controlando a infecção, mesmo sem aadministração de outros antifúngicos.

Dessa maneira o controle dos fungos latentes (Pbmicose doença) oudormentes (Pbmicose infecção) pela terapia gênica baseadas no uso deformulações medicamentosas contendo construções de DNA plasmidial ocorre,pois a produção de antígenos é continuada pelas células de memória dosistema imunológico do hospedeiro e, portanto, a terapia proposta pelo uso dapresente invenção pode trazer benefícios significativos para o controle daPbmicose1 assim como para doenças fúngicas em geral.

Atualmente, a fisiopatologia da Pbmicose não é totalmentecompreendida. Conseqüentemente, o prognóstico dos pacientes é deficiente eos medicamentos disponíveis são insatisfatórios. A necessidade de novasopções terapêuticas para Pbmicose, inclusive o uso de imunomoduladores,como é o caso da presente invenção, é um consenso entre os micologistas epneumologistas. Terapia gênica utilizada somente como prevenção da infecçãoou contra a instalação da doença, foi descrita recentemente utilizando o geneda gp43 em formulações vacinais (Pinto, A. R.e col. DNA-based vaccinationagainst murine Paracoccidioidomycosis using the gp43 gene fromParacoccidioides brasiliensis. Vaccine 18: 3050-3058, 2000). A vacina de DNAcontendo o gene da gp43 apesar de conferir a proteção ao hospedeiroinfectado com o Pb e reduzir a carga fúngica, não apresentou um padrão Th1claramente definido (Pinto, A. R. e col., DNA-based vaccination against murineParacoccidioidomycosis using the gp43 gene from Paraeoceidioidesbrasiliensis. Vaeeine 18: 3050-3058, 2000).

Dentre os principais imunomoduladores com possíveis aplicaçõesem formulações medicamentosas na clínica humana e animal estão asproteínas de choque térmico (HSPs). As HSPs são moléculas intracelularesproduzidas por eucariotos e procariotos e que funcionam como chaperonasmoleculares em muitos processos bioquímicos, como enovelamento etransporte de proteínas, tráfego de peptídeos e processamento de antígenosob condições fisiológicas e de estresse (Manjili, Μ. H. e col., Câncerimmunotherapy and heat-shock proteins: promises and challenges. ExpertOpinion on Biologieal Therapy, 4:363-373, 2004). As HSPs são proteínas devários pesos moleculares, sendo as principais exemplificadas por HSP20,HSP60, HSP65-68, HSP70, HSP90, HSP110 KDa, entre outras. Algumasdessas HSPs são potentes imunomoduladores, indutoras de imunidade inata ede imunidade antígeno-específica. As HSPs ativam parcialmente célulasdendríticas através de receptores do tipo "tool-like", ativam células natural"killer", aumentam a apresentação de antígenos a células efetoras e a respostaimune humoral e celular. Elas funcionam como "sinal de alerta" que prima porrotas de defesa no hospedeiro e essa função é explorada no desenvolvimentode vacinas para câncer e infecções (Todryk, S. M. e col., Heat shock proteinsrefine the danger theory. Immunology, 99:334-337, 2000).

Durante uma infecção, patógeno e hospedeiro aumentamsignificantemente suas sínteses de HSPs para se protegerem contra o estresseimposto pelo outro. Em analogia com respostas de célula B a auto-antígenos, épossível predizer que células T reativas a HSP, como células Tespecificamente reconhecendo HSP65, também sejam envolvidas de modobenéfico na resolução de inflamação por remoção de células estressadas.

A ativação de células dendríticas é necessária para o início daresposta imune primária e secundária, induzidas por compostos presentes empatógenos, como DNA, peptídeos, lipídeos ou açúcares, etc., ou por sinaisendógenos prejudiciais liberados por tecidos sob estresse ou necrose.

Exemplos de sinais endógenos prejudiciais incluem HSPs, nucleotídeos,intermediários reativos de oxigênio, produtos de decomposição da matrizextracelular, neuromediadores e citocinas (como interferons) (Gallucci, S. eMatzinger P. Danger signals: SOS to the immune system. Current Opinion inImmunology, 13:114-119, 2001; Matzinger, P. Tolerance, danger and theextended family. Annual Review of Immunology, 12:991-1045,1994).

Embora as HSPs derivadas de patógenos possam facilitar asobrevida do patógeno no hospedeiro e aumentar a virulência, algumas atuamtambém como imunoestimulantes no hospedeiro. A HSP70 derivada deToxoplasma gondii induz maturação de células dendríticas e estimula aresposta de IL-12 (Kang, Η. K. e col. Toxoplasma gondii-derived heat shockprotein 70 stimulates the maturation of human monocyte-derived dendritic cells.Biochemical and Biophysical Research Communication, 322:899-904, 2004). AHSP60 foi identificada como um Iigante no fungo Histoplasma capsulatum emedia a ligação a receptores CD18 em macrófagos humanos (Long, Κ. H. ecol., Identification of heat shock protein 60 as the Iigand on Histoplasmacapsulatum (Η. capsulatum) that mediates binding to CD18 receptors on humanmacrophages. Journal of Immunology, 170:487-494, 2003). A imunização decamundongos com HSP60 recombinante de H. capsulatum conferiu proteção aum subseqüente desafio por esse fungo (Scheckelhoff, M. e Deepe1 G.S. Jr.,The protective immune response to heat shock protein 60 of H. capsulatum ismediated by a subset of V 8.1/8. 2+ T cells. Journal of Immunology, 169:5818-5826, 2002).

Para manter a homeostasia celular sob condições fisiológicas eestresse, algumas HSPs têm sido empregadas como adjuvantes em vacinaspara câncer e doenças infecciosas. Os membros das famílias HSP70 e HSP60são os principais alvos de constituições medicamentosas para a produção deanticorpos em muitas infecções por helmintos, protozoários e bactérias.

Segundo Lussow e colaboradores (Lussow, A. R. e col.,Mycobacterial heat-shock proteins as carrier molecules. European Journal ofImmunology, 21:2297-2302, 1991) a HSP micobacteriana de 65 KDa (GroEL-tipo) e de 70 KDa (tipo DnaK) atuam como moléculas carreadoras em animais,primados com Mycobacterium bovis (bacillus Calmette-Guerin, BCG), para aindução de altos e duradouros títulos de anticorpos contra o peptídeo sintéticoda malária (NANP)40 na ausência de adjuvantes ou estímulo prévio com BCG.

O efeito da HSP70 foi dependente de célula T, sendo que nenhum anticorpoantipeptídeo ou anti HSP70 foram induzidos em camundongos atímicos(nú/nú). As HSP65 e HSP70 apresentaram função também carreadora paraoligossacarídeos de meningococo do grupo C na ausência de adjuvantes.

Estes dados indicam ser bastante promissora a possibilidade de uso dessasHSPs para indução de anticorpos no desenho e vacinas para uso em humanos(Barrios, C. e col., Mycobacterial heat-shock proteins as carrier molecules. II:The Use of the 70KDa mycobacterial Heat-shock proteins as carrier forconjugated vaccines can circumvent the need for adjuvants and BacillusCalmette Guerin priming. European Journal of Immunology, 22:1365-1372, 1992).

Vários pedidos de patentes depositados no Brasil ou patentesconcedidas no exterior, e mesmo notificações internacionais, mostram quediversas formulações medicamentosas contendo HSPs1 naturais ourecombinantes, atuam como imunomoduladores para diferentes enfermidades:doenças inflamatórias (PI9907228); câncer (W003/090687, W002/32923,CN1522762, US20016328957, W099/07860, US2003082136 e US6734173);doenças infecciosas (W002/062959 e CN1737147). Formulações contendoHSPs suprimem a replicação do vírus da síndrome da imunodeficiênciaadquirida e do vírus da imunodeficiência símia (W001/45738, US6900035,US6524825 e W098/23735); e ainda formam complexos com peptídeosimunogênicos induzindo resposta peptídeo específica aumentada(W097/06821, US6773707 e US6605464); além de atuarem em doençasautoimunes (US6007821 e EP262710) e diabetes (W90/10449). Outro aspectoimportante envolvendo formulações contendo HSPs é descrito na patenteamericana US5993803, relatando que quando HSP60, ou peptídeos e/ou seusanálogos são administrados em pacientes antes do transplante de órgãos outecidos, a autoimunidade à HSP60 é modulada, resultando em prevenção ousupressão da rejeição do órgão ou tecido.

As HSPs também podem ser empregadas em métodos ecomposições medicamentosas para tratamento de desordens vasculares emmamíferos. Um dos procedimentos consiste na administração dessascomposições contendo um ou mais agentes do grupo de HSP, um fragmentoou análogo terapeuticamente efetivo de HSP em uma forma adequada paraadministração na mucosa. Normalmente, as proteínas usadas são a HSP65micobacteriana, a HSP60 humana ou a HSP60 de Clamidea. Tal método podetambém ser usado para tratar a aterosclerose, conforme descrito na patenteamericana US6812205.

Na última década, os avanços na tecnologia de desenvolvimento devacinas permitiram a introdução de novas técnicas para a obtenção e produçãode antígenos. Novas formas de administração e apresentação de antígenospara as células do sistema imune vêm sendo desenvolvidas pela técnica,sendo uma das mais promissoras, as vacinas de ácido desoxirribonucléico(DNA).As vacinas de DNA consistem de um DNA plasmidial codificandouma proteína antigênica ou imunomoduladora, como as HSPs, clonado em umplasmídeo bacteriano (molécula de DNA circular que se replica separadamentedo cromossomo bacteriano) e que apresenta grande potencial como agentesprofiláticos e/ou terapêuticos.

A imunização com vacina de DNA resulta na transfecção de célulasdo hospedeiro com conseqüente produção endógena do antígeno. Essavacinação pode ser realizada em várias espécies de animais, por diversas viase esquemas de administração. Além da injeção intramuscular que é a via maisutilizada, as vacinas gênicas também podem ser usadas por via intranasal, naforma de aerossol, por via oral ou por via intradérmica, através dobombardeamento de micropartículas de ouro recobertas com o materialgenético (Lima, Κ. M. e col., Comparison of different delivery systems ofvaccination for the induction of protection against tuberculosis in mice. Vaccine,19:3518-3525, 2001; Lima, Κ. M. e col., Single dose of a vaccine based on DNAencoding mycobacterial hsp65 protein plus TDM-Ioaded PLGA microspheresprotects mice against a virulent strain of Mycobacterium tuberculosis. GeneTherapy1 10:678-685, 2003).

As Vacinas de DNA têm representado uma nova abordagem paraimunoprofilaxia de doenças. Após injeção intramuscular de um vetor plasmidial,o DNA é capturado pelas células musculares permitindo expressão do antígenocodificado. Após injeção única ou doses múltiplas de DNA uma resposta imunecelular e humoral é desencadeada e linfócitos de memória são induzidos.

