JP6195089B2

JP6195089B2 - ストレプトコッカス・ニューモニエによる肺炎に対するキメラタンパク質ワクチン

Info

Publication number: JP6195089B2
Application number: JP2015518363A
Authority: JP
Inventors: ニコラエーヴィッチスヴォロフ，アレクサンドル; ヴラジミローヴィッチヅクホヴリノフ，イリヤ; イオシフォヴィチオルロフ，アントン; ヤコヴレーヴィッチバイグチン，エヴゲンジ
Original assignee: エピトーペリミテッド（エピトーペエルティーディー）
Priority date: 2012-06-22
Filing date: 2013-06-21
Publication date: 2017-09-20
Anticipated expiration: 2033-06-21
Also published as: EA027981B1; KR20150034192A; EA201590078A1; UA116634C2; WO2013191591A4; WO2013191591A1; CU20140145A7; US9345757B2; CN104470538A; BR112014032135A2; MX355642B; CN104470538B; RU2012126328A; MX2014016049A; US20150174230A1; EP2863944A4; EP2863944B1; RU2510281C2; HK1208632A1; EP2863944A1

Description

本発明は、医薬、薬理学、生命工学に関連するもので、肺炎球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ニューモニエ））による肺炎の予防および治療両方に用いることができる。

「ハイブリッド（またはキメラ）タンパク質」という用語は、複数の異なる遺伝子のコード配列を１つの読み枠に結合させた組換えＤＮＡ分子の発現の結果として得られるタンパク質を示す。

肺炎（同義語：肺の発熱）は、成人および子供のどちらにもよく見られる疾患であり、入念な診断および治療を必要とする。医療統計によれば、毎年百万人を超えるロシア人が肺炎にかかっており、患者の５％は、この疾患により命を落としている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｍｅｄｉａｃｅｎｔｒｅ／ｆａｃｔｓｈｅｅｔｓ／ｆｓ３３１／ｒｕ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。

「肺炎」という用語は、広範囲の疾患を示し、肺炎に含まれる疾患のそれぞれが、疾患独自の病因、発症機序、臨床像、Ｘ線特性、検査値、および専用療法を有し、そして独立した疾患として、または他の疾患から続発するものとして進行する可能性がある。

肺炎とは、ヒト呼吸器系の炎症状態である。肺炎の原因物質には、ウイルスおよび真菌もあるが、この疾患は、細菌により引き起こされることが最も多い。細菌性肺炎を引き起こす最も一般的な病原は、肺炎球菌（Ｓ．ニューモニエ）である。咽頭細菌叢の検査から、健常者の５〜２５％は肺炎球菌の保菌者であることが明らかになった。

肺炎球菌は、厚い多糖莢膜を特徴とし、この莢膜は、微生物を、オプソニン化およびそれに続く食作用から保護している。肺炎球菌にとって莢膜が免疫系に認識される主要な表面構造となるという事実の結果、莢膜の多糖類は非常に高い変異性を特徴とする。現在までに、９１種類の異なる莢膜型の肺炎球菌が検出されている；しかしながら、侵襲性肺炎球菌疾患の大部分（９０％超）は、特に広汎な２３種類の血清型のものにより引き起こされる。莢膜の多糖類に非常に多数の免疫学的変異が存在するということが、有効な多糖類ワクチンの製造を複雑にする要因となっている。

全ての人に肺炎球菌感染症に罹る可能性があるが、リスク群がいくつか存在し、リスク群ではこの疾患に罹りやすくなる。そのようなリスク群とは、６５歳以上の人、小さい乳児、特定の健康上の問題を抱えている人、免疫系が弱っている人、喫煙者である。

多くの場合、肺炎球菌感染症は治療があまり奏功せず、その一方で、流行を繰り返す多数の肺炎球菌株は複数の抗生物質に耐性を発現する。予防目的で、ワクチンが用いられる。ＷＨＯ（世界保健機構）およびロシア呼吸器学会によれば、「ワクチンが、肺炎球菌感染経路を防ぐ唯一の可能性である」。最近、ＦＤＡ（食品医薬品局）が、２種類のワクチンを承認した：肺炎球菌結合型ワクチンおよび肺炎球菌多糖類ワクチンである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｅｄｌｉｎｅｐｌｕｓ／ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．ｈｔｍｌ）。ロシア連邦では、以下のワクチンが承認されている：Ｐｎｅｕｍｏ２３（ＰＰＳＶ２３）−ＳａｎｏｆｉＰａｓｔｅｕｒ（Ｆｒａｎｃｅ）製の２３価肺炎球菌多糖類ワクチン、およびＰｒｅｖｅｎａｒ（登録商標）（ＰＣＶ７）−ＷｙｅｔｈＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＩｎｃ．（ＵＳＡ）製の７価抱合型肺炎球菌多糖類ワクチン。

肺炎球菌多糖類ワクチン（ＰＰＳＶ）は、成人向けである。ＰＰＳＶをワクチン接種した成人の大部分は、接種から２〜３週間後に、大部分の細菌株に対する抵抗力を発現する（それらの抗原がワクチンに存在している）。高齢者、２歳未満の子供、および慢性疾患を有する人の中では、ワクチン接種は、持続的な免疫性の発生を導かないか、またはこの疾患に対する免疫性が完全には発現されない可能性がある（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｅｄｌｉｎｅｐｌｕｓ／ｌａｎｇｕａｇｅｓ／ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．ｈｔｍｌ＃Ｒｕｓｓｉａｎ）。そのうえ、ワクチン接種は、紅斑、注射部位の発痛、発熱、筋肉痛、または重篤な局所反応などの合併症を引き起こす可能性がある（ＤｏｎａｌｉｓｉｏＭＲ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｓＳＭ，ＭｅｎｄｅｓＥＴ，ＫｒｕｔｍａｎＭ．Ａｄｖｅｒｓｅｅｖｅｎｔｓａｆｔｅｒｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．ＪＢｒａｓＰｎｅｕｍｏｌ．２００７Ｆｅｂ；３３（１）：５１−６）（非特許文献１）。

