RU2720614C9 - Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты) - Google Patents

Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты) Download PDF

Info

Publication number
RU2720614C9
RU2720614C9 RU2020114424A RU2020114424A RU2720614C9 RU 2720614 C9 RU2720614 C9 RU 2720614C9 RU 2020114424 A RU2020114424 A RU 2020114424A RU 2020114424 A RU2020114424 A RU 2020114424A RU 2720614 C9 RU2720614 C9 RU 2720614C9
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cov
leu
mouse
val
ser
Prior art date
Application number
RU2020114424A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2720614C1 (ru
Inventor
Ольга Вадимовна Зубкова
Татьяна Андреевна Ожаровская
Инна Вадимовна Должикова
Ольга Попова
Дмитрий Викторович Щебляков
Дарья Михайловна Гроусова
Алина Шахмировна Джаруллаева
Амир Ильдарович Тухватулин
Наталья Михайловна Тухватулина
Дмитрий Николаевич Щербинин
Ильяс Булатович Есмагамбетов
Елизавета Александровна Токарская
Андрей Геннадьевич Ботиков
Сергей Владимирович Борисевич
Борис Савельевич Народицкий
Денис Юрьевич Логунов
Александр Леонидович Гинцбург
Original Assignee
федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации filed Critical федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority to RU2020114424A priority Critical patent/RU2720614C9/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2720614C1 publication Critical patent/RU2720614C1/ru
Priority to EA202000368A priority patent/EA037903B1/ru
Priority to BR112022003154A priority patent/BR112022003154A2/pt
Priority to US17/427,745 priority patent/US20220305111A1/en
Priority to EP20834701.3A priority patent/EP4010017A4/en
Priority to MX2022002194A priority patent/MX2022002194A/es
Priority to PCT/RU2020/000344 priority patent/WO2021002776A1/en
Priority to CN202080068594.3A priority patent/CN115052624A/zh
Priority to CA3156350A priority patent/CA3156350A1/en
Priority to JP2022520116A priority patent/JP2023501879A/ja
Priority to KR1020227005787A priority patent/KR20230005102A/ko
Publication of RU2720614C9 publication Critical patent/RU2720614C9/ru
Priority to ARP210101104A priority patent/AR121931A1/es
Priority to IL290787A priority patent/IL290787A/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10061—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии, в частности к иммунобиологическому средству для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2. Также раскрыт способ индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, включающий введение в организм млекопитающих одного или более иммунобиологических средств для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2. Изобретение позволяет эффективно индуцировать иммунный ответ против вируса SARS-CoV-2. 7 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 ил., 12 табл., 15 пр.