As Vacinas de DNA carreando genes das HSPs são capazes deinduzir imunidade humoral e celular e exibir atividade imunomoduladora pelaindução de liberação de mediadores imunológicos como as citocinas equimiocinas. Uma vantagem adicional das vacinas gênicas é permitir a síntesede antígenos endógenos com características estruturais muito semelhantes àmolécula nativa sintetizada pelo patógeno, criando epítopos conformacionais,necessários para indução de respostas imunes mais efetivas. A imunidadeadquirida persiste por longos períodos de tempo devido à constante produçãodo antígeno dentro da célula hospedeira e à capacidade destes estimularemlinfócitos da memória imunológica. Além disso, as vacinas de DNA são de fácilmanejo e estocagem, o que reduz os custos de sua distribuição (Gurunathan,S. e col., DNA vaccines: immunology, application, and optimization. AnnualReview of Immunology, 18: 927-974, 2000).

O pedido de patente americano US2005197306 descreve umavacina de DNA para tratamento de doenças inflamatórias autoimunesmediadas por células Τ. A vacina emprega uma construção recombinante deuma seqüência de ácidos nucléicos codificando a HSP60, HSP70 ou HSP90 demamíferos ou um fragmento ativo das mesmas.

A vacina de DNA contendo peptídeos hCG C-terminal carreadospela HSP65 induz a produção de anticorpos e inibe o crescimento de tumoresem animais (Yi, H. e col., Improved efficacy of DNA vaccination against breastcâncer by boosting with the repeat beta-hCG C-terminal peptide carried bymycobacterial heat-shock protein HSP65. Vaccine, 24:2575-2584, 2006).

Os Vetores de DNA contendo antígeno de Mycobacteriumtuberculosis rico em alanina-proli856300000028 256200093100707000012807. 155706739655na (Apa), e antígenos micobacterianos Hsp65 eHsp70 combinados com BCG induziram imunidade mais forte e conferirammaior proteção que BCG isolado em tuberculose em camundongos (Ferraz,J.C. e col., A heterologous DNA pümmg-Mycobacterium bovis BCG boostingimmunization strategy using mycobacterial Hsp70, Hsp65, and Apa antigensimproves protection against tuberculosis in mice. Infection and Immunity,72:6945-6950, 2004).

Uma associação de vacina de DNA expressando HSP65 e a citocinaIL-12 protegeu animais contra infecção pelo Mycobacterium tuberculosis,provavelmente, pelo aumento da secreção de IFN-γ pelas células T, ativaçãode células T proliferativas e produção de citocinas (IFN-γ e IL-12) (Yoshida, S1 ecol., DNA vaccine using hemagglutinating virus of Japan-Iiposomeencapsulating combination encoding mycobacterial heat shock protein 65 andinterleukin-12 confers protection against Mycobaeterium tuberculosis by T cellactivation. Vaccine, 24:1191-1204, 2006; Kita, Y. e col., Novel recombinantBCG and DNA-vaccination against tuberculosis in a cynomolgus monkeymodel. Vaccine, 23:2132-2135, 2005).

A patente americana US6492145 propõe que infecçõesmicobacterianas sejam evitadas pela imunização de mamíferos, incluindo ohomem, com uma vacina que emprega a tecnologia do DNA recombinante,utilizando a HSP65 de Mycobacterium Ieprae (M. leprae) como antígeno. Avacina contém uma quantidade efetiva de uma construção de DNA "nú"codificando para a HSP65 de Mycobacterium tuberculosis, M. Ieprae ouMycobacterium bovis. O DNA está ligado a um promotor capaz de expressaressa seqüência em células de hospedeiros mamíferos resultando em respostaimunogênica. A diferença apresentada para a presente invenção está no usode formulação medicamentosa ou vacinai capaz de controlar doençascausadas por fungos, não sendo restrito somente ao controle de doençascausadas por micobactérias patogênicas. Neste mesmo ponto de vista técnico,a patente PI0003132-1 descreve imunomoduladores codificando diferentesHSPs de bactérias do gênero Mycobacterium, principalmente as espécies M.tuberculosis, M. Ieprae ou M. bovis, incluindo uma composição farmacêuticaque os contêm e suas aplicações no tratamento de várias doenças, entre elasmicobacterioses concomitantemente e micobacterioses atípicas.

Os imunomoduladores de interesse para o presente invento,principalmente o DNA-HSP65 de M. Leprae, já foram protegidos na patentePI0003132-1. Assim, o presente pedido de patente se refere a aplicação ouutilização desses imunomoduladores, preferencialmente o DNA-HSP65 de M.Leprae em formulações medicamentosas/vacinais para o tratamento de outrostipos de infecção, especificamente as causadas por fungos e não mais pormicobactérias. Vale ressaltar que a patente PI0003132-1 não apresenta dadosexpandidos a nenhuma micose ou a nenhum tipo de infecção causada porfungos.

O interesse em expandir a aplicação da vacina a base dessesimunomoduladores, principalmente a de DNA-HSP65 em outros modelos deinfecções, como as micoses, foi a grande motivação da pesquisa quefundamenta o presente pedido de patente, quando foi demonstrado o papelimunomodular dessas construções de DNA1 especialmente para tuberculose(PI0003132-1), que são doenças que acometem órgãos vitais como o pulmão.

O efeito profilático e terapêutico de uma vacina ou biofármaco a base de DNA-HSP65 para o tratamento de tuberculose também foi constatado a partir demodelo murino contaminados por esta doença (Lowrie, D. B. e col., Therapy oftuberculosis in mice by DNA vaccination. Nature, 400:269-271, 1999; Lowrie, D.B. e col., DNA vaccines against tuberculosis. Immunology and Cell Biology,75:591-594, 1997; Silva, C. L., New vaccines against tuberculosis. BrazilianJournal of Medicai and Biological Research, 28:843-851, 1995; e Lowrie, D. B. e col., Towards a DNA vaccine against tuberculosis. Vaccine, 12:1537-1540, 1994).

O fato de uma vacina especialmente elaborada para tratartuberculose, ser também usada para o tratamento de Pbmicose, sugeri ummesmo mecanismo de ação para o controle de ambas as doenças. Porém,sabemos que as HSPs atuam nos organismos de maneiras diferentes, nãoapenas de forma direta mas também como adjuvante, percorrendo outras vias.

Existem alguns indícios desses mecanismos serem diferentes, além do fato dese tratarem de patógenos distintos (tuberculose-micobactérias e micosefungos).

Apesar do mecanismo para o controle de micoses ainda não estartotalmente elucidado, sabe-se que a proteína de choque térmico (HSP65)micobacteriana induz diferentes tipos de resposta imune dependendo da formade administração (Lima, K.M. e col. Vaccine adjuvant: it makes the difference.

Vaccine, 22:2374-2379, 2004) e o mecanismo de controle da infecção pareceestar fortemente ligado ao tipo de patógeno (bactéria ou fungo) sobre aresposta imune dos indivíduos provocada por tais construções de DNA,sobretudo as contendo o gene da proteína de choque térmico HSP65 demicobactéria, principalmente M. Leprae.

A Resposta imune pode também ser desencadeada em hospedeirovacinado com formulações contendo um antígeno de interesse ou o vetorgênico que o codifica. Uma composição na forma de microesferas decopolímeros derivados do ácido láctico e do ácido glicólico encapsulandoantígenos, vetores gênicos e/ou adjuvantes estimuladores da resposta imuneobtidos de frações de micobactérias foi descrita no pedido de patente brasileiroPI0103887-7. Nela1 é empregado o dimicolato de trealose associado a HSP65de Mycobacterium Ieprae ou ao plasmídeo contendo o gene que a codificaencapsulados em microesferas. Após a administração de dose única oumúltipla, essa vacina de liberação controlada induziu a secreção de citocinasimplicadas na proteção de doenças infecciosas.

Também é conhecido que a resposta imune e proteção, decorrentesda ação da vacina de DNA-HSP65 são desencadeadas pela HSP65 econtroladas por linfócitos T que produzem interferon-γ (IFN-γ) e são citotóxicos(Silva, C. L. e Lowrie, D. B., Enhancement of immunocompetence intuberculosis by DNA vaccination. Vaccine, 18:1712-1716, 2000; Silva, C. L. ecol., Characterization of T cells that confer a high degree of protective immunityagainst tuberculosis in mice after vaccination with tumor cells expressingmycobacterial hsp65. Infection and Immunity, 64:2400-2407, 1996). Avacinação dos animais estimulou a ativação de células do pulmão CD8+, IFN-γ,TNF-α e redução da injúria pulmonar (Bonato, V. L. e col., Immune regulatoryeffect of pHSP65 DNA therapy in pulmonary tuberculosis: activation of CD8+cells, interferon-gamma recovery and reduction of Iung injury. Immunology,113:130-138,2004).

Camundongos infectados com Myeobaeterium tuberculosis e quereceberam o DNA-HSP65 oito semanas após a infecção apresentaram reduçãoda população bacteriana no baço e no pulmão em comparação aos gruposcontroles que receberam salina, plasmídeo ou BCG. No grupo que recebeuDNA-HSP65 também se observou um predomínio de resposta imune do tipoTh1 em relação aos outros grupos (Lowrie, D. R. e col., Therapy of tuberculosisin mice by DNA vaccination. Nature, 400:269-271, 1999).

O mesmo agente gênico DNA-HSP65 também aumentou a atividadeanti-micobacteriana da isoniazida em associação com pirazinamida e foi efetivoem prevenir a reativação da tuberculose latente (Silva, C. L. e col.,Immunotherapy with plasmid DNA encoding mycobacterial hsp65 in associationwith chemotherapy is a more rapid and efficient form of treatment fortuberculosis in mice. Gene Therapy, 12:281-287, 2005). Esse dado demonstraque a vacina pode ser efetiva como adjuvante ou biofármaco, durante ou apósa quimioterapia para prevenir o desenvolvimento de doenças.

A administração intramuscular do DNA-HSP65 seguida pela infecçãocom Mycobacterium tuberculosis, leva a um aumento do número das células Treativas contra a HSP65. Esse aumento ocorre às custas tanto de célulasCD4+/CD8" como também de células CD4~/CD8+. A imunização com DNA-HSP65 leva ainda a um aumento das células T esplênicas que expressam ofenótipo CD44hl, um marcador associado a respostas do tipo Th1. As célulasreativas contra HSP65 provenientes de animais imunizados produzem níveiselevados de IFN-yindependentemente do seu fenótipo. Por outro lado, oslinfócitos de animais não vacinados respondem in vitro aos estímulos comHSP65 produzindo predominantemente IL-4. A administração do DNA-HSP65,oito semanas após a inoculação de bacilos da tuberculose, causa redução donúmero de bacilos nos tecidos e também induz desvio da resposta imune dotipo Th2 para padrão Th1 (Lowrie, D. B e col. Towards a DNA vaccine againsttuberculosis. Vaccine, 12:1537-1540, 1994; Lowrie, D. B e col., Protectionagainst tuberculosis by plasmid DNA. Vaccine, 15: 834-838, 1997; Lowrie, D. Be col., DNA vaccines against tuberculosis. Immunology and Cell Biology,75:591-594, 1997).