しかしながら、ＰＰＳＶは、肺炎球菌疾患にかかるリスクの低い人々の間でのみ顕著に有効であることがわかった。２歳未満の子供の場合、ワクチン接種の間、抗生物質での同時予防を採用することが推奨される（ＢａｃｌｅＡ，ＤｉｏｔＰ，ＬｅｍａｒｉｅＥ．Ａｎｔｉ−ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌｖａｃｃｉｎｅ：ｊｕｓｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓａｎｄｒｅｓｕｌｔｓ．ＲｅｖＰｎｅｕｍｏｌＣｌｉｎ．１９９７；５３（３）：１２８−３７）（非特許文献２）。

ＰＰＳＶは、肺炎の発生率およびその致死率を下げることはできず、重篤な肺炎球菌感染症にかかる危険性を下げるだけであったと思われる。現行のワクチンでは、高濃度のペニシリンでなければ効かない肺炎球菌株を防ぐことができなかったことも示された（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌｖａｃｃｉｎｅ：ａｓｅｃｏｎｄｌｏｏｋ．ＳｏｌｕｔｉｏｎｆｏｒＳＣｏｒＩＭｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌｖａｃｃｉｎｅ．ＰｒｅｓｃｒｉｒｅＩｎｔ．１９９８Ｆｅｂ；７（３３）：１６−８）（非特許文献３）。そのような結果は、６５歳を超える人々でも報告された（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｆｏｒｅｌｄｅｒｌｙｓｕｂｊｅｃｔｓ：ｌｉｃｅｎｓｅｅｘｔｅｎｓｉｏｎ．Ｓｔｉｌｌｎｏｐｒｏｏｆｏｆｃｌｉｎｉｃａｌｅｆｆｉｃａｃｙ．ＰｒｅｓｃｒｉｒｅＩｎｔ．２０００Ａｕｇ；９（４８）：１０６−９）（非特許文献４）。

ＰＰＳＶの活性成分は、肺炎球菌が病因の侵襲性疾患のうち９０％までもの原因となっている２３種の血清型の連鎖球菌の多糖類混合物である。多糖は、Ｔ細胞反応に関わる抗原であり、したがって、免疫記憶を形成することなく、短期免疫化だけを発現させる；上記の成分のみを含有するワクチンは、有効ではなく、そのことは２歳未満の子供で示されている（ＧｒｅｅｎｗｏｏｄＢＭｅｔａｌ．，ＴｒａｎｓＲＳｏｃＴｒｏｐＭｅｄＨｙｇ，１９８０，７４：７５６−７６０；国際出願公開第２０１０１２０９２１号、優先日２００９年４月１６日）（非特許文献５および特許文献１）。肺炎球菌に９０種を超える血清型が存在するという事実もまた、感染病原体が世界各地によって様々に異なることから、万能多糖類系ワクチンの製造を複雑にしている。

子供で最も頻繁に疾患を引き起こす７種の肺炎球菌血清型の多糖類を用いた、子供用結合型ワクチンは、キャリアタンパク質ＣＲＭ１９７（ジフテリア毒素変異体）を含有しており、このタンパク質はアジュバントの役割を果たす。ワクチンにアジュバントが存在するため、この抗原複合体は、持続性免疫を保証するＴ細胞によく認識される（ＳｃｈｎｅｅｒｓｏｎＲ，ＢａｒｒｅｒａＯ，ＳｕｔｔｏｎＡ，ＲｏｂｂｉｎｓＪＢ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅｔｙｐｅｂｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．ＪＥｘｐＭｅｄ．１９８０Ａｕｇ１；１５２（２）：３６１−７６）（非特許文献６）。ＣＲＭ１９７は、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）と結合する。ＣＲＭ１９７の毒性がジフテリア毒素の毒性の約１０６倍に弱まっているという事実にも関わらず、その使用は、特に高用量のときには、注意が必要である（ＴａｋｕｙａＫａｇｅｙａｍａ，ＭｉｎａｋｏＯｈｉｓｈｉ１，ＳｈｉｎｇｏＭｉｙａｍｏｔｏ，ＨｉｒｏｔｏＭｉｚｕｓｈｉｍａ，ＲｙｏＩｗａｍｏｔｏａｎｄＥｉｓｕｋｅＭｅｋａｄａ．ＤｉｐｈｔｈｅｒｉａＴｏｘｉｎＭｕｔａｎｔＣＲＭ１９７ＰｏｓｓｅｓｓｅｓＷｅａｋＥＦ２−ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌＡｃｔｉｖｉｔｙｔｈａｔＰｏｔｅｎｔｉａｔｅｓｉｔｓＡｎｔｉ−ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃＡｃｔｉｖｉｔｙ．ＲｅｃｅｉｖｅｄＡｐｒｉｌ１６，２００７．ＡｃｃｅｐｔｅｄＭａｙ２，２００７）（非特許文献７）。それに加えて、ワクチン接種は、以下の合併症を引き起こす可能性がある：紅斑、注射部位での皮膚痛および硬化、体温の３８〜３９℃（１００．４〜１０２．２°F）への上昇、ならびに焦燥感、眠気、および食欲減少。そのうえ、２歳齢なら４回、２〜５歳の年齢では子供の年齢に応じた回数で、接種することが推奨される。子供にワクチン接種するのに、合計で、少なくとも４回の投与が必要であるが、これは費用がかかるとともに安全ではない。

ワクチンは、２種類の主成分を含有することが知られている：Ｎ．メニンギティディスの表在性多糖およびＳ．ニューモニエのＰｓａＡ−タンパク質である（ＰｓｐＡ−タンパク質も使用することができる）（国際出願公開第２０１０１２０９２１号、優先日２００９年４月１６日）（特許文献１）。多糖類に対して免疫記憶を発現することが不可能であることを考慮すると、ワクチン成分にＮ．メニンギティディスの表在性多糖を利用するのは不適切であると思われる。次にＰｓａＡおよびＰｓｐＡタンパク質については、それらの利用は、理にかなっている：それらは、肺炎球菌の表在性抗原であり、免疫応答および免疫記憶の両方を誘導することができる。