Description

Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Предложенное средство может применяться для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.
Уровень техники
SARS-CoV-2 – новый штамм коронавируса, выделенный в конце 2019 года в г. Ухань (Китай), который за несколько месяцев распространился во всему миру. В январе 2020 года Всемирная организация здравоохранения объявила эпидемию, связанную с SARS-CoV-2, чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения международного значения, а в марте 2020 года охарактеризовала распространение болезни как пандемию. В начале апреля 2020 года количество заболевших превысило 1 млн человек, а количество погибших - 60 тыс. человек.
Заболевание, которое вызывает SARS-CoV-2 получило собственное название COVID-19. Это потенциально тяжёлая острая респираторная инфекция, которая может протекать как в легкой, так и в тяжелой форме и сопровождаться такими осложнениями, как пневмония, острый респираторный дистресс-синдром, острая дыхательная недостаточность, острая сердечная недостаточность, острая почечная недостаточность, септический шок, кардиомиопатии, и др.
SARS-CoV-2 распространяется путем передачи от человека человеку воздушно-капельным путем или при прямом контакте. Репродуктивный индекс SARS-CoV-2 (Basic reproduction number, R0), т.е. количество людей, которые заражаются от одного инфицированного человека, по разным источникам составляет от 2,68 (Wu JT, Leung K, Leung GM. Nowcasting and forecasting the potential domestic and international spread of the 2019-nCoV outbreak originating in Wuhan, China: a modelling study. Lancet. 2020) до 6,6 (Sanche S, Lin YT, Xu C, Romero-Severson E, Hengartner N, Ke R. The Novel Coronavirus, 2019-nCoV, is Highly Contagious and More Infectious Than Initially Estimated. medRxiv. 2020), а средний инкубационный период составляет 5,2 дня (Li Q, Guan X, Wu P, Wang X, Zhou L, Tong Y. et al. Early Transmission Dynamics in Wuhan, China, of Novel Coronavirus-Infected Pneumonia. N Engl J Med. 2020).
Филогенетические исследования штаммов, выделенных от больных COVID-19, показали, что наиболее близкие к SARS-CoV-2 вирусы обнаруживаются у летучих мышей (Zhou P. et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020; 579: 270-273). Также, предполагается, что другие виды млекопитающих могут быть «промежуточными» хозяевами, в которых SARS-CoV-2 смог приобрести некоторые или все мутации, необходимые для эффективной передачи человеку (Zhang YZ, Holmes EC. A Genomic Perspective on the Origin and Emergence of SARS-CoV-2. Cell. 2020 Mar 26.)
Высокий процент смертности, быстрое географическое распространение SARS-CoV-2 и нечетко определенная этиология заболевания создали острую необходимость в создании эффективных средств профилактики и лечения заболеваний, вызываемых данным вирусом.
За прошедшие годы было предпринято немало усилий по созданию различных вакцин против коронавирусных инфекций. Разработанные кандидатные вакцины можно классифицировать на шесть типов: 1) вакцины на основе вирусных векторов; 2) ДНК-вакцины; 3) субъединичные вакцины; 4) вакцины на основе наночастиц; 5) вакцины на основе инактивированного цельного вируса 6) живые аттенуированные вакцины. Данные вакцины были основаны на различных вирусных белках, таких как белок нуклеокапсида N, белок оболочки E, белок NSP16, S белок коронавируса (Ch. Yong et al. Recent Advances in the Vaccine Development Against Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus. Front Microbiol. 2019 Aug 2;10:1781). Часть из этих препаратов находится на стадии клинических исследований (https://www.clinicaltrials.gov/). Однако, данные препараты не эффективны против нового вируса SARS-CoV-2, это объясняется главным образом низкой гомологией данного коронавируса с возбудителями заболеваний человека SARS-CoV и MERS-CoV. Так, например, степень гомологии между S белком SARS-CoV-2 и SARS-CoV составляет всего 76% (Xu X, Chen P, Wang J, Feng J, Zhou H, Li X, et al. Evolution of the novel coronavirus from the ongoing Wuhan outbreak and modeling of its spike protein for risk of human transmission. Sci China Life Sci. 2020;63(3):457-60). Таким образом, на данный момент не существует ни одной зарегистрированной вакцины против заболеваний вызываемых SARS-COV-2.
Известно решение по патенту US 7452542 B2, в котором предлагается использование живой аттенуированной коронавирусной вакцины, в которой указанный вирус характеризуется как содержащий геном, кодирующий полипептид ExoN, включающий замену на тирозин6398 MHV-A59 или его аналогичное положение, и полипептид Orf2a, содержащий замену на лейцин106 MHV-A59 или его аналогичное положение, и фармацевтически приемлемый разбавитель.
Известно решение по патенту WO 2016116398 A1, в котором рассматривается вакцина против коронавируса MERS-CoV, представляющая собой N-нуклеокапсидный белок вируса MERS-CoV и / или его иммуногенный фрагмент или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую N-нуклеокапсидный белок MERS-CoV и / или его иммуногенный фрагмент.
Известно решение по патенту CN 100360557 C, в котором описано использование S белка вируса SARS, который имеет мутацию в одном из положений: 778D → Y; 77D → G; 244T → I; 1182K → Q; 360F → S; 479N → R или K; 480D → G; 609A → L для производства вакцины против тяжелого острого респираторного синдрома. Дата приоритета заявки 10.07.2003.
Известно решение по заявке на изобретение US 20080267992 A1, где описана вакцина против тяжелого острого респираторного синдрома на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа, содержащего последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV, или последовательность, которая включает домен S1 антигена S вируса SARS-CoV или домен S2 антигена S вируса SARS-CoV, или оба домена. Кроме того, данный рекомбинантный аденовирус в составе экспрессионной кассеты содержит промотор цитомегаловируса человека (CMV-промотор) и сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (polyА BGH).
Данный патент как наиболее близкий по техническому решению был выбран авторами заявляемого изобретения за прототип. Существенным недостатком данного решения является использование антигенов вируса другого вида семейства коронавирусов.
Таким образом, в уровне техники существует острая потребность в разработке нового иммунобиологического средства, обеспечивающего индукцию эффективного иммунного ответа против коронавируса SARS-CoV-2.
Раскрытие изобретения
Целью заявленной группы изобретений является создание иммунобиологического средства для эффективной индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2.
Технический результат заключается в создании эффективного средства для индукции специфического иммунитета к SARS-Cov-2.
Указанный технический результат достигается тем, создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С’-конце гена (SEQ ID NO:2).
Также указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (SEQ ID NO:3).
Также указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида вируса (SEQ ID NO:4).
Также указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита (SEQ ID NO:5).
Также указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (SEQ ID NO:6).
Также указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 на основании последовательностей генов белка S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO:1) в комбинации с иммунобиологическими средствами (SEQ ID NO:2), и/или (SEQ ID NO:3), и/или (SEQ ID NO:4), и/или (SEQ ID NO:5), и/или (SEQ ID NO:6).
Также указанный технический результат достигается способом индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, включающий введение в организм млекопитающих одного или более средств (SEQ ID NO:1), и/или (SEQ ID NO:2), и/или (SEQ ID NO:3), и/или (SEQ ID NO:4), и/или (SEQ ID NO:5), и/или (SEQ ID NO:6) в эффективном количестве.
Также указанный технический результат достигается способом индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, где последовательно вводят в организм млекопитающих два различных иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или два различных иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа с интервалом более чем в 1 неделю.
Также указанный технический результат достигается способом индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, где последовательно вводят в организм млекопитающих любое из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа и любое из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа с интервалом более чем в 1 неделю, или в последовательном введении в организм млекопитающих любого из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа и любого из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа с интервалом более чем в 1 неделю.
Также указанный технический результат достигается способом индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, где одновременно вводят в организм млекопитающих любые два иммунобиологических средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го или 26-го серотипа.
Сущность заявленной группы изобретений поясняется чертежами, где на фиг. 1-5 представлены результаты оценки эффективности иммунизации.
Осуществление изобретения
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, RBD, S-del, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 по оценке доли пролиферирующих CD4+ лимфоцитов, рестимулированных гликопротеином S SARS-CoV-2, на 8 день после иммунизации испытуемых животных.
Ось ординат – количество пролиферирующих клеток, %
Ось абсцисс – различные группы животных:
1) фосфатный буфер (100 мкл)
2) Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
3) Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
5) Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
На фиг. 2 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, RBD, S-del, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 по оценке доли пролиферирующих CD4+ лимфоцитов, рестимулированных гликопротеином S SARS-CoV-2, на 15 день после иммунизации испытуемых животных.
Ось ординат – количество пролиферирующих клеток, %
Ось абсцисс – различные группы животных:
1) фосфатный буфер (100 мкл)
2) Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
3) Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
5) Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
На фиг. 3 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, RBD, S-del, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 по оценке доли пролиферирующих CD8+ лимфоцитов, рестимулированных гликопротеином S SARS-CoV-2, на 8 день после иммунизации испытуемых животных.
Ось ординат – количество пролиферирующих клеток, %
Ось абсцисс – различные группы животных:
1) фосфатный буфер (100 мкл)
2) Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
3) Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
5) Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
На фиг. 4 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, RBD, S-del, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 по оценке доли пролиферирующих CD8+ лимфоцитов, рестимулированных гликопротеином S вируса SARS-CoV-2, на 15 день после иммунизации испытуемых животных.
Ось ординат – количество пролиферирующих клеток, %
Ось абсцисс – различные группы животных:
1) фосфатный буфер (100 мкл)
2) Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
3) Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
5) Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
На фиг. 5 представлены результаты оценки эффективности разработанного иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, RBD, S-del, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 по оценке прироста концентрации ИФН-гамма в среде после стимуляции спленоцитов иммунизированных аденовирусными конструкциями мышей линии C57/BL6 рекомбинантным полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2, на 15 день после иммунизации испытуемых животных.
Ось ординат – значения прироста концентрации ИФН-гамма в среде стимулированных клеток при сравнении с интактными клетками (разы).
Ось абсцисс – исследуемые группы животных: интактные животные и животные, которым вводили по 108БОЕ/мышь
1) фосфатный буфер (100 мкл)
2) Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
3) Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
5) Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
Первым этапом в разработке иммунобиологического средства против коронавируса SARS-CoV-2 являлся выбор вакцинного антигена. В ходе работы был проведен литературный поиск, который показал, что наиболее перспективным антигеном для создания кандидатной вакцины является S белок коронавируса. Это трансмембранный гликопротеин I типа, который отвечает за связывание, слияние и проникновение вирусных частиц в клетку. Было показано, что он является индуктором нейтрализующих антител (Liang M et al, SARS patients-derived human recombinant antibodies to S and M proteins efficiently neutralize SARS-coronavirus infectivity. Biomed Environ Sci. 2005 Dec;18(6):363-74).
S белок состоит из сигнального пептида (аминокислоты 1-12) и 3 доменов: внеклеточного домена (аминокислоты 13-1193), трансмембранного домена (аминокислоты 1194-1215), внутриклеточного домена (аминокислоты 1216-1255). Внеклеточный домен состоит из 2 субъединиц S1 и S2, и небольшого участка между ними, функции которого до конца не ясны. Субъединица S1 отвечает за связывание вируса с рецептором ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2). Участок, который находится в среднем регионе субъединицы S1 (аминокислоты 318-510) называется рецептор-связывающим доменом (receptor-binding domain (RBD)). Субъединица S2, которая содержит предполагаемый пептид слияния (putative fusion peptide) и два гептадных повтора (heptad repeats (HR1 and HR2)), отвечает за слияние между вирусом и целевой клеточной мембраной. Инфекция инициируется связыванием RBD субъединицы S1 вируса с клеточным рецептором ACE2. После этого формируется ядро слияния между HR1 и HR2 регионами субъединицы S2, что влечет за собой сближение вирусной и клеточной мембран, которые в результате сливаются и вирус проникает в клетку. Следовательно, использование S белка или его фрагментов, в составе вакцины, может индуцировать антитела, блокирующие проникновение вируса в клетку.
Для достижения максимально эффективной индукции иммунных реакций авторы предложили различные варианты модификаций данного антигена, а также возможность его комбинации с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита для повышения уровня экспрессии целевого белка.
Было получено 6 различных вариантов нуклеотидных последовательностей (модифицированного гена S вируса SARS-CoV-2 либо рецептор-связывающего домена белка S) путем оптимизации данных последовательностей под экспрессию в клетках млекопитающих.
Далее было разработано несколько конструкций на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го и 26-го серотипов для эффективной доставки модифицированных генов в клетки млекопитающих. Аденовирусные векторы были выбраны, поскольку они обладают такими преимуществами, как безопасность, широкий диапазон тканевого тропизма, хорошо охарактеризованный геном, легкость генетических манипуляций, способность включать большие вставки трансгенной ДНК, присущие им свойства адъюванта, способность индуцировать устойчивый Т-клеточный и гуморальный ответ.
Из ряда известных аденовирусов, наиболее исследованными являются аденовирусы человека 5-го серотипа, поэтому они стали основой для создания векторов для генотерапии. Были разработаны технологии получения векторов первого и второго поколений, химерных векторов (содержащих белки вирусов других серотипов) (J.N. Glasgow et al., An adenovirus vector with a chimeric fiber derived from canine adenovirus type 2 displays novel tropism, Virology, 2004, № 324, 103–116) и ряда других векторов. Также, были созданы векторы, производные от других серотипов, например, 26-го (H. Chen et al., Adenovirus-Based Vaccines: Comparison of Vectors from Three Species of Adenoviridae, Virology, 2010, № 84(20), 10522–10532).
Векторы на основе аденовируса человека 26-го серотипа показывают высокий уровень иммуногенности у приматов, где они способны индуцировать мощный CD8+ Т-клеточный ответ, качественно превосходящий Т-клеточный ответ при введении в организм векторов на основе аденовируса человека 5-го серотипа (J. Liu et al., Magnitude and phenotype of cellular immune responses elicited by recombinant adenovirus vectors and heterologous prime-boost regimens in rhesus monkeys, Virology, 2008, № 82, 4844–4852). При этом происходит распознавание большего числа эпитопов и индукция выработки более широкого спектра факторов, а не преимущественно интерферона гамма (J. Liu et al., Magnitude and phenotype of cellular immune responses elicited by recombinant adenovirus vectors and heterologous prime-boost regimens in rhesus monkeys, Virology, 2008, № 82, 4844–4852). Эти данные позволяют предполагать, что векторы на основе аденовируса человека 26-го серотипа обладают фундаментальными отличиями в способности индуцировать формирование иммунного ответа на целевой антиген относительно других аденовирусных векторов.
Изобретение по варианту 1 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа, или рекомбинантный аденовирус человека 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 на основании последовательностей генов белка S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO:1).
Изобретение по варианту 2 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа, или рекомбинантный аденовирус человека 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С’-конце гена (SEQ ID NO:2).
Изобретение по варианту 3 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа, или рекомбинантный аденовирус человека 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (SEQ ID NO:3).
Изобретение по варианту 4 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа, или рекомбинантный аденовирус человека 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида вируса (SEQ ID NO:4).
Изобретение по варианту 5 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа, или рекомбинантный аденовирус человека 26-го серотипа содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита (SEQ ID NO:5).
Изобретение по варианту 6 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа, или рекомбинантный аденовирус человека 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (SEQ ID NO:6).
Разработан способ индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, включающий во введении в организм млекопитающих одного или более средств по вариантам 1-6 в эффективном количестве. Данный способ предусматривает:
1) последовательное введение в организм млекопитающих двух различных иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или двух различных иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа по вариантам 1-6 с интервалом более чем в 1 неделю
2) последовательное введение в организм млекопитающих любого из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа и любое из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа по вариантам 1-6 с интервалом более чем в 1 неделю, или в последовательном введении в организм млекопитающих любого из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа и любого из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа по вариантам 1-6 с интервалом более чем в 1 неделю.
3) Одновременное введение в организм млекопитающих любых двух иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го или 26-го серотипа по п. 1, и/или п. 2, и/или п. 3, и/или п. 4, и/или п. 5, и/или п. 6.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Получение различных вариантов гликопротеина S SARS-CoV-2
На первом этапе работы авторы разработали несколько модификаций вакцинного антигена для достижения наиболее эффективного иммунного ответа.
За основу был взят S белок вируса SARS-CoV-2 с последовательностью SEQ ID NO:1, который затем был модифицирован несколькими способами:
1) Для представления белка S на плазматической мембране была произведена делеция 18 аминокислот на С’-конце белка S (S-del) SEQ ID NO:2 (использована для варианта 2).
2) Кроме того, была получена оптимизированная экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (использована для варианта 3). Такая модификация усиливает иммуногенность за счет возможного связывания Fc фрагмента белка с Fc рецептором на антиген-презентирующих клетках (Li Z., Palaniyandi S., Zeng R., Tuo W., Roopenian D.C., Zhu X., Transfer of IgG in the female genital tract by MHC class I-related neonatal Fc receptor (FcRn) confers protective immunity to vaginal infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2011, №108, 4388–93), а также увеличивает стабильность белка и продлевает период его полу-жизни in vivo (Zhang M.Y., Wang Y., Mankowski M.K., Ptak R.G., Dimitrov D.S., Cross-reactive HIV-1-neutralizing activity of serum IgG from a rabbit immunized with gp41 fused to IgG1 Fc: Possible role of the prolonged half-life of the immunogen, Vaccine, 2009, №27, 857–863).
3) Для исследования иммуногенности только рецептор-связывающего домена (RBD) белка S вируса SARS-CoV-2 в секретируемой форме, была создана последовательность SEQ ID NO:4 (использована для варианта 4), содержащая последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью лидерного пептида (добавлена для секреции белка).
4) Для исследования RBD белка S вируса SARS-CoV-2 в несекретируемой форме, была выбрана последовательность SEQ ID NO:5 (использована для варианта 5), состоящая из RBD белка S вируса SARS-CoV-2, к которой была добавлена последовательность трансмембранного домена гликопротеина вируса везикулярного стоматита (RBD-G).
5) Для исследования секретируемой формы RBD белка S с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 была выбрана последовательность SEQ ID NO:6 (использована для варианта 6). Добавление Fc-фрагмента от человеческого IgG1 усиливает иммуногенность за счет возможного связывания Fc фрагмента белка с Fc рецептором на антиген-презентирующих клетках (Z. Li et. al., Transfer of IgG in the female genital tract by MHC class I-related neonatal Fc receptor (FcRn) confers protective immunity to vaginal infection, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2011, № 108, 4388–4393), а также может усилить стабильность белка и продлить период полужизни in vivo (M.Y. Zhang et. al., Crossreactive HIV-1-neutralizing activity of serum IgG from a rabbit immunized with gp41 fused to IgG1 Fc: Possible role of the prolonged half-life of the immunogen, Vaccine, 2008, № 27, 857–63).
Пример 2. Получение генетических конструкций, кодирующих ген белка S в различных вариантах
На следующем этапе работы аминокислотные последовательности по примеру 1 (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6) были переведены в нуклеотидные последовательности. Далее была проведена оптимизация полученных последовательностей под экспрессию в клетках млекопитающих. Все нуклеотидные последовательности были получены методом синтеза компанией ЗАО «Евроген» (Москва). В итоге были получены следующие генетические конструкции:
1) pVax-S-CoV-2, содержащая нуклеотидную последовательность полного гена S вируса SARS-CoV-2;
2) pVax-S-del-CoV-2, содержащая нуклеотидную последовательность гена S вируса SARS-CoV-2 c с делецией 18 аминокислот на С’-конце гена;
3) pVax-S-Fc-CoV-2, содержащая нуклеотидную последовательность полного гена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1
4) pAL2-T-RBD-CoV-2, содержащая нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью гена лидерного пептида;
5) pAL2-T-RBD-G-CoV-2, содержащая нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S c геном G вируса везикулярного стоматита;
6) pAL2-T-RBD-Fc-CoV-2, содержащая нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью гена лидерного пептида и нуклеотидной последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1.
Далее с помощью методов генной инженерии последовательность гена белка S из конструкции pVax-S-CoV-2 была клонирована с использованием эндонуклеазы рестрикции XbaI в челночную плазмиду pShuttle-CMV (StratаGen, США) и полученная плазмида была названа pShuttle-S-CoV-2. Таким образом, была создана челночная плазмида pShuttle-S-CoV-2, несущая оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих нуклеотидную последовательность аминокислотной последовательности S (SEQ ID NO:1), полученной в примере 1.
Аналогично нуклеотидные последовательности модифицированных вариантов белка S SARS-CoV-2 были клонированы в челночную плазмиду pShuttle-CMV (StratаGen, США) и были получены следующие челночные плазмиды:
- pShuttle-S-del-CoV-2 (содержит оптимизированную нуклеотидную последовательность гена S вируса SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С’-конце);
- pShuttle-S-Fc-CoV-2, содержащая оптимизированную нуклеотидную последовательность полного гена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1;
- pShuttle-RBD-CoV-2 (содержит оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена S SARS-CoV-2);
- pShuttle-RBD-G-CoV-2 (содержит оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена S SARS-CoV-2 с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита);
- pShuttle-RBD-Fc-CoV-2 (содержит оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена S SARS-CoV-2 с оптимизированной последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1).
Пример 3. Получение иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа
На следующем этапе работы была получена рекомбинантная аденовирусная плазмида pAd5-S-CoV-2, содержащая оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S SARS-CoV-2 (SEQ ID NO:1) (вариант 1). Данная плазмида была получена методом гомологичной рекомбинации между плазмидой pAd-Easy (AdEasy™ Adenoviral Vector System, StratаGen, США), содержащей геномную часть аденовируса человека 5 серотипа с удаленной E1 и E3 областями, и челночной плазмидой pShuttle-S (полученной в примере 3), несущей гомологичные участки генома аденовируса и экспрессионную кассету с целевым геном (белка S). Для этого, полученная в примере 3 челночная плазмида pShuttle-S была линеаризована эндонуклеазой рестрикции PmeI.
Гомологичную рекомбинацию проводили в клетках E. coli штамма BJ5183. Плазмиду Ad-Easy смешивали с плазмидой pShuttle-S, а затем полученной смесью трансформировали клетки E.coli методом электропорации согласно руководству «MicroPulser™ Electroporation Apparatus Operating Instructions and Applications Guide» (Bio-Rad, США). После трансформации клетки E.coli штамма BJ5183 высевали на чашки с LB-агаром, содержащим селективный антибиотик и подращивали в течение 18 часов при температуре +37ºС. Эффективность трансформации составляла 1010 –1011 трансформированных клонов на 1 мкг плазмиды pBluescript II SK(-).
В результате гомологичной рекомбинации в плазмиде pAd-Easy появлялась кассета с целевым трансгеном (белка S), и менялся ген устойчивости к антибиотику.
Таким образом, была сконструирована рекомбинантная аденовирусная плазмида pAd5-S-CoV-2, содержащая полноразмерный геном рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа (с делетированными Е1 и Е3 областями генома) со встроенной генетической конструкцией, полученной в примере 3. Далее плазмиду pAd5-S-CoV-2 гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Pac I и трансфецировали ею пермессивную культуру клеток эмбриональной почки человека линии НЕК 293. Клетки линии НЕК 293 содержат в своем геноме встроенную область Е1 генома аденовируса человека 5-го серотипа, благодаря чему в них может происходить размножение рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов человека 5-го серотипа. На шестой день после трансфекции проводили первые слепые пассажи для более эффективного получения рекомбинантного аденовируса. После наступления цитопатического действия вируса (данные микроскопирования), клетки с культуральной средой трехкратно перемораживали для разрушения клеток и выхода вируса. В результате был получен материал, который затем был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов.
Активность препарата pAd5-S-CoV-2 здесь и далее оценивали стандартным методом титрования на культуре чувствительных клеток 293 HEK в реакциях бляшкообразования.
Для подтверждения создания конструкции предлагаемой рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующей ген S вируса SARS-CoV-2, проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) по известной стандартной методике.
Аналогичным образом были получены еще пять рекомбинантных аденовирусов: Ad5-S-del-CoV-2, Ad5-S-Fc-CoV-2, Ad5-RBD-CoV-2, Ad5-RBD-G-CoV-2, Ad5-RBD-Fc-CoV-2.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены варианты иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа, содержащего:
1) оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена S SARS-CoV-2 (вариант 1);
2) оптимизированную нуклеотидную последовательность протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С’-конце гена (вариант 2);
3) оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (вариант 3);
4) оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью лидерного пептида (вариант 4),
5) оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита (вариант 5),
6) оптимизированную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (вариант 6).
Пример 4. Получение иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа
На первом этапе, в рекомбинантный вектор pAd26-ORF6-Ad5 была помещена экспрессионная кассета с геном S SARS-CoV-2. Для этого вектор pAd26-ORF6-Ad5 был линеаризован с помощью эндонуклеазы рестрикции PmeI, а плазмидная конструкция pShuttle-S, полученная в примере 3 была обработана эндонуклеазами рестрикции PmeI. Продукты гидролиза лигировали, после чего при помощи стандартных методов была получена плазмида pAd26-S-CoV-2.
На следующем этапе плазмиду pAd26-S-CoV-2 гидролизовали эндонуклеазами рестрикции PacI и SwaI и трансфецировали ею пермессивную культуру клеток линии НЕК 293. На третий день после трансфекции проводили первые слепые пассажи для более эффективного получения рекомбинантного аденовируса. После наступления цитопатического действия вируса (данные микроскопирования), клетки с культуральной средой трехкратно перемораживали для разрушения клеток и выхода вируса. В результате был получен материал, который затем был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов. Активность препарата pAd26-S-CoV-2 здесь и далее оценивали стандартным методом титрования на культуре клеток 293 HEK в реакции бляшкообразования.
Для подтверждения создания конструкции предлагаемой рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, экспрессирующей ген S SARS-CoV-2, проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) по известной стандартной методике.
Аналогичным образом были получены еще пять рекомбинантных аденовирусов: pAd26-S-dek-CoV-2, pAd26-S-Fc-CoV-2, pAd26-RBD-CoV-2, pAd26-RBD-G-CoV-2, pAd26-RBD-Fc-CoV-2.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены варианты иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащего:
1) оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена S SARS-CoV-2 (вариант 1);
2) оптимизированную нуклеотидную последовательность протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С’-конце гена (вариант 2);
3) оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (вариант 3);
4) оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью лидерного пептида (вариант 4),
5) оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита (вариант 5),
6) оптимизированную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (вариант 6).
Пример 5. Проверка экспрессии различных вариантов гена гликопротеина S SARS-CoV-2 в клетках линии HEK293 после добавления иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа
Целью данного эксперимента была проверка способности сконструированных рекомбинантных аденовирусов Ad5-S-CoV-2, Ad5-S-del-CoV-2, Ad5-S-Fc-CoV-2, Ad5-RBD-CoV-2, Ad5-RBD-G-CoV-2, Ad5-RBD-Fc-CoV-2 экспрессировать различные варианты гена белка S в клетках млекопитающих.
Клетки HEK293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в инкубаторе при температуре 37ºС и 5% СО2. Клетки помещали на 35 мм2 культуральные чашки Петри и инкубировали в течение суток до достижения 70% конфлюэнтности. Далее к клеткам добавили исследуемые препараты рекомбинантных аденовирусов (Ad5-S-CoV-2, Ad5-S-del-CoV-2, Ad5-S-Fc-CoV-2, Ad5-RBD-CoV-2, Ad5-RBD-G-CoV-2, Ad5-RBD-Fc-CoV-2), контрольный препарат (Ad5-null – рекомбинантый аденовирус, не содержащий вставок) из расчета 100 БОЕ/клетку и фосфатно-солевой буфер (ФСБ) в качестве отрицательного контроля. Через 2 суток после трансдукции клетки собрали, лизировали в 0,5 мл однократного буфера CCLR (Promega), лизат развели карбонат-бикарбонатным буфером и внесли в лунки планшета для ИФА. Инкубировали планшет в течение ночи +4ºС.
Промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку, а затем внесли по 100 мкл блокирующего буфера, накрыли крышкой и инкубировали 1 час 37ºС на шейкере при 400 об/мин. Далее промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку и внесли по 100 мкл сыворотки крови реконвалесцента. Накрыли планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 2 часов. Далее промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку, затем внесли 100 мкл раствора вторичных антител, конъюгированных с биотином. Накрыли планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 2 часов. Далее приготовили раствор стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Для этого развели конъюгат объемом 60 мкл в 5,94 мл буфера для анализа. Промыли лунки планшета дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл раствора стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Планшет инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 оборотов в минуту в течение 1 часа. Затем лунки планшета промыли дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл ТМБ субстрата и инкубировали в темноте при комнатной температуре 10 минут, а затем добавили во все лунки по 100 мкл останавливающего раствора. Значение оптической плотности определяли измерением на планшетном спектрофотометре (Multiskan FC, Thermo) при длине волны 450 нм. Результаты эксперимента представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Результаты эксперимента по проверке экспрессии различных вариантов гена гликопротеина S SARS-CoV-2 в клетках линии HEK293 после добавления иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа
Среднее значение оптической плотности при длине волны 450 нм
ФСБ 0,19 (±0,05)
Ad5-null 0,23 (±0,08)
Ad5-S-CoV-2 1,85 (±0,15)
Ad5-S-del-CoV-2, 1,63 (±0,19)
Ad5-S-Fc-CoV-2 1,57 (±0,30)
Ad5-RBD-CoV-2 1,47 (±0,21)
Ad5-RBD-G-CoV-2 1,52 (±0,19)
Ad5-RBD-Fc-CoV-2 1,58± (0,11)
Как видно из полученных данных, во всех клетках, трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами Ad5-S-CoV-2, Ad5-S-del-CoV-2, Ad5-S-Fc-CoV-2, Ad5-RBD-CoV-2, Ad5-RBD-G-CoV-2, Ad5-RBD-Fc-CoV-2 наблюдалась экспрессия различных вариантов целевого белка.
Пример 6. Проверка экспрессии различных вариантов гена гликопротеина S SARS-CoV-2 в клетках линии HEK293 после добавления иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа
Целью данного эксперимента была проверка способности сконструированных рекомбинантных аденовирусов pAd26-S-CoV-2, Ad26-S-del-CoV-2, Ad26-S-Fc-CoV-2, pAd26-RBD-CoV-2, pAd26-RBD-G-CoV-2, pAd26-RBD-Fc-CoV-2 экспрессировать различные варианты гена белка S в клетках млекопитающих.
Клетки HEK293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в инкубаторе при температуре 37ºС и 5% СО2. Клетки помещали на 35мм2 культуральные чашки Петри и инкубировали в течение суток до достижения 70% конфлюэнтности. Далее к клеткам добавили исследуемые препараты рекомбинантных аденовирусов (pAd26-S-CoV-2, Ad26-S-del-CoV-2, Ad26-S-Fc-CoV-2, pAd26-RBD-CoV-2, pAd26-RBD-G-CoV-2, pAd26-RBD-Fc-CoV-2), контрольный препарат (Ad26-null – рекомбинантый аденовирус, не содержащий вставок) из расчета 100 БОЕ/клетку и фосфатно-солевой буфер (ФСБ) в качестве отрицательного контроля. Через 2 суток после трансдукции клетки собрали, лизировали в 0,5 мл однократного буфера CCLR (Promega), лизат развели карбонат-бикарбонатным буфером и внесли в лунки планшета для ИФА. Инкубировали планшет в течение ночи +4ºС.
Промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку, а затем внесли по 100 мкл блокирующего буфера, накрыли крышкой и инкубировали 1 час 37ºС на шейкере при 400 об/мин. Далее промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку и внесли по 100 мкл сыворотки крови реконвалесцента. Накрыли планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 2 часов. Далее промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку, затем внесли 100 мкл раствора вторичных антител, конъюгированных с биотином. Накрыли планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 2 часов. Далее приготовили раствор стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Для этого развели конъюгат объемом 60 мкл в 5,94 мл буфера для анализа. Промыли лунки планшета дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл раствора стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Планшет инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 оборотов в минуту в течение 1 часа. Затем лунки планшета промыли дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл ТМБ субстрата и инкубировали в темноте при комнатной температуре 10 минут, а затем добавили во все лунки по 100 мкл останавливающего раствора. Значение оптической плотности определяли измерением на планшетном спектрофотометре (Multiskan FC, Thermo) при длине волны 450 нм. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Результаты эксперимента по проверке экспрессии различных вариантов гена гликопротеина S SARS-CoV-2 в клетках линии HEK293 после добавления иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа
Среднее значение оптической плотности при длине волны 450 нм
ФСБ 0,17 (±0,08)
Ad26-null 0,22 (±0,09)
Ad26-S-CoV-2 1,68 (±0,21)
Ad26-S-del-CoV-2 1,65 (0,14)
Ad26-S-Fc-CoV-2 1,71 (±0,13)
Ad26-RBD-CoV-2 1,61 (±0,18)
Ad26-RBD-G-CoV-2 1,45 (±0,22)
Ad26-RBD-Fc-CoV-2 1,51± (0,14)
Как видно из полученных данных, во всех клетках, трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами pAd26-S-CoV-2, Ad26-S-del-CoV-2, Ad26-S-Fc-CoV-2, pAd26-RBD-CoV-2, pAd26-RBD-G-CoV-2, pAd26-RBD-Fc-CoV-2 наблюдалась экспрессия различных вариантов целевого белка.
Пример 7. Способ использования разработанного иммунобиологического средства путем однократного введения в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2
Разработанное иммунобиологическое средство на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го и 26-го серотипов, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, S-del, S-Fc, RBD, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 используется путем введения в организм млекопитающих любым из известных для данного вирусного вектора способов введения (подкожно, внутримышечно, внутривенно, интраназально). При этом в организме млекопитающих развивается иммунный ответ к целевому белку гликопротеина SARS-CoV-2.
Одной из основных характеристик эффективности иммунизации является титр антител. В примере представлены данные, касающиеся изменения титра антител против гликопротеина SARS-CoV-2 через 21 день после однократной внутримышечной иммунизации животных иммунобиологическим средством, включающим рекомбинантный аденовирус человека 5-го или 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, S-del, S-Fc, RBD, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6.
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии C57BL/6, самки 18г. Все животные были разделены на 43 групп по 5 животных, которым внутримышечно вводили:
1) Ad5-S-CoV-2 107БОЕ/мышь
2) Ad5-S-del-CoV-2 107БОЕ/мышь
3) Ad5-S-Fc-CoV-2 107БОЕ/мышь
4) Ad5-RBD-CoV-2 107БОЕ/мышь
5) Ad5-RBD-G-CoV-2 107БОЕ/мышь
6) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 107БОЕ/мышь
7) Ad5-null 107БОЕ/мышь
8) Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
9) Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
10) Ad5-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
11) Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
12) Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
13) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
14) Ad5-null 108БОЕ/мышь
15) Ad5-S-CoV-2 109БОЕ/мышь
16) Ad5-S-del-CoV-2 109БОЕ/мышь
17) Ad5-S-Fc-CoV-2 109БОЕ/мышь
18) Ad5-RBD-CoV-2 109БОЕ/мышь
19) Ad5-RBD-G-CoV-2 109БОЕ/мышь
20) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 109БОЕ/мышь
21) Ad5-null 109БОЕ/мышь
22) Ad26-S-CoV-2 107БОЕ/мышь
23) Ad26-S-del-CoV-2 107БОЕ/мышь
24) Ad26-S-Fc-CoV-2 107БОЕ/мышь
25) Ad26-RBD-CoV-2 107БОЕ/мышь
26) Ad26-RBD-G-CoV-2 107БОЕ/мышь
27) Ad26-RBD-Fc-CoV-2 107БОЕ/мышь
28) Ad26-null 107БОЕ/мышь
29) Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
30) Ad26-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
31) Ad26-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
32) Ad26-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
33) Ad26-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
34) Ad26-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
35) Ad26-null 108БОЕ/мышь
36) Ad26-S-CoV-2 109БОЕ/мышь
37) Ad26-S-del-CoV-2 109БОЕ/мышь
38) Ad26-S-Fc-CoV-2 109БОЕ/мышь
39) Ad26-RBD-CoV-2 109БОЕ/мышь
40) Ad26-RBD-G-CoV-2 109БОЕ/мышь
41) Ad26-RBD-Fc-CoV-2 109БОЕ/мышь
42) Ad26-null 109БОЕ/мышь
43) фосфатно-солевой буфер
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
Белок (S) адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4ºС.
Далее для избавления от неспецифического связывания осуществилась "забивка" планшета 5 % молоком, растворенном в TPBS в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС на протяжении часа.
Методом 2-х кратных разведений разводили образцы сыворотки иммунизированных мышей. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером
Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 1.
Таблица 3 - Титр антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител)
Рекомбинантный аденовирус БОЕ/мышь
107 108 109
Ad5-null 0 0 0
Ad5-S-CoV-2 1:10809 1:18820 1:57052
Ad5-S-del-CoV-2 1:21619 1:28526 1:114105
Ad5-S-Fc-CoV-2 1:14263 1:18820 1:57052
Ad5-RBD-CoV-2 1:12417 1:14263 1:99334
Ad5-RBD-G-CoV-2 1:32768 1: 49667 1:172951
Ad5-RBD-Fc-CoV-2 1:10809 1:12417 1:28526
Ad26-null 0 0 0
Ad26-S-CoV-2 1:18820 1:24834 1:43238
Ad26-S-del-CoV-2 1:24834 1:43238 1:57052
Ad26-S-Fc-CoV-2 1:28526 1:32768 1:86475
Ad26-RBD-CoV-2 1:12417 1:18820 1:86475
Ad26-RBD-G-CoV-2 1:24834 1:32768 1:150562
Ad26-RBD-Fc-CoV-2 1:9410 1:12417 1:24834
Результаты эксперимента показали, что разработанное иммунобиологическое средство, введенное в организм млекопитающего, индуцирует гуморальный иммунный ответ к гликопротеину SARS-CoV-2 во всем диапазоне выбранных доз. При этом, очевидно, что увеличение доз будет приводить к увеличению титра антител в крови млекопитающих до наступления токсического эффекта.
Пример 8. Способ использования разработанного иммунобиологического средства путем последовательно введения в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
В данном примере описан способ использования разработанного иммунобиологического средства основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, S-del, S-Fc, RBD, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 путем их последовательного введения в организм млекопитающих с интервалом в 1 неделю, для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 7.
Все животные были разделены на 29 групп (по 3 животных), которым внутримышечно вводили:
фосфатный буфер (100 мкл), а через неделю фосфатный буфер (100мкл)
фосфатный буфер (100 мкл), а через неделю Ad5-null 108БОЕ/мышь
Ad5-null 108БОЕ/мышь, а через неделю фосфатный буфер (100мкл)
Ad5-null 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-null 108БОЕ/мышь
Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5- S-Fc -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5- S-Fc -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5- S-Fc -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5- S-Fc -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5- S-Fc -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5- S-Fc -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5- RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-RBD-Fc-CoV-2108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
Результаты представлены в таблицах 4 и 5.
Таблица 4 - Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей контрольных групп
Вторая иммунизация (через неделю)
PBS Ad5-null
Первая иммунизация PBS 0 0
Ad5-null 0 0
Таблица 5 - Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей опытных групп
Вторая иммунизация (через неделю)
Первая иммунизация Ad5-S-CoV-2 Ad5-S-del-CoV-2 Ad5-S-Fc-CoV-2 Ad5-RBD-CoV-2 Ad5- RBD-G-CoV-2 Ad5-RBD-Fc-CoV-2
Ad5-S-CoV-2 1:32768 1:131072 1:104032 1:131072 1:65536 1:104032
Ad5-S-del- CoV-2 1:65536 1:131072 1:131072 1:131072 1:65536 1:104032
Ad5-S-Fc- CoV-2 1:65536 1:104032 1:65536 1:104032 1:52016 1:131072
Ad5-RBD-CoV-2 1:52016 1:65536 1:131072 1:65536 1:32768 1:52016
Ad5-RBD-G-CoV-2 1:131072 1:131072 1:104032 1:131072 1:65536 1:104032
Ad5-RBD-Fc-CoV-2 1:82570 1:131072 1:65536 1:32768 1:65536 1:65536
Таким образом, результаты эксперимента полностью подтвердили, что последовательная иммунизация разработанными иммунобиологическими средствами в различных комбинациях, включающими различные формы белка S SARS-CoV-2 вызовет более мощную индукцию иммунного ответа, чем иммунизация по аналогичной схеме одним и тем же антигеном.
Пример 9. Определение эффективности иммунизации разработанным иммунобиологическим средством по оценке доли пролиферирующих лимфоцитов.
Пролиферативный анализ позволяет оценивать способность лимфоцитов усиленно делиться после встречи с антигеном. Для того, чтобы оценить пролиферацию авторы использовали окраску лимфоцитов флуоресцентным красителем CFSE. Данный краситель связывается с клеточными белками, и сохраняется долгое время и при этом никогда не передается соседним клеткам в популяции. Однако, флуоресцентная метка передается дочерним клеткам. Концентрация метки, а, следовательно, и интенсивность флуоресценции, снижаются ровно в два раза. Поэтому делящиеся клетки легко отслеживать по уменьшению их флуоресценции.
В эксперименте использовались мыши линии C57BL/6. Все животные были разделены на 8 групп (по 3 животных), которым внутримышечно вводили:
1) фосфатный буфер (100 мкл)
2) Ad5-null 108БОЕ/мышь
3) Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
4) Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
5) Ad5-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
6) Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
7) Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
8) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
Дозы рекомбинантных аденовирусов были выбраны на основании данных, полученных при определении титра антител.
Через две недели животных усыпляли. Из селезенки выделяли лимфоциты методом центрифугирования в градиенте фиколла-урографина. Затем выделенные клетки окрашивали CFSE по методике (B.J. Quah et. al., Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, Nature Protocols, 2007, № 2(9), 2049-2056) и культивировали в присутствие антигена. Далее клетки анализировали методом проточной цитофлуориметрии. Полученные результаты представлены на Фиг. 1, 2, 3, 4. Таким образом, можно заключить, что полученные аденовирусные конструкции индуцируют формирование антиген-специфического иммунного ответа (как CD4+, так и CD8+).
Как видно из результатов эксперимента (Фиг. 1, 2, 3, 4), разработанные иммунобиологические средства по п.1, п.2, п.3, п.4, п.5 в данной дозе эффективно стимулируют пролиферацию лимфоцитов.
Пример 10. Способ использования разработанных иммунобиологических средств на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го и 26-го серотипов путем их последовательного введения в организм млекопитающих для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 7. Комбинации иммунобиологических средств были выбраны исходя из примеров 7 и 8.
Все животные были разделены на 31 группу (по 3 животных), которым внутримышечно вводили:
1. фосфатный буфер (100 мкл), а через неделю фосфатный буфер (100мкл)
2. Ad26-null 108БОЕ/мышь, а через неделю фосфатный буфер (100 мкл)
3. фосфатный буфер (100 мкл), а через неделю Ad26-null 108БОЕ/мышь
4. Ad26-null 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-null 108БОЕ/мышь
5. Ad5-null 108БОЕ/мышь, а через неделю фосфатный буфер (100 мкл)
6. фосфатный буфер (100 мкл), а через неделю Ad5-null 108БОЕ/мышь
7. Ad5-null 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-null 108БОЕ/мышь
8. Ad5-null 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-null 108БОЕ/мышь
9. Ad26-null 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-null 108БОЕ/мышь
10. Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
11. Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
12. Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
13. Ad26-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
14. Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
15. Ad26-S-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
16. Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
17. Ad26-S-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
18. Ad26-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь
19. Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь
20. Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
21. Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь
22. Ad26-S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
23. Ad26-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
24. Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
25. Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
26. Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
27. Ad26-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
28. Ad5- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
29. Ad26- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
30. Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь
31. Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь
Результаты представлены в таблицах 6 и 7.
Таблица 6 - Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей контрольных групп
Вторая иммунизация (через неделю)
PBS Ad5-null Ad26-null
Первая иммунизация PBS 0 0 0
Ad5-null 0 0 0
Ad26-null 0 0 0
Таблица 7 - Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей опытных групп
Группа животных Среднее геометрическое значение титра антител
Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-G 108БОЕ/мышь 1:208064
Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь 1:1321123
Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь 1:832255
Ad26-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь 1:1321123
Ad5- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь 1:165140
Ad26- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD -CoV-2 108БОЕ/мышь 1:104032
Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь 1:104032
Ad26- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь 1:52016
Ad26-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь 1:131072
Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь 1:104032
Ad5- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь 1:165140
Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь 1:208064
Ad26- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь 1:660561
Ad26-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь 1:416128
Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь 1:208064
Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь 1:65536
Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь 1:131072
Ad26-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь 1:165140
Ad5- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь 1:208064
Ad26-S-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь 1:208064
Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь 1:165140
Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь 1:165140
Таким образом, результаты эксперимента полностью подтвердили, что последовательная иммунизация разработанными иммунобиологическими средствами, включающими различные аденовирусные векторы (на основе аденовирусов человека 5-го и 26-го серотипов) вызовет более мощную индукцию иммунного ответа, чем иммунизация по аналогичной схеме одним и тем же вектором.
Пример 11. Определение эффективности иммунизации разработанным иммунобиологическим средством по оценке индукции ИФН-гамма
В данном эксперименте проводили оценку эффективности иммунизации разработанным иммунобиологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, S-del, S-Fc, RBD, RBD-G, RBD-Fc) вируса SARS-COV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 по определению прироста концентрации ИФН-гамма в среде после стимуляции спленоцитов иммунизированных аденовирусными конструкциями мышей линии C57/BL6 рекомбинантным полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2.
Для определения уровня ИФН-гамма был использован набор Mouse IFN gamma Platinum ELISA (Affymetrix eBioscience, USA).
Порядок проведения ИФА. Промыли лунки планшета однократным буфером для промывки дважды объемом 200 мкл на лунку, а затем внесли по 100 мкл стандартов и 100 мкл раствора для разведения образцов в качестве отрицательного контроля. В лунки образцов внесли по 50 мкл раствора для разведения образцов, а затем по 50 мкл самих образцов (среда от стимулированных спленоцитов). Приготовили раствор антител, конъюгированных с биотином. Для этого развели конъюгат объемом 60 мкл в 5,94 мл буфера для анализа. Затем во все лунки внесли по 50 мкл раствора антител, конъюгированных с биотином, накрыли планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 2 часов. Далее приготовили раствор стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Для этого развели конъюгат объемом 60 мкл в 5,94 мл буфера для анализа. Промыли лунки планшета дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл раствора стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Планшет инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 оборотов в минуту в течение 1 часа. Затем лунки планшета промыли дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл ТМБ субстрата и инкубировали в темноте при комнатной температуре 10 минут, а затем добавили во все лунки по 100 мкл останавливающего раствора. Значение оптической плотности определяли измерением на планшетном спектрофотометре (Multiskan FC, Thermo) при длине волны 450 нм.
Результаты измерения продукции ИФН-гамма на 15-й день после иммунизации испытуемых животных аденовирусными конструкциями представлены графически на Фиг. 5 в виде прироста концентрации ИФН-гамма (разы) при сравнении клеток, стимулированных рекомбинантным полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2, с интактными клетками.
По результатам исследования было показано, что введение полученных конструкций животным приводит высокому уровню индукции экспрессии ИФН-гамма спленоцитами при стимуляции рекомбинантным белком S вируса SARS-CoV-2, что свидетельствует о формировании специфического Т-клеточного иммунитета.
Пример 12. Способ использования разработанных иммунобиологических средств на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го серотипа, содержащих оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белка S и RBD-G) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:5 путем их одновременного введения в организм млекопитающих, для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 7. Комбинация иммунобиологических средств была выбрана исходя из примеров 8 и 11.