Um estudo recente avaliou o efeito do DNA-HSP65 na indução deartrite em linhagens de animais AIRmin e AIRmax que são espécies de animaiscom menor e maior tendência a desenvolver a doença. O DNA, não apenasreduziu as chances de desenvolvimento da inflamação, como também levou aregressão da artrite induzida por pristane nesses roedores (Santos-Júnior, R.R. e col., Immunomodulation and protection induced by DNA-hsp65 vaccinationin an animal model of arthritis. Human Gene Therapy, 16:1338-1345, 2005). Amesma vacina, porém em uma versão encapsulada (microesferas de PLGA),obteve sucesso na imunização de animais infectados com Leishmania major(Coelho, E. A. F. e col., Parasitol Res. 2006 May; 98(6): 568-75. Epub 2006 Jan24).A publicação internacional W095/25744 descreve o uso depeptídeos de HSP65 de Mycobacterium tuberculosis utilizados para preparaçãode uma composição medicamentosa para tratamento e prevenção de doençasinflamatórias incluindo doenças autoimunes, diabetes, doenças artríticas,aterosclerose, esclerose múltipla, miastenia grave ou resposta inflamatóriadevido a tumores ou rejeição de transplante.

Conforme consta no estado da técnica, o DNA-HSP65 promove umdesvio da resposta imune frente à tuberculose, de um padrão Th2 para Th1.Esse padrão de resposta foi caracterizado em camundongos, inclusive, poracentuadas elevações da produção de IFN-γ por clones celulares específicos(Lowrie, D. B. e col. Therapy of tuberculosis in mice by DNA vaccination.Nature, 400:269-271,1999; Silva, C. L. e col., Characterization of thememory/activated T cells that mediate the Iong-Iived host response againsttuberculosis after bacillus Calmette-Guérin, or DNA vaccination. Immunology97:573-58,1999; Bonato, V. L. e col., Identification and characterization ofprotective T cells in hsp65 DNA-vaccinated and Mycobacterium tuberculosis-infected mice. Infection and Immunity, 66:169-175,1998). Esse padrão demudança de resposta imune de Th2 para Th1 pode ser fundamental para otratamento de doença intersticial pulmonar (FPI). Este comportamentofundamentou a proposta da presente invenção, baseada no fato de se usaruma composição vacinai já utilizada no tratamento de tuberculose, paraaplicação também no controle de micoses, principalmente a Pbmicose doença,que também acomete este órgão, por se tratar de micose do trato respiratório.

Embora o principal local de atuação desses agentes gênicos seremcomuns para o tratamento de doenças causadas por micobactérias, não éesperada uma correlação direta para o tratamento de doenças causadas pormicroorganismos distintos. O conhecimento da técnica permite que seja maiscomum esperar que o controle de doenças causadas por micobactéria seestabeleça quando as construções de DNA plasmidiais também sejamderivadas de micobactérias, confirmando o caráter inovador da presenteinvenção. Os resultados experimentais apresentados neste pedido de patentecorroboram neste sentido, pois mostram que o mecanismo de controle dainfecção apresenta características distintas, estando fortemente ligado ao tipode patógeno (bactéria ou fungo) sobre a resposta imune dos indivíduosprovocada por tais construções de DNA, sobretudo as contendo o gene daproteína de choque térmico HSP65 de micobactéria, principalmente M. Leprae,conforme discutido nos Exemplos 6 a 9.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

As construções plasmidiais contendo genes das proteínas dechoque térmico de micobactéria, formando os imunomoduladores de interessepara a presente invenção foram descritos no pedido de patente PI0003132-1.

As micobactérias envolvidas são do gênero Mycobacterium, principalmente asespécies M. tuberculosis, M. Ieprae ou M. bovis BCG e os imunoduladoresobtidos codificam proteínas de estresse micobacteriana de diferentestamanhos, tais como a HSP10 (10 KDa), HSP65 (65 KDa), HSP70 (70 KDa).

Tais imunomoduladores e suas variações, incluindo uma composiçãofarmacêutica que os contêm e suas aplicações no tratamento de várias dedoenças causadas por micobactérias, principalmente a tuberculose, foramreivindicadas.

Portanto, o presente pedido de patente se refere ao segundo uso demedicamento, pois está baseado nos mesmos materiais genéticos e suasderivações previstas na patente mencionada anteriormente como constituintede formulação medicamentosa/vacinai para o controle de micoses, que sãodoenças causadas por fungos. Este controle envolve os processos deprofilaxia (imunização), tratamento e/ou cura de infecções fúngicas,principalmente as causadas pelo gênero Paracoccidioides, principalmente aespécie Paracoccidioides brasiliensis em seres humanos e animais. Valeressaltar que nenhuma menção ao controle de micoses foi abordada nestepedido de patente usado como referência (PI000.3132-1).

O imunomodulador preferencial para a aplicação proposta napresente invenção, se refere à construção plasmidial expressando HSP65 deM. Leprae. Esse imunomodulador (DNAhsp65 de M. Leprae ou simplesmenteDNA-HSP65) é representado pela seqüência Seq. ID N2 1, conforme descritona Listagem de Seqüências em anexo. Para a sua recuperação no NCBI(National Center for Biotechnology Information) - busca via Pubmed, o códigode acesso é: gi I 149923 I gb I M 14341.1 I MSGANTM [ 149923 ],correspondendo a M14341 (GI: 149923 para M. Ieprae 65 kd antigen).

Os demais imunomoduladores que também apresentam atividadeimunogênica nos tecidos pulmonares foram igualmente protegidos no pedidode patente PI0003132-1. Estas construções de DNA plasmidial também podemser usados em formulações medicamentosas/vacinais para o controle demicoses. Eles estão listados na Tabela 1, juntamente com os códigos deacesso no NCBI e de sequenciamento na Listagem em anexo.

A presente invenção relata sobre formulações medicamentosascontendo tais imunomoduladores, para a imunização e tratamento de micoses,exemplificada pelo controle de Pbmicose1 principalmente para um biofármaco abase de DNA-HSP65 de M. leprae. Este modelo de micose foi desenvolvido emcamundongos Balb/c.

TABELA 1

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Para avaliação do efeito imunogênico e terapêutico foram realizadasanálises histopatológicas, quantificação fúngica pulmonar nos animaisinfectados, dosagens de citocinas Interferon-gama (IFN-γ), fator de necrosetumoral alfa (TNF-α), IL-10, IL-12 e IL-4 e avaliação do conteúdo de anticorposespecíficos para este modelo de infeção/tratamento. Os dados foramcomparados com os resultados obtidos nas mesmas condições para grupo deanimais normais e tratados com apenas o vetor plasmidial vazio. Ressaltandoque imunomodulador usado (Seq. ID Ns 1) apresenta os resultadosexperimentais para a construção plasmidial pVAX1m-hsp65 de M. Leprae.

A invenção poderá ser melhor compreendida através da seguintedescrição detalhada mediante os Exemplos de 1 a 9 para os resultadosexperimentais obtidos, os quais são apresentados nas Figuras de 1 a 8, asquais são apresentadas a seguir, juntamente com o significado de algunstermos relevantes. Os procedimentos experimentais envolvidos estãodetalhados em cada um dos Exemplos.

A Figura 1 representa o esquema terapêutico apresentado parareproduzir a Pbmicose. Foram usados 40 camundongos Balb/c, divididos emquatro grupos experimentais de 10 indivíduos cada: Normais, SACAROSE,ρVAXIm e pVAX1m-hsp65 de M. leprae. Todos os experimentos foramrepetidos três vezes, de forma independente, utilizando diferentes lotes doplasmídeo e de animais. A análise da variância (ANOVA) e o método deDunnet foram realizados pelo programa estatístico GraphPad Prism versão 3.0,GraphPad Software, San Diego, Califórnia, USA.

A Figura 2 representa a carga fúngica pulmonar recuperada deanimais infectados com P. brasiliensis (3x107 células) e tratados com 4 dosesde Sacarose ou pVAX1 ou pVAX1-hsp65. O intervalo entre as doses foi de 15dias. O resultado foi expresso unidades formadoras de colônias/grama detecido pulmonar. A presença do * indica o desvio padrão (p < 0,01).

A Figura 3 corresponde a imagens em microscópio óptico deamostras de tecido pulmonar com 5mm de espessura e previamente tratados ecorados por hematoxixilina-eosina (HE), para os sequintes gruposexperimentais: (A) e (B) animal infectado com P. brasiliensis e tratado com 4doses da formulação contendo o vetor vazio (pVAX1); (C) e (D) animalinfectado com P. brasiliensis e tratado com 4 doses da formulação contendo obiofármaco pVAX1-hsp65. As setas indicam: (1) a presença de granulomaepitelióide; e (2) um agregado linfohistiocitário com menor número deleveduras, sem presença de granuloma epitelióide. A imagem foi aumentada20x em (A) e (C); e 40x em (B) e (D).A Figura 4 mostra a dosagem de citocinas padrão Th 1 pelo métodode ELISA em pg/ml para os quatro grupos experimentais utilizados,correspondendo a: (A) TNF α (Fator de necrose tumoral alfa ), (B) IFN gama(Interferon gama) e (C) IL-12 (interleucina 12). A presença do * indica o desviopadrão (p < 0,01).

A Figura 5 corresponde aos gráficos da quantidade de citocinaspadrão Th2 em pg/ml para os quatro grupos experimentais analisados,correspondendo a: (A) IL-4 (interleucina 4) e (B) IL-10 (interleucina 10).

A Figura 6 representa a análise da capacidade de proliferação deesplenócitos (células do baço) dos 4 grupos experimentais na presença ouausência de estímulos como: meio de cultura (RPM), Concanavalina A (ConA)e phitohemaglutinina (PHIT). Animais normais são aqueles que não foraminfectados com P. brasiliensis nem tratados com nenhuma formulação. Osanimais infectados com P. brasiliensis foram tratados com sacarose ou com ovetor vazio (pVAX1) ou com o biofármaco pVAX1-hsp65. A presença do *indica o desvio padrão (p < 0,01).

A Figura 7 representa a dosagem de NO2" e NO3" para os quatrogrupos experimentais analisados (Normais, Sacarose, pVAX1 e pVAX1-hsp65),sendo: (A) dosagem de NO3" e (B) dosagem de NO2". Os resultados foramexpressos em μΜ. A presença do * indica o desvio padrão (p < 0,01).