特許請求しようとしているワクチンの効果は、強力な免疫応答の誘導およびそれに続く免疫記憶の発現に基づいている。したがって、本発明の中心を占めるのは、多糖類ではなく、分子生物学および組換えＤＮＡに基づく方法を用いて得られる肺炎球菌タンパク質である。文献のデータによれば、最も有望なタンパク質系抗原は、以下の３種の表在性タンパク質である：ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、Ｓｐｒ１８９５。

ＰｓａＡ−タンパク質は、国際出願公開第２００４１０２１９９号（優先日２００３年５月１６日）（特許文献２）の著者らによっても、有望な免疫源であると見なされている。この著者らは、ＰｓａＡタンパク質および他の複数のタンパク質（ＳｌｒＡ(すなわちリポタンパク質ロタマーゼ)、ＩｇＡ１(すなわちプロテアーゼ)、ＰｐｍＡ(すなわち連鎖球菌成熟化タンパク質））またはそれらの複合物を、ワクチン製造の主成分として述べている。しかしながら、本発明者らは、Ｓ．ニューモニエが持つ他の表在性タンパク質（ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、およびＳｐｒ１８９５以外）を使用するアプローチの方が有望であると考える。

コレラ毒素のＰｓａＡおよびＢサブユニットをアジュバント機能と共に含有するキメラタンパク質が記載されている（ＡｒｅａｓＡＰ，ＯｌｉｖｅｉｒａＭＬ，ＭｉｙａｊｉＥＮ，ＬｅｉｔｅＬＣ，ＡｉｒｅｓＫＡ，ＤｉａｓＷＯ，ＨｏＰＬ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎＢ−ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌｓｕｒｆａｃｅａｄｈｅｓｉｎＡｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ：ａｂｉｌｉｔｙｏｆＣＴＢ−ＰｓａＡｔｏｉｎｄｕｃｅｈｕｍｏｒａｌｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｍｉｃｅ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ．２００４Ａｕｇ１３；３２１（１）：１９２−６）（非特許文献８）。しかしながら、ワクチン成分としてコレラ毒素またはその複合物を使用することは、フラゲリンに比べて安全性が劣ると思われる、一方で人体はコレラ毒素に対して非常に敏感であるので、たった８μｇの毒素でもひどい下痢を引き起こす可能性がある。

研究により、肺炎球菌ワクチンを作るための主成分にＰｓａＡタンパク質およびＰｓｐＡタンパク質を用いることは理にかなっていることがわかった。ＰｓａＡタンパク質は、様々な血清型の肺炎球菌の間で高度に保存されており、細菌接着および細菌の病原性をもたらしている（ＢｅｒｒｙＡＭ，ａｎｄＰａｔｏｎＪＣ：ＳｅｑｕｅｎｃｅｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙｏｆＰｓａＡ，ａ３７−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎｐｕｔａｔｉｖｅａｄｈｅｓｉｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｖｉｒｕｌｅｎｃｅｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ１９９６；６４：５２５５−５２６２）（非特許文献９）。ＰｓａＡ特異的抗体が、Ｓ．ニューモニエの全ての血清型に対して架橋活性を有することが、わかった。

ＰｓｐＡは、コリン結合性表面抗原であり、この抗原は、補体独立性食作用を阻害し、ラクトフェリンと結合し、また細菌細胞のラクトフェリン独立性排除を防ぐ（ＨａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔＳ，ＢｅｔｈｅＧ，ＲｅｍａｎｅＰＨ，ＣｈｈａｔｗａｌＧＳ（１９９９）ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｔｅｉｎＡａｓａｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ６７：１６８３−１６８７）（非特許文献１０）。この論文では、ＰｓａＡ−タンパク質がワクチンの製造に有望であると述べられている。著者らは、また、肺炎球菌感染症に対するワクチンを製造する候補として幅広いタンパク質を示している；しかしながら、本発明者らは、２種の特定のタンパク質、ＰｓａＡおよびＰｓｐＡが肺炎球菌の複数の血清型の間で、および他の細菌の間でも保存されていることを考慮して、ＰｓａＡおよびＰｓｐＡを使用することが理にかなっていると考える。

提案するワクチンの主成分の１つは、リン酸結合タンパク質、すなわちリン酸ＡＢＣ輸送体の遺伝子がコードするＳｐｒ１８９５タンパク質である。このタンパク質は、細菌の生存能および定常性に必須であり、このことから、このタンパク質は、Ｓ．ニューモニエが原因の疾患に対する肺炎球菌ワクチンの製造に選択される成分となっている。

本発明では、フラゲリンタンパク質（ＦｌｉＣ）がアジュバントの機能を果たす。ＦｌｉＣとＴｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ−５）との相互作用のおかげで、ＦｌｉＣは、マクロファージおよび樹状細胞の成熟を刺激し、その結果、免疫応答が発達する（ＭｃＤｅｒｍｏｔｔＰ．Ｆ．．Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＧｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅｆｌａｇｅｌｌｉｎａｎｄａｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｙｔｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． −２０００． −Ｖ．６８． −ｐ．：５５２５−５５２９；ＭｅａｎｓＴ．Ｋ．ｅｔａｌ．ＴｈｅＴｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ５ｓｔｉｍｕｌｕｓｂａｃｔｅｒｉａｌｆｌａｇｅｌｌｉｎｉｎｄｕｃｅｓｍａｔｕｒａｔｉｏｎａｎｄｃｈｅｍｏｋｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． −２００３． −Ｖ．１７０． −ｐ．：５１６５−５１７５）（非特許文献１１および１２）。

現在、フラゲリンは、最も有望で十分に特性決定なされた次世代アジュバントであると見なされている。調査の結果から、フラゲリンと一緒に注入された遺伝子組換えタンパク質は、向上した免疫原性および抗原性特性を保持することが示されている。それらに対する反応が記録されるのも早くなるし、もたらされる細胞性および体液性免疫応答も強くなる（Ｂａｌａｒａｍ，２００８）。

