CN103501809B - 针对肺炎链球菌（Streptococcus Pneumoniae）的疫苗和组合物 - Google Patents

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Abstract

肺炎链球菌是主要的健康问题，特别是对非常年幼、年老或者免疫受损的患者。本披露尤其提供了某些针对肺炎链球菌高度有效的疫苗和药物组合物。这些抗原可以治疗性地或预防性地使用。

Description

针对肺炎链球菌（Streptococcus Pneumoniae）的疫苗和组 合物
相关申请
本申请要求2011年1月20日提交的美国临时申请号61/434,818的申请日的权益。所提到的申请的整个传授内容通过引用明确地结合在此。
政府支持
这项工作是在政府支持下在由美国国家卫生研究院(National Institutes ofHealth)授予的许可号AI066013下进行的。因此，美国政府拥有本发明中的某些权利。
I.背景
肺炎球菌疾病一直是美国乃至全球范围内导致疾病和死亡的主要原因。每年数以百万计的肺炎、脑膜炎、菌血症以及中耳炎的病例都是由病原体肺炎链球菌感染所致。肺炎链球菌是具有荚膜的革兰氏阳性球菌，它在大约5％-10％的健康成人和20％-40％的健康儿童的鼻咽中都有定植。当肺炎链球菌被携带到咽鼓管、鼻窦、肺、血流、脑膜、关节间隙、骨骼以及腹膜腔中时，正常的定植变成有感染性的。肺炎链球菌具有若干毒力因子，它们使得有机体能够避开免疫系统。实例包括多糖荚膜，它防止被宿主免疫细胞吞噬；蛋白酶，它们抑制补体介导的调理作用；以及蛋白质，它们引起宿主细胞溶解。在多糖荚膜中，复合多糖的存在形成了将肺炎双球菌分成不同血清型的基础。到目前为止，已经鉴定出了肺炎链球菌的93种血清型。
已经使用不同的药物组合物来利用针对肺炎链球菌感染的免疫应答。多价肺炎球菌疫苗PPV-23被开发用来预防成人和老年群体中由于肺炎链球菌所造成的肺炎和其他侵袭性疾病。所述疫苗含有来自肺炎链球菌的23种血清型的荚膜多糖(CP)。作为T细胞非依赖性抗原，这些CP只诱导短暂的抗体应答，从而需要重复给药，这增加了免疫耐受性的风险。针对肺炎链球菌出现的抗体称为抗荚膜抗体，被认为对成人和具有免疫能力的个体具有保护作用。然而，年龄在2 岁以下的儿童和免疫受损的个体，包括老年人，不能很好地对T细胞非依赖性抗原作出反应，并且因此，不能得到PPV-23的最佳保护。另一种肺炎链球菌疫苗沛儿(Prevnar)包括与白喉类毒素蛋白质结合的来自7种肺炎链球菌菌株的细菌多糖。这种疫苗诱导B和T细胞应答。然而，因为它只提供针对7种肺炎球菌血清型的保护，所以血清型替换会致使沛儿失效。血清型替换已经在若干临床试验和流行病学研究中得到证明，从而需要开发这些疫苗的不同制剂。实例是最近引进的针对13种肺炎球菌血清型的沛儿13(Prevnar13)。另外，这两种沛儿制剂制造起来昂贵，大大地限制了它们在发展中世界的可供使用性。由23种经纯化的但未结合的多糖组成的PPV-23具有更广泛的覆盖范围，但对处于肺炎球菌疾病的最高风险中的群体，即年龄在2岁以下的儿童不提供保护。
因此，仍然需要设计比当前策略提议更有效的药物组合物。具体来说，这些组合物需要合并新颖的或特异性抗原来引发针对肺炎链球菌的免疫应答。
II.发明内容
肺炎链球菌是主要的健康问题，特别是对非常年幼、年老或者免疫受损的患者。虽然肺炎链球菌的DNA和蛋白质序列信息已经知道了一段时间，并且研究人员长期以来已经尝试产生针对肺炎链球菌的疫苗，但是主要问题是如何从肺炎链球菌基因组中的约2100个基因中鉴定出保护性多肽。本申请呈现了被设计用来鉴定肺炎链球菌基因组中最具免疫原性蛋白质的全基因组筛选的结果。这一筛选所产生的若干命中物已经在小鼠模型中显示了针对肺炎链球菌定植的保护，以及在一些情况下针对定植和肺炎链球菌诱导的败血症的保护。因此，本披露尤其提供了某些针对肺炎链球菌的高度有效的疫苗。这些疫苗可以用于治疗性的或预防性的用途。本披露还提供了特异性抗原和使用这些抗原来引发针对肺炎链球菌的免疫应答的方法。
在某些方面，本披露提供了疫苗制剂，它包含药学上可接受的载体和具有包含SEQID NO：265或268(或由其组成)的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。在一些实施例中，所述多肽包含外源信号序列。举例来说，所述多肽可以具有包含SEQ ID NO：266的氨基酸序列或其免疫原性片段。所述多肽可以具有由以下各项组成的氨基酸序列：SEQ ID NO：265、266或268。
在一些实施例中，所述疫苗制剂进一步包含第一多肽，它具有包含SEQ ID NO：1-23、267以及269-270之一(或由其组成)的氨基酸序列或其免疫原性片段。在某些实施例中，所述疫苗制剂进一步包含第二多肽，它具有包含SEQ ID NO：1-23、267以及269-270中的任一个的氨基酸序列或其免疫原性片段。
在某些实施例中，所述第一和所述第二多肽属于(i)-(vi)的不同组：(i)SEQ IDNO：1或其免疫原性片段，(ii)SEQ ID NO：2-5和14-17之一或其免疫原性片段，(iii)SEQ IDNO：6-7和18-19之一或其免疫原性片段，(iv)SEQ ID NO：8或其免疫原性片段，(v)SEQ IDNO：9-10和20-21之一或其免疫原性片段，以及 (vi)SEQ ID NO：11-13、267以及269-270之一或其免疫原性片段。
在一些此类实施例中，所述疫苗制剂包含具有包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列的多肽。在一些实施例中，所述疫苗制剂包含由SEQ ID NO：6或7组成的多肽和由SEQ ID NO：9或 10组成的多肽。
在此的方面或实施例中的任一个中，所述疫苗制剂可以包含SEQ ID NO： 265、266或268的多肽，它是具有从1到20个氨基酸残基从N末端、C末端或两个去除的截短片段。在一些实施例中，所述疫苗制剂实质上不含除具有包含 SEQ ID NO：1-21和265-270中的任一个的氨基酸序列的多肽外的其他肺炎链球菌多肽。
在某些实施例中，所述疫苗制剂包含一种或多种多肽，它或它们具有包含SEQ IDNO：22或23的氨基酸序列或其免疫原性片段。
在另一个方面，本发明提供了多种疫苗制剂，它们包含已知的肺炎链球菌抗原，如pneumolysoid、胆碱结合蛋白A(CbpA)或肺炎球菌表面蛋白A (PspA)或其衍生物；以及来自表1或表2的一种、两种或三种多肽。示例性疫苗制剂包含：(i)多肽，它具有包含SEQ ID NO：1-23和265-270中的一个或多个 (或由其组成)的氨基酸序列或其免疫原性片段，(ii)pneumolysoid，以及(iii)药学上可接受的载体。另一种示例性疫苗制剂包含：(i)多肽，它具有包含SEQ ID NO：1-23和265-270中的一个或多个(或由其组成)的氨基酸序列或其免疫原性片段，(ii)CbpA或其衍生物，以及(iii)药学上可接受的载体。另一种示例性疫苗制剂包含：(i)多肽，它具有包含SEQ ID NO：1-23和265-270中的一个或多个 (或由其组成)的氨基酸序列或其免疫原性片段，(ii)PspA或其衍生物，以及(iii) 药学上可接受的载体。在一些此类实施例中，(i)的多肽包含SEQ ID NO：2-5、 6、7、9-13以及265-267中的任一个。在一些实施例中，所述疫苗制剂进一步包含第二多肽，它具有包含SEQ ID NO：1-23和265-270之一的氨基酸序列。在一些实施例中，pneumolysoid是PdT、Pd-A、Pd-B、rPd2、rPd3、Ply8、Δ6PLY、 L460D(参见例如US2009/0285846和L.米切尔(L.Mitchell)，对肺炎链球菌pneumolysoid的保护性免疫应答(Protective Immune Responses to Streptococcuspneumoniae Pneumolysoids)，ASM2011会议摘要，2011)或其变体。在一些实施例中，PspA的衍生物包含PspA的脯氨酸富集区的全部或片段。
在某些实施例中，所述多肽与免疫原性载体结合。在一些实施例中，所述疫苗制剂包含至少脂化多肽。
在一些实施例中，所述疫苗制剂进一步包含结合的肺炎链球菌多糖。这些结合多糖可以例如如美国专利5,623,057、美国专利5,371,197或 PCT/US2011/023526中所述。
在一些实施例中，所述疫苗制剂进一步包含佐剂。所述佐剂可以是例如toll 样受体(TLR)激动剂。所述佐剂可以是例如明矾。在一些实施例中，所述疫苗制剂包含1-1000μg的每种多肽和1-250μg的所述佐剂。
在某些实施例中，所述疫苗制剂所诱导的TH17细胞应答比通过对照组无关抗原在接触TH17细胞之后所诱导的TH17细胞应答大至少1.5倍。在一些实施例中，所述疫苗制剂在未感染的受试者中抑制了被肺炎链球菌感染。在某些实施例中，所述疫苗制剂抑制了肺炎链球菌在个体中定植。在一些实施例中，所述疫苗制剂抑制肺炎链球菌症状或后遗症。举例来说，所述疫苗制剂抑制肺炎链球菌诱导的败血症。
在某些方面，本披露提供了用于治疗罹患或易受肺炎链球菌感染的受试者的方法，它包含给予有效量的在此描述的这些疫苗制剂中的任一种。
在一些实施例中，所述方法在未感染的受试者中抑制了被肺炎链球菌感染。在一些实施例中，所述方法抑制了肺炎链球菌在受试者中定植。在一些实施例中，所述方法抑制肺炎链球菌症状或后遗症。示例性后遗症是败血症。
在某些实施例中，所述方法用一个剂量治疗受试者。在其他实施例中，所述方法用两个或三个剂量治疗受试者。在一些实施例中，所述方法在三个剂量内治疗受试者。
在某些实施例中，所述受试者是人类。
本披露提供了例如疫苗制剂，它包含药学上可接受的载体和一种或多种多肽，所述一种或多种多肽具有包含SEQ ID NO：1-13、265、266以及267中的任一个的氨基酸序列或其免疫原性片段。
本披露还提供了疫苗制剂，它包含药学上可接受的载体和至少一种多肽，所述至少一种多肽具有包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：265 的氨基酸序列或其免疫原性片段。本披露进一步提供了疫苗制剂，它包含药学上可接受的载体和至少一种多肽，所述至少一种多肽具有由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：265组成的氨基酸序列或其免疫原性片段。
另外，本申请提供了疫苗制剂，它包含药学上可接受的载体和一种或多种多肽，所述一种或多种多肽具有包含SEQ ID NO：14-23、268、269以及270中的任一个的氨基酸序列或其免疫原性片段。
本披露进一步提供了免疫原性组合物，它包含药学上可接受的载体和两种或更多种多肽，所述两种或更多种多肽具有包含SEQ ID NO：1-13、265、266以及267中的任一个的氨基酸序列或其免疫原性片段。
本披露还提供了疫苗制剂，它包含药学上可接受的载体和两种或更多种多肽，所述两种或更多种多肽具有包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：265的氨基酸序列或其免疫原性片段。本披露进一步提供了疫苗制剂，它包含药学上可接受的载体和两种或更多种多肽，所述两种或更多种多肽具有由 SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：265组成的氨基酸序列或其免疫原性片段。本披露还提供了疫苗制剂，它包含药学上可接受的载体和两种或更多种多肽，所述两种或更多种多肽具有包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9以及 SEQ ID NO：265的氨基酸序列或其免疫原性片段。另外，本披露提供了疫苗制剂，它包含药学上可接受的载体和两种或更多种多肽，所述两种或更多种多肽具有包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10以及SEQ ID NO：265的氨基酸序列或其免疫原性片段。在一些实施例中，包含SEQ ID NO：265的氨基酸序列包含外源信号序列。
本披露还提供了疫苗制剂，它包含药学上可接受的载体和三种或更多种多肽，所述三种或更多种多肽具有对应地包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10以及SEQ ID NO：265的氨基酸序列或其免疫原性片段。本披露进一步提供了疫苗制剂，它包含药学上可接受的载体和三种或更多种多肽，所述三种或更多种多肽具有对应地由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9以及SEQ ID NO：265组成的氨基酸序列或其免疫原性片段。
III.附图简要说明
图1显示了由小鼠的血液样品所产生的IL-17的浓度，这些小鼠用一种或多种指定蛋白质和霍乱毒素佐剂进行免疫，接着用杀死的无荚膜的全细胞肺炎链球菌进行刺激，如实例5中所述。左图以散点图形式显示了数据，并且右图显示了每种样品的平均值和标准偏差。免疫组“All3”表示用SP2108、SP0148以及 SP1634的组合免疫的动物。
图2显示了由小鼠的血液样品所产生的IL-17的浓度，这些小鼠用一种或多种指定蛋白质和霍乱毒素佐剂进行免疫，接着用三种蛋白质(SP2108、SP0148 以及SP1634)的组合进行刺激，如实例5中所述。
图3显示了从小鼠的洗鼻液中获得的肺炎链球菌菌落的数目，这些小鼠用一种或多种指定蛋白质和霍乱毒素佐剂免疫，接着通过鼻内给予肺炎链球菌进行攻击，如实例5中所述。003表示对照组无关抗原。
图4显示了由小鼠的血液样品所产生的IL-17的浓度，这些小鼠用一种或多种指定蛋白质和霍乱毒素佐剂进行免疫，接着用杀死的无荚膜的全细胞肺炎链球菌进行刺激，如实例6中所述。
图5显示了由小鼠的血液样品所产生的IL-17的浓度，这些小鼠用一种或多种指定蛋白质和霍乱毒素佐剂进行免疫，接着用一种或多种指定蛋白质进行刺激，如实例6中所述。
图6显示了从小鼠的洗鼻液中获得的肺炎链球菌菌落的数目，这些小鼠用一种或多种指定蛋白质和霍乱毒素佐剂进行免疫，接着通过鼻内给予肺炎链球菌进行攻击，如实例6中所述。基因名称为US12(NP_044543.1、NC_001798.1；在所述图中显示为003)的HSV-2蛋白ICP47和卵白蛋白(OVA)表示对照组抗原。
图7显示了从小鼠的洗鼻液中获得的肺炎链球菌菌落的数目，这些小鼠用一种或多种指定蛋白质和霍乱毒素佐剂进行免疫，接着通过鼻内给予肺炎链球菌进行攻击，如实例7中所述。
图8显示了从BALB/c小鼠的洗鼻液中获得的肺炎链球菌菌落的数目，这些小鼠用一种或多种指定蛋白质和霍乱毒素佐剂进行免疫，接着通过鼻内给予肺炎链球菌进行攻击，如实例8中所述。
图9显示了由小鼠的血液样品所产生的IL-17A的浓度，这些小鼠用指定蛋白质和霍乱毒素佐剂进行免疫，接着用免疫蛋白质(左图)或杀死的无荚膜的全细胞肺炎链球菌(右图)进行刺激，如实例9中所述。
图10显示了从小鼠的洗鼻液中获得的肺炎链球菌菌落的数目，这些小鼠用指定蛋白质和霍乱毒素佐剂进行免疫，接着通过鼻内给予肺炎链球菌进行攻击，如实例10中所述。
图11显示了小鼠的存活情况，这些小鼠用指定蛋白质和佐剂明矾进行免疫，接着用肺炎链球菌进行吸气攻击，如实例11中所述。
图12显示了小鼠的存活情况，这些小鼠用指定蛋白质和佐剂明矾进行免疫，接着用肺炎链球菌进行吸气攻击，如实例12中所述。
图13显示了从小鼠的洗鼻液中获得的肺炎链球菌菌落的数目，这些小鼠用指定蛋白质和霍乱毒素佐剂进行免疫，接着通过鼻内给予肺炎链球菌进行攻击，如实例13中所述。
图14显示了由小鼠的血液样品所产生的IL-17A的浓度，这些小鼠用指定蛋白质和明矾进行免疫，接着用左上方指定的蛋白质进行刺激，如实例14中所述。
图15显示了从小鼠的洗鼻液中获得的肺炎链球菌菌落的数目，这些小鼠用指定蛋白质和明矾或者用杀死的无荚膜的全细胞肺炎链球菌加明矾(WCV)进行免疫，接着通过鼻内给予肺炎链球菌进行攻击，如实例15中所述。
图16显示了从小鼠的洗鼻液中获得的肺炎链球菌菌落的数目，这些小鼠用指定蛋白质和明矾或者用杀死的无荚膜的全细胞肺炎链球菌加明矾(WCV)进行免疫，接着通过鼻内给予肺炎链球菌进行攻击，在如实例16中所述的两个合并研究中。
图17显示了从小鼠的洗鼻液中获得的肺炎链球菌菌落的数目，这些小鼠用指定蛋白质和明矾或者用杀死的无荚膜的全细胞肺炎链球菌加明矾(WCB)进行免疫，接着通过鼻内给予肺炎链球菌进行攻击，如实例17中所述。
图18显示了小鼠的存活情况，这些小鼠用对指定蛋白质有特异性的抗体或血清注射，接着用肺炎链球菌进行吸气攻击，如实例18中所述。
图19显示了在六个分开的吸气攻击研究中受保护免于发生败血症的动物的百分比，在实例12和18中更详细地描述了这些研究中的两个。
IV.详细说明
A.用于肺炎链球菌疫苗和免疫原性组合物的特异性多肽和核酸
本申请所述的肺炎链球菌疫苗包括一种或多种如表1中所列的多肽或者基因，或下文所述的它们的变体或片段。所述疫苗可以包括包含表1的序列或者其变体或者免疫原性片段的多肽，或者由表1的序列或其变体或者免疫原性片段组成的多肽。每种基因和多肽的DNA和蛋白质序列可以通过在公用数据库Entrez Gene(在万维网上的NCBI NIH网站，www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gene) 中在肺炎链球菌TIGR4基因组中搜索基因座标签找到，并且所指定的序列也包括在本申请中。
表1.用于疫苗制剂的免疫原性多肽
*NB：所述数据库序列在核苷酸位置541-543处错误地列出了TTG(编码 Leu)。如在SEQ ID NO：28中所显示的正确序列在那个密码子处具有TTC并且编码Phe。所述数据库序列进一步不包括在某些分离株中发现的C末端Glu。
下文更详细地描述表1的某些多肽和其变体。
1.SP1912(SEQ ID NO：265)和其变体
SP1912是具有99个氨基酸的假定蛋白。虽然所述蛋白质功能不是确定地已知的，但是序列分析表明它是假定的硫氧还蛋白。
在一些实施例中，包含肺炎链球菌多肽的疫苗或药物组合物包含含有选自SP1912的至少20个连续的氨基酸残基的多肽。所述多肽还可以是这至少20个残基的片段的变体。在某些实施例中，所述多肽包含S P1912中的不超过90、 75、60、45或30个连续的氨基酸。
在一些实施例中，在此的组合物和方法要求使用SP1912变体，它包含外源性脂化序列。在一些实施例中，信号序列指导脂化。因此，所述脂化信号可以是例如SP2108(SEQ IDNO：275)或SP0148的信号序列或大肠杆菌(E.coli)信号序列。包含大肠杆菌基因RlpB的信号序列(SEQ ID NO：276)的示例性变体 SP1912L由多肽序列SEQ ID NO：266表示。SP1912(SEQ ID NO：265)和 SP1912L(SEQ ID NO：266)可以对应地由根据SEQ ID NO：271和272的核酸编码，但是由于遗传密码的简并，可以使用其他DNA序列(包括密码子优化序列)。
说明来自不同血清型的SP1912序列的组合的共有序列表示为SEQ ID NO： 268。因此，在某些实施例中，所述疫苗制剂包含具有包含SEQ ID NO：268或由其组成的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽(例如，代替具有包含SEQ ID NO：265的氨基酸序列的多肽)。
2.SP0024(SEQ ID NO：1)和其变体
SP0024表示具有165个氨基酸的假定蛋白，它含有从氨基酸27延伸到氨基酸163的保守的碳酸酐酶结构域。基于这种共有基序，SP0024可以是锌结合蛋白。
在一些实施例中，包含肺炎链球菌多肽的疫苗或药物组合物包含含有选自SP0024的至少20个连续的氨基酸残基的多肽。所述多肽还可以是这至少20个残基的片段的变体。在某些实施例中，所述多肽包含SP0024中的不超过150、 125或100个连续的氨基酸残基。
3.SP0882(SEQ ID NO：2)和其变体
SP0882是具有274个氨基酸的假定蛋白。所述蛋白质的绝大部分(氨基酸 2-270)形成了类酯酶或脂酶区。
在一些实施例中，包含肺炎链球菌多肽的疫苗或药物组合物包含含有选自SP0882中的至少20个连续的氨基酸残基的多肽。所述多肽还可以是这至少20 个残基的片段的变体。在某些实施例中，所述多肽包含SP0882中的不超过 250、275、200、175、150、125或100个连续的氨基酸残基。
一个称作SP0882N的特定的截短变体由SP0882的N末端的130个氨基酸组成，并且显示为SEQ ID NO：3。SP0882N包含在不同血清型间非常保守的区域。在某些实施例中，包含SP0882或SP0882N或任一个的免疫原性片段的多肽还可以包含外源信号序列。在一些实施例中，所述信号序列是大肠杆菌或肺炎链球菌信号序列。所述信号序列可以是例如SP2108的信号序列。两种示例性此类多肽是SEQ ID NO：4和5。
SP0882的DNA和蛋白质序列的变体尤其描述在美国专利申请公开号 2009/0215149和国际申请WO2002/077021、WO98/18931以及WO2007/106407 中。SP0882N的变体在国际申请WO2008/146164中披露。
不同肺炎链球菌血清型之间在蛋白质水平方面存在序列差异，并且说明来自不同肺炎链球菌血清型的SP0882序列的组合的共有序列表示为SEQ ID NO： 14-17。因此，在某些实施例中，所述疫苗制剂包含具有包含SEQ ID NO：14-17 中的任一个或由其组成的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽(例如，代替具有包含SEQ ID NO：2-5之一的氨基酸序列的多肽)。
编码SP0882的不同变体(SEQ ID NO：2-5)的核酸序列表示为SEQ ID NO：24-26，但是由于遗传密码的简并，其他DNA序列(包括密码子优化序列)可以编码这些多肽。
4.SP0148(SEQ ID NO：7)和其变体
蛋白质SP0148称为“ABC转运蛋白，底物结合蛋白”。这类蛋白质典型地是与跨膜蛋白复合物发生瞬时相互作用的胞外蛋白。这样的复合物使用ATP水解所产生的能量跨细胞膜转运特定的底物。SP0148是具有276或277(取决于分离株)个氨基酸的蛋白质，它含有跨越氨基酸40-246的保守PBPb(周质结合蛋白)结构域，这对膜结合转运复合物来说是典型的。另外，SP0148具有细菌胞外溶质结合蛋白家族3结构域，它在很大程度上与所述PBPb结构域的延伸范围相同并且从氨基酸40延伸到244。在一些实施例中，疫苗或其他组合物所含的 SP0148的截短突变体包含或者缺少所述结构域和基序中的一种或多种。
在一些实施例中，包含肺炎链球菌多肽的疫苗或药物组合物包含含有选自SP0148中的至少20个连续的氨基酸残基的多肽。所述多肽还可以是这至少20 个残基的片段的变体。在某些实施例中，所述多肽包含SP0148中的不超过 250、275、200、175、150、125或100个连续的氨基酸。
内源性SP0148包含指导其分泌和潜在脂化的信号序列。在一些实施例中， SEQ IDNO：7的多肽的信号序列部分地或完全地通过表达宿主(例如大肠杆菌)来加工。在一些实施例中，使用了缺少所述信号序列的SP0148变体(SEQ ID NO：6)。SEQ ID NO：6的多肽由SEQID NO：27的核酸编码，但是可以使用其他核酸序列(包括密码子优化序列)。SEQ ID NO：28编码此处的筛选中所用的SP0148的全长序列。
SP0148的氨基酸序列和核苷酸序列的变体可以在美国专利申请公开号 2005/0020813、美国专利号7,378,514和7,504,110以及欧洲专利申请号EP1572868和EP1855717中找到。
说明来自不同肺炎链球菌血清型的SP0148序列的组合的共有序列表示为 SEQ IDNO：18和19。因此，在某些实施例中，所述疫苗制剂包含具有包含 SEQ ID NO：18-19中的任一个或由其组成的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽(例如，代替具有包含SEQ ID NO：6或7之一的氨基酸序列的多肽)。
5.SP1072(SEQ ID NO：8)和其变体
SP1072也被称为dnaG，是DNA引物酶，它催化RNA引物的形成从而使 DNA聚合酶起始DNA复制。SP1072是具有586个氨基酸的蛋白质，其含有若干保守的基序。从N末端开始，氨基酸2-96形成锌指结构域，所述DNA引物酶催化核心跨越了氨基酸122-250，并且高度保守的拓扑异构酶-引物酶 (TORPIM)核苷酸转移酶/水解酶结构域区从氨基酸258延伸到330。在一些实施例中，疫苗或其他组合物包含的SP1072的截短突变体包含或者缺少所述结构域和基序中的一种或多种。
在一些实施例中，包含肺炎链球菌多肽的疫苗或药物组合物包含含有选自SP1072中的至少20个连续的氨基酸残基的多肽。所述多肽还可以是这至少20 个残基的片段的变体。在某些实施例中，所述多肽包含SP1072中的不超过 550、500、450、400、350、300、250、200、150或100个连续的氨基酸。
6.SP2108(SEQ ID NO：9)和其变体
多肽SP2108的长度是423个氨基酸，并且也被称为MalX、麦芽糖/麦芽糖糊精ABC转运蛋白或者麦芽糖/麦芽糖糊精结合蛋白。所述蛋白质的绝大部分 (氨基酸3-423)被归类为MalE(麦芽糖结合周质)结构域。另外，SP2108包含指导其分泌和潜在脂化的信号序列。在一些实施例中，SEQ ID NO：9的多肽的信号序列部分地或完全地通过一个表达宿主(例如大肠杆菌)来加工。在一些实施例中，疫苗或其他组合物包含的SP2108截短突变体包含所述结构域和基序中的一种或多种。
在一些实施例中，在此的组合物和方法要求使用缺少信号序列的SP2108变体。这种变体由多肽序列SEQ ID NO：10表示，并且可以由例如根据SEQ ID NO：29的核酸来编码，但是由于遗传密码的简并，可以使用其他DNA序列(包括密码子优化序列)。
在一些实施例中，包含肺炎链球菌多肽的疫苗或药物组合物包含含有选自SP2108中的至少20个连续的氨基酸残基的多肽。所述多肽还可以是这至少20 个残基的片段的变体。在某些实施例中，所述多肽包含SP2108中的不超过 400、350、300、250、200、150或100个连续的氨基酸。
说明来自不同血清型的SP2108序列的组合的共有序列表示为SEQ ID NO： 20和21。因此，在某些实施例中，所述疫苗制剂包含具有包含SEQ ID NO：20- 21中的任一个或由其组成的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽(例如，代替具有包含SEQ ID NO：9或10之一的氨基酸序列的多肽)。
7.SP0641(SEQ ID NO：12)和其变体
长度为2144个氨基酸的SP0641也被称为PrtA，是细胞壁相关的丝氨酸蛋白酶。全长SP0641含有许多保守基序：在氨基酸485与597之间延伸的PA_2 基序，它可以形成蛋白结合表面；Fn3样结构域(氨基酸800-939)；以及位于氨基酸226-449和639-777的S8C5a类型的两个预测的催化结构域。在一些实施例中，疫苗或其他组合物包含的SP0641的截短突变体包含或者缺少所述结构域和基序中的一种或多种。
在一些实施例中，包含肺炎链球菌多肽的疫苗或药物组合物包含含有选自SP0641中的至少20个连续的氨基酸残基的多肽。所述多肽还可以是这至少20 个残基的片段的变体。在某些实施例中，所述多肽包含SP0641中的不超过 1000、900、800、700、600、500、400、300、200或100个连续的氨基酸。
也可以使用SP0641的某些其他截短突变体。举例来说，指定为SP0641N (SEQ IDNO：13)的多肽由661个氨基酸组成，这661个氨基酸对应于接近 SP0641的N末端的氨基酸24-684。被截短变体SP0641M(SEQ ID NO：11)捕获的648个残基的区域位于大致接近SP0641N处(并且对应于SP0641的氨基酸 686-1333)。指定为SP0641.1(SEQ ID NO：267)的多肽由978个氨基酸组成，这978个氨基酸对应于SP0641的氨基酸28-1006。
SP0641的变体在例如美国专利号7,338,786、6,573,082以及7,132,107，以及国际申请WO00/06738中披露。
SEQ ID NO：30、31以及273对应地显示了SP0641M(SEQ ID NO：11)、SP0641N(SEQID NO：13)以及SP641.1(SEQ ID NO：267)的DNA序列，但是由于遗传密码的简并，其他DNA序列(包括密码子优化序列)可以编码这些 SP0641变体。
说明来自不同肺炎链球菌血清型的SP0641N和SP0641M序列的组合的共有序列表示为SEQ ID NO：269和270。因此，在某些实施例中，所述疫苗制剂包含具有包含SEQ ID NO：269或270中的任一个或由其组成的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽(例如，代替具有包含SEQ ID NO：11或13之一的氨基酸序列的多肽)。
与表1和2的多肽同源的多肽(例如SP1912、S P1912L、SP0024、 SP0882、SP0882N、有或者没有信号序列的SP0148、SP1072、有或者没有信号序列的SP2108、SP0641、SP0641M、SP0641N或SP0641.1)也可以被用于在此所披露的组合物和方法中。肺炎链球菌的个别菌株相互之间含有许多突变，并且这些突变中的一些导致不同菌株之间的蛋白质序列不同。本领域的技术人员可以容易地用来自不同肺炎链球菌菌株的同源氨基酸序列代替氨基酸序列或其一部分。在某些方面，本申请提供了一些免疫原性多肽，它们与表1和2的多肽或其免疫原性片段具有至少90％、95％、97％、98％、99％或99.5％的一致性。可以使用血清型差异来设计表1和2的多肽的这些变体。
在一些实施例中，在此的疫苗组合物包含表1或2的蛋白质片段(例如 SP1912、SP1912L、SP0024、SP0882、SP0882N、有或者没有信号序列的OSP148、SP1072、有或者没有信号序列的SP2108、SP0641、SP0641M、 SP0641N或SP0641.1的片段)。在一些实施例中，本申请提供了截短突变体，它们与表1或2的多肽(例如SEQ ID NO：1-13、265、266或267之一)大小接近。举例来说，它们可以在一个末端或者两个末端缺少最多一个、两个、三个、四个、五个、十个或二十个氨基酸。也涵盖例如1-10、11-20、21-30或31-40个氨基酸的内部缺失。
在某些实施例中，所述疫苗制剂包含一种或多种具有包含SEQ ID NO：14- 21、268、269以及270中的任一个或由其组成的氨基酸序列的多肽。在某些实施例中，所述片段是SEQ ID NO：14-21、268、269以及270中的任一个的截短片段，其中从N末端、C末端或两个末端去除了1-5、1-10或1-20个氨基酸残基。在某些实施例中，所述片段是SEQ ID NO：14-21、268、269以及270中的任一个的截短片段，其中从N末端、C末端或两个末端去除了1-10个氨基酸残基。举例来说，可以从N末端和C末端各去除10个氨基酸残基，从而产生去除了20个氨基酸残基的蛋白质。