A Figura 8 corresponde a dosagem de imunoglobulinas (lgG1 elgG2a) para os quatro grupos experimentais analisados (normais, sacarose,pVAX1 e pVAX1-hsp65). A leitura foi realizada com absorbância em 492 nm. Apresença do * indica o desvio padrão (p < 0,01).

O termo "biofármaco" usado nessa invenção se refere a umaformulação medicamentosa/vacinai que contém a composição plasmidial deDNA capaz de apresentar atividade imunogênica (prevenção/imunização) eimunoterapêutica (tratamento) de micoses. Um plasmídeo normalmente contémum gene e outros elementos responsáveis pela expressão do produto desse gene.O termo "citocina" tem o mesmo significado que normalmente éempregado no estado da arte, ou seja, se refere a um sinal ou mediadorquímico intra ou intercelular.

O termo "maior produção de uma ou mais citocinas" se refere aoaumento da produção de uma ou mais citocinas por uma célula quando emcontato com a proteína de choque térmico HSP expressa pelo respectivo DNA.O aumento da produção de uma ou mais citocinas pode ser o resultado damaior expressão de genes codificando quimiocina, ou talvez o resultado daliberação de quimiocinas da célula.

As diferentes formulações medicamentosas aplicadas às maisdiversas modalidades terapêuticas para a Pbmicose disponíveis atualmenteapresentam vantagens tais como o amplo espectro antifúngico e os rarosepisódios de resistência (anfotericina B). Porém, os efeitos colaterais etoxicológicos são freqüentes e os pacientes são submetidos a longos períodosde tratamento o que leva a desistência e possíveis recidivas das micoses(tratamentos convencionais).

A presente invenção representa uma alternativa de controle dessetipo de doença bastante promissora, pois abrange a prevenção, tratamentoe/ou cura de forma segura e mais eficaz que os resultados alcançados pelo usodas formulações medicamentosas utilizadas nos tratamentos convencionais.Os objetivos da presente invenção foram atingidos de forma bastantesatisfatória, já que os imunomoduladores utilizados (correspondendo a Seq. IDN- 1, com resultados testados para pVAX1-hsp65 de M. leprae) e outrosimunomoduladores conforme descritos anteriormente (representados pelasseqüências de Seq. ID N- 2 a Seq. ID N- 4) apresentam propriedadesimunogênicas e imunoterapêuticas contra a infecção e/ou doença jáestabelecida, sendo estáveis em formulações medicamentosas, principalmentevacinas. Além disso, o biofármaco também pode ser utilizado para o controlede outras micoses, tornando ampliada a sua aplicabilidade para o preparo deinúmeras formulações para o tratamento de um número significativo depacientes com infecções fúngicas.A presente invenção representa a primeira utilização dessesimunomoduladores, principalmente o representado pela seqüência Seq.lD N2 1,em doenças fúngicas, como terapia gênica com grande eficiência,especialmente para Pbmicose. A utilização das formulações propostasapresenta ainda outras vantagens, pois controlam:

- o estabelecimento da doença causada pelo Pb, principalmenteaquelas contendo o imunomodulador descrito na seqüência Seq. ID N- 1;

- além dos casos que apresentam a forma crônica unifocal, controlaa sua forma crônica multifocal e também disseminada desse tipo de infecção;

- a carga fúngica sobrevivente no organismo quando os indivíduoscom Pbmicose não são adequadamente tratados e evita-se uma possívelrecidiva futura;

Além disso, a utilização das formulações propostas, principalmenteas contendo o imunomodulador representado pela seqüência Seq. ID N2 1,atuam no processo que previne a reativação da doença quando o hospedeirocontendo formas latentes do fungo apresenta um estado transitório ou não deimunodepressão.

Os benefícios práticos e estratégicos da utilização dosimunomoduladores utilizados nesta invenção, em formulaçõesmedicamentosas para o tratamento de doenças fúngicas são inúmeros: sãoseguros e eficazes; estimulam amplamente a resposta imunológica; possuemefeito protetor e podem contribuir significativamente para a diminuição daincidência e mesmo erradicação da Pbmicose; o custo de produção em largaescala é relativamente baixo e consiste em uma imunoterapia estável àtemperatura ambiente.

Todos os fatores acima mencionados facilitam o transporte e adistribuição de programas terapêuticos em regiões de difícil acesso/áreas ruraise absolutamente desejáveis no âmbito da realidade brasileira. Além disso, aimunidade adquirida pelo tratamento com a vacina de DNA persiste por longoperíodo de tempo, devido tanto a constante produção do antígeno dentro dacélula hospedeira como a capacidade destes estimularem linfócitos dememória imunológica e, com isso, sendo desnecessárias as re-vacinações(Silva, C. L., etal, Immunology 97:573-581,1999).

Com o objetivo de comprovar o efeito no tratamento de doençasfúngicas proposto na presente invenção, foram realizados testes investigativossobre o controle da Pbmicose (usada como doença modelo). Esta doença foiexperimentalmente desencadeada em animais inoculados com fungoespecífico e posteriormente tratados com o DNA-HSP65 (representado pelaseqüência Seq. ID N2 1 e ilustrado pelos resultados de pVAX1-hsp65) e váriosparâmetros foram avaliados para certificação do efeito. Os exemplos abaixotêm por objetivo melhor elucidar e ilustrar a presente invenção, não devendoservir para efeitos Iimitativos do escopo da mesma.

EXEMPLO 1:

DNA-HSP65 - PREPARO DO PLASMÍDEO

Bactérias Escherichia coli DH5a transformadas com o vetor gênicopVAX1 e com o plasmídeo contendo o gene da HSP65 (pVAX1-hps65) foramcultivadas em meio de cultura Lúria Bertani (LB BROTH Base - GIBCO BRL,Scotland) contendo kanamicina na concentração de 10 a 100 microgramas/mL.Os plasmídeos foram purificados utilizando resinas de troca iônica e deafinidade. A quantificação dos plasmídeos foi feita por espectrofotometria a 260e 280 nm.

EXEMPLO 2:

PRODUÇÃO DO BIOFÁRMACO DNA-HSP65

O DNA-HSP65 foi obtido a partir da clonagem do gene que codificaa proteína de choque térmico de 65 kDa (HSP65) de Mycobacterium leprae, emplasmídeo pVAX1 (Invitrogen®). Para tanto foram empregados plasmídeos queexpressam o promotor do gene precoce imediato do citomegalovirus (CMV), ououtro originário da hidroximetilglutaril-coenzima-A redutase murina (HMG), comresultados semelhantes.

Os plasmídeos clonados foram usados como vacina e obtidos apartir de crescimento em bactérias Eseheriehia coli incubadas em meio decultura Luria Bertani (DIFCO) contendo kanamicina (Cilinon TM) por 8 horas, a37°C, sob agitação a 250 rpm. Após o crescimento, a suspensão de culturabacteriana foi centrifugada e os plasmídeos purificados com sistemas depurificação da marca QIAGEN, conforme especificações do fabricante.

Outras variações incluem a maneira geral de produção dessesimunomoduladores descritos na patente PI0003132-1, referentes aconstruções de ácidos nucléicos compreendendo uma seqüência codificadora,operacionalmente ligadas a um promotor capaz de expressar tais seqüênciascodificadoras em células de hospedeiros mamíferos, podendo ser usadospromotores do tipo CMV e HMG. Além disso, o gene de expressão da proteínade choque térmico de diferentes tamanhos pode se originar de diferentesfontes, sendo de origem bacteriana, de mamíferos ou micobacteriana,principalmente as HSP10, HSP65 e HSP70, preferencialmente a HSP65.

EXEMPLO 3:

TRATAMENTO DOS ANIMAIS INFECTADOS COM Paracoccidioidesbrasiliensis (Pb)

Compreende o controle da infecção e/ou doença causada porfungos, especialmente o Pb, através da administração no hospedeiro de umaquantidade efetiva do agente terapêutico gênico plasmidial. Para avaliar aatividade imunoterapêutica do produto (agente terapêutico gênico plasmidialanteriormente citado) foram conduzidos experimentos murinos obedecendo asnormas do Comitê de Ética do Uso Animal (CEUA) do Instituto de Biologia daUniversidade de Brasília.

Para reproduzir a doença, camundongos Balb/c foram submetidosaos ensaios divididos em quatro grupos experimentais :

1) Dez animais normais, grupo de animais que não foram infectadoscom Pb e nem tratados (Grupo NORMAIS);

2) Dez animais infectados com Pb e tratados apenas com sacarose0,9% (Grupo SACAROSE);

3) Dez animais infectados com Pb e tratados apenas comformulação vacinai contendo apenas o vetor plasmidial vazio (pVAX1) sem oinserto do gene da proteína de choque térmico hsp65 de M Ieprae (GRUPOpVAX1);4) Dez animais infectados com Pb e tratados com a formulaçãovacinai contendo a construção plasmidial pVAX1-hsp65 de M Ieprae (GRUPOpVAX1-hsp65).

A infecção dos camundongos foi realizada com o fungo Pb, isoladoPb18, obtido no Laboratório de Biologia Molecular da Universidade de Brasília.Este isolado foi cultivado em meio de cultura YPD (yeast extract 10g, dextrose20g, peptona bacteriológica 20g, água destilada qsp1 litro) líquido a 36°C emshaker rotatório (220 rpm). Após 5 dias de cultivo todo o meio foi centrifugado a1000 rpm durante cinco minutos. O sedimento de células foi ressuspenso emPBS estéril (pH 7.4) e as células foram contadas. A viabilidade celular foideterminada pelo corante Verde-Janus. Cada animal foi anestesiado com étere inoculado com 100 μί por via endovenosa (retro orbital) de uma suspensãode células na concentração de 3x107 células viáveis/mL. Após 60 dias deinfecção, os camundongos receberam quatro doses de 100 μg total deplasmídeo contendo o gene que codifica a proteína hsp65 do M. Ieprae por viaintramuscular (IM)1 nas duas coxas traseiras (50 μg de DNA por coxa) emintervalos de 15 dias entre cada aplicação. A construção plasmidial foi diluídaem solução de sacarose 0,9%, usando água destilada autoclavada, naproporção de 1:1, ou seja, para cada animal foi feita uma administração(injeção) de 100 μί. de solução de sacarose, contendo 100 μg de DNA divididaem duas aplicações, nas duas coxas traseiras. Após 15 dias da últimaaplicação os camundongos foram sacrificados e a evolução da doença e opadrão de resposta imune gerada foi analisado. O esquema imunoterapêuticoutilizado está mostrado na Figura 1.

