RU2733832C1 - Искусственный ген Stbl_RBD_TrM_SC2, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецепторсвязывающего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, трансмембранного региона, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 - Google Patents
Искусственный ген Stbl_RBD_TrM_SC2, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецепторсвязывающего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, трансмембранного региона, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2733832C1 RU2733832C1 RU2020125809A RU2020125809A RU2733832C1 RU 2733832 C1 RU2733832 C1 RU 2733832C1 RU 2020125809 A RU2020125809 A RU 2020125809A RU 2020125809 A RU2020125809 A RU 2020125809A RU 2733832 C1 RU2733832 C1 RU 2733832C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cov
- rbd
- sars
- coronavirus
- stbl
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Описан искусственный ген Stbl_RBD_TrM_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2, кодирующий искусственный белок-иммуноген, представляющий собой бицистронную структуру, состоящую из последовательностей рецепторсвязывающего домена (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, гетерологического сигнального пептида гемагглютинина (HA) вируса гриппа А, трансмембранного региона, линкера, P2A-пептида для расщепления полипротеина во время трансляции и гликопротеина G с мутацией M(1)>P(1), предотвращающей альтернативную инициацию трансляции, представленных в SEQ ID NO:1 длиной 2463 п.н. Описана рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, имеющая молекулярную массу 8,92⋅106 дальтон, размер 14417 п.н., представленная на Фиг. 2. Представлен штамм rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, полученный с использованием рекомбинантной плазмиды pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, обеспечивающий независимый синтез коронавирусного антигена (рецепторсвязывающий домен гликопротеина S SARS-CoV-2 с трансмембранным регионом) и белка G вируса везикулярного стоматита, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 и депонированный в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-983. Техническим результатом является улучшение фолдинга трансмембранного иммуногена, повышение стабильности целевого трансгена и иммуногенных/антигенных свойств заявляемого рекомбинантного вируса. 3 н.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к искусственному гену, кодирующему бицистронную структуру, образованную последовательностями рецептор-связывающего домена (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, трансмембранного региона, P2A-пептида и гликопротеина G вируса везикулярного стоматита, рекомбинантной плазмиде, обеспечивающей экспрессию указанного искусственного гена, и рекомбинантному штамму вируса везикулярного стоматита, экспрессирующему антигены коронавируса SARS-CoV-2, индуцирующему специфический иммунный ответ к SARS-CoV-2 и используемому для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 и может быть использовано в биотехнологии, молекулярной биологии, генетической инженерии и медицине.
Известно решение по патенту (US, 20190062785A1, МПК A61K 39/215, А61K39/205; C12N15/86, опубл. 28.02.2019 г.), где описана вакцина на основе рекомбинантного вируса бешенства, которая обеспечивает защиту против бешенства и тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV). Транскрипционная кассета локализована в межгенном регионе N и P, что гарантирует высокий уровень экспрессии трансгена за счет особенностей организации генома рабдовирусов. В патенте раскрыты основные существующие подходы дизайна целевых коронавирусных иммуногенов/антигенов, такие как полноразмерный гликопротеин S, вариант с усеченным цитоплазматическим доменом (Δ19), а также рецептор-связывающий домен RBD с трансмембранным регионом и цитоплазматическим доменом вируса бешенства.
Однако использование данного вектора осложнено остаточной нейровирулентностью и возможными побочными эффектами. В тоже время использование функционального гликопротеина S коронавирусов в качестве иммуногена может привести к созданию рекомбинантного вируса бешенства, обладающего двойной тропностью за счет экспонированных вирусных гликопротеинов. Недостатком данного решения также является использование антигенов вируса SARS-CoV, что, вероятно, не позволит сформировать противовирусный иммунитет против нового коронавируса SARS-CoV-2.
Известно иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С’-конце гена (RU, 2720614, МПК A61K39/215; A61P31/12, опубл. 12.05.2020 г.), или последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1, или последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида вируса, или последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита, или последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1, или их комбинации.