在某些实施例中，在此所提供的疫苗制剂包含或进一步包含一种或多种或者两种或更多种已知的肺炎链球菌抗原。在一些情况下，这些已知的肺炎链球菌抗原主要是抗体标靶。在一些情况下，这些已知的肺炎链球菌抗原可提供保护免遭肺炎链球菌定植或肺炎链球菌诱导的败血症。本领域所公认的一类适当的肺炎链球菌抗原是pneumolysoid。pneumolysoid与肺炎链球菌蛋白肺炎球菌溶血素(PLY)具有同源性，但是毒性比肺炎球菌溶血素低。pneumolysoid可以是天然存在的或者工程化的肺炎球菌溶血素衍生物。在一些实施例中，pneumolysoid与肺炎球菌溶血素具有至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的一致性。在一些实施例中，在关于针对红细胞的溶血活性和对多形核白细胞的抑制中的一个或两个的分析中，pneumolysoid显示的毒性小于肺炎球菌溶血素毒性的1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100、1/200、1/500或1/1000。两个分析都在桑德斯F.K.等人(“肺炎链球菌的巯基活化毒素肺炎球菌溶血素的体外活性并不需要巯基”，《感染与免疫》，1989年8月；57(8)：2547-52)(Saunders F.K.et al. (″Pneumolysin，the thiol-activatedtoxin of Streptococcus pneumoniae，does not require a thiol group for in vitroactivity″Infect Immun.1989Aug；57(8)：2547-52)中描述。示例性pneumolysoid包括PdT(三重突变体，它在贝里A.M.等人(1995)，《感染与免疫》63：1969-74(Berry，A.M.et al.(1995)Infection and Immunity63：1969- 74)中进一步描述)；Pd-A和Pd-B(佩顿J.C.等人“遗传上获得的肺炎球菌溶血素类毒素的纯化和免疫原性以及其与肺炎链球菌型19F多糖的结合”，《感染与免疫》1991年7月；59(7)：2297-304(Paton J.C.et al.″Purificationand immunogenicity of genetically obtained pneumolysin toxoids and theirconjugation to Streptococcus pneumoniae type19F polysaccharide″InfectImmun.1991Jul；59(7)：2297-304))； rPd2和rPd3(费雷拉等人“基于遗传上脱毒的肺炎球菌溶血素衍生物的DNA疫苗不能保护小鼠免受肺炎链球菌攻击”，《欧洲微生物学会联合会免疫学与医学微生物学》(2006)46：291-297(Ferreira et al.″DNA vaccines based ongenetically detoxified derivatives of pneumolysin fail to protect miceagainst challenge with Streptococcus pneumoniae″FEMS Immunol Med Microbiol(2006)46：291-297))； Ply8、Δ6PLY、L460D或其变体。在一些实施例中，所述肺炎球菌溶血素在催化中心中，如在氨基酸428或433或附近具有突变。
用于联合疫苗的其他适当的肺炎链球菌抗原包括肺炎球菌表面蛋白A (PspA)；PspA的衍生物、胆碱结合蛋白A(CbpA)和其衍生物(AD欧谷尼一等人，“通过用肺炎球菌溶血素和CbpA免疫所引发的针对肺炎链球菌的保护”，《感染与免疫》2001年10月；69(10)：5997-6003(AD Ogunniyi et al.，″Protection against Streptococcus pneumoniae elicitedby immunization with pneumolysin and CbpA，″Infect Immun.2001Oct；69(10)：5997-6003))；肺炎球菌表面粘附素A (PsaA)；酪蛋白裂解蛋白酶；分拣酶A(SrtA)；菌毛1RrgA粘附素；PpmA； PrtA；PavA；LytA；Stk-PR；PcsB；RrgB以及其衍生物。
PspA的衍生物包括具有非脯氨酸区块的脯氨酸富集段(PR+NPB，在下文中以及在丹尼尔C.C.等人(2010)《感染与免疫》78：2163-72(Daniels，C.C.et al. (2010)Infectionand Immunity78：2163-72)中进一步描述)和包括PspA的脯氨酸富集区的全部或片段的相关构建体(例如，含有序列PAPAP、PKP、PKEPEQ以及PEKP中的一个或多个并且任选地包含非脯氨酸区块的区域)。非脯氨酸区块的实例具有示例性序列EKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ(SEQ ID NO：306)，其在PspA的非卷曲区的另外的脯氨酸富集区中通常没有脯氨酸残基。非脯氨酸区块(NPB)序列的其他实施例包括SEQ ID NO：307和308。PspA和其衍生物可以包含表达有或者没有NPB的类似脯氨酸富集结构(即PKP、 PKEPEQ以及PEKP)的基因。在NPB任一个末端处的氨基酸标记脯氨酸富集区的边界。在一个实例中，PR区的氨基末端边界是DLKKAVNE(SEQ ID NO： 309)，并且羧基末端边界是(K/G)TGW(K/G)QENGMW(SEQ ID NO：310)。含有NPB的肽特别具有免疫原性，表明NPB可能是重要的表位。含有卷曲螺旋结构的示例性免疫原性PspA多肽衍生物包括SEQ ID NO：301和302。缺少卷曲螺旋结构的免疫原性PspA多肽衍生物的特定实施例具有的氨基酸序列显示为SEQ ID NO：303-305。免疫原性PspA多肽SEQ ID NO：301、303以及305包含PR 和NPB序列(PR+NPB)。SEQ ID NO：302和304的免疫原性PspA多肽只包括 PR序列(只有PR)并且缺少NPB。
在一些情况下，另一种适当的肺炎链球菌抗原与相应野生型肺炎链球菌蛋白具有至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的一致性。以上提到的多肽和编码它们的核酸的序列是已知的；参见例如根据基因库登录号 FM211187.1的肺炎链球菌ATCC700669全基因组序列以及其中所连接的多肽序列。
用于联合疫苗的其他肺炎链球菌抗原包括结合的肺炎链球菌多糖。这些结合多糖可以例如如美国专利5,623,057、美国专利5,371,197或PCT/US2011/023526中所述。
除上文表1所述的那些核酸和多肽以外，本申请还提供了免疫原性组合物，如在此所述，它们包含表2中所列的多肽或基因或其变体或片段中的一种或多种。每个基因和蛋白质的DNA和蛋白质序列可以如上文所述通过搜索公用数据库Entrez Gene中的基因座标签而找到。
表2.人类和小鼠筛选中所鉴定的免疫原性蛋白
典型地，本发明化合物中所存在的多肽都是具有免疫原性的，无论是其本身还是其变体形式，变体包括与另一个多肽融合或者与佐剂混合或复合的多肽。如在此所述，变体还包括具有小于100％序列一致性的序列。在某些实施例中，表1或2中的抗原以全长多肽形式提供。另外，可以使用具有适当免疫原性的片段、前体以及类似物。
这些多肽可以在哺乳动物中具有免疫原性，例如，在小鼠、豚鼠或者人类中。免疫原性多肽典型地是那些能够在分析中或者受试者中引发显著的免疫应答的多肽。所述免疫应答可以是先天的、体液的、细胞介导的或粘膜的(组合先天的、体液的以及细胞介导的免疫的要素)。举例来说，免疫原性多肽可以提高T 细胞产生的IL-17的量。实例1-4中所述的IL-17分析是可以被用来鉴定免疫原性多肽的分析实例。或者或另外，免疫原性多肽可以(i)诱导产生与多肽和/或整个细菌结合的抗体，例如中和抗体，(ii)诱导TH17免疫，(iii)激活CD4+T细胞应答，例如通过增加CD4+T细胞和/或增加CD4+T细胞定位到感染或再感染部位，(iv)激活CD8+CTL反应，例如通过增加CD8+T细胞和/或增加CD8+T细胞定位到感染或再感染部位，(v)诱导TH1免疫和/或(vi)激活先天免疫。在一些实施例中，免疫原性多肽引起产生可检测量的对那种抗原具有特异性的抗体。
在某些实施例中，这些多肽与人类自身抗原和/或肠道共生菌(例如某些拟杆菌属(Bacteroides)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、梭形杆菌属 (Fusobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、双歧杆菌属 (Bifidobacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)以及乳杆菌属(Lactobacillus)物种)具有小于20％、30％、40％、50％、60％或70％的一致性。人类自身抗原的实例包括胰岛素、增殖细胞核抗原、细胞色素P450以及髓磷脂碱性蛋白。
本发明还提供了免疫原性组合物，它包含药学上可接受的载体、具有包含 SEQ IDNO：265、266或268的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽，以及一种或多种具有包含以下各项中的任一个的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽：SEQ ID NO：1-23以及SP1574、SP1655、SP2106、SP1473、SP0605、SP1177、SP0335、SP0906、SP1828、SP2157、SP1229、SP1128、SP1836、SP1865、 SP0904、SP0765、SP1634、SP0418、SP1923、SP1313、SP0775、SP0314、SP0912、SP0159、SP0910、SP2148、SP1412、SP0372、SP1304、SP2002、 SP0612、SP1988、SP0484、SP0847、SP1527、SP0542、SP0441、SP0350、 SP0014、SP1965、SP0117、SP0981、SP2229、SP2136、SP1179、SP1174、 SP2216、SP1393、SP0641.1、SP1384以及SP2032。
在一些实施例中，所述疫苗制剂包含至少两种多肽，每种多肽属于(i)-(vii) 的不同组：(i)SEQ ID NO：1或其免疫原性片段，(ii)SEQ ID NO：2-5和14-17之一或其免疫原性片段，(iii)SEQ ID NO：6-7和18-19之一或其免疫原性片段，(iv) SEQ ID NO：8或其免疫原性片段，(v)SEQ ID NO：9-10和20-21之一或其免疫原性片段，(vi)SEQ ID NO：11-13、267以及269-270之一或其免疫原性片段，以及(vii)SEQ ID NO：265-266和268之一或其免疫原性片段。这些组合的实例列于下文中。可以通过用相应的共有序列(例如SEQ ID NO：14-21或268-270 之一)代替以下序列之一来得到另外的组合。在一些实施例中，这些多肽之一是SEQ ID NO：265-266和268之一或其免疫原性片段。在一些实施例中，所述疫苗制剂进一步包含pneumolysoid。在一些实施例中，所述疫苗制剂进一步包含 CbpA或其衍生物。在一些实施例中，所述疫苗制剂进一步包含PspA或其衍生物，所述衍生物包含PspA的脯氨酸富集区的全部或片段。
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：6
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：8
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：9
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：10
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：12
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：13
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：265
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：266
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：267
SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6
SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7
SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8
SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9
SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：10
SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：11
SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：12
SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：13
SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：265
SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：266
SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：267
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：8
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：9
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：10
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：11
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：12
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：265
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：266
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：267
SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6
SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：7
SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8
SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：9
SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：10
SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：11
SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：12
SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：13
SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：265
SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：266
SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：267
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：9
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：10
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：11
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：12
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：13
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：265
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：266
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：267
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：11
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：12
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：13
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：265
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：266
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：267
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：10
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：12
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：13
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：265
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：266
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：267
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：11
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：12
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：13
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：265
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：266
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：267
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：13
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：265
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：266
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：267
SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11
SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12
SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：13
SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：265
SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：266
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SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：265
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在某些实施例中，所述疫苗制剂包含至少三种不同多肽，其具有包含SEQ ID NO：1-13、265、266以及267中的任一个的氨基酸序列或其免疫原性片段，每种多肽属于(i)-(vii)的不同组：(i)SEQ ID NO：1或其免疫原性片段，(ii)SEQ ID NO：2-5之一或其免疫原性片段，(iii)SEQ ID NO：6-7之一或其免疫原性片段，(iv)SEQ ID NO：8或其免疫原性片段，(v)SEQ ID NO：9-10之一或其免疫原性片段，(vi)SEQ ID NO：11-13和267之一或其免疫原性片段，以及(vii)SEQ ID NO：265-266之一或其免疫原性片段。这些组合的实例列于下文中。可以通过用相应的共有序列(例如SEQ ID NO：14-21或268-270之一)代替以下序列之一来得到另外的组合。在一些实施例中，这些多肽之一是SEQ ID NO：265-266 和268之一或其免疫原性片段。在一些实施例中，所述疫苗制剂进一步包含 pneumolysoid。在一些实施例中，所述疫苗制剂进一步包含CbpA或其衍生物。在一些实施例中，所述疫苗制剂进一步包含PspA或其衍生物，所述衍生物包含 PspA的脯氨酸富集区的全部或片段。
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SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：267以及SEQ ID NO：266
在一些实施例中，所述疫苗制剂包含至少两种具有包含SEQ ID NO：14- 21、268、269以及270中的任一个的氨基酸序列或其免疫原性片段的不同多肽。在某些此类实施例中，所述疫苗制剂包含至少两种多肽，每种多肽属于(i)- (v)的不同组：(i)SEQ ID NO：14-17之一或其免疫原性片段，(ii)SEQ ID NO： 18-19之一或其免疫原性片段，(iii)SEQ IDNO：20-21之一或其免疫原性片段， (iv)SEQ ID NO：268之一或其免疫原性片段，以及(v)SEQ ID NO：269-279之一或其免疫原性片段。这些组合的实例列于下文中。以下组合指明共有序列。然而，可以通过用相应的非共有序列(例如SEQ ID NO：1-13或266-267之一)代替共有序列之一来得到另外的组合。在一些实施例中，这些多肽之一是SEQ ID NO：268或其免疫原性片段。在一些实施例中，所述疫苗制剂进一步包含pneumolysoid。在一些实施例中，所述疫苗制剂进一步包含CbpA或其衍生物。在一些实施例中，所述疫苗制剂进一步包含PspA或其衍生物，所述衍生物包含 PspA的脯氨酸富集区的全部或片段。
SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：18
SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：19
SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：20
SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：21
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SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：18
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SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：270
SEQ ID NO：268和SEQ ID NO：269
SEQ ID NO：268和SEQ ID NO：270
在一些实施例中，所述片段是SEQ ID NO：14-21和268-270中的任一个的截短片段，其中从N末端、C末端或两个末端去除了1-20个氨基酸残基。
在一些实施例中，所述疫苗制剂包含具有包含SEQ ID NO：14-17中的任一个的氨基酸序列的多肽。在一些实施例中，所述疫苗制剂包含具有包含SEQ ID NO：18-19中的任一个的氨基酸序列的多肽。在一些实施例中，所述疫苗制剂包含具有包含SEQ ID NO：20-21中的任一个的氨基酸序列的多肽。在一些实施例中，所述疫苗制剂包含具有包含SEQ ID NO：268-270中的任一个的氨基酸序列的多肽。
在一些方面，包含SEQ ID NO：14-21、268、269以及270中的一个或多个的疫苗制剂进一步包含具有包含SEQ ID NO：1-13、265、266以及267中的任一个的氨基酸序列的多肽。
在某些实施例中，所述疫苗制剂包含至少三种具有包含SEQ ID NO：14- 21、268、269以及270中的任一个的氨基酸序列或其免疫原性片段的不同多肽。在某些此类实施例中，所述疫苗制剂包含(i)-(v)中的三个：(i)SEQ ID NO： 14-17之一或其免疫原性片段，(ii)SEQ ID NO：18-19之一或其免疫原性片段，以及(iii)SEQ ID NO：20-21之一或其免疫原性片段，(iv)SEQ ID NO：268之一或其免疫原性片段，以及(v)SEQ ID NO：269-270之一或其免疫原性片段。这些组合的实例列于下文中。以下组合指明共有序列。然而，可以通过用相应的非共有序列(例如SEQ ID NO：1-13或266-267之一)代替共有序列之一来得到另外的组合。在一些实施例中，这些多肽之一是SEQ ID NO：268或其免疫原性片段。在一些实施例中，所述疫苗制剂进一步包含pneumolysoid。在一些实施例中，所述疫苗制剂进一步包含CbpA或其衍生物。在一些实施例中，所述疫苗制剂进一步包含PspA或其衍生物，所述衍生物包含PspA的脯氨酸富集区的全部或片段。
SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18以及SEQ ID NO：20
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SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：268以及SEQ ID NO：270
多肽可以包含一个或多个免疫原性部分和一个或多个非免疫原性部分。免疫原性部分可以通过不同的方法鉴定，这些方法包括蛋白质微阵列、 ELISPOT/ELISA技术和/或针对议论中的多肽的不同缺失突变体(例如片段)的特定分析。免疫原性部分还可以通过计算机算法鉴定。一些此类算法，如 EpiMatrix(由EpiVax生产)使用计算矩阵方法。用于鉴定抗原表位的其他计算工具包括PEPVAC(基于混杂的表位的疫苗(Promiscuous EPitope-basedVACcine)，由丹纳-法伯癌症研究所(Dana Farber Cancer Institute)在万维网immunax.dfci.harvard.edu/PEPVAC上主创)、MHCPred(其使用偏最小二乘法并且由詹纳研究所(The Jenner Institute)在万维网www.jenner.ac.uk/MHCPred上主创)以及在万维网tools.immuneepitope.org上的免疫表位数据库算法。如以实验方式测量或通过算法鉴定，在此所述的多肽的免疫原性片段包含至少一个免疫原性部分。通过如上所述的工具鉴定的肽包括以下：
因此，在一些方面，本申请提供了在此所述的抗原的免疫原性片段。在一些情况下，这些片段与全长多肽或表1或2的多肽大小接近。举例来说，它们可以在一个末端或者两个末端缺少最多一个、两个、三个、四个、五个、十个、二十个或三十个氨基酸。在某些实施例中，多肽的长度为100-500个氨基酸，或者 150-450、或者200-400、或者250-250个氨基酸。在一些实施例中，多肽的长度为100-200、150-250、200-300、250-350、300-400、350-450或者400-500个氨基酸。在某些实施例中，这些片段由表达宿主(例如大肠杆菌、昆虫细胞系(例如杆状病毒表达系统)或哺乳动物(例如人类或中国仓鼠卵巢)细胞系)对信号序列进行加工或部分加工而产生。上述片段或者其子片段(例如，8-50、8-30或者8-20个氨基酸残基的片段)优选地具有下述生物活性中的一种，如使释放的 IL-17的量提高至少1.5倍或2倍或更多倍(例如，作为绝对量度或相对于免疫失活蛋白)。片段可以作为多肽用于在此所述的疫苗中，或者可以与另一个蛋白质、蛋白质片段或者多肽融合。
在一些实施例中，所述片段是SEQ ID NO：1-21或265-270中的任一个的截短片段，其具有1-5、1-10或1-20个氨基酸残基从N末端、C末端或两个末端去除。在一些此类实施例中，从N末端和C末端去除了相同数目的残基；而在其他实施例中，从N末端去除了与C末端相比不同数目的残基。
在某些方面，本申请提供了一些免疫原性多肽，它们与表1或2的多肽具有至少90％、95％、97％、98％、99％或99.5％的一致性。在某些实施例中，所述疫苗制剂包含至少两种不同多肽，其具有包含与SEQ ID NO：1-21或265-270 中的任一个至少90％、95％、98％或99％一致的序列的氨基酸序列或其免疫原性片段。