本発明では、フラゲリン成分がアジュバントとして機能し得ることが示される。２つの受容体活性化ドメインが、フラゲリンの末端領域で発見されている（７９−１１７番アミノ酸および４０８−４３９番アミノ酸）（Ｔｏｎｙｉａ，２００１）。

つまり、フラゲリンの限定的成分を使用するアプローチは理にかなっている（ＦｌｉＣドメイン１、ＦｌｉＣドメイン２）。

ＴＬＲ−５は、自然免疫の細胞、上皮細胞、および内皮細胞の表面で発現する（ＳｅｂａｓｔｉａｎｉＧ．ｅｔａｌ．ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｕｒｉｎｅＴｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ５（Ｔｌｒ５）ｇｅｎｅ：ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｔｕｄｉｅｓｉｎＳａｌｍｏｎｅｌｌａ−ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅＭＯＬＦ／Ｅｉｍｉｃｅ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． −２０００． −Ｖ．６４． −ｐ．２３０−２４０；ＺａｒｅｍｂｅｒＫ．Ａ．ａｎｄＧｏｄｏｗｓｋｉＰ．Ｊ．ＴｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｕｍａｎＴｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＴｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒｍＲＮＡｓｉｎｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｍｉｃｒｏｂｅｓ，ｔｈｅｉｒｐｒｏｄｕｃｔｓ，ａｎｄｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． −２００２． −Ｖ．１６８． −ｐ．５５４−５６１；Ｄｅｌｎｅｓｔｅ，２００７）（非特許文献１３および１４）。このことを考慮すると、免疫化に粘膜を利用することは理にかなっている、粘膜は免疫原の輸送を顕著に促進する。

このようにして、国際公開第ＷＯ２００４１０２１９９号（特許文献２）に記載される発明および上記論文に記載されるコンストラクトＣＴＢ−ＰｓａＡは、本発明と最も似通っていると言うことができる。しかしながら、上記国際出願では、タンパク質またはその機能ユニットを、独立したワクチン成分として用いることが提案されている。本発明は、さらに、キメラタンパク質に基づいており、このキメラタンパク質は、その特定Ｓ．ニューモニエタンパク質構成成分を除いて、アジュバントも含む。したがって、本発明の原型は、ブラジルの著者らが記載したキメラタンパク質である。

キメラタンパク質ＣＴＢ−ＰｓａＡは、血清型６ＢのＳ．ニューモニエのＰｓａＡ（２８９番アミノ酸）ならびにアジュバントとしてコレラ毒素の機能を持つＢサブユニットを含む（ＡｒｅａｓＡＰ，ＯｌｉｖｅｉｒａＭＬ，ＭｉｙａｊｉＥＮ，ＬｅｉｔｅＬＣ，ＡｉｒｅｓＫＡ，ＤｉａｓＷＯ，ＨｏＰＬ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎＢ−ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌｓｕｒｆａｃｅａｄｈｅｓｉｎＡｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ：ａｂｉｌｉｔｙｏｆＣＴＢ−ＰｓａＡｔｏｉｎｄｕｃｅｈｕｍｏｒａｌｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｍｉｃｅ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ．２００４Ａｕｇ１３；３２１（１）：１９２−６）（非特許文献８）。しかしながら、正しい分子折り畳みを提供するためには、全長タンパク質ではなくてタンパク質断片、すなわち抗原性決定基を用いる方がより有益で簡単である。まさにこのアプローチ（最も免疫原性のあるタンパク質断片の利用）を用いて、本発明はなされた。本発明者らはまた、ワクチン成分にコレラ毒素またはその成分を使用することは、フラゲリンと比較して安全性が低いと考える、なぜなら、人々はコレラ毒素に対して非常に敏感であるので、たった８μｇの毒素でもひどい下痢を引き起こす可能性がある。このキメラタンパク質の製造方法については、ＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子をプラスミドとは別に増幅し（プラスミドに遺伝子を後から挿入し）、続いてＣＴＢコード遺伝子を含有するベクターの制限酵素部位を介してクローン化した。本発明者らの場合、キメラタンパク質をコードする全長遺伝子の合成を用いた。