Однако показано, что использование векторов на основе циркулирующих в человеческой популяции агентов (аденовирусы, герпесвирусы, респираторно-синцитиальный вирус и т.д.) может быть осложнено наличием специфического иммунитета против вируса «дикого типа», в результате чего не будет происходить достаточного продуктивного инфицирования клеток рекомбинантным вирусом, и как следствие, не будет эффективно обеспечена экспрессия целевого трансгена.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является решение по патенту (CN, 111088283A, МПК A61K 39/215; A61P 31/14; C12N 15/86; опубл. 01.05.2020 г.), где предложены вирусные векторы на основе аттенуированного вируса везикулярного стоматита, в котором химерный ген гетерологичного антигена локализован между генами G и L. В патенте также раскрываются классические подходы дизайна целевых коронавирусных иммуногенов/антигенов (кодон-оптимизация, полноразмерный S (Spike), RBD). В патенте раскрывается подход получения химерных поверхностных гликопротеинов вируса везикулярного стоматита, с целью индукции иммунитета на коронавирусный компонент.
Недостатком данного решения является дизайн иммуногенов в виде N- и C-концевых слитых белков, что может сказаться на фолдинге коронавирусных антигенных компонентов и инфекционном титре рекомбинантного вируса. Также нерешенным остается вопрос стабильности целевых трансгенов в составе РНК-содержащих вирусов, что может повлечь снижение иммуногенных/антигенных свойств и/или изменение тропизма и вирулентных свойств рекомбинантных вирусов.
Таким образом, в уровне техники существует острая потребность в разработке новых рекомбинантных вакцин от коронавирусной инфекции COVID-19 (SARS-CoV-2).
Раскрытие изобретения
Целью заявленного изобретения является создание рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, обеспечивающего экспрессию антигенов коронавируса SARS-CoV-2, и индуцирующего специфический иммунный ответ к SARS-CoV-2.
Техническим результатом является улучшение фолдинга трансмембранного иммуногена, повышение стабильности целевого трансгена и иммуногенных/антигенных свойств заявляемого рекомбинантного вируса.
Указанный технический результат достигается созданием искусственного гена Stbl_RBD_TrM_SC2, используемого для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2, кодирующего искусственный белок-иммуноген, представляющий собой бицистронную структуру, состоящую из последовательностей рецептор-связывающего домена (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, гетерологического сигнального пептида гемагглютинина (HA) вируса гриппа А, трансмембранного региона, линкера, P2A-пептида для расщепления полипротеина во время трансляции, и гликопротеина G с мутацией M(1)>P(1), предотвращающей альтернативную инициацию трансляции, представленных в SEQ ID NO:1 длиной 2463 п.н.
Указанный технический результат достигается также созданием рекомбинантной плазмиды pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, используемой для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2, имеющей молекулярную массу 8,92⋅106 дальтон, размер 14417 п.н. и содержащей в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 2 целевой ген по п. 1, кодирующий искусственный белок-иммуноген RBD гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с трансмембранным регионом, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 длиной 820 а.к.о. и находящийся под контролем вирусного промотора, обеспечивающего его экспрессию в клетках млекопитающих и состоящая из следующих фрагментов:
- ORI - (ORI, origin of replication) точка начала репликации плазмидного вектора pUC (координаты 13591-14179 п.н.);
- AmpR - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость трансформантов E.coli к селективному антибиотику ампициллину (координаты 12560-13420 п.н.);
- T7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага T7, необходимая для транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 166-183 п.н.);
- T7 terminator - нуклеотидная последовательность терминатора бактериофага T7, необходимая для терминации транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 12332-12438 п.н.);
- HDV-Rbz - нуклеотидная последовательность рибозима HDV, которая после транскрибирования отщепляется с формированием аутентичной 3’-концевой некодирующей последовательности (координаты 12245-12327 п.н.);
- N - открытая рамка считывания гена N (нуклеопротеин) (координаты 247-1515 п.н.);
- P - открытая рамка считывания гена P (фосфопротеин) (координаты 1579-2376 п.н.);
- L - открытая рамка считывания гена L (РНК-зависимая РНК-полимераза) (координаты 5816-12145 п.н.);
- VSV-G - открытая рамка считывания гликопротеина G с мутацией M(1)>P(1) (координаты 4198-5730 п.н.);
- P2A - 2A-пептид тешовируса-1, обеспечивающий расщепление полипротеина на этапе трансляции (координаты 4138-4197 п.н.);
- Transmembrane region -трансмембранный регион гликопротеина S SARS-CoV-2, обеспечивающий экспонирование целевого антигена на поверхности клеток и вирионов (координаты 4045-4122 п.н.);
- Signal peptide - сигнальный пептид гемагглютинина (HA) вируса гриппа А, обеспечивающий эффективный внутриклеточный транспорт синтезируемого полипротеина (координаты 3268-3321 п.н.);
- Spike protein - фрагмент гена S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 3322-4037 п.н.);
- Receptor-binding domain (RBD) - рецептор-связывающий домен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 3334-4002 п.н.).