在一些实施例中，以混合物形式提供表1或表2中的一种或多种，例如两种、三种、四种或更多种多肽或其免疫原性片段或变体。在一些实施例中，所述混合物含有全长多肽和由表达宿主(例如大肠杆菌、昆虫细胞系(例如杆状病毒表达系统)或哺乳动物(例如人类或中国仓鼠卵巢)细胞系)对信号序列进行加工或部分加工而产生的片段。
在一些实施例中，与其呈简单的物理混合物的形式，表1或2中的两种、三种、四种或更多种多肽或其免疫原性片段或变体倒不如彼此共价结合，例如作为融合蛋白。在一些实施例中，所述疫苗制剂实质上不含除了具有包含SEQ ID NO：1-23或265-270中的任一个的氨基酸序列的多肽之外的其他肺炎链球菌多肽。在一些实施例中，所述疫苗制剂实质上不含除了表1的多肽之外的其他肺炎链球菌多肽。在一些实施例中，所述疫苗制剂实质上不含除了表1和/或2的多肽之外的其他肺炎链球菌多肽。
在某些实施例中，疫苗制剂或免疫原性组合物实质上不含除了具有包含 SEQ IDNO：1-23或265-270中的任一个的氨基酸序列的多肽之外的其他肺炎链球菌多肽。在某些此类实施例中，疫苗制剂或免疫原性组合物实质上不含除了具有由SEQ ID NO：1-23或265-270中的任一个组成的氨基酸序列的多肽之外的其他肺炎链球菌多肽。在一些实施例中，疫苗制剂或免疫原性组合物实质上不含除了具有包含表1和/或2的多肽的氨基酸序列中的任一个(或由其组成)的氨基酸序列的多肽之外的其他肺炎链球菌多肽。实质上，在此上下文中，是指其他肺炎链球菌多肽小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于3％、小于2％或甚至小于1％。
在某些实施例中，所述疫苗组合物在接触TH17细胞后所诱导的TH17细胞应答相比于由对照组无关抗原(如HSV-2蛋白ICP47，其基因名称为US12)所诱导的反应要高至少1.5倍。在一些实施例中，所述疫苗制剂在未感染的受试者中抑制了被肺炎链球菌感染。在某些实施例中，所述疫苗制剂降低了被肺炎链球菌感染的个体中肺炎链球菌鼻咽定植的发生率或持续时间。在一些实施例中，所述疫苗制剂在被肺炎链球菌感染的个体中抑制了败血症的发展。在一些实施例中，所述疫苗制剂抑制了肺炎、脑膜炎、中耳炎、窦炎或其他部位或器官的肺炎链球菌感染的发展。
在某些实施例中，本申请提供了编码一种或多种上述多肽的核酸，如 DNA、RNA或其类似物。上述多肽的基本DNA序列可以按不影响蛋白质产物序列的方式进行修饰，并且这种序列包括在本发明内。举例来说，DNA序列可以进行密码子优化以提高在宿主中的表达，所述宿主如大肠杆菌、昆虫细胞系 (例如，使用杆状病毒表达系统)或者哺乳动物(例如，人类或中国仓鼠卵巢) 细胞系。
在某些实施例中，本申请提供了核酸(如DNA、RNA或其类似物)，其与表1或2中的基因或所述基因的变体或一部分至少70％、80％、90％、95％、 97％、98％、99％或100％一致。在某些实施例中，核酸长度为600-2000、800- 1800、1000-1600、1200-1400个核苷酸。在一些实施例中，核酸长度为600- 1600、800-1800或者1000-2000个核苷酸。这些核酸可以被用于例如重组产生表 1和2中的多肽或其免疫原性片段。
在一些实施例中，所述疫苗或免疫原性组合物可以包含融合蛋白和/或融合 DNA构建体。在此所述的多肽可以在未经修饰的情况下使用。在某些实施例中，当使用更小的相关多肽(如片段等)并且其分子量小于约5000道尔顿(例如1500到5000道尔顿)时，对其进行修饰可以用于引发所希望的免疫应答。举例来说，可以将这些更小的多肽与适当的免疫原性载体结合，合适的免疫原性载体如破伤风类毒素、肺炎球菌溶血素、钥孔戚血蓝蛋白等。
在某些实施例中，所述疫苗制剂包含至少一种脂化的多肽。与脂质部分的结合可以是直接的或间接的(例如通过接头)。所述脂质部分可以是合成的或天然产生的。在某些实施例中，表1或2中的多肽可以与脂质部分化学结合。在某些实施例中，构建体可以包含表1或2中的基因或多肽或其免疫原性片段或变体以及脂化序列，包括脂盒基序。规范的脂盒基序显示为SEQ ID NO：274。脂化序列可以在蛋白质的N末端或C末端，并且可以被嵌入到信号或其他序列中，或融合蛋白中。示例性脂化序列包括SP2108的信号序列(SEQ ID NO：275)和大肠杆菌基因RlpB的信号序列(SEQ ID NO：276)。信号序列可以是例如大肠杆菌或肺炎链球菌信号序列。示例性大肠杆菌信号序列包括mlpA信号序列(林 J.J.等人，“在外膜前脂蛋白的信号序列内具有氨基酸变异的大肠杆菌突变体”，《美国国家科学院院刊》，1978年10月；75(10)：4891-5(Lin，J.J.et al.，″An Escherichia coli mutant with an aminoacid alteration within the signal sequence of outer membrane prolipoprotein″Proc Natl Acad Sci U S A.1978Oct；75(10)：4891- 5))、lamB信号序列(埃米尔S.D.等人，“改变大肠杆菌外膜蛋白噬菌体λ受体的细胞定位的突变”，《美国国家科学院院刊》，1978年12月；75(12)：5802-6(Emr， S.D.et al.″Mutations altering the cellularlocalization of the phage lambda receptor，an Escherichia coli outer membraneprotein″，Proc Natl Acad Sci U S A.1978 Dec；75(12)：5802-6))、MBP信号序列(巴斯福德P.J.，“使用基因融合来研究麦芽糖结合蛋白到大肠杆菌周质中的分泌”，《细菌学杂志》，1979年7月；139(1)：19- 31(Bassford，P.J.，″Use of gene fusion to study secretionof maltose-binding protein into Escherichia coli periplasm″JBacteriol.1979Jul；139(1)：19-31))。Lpp是指导脂化的示例性大肠杆菌信号序列(卡伦P.A.等人，“用于在大肠杆菌中表达重组脂蛋白的质粒载体的构建以及评估”，《质粒》，2003年1月；49(1)：18-29(Cullen，P.A. et al.″Construction and evaluation of a plasmidvector for the expression of recombinant lipoproteins in Escherichia coli″Plasmid.2003Jan；49(1)：18-29))。指导脂化的大肠杆菌信号序列也描述在里格朗M.(Legrain，M.)等人(“大肠杆菌中脂化的脑膜炎球菌转铁蛋白结合蛋白2的产生”，《蛋白质表达与纯化》，1995年 10月；6(5)：570-8(″Production of lipidated meningococcaltransferrin binding protein 2in Escherichia coli″.1995Oct；6(5)：570-8)中，例如基因RlpB的信号序列(SEQ ID NO：276))。本领域中已知众多肺炎链球菌信号序列。一个此类信号序列是 SEQ ID NO：275。
在其他实施例中，构建体可以包含表1或2中的基因或蛋白质，或其免疫原性片段或变体，以及标签。标签可以位于N末端或者C末端。举例来说，可以在核酸或者多肽上添加标签以助于纯化、检测、溶解或者赋予所述蛋白质或核酸以其他所希望的特性。举例来说，纯化标签可以是多肽、寡肽、或者可用于亲和纯化的多肽。实例包括His、GST、TAP、FLAG、myc、HA、MBP、VSV- G、硫氧还蛋白、V5、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、BCCP、钙调蛋白、Nus、S标签、脂蛋白D以及β半乳糖苷酶。特定示例性His标签包括HHHHHH (SEQ ID NO：32)和MSYYHHHHHH(SEQ ID NO：33)。在其他实施例中，多肽不含标签(如蛋白质纯化标签)，并且通过不依赖于对纯化标签的亲和力的方法来纯化。在一些实施例中，融合的部分很短。在一些情况下，这是指融合蛋白在表1或2的多肽的一个末端或者两个末端包含不超过1、2、3、4、5、10或 20个另外的氨基酸。
B.免疫原性组合物
本披露还提供了药物组合物，其含有免疫原性多肽或编码这些免疫原性多肽的聚核苷酸，以及药物载体。来自肺炎链球菌的抗原通过筛选感染了肺炎链球菌的小鼠或者健康的捐助人的免疫细胞来鉴定。因为肺炎链球菌是非常常见的疾病和定植病原体，所以这些捐助人据推测在其生活中的某个时间曾暴露于肺炎链球菌。简要来说，肺炎链球菌抗原文库在细菌中表达，并且与抗原呈递细胞 (APC)混合。这些APC又将来源于肺炎链球菌的多肽呈递给已经从小鼠或者从捐助人中分离出的淋巴细胞。关于与肺炎链球菌的反应性来分析淋巴细胞应答。用肺炎链球菌免疫的捐赠人以及小鼠产生了对肺炎链球菌抗原具有特异性的淋巴细胞。因此，本披露涵盖肺炎链球菌抗原的组合物，其在已免疫的或感染的小鼠或人体内引发强烈的免疫应答以抵抗被肺炎链球菌感染。
表1和2列出了根据在此所述的筛选方法鉴定出的肺炎链球菌抗原的蛋白质序列和相应的核苷酸序列。这些抗原是在小鼠和人类T细胞的筛选中鉴定出的。在小鼠T细胞的筛选中，对鉴定出的抗原进行至少两轮筛选：全基因组轮次，以鉴定出引发免疫应答的4种抗原的池；接着是去卷积轮次，从全基因组轮次中所鉴定的池中个别地测试并鉴定出引发免疫应答的单一抗原。相比之下，在人类T细胞的筛选中，建立两组不同的抗原池，这样使得多肽与在第一个池与第二个池之间不同的多肽混合。因此，有可能通过鉴定哪些多肽在第一组和第二组中都处在阳性池中来确定哪些多肽为抗原。表1列出了通过上述筛选方法之一鉴定的抗原(和其变体)，然后使其在实例5-12中所述的小鼠模型中进行进一步测试。因此，根据本披露的组合物可以包含表1或2中所列出的基因中的一个或两个或更多个，或相应基因产物。
免疫原性组合物还可以包含所述链球菌多肽的一部分，例如缺失突变体、截短突变体、寡核苷酸以及肽片段。在一些实施例中，所述多肽的这些部分具有免疫原性。蛋白质的某一部分的免疫原性易于使用与用于测定全长蛋白的免疫原性的分析相同的分析来测定。在一些实施例中，所述多肽的所述部分具有与全长蛋白实质上相同的免疫原性。在一些实施例中，所述免疫原性比全长蛋白(例如表1和2的多肽)的免疫原性小不超过10％、20％、30％、40％或50％。这些多肽片段可以是例如线性的、环形的或者含侧链的。
在此所述的疫苗制剂和免疫原性组合物的一些实施例包含免疫原性多肽 (例如表1和2的多肽)，其含有膜转位序列(MTS)以助于将多肽引入哺乳动物细胞中，随后刺激细胞介导的免疫应答。示例性膜转位序列包括Kaposi成纤维细胞生长因子信号序列中的疏水区，α-突触核蛋白、β-突触核蛋白或γ-突触核蛋白的MTS，触角同源结构域的第三螺旋，SN50，整联蛋白β3的h-区，HIV Tat，pAntp，PR-39，蜜蜂抗菌肽abaecin，蜜蜂抗菌肽apidaecin，Bac5，Bac7，伯氏疟原虫(P.berghei)CS蛋白，以及美国专利6,248,558、6,432,680以及 6,248,558中所述的那些MTS。
在某些实施例中，抗原(例如，表1或2的多肽)与另一个分子共价结合。这样可以例如提高所述抗原的半衰期、溶解性、生物利用度或者免疫原性。可以与抗原共价结合的分子包括碳水化合物、生物素、聚乙二醇(PEG)、多聚唾液酸、N-丙酰多聚唾液酸、核酸、多糖以及PLGA。存在很多不同类型的 PEG，其分子量范围从300g/mol以下到10,000,000g/mol以上不等。PEG链可以是线性的、含侧链的或者具有梳形或星形几何结构。在一些实施例中，天然产生的蛋白质形式与刺激免疫系统的部分共价结合。此类部分的实例是脂质部分。在一些情况下，脂质部分被Toll样受体(TLR)(如TLR-2或TLR-4)识别并且激活先天免疫系统。
C.对表1和2的蛋白质具有特异性的抗体
在此所披露的另一方面是针对抗原组合物(例如，表1或2中所列的一种蛋白质或其免疫原性片段)所产生的抗体制剂。举例来说，本披露提供了两种、三种、四种或五种抗体的组合，每种抗体识别表1或2的不同的蛋白质。包含多种抗体中的任一个。这些抗体包括例如多克隆、单克隆、重组、人源化或部分人源化的单链、Fab以及其片段等等。这些抗体可以是任何同种型，例如IgG，不同的IgG同种型如IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4等等；并且它们可以来自于产生这些抗体的任何动物物种，包括山羊、兔、小鼠、鸡等。在一些实施例中，Fab分子在如大肠杆菌的遗传转化的宿主中表达和组装。因此可用λ载体系统来表达Fab群体，这些Fab的潜在多样性等于或超过产生先前抗体的受试者的多样性。参见哈斯等人(1989)，《科学》246，1275-81(Huse et al.(1989)， Science246，1275-81.)。
D.D.包含肺炎链球菌抗原或识别这些抗原的抗体的疫苗或免疫原性组合物的组分
在某些实施例中，所述疫苗或免疫原性组合物包含抗原和以下各项中的一个或多个：佐剂、稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、控制释放组分、盐、防腐剂和 /或对所述抗原具有特异性的抗体。
1.佐剂
在此所述的疫苗制剂和免疫原性组合物可以包含佐剂。基于佐剂的主要作用机制可以将其大致分成两类：疫苗递送系统和免疫刺激佐剂(参见例如辛格等人，《当今爱滋病研究》1：309-20，2003(Singh et al.，Curr.HIV Res.1：309-20，2003))。在许多疫苗制剂中，所述佐剂向免疫系统提供信号，这样使得它对抗原产生反应，并且所述抗原是驱动对病原体的反应的特异性所需的。疫苗递送系统通常是颗粒制剂，例如，乳液、微粒、免疫刺激复合物(ISCOM)、纳米颗粒，它们可以是例如颗粒和/或基质以及脂质体。相比之下，免疫刺激佐剂有时是源自病原体，并且会表现出病原体相关的分子模式(PAMP)，例如脂多糖 (LPS)、单磷酰脂(MPL)或者含CpG的DNA，它们激活细胞的先天免疫系统。
或者，佐剂可以分类为有机的和无机的。无机佐剂包括铝盐，如磷酸铝，非晶形羟基磷酸硫酸铝以及氢氧化铝，这些常用在人类疫苗中。有机佐剂包含有机分子，包括大分子。有机佐剂的实例是霍乱毒素。
佐剂还可以根据它们所诱导的反应来分类。在一些实施例中，佐剂诱导TH1细胞或TH2细胞激活。在其他实施例中，佐剂诱导B细胞激活。在又其他实施例中，佐剂诱导抗原呈递细胞激活。这些分类并不是相互排斥的；在一些情况下，佐剂激活一种以上细胞类型。
在某些实施例中，佐剂诱导TH17细胞激活。它可以促进CD4+或CD8+T细胞分泌IL-17。在一些实施例中，诱导TH17细胞激活的佐剂是在以下分析中产生至少2倍，并且在一些情况下10倍实验样品与对照组之比的佐剂。在所述分析中，实验人员比较了由两个细胞群体分泌的IL-17水平：(1)来自用所述佐剂和已知诱导TH17激活的多肽免疫的动物细胞，和(2)来自用所述佐剂和无关(对照)多肽处理的动物细胞。诱导TH17细胞激活的佐剂可以引起细胞群体(1)相比于细胞群体(2)产生2倍以上或10倍以上的IL-17。IL-17可以例如通过ELISA或ELISPOT来测量。某些毒素，如霍乱毒素和不稳定毒素(由产肠毒素的大肠杆菌或ETEC产生)激活TH17反应。因此，在一些实施例中，佐剂是毒素。霍乱毒素已被成功地用于小鼠模型中与表1中的某些多肽一起诱导保护性免疫(参见实例5-8)。因特塞公司(Intercell)生产出了一种形式的不稳定毒素。也可以使用不稳定毒素的突变体衍生物，它们与佐剂一样有效但是毒性显著更低。不稳定毒素的示例性脱毒突变体衍生物包括缺少ADP核糖基转移酶活性的突变体。不稳定毒素的特定脱毒突变体衍生物包括LTK7(杜丝等人，“缺少ADP 核糖基转移酶活性的大肠杆菌热不稳定毒素的突变体用作无毒的粘膜佐剂”，《美国国家科学院院刊》第92卷，第1644-1648页，1995年2月(Douce et al.，″Mutantsof Escherichia coli heat-labile toxin lacking ADP-ribosyltransferase activityact as nontoxic，mucosal adjuvants″PNAS Vo1.92，pp.1644-1648，February1995)) 和LTK63(威廉等人，“大肠杆菌的经修饰的热不稳定毒素(LTK63)引起的先天印记提供了针对肺感染性疾病的一般性保护”，《免疫学杂志》，2004，173：7435- 7443(Williams et al.，″Innate Imprinting by the Modified Heat-Labile Toxin of Escherichia coli(LTK63)Provides Generic Protection against Lung Infectious Disease″TheJournal of Immunology，2004，173：7435-7443))、LT-G192(杜丝等人“大肠杆菌的热不稳定毒素的遗传上脱毒的突变体能用作口服佐剂”，《感染与免疫》，1999年9月；67(9)：4400-6(Douce et al.″Genetically detoxified mutants of heat-labile toxin fromEscherichia coli are able to act as oral adjuvants″Infect Immun. 1999Sep；67(9)：4400-6))以及LTR72(“部分敲除ADP核糖基转移酶活性的大肠杆菌热不稳定肠毒素的新颖突变体LTR72的粘膜佐剂性和免疫原性”，《实验医学杂志》，1998年4月6日；187(7)：1123-32(″Mucosal adjuvanticity and immunogenicity of LTR72，a novel mutant ofEscherichia coli heat-labile enterotoxin with partial knockout of ADP-ribosyltransferase activity.″J Exp Med.1998Apr 6；187(7)：1123-32))。
在一些实施例中，佐剂包含VLP(病毒样颗粒)。一个这样的佐剂平台甲病毒复制子使用甲病毒来诱导TH17细胞激活，并且由阿尔法维克斯公司 (Alphavax)生产。在甲病毒复制子系统的某些实施例中，可以使甲病毒工程化来表达感兴趣的抗原、感兴趣的细胞因子(例如，IL-17或刺激IL-17产生的细胞因子)或两者，并且可以在辅助细胞系中产生。更详细的信息可在美国专利号 5,643,576和6,783,939中找到。在一些实施例中，向患者给予疫苗制剂与编码细胞因子的核酸的组合。
某些类别的佐剂激活toll样受体(TLR)以激活TH17反应。TLR是可见于白细胞膜上的众所周知的蛋白质，并且识别外来抗原(包括微生物抗原)。与感兴趣的抗原一起给予已知的TLR配体(例如，以融合蛋白的形式)能够促进对感兴趣的抗原具有特异性的免疫应答的发展。激活TLR的一个示例性佐剂包括单磷酰脂A(MPL)。传统上，已经产生MPL作为从革兰氏阴性细菌(如明尼苏达链球菌(S.minnesota))获得的脱毒脂多糖(LPS)内毒素。具体来说，LPS 连续的酸和碱水解产生免疫活性脂质A分离部分(它是MPL)，并且缺少糖基和 LPS中所存在的一种以外的所有磷酸盐。许多合成的TLR激动剂(特别是TLR- 4激动剂)在埃文斯JT等人，“通过TLR-4配体MPL佐剂和Ribi.529增强抗原特异性免疫”，《疫苗专家评论》，2003年4月；2(2)：219-29(Evans JT et al. “Enhancement of antigen-specificimmunity via the TLR-4ligands MPL adjuvant and Ribi.529.”Expert RevVaccines2003Apr；2(2)：219-29)中披露。和MPL佐剂一样，这些合成化合物通过TLR激活先天免疫系统。另一种类型的TLR激动剂是合成的磷脂二聚体，例如E6020(石坂ST等人，“E6020：作为疫苗佐剂的合成的 Toll样受体4激动剂”，《疫苗专家评论》，2007年10月；6(5)：773-84(Ishizaka ST et al.″E6020：a synthetic Toll-like receptor4agonist asa vaccine adjuvant.″Expert Rev.Vaccines.2007Oct；6(5)：773-84))。不同的TLR激动剂(包括TLR-4激动剂)已经由例如感染性疾病研究所(IRDI)、科雷莎公司(Corixa)、埃塞公司(Esai)、阿凡提极性脂质公司(Avanti Polar Lipids，Inc.)以及西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)生产和/或出售。激活TLR的另一种示例性佐剂包含MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)以及双十八烷基二甲基溴化铵(DDA)的混合物。另一种激活TLR的佐剂是R848(瑞喹莫德(resiquimod))。
在一些实施例中，佐剂是皂苷或者包含皂苷。典型地，皂苷为三萜皂苷，如从皂树(Quillaja saponaria)树皮中分离出的那些皂苷。从生物来源中提取出的皂苷可以进一步分离(例如，通过色谱法)以分离所述提取物中具有最佳佐剂活性和具有可接受毒性的部分。已知皂树提取物中用作佐剂的典型分离部分是分离部分A和C。
可以用于在此所述的疫苗制剂中的特定形式的皂苷是免疫刺激复合物 (ISCOM)。ISCOM是本领域所公认的一类佐剂，其通常包含皂树皂苷分离部分和脂质(例如，胆固醇和磷脂，如磷脂酰胆碱)。在某些实施例中，ISCOM与感兴趣的多肽或核酸组装在一起。然而，不同的皂素分离部分可以不同的比率使用。另外，不同的皂素分离部分可以一起存在于相同颗粒中，或者每种颗粒实质上仅具有一种分离部分(这样使得指定比率的分离部分A和C通过将具有不同分离部分的颗粒混合在一起而产生)。在此上下文中，“实质上”是指小于20％、 15％、10％、5％、4％、3％、2％或甚至1％。这些佐剂可以包含分离部分A和分离部分C，其混合成以下比率：70-95A：30-5C，如70A：30C到75A：5C、75 A：5C到80A：20C、80A：20C到85A：15C、85A：15C到90A：10C、90 A：10C到95A：5C或95A：5C到99A：1C。
在某些实施例中，使用佐剂组合。三个示例性佐剂组合是MPL和明矾、 E6020和明矾以及MPL和ISCOM。
佐剂可以与抗原共价结合。在一些实施例中，所述佐剂可以包含蛋白质，所述蛋白质通过激活抗原呈递细胞(APC)来诱导炎症反应。在一些实施例中，这些蛋白质中的一种或多种可与所选抗原重组融合，这样使得所得融合分子促进树突细胞成熟，激活树突细胞产生细胞因子和趋化因子，并且最终增强抗原到T 细胞的呈递并启动T细胞应答(参见吴等人，《癌症研究》，2005；65(11)，第 4947-4954页(Wu et al.，Cancer Res2005；65(11)，pp4947-4954))。在某些实施例中，在此所述的多肽存在于三价结合系统的情况下，包含肺炎链球菌肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)与pneumolysoid PdT的融合蛋白和细胞壁多糖(PsaA：PdT- CPs)，描述在陆等人(“融合蛋白与细胞壁多糖的三价结合物提供保护免遭肺炎球菌定植和致命肺炎”，《感染与免疫》，2009年5月；77(5)：2076-83)(Lu et al. (″Protection against Pneumococcal colonization and fatal pneumonia by atrivalent conjugate of a fusion protein with the cell wall polysaccharide.″Infect Immun.2009 May；77(5)：2076-83))中。PdT携带三个氨基酸取代(W433F、D385N以及C428G)，其使得所述分子无毒但不干扰其TLR-4-介导的炎症性质。多糖和多肽与TLR-4-激动剂PdT的融合物的结合使得对多肽的免疫应答大大增强。在一些实施例中，使用在此所述的一种或多种多肽代替三价结合物中的PsaA。所述三价结合系统典型地包括明矾，并且通常通过非经肠给药。可以与抗原共价结合的其他示例性佐剂包括多糖、肺炎链球菌溶血素、合成肽、脂肽以及核酸。
典型地，每一剂量的疫苗中存在相同的佐剂或佐剂混合物。然而，任选地，佐剂可以与第一次疫苗给药一起给予，但在接下来的给药(即强化注射)不给予。或者，可以与第一次疫苗给药一起给予强佐剂，并且可以与接下来的给药一起给予较弱的佐剂或者较低剂量的强佐剂。佐剂可以在向受试者给予抗原之前、给予抗原同时或者给予抗原之后给予(有时是在1、2、6或12个小时之内，并且有时是在1、2或5天之内)。某些佐剂适用于人类患者、非人类动物、或两者。
2.疫苗或免疫原性组合物的其他组分
除上述抗原和佐剂以外，疫苗制剂或免疫原性组合物可以包含一种或多种另外的组分。
在某些实施例中，疫苗制剂或免疫原性组合物可以包含一种或多种稳定剂，如糖(如蔗糖、葡萄糖或果糖)、磷酸盐(如磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或磷酸一钠)、谷氨酸盐(如L-谷氨酸一钠)、凝胶(例如处理过的凝胶、水解的凝胶、或猪凝胶)、氨基酸(如精氨酸、天冬酰胺、组氨酸、L-组氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸以及其烷基酯)、肌苷或硼酸钠。
在某些实施例中，疫苗制剂或免疫原性组合物包含一种或多种缓冲剂，如碳酸氢钠和抗坏血酸的混合物。在一些实施例中，疫苗制剂可以在生理盐水(如磷酸盐缓冲生理盐水(PBS))或蒸馏水中给予。
在某些实施例中，疫苗制剂或免疫原性组合物包含一种或多种表面活性剂，如聚山梨酯80(Tween80)、Triton X-100(聚乙二醇叔辛基苯基醚叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)(TRITON X-100)；聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(TWEEN 20)；以及4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯酚与甲醛和环氧乙烷的聚合物 (TYLOXAPOL)。表面活性剂可以是离子型的或非离子型的。
在某些实施例中，疫苗制剂或免疫原性组合物包含一种或多种盐，如氯化钠、氯化铵、氯化钙或氯化钾。
在某些实施例中，疫苗制剂或免疫原性组合物中包含防腐剂。在其他实施例中，不使用防腐剂。防腐剂在多剂量的疫苗小瓶中最常使用，在单剂量的疫苗小瓶中较不经常需要。在某些实施例中，防腐剂是2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、苯甲醇和/或山梨酸。
在某些实施例中，疫苗制剂或免疫原性组合物是控制释放的制剂。
E.DNA疫苗
在某些方面，所述疫苗包含在此所披露的或对应于在此所述的多肽的核酸中的一种或多种。当向患者给予核酸疫苗时，患者体内会产生相应的基因产物 (如所希望的抗原)。在一些实施例中，包含优化的重组聚核苷酸的核酸疫苗载体可以被递送给哺乳动物(包括人类)以诱导治疗性或预防性免疫应答。核酸可以是例如DNA、RNA或合成的核酸。所述核酸可以是单链的或者双链的。
核酸疫苗载体(例如腺病毒、脂质体、乳头状瘤病毒、逆转录酶病毒等等)可以直接给予哺乳动物，以在体内进行细胞转导。核酸疫苗可以被配制成以任何适合的方式给药的药物组合物，包括非经肠给药。质粒载体典型地更有效地将基因转移到肌肉组织。也已经报导了通过口服给药将DNA载体递送到粘膜表面的可能性(PLGA包膜的轮状病毒和B型肝炎)并且DNA质粒已经被用来将基因直接引入到其他组织中。DNA疫苗已经主要通过肌肉内注射、通过基因枪递送或通过电穿孔被引入到动物中。在被引入之后，这些质粒通常被维持为游离型而不复制。编码的蛋白质的表达已经显示持续延长的时期，从而提供对B和T 细胞的刺激。
在确定被给予用来治疗或者预防感染或其他病状的载体的有效剂量时，医师评估载体的毒性、疾病的进展以及抗载体抗体的产生情况(如果有的话)。通常，对于典型的70公斤的患者来说，来自载体的净核酸的剂量当量为约1μg到 1mg，并且计算用于递送核酸的载体的剂量以得到治疗性核酸的等效量。给药可以通过单次或分次给药来完成。核酸疫苗载体的毒性和疗效可以在细胞培养物或实验动物中使用标准药物程序来测定。
核酸疫苗可以包含DNA、RNA、修饰的核酸或其组合。在一些实施例中，疫苗包含一种或多种克隆或表达载体；举例来说，疫苗可以包含多种表达载体，每种表达载体都能够在哺乳动物细胞中自主表达核苷酸编码区以产生至少一种免疫原性多肽。表达载体通常包含真核生物的启动子序列，如强真核生物启动子的核苷酸序列，其被可操作地连接到一个或多个编码区。在此的组合物和方法可以涉及使用任何特定的真核生物的启动子，并且已知许多种；如CMV或RSV启动子。所述启动子相对于宿主细胞可以是异源的。所用启动子可以是组成型启动子。
适用于本申请组合物和方法的载体可以是环形的或线性的，单链的或双链的，并且可以是质粒、粘粒或附加体。在合适的实施例中，每个核苷酸编码区位于单独的载体上；然而应了解，一个或多个编码区可以存在于单个载体上，并且这些编码区可以受单个或者多个启动子控制。
众多质粒可以被用于产生核酸疫苗。核酸疫苗的合适的实施例采用使用质粒VR1012(加州圣地亚哥的维考公司(Vical Inc.，San Diego Calif.))、pCMVI.UBF3/2(得克萨斯大学的S.约翰斯顿(S.Johnston，University of Texas))或pcDNA3.1(加州卡尔斯巴德的英杰公司(InVitrogen Corporation， Carlsbad，Calif.))作为载体的构建体。此外，载体构建体可以含有免疫刺激序列 (ISS)，如未甲基化的dCpG基序，所述基序刺激动物的免疫系统。核酸疫苗还可以编码含有免疫原性多肽的融合产物。质粒DNA还可以使用减毒的细菌作为递送系统进行递送，这是适用于经口给予的DNA疫苗的方法。用独立复制的质粒转化细菌，减毒的细菌在宿主细胞中死亡后，所述质粒被释放到宿主细胞细胞质中。
DNA疫苗，包括编码所希望的抗原的DNA，可以按任何合适的形式被引入到宿主细胞中，这些形式包括单独的片段、线性化质粒、环形质粒、能够复制的质粒、附加体、RNA等等。优选地，所述基因被容纳在质粒中。在某些实施例中，所述质粒是表达载体。能够表达遗传物质的个别表达载体可以使用标准重组技术来产生。关于一般性克隆方法参见例如马尼亚蒂斯等人，1985分子克隆：实验室手册或DNA克隆，第I和II卷(D.N.格洛夫编，1985)(Maniatis et al.， 1985Molecular Cloning：A Laboratory Manual or DNA Cloning，Vol.I and II(D.N. Glover，ed.，1985)).