国際出願公開第２０１０１２０９２１号パンフレット国際出願公開第２００４１０２１９９号パンフレット

ＤｏｎａｌｉｓｉｏＭＲ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｓＳＭ，ＭｅｎｄｅｓＥＴ，ＫｒｕｔｍａｎＭ．Ａｄｖｅｒｓｅｅｖｅｎｔｓａｆｔｅｒｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．ＪＢｒａｓＰｎｅｕｍｏｌ．２００７Ｆｅｂ；３３（１）：５１−６ＢａｃｌｅＡ，ＤｉｏｔＰ，ＬｅｍａｒｉｅＥ．Ａｎｔｉ−ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌｖａｃｃｉｎｅ：ｊｕｓｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓａｎｄｒｅｓｕｌｔｓ．ＲｅｖＰｎｅｕｍｏｌＣｌｉｎ．１９９７；５３（３）：１２８−３７Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌｖａｃｃｉｎｅ：ａｓｅｃｏｎｄｌｏｏｋ．ＳｏｌｕｔｉｏｎｆｏｒＳＣｏｒＩＭｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌｖａｃｃｉｎｅ．ＰｒｅｓｃｒｉｒｅＩｎｔ．１９９８Ｆｅｂ；７（３３）：１６−８Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｆｏｒｅｌｄｅｒｌｙｓｕｂｊｅｃｔｓ：ｌｉｃｅｎｓｅｅｘｔｅｎｓｉｏｎ．Ｓｔｉｌｌｎｏｐｒｏｏｆｏｆｃｌｉｎｉｃａｌｅｆｆｉｃａｃｙ．ＰｒｅｓｃｒｉｒｅＩｎｔ．２０００Ａｕｇ；９（４８）：１０６−９ＧｒｅｅｎｗｏｏｄＢＭｅｔａｌ．，ＴｒａｎｓＲＳｏｃＴｒｏｐＭｅｄＨｙｇ，１９８０，７４：７５６−７６０ＳｃｈｎｅｅｒｓｏｎＲ，ＢａｒｒｅｒａＯ，ＳｕｔｔｏｎＡ，ＲｏｂｂｉｎｓＪＢ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅｔｙｐｅｂｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．ＪＥｘｐＭｅｄ．１９８０Ａｕｇ１；１５２（２）：３６１−７６ＴａｋｕｙａＫａｇｅｙａｍａ，ＭｉｎａｋｏＯｈｉｓｈｉ１，ＳｈｉｎｇｏＭｉｙａｍｏｔｏ，ＨｉｒｏｔｏＭｉｚｕｓｈｉｍａ，ＲｙｏＩｗａｍｏｔｏａｎｄＥｉｓｕｋｅＭｅｋａｄａ．ＤｉｐｈｔｈｅｒｉａＴｏｘｉｎＭｕｔａｎｔＣＲＭ１９７ＰｏｓｓｅｓｓｅｓＷｅａｋＥＦ２−ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌＡｃｔｉｖｉｔｙｔｈａｔＰｏｔｅｎｔｉａｔｅｓｉｔｓＡｎｔｉ−ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃＡｃｔｉｖｉｔｙ．ＲｅｃｅｉｖｅｄＡｐｒｉｌ１６，２００７．ＡｃｃｅｐｔｅｄＭａｙ２，２００７ＡｒｅａｓＡＰ，ＯｌｉｖｅｉｒａＭＬ，ＭｉｙａｊｉＥＮ，ＬｅｉｔｅＬＣ，ＡｉｒｅｓＫＡ，ＤｉａｓＷＯ，ＨｏＰＬ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎＢ−ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌｓｕｒｆａｃｅａｄｈｅｓｉｎＡｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ：ａｂｉｌｉｔｙｏｆＣＴＢ−ＰｓａＡｔｏｉｎｄｕｃｅｈｕｍｏｒａｌｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｍｉｃｅ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ．２００４Ａｕｇ１３；３２１（１）：１９２−６ＢｅｒｒｙＡＭ，ａｎｄＰａｔｏｎＪＣ：ＳｅｑｕｅｎｃｅｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙｏｆＰｓａＡ，ａ３７−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎｐｕｔａｔｉｖｅａｄｈｅｓｉｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｖｉｒｕｌｅｎｃｅｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ１９９６；６４：５２５５−５２６２ＨａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔＳ，ＢｅｔｈｅＧ，ＲｅｍａｎｅＰＨ，ＣｈｈａｔｗａｌＧＳ（１９９９）ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｔｅｉｎＡａｓａｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ６７：１６８３−１６８７ＭｃＤｅｒｍｏｔｔＰ．Ｆ．．Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＧｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅｆｌａｇｅｌｌｉｎａｎｄａｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｙｔｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． −２０００． −Ｖ．６８． −ｐ．：５５２５−５５２９ＭｅａｎｓＴ．Ｋ．ｅｔａｌ．ＴｈｅＴｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ５ｓｔｉｍｕｌｕｓｂａｃｔｅｒｉａｌｆｌａｇｅｌｌｉｎｉｎｄｕｃｅｓｍａｔｕｒａｔｉｏｎａｎｄｃｈｅｍｏｋｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． −２００３． −Ｖ．１７０． −ｐ．：５１６５−５１７５ＳｅｂａｓｔｉａｎｉＧ．ｅｔａｌ．ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｕｒｉｎｅＴｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ５（Ｔｌｒ５）ｇｅｎｅ：ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｔｕｄｉｅｓｉｎＳａｌｍｏｎｅｌｌａ−ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅＭＯＬＦ／Ｅｉｍｉｃｅ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． −２０００． −Ｖ．６４． −ｐ．２３０−２４０ＺａｒｅｍｂｅｒＫ．Ａ．ａｎｄＧｏｄｏｗｓｋｉＰ．Ｊ．ＴｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｕｍａｎＴｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＴｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒｍＲＮＡｓｉｎｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｍｉｃｒｏｂｅｓ，ｔｈｅｉｒｐｒｏｄｕｃｔｓ，ａｎｄｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． −２００２． −Ｖ．１６８． −ｐ．５５４−５６１；Ｄｅｌｎｅｓｔｅ，２００７

本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエのタンパク質ＰｓｐＡの免疫原性断片（１６０−２６２番アミノ酸、ｇｂ｜ＥＨＤ８９２６６．１｜肺炎球菌表面タンパク質Ａ［ストレプトコッカス・ニューモニエ］）、Ｓｐｒ１８９５の免疫原性断片（９４−１６１番アミノ酸、ｒｅｆ｜ＺＰ０１８３６１３９．１｜ＬｙｓＭドメインタンパク質［ストレプトコッカス・ニューモニエ］）、およびＰｓａＡの免疫原性断片（２３８−３０９番アミノ酸、ｇｂ｜ＡＡＦ７０６６７．１｜ＰｓａＡ［ストレプトコッカス・ニューモニエ］）、ならびにフラゲリン成分（１−１６９番アミノ酸、ｇｂ｜ＡＡＢ３３９５２．１｜フラゲリン｛選択的にスプライシングされたもの｝［サルモネラ・チフィリウム］、及び３１１−４０５番アミノ酸、ｇｂ｜ＡＡＢ３３９５２．１｜フラゲリン｛選択的にスプライシングされたもの｝［サルモネラ・チフィリウム］）を含有し、これらが可動性リンカーを介して融合している、高精製されたキメラタンパク質（配列番号１として表されている）を含む肺炎球菌ワクチンを具現化した。ここで、前記フラゲリン成分は、アジュバントとして機能するものである。