Все животные были разделены на 17 групп (по 5 животных), которым внутримышечно вводили:
1. фосфатный буфер (100 мкл)
2. Ad5-null 105 вирусных частиц/мышь
3. Ad5-null 106 вирусных частиц/мышь
4. Ad5-null 107 вирусных частиц/мышь
5. Ad5-null 108 вирусных частиц/мышь
6. Ad5-null 109 вирусных частиц/мышь
7. Ad5-null 1010 вирусных частиц/мышь
8. Ad5-null 5*1010 вирусных частиц/мышь
9. Ad5-null 1011 вирусных частиц/мышь
10. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 105 вирусных частиц/мышь
11. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 106 вирусных частиц/мышь
12. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 107 вирусных частиц/мышь
13. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 108 вирусных частиц/мышь
14. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 109 вирусных частиц/мышь
15. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 1010 вирусных частиц/мышь
16. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 5*1010 вирусных частиц/мышь
17. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 1011 вирусных частиц/мышь
Результаты представлены в таблицах 8 и 9.
Таблица 8 - Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей контрольных групп
Группа животных Среднее геометрическое значение титра антител к белку S SARS-CoV-2
фосфатный буфер 0
Ad5-null 105 вирусных частиц/мышь 0
Ad5-null 106 вирусных частиц/мышь 0
Ad5-null 107 вирусных частиц/мышь 0
Ad5-null 108 вирусных частиц/мышь 0
Ad5-null 109 вирусных частиц/мышь 0
Ad5-null 1010 вирусных частиц/мышь 0
Ad5-null 5*1010 вирусных частиц/мышь 0
Ad5-null 1011 вирусных частиц/мышь 0
Таблица 9 - Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей опытных групп
Группа животных, вирусных частиц/мышь Среднее геометрическое значение титра антител к белку S SARS-CoV-2
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 105 0
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 106 1:14263
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 107 1:99334
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 108 1:131072
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 109 1:172951
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 1010 1:301124
Ad5-S-CoV-2+Ad5-RBD-G-CoV-2 5*1010 1:345901
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 1011 1:524288
Таким образом, результаты эксперимента полностью подтвердили, что одновременная иммунизация разработанными иммунобиологическими средствами индуцирует гуморальный иммунный ответ к гликопротеину SARS-CoV-2 в диапазоне доз от 106 вирусных частиц/мышь до 1011 вирусных частиц/мышь. При этом, очевидно, что увеличение доз будет приводить к увеличению титра антител в крови млекопитающих до наступления токсического эффекта.
Пример 13 Способ использования разработанного иммунобиологического средства путем последовательно введения в организм млекопитающих через различные интервалы времени в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
В данном примере описан способ использования разработанного иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, S-del, RBD, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 путем их последовательного введения в организм млекопитающих с интервалом в 1 неделю или с интервалом в 3 недели для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 7.
Все животные были разделены на 28 группы (по 3 животных), которым внутримышечно вводили:
1. фосфатный буфер (100 мкл), а через неделю фосфатный буфер (100мкл)
2. Ad5-null 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-null 108БОЕ/мышь
3. Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
4. Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
5. Ad5-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
6. Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
7. Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
8. Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
9. Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
10. Ad26-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
11. Ad26-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
12. Ad26-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
13. Ad26-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
14. Ad26-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
15. фосфатный буфер (100 мкл), а через 3 недели фосфатный буфер (100мкл)
16. Ad5-null 108БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-null 108БОЕ/мышь
17. Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
18. Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
19. Ad5-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
20. Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
21. Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
22. Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
23. Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
24. Ad26-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad26-S-del-CoV-2 108БОЕ/мышь
25. Ad26-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad26-S-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
26. Ad26-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad26-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь
27. Ad26-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad26-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь
28. Ad26-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad26-RBD-Fc-CoV-2 108БОЕ/мышь
Результаты представлены в таблице 10.
Таблица 10 - Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей
2 иммунизация
с интервалом в 1 неделю с интервалом в 2 недели
ФСБ/ФСБ 0 0
Ad5-null/ Ad5-null 0 0
Ad5-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2 1:32768 1:41285
Ad5-S-del-CoV-2/ Ad5-S-del-CoV-2 1:41285 1:52016
Ad5-S-Fc-CoV-2/ Ad5-S-Fc-CoV-2 1:82570 1:104032
Ad5-RBD-CoV-2/ Ad5-RBD-CoV-2 1:65536 1:82570
Ad5-RBD-G-CoV-2/ Ad5-RBD-G-CoV-2 1:65536 1:82570
Ad5-RBD-Fc-CoV-2/ Ad5-RBD-Fc-CoV-2 1:65536 1:104032
Ad26-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2 1:26008 1:32768
Ad26-S-del-CoV-2/ Ad26-S-del-CoV-2 1:52016 1:65536
Ad26-S-Fc-CoV-2/ Ad26-S-Fc-CoV-2 1:26008 1:52016
Ad26-RBD-CoV-2/ Ad26-RBD-CoV-2 1:20643 1:26008
Ad26-RBD-G-CoV-2/ Ad26-RBD-G-CoV-2 1:41285 1:52016
Ad26-RBD-Fc-CoV-2/ Ad26-RBD-Fc-CoV-2 1:13004 1:16384
Таким образом, результаты эксперимента подтверждают, что последовательная иммунизация разработанным иммунобиологическим средством приводит к более высоким уровням иммунного ответа, по сравнению с однократной иммунизацией. Специалисту среднего уровня очевидно, что конечная схема иммунизации готовым препаратом опирается на многолетние исследования и часто корректируется непосредственно врачом, она зависит от многих факторов, в том числе от целевой группы пациентов, их возраста, эпидемиологической ситуации и пр.
Пример 14 Способ использования разработанного иммунобиологического средства путем последовательно введения в организм млекопитающих с интервалом в одну неделю в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2
В данном примере описан способ использования разработанного иммунобиологического средства основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа и рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, путем их последовательного введения в организм млекопитающих с интервалом в 1 неделю для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 7.
Все животные были разделены на 9 групп (по 5 животных), которым внутримышечно вводили:
фосфатный буфер (100 мкл), затем через неделю фосфатный буфер (100мкл), затем через неделю фосфатный буфер (100мкл)
Ad5-null 108БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-null 108БОЕ/мышь, , затем через неделю Ad5-null 108БОЕ/мышь
Ad26-null 108БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-null 108БОЕ/мышь, , затем через неделю Ad26-null 108БОЕ/мышь
Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь
Результаты представлены в таблице 11.
Таблица 11 - Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей
Группа животных Титр антител
ФСБ/ФСБ/ФСБ 0
Ad5-null/ Ad5-null/ Ad5-null 0
Ad26-null/ Ad26-null/ Ad26-null 0
Ad5-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2 1:150562
Ad5-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2 1:301124
Ad5-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2 1:228209
Ad26-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2 1:172950
Ad26-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2 1:262144
Ad26-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2 1:301124
Таким образом, результаты данного эксперимента на примере разработанного иммунобиологического средства основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го или 26-го серотипа, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность белка S SARS-CoV-2 показали, что 3х кратное последовательное введение любых вариантов данного средства приводит к более сильному иммунному ответу на антиген, по сравнению с однократным и двукратным введением. Специалисту среднего уровня очевидно, что разработанное иммунобиологическое средство можно вводить многократно, что будет приводить к увеличению титра антител в крови млекопитающих до наступления токсического эффекта. Необходимое количество иммунизаций может отличаться в зависимости от целевой категории населения (их национальной принадлежности, возраста, работы и пр.). Кратность иммунизации определяется также экономической целесообразностью.
Пример 15 Способ использования разработанного иммунобиологического средства путем однократного введения в организм млекопитающих различными способами в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
В данном примере описан способ использования разработанного иммунобиологического средства основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа и рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, путем их однократного введения в организм млекопитающих 3 способами (интраназально, подкожно, внутримышечно) для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 7.
Все животные были разделены на 15 групп (по 3 животных), которым вводили:
ФСБ интраназально
ФСБ подкожно
ФСБ внутримышечно
Ad5-null 109БОЕ/мышь интраназально
Ad5-null 109БОЕ/мышь подкожно
Ad5-null109БОЕ/мышь внутримышечно
Ad26-null 109БОЕ/мышь интраназально
Ad26-null 109БОЕ/мышь подкожно
Ad26-null 109БОЕ/мышь внутримышечно
Ad5-S-CoV-2 109БОЕ/мышь интраназально
Ad5-S-CoV-2 109БОЕ/мышь подкожно
Ad5-S-CoV-2 109БОЕ/мышь внутримышечно
Ad26-S-CoV-2 109БОЕ/мышь интраназально
Ad26-S-CoV-2 109БОЕ/мышь подкожно
Ad26-S-CoV-2 109БОЕ/мышь внутримышечно
Результаты представлены в таблице 12.
Таблица 12 - Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей
Группа животных Титр антител
ФСБ интраназально 0
ФСБ подкожно 0
ФСБ внутримышечно 0
Ad5-null интраназально 0
Ad5-null подкожно 0
Ad5-null внутримышечно 0
Ad26-null интраназально 0
Ad26-null подкожно 0
Ad26-null внутримышечно 0
Ad5-S-CoV-2 интраназально 1:16384
Ad5-S-CoV-2 подкожно 1:26008
Ad5-S-CoV-2 внутримышечно 1:57052
Ad26-S-CoV-2 интраназально 1:13004
Ad26-S-CoV-2 подкожно 1:24300
Ad26-S-CoV-2 внутримышечно 1:43238
Таким образом, результаты данного эксперимента подтверждают возможность использования разработанного иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 путем его интраназального, внутримышечного или подкожного введения.
Промышленная применимость
Преимуществом заявленного технического решения является использование таких доз рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих ген полноразмерного белка, которые позволяют повысить иммуногенность, но при которых еще не наблюдаются токсические эффекты на животных. Также к преимуществам можно отнести дополнительное возрастание иммуногенности рецептор-связывающего домена гена S вируса SARS-CoV-2 за счет присоединения лидерной последовательности для секреции белка из клетки во внешнюю среду. Одним из преимуществ заявленного технического решения является наличие адекватного Т-клеточного ответа (как CD4+, так и CD8+) на введение антигена.
Таким образом, создано иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа, содержащее аденовирус человека 5-го серотипа с делетированными Е1/Е3 областями и встроенную генетическую конструкцию, кодирующую разработанные оптимальные аминокислотные последовательности протективного антигена S вируса SARS-CoV-2.
Также, создано иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее аденовирус человека 26-го серотипа с делетированными Е1/Е3 областями, замененной открытой рамкой считывания 6 на открытую рамку считывания аденовируса человека 5-го серотипа и с встроенной генетической конструкцией, кодирующей разработанные оптимальные аминокислотные последовательности протективного антигена S вируса SARS-CoV-2. При этом кодирующие последовательности различных форм белка S вируса SARS-CoV-2 экспрессируются рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами непосредственно в организме субъекта.
Разработанное иммунобиологическое средство может рассматриваться в качестве препарата для доклинических исследований, как противовирусная вакцина, которая способна эффективно защищать человека от заражения коронавирусом SARS-CoV-2. Предложена технология производства такой вакцины.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи" Минздрава России
<120> Иммунобиологическое средство и способ его использования
для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого
острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты).
<160> 5
<170> BISSAP1.3.6
<210> 1
<211> 1273
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205 1210 1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 2
<211> 1255
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 2
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205 1210 1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys
1250 1255
<210> 3
<211> 1445
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 3
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Thr Met Val
1205 1210 1215
Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1220 1225 1230
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
1235 1240 1245
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
1250 1255 1260
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
1265 1270 1275 1280
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
1285 1290 1295
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
1300 1305 1310
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
1315 1320 1325
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
1330 1335 1340
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
1345 1350 1355 1360
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
1365 1370 1375
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
1380 1385 1390
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
1395 1400 1405
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
1410 1415 1420
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
1425 1430 1435 1440
Leu Ser Pro Gly Lys
1445
<210> 4
<211> 236
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 4
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Arg Val Gln
1 5 10 15
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
20 25 30
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
35 40 45
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
50 55 60
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
65 70 75 80
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
85 90 95
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
100 105 110
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
115 120 125
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
130 135 140
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
145 150 155 160
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
165 170 175
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
180 185 190
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
195 200 205
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
210 215 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
225 230 235
<210> 5
<211> 291
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 5
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Arg Val Gln
1 5 10 15
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
20 25 30
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
35 40 45
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
50 55 60
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
65 70 75 80
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
85 90 95
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
100 105 110
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
115 120 125
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
130 135 140
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
145 150 155 160
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
165 170 175
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
180 185 190
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
195 200 205
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
210 215 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Lys Leu Ser Ser
225 230 235 240
Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile
245 250 255
Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu
260 265 270
Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg
275 280 285
Leu Gly Lys
290
<210> 6
<211> 468
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 6
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Arg Val Gln
1 5 10 15
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
20 25 30
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
35 40 45
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
50 55 60
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
65 70 75 80
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
85 90 95
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
100 105 110
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
115 120 125
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
130 135 140
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
145 150 155 160
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
165 170 175
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
180 185 190
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
195 200 205
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
210 215 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Thr Met Val Arg
225 230 235 240
Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465
<---