给药途径包括(但不限于)肌肉内、鼻内、腹膜内、真皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内以及经口以及局部地、经真皮、通过吸入或栓剂或到粘膜组织，如通过灌洗阴道、直肠、尿道、颊内以及舌下组织。典型的给药途径包括肌肉内、腹膜内、真皮内以及皮下注射。基因构建体可以通过包括(但不限于)传统注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪”的手段或其他物理方法，如电穿孔 (“EP”)、“流体动力学方法”或超声波来给予。DNA疫苗可以通过可以用于递送 DNA的任何方法来递送，只要DNA得到表达并且在细胞内形成所希望的抗原即可。
在一些实施例中，DNA疫苗是通过已知转染试剂来递送，这些转染试剂如阳离子脂质体、氟碳乳液、螺旋状细管、金颗粒、生物可降解的微球体或阳离子聚合物。螺旋状递送媒剂是稳定的磷脂钙沉淀剂，其由磷脂酰丝氨酸、胆固醇以及钙组成；这种无毒并且非炎性的转染试剂可以存在于消化系统中。生物可降解的微球体包括聚合物，如聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚酯，其可以被用于产生用于转染的DNA的微胶囊。基于脂质的微管通常由两个螺旋式缠绕的脂质层组成，这两个层通过其边缘彼此连接而进行包装。当使用细管时，可以将核酸安排在其中央空心部分中用于递送并且控制释放到动物体内。
在一些实施例中，DNA疫苗是通过微球体被递送到粘膜表面。生物粘附微球体可以使用不同技术来制备并且可以进行调整以粘附到任何粘膜组织，包括在眼睛、鼻腔、尿道、结肠以及胃肠道中所见到的那些组织，从而提供定位以及全身性控制释放疫苗的可能性。将生物粘附微球体施用到特定粘膜组织还可以被用于定位疫苗作用。在一些实施例中，用于粘膜疫苗递送的另一种方法是向编码特异性蛋白抗原基因的质粒DNA表达载体的粘膜表面直接给药。
根据本发明的DNA质粒疫苗是根据待使用的给药模式来配制的。在DNA 质粒疫苗是可注射组合物的一些实施例中，它们是无菌的和/或无热原的和/或无颗粒的。在一些实施例中，优选地使用等张的制剂。一般来说，等张性添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇以及乳糖。在一些实施例中，如磷酸盐缓冲生理盐水的等张溶液是优选的。在一些实施例中，稳定剂包括凝胶和白蛋白。在一些实施例中，向制剂中添加血管收缩剂。在一些实施例中，向制剂中添加使得所述制剂在室温或环境温度下稳定持续延长的时间段的稳定剂，如LGS 或其他聚阳离子或聚阴离子。
在一些实施例中，DNA疫苗可以进一步包含药理学上可接受的载体或稀释剂。用于疫苗的合适载体是本领域的普通技术人员众所周知的并且包括(但不限于)蛋白质、糖等等。这些载体可以是水性的或非水性的溶液、悬浮液以及乳液。非水性载体的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)以及可注射的有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇性/水性溶液、乳液或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质。非经肠媒剂包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer′s dextrose)和氯化钠、乳酸盐林格氏或不挥发性油。静脉内媒剂包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如那些基于林格氏右旋糖的电解质补充剂)等。防腐剂和抗微生物剂包括抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。优选的防腐剂包括福尔马林、硫柳汞、新霉素、多粘菌素B以及两性霉素B。
将核酸递送到动物中的另一种方法涉及使用病毒或细菌载体。合适的病毒载体的实例包括腺病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒(如牛痘、金丝雀痘以及禽痘)、疱疹病毒(包括鲶鱼疱疹病毒)、腺病毒相关载体以及逆转录酶病毒。示例性细菌载体包括减毒形式的沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(shigella)、鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)、鲁克氏耶尔森菌(Yersinia ruckerii)以及单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)。在一些实施例中，核酸是载体，如质粒，其能够自主表达编码免疫原性多肽的核苷酸序列。
E.疫苗的用途
在此所述的肺炎链球菌疫苗可以被用来预防性和/或治疗性治疗肺炎链球菌。因此，本申请提供了用于治疗罹患或易受肺炎链球菌感染的受试者的方法，所述方法包含给予有效量的在此所述的任一种疫苗制剂。在一些方面，所述方法抑制了肺炎链球菌在个体中定植。在一些方面，所述方法抑制了肺炎链球菌症状或后遗症，如败血症。接受疫苗接种的受试者可以是男性或女性，并且可以是孩子或成人。在一些实施例中，所治疗的受试者是人类。在其他实施例中，所述受试者是非人类动物。
1.预防性用途
在预防性实施例中，向受试者给予疫苗以诱导免疫应答，所述免疫应答可以帮助提供保护免于肺炎链球菌的建立，例如，通过保护免于定植，定植是疾病中的第一且必须的步骤。因而，在一些方面，所述方法抑制了肺炎链球菌对未定植或未感染的受试者的感染。在另一方面，所述方法可以减少已定植个体中的定植持续时间。
在一些实施例中，本发明的疫苗组合物赋予保护性免疫，允许接种疫苗的个体展现出症状或后遗症延迟发作，或者症状或后遗症的严重程度降低，作为他或她暴露于疫苗的结果。在某些实施例中，症状或后遗症的严重程度降低至少 25％、40％、50％、60％、70％、80％或甚至90％。在特定的实施例中，接种疫苗的个体在接触肺炎链球菌后可能不显示症状或后遗症，不被肺炎链球菌定植或两种情况都发生。保护性免疫典型地通过以下机制中的一种或多种来实现：粘膜、体液或细胞免疫。粘膜免疫主要是呼吸道、胃肠道以及泌尿生殖道粘膜表面上的分泌型IgA(sIGA)抗体的结果。sIGA抗体是在抗原处理细胞、B和T淋巴细胞介导的一系列事件之后产生的，这些事件导致体内粘膜衬里组织的B淋巴细胞产生sIGA。体液免疫典型地是血清中的IgG抗体和IgM抗体的结果。细胞免疫可以通过细胞毒性T淋巴细胞，或通过涉及巨噬细胞和T淋巴细胞的延迟型超敏反应，以及涉及T细胞但不需要抗体的其他机制来实现。具体来说，细胞免疫可以由TH1或TH17细胞介导。
基本上任何个体都具有感染肺炎链球菌的某种风险。然而，某些子群体所具有的感染风险增加。在一些实施例中，向免疫受损的患者给予在此所述的疫苗制剂(例如包含表1或2中的一种或多种多肽的，或编码这些多肽的核酸，或与这些多肽反应的抗体的组合物)。
由医疗引起的免疫功能不全病状很可能使议论中的个体暴露于感染肺炎链球菌的更高风险。有可能在已知损害免疫功能的治疗之前或期间预防地治疗在具有免疫受损状态的个体中的感染。在已知损害免疫功能的治疗之前或期间，通过用抗原组合物(例如，表1或2中的两种或更多种抗原，或编码这些抗原的核酸)，或者用与表1或表2中的两种或更多种抗原反应的抗体来进行预防性的治疗，有可能预防随后的肺炎链球菌感染或者降低个体因为免疫受损状态而遭受感染的风险。如果个体遭受了肺炎链球菌感染，例如，在进行导致免疫受损状态的治疗后，还可能通过向所述个体给予抗原组合物来治疗感染。
以下各组的肺炎球菌疾病或其并发症的风险增加，并且因此处在这些组中的一个或多个的范围内的受试者宜接受在此所述的疫苗制剂：孩子，尤其是那些 1个月到5岁或2个月到2岁的孩子；具有无脾症、脾脏机能障碍或镰状细胞病的年龄至少2岁的孩子；具有肾病综合征、慢性脑脊液渗漏、HIV感染或与免疫抑制相关的其他病状的年龄至少2岁的孩子。
在另一个实施例中，对以下各组中的肺炎球菌疾病或其并发症的风险增加的成人给予至少一个剂量的肺炎球菌抗原组合物：年龄65岁的所有人；具有无脾症、脾脏机能障碍或镰状细胞病的成人；具有以下病状的成人：慢性心肺疾病、肝硬化、酒精中毒、慢性肾脏疾病、肾病综合征、糖尿病、慢性脑脊液渗漏、HIV感染、AIDS以及与免疫抑制相关的其他病状(霍奇金病(Hodgkin′s disease)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、器官移植的免疫抑制)；具有耳蜗植入物的个体；具有长期健康问题(如心脏病和肺病)的个体；以及正在服用会降低身体对感染的抵抗力的任何药物或治疗(如长期类固醇、某些癌症药物、放射疗法)的个体；阿拉斯加土著人以及某些美洲土著群体。
2.治疗性用途
在一些治疗性应用中，可以向罹患肺炎链球菌感染的患者给予足以治疗所述患者的量的疫苗。在这种情况下，治疗患者是指减少被感染个体的肺炎链球菌症状和/或细菌负荷和/或后遗症。在一些实施例中，治疗患者是指减少症状或后遗症的持续时间，或降低症状或后遗症的强度。在一些实施例中，疫苗降低了接种免疫的患者中肺炎链球菌的传播性。在某些实施例中，上述降低是至少 25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或甚至90％。
在治疗性实施例中，对感染后的个体给予疫苗。疫苗可以在感染之后不久给予，例如在症状或后遗症显现之前，或可以在症状或后遗症显现期间或之后给予。
治疗性肺炎链球菌疫苗可以降低肺炎链球菌感染的不同的症状或后遗症的强度和/或持续时间。肺炎链球菌感染的症状或后遗症可以采用多种形式。在一些情况下，被感染患者会发展肺炎、急性窦炎、中耳炎(耳部感染)、脑膜炎、菌血症、败血症、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、蜂窝组织炎或脑脓肿。
败血症是肺炎链球菌感染的罕见的但危及生命的并发症，其中细菌侵入血流并且产生全身性炎症。典型地，观察到发烧并且白细胞计数增加。败血症的进一步描述见于戈德斯坦B.等人，“国际儿科败血症共识会议：关于儿科败血症和器官机能障碍的定义”，《儿科危症护理医学》，2005年1月；6(1)：2-8(Goldstein， B.et al.″International pediatricsepsis consensus conference：definitions for sepsis and organ dysfunction inpediatrics.″Pediatr Crit Care Med.Jan2005；6(1)：2-8)中。
3.分析疫苗接种功效
除上述临床结果之外，用在此所披露的疫苗进行疫苗接种的功效可以用众多方式测定。首先，我们可以通过在疫苗接种之后刺激来源于受试者的T细胞来分析IL-17水平(特别是IL-17A)。可以将这些IL-17水平与在疫苗接种之前的同一受试者中的IL-17水平相比较。IL-17(例如IL-17A)水平增加，如增加1.5 倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍，将表明对疫苗的反应增加。或者(或以组合形式)，我们可以在来自患者的T细胞或抗体存在下分析嗜中性粒细胞的肺炎球菌杀死量。肺炎球菌杀死量增加，如增加1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍，将表明对疫苗的反应增加。另外，我们可以测量TH17细胞激活，其中TH17细胞激活增加，如增加1.5倍、2倍、5 倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍，与对疫苗的反应增加有关。我们还可以测量对疫苗具有特异性的抗体的水平，其中所述特异性抗体水平增加，如增加1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍，这与疫苗疗效增加有关。在某些实施例中，使用这些分析中的两种或更多种。举例来说，我们可以测量IL-17水平和疫苗特异性抗体的水平。或者，我们可以追踪流行病学标记，如接种疫苗的个体相比于未接种疫苗的个体的肺炎球菌感染的发病率、严重程度或持续时间。
疫苗疗效还可以在不同模型系统中分析，如小鼠模型。举例来说，可以使用BALB/c或C57BL/6品系的小鼠。在向受试者给予测试疫苗(以单剂量或多剂量形式)之后，实验人员给予攻击剂量的肺炎链球菌。在一些情况下，鼻内给予的攻击剂量足以引起肺炎链球菌在未接种疫苗的动物中定植(尤其是鼻定植)；并且在一些情况下，通过吸气给予的攻击剂量足以在未接种疫苗的动物中引起败血症和高的致死率。我们可以接着测量在接种疫苗的动物中定植的减少或致死率的减少。实例5-8和10显示了在小鼠模型中，在鼻内攻击之后，表1的多肽在抑制肺炎链球菌鼻定植方面的疗效。实例11和12显示了在小鼠模型中，在通过吸气感染肺炎链球菌之后，表1的多肽在提供保护免于败血症和死亡的保护方面的疗效。
G.免疫原性组合物的用途
1.针对肺炎链球菌感染的防御
本披露的免疫原性组合物被设计成可引发针对肺炎链球菌的免疫应答。在此所述的组合物(例如包含表1或2的一种或多种多肽或编码这些多肽的核酸的组合物)在其所给予的哺乳动物中可以刺激抗体应答或细胞介导的免疫应答或两者。在一些实施例中，所述组合物刺激TH1偏移的CD4+T细胞应答、TH17偏移的CD4+T细胞应答和/或CD8+T细胞应答。在一些实施例中，所述组合物刺激抗体应答。在一些实施例中，所述组合物刺激TH1偏移的CD4+T细胞应答、 TH17偏移的CD4+T细胞应答和/或CD8+T细胞应答以及抗体应答。
在某些实施例中，所述组合物(例如包含表1或2中的一种或多种多肽，或编码这些多肽的核酸，或与这些多肽反应的抗体的组合物)包括细胞因子或者编码细胞因子(如IL-17)的核苷酸编码区，提供对哺乳动物免疫系统的另外的刺激。在某些实施例中，所述组合物包含细胞因子，如IL-17。
虽然不希望被理论束缚，但是在一些实施例中，TH17细胞应答在设立对在此所披露的组合物的免疫应答方面是所希望的，这些组合物例如包含表1或2的一种或多种多肽的组合物。在某些实施例中，有效的TH17反应有益于清除肺炎球菌感染。举例来说，缺少IL-17A受体的小鼠显示了针对肺炎球菌攻击的基于全细胞的疫苗保护能力降低(陆等人，“白细胞间介素-17A介导针对肺炎球菌定植的获得性免疫”，《公共科学图书馆·病原体》，2008年9月19日；4(9)(Lu et al.，″Interleukin-17A mediates acquired immunity topneumococcal colonization.″PLoS Pathog.2008Sep19；4(9)))。
因此，在此提供了通过向受试者给予在此所述的组合物(例如包含表1或2 的一种或多种多肽的组合物)来增加IL-17产量的方法。另外，本申请提供了通过向受试者给予所述组合物来激活TH17细胞的方法。在某些实施例中，IL-17A 水平增加使得被嗜中性粒细胞或类嗜中性粒细胞杀死的肺炎球菌量增加，例如通过诱导嗜中性粒细胞或类嗜中性粒细胞的补充和激活。在某些实施例中，这种肺炎球菌杀死与抗体和补体无关。然而，特异性抗体产生和补体激活可以是有助于清除肺炎球菌感染的有用的另外的机制。
还提供了含有免疫原性多肽或编码这些免疫原性多肽的聚核苷酸以及药物载体的免疫原性组合物。
在一些情况下，所述免疫原性组合物包含编码SEQ ID NO：1-13、265、266 以及267的一种或多种多肽的一种或多种核酸，如从SEQ ID No：24-31、271、 272以及273中选出的一种或多种核酸。在一些实施例中，这些核酸是在免疫个体中表达，产生编码的肺炎链球菌抗原，并且如此产生的肺炎链球菌抗原可以在免疫个体中产生免疫刺激作用。
此类含有核酸的免疫刺激组合物可以包含例如复制起点和启动子，所述启动子驱动编码SEQ ID NO：1-13、265、266以及267的一种或多种多肽的一种或多种核酸的表达。此类组合物还可以包含启动子(有时是强病毒启动子)插入其中的细菌质粒载体、编码SEQ IDNO：1-13、265、266以及267的一种或多种多肽的一种或多种核酸，以及聚腺苷酸化/转录终止序列。在一些情况下，所述核酸是DNA。
H.诊断用途
本申请尤其提供了用于检测患者中的肺炎链球菌的快速、经济、灵敏并且特异性的方法。在这个方面，这将有益于所有医院和医师对具有肺炎链球菌感染或具有肺炎链球菌感染风险的患者进行检查和治疗。检测试剂盒可以足够简单到在任何本地医院实验室中构建，并且抗体和其抗原结合部分能够容易地制作成可为所有医院用于治疗具有肺炎链球菌感染或具有肺炎链球菌感染风险的患者。如在此所用，“患者”是指具有肺炎链球菌感染或者具有遭受肺炎链球菌感染的可能性的个体(如人类)。患者可以是具有肺炎链球菌感染、具有遭受肺炎链球菌感染的可能性、已经从肺炎链球菌感染康复和/或感染状态未知的个体(如人类)。
在一些实施例中，我们可以使用两种或更多种抗体来执行诊断分析，每种抗体结合表1或2的抗原中的一种以检测个体中的肺炎链球菌。在一些实施例中，这些抗原之一是SEQ ID NO：265、266或268。本披露还提供了分析来自怀疑具有肺炎链球菌感染的患者的生物样品的表型的方法：(a)从患者获得生物样品；(b)使所述样品与两种或更多种肺炎链球菌特异性抗体或其抗原结合部分在允许所述抗体或抗原结合部分与肺炎链球菌的表位结合的条件下接触；其中结合表明所述样品中存在肺炎链球菌。在一些实施例中，将与生物样品的结合和相同抗体与阴性对照组织的结合进行比较，其中如果与阴性对照组织相比，所述生物样品显示了存在肺炎链球菌，那么所述患者就被鉴定为可能具有肺炎链球菌感染。在一些情况下，一种抗体的结合表明存在肺炎链球菌；在其他情况下，两种或更多种抗体的结合表明存在肺炎链球菌。可以适当地调整上述测试以检测其他细菌感染，例如通过使用对表1中所述蛋白质之一的同源物(来自另一个细菌物种)具有免疫活性的抗体。在一些实施例中，针对表1或2中的肺炎链球菌蛋白质出现的抗体还将结合另一个链球菌物种中的同源物，尤其是当这些同源物具有高百分比的序列一致性时。
或者，我们可以使用表1或2的抗原(如SEQ ID NO：265、266或268)来检测个体中的抗肺炎链球菌抗体。本披露还提供了分析来自怀疑具有肺炎链球菌感染的患者的生物样品的表型的方法：(a)从患者获得生物样品；(b)使所述样品与从表1或2中选出的两种或更多种肺炎链球菌特异性抗原或其部分在允许所述抗原(或其部分)与所述样品中所存在的任何宿主抗体结合的条件下接触；其中结合表明所述样品中存在抗肺炎链球菌抗体。在一些实施例中，将与生物样品的结合和相同抗原与阴性对照组织的结合进行比较，其中如果与阴性对照组织相比，所述生物样品显示了存在抗肺炎链球菌抗体，那么所述患者就被鉴定为可能 (1)具有肺炎链球菌感染，或者(2)过去曾经具有肺炎链球菌感染。在一些情况下，检测到一种抗体表明现在或过去感染了肺炎链球菌；在其他情况下，检测到两种或更多种抗体表明现在或过去感染了肺炎链球菌。可以适当地调整上述测试以检测其他细菌感染，例如通过使用表1中所述蛋白质的同源物(来自另一个细菌物种(例如链球菌物种))。
在一些实施例中，哺乳动物细胞的免疫细胞应答可以在体外定量。用于这种定量的方法包括向哺乳动物T细胞体外给予在此所披露的组合物，并且定量哺乳动物T细胞对所述组合物作出反应而产生的细胞因子量的变化。在这些方法中，细胞因子可以是例如IL-17。
可以使用任何适当的方法来测量抗肺炎链球菌抗体与抗原(例如表1或2 的多肽，如SEQ ID NO：265、266或268)的结合。这些方法包括ELISA(酶联免疫吸附测定)、蛋白质印迹法、竞争分析以及斑点杂交。检测步骤可以是例如化学发光、荧光或比色分析。一种适于测量抗体-蛋白质结合的方法是Luminex xMAP系统，其中多肽与含有染料的微球体结合。某些系统(包括xMAP系统) 可以多路方式测量若干不同的标记，并且可以被用于一次性测量抗体水平。在一些实施例中，使用其他系统来以多路方式分析多种标记。举例来说，可以使用以下系统中的任一个来执行特征分析(profiling)：抗原微阵列、珠微阵列、纳米条形码颗粒技术、来自cDNA表达文库的阵列蛋白质、蛋白质原位阵列、活转化株的蛋白质阵列、通用蛋白质阵列、芯片实验室微流体以及销上肽(peptides on pins)。另一种类型的临床分析是化学发光分析，检测抗体结合。在一些这样的分析中，包括VITROS Eci抗HCV分析，抗体与由液体悬浮液中的微粒构成的固相支持物相结合，并且使用表面荧光计来定量酶产生的荧光产物。
在一些实施例中，如果生物样品显示了存在肺炎链球菌(例如通过检测表1 或2的一种或多种多肽，如SEQ ID NO：265、266或268，或结合所述多肽之一的抗体)，我们可以向所述患者给予治疗有效量的在此所述的组合物和疗法。生物样品可以包括例如血液、精液、尿液、阴道流体、粘液、唾液、粪便、尿液、脑脊髓液或者组织样品。在一些实施例中，生物样品是意欲进行移植的器官。在某些实施例中，在检测步骤之前，使生物样品经受可促进肺炎链球菌生长的培养条件。
在此的诊断测试(例如那些检测表1或2的多肽，如SEQ ID NO：265、 266或268，或结合所述多肽之一的抗体的测试)可以被用来检测各种样品中的肺炎链球菌，这些样品包括从患者取得的样品和从其他来源获得的样品。举例来说，诊断测试可以被用于检测以下各处的肺炎链球菌：食品、饮料或食品和饮料的成分中；物品，如医疗仪器、医疗装置(如耳蜗植入物和起搏器)、鞋子、衣物、家具(包括医院家具)以及布帘(包括医院布帘)上；或者从环境中取得的样品(如植物样品)中。在一些实施例中，在此的测试可以对从动物中取得的样品进行，这些动物如农业动物(牛、猪、鸡、山羊、马等)，伴侣动物(狗、猫、鸟等)或者野生动物。在某些实施例中，在此的测试可以对从细胞培养物取得的样品进行，这些细胞培养物如产生治疗性蛋白的人类细胞培养物，意欲产生有用的生物分子的细菌培养物，或用于研究目的所生长的细胞培养物。
本披露还提供了测定肺炎链球菌感染在患者中的位置的方法，所述方法包括：(a)向患者给予包含带标签的肺炎链球菌抗体或其抗原结合部分的药物组合物，和(b)检测所述标签，其中结合表明肺炎链球菌感染在所述患者的特定位置中。这样的诊断还可以包括将患者的结合水平与对照组比较。在某些实施例中，所述方法进一步包括，如果患者具有肺炎链球菌感染，那么通过给予所述患者治疗有效量的肺炎链球菌结合抗体或其抗原结合部分来治疗感染。在某些实施例中，所述方法进一步包括，如果患者具有肺炎链球菌感染，那么通过给予所述患者治疗有效量的表1或2中的肺炎链球菌蛋白或其免疫原性部分来治疗感染。所述方法可以进一步包括测定肺炎链球菌在患者中的位置和/或体积。所述方法可以被用于评估肺炎链球菌在患者中的扩散并且确定局部疗法是否适当。
在一些实施例中，在此所述的抗肺炎链球菌抗体或T细胞可以被用来作出对感染过程的预后。在一些实施例中，可以在从患者取得的样品中检测在此的抗肺炎链球菌抗体或T细胞。如果抗体或T细胞以正常水平存在，那么这将表明所述患者已经出现了针对抗肺炎链球菌的免疫应答。如果不存在抗体或T细胞，或存在水平降低，那么这将表明所述患者不能产生足够的针对肺炎链球菌的反应，并且需要推荐更加积极的治疗。在一些实施例中，存在水平降低的抗体或T 细胞是指存在水平比具有正常免疫系统的患者中典型的抗体或T细胞水平少 50％、20％、10％、5％、2％或1％的抗体。抗体可以通过对在此所述的任何抗原(例如表1和/或2中的那些抗原)的亲和力来检测，例如使用ELISA。T细胞可以通过对在此所述的任何抗原(例如表1和/或2中的那些抗原)的体外反应来检测，例如使用ELISA或ELISPOT分析。
在一些实施例中，特异性肺炎链球菌抗原(例如表1和/或2中的那些抗原，如SEQID NO：265、266或268)的检测可以被用来预测患者中肺炎链球菌感染的进展和症状。本领域的技术人员将了解，在此的方法不局限于检测肺炎链球菌。其他实施例包括检测相关细菌，包括具有与表1或2中所述的蛋白质同源的蛋白质的细菌。这些相关细菌包括例如链球菌的其他菌株。
I.剂量与给药途径
1.剂型、剂量以及时间选择
每一剂量的疫苗或免疫原性组合物中抗原的量被选择为有效量，其以单剂量或经过多剂量诱导如上所述的预防性或治疗性反应。优选地，所述剂量在典型的疫苗接种者中无显著的不良副作用。这种量将根据采用哪种具体抗原而变化。一般来说，据预期，一个剂量将包含1-1000μg的每种蛋白质，在一些情况下是2-100μg，例如4-40μg。在一些方面，所述疫苗制剂包含1-1000μg的多肽和1- 250μg的佐剂。在一些实施例中，待递送的抗原的适当量将取决于受试者的年龄、体重以及健康(例如，免疫受损状态)。当存在时，典型地，佐剂将以每剂量1μg-250μg的量存在，例如50-150μg、75-125μg或100μg。
在一些实施例中，仅给予一剂疫苗来实现上述结果。在其他实施例中，在初次疫苗接种后，受试者接受了一次或多次强化疫苗接种，总共两次、三次、四次或五次疫苗接种。有利的是，所述数字是三或更小。强化疫苗接种可以在初次疫苗接种之后例如约1个月、2个月、4个月、6个月或12个月给予，这样使得一个疫苗接种方案涉及在0、0.5-2以及4-8个月时给药。给予分开剂量的疫苗可能是有利的，这些剂量的疫苗可以通过相同或不同的途径给予。