本発明を以下の図面で図示する：
キメラタンパク質、αヘリックス、およびβシートの三次元構造を示す。キメラタンパク質、アミノ酸残基の三次元構造を示す。１ＬＤのＳ．ニューモニエで感染後のマウス生存率（％）の動態（予防モデル）。１ＬＤのＳ．ニューモニエで感染後のマウス生存率（％）の動態（治療モデル）。

本発明のワクチンは、高精製されたキメラタンパク質を生理学的に許容可能なキャリアと混合した結果、得られる。本発明に一致したキメラタンパク質を製造するには、分子生物学および微生物学の標準方法を用いることができ、そのような方法は、当業者にとってなじみ深いものである。そのような方法は、科学文献に十分に記載されている。

ワクチンが導入されると、生命体は、ワクチンのキメラタンパク質に存在する細菌表面タンパク質のエピトープに対する抗体を産生し、Ｓ．ニューモニエの進入に反応して抗体を産生する能力を獲得する。肺炎球菌の全ての血清型に存在する肺炎球菌保存タンパク質の抗原性決定基は、ワクチンのキメラタンパク質に表現されている；したがって、ワクチン接種後、どの肺炎球菌血清型に対峙した際にも免疫応答が発現するだろう。複数のタンパク質のエピトープの利用は、ワクチン効力を向上させるだろう。ヒト血清中にＳ．ニューモニエの感染防御抗体が存在することで、ヒトは病気にならないか、または病気になってもあまり悪くならずにすむだろう。

本ワクチンは、予防および治療の両方の効果を有する。

本発明を用いると、タンパク質が、複数の肺炎球菌保存タンパク質の免疫原性エピトープにより表現されており、そのタンパク質で特定の免疫応答が免疫記憶形成を伴って起こるという事実に従って、Ｓ．ニューモニエにより引き起こされる疾患に関して予防および治療の両方の効果が得られるので、技術的な結果として、世界的な肺炎球菌の防御になる。

本発明を用いると、フラゲリン成分で表されるアジュバントにより、技術的な結果として、ワクチン活性成分に対する免疫応答も増強される。

無毒の作用剤、すなわちアジュバント（フラゲリン成分で表される）の使用に従い、技術的な結果として、ワクチン安全性も向上する。

キメラタンパク質のモデル設計
キメラポリペプチドとして計画したのは、複合マルチドメインタンパク質（５つのドメイン：ＦｌｉＣ１、ＦｌｉＣ２、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、Ｓｐｒ１８９５）である。マルチドメインタンパク質のモデル設計のため、以下の手順を用いた：ドメイン乗り込み体の見積もり、ドメイン配向を見積もるための全タンパク質モデルの構築、各ドメインについてのモデルの構築（三次元構造の例およびアブイニシオに基づくモデル設計を使用）、全タンパク質モデルを用いた各モデルの結合。

計画したキメラポリペプチドにおいて、２つのドメインには原型が存在したが、３つのドメインはアブイニシオに基づくモデル設計が必要であった；そのうえ、アブイニシオに基づくモデル設計を行ううちに、ドメイン間に可動性リンカーを形成させなければいけなくなった。

自動モードで現実的な結果を得るため、Ｉ−Ｔａｓｓｅｒアルゴリズムを用いた。このアルゴリズムは、過去３回のＣＡＳＰ（タンパク質構造予測の批判的評価）、すなわちタンパク質モデリングのコンテストで最良のものであったと判断されている。この解析は３日間行われた。しかしながら、この強力なアルゴリズムを持ってしても、ドメインおよびそれらの乗り込み体のアブイニシオに基づくモデル設計を含むマルチドメインタンパク質についての現実的なデータ生成は、完全には有効性が保証されない（７０％）。

より正確なデータを生成させる目的で、マルチドメインタンパク質を、使用されているドメインに分解し、それからＩ−Ｔａｓｓｅｒを用いて各ドメインのモデル設計を行い、続いてそれらを結合させた。

上記の工程全てを行って、得られた構造を図１、図２に示す。

モデル設計されたキメラタンパク質は、５３６のアミノ酸残基からなる；そのアミノ酸配列を配列番号１に示す。ＰｒｏｔＰａｒａｍプログラム（ｈｔｔｐ：／／ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ．ｈｔｍｌ）によるこのタンパク質のアミノ酸配列の分析から、キメラタンパク質の分子量は、５６．６ｋＤａ、ｐＩは４．５６であることがわかった。

キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列の生成。
タンパク質断片ＰｓｐＡ、Ｓｐｒ１８９５、ＰｓａＡ、ＦｌｉＣを含むキメラタンパク質のアミノ酸配列を、ヌクレオチド配列（１６２３ｂｐ）に翻訳し、次いでＥ．コリ細胞で発現するのに最適であるように変更した。

このヌクレオチド配列の合成は、文献に記載されている方法（Ｍａｊｕｍｄｅｒ，１９９２）に従って、重複するオリゴヌクレオチドを延長させるやり方で行った。オリゴヌクレオチドは、キメラ遺伝子の断片を表しており、７０ヌクレオチドの長さがあって、その中に２０ヌクレオチドの重複領域が含まれていた。主なプライマー必要条件は以下の通りであった：プライマー長は６０ヌクレオチドを超えてはならず、その一方でハイブリッド形成部位は２０ヌクレオチドより短くてはならない。そのうえさらに、長い末端Ｇ／Ｃ繰返しは存在してはならなかった。場合によっては、最適プライマーの選択は、プライマー・テンプレート運動を介して、またはプライマーの長さを３〜６ヌクレオチドぶん変えることで、経験的に行われた。まとめると、１６２３ｂｐ長のキメラ遺伝子を合成するために、５９のプライマーを用いた。合成した断片（各３００ｂｐ）を、ゲル電気泳動で抽出して、プラスミドベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙにクローン導入した。クローン導入は、制限部位Ｋｐｎｌ、ＳａｃＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩを含めて、または場合によっては平滑末端を介して行った。配列決定後、断片を増幅させ、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によりつなぎ合わせてキメラタンパク質のヌクレオチド配列にした。断片の連結によるキメラ遺伝子合成の最終段階後、人工遺伝子をＫｐｎＩおよびＳａｃＩ制限部位を介してｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローン導入した。製造された遺伝子は、さらなる制限部位と隣接した：５'末端でＥｃｏＲＩ、および３'末端でＸｈｏＩである。次に、人工遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限部位を介して発現ベクターｐＥＴ２４ａに再度クローン導入した。

キメラタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡの生成。
実施例２に記載の方法に従って、肺炎球菌ワクチン製造用のヌクレオチド配列を得た。

得られる遺伝子を、その後の発現用に、ｐＥＴ２４ａプラスミドにクローン導入した。そのため、遺伝子とｐＥＴ２４ａベクターの連結を、適切な緩衝液およびリガーゼを用いて行った。反応は、＋２０℃で２時間行った。

混合物を＋９５℃で１０分間加温し、ついで、孔径０．０２５μｍのニトロセルロース膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）で透析することで塩類を除去した。透析は、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１０％グリセロール溶液に対して１０分間行った。

キメラ遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡを増幅させるためのＥ．コリ株の生成。
実施例３に記載の方法に従って、肺炎球菌ワクチンを作るための遺伝子のヌクレオチド配列が生成したので、それをｐＥＴ２４ａベクターにクローン導入した。以下の遺伝子型を有する株ＤＨ１０Ｂ／Ｒ（ＧｉｂｋｏＢＲＬ、США）由来のＥ．コリ細胞を、得られたプラスミドで、電気穿孔法により形質転換した：Ｆ−ｍｃｒＡΔ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ｄｅｏＲｒｅｃＡ１ｅｎｄＡ１ａｒａＤ１３９ Δ（ａｒａ、ｌｅｕ）７６９ｇａｌＵｇａｌＫλ− ｒｐｓＬｎｕｐＧ。

形質転換後、細胞を、ＳＯＣ培地（２％のｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％の酵母菌抽出物、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＭｇＳＯ_４、２０ｍＭのグルコース）中、＋３７℃で４０分間インキュベートした。

プラスミドの存在を同定するため選択培地（ＬＢ寒天および１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有）中でＥ．コリ細胞のスクリーニングを行い、適切なＥ．コリ細胞を試料採取することで、キメラ遺伝子含有プラスミドＤＮＡをその後に増幅するためのＥ．コリ株を得た。

増殖したクローンから、ＷｉｚａｒｄＭｉｎｉｐｒｅｐｓＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いて、プラスミドＤＮＡを抽出した。

精製したプラスミドＤＮＡは、必要としていたものであることが、限定解析および配列決定から証明された。調査の課程において、プラスミド中に必要な大きさのＤＮＡフラグメントを含有するクローンを試料採取した。次に、そのようなプラスミドを、その後の遺伝子発現誘導のために抽出した。

キメラタンパク質産生Ｅ．コリ株の獲得。
実施例４に記載の方法に従って、肺炎球菌ワクチンを製造するためのタンパク質のヌクレオチド配列が得られたので、これをｐＥＴ２４ａプラスミドにクローン導入した；得られたプラスミドをＤＨ１０Ｂ／Ｒ株由来のＥ．コリ細胞で増幅させ、次いで抽出した。

タンパク質を発現させるため、以下の遺伝子型を持つ株ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）由来のＥ．コリ細胞を用いた：Ｆ−ｏｍｐＴｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌｄｃｍｒｎｅ１３１（ＤＥ３）、ゲノム中にλＤｅ３溶原菌およびｒｎｅ１３１変異を含有。変異ｒｗｅ遺伝子（ｒｎｅ１３１）は、ＲＮＡ分解酵素Ｅの短略型をコードし、この短略型は、細胞内ｍＲＮＡ解重合を減少させ、そうすることでその発酵安定性を高める。プロテアーゼ遺伝子のｌｏｎ変異およびｏｍｐＴ変異は、タンパク質分解されていない組換えタンパク質を高収率で得ることを可能にする。

遺伝子型Ｆ−ｏｍｐＴｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌｄｃｍｒｎｅ１３１（ＤＥ３）を持つ株ＢＬ２１由来のＥ．コリ細胞を、以下のとおり調製した。細胞を、５ｍｌのＬブロス（１％のトリプトン、１％の酵母菌抽出物、および１％の塩化ナトリウム含有）中で、＋３７℃で一晩インキュベートした。培養物を、新たなＬブロスで５０〜１００倍に希釈し、震盪撹拌インキュベーターに入れて、波長５９０ｎｍでの吸光度（ＯＤ）が０．２〜０．３になるまで、＋３７℃で培養した。０．３ＯＤに達したら、培養物を新たなＬブロスで０．１ＯＤまで希釈し、３０分間培養した。１００ｍｌ体積の培養物を、滅菌遠心管に移し、＋４℃、５０００ｇで１０分間、細胞のペレット化を行った。上清を廃棄し、細胞を脱イオン水に再懸濁させ、最初の体積にして、引き続き遠心を行った。この洗浄工程を３回繰り返した。洗浄後、細胞ペレットを少量の脱イオン水に再懸濁させ、懸濁液を微量遠心機にて、５０００ｒｐｍで３０秒間遠心した。

コンピテント細胞の形質転換は、電気穿孔法により行った。そのため、コンピテント細胞１２μｌに１μｌのプラスミドＤＮＡを添加し、懸濁液を混合した。その後の電気穿孔法は、滅菌室中で、パルス発生器ＧＶＩ−１（ΓΒИ−１）（サンクトペテルブルク工科大学、Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ）を用いて、１０ｋＶ／ｃｍで４ｍｓｅｃ間行った。

形質転換後、細胞を、ＳＯＣ培地（２％のｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％の酵母菌抽出物、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＭｇＳＯ_４、２０ｍＭのグルコース）中、＋３７℃で４０分間インキュベートした。プラスミドを持つクローン（生産株）を選択するため、細胞懸濁液１０〜１００μｌを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）含有選択ＬＢ培地（ＧｉｂｋｏＢＲＬ、ＵＳＡ）に移した。