Claims (10)

1. Иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С’-конце гена (SEQ ID NO:2).
2. Иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (SEQ ID NO:3).
3. Иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида вируса (SEQ ID NO:4).
4. Иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита (SEQ ID NO:5).
5. Иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (SEQ ID NO:6).
6. Иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 на основании последовательностей генов белка S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO:1) в комбинации с иммунобиологическим средством по п.1, и/или 2, и/или 3, и/или 4, и/или 5.
7. Способ индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, включающий введение в организм млекопитающих одного или более средств по п.1, и/или 2, и/или 3, и/или 4, и/или 5, и/или 6 в эффективном количестве.
8. Способ по п.7, где последовательно вводят в организм млекопитающих два различных иммунобиологических средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или два различных иммунобиологических средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа по п. 1, и/или 2, и/или 3, и/или 4, и/или 5, и/или 6 с интервалом более чем в 1 неделю.
9. Способ по п.7, где последовательно вводят в организм млекопитающих любое из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа и любое из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа по п. 1, и/или 2, и/или 3, и/или 4, и/или 5, и/или 6 с интервалом более чем в 1 неделю, или в последовательном введении в организм млекопитающих любого из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа и любого из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа по п. 1, и/или 2, и/или 3, и/или 4, и/или 5, и/или 6 с интервалом более чем в 1 неделю.
10. Способ по п.7, где одновременно вводят в организм млекопитающих любые два иммунобиологических средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го или 26-го серотипа по п. 1, и/или 2, и/или 3, и/или 4, и/или 5, и/или 6.
RU2020114424A 2020-04-23 2020-04-23 Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты) RU2720614C9 (ru)