在此所述的疫苗和免疫原性组合物可以采用各种剂型。在某些实施例中，所述组合物以固体或粉末(例如冻干)形式提供；也可以按溶液形式提供。在某些实施例中，剂型以剂量的冻干组合物和至少一个单独的无菌容器的稀释剂形式提供。
在一些实施例中，组合物将以剂量递增的方式给予，因此相继给予的组合物含有比先前给药更高浓度的组合物。在一些实施例中，组合物将以相继给予的组合物含有比先前给药更低浓度的方式给予。
在治疗性应用中，向罹患疾病的患者给予足以治疗所述患者的量的组合物。在此所述的组合物的治疗性应用包括降低传播性、减慢疾病进展、降低细菌生存能力或复制，或抑制毒性所需的蛋白质的表达，如降低了在没有用所述组合物治疗的个体中将会出现的水平的90％、80％、70％、60％、50％、40％、 30％、20％或10％。
在预防性实施例中，向人类或其他哺乳动物给予组合物以诱导免疫应答，所述免疫应答可以抑制感染性疾病或其他病状的建立。在一些实施例中，组合物可以部分地阻断细菌建立感染。
在一些实施例中，这些组合物与抗生素联合给予。这种共同给予在向最近已经暴露(或怀疑最近已经暴露)于肺炎链球菌的患者给予药物组合物时是特别适当的。多种抗生素被用来治疗肺炎球菌感染，包括青霉素、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢曲松以及万古霉素。适当的抗生素可以基于感染的类型和严重程度以及感染的任何已知抗生素抗性来选择(雅各布斯 MR，“耐药性肺炎链球菌：合理的抗生素选择”，《美国医学杂志》，1999年5月3 日；106(5A)：19S-25S(Jacobs MR″Drug-resistantStreptococcus pneumoniae：rational antibiotic choices″Am J Med.1999May3；106(5A)：19S-25S))。
2.给药途径
在此的疫苗制剂和药物组合物可以通过向个体给药来递送，典型地通过全身给药(例如，静脉内、腹膜内、肌肉内、真皮内、皮下、真皮下、经真皮、颅内、鼻内、经粘膜、经肛门、经阴道、经口、颊内途径或者它们可以被吸入)或它们可以通过局部施用来给药。在一些实施例中，给药途径是肌肉内。在其他实施例中，给药途径是皮下。在又其他实施例中，给药途径是经粘膜。在某些实施例中，给药途径是经真皮或真皮内。
某些给药途径特别地适合于包含指定佐剂的疫苗制剂和免疫原性组合物。具体来说，经真皮给药是包含毒素(例如霍乱毒素或不稳定毒素)的肺炎链球菌疫苗的一种适合的给药途径；在其他实施例中，鼻内给药。用甲病毒复制子配制的疫苗可以例如通过肌肉内或皮下途径来给予。包含单磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)以及双十八烷基二甲基溴化铵(DDA)的疫苗适于(尤其)肌肉内和皮下给药。包含瑞喹莫德的疫苗可以例如局部或皮下给药。
3.制剂
疫苗制剂或免疫原性组合物可以适用于向人类患者给药，并且疫苗或免疫原性组合物的制备可以遵照USFDA指导原则。在一些实施例中，疫苗制剂或免疫原性组合物适用于向非人类动物给药。在一些实施例中，疫苗或免疫原性组合物实质上不含内毒素或外毒素。内毒素可以包括热原，如脂多糖(LPS)分子。疫苗或免疫原性组合物还可以实质上不含失活蛋白质片段，这些失活蛋白质片段可能引起发热或其他副作用。在一些实施例中，所述组合物含有小于1％、小于 0.1％、小于0.01％、小于0.001％或小于0.0001％的内毒素、外毒素和/或失活蛋白质片段。在一些实施例中，疫苗或免疫原性组合物具有比工业用水、自来水或蒸馏水更低水平的热原。其他疫苗或免疫原性组合物组分可以使用本领域已知的方法进行纯化，如离子交换色谱、超滤或者蒸馏。在其他实施例中，可以使热原在给予给患者之前失活或破坏。疫苗的原料，如水、缓冲液、盐以及其他化学物质也可以进行筛选并去除热原。疫苗中的所有材料都可以是无菌的，并且每批疫苗都可以测试无菌性。因此，在某些实施例中，疫苗中的内毒素水平低于 USFDA所设定的水平，例如，鞘内注射组合物的产品为0.2内毒素(EU)/kg；非鞘内注射组合物的产品为5EU/kg，并且无菌水为0.25-0.5EU/mL。
在某些实施例中，所述制剂包含小于50％、20％、10％或5％(以干重计) 的污染性蛋白质。在某些实施例中，所希望的分子在实质上不存在其他生物大分子，如其他蛋白质(特别是可能实质上掩盖、减小、混淆或改变组分蛋白质作为纯化制剂或在其在主题复原混合物中的功能中的特性的其他蛋白质)的情况下存在。在某些实施例中，存在至少80％、90％、95％、99％或99.8％(以干重计) 的相同类型的生物大分子(但是可以存在水、缓冲液以及其他小分子，尤其是分子量小于5000的分子)。在一些实施例中，包含纯化亚单位蛋白的疫苗或免疫原性组合物含有相对于纯化亚单位的量小于5％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％的来自表达这些亚单位蛋白的宿主细胞的蛋白质。在一些实施例中，所希望的多肽实质上不含核酸和/或碳水化合物。举例来说，在一些实施例中，所述疫苗或免疫原性组合物含有小于5％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.2％或小于 0.1％的宿主细胞DNA和/或RNA。在某些实施例中，至少80％、90％、95％、 99％或99.8％(以干重计)的相同类型的生物大分子存在于所述制剂中(但是可以存在水、缓冲液以及其他小分子，尤其是分子量小于5000的分子)。
优选的是疫苗或免疫原性组合物在合理的风险-收益比内具有低毒性或无毒性。在某些实施例中，疫苗或免疫原性组合物包含浓度低于接种疫苗的动物的 LD50测量值的成分。LD50测量值可以在小鼠或其他实验模型系统中获得，并且外推到人类和其他动物。用于评估化合物在人类以及其他动物中的LD50的方法在本领域中众所周知。疫苗制剂或免疫原性组合物以及其中的任何组分在大鼠中可以具有大于100g/kg、大于50g/kg、大于20g/kg、大于10g/kg、大于5 g/kg、大于2g/kg、大于1g/kg、大于500mg/kg、大于200mg/kg、大于100mg/kg、大于50mg/kg、大于20mg/kg或大于10mg/kg的LD50值。包含毒素 (如肉毒杆菌毒素)(其可以被用作佐剂)的疫苗制剂或免疫原性组合物应含有显著小于LD50的肉毒杆菌毒素。
适用于引入疫苗制剂或药物组合物的制剂根据给药途径而变化。适用于非经肠给药(如通过关节内(关节中)、静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、鼻内以及皮下途径)的制剂包括水性和非水性等张无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑细菌剂以及使制剂与既定接受者的血液等张的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂以及防腐剂。这些制剂可以存在于单位剂量或多剂量的密封容器中，如安瓿或小瓶。
注射溶液和悬浮液可以由上述类型的无菌粉末、颗粒以及药片制备。在过继性转移治疗性T细胞的情况下，这些细胞可以通过静脉内或非经肠给药。
适用于经口给予的制剂可以由以下各项组成：(a)液体溶液，如悬浮在如水、生理盐水或PEG400的稀释剂中的有效量的多肽或封装的核酸；(b)胶囊、小袋或药片，每一个都含有预定量的呈液体、固体、颗粒或凝胶形式的活性成分；(c)在适当液体中的悬浮液；以及(d)合适的乳液。药片形式可以包含一种或多种以下成分：乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、黄芪胶、微晶纤维素、阿拉伯胶、凝胶、胶态二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸以及其他赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂以及药学上相容的载体。口含锭形式可以包含在调味剂(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)中的活性成分，以及包含在惰性基质(如凝胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中的活性成分的片剂，乳液，凝胶，以及除活性成分之外还含有本领域中已知的载体的类似剂型。药物组合物可以被封装，例如在脂质体中，或在提供活性成分的缓慢释放的制剂中。
抗原可以单独或者与其他合适的组分组合制成气雾剂制剂(例如，它们可以被“雾化”)以便通过吸入给药。气雾剂制剂可被放到加压的可接受的推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。气雾剂制剂可以经口或经鼻递送。
用于阴道或直肠给药的适合制剂包括例如栓剂，其由多肽或封装的核酸以及栓剂基质组成。适合的栓剂基质包括天然的或合成的甘油三脂或石蜡烃。此外，还有可能使用凝胶直肠胶囊，其由多肽或封装的核酸以及基质组成，基质包括例如液体甘油三脂、聚乙二醇以及石蜡烃。
J.疫苗制剂和免疫原性组合物的制备和储存
在此所述的肺炎链球菌疫苗和免疫原性组合物可以使用各种技术来产生。举例来说，多肽可以使用重组DNA技术在适合的宿主细胞中产生。适合的宿主细胞可以是细菌、酵母、哺乳动物或者其他类型的细胞。宿主细胞可以被修饰以表达相关多肽基因之一的外源拷贝。典型地，所述基因可操作地连接到适当的调控序列，如强启动子和聚腺苷酸化序列。在一些实施例中，启动子是诱导型的或抑制型的。取决于我们希望如何纯化多肽，其他调控序列可以提供感兴趣的多肽的分泌或排泄或者感兴趣的多肽在细胞质或细胞膜中的保留。基因可以存在于染色体外的质粒中，或者被整合到宿主基因组中。本领域的技术人员应该了解，没有必要使用与天然存在的序列100％一致的核酸。而事实上，对这些序列的一些变异是容许的并且可能是所希望的。举例来说，可以改变核酸以利用遗传密码的简并这样使得编码的多肽保持相同。在一些实施例中，所述基因被密码子优化以提高在特定宿主中的表达。核酸可以例如通过PCR或通过化学合成来产生。
一旦产生出重组细胞系后，就可以从中分离多肽。分离可以例如通过亲和纯化技术或物理分离技术(例如，尺寸柱)来实现。
在本披露的另一个方面，提供了制造方法，所述方法包括将一种或多种多肽或其免疫原性片段或变体与载体和/或佐剂混合。
在一些实施例中，免疫制剂和免疫原性组合物中所包含的抗原可以在细胞培养中产生。一种方法包括提供一种或多种表达载体和克隆编码从具有表1或2 的氨基酸序列(如SEQ ID NO：265、266或268)的多肽中选出的的一种或多种多肽的核苷酸，然后表达并且分离多肽。
在此所述的免疫原性多肽和表达这些多肽的核酸组合物可以封装在包装、分配装置以及试剂盒中用于向哺乳动物给予核酸组合物。举例来说，提供了含有一个或多个单位剂型的包装或分配装置。典型地，将随包装一起提供化合物的给药说明书，以及标签上的关于所述化合物适用于治疗所指示病状(如在此所披露的那些病状)的合适指示。
V.实例
实例1.抗原鉴定和合并的鼠类筛选
将肺炎链球菌TIGR4基因组中所预测到的每个开放阅读框克隆到包含标签的表达载体中，所述标签能够由主要组织相容性复合体(MHC)呈递。然后在大肠杆菌中表达每个构建体，并且通过替代测定来验证全长表达，所述替代测定鉴定出在MHC背景下的标签。所述筛选更详细地描述在国际申请WO 2010/002993中。为了促进筛选大文库，将文库合并，使得在每个孔中存在四个诱导的文库克隆。为了从针对肺炎链球菌免疫的小鼠中筛选T细胞，将合并文库的等分部分添加到来自腹膜的巨噬细胞。允许巨噬细胞通过MHC结合带标签的肺炎链球菌抗原。在37℃下，在2小时之后，用PBS洗涤巨噬细胞。然后用 1％多聚甲醛将巨噬细胞固定15min，并且用PBS充分洗涤。将105个T细胞添加到每个孔的200μL RP-10培养基中。这些T细胞是先前从已经用杀死的肺炎链球菌和霍乱毒素佐剂免疫2次的小鼠分离的。将测定板在37℃孵育72小时。通过使用IL-17ELISA测定来确定每个孔的上清液中的IL-17的量。阳性结果的阈值被设定为高出所有样品的平均值的两个标准偏差。
实例2.阳性鼠类池的去卷积
使用第二次筛选来确定每个孔中的四种克隆中哪种(些)抗原诱导了实例1 中所述的合并筛选中所观察到的阳性反应。每个阳性池中的所有克隆都被单独地脉冲到复孔中的腹膜巨噬细胞上。使用从与初次筛选相同遗传背景的免疫小鼠分离的T细胞，使用在实例1中所述的IL-17测定来筛选脉冲巨噬细胞。在复孔中诱导的平均反应超出阴性对照样品的平均值两个标准偏差以上的单独的抗原被认为是阳性反应。将存在于这些阳性克隆中的文库质粒测序，以证实抗原的身份。使用这种方法证实了抗原SP1574、SP1655、SP2106、SP0148、SP1473、 SP0605、SP1177、SP0335、SP0906、SP1828、SP2157、SP1229、SP1128、SP1836、SP1865、SP0904、SP0882、SP0765、SP1634、SP0418、SP1923、 SP1313、SP0775、SP0314、SP0912、SP0159、SP0910、SP2148、SP1412、 SP0372、SP1304、SP2002、SP0612、SP1988、SP0484、SP0847、SP1527、 SP0542、SP0441、SP0350、SP0014、SP1965、SP0117以及SP2108。
实例3.抗原鉴定和合并的人类筛选
从获自人供体的外周血分离CD4+T细胞和CD14+单核细胞。通过将这些单核细胞在含GM-CSF和IL-4的培养基中培养使它们分化成树突细胞，基本上如泰德TF和詹森PJ(1997“人类树突细胞的分离和传代”，《免疫学实验指南》，增刊23：7.32.1-7.32.16)(Tedder TFand Jansen PJ(1997“Isolation and generation of human dendritic cells.”CurrentProtocols in Immunology Supp23：7.32.1-7.32.16))中所述。在培养五天之后，将树突细胞接种到384孔板。使CD4+T细胞在培养物中非特异性地扩增以确保足量。
将肺炎链球菌TIGR4基因组中所预测到的每个开放阅读框克隆到包含标签的表达载体中，所述标签能够由主要组织相容性复合体(MHC)呈递。然后在大肠杆菌中表达每个构建体，并且通过替代测定来验证全长表达，所述替代测定鉴定出在MHC背景下的标签。为了促进筛选大文库，将文库合并，使得在每个孔中存在四个诱导的文库克隆。为了筛选人类T细胞，将合并文库的等分试样添加到384孔板中接种的树突细胞中。在37℃下2小时之后，用1％多聚甲醛固定树突细胞持续15min并且用磷酸盐缓冲液和赖氨酸缓冲液充分洗涤。将在70μL 的RP-10培养基中的40,000个CD4+T细胞添加到384孔板的每个孔中。将这些测定板在37℃孵育3天。通过使用IL-17ELISA测定来确定每个孔的上清液中的IL-17的量。在筛选的不同迭代中，阳性结果的阈值被设定为高出所有样品的平均值的两个标准偏差，高出阴性对照平均值的两个标准偏差或者是数据集的中位数绝对偏差的1.78倍。然后如在实例4中所述对阳性池进行去卷积。
实例4.阳性人类池的去卷积
对于所有抗原，通过比较两组池筛选的结果进行去卷积。在这种方法中，制备了两组不同的池，使得多肽在第一个池与第二个池之间和三种不同的多肽在一起。因此，有可能通过鉴定出哪些多肽在第一组和第二组中都处在阳性池中来决定哪些多肽为抗原。在这种去卷积方法中，如果一个池是数据集中位数绝对偏差的1.78倍，那么它被鉴定为阳性的。
如果抗原在至少两次重复的第二次筛选中都是阳性的，那么它被鉴定为阳性命中物(positive hit)。使用上述方法鉴定了抗原SP2108、SP0641、SP1393、 SP0024、SP0641.1、SP1072、SP1384以及SP2032。
实例5
SP2108、SP0148以及SP1634多肽
使用4μg多肽与1μg霍乱毒素佐剂(CT)的组合将SP2108多肽(SEQ ID NO：9)、SP0148多肽(SEQ ID NO：7)以及S P1634多肽(参见表2)配制为疫苗组合物。关于组合，使用了4μg的每种多肽。向C57BL/6小鼠鼻内给予组合物三次，每次间隔一周。然后允许受试者休息3周，并且在那时进行抽血用于检查免疫原性。为了这一测定，从眶后窦(retrogradeorbital sinus)收集肝素化全血。全部PBMC用圆底管中的杀死的无荚膜的全细胞肺炎链球菌(WCC)或三种多肽的组合刺激三天。然后收集上清液并且通过ELISA评估IL-17水平。单独的霍乱毒素(CT)或来自HSV的无关抗原(003)用作阴性对照。IL-17免疫原性分析的结果显示于图1和2中，其中左图以分散格式显示了数据，并且右图将数据显示为具有标准偏差的平均值。允许这些受试者休息另外的2周，在这段时间通过鼻内给予活的具有荚膜的肺炎链球菌来攻击它们。一周后将这些受试者处死，并且从洗鼻液计数菌落形成单位(CFU)的数目。定植分析的结果显示于图 3中。
实例6
SP0882和SP0314多肽
这个实例使用与实例5相同的方案，除了只给予两个剂量的疫苗组合物之外。在这些实验中，与实例5中所测试的三种多肽中的两种平行地测试SP0882 多肽(SEQ ID NO：2)和SP0314多肽(参见表2)。IL-17免疫原性分析的结果显示于图4和5中。定植分析的结果显示于图6中。
实例7
SP1072、SP0641N、以及SP0024多肽
这个实例使用与实例5相似的方案，除了给予两个剂量的疫苗组合物之外，每次间隔一周。疫苗组合物包含多肽SP1072(SEQ ID NO：8)、SP0641N (SEQ ID NO：13)或SP0024(SEQ ID NO：1)、以及霍乱毒素佐剂(CT)。在最后一次免疫之后四周，用活的6B型肺炎链球菌鼻内攻击小鼠。一周以后，通过将鼻腔灌洗液平板接种于选择培养基上并且对所得CFU进行计数来评定每只小鼠中的细菌负荷。针对每个免疫群组，绘制从每只小鼠分离的CFU的数目的图。这个定植分析的结果显示于图7中。在所述图中指示了统计显著性结果(* ＝p值＜0.05)。
实例8
在BALB/c小鼠中测试的SP0148、SP0314、SP0882、以及SP2108多肽
为了确定对于不同的小鼠基因型是否看到了相似的免疫应答，将免疫组合物给予BALB/c小鼠。疫苗组合物包含多肽SP0148(SEQ ID NO：2)、SP0314 (参见表2)、SP0882(SEQID NO：2)或SP2108(SEQ ID NO：9)以及霍乱毒素佐剂(CT)。使用与实例5相似的方案，对这些小鼠进行免疫，用肺炎链球菌鼻内攻击，并且记录CFU数目。这个定植实验的结果显示于图8中。
实例9
SP1912、SP2108以及SP0148多肽：IL-17A免疫原性分析
将多肽SP1912(SEQ ID NO：265)、SP2108(SEQ ID NO：9)或SP0148 (SEQ ID NO：7)与霍乱毒素佐剂(CT)一起配制为疫苗组合物。向小鼠给予这些疫苗组合物两次，每次间隔一周。阳性对照是杀死的无荚膜的全细胞+CT (WCB)，并且阴性对照是单独的CT或不含CT的重组蛋白(SP1912除外)。在最后一次免疫之后三周，从眶后窦收集外周血并且在全血分析中评估。简单来说，将肝素化全血稀释在培养基中并且然后一式两份地与A)免疫蛋白或B)全细胞疫苗一起培养六天。收集上清液并且通过ELISA测量IL-17A水平。IL-17A免疫原性分析的结果显示于图9中。图中的每个符号代表来自单独的小鼠的反应，并且线表示所述组的中位数反应。
实例10
SP1912、SP2108以及SP0148多肽：定植分析
用如实例9中所述的疫苗制剂免疫动物，这些疫苗制剂包含多肽SP1912 (SEQ IDNO：265)、SP2108(SEQ ID NO：9)或SP0148(SEQ ID NO：7)以及霍乱毒素佐剂(CT)，然后在最后一次免疫之后四周(以及在眶后采血之后一周)用107个活的6B型肺炎链球菌鼻内攻击。在攻击之后七天，将这些动物处以安乐死并且对其进行鼻咽腔进行灌洗并且在许可的培养基上培养以评估肺炎链球菌滴度。结果以每次灌洗的细菌的菌落形成单位(CFU)的形式显示于图10 中。每个符号代表单独的小鼠反应的滴度，并且水平线代表所述组的中位数。(***＝p值＜0.05)。
实例11
SP1912多肽：吸气攻击(败血症分析)
评估多肽SP1912保护小鼠免遭败血症的能力。对十只小鼠的组用包含吸附于明矾的SP1912多肽(SEQ ID NO：265)或pneumolysoid(PdT)的疫苗组合物皮下免疫三次，每次间隔两周。阳性对照是杀死的无荚膜的全细胞肺炎链球菌 +明矾(WCB)，并且阴性对照是单独的明矾。在最后一次免疫之后三周，收集血液用于评估IL-17A反应和抗体水平，然后在一周以后，用107个活菌株0603 (6B型)肺炎链球菌对这些小鼠进行吸气攻击。监测这些动物的存活情况持续八天。吸气攻击的结果以每个免疫组的存活曲线形式显示于图11中。
实例12
pneumolysoid PdT、SP0148以及SP0641N多肽：吸气攻击(败血症分析)
评估多肽SP0148当单独地或与SP0641N和/或pneumolysoid(PdT)联合免疫时保护小鼠免于败血症的能力。对十只小鼠的组用包含单独的多肽SP0148 (SEQ ID NO：7)或与吸附于明矾的多肽SP0641N(SEQ ID NO：13)和/或PdT 联合的多肽SP0148(SEQ ID NO：7)的疫苗组合物皮下免疫三次，每次间隔两周。阳性对照是杀死的无荚膜的全细胞肺炎链球菌+明矾(WCB)，并且阴性对照是单独的明矾。在最后一次免疫之后三周，收集血液用于评估IL-17和抗体，然后在一周以后，用107个活菌株0603(6B型)肺炎链球菌对小鼠进行吸气攻击。监测这些动物的存活情况持续八天。数据以每个免疫组的存活曲线形式显示于图12中。
实例13
SP1912、SP2108以及SP0148多肽：定植分析
基本上如在实例10中所述进行另外的研究，总共四个单独的研究。简单来说，用如在实例9中所述的疫苗制剂免疫动物，这些疫苗制剂包含多肽SP1912 (SEQ ID NO：265)、SP2108(SEQ ID NO：9)、SP0148(SEQ ID NO：7)或另外的SP2108加SP0148、以及霍乱毒素佐剂(CT)。用杀死的无荚膜的全细胞肺炎链球菌加CT(WCB)或单独的CT免疫对照动物。在最后一次免疫之后四周，用107个活的6B型肺炎链球菌鼻内攻击这些免疫的动物。在攻击之后七天，对这些动物处以安乐死并且对其进行鼻咽腔灌洗并且在许可的培养基上培养以评估肺炎链球菌滴度。四个研究的合并结果以每次灌洗的细菌的菌落形成单位 (CFU)的形式显示于图13中。每个符号代表来自单独的小鼠反应的滴度，并且水平线代表所述组的中位数。(***＝p值＜0.05)。N指示所评估的动物的总数。百分比是指受到保护而免于定植的动物的数目。
实例14
SP1912和SP0148多肽：IL-17A免疫原性分析
对十只小鼠的组用包含吸附于明矾的SP1912多肽(SEQ ID NO：265)、 SP0148多肽(SEQ ID NO：7)或这两种多肽的疫苗组合物皮下免疫两次，每次间隔两周。仅仅用明矾免疫对照动物。在最后一次免疫之后三周，通过心脏穿刺收集肝素化血液并且在全血分析中评估IL-17A水平。简单来说，将肝素化全血稀释在培养基中然后与一种或多种免疫蛋白一起培养六天。收集上清液并且通过 ELISA测量IL-17A水平。IL-17A免疫原性分析的结果显示于图14中。图中的每个符号代表来自单独的小鼠的反应，并且线表示所述组的中位数反应。
实例15
SP1912和SP0148多肽：定植分析
用疫苗制剂皮下免疫动物三次，每次间隔两周，这些疫苗制剂包含吸附于明矾的不同剂量的多肽SP0148(SEQ ID NO：7)加减S P1912(SEQ ID NO： 265)。用杀死的无荚膜的全细胞肺炎链球菌加明矾(WCV)或单独的明矾免疫对照动物。在最后一次免疫之后四周，用107个活的6B型肺炎链球菌鼻内攻击这些免疫的动物。在攻击之后七天，对这些动物处以安乐死并且对其进行鼻咽腔灌洗并且在许可的培养基上培养以评估肺炎链球菌滴度。结果以每次灌洗的细菌的菌落形成单位(CFU)的形式显示于图15中。每个符号代表来自单独的小鼠反应的滴度，并且水平线代表所述组的中位数。所述组的动物数目中受到保护免于定植的动物数目指示在所述图的顶部。
实例16
SP1912、SP0148、以及SP2108多肽：定植分析
在两个单独的研究中，用疫苗制剂皮下免疫动物三次，每次间隔两周，这些疫苗制剂包含吸附于明矾的多肽SP0148(SEQ ID NO：7)和SP0148加 SP1912(SEQ ID NO：265)、或另外加上SP2108(SEQ ID NO：9)、SP2108加 SP0148、以及SP2108加SP1912。用杀死的无荚膜的全细胞肺炎链球菌加明矾 (WCV)或单独的明矾免疫对照动物。在最后一次免疫之后四周，用107个活的 6B型肺炎链球菌鼻内攻击这些免疫的动物。在攻击之后七天，对这些动物处以安乐死并且对其进行鼻咽腔灌洗并且在许可的培养基上培养以评估肺炎链球菌滴度。两个研究的合并结果以每次灌洗的细菌的菌落形成单位(CFU)的形式显示于图16中。每个符号代表来单独的小鼠反应的滴度，并且水平线代表所述组的中位数。所述组的动物数目中受到保护免于定植的动物数目和受到保护免于定植的动物的相应百分比指示在所述图的顶部。(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与明矾对照相比的邓恩多重比较检验(Dunn′s Multiple Comparison Test))。