EXEMPLO 4:

REDUÇÃO DA CARGA FÚNGICA PULMONAR DOS ANIMAIS INFECTADOSCOM Pb E TRATADOS COM DNA-HSP65

Fragmentos de pulmão dos camundongos foram retirados, pesadose divulsionados em 1 mL de salina tamponada estéril. Cem microlitros destemacerado foram semeados em placas de vidro contendo meio BHI-ágar (Brain-Heart-Infusion,) enriquecido com 5 % (v/v pVAX1) de soro de cavalo, dextrosee 5 % (v/v) de filtrado de cultura de Pb 192 cultivado por 7 dias, necessáriospara o crescimento clonal do Pb. As placas foram incubadas a 37 0C por até 20dias, quando então foram contadas as unidades formadoras de colônia (UFCs).

Os resultados foram expressos em UFC/g de pulmão. As diferenças entre asmédias dos números de UFCs entre os grupos experimentais foram analisadaspelos teste estatístico ANOVA seguido do método Dunnet (pós teste). Oprograma utilizado para estas análises foi o Graphpad Prism versão 3.0,Graphpad Software, San Diego, Califórnia, USA.

Conforme indicam os resultados apresentados na Figura 2, osanimais que foram tratados com a construção plasmidial pVAX1-hsp65 da M.Ieprae apresentaram diferenças significativas em relação à recuperaçãofúngica do macerado pulmonar quando comparados aos grupos dos animaisnormais (sem infecção e sem tratamento), dos animais tratados apenas comsacarose (grupo sacarose) e dos animais tratados com o vetor vazio sem oinserto gênico da hsp65 de M. Ieprae. Os animais que não receberamtratamento apresentaram maior quantidade de UFCs nos pulmões. Arecuperação celular de fungos dos tecidos é um parâmetro importante paradeterminar a eficiência de uma terapia antifúngica (Nishikaku&Burger,Blankophor. J. Evaluation of fungai burden in experimentalparacoccidioidomycosis by using the fluorescent dye Blankophor. ClinMicrobiol. 2003 41(7):3419-22). A formulação vacinai contendo a construçãoplasmidial pVAX1-hsp65 mostrou-se eficiente na recuperação fúngica pulmonarvisto que houve diferença significativa, cerca de 50% de redução fúngicapulmonar, entre o grupo tratado com a construção pVAX1-hsp65 e os animaisinfectados e tratados apenas com a solução de sacarose 0,9% (gruposacarose) e os animais infectados e tratados com o vetor de expressão vaziosem o inserto gênico (grupo pVAX1).

EXEMPLO 5:

ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA PULMONAR DE ANIMAIS INFECTADOSCOM Pb E TRATADOS COM DNA-HSP65

Os animais infectados com Pb foram sacrificados e fragmentos deseus pulmões foram retirados e fixados em formol (10%). Após fixação porperíodo máximo de 8 horas, os fragmentos foram mantidos em álcool 70%(diluído com água destilada) e incluídos em parafina. Cortes de 5 mm deespessura foram corados por hematoxilina-eosina (HE) e examinados emmicroscópio óptico.

Os resultados obtidos confirmam a ação antifúngica proposta napresente invenção e concomitante atividade terapêutica da construçãoplasmidial pVAX1-hsp65.

As Figuras 3A e 3B apresentam superfícies pulmonares comgranuloma epitelióide envolvendo grande quantidade de leveduras de animaisinfectados com Pb (indicado em (1)) e tratados com o vetor de expressãovazio, sem o inserto gênico (grupo experimental pVAX1), respectivamente.

As Figuras 3C e 3D apresentam um agregado linfohistiocitárioenvolvendo algumas leveduras (indicado em (2)), sem presença de granulomaepitelióide. Esse grupo experimental (tratado com a formulação vacinaicontendo a construção plasmidial pVAX1-hsp65) apresentou redução donúmero de levedura nos cortes de tecido pulmonar, confirmando o efeitoprotetor do tratamento para Pbmicose. Os resultados positivos para essadoença fúngica-modelo são expandidas a outras doenças causadas porfungos.

EXEMPLO 6:

AUMENTO DA PRODUÇÃO DE CITOCINAS DE PADRÃO TH1 NOSANIMAIS TRATADOS COM O BIOFÁRMACO DNA-HSP65

Um aumento significativo na produção de citocinas de padrão Th1induzida pela terapia gênica é responsável pelo efeito benéfico emcamundongos infectados com Pb. As citocinas produzidas pelos macrófagos eneutrófilos obtidos da cavidade peritoneal de camundongos foram dosadaspelo método de ELISA. Foram utilizados kits comerciais padronizados paracada grupo de citocinas (BD Biosciences San Diego CA).

Os dados da Figura 4 mostram que os animais previamenteinfectados com Pb e tratados com a formulação vacinai contendo a construçãoplasmidial pVAX1-hsp65 induziu a secreção de citocinas de padrão Th1(TNF-a, IFN-γ e IL-12), criando um ambiente favorável à erradicação do Pb. Osresultados da Figura 5 mostram que não houve aumento significativo nasecreção de citocinas de padrão Th2 (IL-04 e IL-10).

No tratamento para Pbmicose com o biofármaco contendo o DNA-HSP65 está aumentada a liberação de IFN-g, TNF-a e IL-12 (que sãoconsideradas citocinas estimulatórias da resposta imune celular), mas não deIL-4 e IL-10 que são supressoras dessa resposta). Portanto, o padrão deresposta imunológica induzida nos camundongos, pelo tratamento com o genehsp65, foi considerado do tipo Th1, o qual é altamente favorável para aeliminação de agentes infecciosos.

Tanto para tuberculose quanto para Pbmicose o padrão de citocinasTh1 é um padrão ligado a proteção do hospedeiro, ou seja, havendo uma maiorsecreção dessas citocinas após o tratamento. Com o tratamento por meio davacina de DNA-HSP65 é provável que o organismo consiga combater ainfecção, reduzindo ou até curando a doença. Isto está de acordo com osresultados mostrados na Figura 4, onde foi observado um aumentosignificativo na produção de IFN gama nos animais infectados com P.brasiliensis e tratados com o biofármaco (DNA-HSP65, representado pelosresultados de pVAX1-hsp65) em comparação com os animais normais (níveisbasais da citocina), animais infectados e tratados com apenas a sacarose e ovetor vazio (pVAX1). Mesmo havendo acréscimo significativo, os níveis de IFN-gama estão mais baixos quando comparados com os dados encontrados paraanimais imunizados e tratados com o mesmo biofármaco e infectados com M.tuberculosis (patente PI003132). Portanto, esse aumento de IFN- gama é maisacentuado para tuberculose. Embora haja proteção conferida aos animaisinfectados com P. Brasiliensis, como mostram os dados da presente invenção,porém sem níveis muito altos de IFN gama.

Os mecanismos envolvidos no processo de proteção eimunomodulação gerados a partir da administração de HSPs, como a HSP65M. leprae, ainda estão em fase de consolidação, sendo necessários arealização de outros estudos a fim de elucidar completamente essesprocessos. Na tuberculose pode estar ocorrendo de forma predominante opapel da HPS65 e assim é desenvolvida uma resposta imune específicabaseada na estimulação de anticorpos, e linfócitos TCD4 e TCD8 específicos.Na Pbmicose pode estar ocorrendo de forma predominante a atividadeimunoadjuvante e também a atividade chaperonina da HSP65.

EXEMPLO 7:

RECUPERAÇÃO DA CAPACIDADE DE PROLIFERAÇÃO DEESPLENÓCITOS TOTAIS DE ANIMAIS INFECTADOS COM Pb ETRATADOS COM DNA-HSP65

Após o sacrifício, células do baço foram utilizadas em cultura paraavaliar a proliferação celular. As células foram ressuspensas para umaconcentração de 5 χ 106 células/mL. As células foram colocadas em placas de96 poços de fundo chato, em volume de 100 pL das suspensões celulares, emtriplicata. Às células foram adicionados 100 μΙ_ de RPMI contendo o mitógenoinespecífico (Concanavalina A) ou phito- ou fitohemaglutinina (PHIT). Ascélulas foram incubadas por 60 horas a 37°C com 5% de CO2 e 12 horas antesdo término da incubação, 1 pCi de timidina tritiada [3H] TdR (1 mCi/mL) foiadicionada às culturas. Após este período, as células foram coletadas e aincorporação da timidina tritiada foi determinada em pela radiação liberada,medida em contador de cintilação líquida. Os resultados foram expressos emcontagens por minuto (cpm) por 5 χ 105 células.

Segundo os resultados apresentados na Figura 6, os animais dosgrupos experimentais infectados com Pb e tratados com o sacarose 0,9%(sacarose) e o tratado com o vetor de expressão vazio, sem o inserto (pVAX1),apresentaram diminuição da capacidade de proliferação de esplenócitos totaisapós estimulação com Concanavalina A (ConA ) e (PHIT). Diferentemente, osanimais do grupo experimental pVAX1-hsp65 recuperaram, em parte, acapacidade de proliferar. Todos os grupos experimentais foram comparadoscom o grupo normal que corresponde aos animais que não foram neminfectados e nem tratados. Apenas o grupo infectado com P. brasilienis etratado com a construção plasmidial pVAX1-hsp65 não possuiu diferençasignificativa quando comparado estatisticamente. Isto significa que otratamento da Pbmicose em camundongos pela injeção intramuscular direta deDNA-HPS65 de M. Ieprae promove recuperação da capacidade de proliferaçãode esplenócitos totais, não havendo diferença significativa com os animaisnormais (controle), que são animais saudáveis, livres de infecções. Os animaisinfectados com P. brasilienis e tratados com formulações contendo sacarose ouo vetor vazio, ou seja, não contendo o biofármaco, perderam em parte a suacapacidade de proliferação celular, comum em casos de infecções e animaiscom padrão imunológico alterado.

EXEMPLO 8:

PRODUÇÃO DE RADICAIS REATIVOS DO NITROGÊNIO PELOSMACRÓFAGOS ATIVADOS DE ANIMAIS INFECTADOS COM Pb eTRATADOS COM DNA-HSP65

A diminuição da infecção experimental pelo Pb está relacionada coma produção de óxido nítrico (NO), quantificado pela presença de nitrito(sobrenadante de cultura de células) e nitrato (soro) (Bocca, A. L., e col.,Treatment of Paracoccidioides brasiliensis-infected mice with a nitric oxideinhibitor prevents the failure of cell-mediated immune response. J. Immunol.161:3056-3063, 1998). A produção de NO pelos macrófagos é considerada oprincipal mecanismo microbicida, já que os reativos intermediários do oxigênio,também produzidos pelos macrófagos ativados, não são capazes de destruir ofungo (Brummer et al, In vivo and in vitro activation of pulmonary macrophagesby IFN-gamma for enhanced killing of Paracoccidioides brasiliensis orBlastomyces dermatitidis J. Immunol., 140-2786-2789, 1998). O NO decompõe-se espontaneamente em nitritos (NO2) e nitratos (NO3) no meio de cultura e aprodução de NO2" pelos macrófagos pode ser dosada por ensaio colorimétricobaseado na reação de Griess (GREEN, L. C., e col., Nitrate synthesis in thegermfree and conventional rat Science, 212.4490, 56-58, 1981).