Priority Applications (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020114424A RU2720614C9 (ru) 2020-04-23 2020-04-23 Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты)
KR1020227005787A KR20230005102A (ko) 2020-04-23 2020-07-13 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위한 면역생물제
MX2022002194A MX2022002194A (es) 2020-04-23 2020-07-13 Agente immunobiologico para inducir inmunidad especifica contra el virus de sindrome respiratorio agudo severo sars-cov-2.
BR112022003154A BR112022003154A2 (pt) 2020-04-23 2020-07-13 Agente imunobiológico para induzir a imunidade específica contra o vírus da síndrome respiratória aguda grave sars-cov-2
US17/427,745 US20220305111A1 (en) 2020-04-23 2020-07-13 Immunobiological agent for inducing specific immunity against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2
EP20834701.3A EP4010017A4 (en) 2020-04-23 2020-07-13 IMMUNOBIOLOGICAL AGENT FOR INDUCING SPECIFIC IMMUNITY AGAINST THE VIRUS OF SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME SARS-COV-2
EA202000368A EA037903B1 (ru) 2020-04-23 2020-07-13 ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ИНДУКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ВИРУСА ТЯЖЕЛОГО ОСТРОГО РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА SARS-CoV-2 (ВАРИАНТЫ)
PCT/RU2020/000344 WO2021002776A1 (en) 2020-04-23 2020-07-13 Immunobiological agent for inducing specific immunity against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2
CN202080068594.3A CN115052624A (zh) 2020-04-23 2020-07-13 用于诱导针对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的免疫生物剂
CA3156350A CA3156350A1 (en) 2020-04-23 2020-07-13 IMMUNOBIOLOGICAL AGENT FOR INDUCING SPECIFIC IMMUNITY AGAINST SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS 2 (SARS-COV-2)
JP2022520116A JP2023501879A (ja) 2020-04-23 2020-07-13 重症急性呼吸器症候群ウイルスｓａｒｓ－ｃｏｖ－２に対する特異的免疫を誘導するための免疫生物学的製剤
ARP210101104A AR121931A1 (es) 2020-04-23 2021-04-23 AGENTE INMUNOBIOLÓGICO Y MÉTODO DE UTILIZACIÓN DEL MISMO PARA INDUCIR INMUNIDAD ESPECÍFICA CONTRA EL VIRUS DEL SÍNDROME RESPIRATORIO AGUDO SEVERO SARS-CoV-2 (VARIANTES)
IL290787A IL290787A (en) 2020-04-23 2022-02-21 Immunobiological agent and method of its use for inducing specific immunity against the severe respiratory syndrome virus sars-cov-2 (embodiment)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020114424A RU2720614C9 (ru) 2020-04-23 2020-04-23 Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2720614C1 RU2720614C1 (ru) 2020-05-12
RU2720614C9 true RU2720614C9 (ru) 2021-02-09

Family

ID=70735097

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020114424A RU2720614C9 (ru) 2020-04-23 2020-04-23 Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты)

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20220305111A1 (ru)
EP (1) EP4010017A4 (ru)
JP (1) JP2023501879A (ru)
KR (1) KR20230005102A (ru)
CN (1) CN115052624A (ru)
AR (1) AR121931A1 (ru)
BR (1) BR112022003154A2 (ru)
CA (1) CA3156350A1 (ru)
EA (1) EA037903B1 (ru)
IL (1) IL290787A (ru)
MX (1) MX2022002194A (ru)
RU (1) RU2720614C9 (ru)
WO (1) WO2021002776A1 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2761904C1 (ru) * 2021-11-26 2021-12-13 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей
RU2765729C1 (ru) * 2021-12-29 2022-02-02 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа против SARS-CoV-2 и способ его применения (варианты)
RU2810476C1 (ru) * 2022-12-29 2023-12-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Широко нейтрализующее антитело против SARS-CoV-2