实例17
pneumolysoid L460D、PspA衍生物PR+NPB、SP1912、SP0148、以及SP2108 多肽：定植分析
用疫苗制剂皮下免疫动物三次，每次间隔两周，这些疫苗制剂包含吸附于明矾的多肽SP0148(SEQ ID NO：7)、SP2108(SEQ ID NO：9)、SP0148加 SP2108、以及SP0148加SP2108与SP1912(SEQ ID NO：265)或已知肺炎链球菌抗原L460D加PR+NPD的组合。进行了两个独立研究。仅仅用明矾免疫对照动物。在最后一次免疫之后四周，用107个活的6B型肺炎链球菌鼻内攻击这些免疫的动物。在攻击之后七天，对这些动物处以安乐死并且对其进行鼻咽腔灌洗并且在许可的培养基上培养以评估肺炎链球菌滴度。第二个研究的结果以每次灌洗的细菌的菌落形成单位(CFU)的形式显示于图17中。每个符号代表来自单独的小鼠反应的滴度，并且水平线代表所述组的中位数。所述组的动物数目中受到保护免于定植的动物数目指示在所述图的顶部。
下表显示了在实例16和17中所述的四个研究中受到保护免于定植的动物的绝对数和相应百分比。
实例18
PspA、SP0148以及SP2108被动抗体转移和吸气攻击(败血症分析)
对十只小鼠的组用对PspA具有特异性的单克隆抗体、对SP0148、 SP2108、或这两者的组合具有特异性的热灭活兔血清进行注射。用正常兔血清 (NRS)和PBS调整抗体和抗血清浓度以及总注射体积。用NRS或针对杀死的无荚膜的全细胞肺炎链球菌(WCB)的血清注射对照动物。在注射之后一天，用 106个活的WU-2型肺炎链球菌(ST-3)对小鼠进行吸气攻击。监测这些动物的存活情况持续八天。数据以每个免疫组的存活曲线形式显示于图18中。
图19显示了在实例12和18中所述的研究以及另外的两个研究中受到保护免于败血症的动物的百分比。
序列表
SEQ ID NO：1
SP0024
＞gi|14971488|gb|AAK74215.1|保守的假定蛋白肺炎链球菌TIGR4
MSYFEQFMQANQAYVALHGQLNLPLKPKTRVAIVTCMDSRLHVAQALGLALGDAHILRNAGGRVTEDMIRSLVISQQ
QMGTREIVVLHHTDCGAQTFENEPFQEYLKEELGVDVSDQDFLPFQDIEESVREDMQLLIESPLIPDDVIISGAIYN
VDTGSMTVVEL
SEQ ID NO：2
SP0882
＞gi|14972356|gb|AAK75009.1|保守的假定蛋白(肺炎链球菌TIGR4)
MNQSYFYLKMKEHKLKVPYTGKERRVRILLPKDYEKDTDRSYPVVYFHDGQNVFNSKESFIGHSWKIIPAIKRNPDI
SRMIVVAIDNDGMGRMNEYAAWKFQESPIPGQQFGGKGVEYAEFVMEVVKPFIDETYRTKADCQHTAMIGSSLGGNI
TQFIGLEYQDQIGCLGVFSSANWLHQEAFNRYFECQKLSPDQRIFIYVGTEEADDTDKTLMDGNIKQAYIDSSLCYY
HDLIAGGVHLDNLVLKVQSGAIHSEIPWSENLPDCLRFFAEKW
SEQ ID NO：3
SP0882N
MNQSYFYLKMKEHKLKVPYTGKERRVRILLPKDYEKDTDRSYPVVYFHDGQNVFNSKESFIGHSWKIIPAIKRNPDI
SRMIVVAIDNDGMGRMNEYAAWKFQESPIPGQQFGGKGVEYAEFVNEVVKPFI
SEQ ID NO：4
具有外源信号序列的SP0882
MSSKFMKSAAVLGTATLASLLLVACMNQSYFYLKMKEHKLKVPYTGKERRVRILLPKDYEKDTDRSYPVVYFHDGQN
VFNSKESFIGHSWKIIPAIKRNPDISRMIVVAIDNDGMGRMNEYAAWKFQESPIPGQQFGGKGVEYAEFVMEVVKPF
IDETYRTKADCQHTAMIGSSLGGNITQFIGLEYQDQIGCLGVFSSANWLHQEAFNRYFECQKLSPDQRIFIYVGTEE
ADDTDKTLMDGNIKQAYIDSSLCYYHDLIAGGVHLDNLVLKVQSGAIHSEIPWSENLPDCLRFFAEKW
SEQ ID NO：5
具有外源信号序列的SP0882N
MSSKFMKSAAVLGTATLASLLLVACMNQSYFYLKMKEHKLKVPYTGKERRVRILLPKDYEKDTDRSYPVVYFHDGQN
VFNSKESFIGHSWKIIPAIKRNPDISRMIVVAIDNDGMGRMNEYAAWKFQESPIPGQQFGGKGVEYAEFVMEVVKPF
I
SEQ ID NO：6
缺乏信号序列的SP0148
MCSGGAKKEGEAASKKEIIVATNGSPKPFIYEENGELTGYEIEVVRAIFKDSDKYDVKFEKTEWSGVFAGLDADRYN
MAVNNLSYTKERAEKYLYAAPIAQNPNVLVVKKDDSSIKSLDDIGGKSTEVVQATTSAKQLEAYNAEHTDNPTILNY
TKADFQQIMVRLSDGQFDYKIFDKIGVETVIKNQGLDNLKVIELPSDQQPYVYPLLAQGQDELKSFVDKRIKELYKD
GTLEKLSKQFFGDTYLPAEADIKE
SEQ ID NO：7
包含信号序列的SP0148(具有N末端E的277个氨基酸)
MKKIVKYSSLAALALVAAGVLAACSGGAKKEGEAASKKEIIVATNGSPKPFIYEENGELTGYEIEVVRAIFKDSDKY
DVKFEKTEWSGVFAGLDADRYNMAVNNLSYTKERAEKYLYAAPIAQNPNVLVVKKDDSSIKSLDDIGGKSTEVVQAT
TSAKQLEAYNAEHTDNPTILNYTKADFQQIMVRLSDGQFDYKIFDKIGVETVIKNQGLDNLKVIELPSDQQPTVYPL
LAQGQDELKSFVDKRIKELYKDGTLEKLSKQFFGDTYLPAEADIKE
SEQ ID NO：8
SP1072
＞gi|14972547|gb|AAK75185.1|DNA引物酶肺炎链球菌TIGR4
MVDKQVIEEIKNNANIVEVIGDVISLQKAGRNYLGLCPFHGEKTPSFNVVEDKQFYHCFGCGRSGDVFKFIEEYQGV
PFIEAVQILGQRVGIEVEKPLYSEQKSASPHQALYDMHEDAAKFYHAILMTTTMGEEARNYLYQRGLTDEVLKHFWI
GLAPPERNYLYQRLSDQYREEDLLDSGLFYLSDANQFVDTFHNRIMFPLTNDQGKVIAFSGRIWQKTDSQTSKYKNS
RSTAIFNKSYELYHMDRAKRSSGKASEIYLMEGFMDVIAAYRAGIENAVASMGTALSREHVEHLKRLTKKLVLVYDG
DKAGQAATLKALDEIGDMPVQIVSMPDNLDPDEYLQKNGPEDLAYLLTKTRISPIEFYIHQYKPENSENLQAQIEFL
EKIAPLIVQEKSIAAQNSYIHILADSLASFDYTQIEQIVNESRQVQRQNRMEGISRPTPITMPVTKQLSAIMRAEAH
LLYRMMESPLVLNDYRLREDFAFATPEFQVLYDLLGQYGNLPPEVLAEQTEEVERAWYQVLAQDLPAEISPQELSEV
EMTRNKALLNQDNMRIKKKVQEASHVGDTDTALEELERLISQKRRME
SEQ ID NO：9
包含信号序列的SP2108
＞gi|14973620|gb|AAK76167.1|麦芽糖/麦芽糊精ABC转运蛋白、麦芽糖/麦芽糊精结合蛋白(肺炎链球菌TIGR4)
MSSKFMKSAAVLGTATLASLLLVACGSKTADKPADSGSSEVKELTVYVDEGYKSYIEEVAKAYEKEAGVKVTLKTGD
ALGGLDKLSLDNQSGNVPDVMMAPYDRVGSLGSDGQLSEVKLSDGAKTDDTTKSLVTAANGKVYGAPAVIESLVMYY
NKDLVKDAPKTFADLENLAKDSKYAFAGEDGKTTAFLADWTNFYYTYGLLAGNGAYVFGQNGKDAKDIGLANDGSIV
GINYAKSWYEKWPKGMQDTEGAGNLIQTQFQEGKTAAIIDGPWKAQAFKDAKVNYGVATIPTLPNGKEYAAFGGGKA
WVIPQAVKNLEASQKFVDFLVATEQQKVLYDKTNEIPANTEARSYAEGKNDELTTAVIKQFKNTQPLPNISQMSAVW
DPAKNMLFDAVSGQKDAKTAANDAVTLIKETIKQKFGE
SEQ ID NO：10
缺乏信号序列的SP2108
MCGSKTADKPADSGSSEVKELTVYVDEGYKSYIEEVAKAYEKEAGVKVTLKTGDALGGLDKLSLDNQSGNVPDVMMA
PYDRVGSLGSDGQLSEVKLSDGAKTDDTTKSLVTAANGKVYGAPAVIESLVMYYNKDLVKDAPKTFADLENLAKDSK
YAFAGEDGKTTAFLADWTNFYYTYGLLAGNGAYVFGQNGKDAKDIGLANDGSIVGINYAKSWYEKWPKGMQDTEGAG
NLIQTQFQEGKTAAIIDGPWKAQAFKDAKVNYGVATIPTLPNGKEYAAFGGGKAWVIPQAVKNLEASQKFVDFLVAT
EQQKVLYDKTNEIPANTEARSYAEGKNDELTTAVIKQFKNTQPLPNISQMSAVWDPAKNMLFDAVSGQKDAKTAAND
AVTLIKETIKQKFGE
SEQ ID NO：11
SP0641M
MSGTSMATPIVAASTVLIRPKLKEMLERPVLKNLKGDDKIDLTSLTKIALQNTARPMMDATSWKEKSQYFASPRQQG
AGLINVANALRNEVVATFKNTDSKGLVNSYGSISLKEIKGDKKYFTIKLHNTSNRPLTFKVSASAITTDSLTDRLKL
DETYKDEKSPDGKQIVPEIHPEKVKGANITFEHDTFTIGANSSFDLNAVINVGEAKNKNKFVESFIHFESVEEMEAL
NSNGKKINFQPSLSMPLMGFAGNWNHEPILDKWAWEEGSRSKTLGGYDDDGKPKIPGTLNKGIGGEHGIDKFNPAGV
IQNRKDKNTTSLDQNPELFAFNNEGINAPSSSGSKIANIYPLDSNGNPQDAQLERGLTPSPLVLRSAEEGLISIVNT
NKEGENQRDLKVISREHFIRGILNSKSNDAKGIKSSKLKVWGDLKWDGLIYNPRGREENAPESKDNQDPATKIRGQF
EPIAEGQYFYKFKYRLTKDYPWQVSYIPVKIDNTAPKIVSVDFSNPEKIKLITKDTYHKVKDQYKNETLFARDQKEH
PEKFDEIANEVWYAGAALVNEDGEVEKNLEVTYAGEGQGRNRKLDKDGNTIYEIKGAGDLRGKIIEVIALDGSSNFT
KIHRIKFANQADEKGMISYYLVDPDQDSSKYQ
SEQ ID NO：12
SP0641
＞gi|14972117|gb|AAK74791.1|丝氨酸蛋白酶，枯草杆菌酶家族[肺炎链球菌TIGR4]
MKKSTVLSLTTAAVILAAYAPNEVVLADTSSSEDALNISDKEKVAENKEKHENIHSAMETSQDFKEKKTAVIKEKEV
VSKNPVIDNNTSNEEAKIKEENSNKSQGDYTDSFVNKNTENPKKEDKVVYIAEFKDKESGEKAIKELSSLKNTKVLY
TYDRIFNGSAIETTPDNLDKIKQIEGISSVERAQKVQPMMNHARKEIGVEEAIDYLKSINAPFGKNFDGRGMVISNI
DTGTDYRHKAMRIDDDAKASMRFKKEDLKGTDKNYWLSDKIPHAFNYYNGGKITVEKYDDGRDYFDPHGMHIAGILA
GNDTEQDIKNFNGIDGIAPNAQIFSYKMYSDAGSGFAGDETMFHAIEDSIKHNVDVVSVSSGFTGTGLVGEKYWQAI
RALRKAGIPMVVATGNYATSASSSSWDLVANNHLKMTDTGNVTRTAAHEDAIAVASAKNQTVEFDKVNIGGESFKYR
NIGAFFDKSKITTNEDGTKAPSKLKFVYIGKGQDQDLIGLDLRGKIAVMDRIYTKDLKNAFKKAMDKGARAIMVVNT
VNYYNRDNWTELPAMGYEADEGTKSQVFSISGDDGVKLWNMINPDKKTEVKRNNKEDFKDKLEQYYPIDMESFNSNK
PNVGDEKEIDFKFAPDTDKELYKEDIIVPAGSTSWGPRIDLLLKPDVSAPGKNIKSTLNVINGKSTYGYMSGTSMAT
PIVAASTVLIRPKLKEMLERPVLKNLKGDDKIDLTSLTKIALQNTARPMMDATSWKEKSQYFASPRQQGAGLINVAN
ALRNEVVATFKNTDSKGLVNSYGSISLKEIKGDKKYFTIKLHNTSNRPLTFKVSASAITTDSLTDRLKLDETYKDEK
SPDGKQIVPEIHPEKVKGANITFEHDTFTIGANSSFDLNAVINVGEAKNKNKFVESFIHFESVEEMEALNSNGKKIN
FQPSLSMPLMGFAGNWNHEPILDKWAWEEGSRSKTLGGYDDDGKPKIPGTLNKGIGGEHGIDKFNPAGVIQNRKDKN
TTSLDQNPELFAFNNEGINAPSSSGSKIANIYPLDSNGNPQDAQLERGLTPSPLVLRSAEEGLISIVNTNKEGENQR
DLKVISREHFIRGILNSKSNDAKGIKSSKLKVWGDLKWDGLIYNPRGREENAPESKDNQDPATKIRGQFEPIAEGQY
FYKFKYRLTKDYPWQVSYIPVKIDNTAPKIVSVDFSNPEKIKLITKDTYHKVKDQYKNETLFARDQKEHPEKFDEIA
NEVWYAGAALVNEDGEVEKNLEVTYAGEGQGRNRKLDKDGNTIYEIKGAGDLRGKIIEVIALDGSSNFTKIHRIKFA
NQADEKGMISYYLVDPDQDSSKYQKLGEIAESKFKNLGNGKEGSLKKDTTGVEHHHQENEESIKEKSSFTIDRNIST
IRDFENKDLKKLIKKKFREVDDFTSETGKRMEEYDYKYDDKGNIIAYDDGTDLEYETEKLDEIKSKIYGVLSPSKDG
HFEILGKISNVSKNAKVYYGNNYKSIEIKATKYDFHSKTMTFDLYANINDIVDGLAFAGDMRLFVKDNDQKKAEIKI
RMPEKIKETKSEYPYVSSYGNVIELGEGDLSKNKPDNLTKMESGKIYSDSEKQQYLLKDNIILRKGYALKVTTYNPG
KTDMLEGNGVYSKEDIAKIQKANPNLRALSETTIYADSRNVEDGRSTQSVLMSALDGFNIIRYQVFTFKMNDKGEAI
DKDGNLVTDSSKLVLFGKDDKEYTGEDKFNVEAIKEDGSMLFIDTKPVNLSMDKNYFNPSKSNKIYVRNPEFYLRGK
ISDKGGFNWELRVNESVVDNYLIYGDLHIDNTRDFNIKLNVKDGDIMDWGMKDYKANGFPDKVTDMDGNVYLQTGYS
DLNAKAVGVHYQFLYDNVKPEVNIDPKGNTSIEYADGKSVVFNINDKRNNGFDGEIQEQHIYINGKEYTSFNDIKQI
IDKTLNIKIVVKDFARNTTVKEFILNKDTGEVSELKPHRVTVTIQNGKEMSSTIVSEEDFILPVYKGELEKGYQFDG
WEISGFEGKKDAGYVINLSKDTFIKPVFKKIEEKKEEENKPTFDVSKKKDNPQVNHSQLNESHRKEDLQREEHSQKS
DSTKDVTATVLDKNNISSKSTTNNPNKLPKTGTASGAQTLLAAGIMFIVGIFLGLKKKNQD
SEQ ID NO：13
SP0641N
MVVLADTSSSEDALNISDKEKVAENKEKHENIHSAMETSQDFKEKKTAVIKEKEVVSKNPVIDNNTSNEEAKIKEEN
SNKSQGDYTDSFVNKNTENPKKEDKVVYIAEFKDKESGEKAIKELSSLKNTKVLYTYDRIFNGSAIETTPDNLDKIK
QIEGISSVERAQKVQPMMNHARKEIGVEEAIDYLKSINAPFGKNFDGRGMVISNIDTGTDYRHKAMRIDDDAKASMR
FKKEDLKGTDKNYWLSDKIPHAFNYYNGGKITVEKYDDGRDYFDPHGMHIAGILAGNDTEQDIKNFNGIDGIAPNAQ
IFSYKMYSDAGSGFAGDETMFHAIEDSIKHNVDVVSVSSGFTGTGLVGEKYWQAIRALRKAGIPMVVATGNYATSAS
SSSWDLVANNHLKMTDTGNVTRTAAHEDAIAVASAKNQTVEFDKVNIGGESFKYRNIGAFFDKSKITTNEDGTKAPS
KLKFVYIGKGQDQDLIGLDLRGKIAVMDRIYTKDLKNAFKKAMDKGARAIMVVNTVNYYNRDNWTELPAMGYEADEG
TKSQVFSISGDDGVKLWNMINPDKKTEVKRNNKEDFKDKLEQYYPIDMESFNSNKPNVGDEKEIDFKFAPDTDKELY
KEDIIVPAGSTSWGPRIDLLLKPDVSAPGKNIKSTLNVINGKSTYG
SEQ ID NO：14
SP0882共有序列
MNQSYFYLKMKEHKLKVPYTGKERRVRILLPKDYEKDTDRSYPVVYFHDGQNVFNSKESF
I Y
IGHSWKIIPAIKRNPDISRMIVVAIDNDGMGRMNEYAAWKFQESPIPGQQFGGKGVEYAE
Y H E E
FVMEVVKPFIDETYRTKADCQHTAMIGSSLGGNITQFIGLEYQDQIGCLGVFSSANWLHQ
EK
EAFNRYFECQKLSPDQRIFIYVGTEEADDTDKTLMDGNIKQAYIDSSLCYYHDLIAGGVH
I H R
LDNLVLKVQSGAIHSEIPWSENLPDCLRFFAEKW
SEQ ID NO：15
SP0882N共有序列
MNQSYFYLKMKEHKLKVPYTGKERRVRILLPKDYEKDTDRSYPVVYFHDGQNVFNSKESF
I Y
IGHSWKIIPAIKRNPDISRMIVVAIDNDGMGRMNEYAAWKFQESPIPGQQFGGKGVEYAE
Y H E E
FVMEVVKPFI
SEQ ID NO：16
具有外源信号序列的SP0882共有序列
MSSKFMKSAAVLGTATLASLLLVACMNQSYFYLKMKEHKLKVPYTGKERRVRILLPKDYE
T T V I
KDTDRSYPVVYFHDGQNVFNSKESFIGHSWKIIPAIKRNPDISRMIVVAIDNDGMGRMNE
Y Y H
YAAWKFQESPIPGQQFGGKGVEYAEFVMEVVKPFIDETYRTKADCQHTAMIGSSLGGNIT
E E
QFIGLEYQDQIGCLGVFSSANWLHQEAFNRYFECQKLSPDQRIFIYVGTEEADDTDKTLM
EK I H
DGNIKQAYIDSSLCYYHDLIAGGVHLDNLVLKVQSGAIHSEIPWSENLPDCLRFFAEKW
R
SEQ ID NO：17
具有外源信号序列的SP0882N共有序列
MSSKFMKSAAVLGTATLASLLLVACMNQSYFYLKMKEHKLKVPYTGKERRVRILLPKDYE
T T V I
KDTDRSYPVVYFHDGQNVFNSKESFIGHSWKIIPAIKRNPDISRMIVVAIDNDGMGRMNE
Y Y H
YAAWKFQESPIPGQQFGGKGVEYAEFVMEVVKPFI
E E
SEQ ID NO：18
缺乏信号序列的SP0148共有序列
MCSGGAKKEGEAASKKEIIVATNGSPKPFIYEENGELTGYEIEVVRAIFKDSDKYDVKFE
Q S R N N X
KTEWSGVFAGLDADRYNMAVNNLSYTKERAEKYLYAAPIAQNPNVLVVKKDDSSIKSLDD
I E
IGGKSTEVVQATTSAKQLEAYNAEHTDNPTILNYTKADLQQIMVRLSDGQFDYKIFDKIG
F
VETVIKNQGLDNLKVIELPSDQQPYVYPLLAQGQDELKSFVDKRIKELYKDGTLEKLSKQ
Y S
FFGDTYLPAEADIK(E)
SEQ ID NO：19
包含信号序列的SP0148共有序列
MKKIVKYSSLAALALVAAGVLAACSGGAKKEGEAASKKEIIVATNGSPKPFIYEENGELT
G L Q S R N
GYE IEVVRAIFKDSDKYDVKFEKTEWSGVFAGLDADRYNMAVNNLSYTKERAEKYLYAAP
N X I
IAQNPNVLVVKKDDSSIKSLDDIGGKSTEVVQATTSAKQLEAYNAEHTDNPTILNYTKAD
E
LQQIMVRLSDGQFDYKIFDKIGVETVIKNQGLDNLKVIELPSDQQPYVYPLLAQGQDELK
F Y S
SFVDKRIKELYKDGTLEKLSKQFFGDTYLPAEADIK(E)
SEQ ID NO：20
缺乏信号序列的SP2108共有序列
MCGSKTADKPADSGSSEVKELTVYVDEGYKSYIEEVAKAYEKEAGVKVTLKTGDALGGLD
A I
KLSLDNQSGNVPDVMMAPYDRVGSLGSDGQLSEVKLSDGAKTDDTTKSLVTAANGKVYGA
I X T
PAVIESLVMYYNKDLVKDAPKTFADLENLAKDSKYAFAGEDGKTTAFLADWTNFYYTYGL
A
LAGNGAYVFGQNGKDAKDIGLANDGSIVGINYAKSWYEKWPKGMQDTEGAGNLIQTQFQE
G P A X H
GKTAAIIDGPWKAQAFKDAKVNYGVATIPTLPNGKEYAAFGGGKAWVIPQAVKNLEASQK
A
FVDFLVATEQQKVLYDKTNEIPANTEARSYAEGKNDELTTAVIKQFKNTQPLPNISQMSA
S A S
VWDPAKNMLFDAVSGQKDAKTAANDAVTLIKETIKQKFGE
SEQ ID NO：21
包含信号序列的SP2108共有序列
MSSKFMKSAAVLGTATLASLLLVACGSKTADKPADSGSSEVKELTVYVDEGYKSYIEEVA
T T V A
KAYEKEAGVKVTLKTGDALGGLDKLSLDNQSGNVPDVMMAPYDRVGSLGSDGQLSEVKLS
I I X
DGAKTDDTTKSLVTAANGKVYGAPAVIESLVMYYNKDLVKDAPKTFADLENLAKDSKYAF
T
AGEDGKTTAFLADWTNFYYTYGLLAGNGAYVFGQNGKDAKDIGLANDGSIVGINYAKSWY
A G P A X
EKWPKGMQDTEGAGNLIQTQFQEGKTAAIIDGPWKAQAFKDAKVNYGVATIPTLPNGKEY
H
AAFGGGKAWVIPQAVKNLEASQKFVDFLVATEQQKVLYDKTNEIPANTEARSYAEGKNDE
A S A
LTTAVIKQFKNTQPLPNISQMSAVWDPAKNMLFDAVSGQKDAKTAANDAVTLIKETIKQK
S
FGE
SEQ ID NO：22
SP1634
＞gi|14973124|gb|AAK75714.1|假定蛋白SP_1634肺炎链球菌TIGR4
DANIFDYLKDVAYDSYYDLPLNELDILTLIEITYLSFDNLVSTLPQRLLDLAPQVPRDPTMLTSKNRLQLLDELAQH
KRFKNCKLSHFINDIDPELQKQFAAMTYRVSLDTYLIVFRGTDDSIIGWKEDFHLTYMKEIPAQKHALRYLKNFFAH
HPKQKVILAGHSKGGNLAIYAASQIEQSLQNQITAVYTFDAPGLHQELTQTAGYQRIMDRSKIFIPQGSIIGMMLEI