Para dosagem foi adicionado aos sobrenadantes o mesmo volumedo reagente de Griess, que continha NEED 0,1% (N-(I-NaphthyI) ethyl-enedinamine e sulfanilamida 1% diluída em ácido fosfórico (H3PO4) a 5%). Areação é revelada e parada por nitrito de sódio e as amostras foram lidas emleitor de ELISA com filtro de 450 nm. Os resultados foram expressos em μιτιοΙ/Lde NO2" por 3 χ 105 células após 24 h de incubação, comparando-se a D.O. doexperimento com a D.O. da curva padrão de NO2", que variou de 3,125 a 200,0μmol/L, com relação ao do experimento (GREEN, L. C., e col., Nitratesynthesis in the germfree and conventional rat Science, 212.4490, 56-58,1981).

A dosagem de NO no soro dos animais foi realizada através deredução enzimática do NO3" em NO2" pela enzima nitrato redutase. Os sorosforam diluídos (1:5 em água destilada em volume) e alíquotas de 50μΙ_ foramincubadas com o mesmo volume do tampão redutase (fosfato de potássio0.1 M, pH 7.5 contendo 1mM NADPH, 10 mM FAD e 4U nitrato redutase /mL)por 12 horas a 37°C. Os dados para construção da curva de nitrato tambémforam nas mesmas condições (incubação com tampão redutase). Aconcentração do nitrito foi determinada pela reação colorimétrica de Griess. Osresultados foram expressos em μΜ de NO3".

As Figuras 7A e 7B mostram os resultados obtidos nas dosagensde NO3" e NO2", respectivamente. O aumento significativo observado naprodução de ambas as espécies do nitrogênio pelos macrófagos ativadosdemonstra que a infecção por Pb está sendo controlada, uma vez que quantomaior a concentração desses ânions, maior é a concentração de NO gerado,que neste caso é o principal responsável pela ação microbicida dosmacrófagos.

EXEMPLO 9:

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS DO TIPO IGg2a

As amostras de soro de todos os grupos experimentais foramutilizadas para a dosagem dos isotipos IgGI e lgG2A por ELISA.

Foram utilizadas placas de ELISA de 96 orifícios (Nunc)sensibilizadas com 100pL de proteína recombinante HSP65(rhsp65 - 250 ng/100pL/orifício) por 12 h a 4°C. Após a primeira incubação, osorifícios foram bloqueados com tampão fosfato acrescido de caseína a 2% por2h a 37°C. Posteriormente, os orifícios foram incubados com as amostras dossoros dos animais diluídas 1:100 por 2 h a 37°C. Após a incubação, a placa foilavada com tampão de lavagem (Tampão Fosfato com 0,05% tween 20) eincubada com anticorpos específicos, com peroxidase marcada, decamundongo para os isotipos IgGI ou lgG2a (Sigma), diluídos 1:5000 por 2 h a37 0C. As placas foram lavadas sete vezes com o tampão de lavagem eincubadas com H2O2 e σ-fenilenediamina para o desenvolvimento da reação.Esta foi interrompida com 20 pl_ de H2SO4 (2N) e a leitura foi realizada em filtrode 492 nm.

Os resultados apresentados na Figura 8 dos níveis dasimunoglobulinas G em soros de animais (isótipos 1 e 2a) mostram um padrãode resposta Th 1 pelo aumento da produção da lgG2a em animais tratados coma formulação vacinai contendo a construção plasmidial pVAX1-hsp65. Essesdados demonstram, mais uma vez, o efeito imunoterapêutico da presenteinvenção em animais infectados com Pb.

Apesar dos resultados positivos (protetores) em animais infectadoscom o fungo P. brasiliensis e imunizados ou tratados com a vacina DNA-HPS65, o mecanismo de ação ainda necessita de novos estudos para melhorcompreensão. Sabemos que a proteína de choque térmico (HSP65)micobacteriana induz diferentes tipos de resposta imune dependendo da formade administração (Lima, K.M. e col. Vaccine adjuvant: it makes the difference.Vaccine, 22:2374-2379, 2004) e o mecanismo de controle da infecção pareceestar fortemente ligado ao tipo de patógeno (bactéria ou fungo) sobre aresposta imune dos indivíduos provocada por tais construções de DNA,sobretudo as contendo o gene da proteína de choque térmico HSP65 demicobactéria, principalmente M. Leprae (como sugerem os resultados obtidosnos Exemplos 6 e 9).

Adicionalmente, é de conhecimento que para a tuberculose ainoculação do DNA-HSP65 M. Leprae induz a produção da proteína HSP65 econtra a qual é desenvolvida uma resposta imune específica baseada naestimulação de anticorpos, e linfócitos T CD4 e TCD8 específicos (Silva, C. L. eLowrie, D. B., Enhancement of immunocompetence in tuberculosis by DNAvaccination. Vaccine, 18:1712-1716, 2000; Silva, C. L. e col., Characterizationof T cells that confer a high degree of protective immunity against tuberculosisin mice after vaccination with tumor cells expressing mycobacterial hsp65.Infection and Immunity, 64:2400-2407, 1996; Bonato, V. L. e col., Immuneregulatory effect of pHSP65 DNA therapy in pulmonary tuberculosis: activationof CD8+ cells, interferon-gamma recovery and reduction of Iung injury.Immunology, 113:130-138, 2004). A imunização com DNA-HSP65 paratuberculose ainda leva a um aumento das células T esplênicas que expressamo fenótipo CD44hl, um marcador associado a respostas do tipo Th1. As célulasreativas contra HSP65 provenientes de animais imunizados produzem níveiselevados de IFN-γ independentemente do seu fenótipo. Por outro lado, oslinfócitos de animais não vacinados respondem in vitro aos estímulos comHSP65, produzindo predominantemente IL-4. A administração do DNA-HSP65,oito semanas após a inoculação de bacilos da tuberculose, causa redução donúmero de bacilos nos tecidos e também induz desvio da resposta imune dotipo Th2 para padrão Th1 (Lowrie, D. B. e col. Towards a DNA vaccine againsttuberculosis. Vaccine, 12:1537-1540, 1994; Lowrie, D. B. e col. Protectionagainst tuberculosis by plasmid DNA. Vaccine, 15: 834-838, 1997; Lowrie, D. B.e col. DNA vaccines against tuberculosis. Immunology and Cell Biology,75:591-594, 1997).

Além disso, as proteínas de choque térmico (HSPs) podem ter umpapel adjuvante (imunoadjuvante) predominante após serem inoculadas. Nocaso da Pbmicose, o modelo de doença fúngica abordado na presenteinvenção, o mecanismo de controle pode estar associado à participação daatividade imunoadjuvante da HSP65. Assim, após a sua síntese, a suaatividade imunoadjuvante pode estimular células APCs (macrófagos e célulasdendríticas via receptores Toll Like, entre outros) a liberar diversos mediadoresimunológicos que favorecem uma resposta imune do tipo Th1 e também pelaatividade chaperonina da HSP65, formando complexos HSP65-peptídeos deproteínas de patógenos, por exemplo, e favorecendo resposta imuneespecífica para esses peptídeos carreados pela HSP65. Assim, o mecanismoefetor da vacina de DNA utilizando a HSP65 pode se dar não só de formadireta, com a atuação da proteína sintetizada dentro do organismo imunizadoou tratado com o gene dessa proteína, como também de forma adjuvante,estimulando receptores de membrana e formando complexos HSP65-peptídeos.O efeito antifúngico apresentado pela composição medicamentosaque contém o imunomodulador apresentado nesta invenção possui fortesindícios sob a ação microbicida de oxido nítrico (NO), produzidos pelosmacrófagos no controle da infecção causada por esses microorganismos.

Apesar do mecanismo ainda não estar elucidado, o NO apresenta uma açãomicrobicida comprovadamente mais eficaz que os intermediários ativos deoxigênio (Bocca, A. L, e col., Treatment of Paracoccidioides brasiliensis-infected mice with a nitric oxide inhibitor prevents the failure of cell-mediatedimmune response. J. Immunol. 161:3056-3063, 1998). Isto sugere, que apesardo presente imunomodulador possuir ação para o controle de doençascausadas por micobactéria das quais são derivados (microorganismopatogênico utilizado na construção do plasmídeo primário e posterior clonagemem outro microorganismo - bactéria hospedeira), como tuberculose ehanseníase, o mecanismo de controle da infecção parece estar fortementeligado ao tipo de patógeno (bactéria ou fungo) sobre a resposta imune dosindivíduos provocada por tais construções de DNA, sobretudo as contendo ogene da proteína de choque térmico HSP65 de micobactéria, principalmente M.Leprae.

Todos os resultados apresentados nos exemplos acima descritoscorroboram que o objetivo da presente invenção foi atingido, mostrando aaplicação da terapia gênica para Pbmicose, pela administração de umaconstrução de DNA plasmidial, principalmente por via IM e doses especificasem animais já infectados previamente com Pb. A vacina de DNA preveniu odesenvolvimento da doença e reduziu significativamente a carga fúngicapulmonar (cerca de 50%), estimulando amplamente a resposta imunológica dohospedeiro. Os demais imunomoduladores plasmidiais, representados pelasseq. ID Ns 2 a 4, também foram promissores para o controle de Pb (tipo dedoença fúngica-modelo). O controle da infecção pode ser atingido ainda pelouso dessas construções de DNA plasmidiais de maneira isolada ou combinada(mistura de pelo menos dois imunomoduladores distintos) em formulaçõesmedicamentosas/vacinais destinadas ao controle de doenças causadas porfungos, tais como Candidíase, Histoplasmose, Coccidioidomicose,Blastomicose, Sporotricose, Cryptococose, Aspergilose eParacoccidioidomicose, especialmente as provocadas pelo gêneroParacoccidioidesj principalmente a espécie Paracoccidioides brasiliensis.

Portanto, os biofármacos testados para micoses ou doençasfungicas em geral poderão ser formulados e administrados na presença de pelomenos um veículo, um diluente, um solvente, um sistema de liberaçãocontrolada e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, estabilizados emfase homogênea ou heterogênea. Nos testes, foi utilizada solução de saca rose(de 0,9% preparada com água destilada autoclavada). Porém outras soluçõespoderão desempenhar a mesma função de diluente, sendo o biofármacoformulado e/ou veiculado não somente em formulações aquosas, mas tambémpodendo ser usados emulsões do tipo óleo/água ou óleo/água/óleo, formandofase homogênea ou heterogênea.

De forma geral, além da presença dos aditivos listadosanteriormente outros compostos antifúngicos e outros imunomoduladores ouagentes gênicos terapêuticos podem ser usados, estando a apresentação daformulação medicamentosa em conformidade com as vias de administração.