コンピテントＥ．コリ細胞の形質転換後に得られたプラスミドは、コードされた組換えタンパク質を高レベルで発現した。

Ｓｔｕｄｉｅｒ法に従い０．２％のラクトースによりタンパク質合成を誘導することで、Ｅ．コリ細胞において、肺炎球菌ワクチン製造用のキメラタンパク質を産生させる。
実施例５に記載の方法に従って、肺炎球菌ワクチン製造用のキメラタンパク質のヌクレオチド配列が得られたので、これをｐＥＴ２４ａプラスミドにクローン導入した；得られたプラスミドをＤＨ１０Ｂ／Ｒ株由来のＥ．コリ細胞で増幅させ、抽出し、それを用いて、標的遺伝子発現の誘導を目的として、ＢＬ２１株由来のＥ．コリ細胞を形質転換した。

得られた産生株を培養する目的で、非特異的発現を遮断するためのアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）および１％グルコースを含有する標準の寒天ＬＢ培地を用いた。

細胞培養物の吸光度が６００ｎｍで０．６〜０．８ＯＤに到達してから、発現誘導を行った。

誘導剤として、０．２％ラクトースを用いた（Ｓｔｕｄｉｅｒ，２００５）。

Ｓｔｕｄｉｅｒの方法（Ｓｔｕｄｉｅｒ，２００５）に従って発現を自動誘導するため、１％のペプトン（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）、０．５％の酵母菌抽出物（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）、５０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、５０ｍＭのＫ_２ＨＰＯ_４、２５ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２ｍＭのＭｇＳＯ_４、０．５％のグリセロール、０．０５％のグルコース、および０．２％のラクトースを含有するＰＹＰ−５０５２培地を用いた。

単独の産生株コロニーを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）含有ＰＹＰ−５０５２培地に播種した。発酵は、恒温シェーカーに入れて、２５０ｒｐｍで、１時間あたりのＯＤ_６００に明らかな変化が記録されなくなるまで、２０時間＋３７℃で行った。ワクチンタンパク質をコードする遺伝子の発現解析を目的として、細胞を一定分量取り分けた。発現解析は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により行った。バイオマスの残りの分は、９０００ｇで遠心してペレットにした。

タンパク質は、細胞溶解によりＥ．コリ細胞から抽出した。細胞を、緩衝液５〜７ｍｌあたり細胞１ｇを基準として、溶解緩衝液（２０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、および１ｍＭのフェノキシメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含有）に再懸濁させた。細胞懸濁液に３０秒間隔で３０秒間の超音波処理を７回行った（２２ｋＨｚ）。溶解液を、＋４℃、５０００ｇで１０分間遠心した。上清を廃棄し、ペレットを１Ｍの尿素溶液に、細胞１ｇあたり１０ｍｌを基準として加えて、激しく混合することにより、再懸濁させた。遠心工程を繰返した。上清を廃棄し、ペレットを同体積の２Ｍの尿素溶液に再懸濁させた。遠心工程を繰返した。上清を廃棄した。

ＳＤＳ−Ｐａｇｅ（ドデシル硫酸ナトリウムを用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動）データによれば、得られた生成物には、約９７％のキメラタンパク質が含まれており、濃度は１ｍｇ／ｍｌであった。

抽出および精製条件は実験的に調整されたものであって、当業者になじみある範囲である程度変更することができる。

致死性Ｓ．ニューモニエ感染の予防モデルにおける、タンパク質断片ＰｓｐＡ、Ｓｐｒ１８９５、ＰｓａＡ、ＦｌｉＣ含有キメラタンパク質を含むワクチンの予防効果。
キメラタンパク質の予防効果を見積もるため、マウスを用いた。

対照群および実験群は、７〜８週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウス（体重１８〜２０ｇ）３０匹で構成された。キメラタンパク質１０μｇを各マウスに導入した。接種の１週間後、マウスを肺炎球菌に感染させた：マウス１匹あたりＳ．ニューモニエ１０^４ｃｆｕ（コロニー形成単位）を腹部注射した（これはマウスにとって最小致死量である）。生存実験を、肺炎球菌の致死量注射の直後から開始し、１４日間継続した（図３）。

組換えキメラタンパク質に基づくワクチンで免疫化されたマウスは、感染から１週間後に８０％、および１４日目に６８％の生存率を示した。対照群の生存率は、５日目に０％になった。

つまり、提供するワクチンは、保護効果を有している。そのうえ、試験した用量のワクチン（１０μｇ／マウス）は、マウスにまったく毒作用を示さなかった。

致死性Ｓ．ニューモニエ感染の治療モデルにおける、タンパク質断片ＰｓｐＡ、Ｓｐｒ１８９５、ＰｓａＡ、ＦｌｉＣ含有キメラタンパク質を含むワクチンの予防効果。
対照群および実験群は、７〜８週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウス（体重１８〜２０ｇ）３０匹で構成された。マウスを肺炎球菌に感染させた：マウス１匹あたりＳ．ニューモニエ１０^４ｃｆｕ（コロニー形成単位）を腹部注射した（これはマウスにとって最小致死量である）。同日、キメラタンパク質１０μｇを各マウスに接種した。生存実験を、肺炎球菌の致死量注射の直後から開始し、１４日間継続した。

肺炎球菌およびキメラタンパク質に基づくワクチンの両方を同時導入した後、マウスは、導入から１週間後に７６％、および１４日目に６５％の生存率を示した。対照群の生存率は、５日目に０％になった。

このような結果は、本発明が提供するワクチンの高い免疫原性を証明している。したがって、本ワクチンは、肺炎球菌感染症の治療に用いることができる。

Claims

ストレプトコッカス・ニューモニエのタンパク質の断片：ＰｓｐＡ、Ｓｐｒ１８９５、およびＰｓａＡ、ならびにフラゲリン成分を含有し、これらが可動性リンカーを介して融合し、前記フラゲリン成分はアジュバントとして機能するものであり、配列番号１として表されているキメラタンパク質を含む、肺炎球菌ワクチン。