PAHQIIVQSTALGGIAQHDTFSWQIEDKHFVQLDKTNSDSQQVDTTFKEWVATVPDEELQLYFDLFFGTILDAGISS
INDLASLKALEYIHHLFVQAQSLTPEERETLGRLTQLLIDTRYQAWKNR
SEQ ID NO：23
SP0314
＞gi|14971788|gb|AAK74491.1|透明质酸酶肺炎链球菌
TIGRAMQTKTKKLIVSLSSLVLSGFLLNHYMTIGAEETTTNTIQQSQKEVQYQQRDTKNLVENGDFGQTEDGSSPWT
GSKAQGWSAWVDQKNSADASTRVIEAKDGAITISSHEKLRAALHRMVPIEAKKKYKLRFKIKTDNKIGIAKVRIIEE
SGKDKRLWNSATTSGTKDWQTIEADYSPTLDVDKIKLELFYETGTGTVSFKDIELVEVADQLSEDSQTDKQLEEKID
LPIGKKHVFSLADYTYKVENPDVASVKNGILEPLKEGTTNVIVSKDGKEVKKIPLKILASVKDAYTDRLDDWNGIIA
GNQYYDSKNEQMAKLNQELEGKVADSLSSISSQADRTYLWEKFSNYKTSANLTATYRKLEEMAKQVTNPSSRYYQDE
TVVRTVRDSMEWMHKHVYNSEKSIVGNWWDYEIGTPRAINNTLSLMKEYFSDEEIKKYTDVIEKFVPDPEHFRKTTD
NPFKALGGNLVDMGRVKVIAGLLRKDDQEISSTIRSIEQVFKLVDQGEGFYQDGSYIDHTNVAYTGAYGNVLIDGLS
QLLPVIQKTKNPIDKDKMQTMYHWIDKSFAPLLVNGELMDMSRGRSISRANSEGHVAAVEVLRGIHRIADMSEGETK
QCLQSLVKTIVQSDSYYDVFKNLKTYKDISLMQSLLSDAGVASVPRPSYLSAFNKMDKTAMYNAEKGFGFGLSLFSS
RTLNYEHMNKENKRGWYTSDGMFYLYNGDLSHYSDGYWPTVNPYKMPGTTETDAKRADSDTGKVLPSAFVGTSKLDD
ANATATMDFTNWNQTLTAHKSWFMLKDKIAFLGSNIQNTSTDTAATTIDQRKLESGNPYKVYVNDKEASLTEQEKDY
PETQSVFLESFDSKKNIGYFFFKKSSISMSKALQKGAWKDINEGQSDKEVENEFLTISQAHKQNRDSYGYMLIPNVD
RATFNQMIKELESSLIENNETLQSVYDAKQGVWGIVKYDDSVSTISNQFQVLKRGVYTIRKEGDEYKIAYYNPETQE
SAPDQEVFKKLEQAAQPQVQNSKEKEKSEEEKNHSDQKNLPQTGEGQSILASLGFLLLGAFYLFRRGKNN
SEQ ID NO：24
SP0882N DNA
ATGAATCAATCCTACTTTTATCTAAAAATGAAAGAACACAAACTCAAGGTTCCTTATACAGGTAAGGAGCGCCGTGT
ACGTATTCTTCTTCCTAAAGATTATGAGAAAGATACAGACCGTTCCTATCCTGTTGTATACTTTCATGACGGGCAAA
ATGTTTTTAATAGCAAAGAGTCTTTCATTGGACATTCATGGAAGATTATCCCAGCTATCAAACGAAATCCGGATATC
AGTCGCATGATTGTCGTTGCTATTGACAATGATGGTATGGGGCGGATGAATGAGTATGCGGCTTGGAAGTTCCAAGA
ATCTCCTATCCCAGGGCAGCAGTTTGGTGGTAAGGGTGTGGAGTATGCTGAGTTTGTCATGGAGGTGGTCAAGCCTT
TTATC
SEQ ID NO：25
具有外源信号序列的SP0882(核苷酸)
ATGTCATCTAAATTTATGAAGAGCGCTGCGGTGCTTGGAACTGCTACACTTGCTAGCTTGCTTTTGGTAGCTTGCAT
GAATCAATCCTACTTTTATCTAAAAATGAAAGAACACAAACTCAAGGTTCCTTATACAGGTAAGGAGCGCCGTGTAC
GTATTCTTCTTCCTAAAGATTATGAGAAAGATACAGACCGTTCCTATCCTGTTGTATACTTTCATGACGGGCAAAAT
GTTTTTAATAGCAAAGAGTCTTTCATTGGACATTCATGGAAGATTATCCCAGCTATCAAACGAAATCCGGATATCAG
TCGCATGATTGTCGTTGCTATTGACAATGATGGTATGGGGCGGATGAATGAGTATGCGGCTTGGAAGTTCCAAGAAT
CTCCTATCCCAGGGCAGCAGTTTGGTGGTAAGGGTGTGGAGTATGCTGAGTTTGTCATGGAGGTGGTCAAGCCTTTT
ATCGATGAGACCTATCGTACAAAAGCAGACTGCCAGCATACGGCTATGATTGGTTCCTCACTAGGAGGCAATATTAC
CCAGTTTATCGGTTTGGAATACCAAGACCAAATTGGTTGCTTGGGCGTTTTTTCATCTGCAAACTGGCTCCACCAAG
AAGCCTTTAACCGCTATTTCGAGTGCCAGAAACTATCGCCTGACCAGCGCATCTTCATCTATGTAGGAACAGAAGAA
GCAGATGATACAGACAAGACCTTGATGGATGGCAATATCAAACAAGCCTATATCGACTCGTCGCTTTGCTATTACCA
TGATTTGATAGCAGGGGGAGTACATCTGGATAATCTTGTGCTAAAAGTTCAGTCTGGTGCCATCCATAGTGAAATCC
CTTGGTCAGAAAATCTACCAGATTGTCTGAGATTTTTTGCAGAAAAATGGTAA
SEQ ID NO：26
具有外源信号序列的SP0882N(核苷酸)
ATGTCATCTAAATTTATGAAGAGCGCTGCGGTGCTTGGAACTGCTACACTTGCTAGCTTGCTTTTGGTAGCTTGCAT
GAATCAATCCTACTTTTATCTAAAAATGAAAGAACACAAACTCAAGGTTCCTTATACAGGTAAGGAGCGCCGTGTAC
GTATTCTTCTTCCTAAAGATTATGAGAAAGATACAGACCGTTCCTATCCTGTTGTATACTTTCATGACGGGCAAAAT
GTTTTTAATAGCAAAGAGTCTTTCATTGGACATTCATGGAAGATTATCCCAGCTATCAAACGAAATCCGGATATCAG
TCGCATGATTGTCGTTGCTATTGACAATGATGGTATGGGGCGGATGAATGAGTATGCGGCTTGGAAGTTCCAAGAAT
CTCCTATCCCAGGGCAGCAGTTTGGTGGTAAGGGTGTGGAGTATGCTGAGTTTGTCATGGAGGTGGTCAAGCCTTTT
ATC
SEQ ID NO：27
缺乏信号序列的SP0148(核苷酸)
ATGTGCTCAGGGGGTGCTAAGAAAGAAGGAGAAGCAGCTAGCAAGAAAGAAATCATCGTTGCAACCAATGGATCACC
AAAGCCATTTATCTATGAAGAAAATGGCGAATTGACTGGTTACGAGATTGAAGTCGTTCGCGCTATCTTTAAAGATT
CTGACAAATATGATGTCAAGTTTGAAAAGACAGAATGGTCAGGTGTCTTTGCTGGTCTTGACGCTGATCGTTACAAT
ATGGCTGTCAACAATCTTAGCTACACTAAAGAACGTGCGGAGAAATACCTCTATGCCGCACCAATTGCCCAAAATCC
TAATGTCCTTGTCGTGAAGAAAGATGACTCTAGTATCAAGTCTCTCGATGATATCGGTGGAAAATCGACGGAAGTCG
TTCAAGCCACTACATCAGCTAAGCAGTTAGAAGCATACAATGCTGAACACACGGACAACCCAACTATCCTTAACTAT
ACTAAGGCAGACTTCCAACAAATCATGGTACGTTTGAGCGATGGACAATTTGACTATAAGATTTTTGATAAAATCGG
TGTTGAAACAGTGATCAAGAACCAAGGTTTGGACAACTTGAAAGTTATCGAACTTCCAAGCGACCAACAACCGTACG
TTTACCCACTTCTTGCTCAGGGTCAAGATGAGTTGAAATCGTTTGTAGACAAACGCATCAAAGAACTTTATAAAGAT
GGAACTCTTGAAAAATTGTCTAAACAATTCTTCGGAGACACTTATCTACCGGCAGAAGCTGATATTAAAGAGTAA
SEQ ID NO：28
包含信号序列的SP0148(核苷酸)
ATGAAAAAAATCGTTAAATACTCATCTCTTGCAGCCCTTGCTCTTGTTGCTGCAGGTGTGCTTGCGGCTTGCTCAGG
GGGTGCTAAGAAAGAAGGAGAAGCAGCTAGCAAGAAAGAAATCATCGTTGCAACCAATGGATCACCAAAGCCATTTA
TCTATGAAGAAAATGGCGAATTGACTGGTTACGAGATTGAAGTCGTTCGCGCTATCTTTAAAGATTCTGACAAATAT
GATGTCAAGTTTGAAAAGACAGAATGGTCAGGTGTCTTTGCTGGTCTTGACGCTGATCGTTACAATATGGCTGTCAA
CAATCTTAGCTACACTAAAGAACGTGCGGAGAAATACCTCTATGCCGCACCAATTGCCCAAAATCCTAATGTCCTTG
TCGTGAAGAAAGATGACTCTAGTATCAAGTCTCTCGATGATATCGGTGGAAAATCGACGGAAGTCGTTCAAGCCACT
ACATCAGCTAAGCAGTTAGAAGCATACAATGCTGAACACACGGACAACCCAACTATCCTTAACTATACTAAGGCAGA
CTTCCAACAAATCATGGTACGTTTGAGCGATGGACAATTTGACTATAAGATTTTTGATAAAATCGGTGTTGAAACAG
TGATCAAGAACCAAGGTTTGGACAACTTGAAAGTTATCGAACTTCCAAGCGACCAACAACCGTACGTTTACCCACTT
CTTGCTCAGGGTCAAGATGAGTTGAAATCGTTTGTAGACAAACGCATCAAAGAACTTTATAAAGATGGAACTCTTGA
AAAATTGTCTAAACAATTCTTCGGAGACACTTATCTACCGGCAGAAGCTGATATTAAAGAGTAA
SEQ ID NO：29
缺乏信号序列的SP2108(核苷酸)
ATGTGCGGAAGCAAAACTGCTGATAAGCCTGCTGATTCTGGTTCATCTGAAGTCAAAGAACTCACTGTATATGTAGA
CGAGGGATATAAGAGCTATATTGAAGAGGTTGCTAAAGCTTATGAAAAAGAAGCTGGAGTAAAAGTCACTCTTAAAA
CTGGTGATGCTCTAGGAGGTCTTGATAAACTTTCTCTTGACAACCAATCTGGTAATGTCCCTGATGTTATGATGGCT
CCATACGACCGTGTAGGTAGCCTTGGTTCTGACGGACAACTTTCAGAAGTGAAATTGAGCGATGGTGCTAAAACAGA
CGACACAACTAAATCTCTTGTAACAGCTGCTAATGGTAAAGTTTACGGTGCTCCTGCCGTTATCGAGTCACTTGTTA
TGTACTACAACAAAGACTTGGTGAAAGATGCTCCAAAAACATTTGCTGACTTGGAAAACCTTGCTAAAGATAGCAAA
TACGCATTCGCTGGTGAAGATGGTAAAACTACTGCCTTCCTAGCTGACTGGACAAACTTCTACTATACATATGGACT
TCTTGCCGGTAACGGTGCTTACGTCTTTGGCCAAAACGGTAAAGACGCTAAAGACATCGGTCTTGCAAACGACGGTT
CTATCGTAGGTATCAACTACGCTAAATCTTGGTACGAAAAATGGCCTAAAGGTATGCAAGATACAGAAGGTGCTGGA
AACTTAATCCAAACTCAATTCCAAGAAGGTAAAACAGCTGCTATCATCGACGGACCTTGGAAAGCTCAAGCCTTTAA
AGATGCTAAAGTAAACTACGGAGTTGCAACTATCCCAACTCTTCCAAATGGAAAAGAATATGCTGCATTCGGTGGTG
GTAAAGCTTGGGTCATTCCTCAAGCCGTTAAGAACCTTGAAGCTTCTCAAAAATTTGTAGACTTCCTTGTTGCAACT
GAACAACAAAAAGTATTATATGATAAGACTAACGAAATCCCAGCTAATACTGAGGCTCGTTCATACGCTGAAGGTAA
AAACGATGAGTTGACAACAGCTGTTATCAAACAGTTCAAGAACACTCAACCACTGCCAAACATCTCTCAAATGTCTG
CAGTTTGGGATCCAGCGAAAAATATGCTCTTTGATGCTGTAAGTGGTCAAAAAGATGCTAAAACAGCTGCTAACGAT
GCTGTAACATTGATCAAAGAAACAATCAAACAAAAATTTGGTGAATAA
SEQ ID NO：30
SP0641M(核苷酸)
ATGTCAGGAACTAGTATGGCGACTCCAATCGTGGCAGCTTCTACTGTTTTGATTAGACCGAAATTAAAGGAAATGCT
TGAAAGACCTGTATTGAAAAATCTTAAGGGAGATGACAAAATAGATCTTACAAGTCTTACAAAAATTGCCCTACAAA
ATACTGCGCGACCTATGATGGATGCAACTTCTTGGAAAGAAAAAAGTCAATACTTTGCATCACCTAGACAACAGGGA
GCAGGCCTAATTAATGTGGCCAATGCTTTGAGAAATGAAGTTGTAGCAACTTTCAAAAACACTGATTCTAAAGGTTT
GGTAAACTCATATGGTTCCATTTCTCTTAAAGAAATAAAAGGTGATAAAAAATACTTTACAATCAAGCTTCACAATA
CATCAAACAGACCTTTGACTTTTAAAGTTTCAGCATCAGCGATAACTACAGATTCTCTAACTGACAGATTAAAACTT
GATGAAACATATAAAGATGAAAAATCTCCAGATGGTAAGCAAATTGTTCCAGAAATTCACCCAGAAAAAGTCAAAGG
AGCAAATATCACATTTGAGCATGATACTTTCACTATAGGCGCAAATTCTAGCTTTGATTTGAATGCGGTTATAAATG
TTGGAGAGGCCAAAAACAAAAATAAATTTGTAGAATCATTTATTCATTTTGAGTCAGTGGAAGAAATGGAAGCTCTA
AACTCCAACGGGAAGAAAATAAACTTCCAACCTTCTTTGTCGATGCCTCTAATGGGATTTGCTGGGAATTGGAACCA
CGAACCAATCCTTGATAAATGGGCTTGGGAAGAAGGGTCAAGATCAAAAACACTGGGAGGTTATGATGATGATGGTA
AACCGAAAATTCCAGGAACCTTAAATAAGGGAATTGGTGGAGAACATGGTATAGATAAATTTAATCCAGCAGGAGTT
ATACAAAATAGAAAAGATAAAAATACAACATCCCTGGATCAAAATCCAGAATTATTTGCTTTCAATAACGAAGGGAT
CAACGCTCCATCATCAAGTGGTTCTAAGATTGCTAACATTTATCCTTTAGATTCAAATGGAAATCCTCAAGATGCTC
AACTTGAAAGAGGATTAACACCTTCTCCACTTGTATTAAGAAGTGCAGAAGAAGGATTGATTTCAATAGTAAATACA
AATAAAGAGGGAGAAAATCAAAGAGACTTAAAAGTCATTTCGAGAGAACACTTTATTAGAGGAATTTTAAATTCTAA
AAGCAATGATGCAAAGGGAATCAAATCATCTAAACTAAAAGTTTGGGGTGACTTGAAGTGGGATGGACTCATCTATA
ATCCTAGAGGTAGAGAAGAAAATGCACCAGAAAGTAAGGATAATCAAGATCCTGCTACTAAGATAAGAGGTCAATTT
GAACCGATTGCGGAAGGTCAATATTTCTATAAATTTAAATATAGATTAACTAAAGATTACCCATGGCAGGTTTCCTA
TATTCCTGTAAAAATTGATAACACCGCCCCTAAGATTGTTTCGGTTGATTTTTCAAATCCTGAAAAAATTAAGTTGA
TTACAAAGGATACTTATCATAAGGTAAAAGATCAGTATAAGAATGAAACGCTATTTGCGAGAGATCAAAAAGAACAT
CCTGAAAAATTTGACGAGATTGCGAACGAAGTTTGGTATGCTGGCGCCGCTCTTGTTAATGAAGATGGAGAGGTTGA
AAAAAATCTTGAAGTAACTTACGCAGGTGAGGGTCAAGGAAGAAATAGAAAACTTGATAAAGACGGAAATACCATTT
ATGAAATTAAAGGTGCGGGAGATTTAAGGGGAAAAATCATTGAAGTCATTGCATTAGATGGTTCTAGCAATTTCACA
AAGATTCATAGAATTAAATTTGCTAATCAGGCTGATGAAAAGGGGATGATTTCCTATTATCTAGTAGATCCTGATCA
AGATTCATCTAAATATCAA
SEQ ID NO：31
SP0641N(核苷酸)
ATGGTAGTCTTAGCAGACACATCTAGCTCTGAAGATGCTTTAAACATCTCTGATAAAGAAAAAGTAGCAGAAAATAA
AGAGAAACATGAAAATATCCATAGTGCTATGGAAACTTCACAGGATTTTAAAGAGAAGAAAACAGCAGTCATTAAGG
AAAAAGAAGTTGTTAGTAAAAATCCTGTGATAGACAATAACACTAGCAATGAAGAAGCAAAAATCAAAGAAGAAAAT
TCCAATAAATCCCAAGGAGATTATACGGACTCATTTGTGAATAAAAACACAGAAAATCCCAAAAAAGAAGATAAAGT
TGTCTATATTGCTGAATTTAAAGATAAAGAATCTGGAGAAAAAGCAATCAAGGAACTATCCAGTCTTAAGAATACAA
AAGTTTTATATACTTATGATAGAATTTTTAACGGTAGTGCCATAGAAACAACTCCAGATAACTTGGACAAAATTAAA
CAAATAGAAGGTATTTCATCGGTTGAAAGGGCACAAAAAGTCCAACCCATGATGAATCATGCCAGAAAGGAAATTGG
AGTTGAGGAAGCTATTGATTACCTAAAGTCTATCAATGCTCCGTTTGGGAAAAATTTTGATGGTAGAGGTATGGTCA
TTTCAAATATCGATACTGGAACAGATTATAGACATAAGGCTATGAGAATCGATGATGATGCCAAAGCCTCAATGAGA
TTTAAAAAAGAAGACTTAAAAGGCACTGATAAAAATTATTGGTTGAGTGATAAAATCCCTCATGCGTTCAATTATTA
TAATGGTGGCAAAATCACTGTAGAAAAATATGATGATGGAAGGGATTATTTTGACCCACATGGGATGCATATTGCAG
GGATTCTTGCTGGAAATGATACTGAACAAGACATCAAAAACTTTAACGGCATAGATGGAATTGCACCTAATGCACAA
ATTTTCTCTTACAAAATGTATTCTGACGCAGGATCTGGGTTTGCGGGTGATGAAACAATGTTTCATGCTATTGAAGA
TTCTATCAAACACAACGTTGATGTTGTTTCGGTATCATCTGGTTTTACAGGAACAGGTCTTGTAGGTGAGAAATATT
GGCAAGCTATTCGGGCATTAAGAAAAGCAGGCATTCCAATGGTTGTCGCTACGGGTAACTATGCGACTTCTGCTTCA
AGTTCTTCATGGGATTTAGTAGCAAATAATCATCTGAAAATGACCGACACTGGAAATGTAACACGAACTGCAGCACA
TGAAGATGCGATAGCGGTCGCTTCTGCTAAAAATCAAACAGTTGAGTTTGATAAAGTTAACATAGGTGGAGAAAGTT
TTAAATACAGAAATATAGGGGCCTTTTTCGATAAGAGTAAAATCACAACAAATGAAGATGGAACAAAAGCTCCTAGT
AAATTAAAATTTGTATATATAGGCAAGGGGCAAGACCAAGATTTGATAGGTTTGGATCTTAGGGGCAAAATTGCAGT
AATGGATAGAATTTATACAAAGGATTTAAAAAATGCTTTTAAAAAAGCTATGGATAAGGGTGCACGCGCCATTATGG
TTGTAAATACTGTAAATTACTACAATAGAGATAATTGGACAGAGCTTCCAGCTATGGGATATGAAGCGGATGAAGGT
ACTAAAAGTCAAGTGTTTTCAATTTCAGGAGATGATGGTGTAAAGCTATGGAACATGATTAATCCTGATAAAAAAAC
TGAAGTCAAAAGAAATAATAAAGAAGATTTTAAAGATAAATTGGAGCAATACTATCCAATTGATATGGAAAGTTTTA
ATTCCAACAAACCGAATGTAGGTGACGAAAAAGAGATTGACTTTAAGTTTGCACCTGACACAGACAAAGAACTCTAT
AAAGAAGATATCATCGTTCCAGCAGGATCTACATCTTGGGGGCCAAGAATAGATTTACTTTTAAAACCCGATGTTTC
AGCACCTGGTAAAAATATTAAATCCACGCTTAATGTTATTAATGGCAAATCAACTTATGGC
SEQ ID NO：32
HHHHHH
SEQ ID NO：33
MSYYHHHHHH
SEQ ID NO：265
SP1912
MNGMKAKKMWMAGLALLGIGSLALATKKVADDRKLMKTQEELTEIVRDHFSDMGEIATLYVQVYESSLESLVGGVIF
EDGRHYTFVYENEDLVYEEEVL
SEQ ID NO：266
SP1912L
MRYLATLLLSLAVLITAGCKKVADDRKLMKTQEELTEIVRDHFSDMGEIATLYVQVYESSLESLVGGVIFEDGRHYT
FVYENEDLVYEEEVL
SEQ ID NO：267
SP0641.1
DTSSSEDALNISDKEKVAENKEKHENIHSAMETSQDFKEKKTAVIKEKEVVSKNPVIDNNTSNEEAKIKEENSNKSQ
GDYTDSFVNKNTENPKKEDKVVYIAEFKDKESGEKAIKELSSLKNTKVLYTYDRIFNGSAIETTPDNLDKIKQIEGI
SSVERAQKVQPMMNHARKEIGVEEAIDYLKSINAPFGKNFDGRGMVISNIDTGTDYRHKAMRIDDDAKASMRFKKED
LKGTDKNYWLSDKIPHAFNYYNGGKITVEKYDDGRDYFDPHGMHIAGILAGNDTEQDIKNFNGIDGIAPNAQIFSYK
MYSDAGSGFAGDETMFHAIEDSIKHNVDVVSVSSGFTGTGLVGEKYWQAIRALRKAGIPMVVATGNYATSASSSSWD
LVANNHLKMTDTGNVTRTAAHEDAIAVASAKNQTVEFDKVNIGGESFKYRNIGAFFDKSKITTNEDGTKAPSKLKFV