As vias de administração que podem ser utilizadas são: via tópica, nasal, oral,inalação, transdérmica, retal ou parenteral. Além disso, tais biofármacospoderão ser administrados em humanos, isolado em dose única ou múltiplasdoses ou em associação com outros medicamentos ou preparaçõesimunoterapêuticas. Nos Exemplos, os dados apresentados foram baseados em4 doses de 100 microgramas de DNA plasmidial cada, sendo no total 400microgramas de DNA para o tratamento. A diminuição das doses poderá serpossível quando utilizado com um adjuvante em tratamentos convencionais,com drogas tradicionais. Também a utilização de sistemas de liberaçãocontrolada (como os polímeros biocompatíveis, matrizes poliméricas, cápsulas,microcápsulas, nanocápsulas, micropartículas, nanopartículas, lipossomas,lipoesferas, pós secos, e sistemas de liberação transdérmica) ou suascombinações poderão reduzir as doses utilizadas.

A dosagem efetiva vai depender, portanto, de muitos fatores, taiscomo do sistema carreador que está sendo utilizado, da rota de administraçãoe do tamanho/peso do indivíduo a ser tratado. O esquema de doses tambémpode variar de acordo com a rota de administração, do indivíduo e a condiçãodeste indivíduo. O tratamento da micose pode estar ou não associada asíndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS).

Vias de administração preferidas são por oral ou injeção, tipicamenteintramuscular ou injeção intradérmica. Injeção do agente terapêutico nomúsculo esquelético ou na pele de humanos ou animais é particularmentepreferida.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS BIOLÓGICAS

1) Informações gerais do Pedido de Patente

(i) Dados dos Requerentes:

a) Nomes: (1) Fundação Universidade de Brasília e (2) FarmacoreBiotecnologia Ltda.

b) Endereços: (1) Campus Universitário Darcy Ribeiro, Faculdade deTecnologia, Módulo AT-05, Caixa Postal 04397, CEP: 70919-970, Asa Norte,Brasília - DF e (2) Incubadora Supera, Rua dos Técnicos, s/n, Campus daUSP, CEP: 14049-900, Ribeirão Preto-SP.

(ii) Título da invenção: "USO DO IMUNOMODULADOR PLASMIDIALEXPRESSANDO UMA PROTEÍNA DE ESTRESSE MICOBACTERIANA PARAO CONTROLE DE MICOSES"

(iii) Número de seqüências constantes do pedido: 4 (quatro)

(iv) Formato para leitura no computador: Microsoft Word; Windows XP;computador tipo PC.

2) Informações gerais das seqüênciasCaracterísticas das moléculas seqüenciadas:Descrição da seqüência: Seq. ID N- 1:

a) Tamanho da seqüência : 3613 pares de bases

b)Tipo da seqüência: Ácido nucléico

c) número identificador da seqüência: M 14341.1 Gl: 149923 (PubmedProtein)

d) topologia: DNA linear

3) Características da molécula seqüenciada: Seq. ID N- 1:

a) tipo: DNA

b) nome: M. Ieprae 65kd antigen

c) produto do gene: Proteína de choque térmico HPS65

d) fonte original da molécula: organism="Mycobacterium leprae"mol_type="genomic DNA"

e) posição da seqüência no genoma: 1...3613 táxon 1769

f) fenótipo associado: proteína de choque térmico hsp65 M. Iepraeg) atividade biológica: proteína de choque térmico atuando comochaperona, participando do dobramento , desdobramento emontagem de proteínas, prevenindo desnaturação e agregaçãoprotéica. Também exercem atividade ATPase e transporte depeptídeos.

h) localização celular: São encontradas em diversos compartimentoscelulares como citosol, núcleo, retículo endoplasmático, mitocôndriae cloroplastos.