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022003719A2 (en) * 2020-07-03 2022-01-06 Indian Institute Of Science POLYPEPTIDE FRAGMENTS, IMMUNOGENIC COMPOSITION AGAINST SARS-CoV-2, AND IMPLEMENTATIONS THEREOF
RU2733834C1 (ru) * 2020-07-28 2020-10-07 Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) Искусственный ген EctoS_SC2, кодирующий эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с C-концевым тримеризующим доменом, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-EctoS_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2
RU2733832C1 (ru) * 2020-07-28 2020-10-07 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) Искусственный ген Stbl_RBD_TrM_SC2, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецепторсвязывающего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, трансмембранного региона, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2
RU2745774C1 (ru) * 2020-08-14 2021-03-31 Алексей Викторович Марочков Способ лечения пациентов с новой коронавирусной инфекцией (covid-19)
CN114728055A (zh) * 2020-08-22 2022-07-08 俄罗斯联邦卫生部的联邦国家预算机构“以名誉院士N.F.加马列亚命名的国家流行病学和微生物学研究中心” 用于诱导针对sars-cov-2的特异性免疫的药物制剂
CN112618707B (zh) * 2020-10-15 2023-07-04 广州达博生物制品有限公司 一种SARS-CoV-2冠状病毒疫苗及其制备方法
WO2022119481A1 (ru) * 2020-12-03 2022-06-09 Антон Иосифович ОРЛОВ Вакцина для профилактики и лечения коронавирусной инфекции
CN112646781B (zh) * 2020-12-25 2023-07-25 广东省人民医院 一种包含人ace2蛋白的外泌体及其应用
RU2771288C1 (ru) * 2021-02-02 2022-04-29 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 2E1B5 - продуцент моноклонального антитела к рецептор-связывающему домену белка S вируса SARS-CoV-2
RU2769817C1 (ru) * 2021-02-15 2022-04-06 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 1F1 - продуцент моноклонального антитела к нуклеокапсидному белку N вируса SARS-CoV-2
EP4291212A1 (en) 2021-02-15 2023-12-20 LivingMed Biotech S.R.L. Genetically clostridium modifiedstrains expressing recombinant antigens and uses thereof
US11857621B2 (en) 2021-05-18 2024-01-02 Imam Abdulrahman Bin Faisal University Synthetic pDNA vaccines against COVID-19
RU2751485C1 (ru) * 2021-06-14 2021-07-14 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации Вакцина против гриппа типа А, гриппа типа B и COVID-19
WO2023018384A1 (en) * 2021-08-13 2023-02-16 Chulalongkorn University A vaccine composition against coronavirus infection
WO2023019309A1 (en) * 2021-08-17 2023-02-23 Monash University Vaccine compositions
AR123532A1 (es) * 2021-09-16 2022-12-14 Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecn Conicet Vacuna contra coronavirus, cepas de levadura, métodos de detección, métodos de tratamiento y usos
TW202334429A (zh) 2021-10-01 2023-09-01 中央研究院 Sars-cov-2棘蛋白特異性抗體及其用途
US11654121B1 (en) 2022-06-22 2023-05-23 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Combination therapies for the treatment of viral infections
WO2023250111A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Combination therapies for the treatment of viral infections
KR20230074664A (ko) 2023-05-03 2023-05-31 김승찬 코로나19 변이＆전사 방지 말단결합 헤어핀 상보적 dna 염기조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080267992A1 (en) * 2004-06-04 2008-10-30 Cancer Center, Sun Yat-Sun University Sars Virus Vaccine with Adenovirus Carrier and Preparation Method Thereof, and Use of Sars Virus S Gene for Preparation of Vaccine
RU2510281C2 (ru) * 2012-06-22 2014-03-27 Общество с ограниченной ответственностью "Эпитоп" (ООО "Эпитоп") ВАКЦИНА ПРОТИВ ПНЕВМОНИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ Streptococcus pneumoniae, НА ОСНОВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА
KR20200032050A (ko) * 2020-03-05 2020-03-25 김승찬 COVID-19 바이러스 맞춤형 삼중 knockout DNA 치료제

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201108879D0 (en) * 2011-05-25 2011-07-06 Isis Innovation Vector
EP3439695B1 (en) * 2016-04-04 2022-05-04 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Multivalent vaccines for rabies virus and coronaviruses
EP3472327B1 (en) * 2016-06-20 2020-08-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and balanced bidirectional promoter
GB2549809C (en) * 2016-06-23 2022-11-30 Univ Oxford Innovation Ltd Vector
CN110974950B (zh) * 2020-03-05 2020-08-07 广州恩宝生物医药科技有限公司 一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080267992A1 (en) * 2004-06-04 2008-10-30 Cancer Center, Sun Yat-Sun University Sars Virus Vaccine with Adenovirus Carrier and Preparation Method Thereof, and Use of Sars Virus S Gene for Preparation of Vaccine
RU2510281C2 (ru) * 2012-06-22 2014-03-27 Общество с ограниченной ответственностью "Эпитоп" (ООО "Эпитоп") ВАКЦИНА ПРОТИВ ПНЕВМОНИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ Streptococcus pneumoniae, НА ОСНОВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА
KR20200032050A (ko) * 2020-03-05 2020-03-25 김승찬 COVID-19 바이러스 맞춤형 삼중 knockout DNA 치료제

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIANG MF et al. SARS patients-derived human recombinant antibodies to S and M proteins efficiently neutralize SARS-coronavirus infectivity, Biomed Environ Sci., 2005, 18(6), 363-374. База данных: NCBI Reference Sequence: YP_009724390.1, 30.03.2020. *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2761904C1 (ru) * 2021-11-26 2021-12-13 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей
WO2022197209A1 (en) * 2021-11-26 2022-09-22 Federal State Budgetary Institution "National Research Centre For Epidemiology And Microbiology Named After The Honorary Academician N. F. Gamaleya" Of The Ministry Of Health Of The Russian Federation Induction of immunity to sars-cov-2 in children
RU2765729C1 (ru) * 2021-12-29 2022-02-02 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа против SARS-CoV-2 и способ его применения (варианты)
WO2023128799A1 (ru) * 2021-12-29 2023-07-06 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Национальный Исследовательский Центр Эпидемиологии И Микробиологии Имени Почетного Академика Н.Ф.Гамалеи" Министерства Здравоохранения Российской Федерации ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ИНДУКЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРОТИВ SARS-CoV-2 И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ (ВАРИАНТЫ)
RU2810476C1 (ru) * 2022-12-29 2023-12-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Широко нейтрализующее антитело против SARS-CoV-2

Also Published As

Publication number Publication date
CN115052624A (zh) 2022-09-13
EA202000368A1 (ru) 2021-06-02
AR121931A1 (es) 2022-07-27
CA3156350A1 (en) 2021-01-07
EP4010017A4 (en) 2022-12-07
EA037903B1 (ru) 2021-06-03
IL290787A (en) 2022-04-01
RU2720614C1 (ru) 2020-05-12
MX2022002194A (es) 2022-05-24
US20220305111A1 (en) 2022-09-29
BR112022003154A2 (pt) 2022-11-16
WO2021002776A1 (en) 2021-01-07
JP2023501879A (ja) 2023-01-20
KR20230005102A (ko) 2023-01-09
EP4010017A1 (en) 2022-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2720614C9 (ru) Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты)
WO2021184560A1 (zh) 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗
ES2716010T3 (es) Métodos y composiciones para la proteína IL-10 de citomegalovirus
WO2021076010A1 (en) Pharmaceutical agent for inducing specific immunity against sars-cov-2
Rice et al. A next generation bivalent human Ad5 COVID-19 vaccine delivering both spike and nucleocapsid antigens elicits Th1 dominant CD4+, CD8+ T-cell and neutralizing antibody responses
Kohlmann et al. Protective efficacy and immunogenicity of an adenoviral vector vaccine encoding the codon-optimized F protein of respiratory syncytial virus
JP2016136950A (ja) ベータヘルペスウイルス感染に対するワクチンおよびその使用
JP7319368B2 (ja) アデノウイルスおよびアデノウイルスを使用するための方法
EP4205761A1 (en) Novel coronavirus recombinant spike protein, polynucleotide encoding same, vector comprising polynucleotide, and vaccine for preventing or treating coronavirus infection, comprising vector
RU2709659C1 (ru) Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета к вирусу ближневосточного респираторного синдрома (варианты)
Rice et al. The Dual-Antigen Ad5 COVID-19 Vaccine Delivered as an Intranasal Plus Subcutaneous Prime Elicits Th1 Dominant T-Cell and Humoral Responses in CD-1 Mice
US11806395B2 (en) Epstein-Barr virus-like particles with broadened antigenic spectrum
CA3152658A1 (en) Expression vector against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2
KR20220083773A (ko) 암 항원을 포함하는 개선된 lamp 구축물
RU2782528C1 (ru) Аденовирусы и способы применения аденовирусов
RU2811791C1 (ru) Экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 19 серотипа и способ его применения
JP7360544B2 (ja) Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２に対する特異的免疫を誘導するための医薬品
US20220370600A1 (en) Multigenic mva-sars-cov-2 vaccine
Cicin-Sain et al. MCMV based vaccine vectors expressing full-length viral proteins provide long-term humoral immune protection upon a single-shot vaccination
Muralidharan et al. Targeting CD40 enhances antibody-and CD8-mediated protection against respiratory syncytial virus infection
WO2023128799A1 (ru) ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ИНДУКЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРОТИВ SARS-CoV-2 И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ (ВАРИАНТЫ)
WO2022197209A1 (en) Induction of immunity to sars-cov-2 in children
CA3156264A1 (en) Utilization of an agent for induction of specific immunity against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2 in children
WO2021178844A1 (en) Zika and flavivirus immunogenic compositions and their use
Wussow et al. Human Cytomegalovirus Vaccine Based on the Envelope gH/gL Pentamer

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Reissue of patent specification
TC4A Change in inventorship

Effective date: 20210215