YIGKGQDQDLIGLDLRGKIAVMDRIYTKDLKNAFKKAMDKGARAIMVVNTVNYYNRDNWTELPAMGYEADEGTKSQV
FSISGDDGVKLWNMINPDKKTEVKRNNKEDFKDKLEQYYPIDMESFNSNKPNVGDEKEIDFKFAPDTDKELYKEDII
VPAGSTSWGPRIDLLLKPDVSAPGKNIKSTLNVINGKSTYGYMSGTSMATPIVAASTVLIRPKLKEMLERPVLKNLK
GDDKIDLTSLTKIALQNTARPMMDATSWKEKSQYFASPRQQGAGLINVANALRNEVVATFKNTDSKGLVNSYGSISL
KEIKGDKKYFTIKLHNTSNRPLTFKVSASAITTDSLTDRLKLDETYKDEKSPDGKQIVPEIHPEKVKGANITFEHDT
FTIGANSSFDLNAVINVGEAKNKNKFVESFIHFESVEEMEALNSNGKKINFQPSLSMPLMGFAGNWNHEPILDKWAW
EEGSRSKTLGGYDDDGKPKIPGTLNKGIGGEHGIDKFNPAGVIQNRKDKNTTSL
SEQ ID NO：268
SP1912共有序列
MNGMKAKKMWMAGLALLGIGSLALATKKVADDRKLMKTQEELTEIVRDHFSDMGEIATLYVQVYESSLESLVGGVIF
H A L I L S
EDGRHYTFVYENEDLVYEEEVL
I
SEQ ID NO：269
SP641N共有序列
MVVLADTSSSEDALNISDKEKVA-----ENKEKHENIHSAMETSQDFKEKKTAVIKEKEVVSKNPVIDNNTSNEEAK
- N S VVDKET KD N I K TE TI EG A T TK R
L
IKEENSNKSQGDYTDSFVNKNTENPKKEDKVVYIAEFKDKESGEKAIKELSSLKNTKVLYTYDRIFNGSAIETTPDN
D- Q H Q S Q N G Q
NAH SA G RL G
LDKIKQIEGISSVERAQKVQPMMNHARKEIGVEEAIDYLKSINAPFGKNFDGRGMVISNIDTGTDYRHKAMRIDDDA
T I
KASMRFKKEDLKGTDKNYWLSDKIPHAFNYYNGGKITVEKYDDGRDYFDPHGMHIAGILAGNDTEQDIKNFNGIDGI
APNAQIFSYKMYSDAGSGFAGDETMFHAIEDSIKHNVDVVSVSSGFTGTGLVGEKYWQAIRALRKAGIPMVVATGNY
ATSASSSSWDLVANNHLKMTDTGNVTRTAAHEDAIAVASAKNQTVEFDKVNIGGESFKYRNIGAFFDKSKITTNEDG
Q N
TKAPSKLKFVYIGKGQDQDLIGLDLRGKIAVMDRIYTKDLKNAFKKAMDKGARAIMVVNTVNYYNRDNWTELPAMGY
EADEGTKSQVFSISGDDGVKLWNMINPDKKTEVKRNNKEDFKDKLEQYYPIDMESFNSNKPNVGDEKEIDFKFAPDT
N
DKELYKEDIIVPAGSTSWGPRIDLLLKPDVSAPGKNIKSTLNVINGKSTYG
SEQ ID NO：270
SP641M共有序列
MSGTSMATPIVAASTVLIRPKLKEMLERPVLKNLKGDDKIDLTSLTKIALQNTARPMMDATSWKEKSQYFASPRQQG
K T
AGLINVANALRNEVVATFKNTDSKGLVNSYGSISLKEIKGDKKYFTIKLHNTSNRPLTFKVSASAITTDSLTDRLKL
V
DETYKDEKSPDGKQIVPEIHPEKVKGANITFEHDTFTIGANSSFDLNAVINVGEAKNKNKFVESFIHFESVEEMEAL
Y R A
NSNGKKINFQPSLSMPLMGFAGNWNHEPILDKWAWEEGSRSKTLGGYDDDGKPKIPGTLNKGIGGEHGIDKFNPAGV
S TD K ME
IQNRKDKNTTSLDQNPELFAFNNEGINAPSSSGSKIANIYPLDSNGNPQDAQLERGLTPSPLVLRSAEEGLISIVNT
R D D Q VH E T
NKEGENQRDLKVISREHFIRGILNSKSNDAKGIKSSKLKVWGDLKWDGLIYNPRGREENAPESKDNQDPATKIRGQF
K V G
EPIAEGQYFYKFKYRLTKDYPWQVSYIPVKIDNTAPKIVSVDFSNPEKIKLITKDTYHKVKDQYKNETLFARDQKEH
PEKFDEIANEVWYAGAALVNEDGEVEKNLEVTYAGEGQGRNRKLDKDGNTIYEIKGAGDLRGKIIEVIALDGSSNFT
S A
KIHRIKFANQADEKGMISYYLVDPDQDSSKYQ
DH K A E
SEQ ID NO：271
SP1912(核苷酸)
ATGAATGGTATGAAAGCTAAAAAAATGTGGATGGCAGGCTTGGCTCTGCTAGGTATCGGAAGCCTTGCTCTTGCTAC
GAAAAAAGTTGCAGATGACCGTAAGCTCATGAAGACTCAGGAAGAGTTGACAGAGATTGTGCGAGACCATTTTTCCG
ACATGGGGGAAATTGCGACCCTTTATGTTCAAGTTTACGAAAGCAGTCTGGAGAGCTTGGTTGGTGGCGTCATTTTT
GAGGATGGCCGTCATTATACCTTTGTCTATGAAAATGAAGACCTAGTCTATGAGGAGGAAGTCTTATGA
SEQ ID NO：272
SP1912L(核苷酸)
ATGAGATACCTGGCAACATTGTTGTTATCTCTGGCGGTGTTAATCACCGCCGGGTGCAAAAAAGTTGCAGATGACCG
TAAGCTCATGAAGACTCAGGAAGAGTTGACAGAGATTGTGCGAGACCATTTTTCCGACATGGGGGAAATTGCGACCC
TTTATGTTCAAGTTTACGAAAGCAGTCTGGAGAGCTTGGTTGGTGGCGTCATTTTTGAGGATGGCCGTCATTATACC
TTTGTCTATGAAAATGAAGACCTAGTCTATGAGGAGGAAGTCTTATGA
SEQ ID NO：273
SP0641.1(核苷酸)
GACACATCTAGCTCTGAAGATGCTTTAAACATCTCTGATAAAGAAAAAGTAGCAGAAAATAAAGAGAAACATGAAAA
TATCCATAGTGCTATGGAAACTTCACAGGATTTTAAAGAGAAGAAAACAGCAGTCATTAAGGAAAAAGAAGTTGTTA
GTAAAAATCCTGTGATAGACAATAACACTAGCAATGAAGAAGCAAAAATCAAAGAAGAAAATTCCAATAAATCCCAA
GGAGATTATACGGACTCATTTGTGAATAAAAACACAGAAAATCCCAAAAAAGAAGATAAAGTTGTCTATATTGCTGA
ATTTAAAGATAAAGAATCTGGAGAAAAAGCAATCAAGGAACTATCCAGTCTTAAGAATACAAAAGTTTTATATACTT
ATGATAGAATTTTTAACGGTAGTGCCATAGAAACAACTCCAGATAACTTGGACAAAATTAAACAAATAGAAGGTATT
TCATCGGTTGAAAGGGCACAAAAAGTCCAACCCATGATGAATCATGCCAGAAAGGAAATTGGAGTTGAGGAAGCTAT
TGATTACCTAAAGTCTATCAATGCTCCGTTTGGGAAAAATTTTGATGGTAGAGGTATGGTCATTTCAAATATCGATA
CTGGAACAGATTATAGACATAAGGCTATGAGAATCGATGATGATGCCAAAGCCTCAATGAGATTTAAAAAAGAAGAC
TTAAAAGGCACTGATAAAAATTATTGGTTGAGTGATAAAATCCCTCATGCGTTCAATTATTATAATGGTGGCAAAAT
CACTGTAGAAAAATATGATGATGGAAGGGATTATTTTGACCCACATGGGATGCATATTGCAGGGATTCTTGCTGGAA
ATGATACTGAACAAGACATCAAAAACTTTAACGGCATAGATGGAATTGCACCTAATGCACAAATTTTCTCTTACAAA
ATGTATTCTGACGCAGGATCTGGGTTTGCGGGTGATGAAACAATGTTTCATGCTATTGAAGATTCTATCAAACACAA
CGTTGATGTTGTTTCGGTATCATCTGGTTTTACAGGAACAGGTCTTGTAGGTGAGAAATATTGGCAAGCTATTCGGG
CATTAAGAAAAGCAGGCATTCCAATGGTTGTCGCTACGGGTAACTATGCGACTTCTGCTTCAAGTTCTTCATGGGAT
TTAGTAGCAAATAATCATCTGAAAATGACCGACACTGGAAATGTAACACGAACTGCAGCACATGAAGATGCGATAGC
GGTCGCTTCTGCTAAAAATCAAACAGTTGAGTTTGATAAAGTTAACATAGGTGGAGAAAGTTTTAAATACAGAAATA
TAGGGGCCTTTTTCGATAAGAGTAAAATCACAACAAATGAAGATGGAACAAAAGCTCCTAGTAAATTAAAATTTGTA
TATATAGGCAAGGGGCAAGACCAAGATTTGATAGGTTTGGATCTTAGGGGCAAAATTGCAGTAATGGATAGAATTTA
TACAAAGGATTTAAAAAATGCTTTTAAAAAAGCTATGGATAAGGGTGCACGCGCCATTATGGTTGTAAATACTGTAA
ATTACTACAATAGAGATAATTGGACAGAGCTTCCAGCTATGGGATATGAAGCGGATGAAGGTACTAAAAGTCAAGTG
TTTTCAATTTCAGGAGATGATGGTGTAAAGCTATGGAACATGATTAATCCTGATAAAAAAACTGAAGTCAAAAGAAA
TAATAAAGAAGATTTTAAAGATAAATTGGAGCAATACTATCCAATTGATATGGAAAGTTTTAATTCCAACAAACCGA
ATGTAGGTGACGAAAAAGAGATTGACTTTAAGTTTGCACCTGACACAGACAAAGAACTCTATAAAGAAGATATCATC
GTTCCAGCAGGATCTACATCTTGGGGGCCAAGAATAGATTTACTTTTAAAACCCGATGTTTCAGCACCTGGTAAAAA
TATTAAATCCACGCTTAATGTTATTAATGGCAAATCAACTTATGGCTATATGTCAGGAACTAGTATGGCGACTCCAA
TCGTGGCAGCTTCTACTGTTTTGATTAGACCGAAATTAAAGGAAATGCTTGAAAGACCTGTATTGAAAAATCTTAAG
GGAGATGACAAAATAGATCTTACAAGTCTTACAAAAATTGCCCTACAAAATACTGCGCGACCTATGATGGATGCAAC
TTCTTGGAAAGAAAAAAGTCAATACTTTGCATCACCTAGACAACAGGGAGCAGGCCTAATTAATGTGGCCAATGCTT
TGAGAAATGAAGTTGTAGCAACTTTCAAAAACACTGATTCTAAAGGTTTGGTAAACTCATATGGTTCCATTTCTCTT
AAAGAAATAAAAGGTGATAAAAAATACTTTACAATCAAGCTTCACAATACATCAAACAGACCTTTGACTTTTAAAGT
TTCAGCATCAGCGATAACTACAGATTCTCTAACTGACAGATTAAAACTTGATGAAACATATAAAGATGAAAAATCTC
CAGATGGTAAGCAAATTGTTCCAGAAATTCACCCAGAAAAAGTCAAAGGAGCAAATATCACATTTGAGCATGATACT
TTCACTATAGGCGCAAATTCTAGCTTTGATTTGAATGCGGTTATAAATGTTGGAGAGGCCAAAAACAAAAATAAATT
TGTAGAATCATTTATTCATTTTGAGTCAGTGGAAGAAATGGAAGCTCTAAACTCCAACGGGAAGAAAATAAACTTCC
AACCTTCTTTGTCGATGCCTCTAATGGGATTTGCTGGGAATTGGAACCACGAACCAATCCTTGATAAATGGGCTTGG
GAAGAAGGGTCAAGATCAAAAACACTGGGAGGTTATGATGATGATGGTAAACCGAAAATTCCAGGAACCTTAAATAA
GGGAATTGGTGGAGAACATGGTATAGATAAATTTAATCCAGCAGGAGTTATACAAAATAGAAAAGATAAAAATACAA
CATCCCTG
SEQ ID NO：274
规范的脂盒基序
[LIVMFESTAGPC]-[LVIAMFTG]-[IVMSTAGCP]-[AGS]-C
SEQ ID NO：275
SP2108信号序列
MSSKFMKSAAVLGTATLASLLLVAC
SEQ ID NO：276
大肠杆菌RlpB信号序列
MRYLATLLLSLAVLITAG[C]
SEQ ID NO：301
包含卷曲螺旋结构的免疫原性PspA/PspC多肽(PR+NPB)
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVA
KLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSG
HMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADLKKAVNE
PEKPAEEPENPAPAPKPAPAPQPEKPAPAPAPKPEKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQ
QPPKAEKPAPAPVPKPEQPAPAPKTGWGQENGMWCRQACGRTRAPPPPPLRSGC
SEQ ID NO：302
包含卷曲螺旋结构的免疫原性PspA/PspC多肽(只有PR)
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVA
KLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSG
HMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADLKKAVNE
PETPAPAPAPAPAPAPTPEAPAPAPAPAPKPAPAPKPAPAPKPAPAPKPAPAPKPAPAPKP
APAPAPAPKPEKPAEKPAPAPKPETPKTGWKQENGMWCRQACGRTRAPPPPPLRSG
SEQ ID NO：303
缺乏卷曲螺旋结构的免疫原性PspA/PspC多肽(PR+NPB)
DLKKAVNEPEKPAEEPENPAPAPKPAPAPQPEKPAPAPAPKPEKSADQQAEEDYARR
SEEEYNRLTQQQPPKAEKPAPAPVPKPEQPAPAPKTGWGQENGMW
SEQ ID NO：304
缺乏卷曲螺旋结构的免疫原性PspA/PspC多肽(只有PR)
DLKKAVNEPETPAPAPAPAPAPAPTPEAPAPAPAPAPKPAPAPKPAPAPKPAPAPKPA
PAPKPAPAPKPAPAPAPAPKPEKPAEKPAPAPKPETPKTGWKQENGMW
SEQ ID NO：305
缺乏卷曲螺旋结构的免疫原性PspA/PspC多肽(PR+NPB)
MAKKAELEKTPEKPAEEPENPAPAPQPEKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQPPKA
SEQ ID NO：306
非脯氨酸区块(NPB)
EKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ
SEQ ID NO：307
非脯氨酸区块(NPB)
DQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ
SEQ ID NO：308
非脯氨酸区块(NPB)
MEKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ
SEQ ID NO：309
PR区的氨基末端边界
DLKKAVNE
SEQ ID NO：310
PR区的羧基末端边界
(K/G)TGW(K/G)QENGMW

Claims (47)

1.疫苗制剂，其包含药学上可接受的载体、第一多肽和第二多肽，所述第一多肽由SEQID NO：265、266或268的氨基酸序列组成，所述第二多肽由SEQ ID NO：6、7、18或19的氨基酸序列组成。
2.如权利要求1所述的疫苗制剂，进一步包含第三多肽，所述第三多肽由SEQ ID NO：9、10、20或21的氨基酸序列组成。
3.如权利要求1所述的疫苗制剂，其中所述第一多肽由SEQ ID NO：265的氨基酸序列组成。
4.如权利要求1所述的疫苗制剂，其中所述第一多肽由SEQ ID NO：266的氨基酸序列组成。
5.如权利要求1所述的疫苗制剂，其中所述第一多肽由SEQ ID NO：268的氨基酸序列组成。
6.如权利要求2所述的疫苗制剂，其中所述第三多肽由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成。
7.如权利要求1所述的疫苗制剂，其中所述第二多肽由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成。
8.如权利要求1所述的疫苗制剂，其中所述第二多肽由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成。
9.如权利要求1所述的疫苗制剂，不含其他肺炎链球菌多肽。
10.如权利要求1所述的疫苗制剂，其中所述第一和/或第二多肽被结合到免疫原性载体。
11.如权利要求1所述的疫苗制剂，包含至少一种脂化多肽。
12.疫苗制剂，其包含药学上可接受的载体、第一多肽、第二多肽和第三多肽，所述第一多肽由SEQ ID NO：265、266或268的氨基酸序列组成，所述第二多肽由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成，所述第三多肽由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成。
13.如权利要求12所述的疫苗制剂，其中所述第二多肽是脂化的。
14.疫苗制剂，其包含药学上可接受的载体、以及第一多肽、第二多肽和第三肽的混合物，所述第一多肽由SEQ ID NO：265、266或268的氨基酸序列组成，所述第二多肽由SEQ IDNO：6或7的氨基酸序列组成，所述第三多肽由SEQ ID NO：9或10的氨基酸序列组成。
15.疫苗制剂，其包含药学上可接受的载体、第一多肽、第二多肽和第三多肽，所述第一多肽由SEQ ID NO：265、266或268的氨基酸序列组成，所述第二多肽由SEQ ID NO：9或10的氨基酸序列组成，所述第三多肽由SEQ ID NO：6、7、18或19的氨基酸序列组成。
16.如权利要求15所述的疫苗制剂，其中所述第二多肽由SEQ ID NO：10的氨基酸组成，并且是脂化的。
17.如权利要求1所述的疫苗制剂，进一步包含佐剂。
18.如权利要求17所述的疫苗制剂，其中所述佐剂是toll样受体(TLR)激动剂。
19.如权利要求17所述的疫苗制剂，其中所述佐剂是明矾。
20.如权利要求17所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂包含1-1000μg的每种多肽和1-250μg的所述佐剂。
21.如权利要求1到20中任一项所述的疫苗制剂，其在接触TH17细胞之后诱导比通过对照无关抗原所诱导的TH17细胞应答大至少1.5倍的TH17细胞应答。
22.如权利要求1到20中任一项所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂在未感染的受试者中抑制被肺炎链球菌感染。
23.如权利要求1到20中任一项所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂抑制肺炎链球菌在个体中定植。
24.如权利要求1到20中任一项所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂在受试者中抑制一种或多种肺炎链球菌症状。
25.如权利要求1到20中任一项所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂在受试者中抑制肺炎链球菌诱导的败血症。
26.如权利要求1到20中任一项所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂降低肺炎链球菌在受试者中定植的持续时间。
27.如权利要求1到20中任一项所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂在受试者中引发针对肺炎链球菌的细胞介导的免疫应答。
28.如权利要求1到20中任一项所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂在受试者中引发针对肺炎链球菌的T细胞应答。
29.如权利要求1到20中任一项所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂在受试者中引发针对肺炎链球菌的CD4+T细胞应答。
30.如权利要求1到20中任一项所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂在受试者中引发针对肺炎链球菌的TH17细胞应答。
31.如权利要求1到20中任一项所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂在受试者中诱导IL-17水平升高。
32.如权利要求1到20中任一项所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂在受试者中引发针对肺炎链球菌的TH1细胞应答。
33.如权利要求1到20中任一项所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂在受试者中引发针对肺炎链球菌的CD8+T细胞应答。
34.如权利要求1到20中任一项所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂在受试者中引发针对肺炎链球菌的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。
35.如权利要求1到20中任一项所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂在受试者中引发针对肺炎链球菌的先天免疫应答。
36.如权利要求1到20中任一项所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂在受试者中抑制中耳炎的发展。
37.如权利要求1到20中任一项所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂在受试者中降低中耳炎的强度和/或严重程度。
38.根据权利要求1到20中任一项所述的疫苗制剂在制备用于治疗罹患或易受肺炎链球菌感染的受试者的药物中的用途，包括给予所述受试者有效量的所述药物。
39.如权利要求38所述的用途，其中所述药物在未感染的受试者中抑制被肺炎链球菌感染。
40.如权利要求38所述的用途，其中所述药物抑制肺炎链球菌在受试者中定植。
41.如权利要求38所述的用途，其中所述药物在所述受试者中抑制肺炎链球菌症状。
42.如权利要求38所述的用途，其中所述药物在所述受试者中抑制肺炎链球菌诱导的败血症。
43.如权利要求38所述的用途，其中所述药物在所述受试者中抑制中耳炎的发展。
44.如权利要求38所述的用途，其中所述药物在所述受试者中降低中耳炎的强度和/或严重程度。
45.如权利要求38所述的用途，其中所述药物的一个剂量治疗受试者。
46.如权利要求38所述的用途，其中所述药物在三个剂量之内治疗受试者。
47.如权利要求38所述的用途，其中所述受试者为人类。
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