Descrição da Seqüência

GAATTCCGGA ATTGCACTCG CCTTAGGGGA GTGCTAAAAA TGATCCTGGC ACTCGCGATC 60

AGCGAGTGCC AGGTCGGGAC GGTGAGACCC AGCCAGCAAG CTGTGGTCGT CCGTCGCGGG 120

CACTGCACCC GGCCAGCGTA AGTAATGGGG GTTGTCGGCA CCCGGTGACC CTAGCTTCAT 180

TCCTAATCCG GAGGAATCAC TTCGCAATGG CCAAGACAAT TGCGTACGAC GAAGAGGCCC 240

GTCGCGGCCT CGAGCGGGGC TTGAACAGCC TCGCCGACGC GGTAAAGGTG ACGTTGGGTC 300

CGAAGGGGCG CAACGTCGTT CTAGAGAAGA AGTGGGGTGC TCCCACGATC ACCAACGATG 360

GCGTGTCCAT CGCCAAGGAG ATCGAGCTGG AGGACCCGTA CGAGAAGATT GGCGCTGAGT 420

TGGTCAAGGA AGTCGCCAAG AAGACAGATG ACGTCGCCGG TGATGGCACC ACGACGGCCA 480

CCGTGCTGGC CCAGGCATTG GTCAAAGAGG GCCTACGCAA CGTCGCGGCC GGCGCCAACC 540

CGCTAGGTCT CAAGCGTGGC ATCGAGAAAG CTGTCGATAA GGTAACTGAG ACTCTGCTCA 600

AGGACGCTAA GGAGGTCGAA ACCAAGGAAC AAATTGCTGC CACTGCAGCG ATTTCGGCGG 660

GTGACCAGTC GATCGGTGAT CTGATCGCCG AGGCGATGGA CAAGGTTGGC AACGAGGGTG 720

TTATCACCGT CGAGGAATCC AACACCTTCG GTCTGCAGCT CGAGCTCACC GAGGGAATGC 780

GGTTCGACAA GGGCTACATT TCGGGCTACT TCGTCACCGA CGCCGAGCGT CAGGAAGCTG 840

TCCTAGAGGA GCCCTACATC CTTCTGGTCA GCTCCAAAGT GTCTACCGTC AAGGACCTGC 900

TGCCGCTGCT AGAGAAGGTC ATCCAGGCCG GCAAGTCGCT GCTGATCATT GCTGAGGATG 960

TCGAGGGTGA GGCGTTGTCT ACCCTGGTCG TCAACAAGAT CCGTGGCACT TTCAAGTCGG 1020

TGGCGGTCAA AGCTCCTGGC TTTGGTGACC GCCGCAAGGC AATGTTGCAA GACATGGCCA 1080

TTCTCACCGG AGCCCAGGTC ATCAGCGAGG AGGTCGGTCT CACATTGGAG AACACCGATC 1140

TGTCATTGCT GGGCAAGGCC CGCAAGGTGG TTATGACCAA GGACGAAACC ACCATCGTCG 1200

AGGGTGCCGG TGACACCGAC GCCATCGCCG GGCGAGTGGC TCAGATCCGT ACCGAGATCG 1260

AGAACAGTGA CTCTGACTAT GACCGCGAGA AACTGCAGGA ACGCCTGGCT AAGTTGGCCG 1320

GTGGTGTTGC GGTGATCAAG GCCGGTGCTG CCACTGAGGT GGAGCTCAAG GAGCGCAAGC 1380

ACCGCATCGA GGACGCAGTC CGCAACGCCA AGGCCGCGGT GGAGGAGGGG ATCGTCGCCG 1440

GCGGCGGTGT GACTCTGCTA CAGGCTGCTC CGGCTCTGGA CAAGCTGAAG CTGACCGGTG 1500

ACGAGGCGAC CGGTGCCAAT ATTGTCAAGG TGGCGTTGGA AGCTCCGCTC AAGCAGATCG 1560

CCTTCAATTC CGGGATGGAG CCCGGCGTGG TGGCCGAAAA GGTGCGTAAC CTTTCAGTGG 1620

GTCACGGCCT GAACGCCGCC ACCGGTGAGT ACGAGGACCT GCTCAAGGCC GGCGTTGCCG 1680

ACCCGGTGAA GGTTACACGT TCTGCGCTGC AGAACGCAGC GTCCATCGCC GGCCTGTTCC 1740

TTACTACGGA GGCCGTCGTC GCCGACAAGC CGGAGAAGAC GGCAGCTCCG GCGAGCGACC 1800

CGACCGGTGG CATGGGTGGT ATGGACTTCT GACGTCCGGT CATGATGCAG GTAGCTACGT 1860

GGTCTGAAGT GGGGTACTTC ATCAACTGAG TAGCGGCGGG CGAACTGGAC AATCGAATTA 1920

GGAGTTGACA AAGAAAAAGA GCCCGGCCCC CCAAAAAAAG GGACCGGGCT CTTTCTTGTT 1980

CTTGCGCGTC CAGGGGAGTC GGGCTTGGCC TCGAGGTGCA GGAGCGTGGG TCGGAACGAC 2040

ACTGAACCGG GCAGTCTCGT TGCCGGGGCT CGCGTCGTTG CGCTGGAAGG AGCGCGCGCG 2100

CCCGAGCCGT TCTAGGGTGT TGTGGGTGTT TCATAGGTGG TGGGTGAAAT GGCTGTTTTT 2160

GCGTTTTATG ACTGGCCGAT ATGTTCGGTA GTCGTGGGGG GCAGCCCGGA ATCCTGTTGA 2220

CGTGTTTTGC TGTGTTGCGG GGTTTTTGTT GGTGGGTGGC TGACTGCCTG CTTTCGATGA 2280

GGCTTCGTGT GCTTTGCCGC AGTGGACACG ATTAGCGCGG CGCACGTAAG CATGTCGGTG 2340

GTGGGTGCTG CTTGGTCTAC ATGTTGATGA TGCCAGGGGC TGGGCACCTG GGCTGTGCTG 2400AAGGCGATAT CGATGCAGGC GTGGGTGTGA GGGTAGTTGT TAGCGCCGCG GGGTAGGGGC 24 60GTTTTAGTGT GCATGTCATG GCCTTGAGGT GTCGGCGTGG TCAATGTGGC CGCACCTGAA 2520CAGGCACGTC CCCGTGCACG GTATAACTAT TCGCACCTGA TGTTATCCCT TGCACCATTT 2580CTGCCGCTGG TATCGGTGTC GGCGGCTTGT TGACCGGCCC TCAGCCAGCA AGCAGGCATG 2640CCGCCGGGTG CAGCAGTATC GTGTTAGTGA ACAGTGCATC GATGATCCGG CCGTCGGCGG 2700CACATACGGC AACCTTCTAG CGCAGATCAA CCACCCACAC CCCACCAGCC CACCACAACA 27 60CCACCACCCA AACCAAACCA GCAAAAAATA ACCACCAAAT GACCATCACG ACGACGATAT 2820GGTGGGTGCG TTCAGCGCGC AGATGCCCGC TGCCGCCGCA TAGCAACCCG GTTGGGATCA 2880ACGCTGTGTT GGGCAGTAGC AGGTTAGAGT AGGCTGAGGC TAGCGCAATC GCGACTGAGA 294 0GATCTGGTGC CGGATCGGTT AACCGCATGC CGTCTACGGT GAAAAGATAG ACGTTATTGA 3000CCGCGATGCT CTAGTTGGTT GTGTTTTTCC AGGGCGGTGG TGGCTATAGC TGCCCGGGCG 3060TGTGTCGATC CTGTTGATGA CACGGCGCGG CGAGCCACTA ATATGGCGTT GCCAATAGCG 3120TCTGGATCTC GCCGATGAGT GGTTGCTTTC CTCCACCCAG TGTCATCGTG ATCGCAGTAC 3180CGGCTACCGG TGTTGGCCGC TGATTGATTG AAGAAAAGGT TTCAATGGAT CGGCAACGTC 324 0GTCGATTCCG TCGTCACGCA ACAGGAAACA CTCGACTTTG TCACTTTGTC GGTGGCTCCG 3300AATTGATTCT TGACGTCCCG GACCGTCTGC ATCGGGTAGT TTGTGATTTT CCTGCGAATG 3360CAGCACTACG TCGACGAGGT GTTCGAGCGA GTACGGCCTG GCGATGGACC CGTCTTTGGT 3420GACATGTCCG ACCAGAATCA ACGCAACTAC CGTTGGCTTT GGCGTTCGGC GTCGTTGTTA 34 80CGGCACGTAC TTGGGTGCCA CCACCGGTGA TTTCGTCGGC TTCGGTGAGT GGCCATGGTT 354 0TGCACTGAGG CGGTGCTGCT CAGCGCAGAC AGACCATCAC GACGTGGCCC AGCACGGTGT 3600GCAGGTCGAA TTC 3613

Descrição da seqüência: Seq. ID N- 2:

a) Tamanho da seqüência : 146 aminoácidos

b) Tipo da seqüência: aminoácidos

c) número identificador da seqüência: NP_962635.1 Gl:41409799 (PubmedProtein)

d) topologia: LINEAR

3) Características da molécula seqüenciada: Seq. ID N° 2:

a) tipo: aminoácido

b) nome: Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10

c) fonte original da molécula: Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis K-10

e) posição da seqüência no genoma: 1 a 146 aa (resíduos)

Descrição da Seqüência

MSNLALWTRP AWDTDRWLRD FFGPAAAADW NKPATSAFKP AAEIVKDGDD AIVRVELPGV 60

DVDQDVQVEL DRGRLVIRGE HRDEHAEEKD GRTLREIRYG SFHRSFQLPG HVTDDDITAS 120

YDAGVLTVRV TGAYAGNQAK RIAITK 14 6

Descrição da seqüência: Seq. ID Ns 3:

a) Tamanho da seqüência : 235 aminoácidos

b) Tipo da seqüência: aminoácidosc) número identificador da seqüência: NP_214865.1 Gl:15607492 (Pubmed Protein)

d) topologia: LINEAR

3) Características da molécula seqüenciada: Seq. ID N° 3:

a) tipo: aminoácido

b) nome: PROBABLE GRPE PROTEIN (HSP-70 COFACTOR)[Mycobacterium tuberculosis H37Rv

c) fonte original da molécula: Mycobacterium tuberculosis H37Rv

e) posição da seqüência no genoma: 1 a 235 aa (resíduos)

Descrição da Seqüência

MTDGNQKPDG NSGEQVTVTD KRRIDPETGE VRHVPPGDMP GGTAAADAAH TEDKVAELTA 60

DLQRVQADFA NYRKRALRDQ QAAADRAKAS VVSQLLGVLD DLERARKHGD LESGPLKSVA 120

DKLDSALTGL GLVAFGAEGE DFDPVLHEAV QHEGDGGQGS KPVIGTVMRQ GYQLGEQVLR 180

HALVGVVDTV VVDAAELESV DDGTAVADTA ENDQADQGNS ADTSGEQAES EPSGS 235

Descrição da seqüência: Seq. ID N-4:

a) Tamanho da seqüência : 193 aminoácidos

b) Tipo da seqüência: Resíduos de aminoácidos

c) número identificador da seqüência: BAA07184 gi:531029 (PubmedProtein)

d) topologia: LINEAR

3) Características da molécula seqüenciada: Seq. ID N° 4:

a) tipo: aminoácido

b) nome: MPT70 M tuberculosis H37Rv

c) fonte original da molécula: M tuberculosis H37Rv

e) posição da seqüência no genoma: 1 a 193 aa (resíduos)

Descrição da Seqüência

MKVKNTIAAT SFAAAGLAAL AVAVSPPAAA GDLVGPGCAE YAAANPTGPA SVQGMSQDPV 60

AVAASNNPEL TTLTAALSGQ LNPQVNLVDT LNSGQYTVFA PTNAAFSKLP ASTIDELKTN 120

SSLLTSILTY HVVAGQTSPA NVVGTRQTLQ GASVTVTGQG NSLKVGNADV VCGGVSTANA 180

TVYMIDSVLM PPA 193

Claims (13)

1. USO DO IMUNOMODULADOR PLASMIDIAL EXPRESSANDO UMAPROTEÍNA DE ESTRESSE MICOBACTERIANA descritos por construções deácidos nucléicos compreendendo uma seqüência codificadora,operacionalmente ligadas a um promotor capaz de expressar tais seqüênciascodificadoras em células de hospedeiros mamíferos caracterizado por serpara preparação de uma composição medicamentosa ou vacinai para ocontrole de micoses em seres humanos e animais, sendo o controleabrangendo a prevenção, tratamento e cura de doenças causadas por fungos.

2. USO DO IMUNOMODULADOR PLASMIDIAL EXPRESSANDO UMAPROTEÍNA DE ESTRESSE MICOBACTERIANA de diferentes tamanhos, deacordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos imunomoduladoresplasmidiais serem descritos pelas Seq. ID N9 1 a 4, preferencialmente o deSeq. ID N9 1.

3. USO DO IMUNOMODULADOR PLASMIDIAL EXPRESSANDO UMAPROTEÍNA DE ESTRESSE MICOBACTERIANA de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato do biofármaco ou composiçãomedicamentosa ser utilizado no controle de doenças fúngicas, dentreCandidiase1 Histoplasmose, Blastomicose, Sporotricose, Cryptococose,Aspergilose, Coccidioidomicose e Paracoccidioidomicose ou Pbmicose,principalmente as causadas por fungos do gênero Paracoccidioides,preferencialmente Paracoccidioides brasiliensis.

4. USO DO IMUNOMODULADOR PLASMIDIAL EXPRESSANDO UMAPROTEÍNA DE ESTRESSE MICOBACTERIANA de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato do gene de expressão da proteína dechoque térmico de diferentes tamanhos ser de origem bacteriana, demamíferos ou micobacteriana, principalmente as HSP10, HSP65 e HSP70,preferencialmente a HSP65.

5. USO DO IMUNOMODULADOR PLASMIDIAL EXPRESSANDO UMAPROTEÍNA DE ESTRESSE MICOBACTERIANA de acordo com areivindicação 4, caracterizado pelo fato do gene de expressão da proteína dechoque térmico de origem micobacteriana ser particularmente do gêneroMycobacteríum, principalmente as espécies Mycobacterium bovis BCG1Mycobacterium tuberculosis e de Mycobacteríum leprae, preferencialmente deMycobacteríum leprae.

6. USO DO IMUNOMODULADOR PLASMIDIAL EXPRESSANDO UMAPROTEÍNA DE ESTRESSE MICOBACTERIANA de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato da formulação da composiçãomedicamentosa ou vacinai compreender pelo menos um veículo, um diluente,um solvente, um sistema de liberação controlada e/ou excipientesfarmaceuticamente aceitáveis, estabilizados em fase homogênea ouheterogênea.

7. USO DO IMUNOMODULADOR PLASMIDIAL EXPRESSANDO UMAPROTEÍNA DE ESTRESSE MICOBACTERIANA de acordo com areivindicação 6, caracterizado pelo fato do imunomodulador ser utilizado deforma isolada ou em associação com outros imunomoduladores ou outroscompostos antifúngicos, a serem administrados de forma única ou com outrosmedicamentos ou preparações imunoterapêuticas, em dose única ou em dosesmúltiplas.

8. USO DO IMUNOMODULADOR PLASMIDIAL EXPRESSANDO UMAPROTEÍNA DE ESTRESSE MICOBACTERIANA de acordo com areivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato da formulação da composiçãomedicamentosa compreender uma forma de apresentação em conformidadecom as vias de administração, dentre via tópica, nasal, oral, inalação,transdérmica, retal ou parenteral, sendo preferidas as vias oral ou injeção.

9. USO DO IMUNOMODULADOR PLASMIDIAL EXPRESSANDO UMAPROTEÍNA DE ESTRESSE MICOBACTERIANA de acordo com areivindicação 8, caracterizado pelo fato da apresentação da formulaçãomedicamentosa ou vacinai possibilitando via de administração parenteral serpor uma das vias, subcutânea, intradérmica, intravenosa, intramuscular eintraperitoneal, preferencialmente injeções no músculo esquelético ou na pelede humanos ou animais.

10. USO DO IMUNOMODULADOR PLASMIDIAL EXPRESSANDO UMAPROTEÍNA DE ESTRESSE MICOBACTERIANA de acordo com areivindicação 8, caracterizado pelo fato da apresentação da formulaçãomedicamentosa possibilitando via de administração tópica serempreferencialmente por, inalação por aerossol, administração nasal ou aplicaçãona superfície da pele de mamíferos.

11. USO DO IMUNOMODULADOR PLASMIDIAL EXPRESSANDO UMAPROTEÍNA DE ESTRESSE MICOBACTERIANA de acordo com areivindicação 6, caracterizado pelo fato da liberação controlada compreenderdiferentes sistemas ou suas combinações, dentre polímeros biocompatíveis,matrizes poliméricas, cápsulas, microcápsulas, nanocápsulas, micropartículas,nanopartículas, lipossomas, lipoesferas, pós secos e sistemas de liberaçãotransdérmica.

12. USO DO IMUNOMODULADOR PLASMIDIAL EXPRESSANDO UMAPROTEÍNA DE ESTRESSE MICOBACTERIANA de acordo com areivindicação 6, caracterizado pelo fato da composição medicamentosa ouvacinai seja formulada e/ou veiculada em meios aquosos, em emulsõesóleo/água ou óleo/água/óleo, formando fase homogênea ou heterogênea.

13. USO DO IMUNOMODULADOR PLASMIDIAL EXPRESSANDO UMAPROTEÍNA DE ESTRESSE MICOBACTERIANA de acordo com uma dasreivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato da micose estar ou nãoassociada a síndrome da imunodeficiência adquirida.