Указанный технический результат достигается также созданием штамма rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, полученный с использованием рекомбинантной плазмиды pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2 по п. 2, обеспечивающего независимый синтез трансмембранного коронавирусного антигена (рецептор-связывающего домена гликопротеина S SARS-CoV-2 с трансмембранным регионом) и белка G вируса везикулярного стоматита, используемого для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 и депонированного в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под № V-983.
Существенными отличиями от прототипа, обеспечивающими достижение технического результата, являются:
1. Оптимизация искусственного гена посредством нормализации кодонного состава и исключение из последовательности элементов, оказывающих негативное влияние на уровень экспрессии и стабильности мРНК;
2. Использование гетерологичного сигнального пептида гемагглютинина (HA) вируса гриппа А, необходимого для эффективного внутриклеточного транспорта синтезируемого полипротеина;
3. Использование P2A-пептида для формирования бицистронной структуры для независимого синтеза и фолдинга коронавирусного антигена (рецептор-связывающий домен гликопротеина S SARS-CoV-2 с трансмембранным регионом) и необходимого для репродукции вируса гликопротеина G вируса везикулярного стоматита;
4. Внесение мутации M(1)>P(1) в открытую рамку считывания гликопротеина G в составе искусственного гена, необходимой для предотвращения альтернативной инициализации трансляции необходимого для репродукции вируса гликопротеина;
5. Экспонирование целевого коронавирусного антигена на поверхности клеток и вирионов за счет С-концевого трансмембранного региона.
Осуществление изобретения
Сущность заявленного изобретения поясняется чертежами. На фиг. 1 приведена схема клонирования гена, кодирующего конструкционный вариант RBD гликопротеина S в плазмидном векторе для обратной генетики вируса везикулярного стоматита pStem-rVSV_P2A_G. На фиг. 2 изображена схема конструкции рекомбинантной плазмиды pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, используемой для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2.
На фиг. 3 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:1) искусственного гена, кодирующего искусственный белок-иммуноген рецептор-связывающего домена (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c гетерологической сигнальной последовательностью гемагглютинина (HA) вируса гриппа А, трансмембранным регионом, линкером и P2A-пептидом для расщепления полипротеина во время трансляции, гликопротеином G с мутацией M(1)>P(1).
На фиг. 4 приведена аминокислотная последовательность трансмембранного рецептор-связывающего домена (RBD) гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 c гетерологической сигнальной последовательностью, трансмембранным регионом, линкером и P2A-пептидом, обеспечивающим независимый синтез коронавирусного антигена и белка G вируса везикулярного стоматита (SEQ ID NO:2).
Дизайн искусственного гена и получение рекомбинантной плазмиды. Первым этапом создания рекомбинантного вируса везикулярного стоматита для создания вакцины стал дизайн целевого антигена/иммуногена. Согласно литературным данным, наиболее перспективными вирусными компонентами, для индукции протективного иммунитета, являются поверхностный трансмембранный гликопротеин S (Spike), а также нуклеопротеин N.
В ходе проведенного биоинформатического анализа опубликованных полногеномных нуклеотидных последовательностей вируса SARS-CoV-2 (референс последовательность GenBank: NC_045512.2), а также фрагментарных нуклеотидных последовательностей, кодирующих гликопротеин S, подтверждена относительная стабильность аминокислотных последовательностей целевых антигенов.
Важно отметить, что нативный вирусный гликопротеин S представлен трансмембранным тримером, с сигналами удержания в ER/Гольджи в C-концевом фрагменте белка. С использованием онлайн инструментов SignalIP-5.0 и TMHMM был локализован эктодомен гликопротеина S, по гомологии с гликопротеином S SARS-CoV выделен рецептор-связывающий домен (RBD), с фланкирующими регионами, необходимыми для корректного фолдинга домена. Согласно литературным данным, иммунизация животных рекомбинантным белком RBD родственных коронавирусов (SARS-CoV, MERS-CoV и др.), или конструкциями, обеспечивающими его экспрессию, приводит к индукции специфических вируснейтрализующих антител.
Следовательно, экспрессия рецептор-связывающего домена (RBD) посредством рекомбинантного вируса в составе вакцины будет индуцировать синтез вирусспецифических антител к SARS-CoV-2. В изобретении предложена оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая рецептор-связывающий домен (RBD) гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 с трансмембранным регионом. Оптимизация синтетических конструкций, кодирующих рецептор-связывающий домен (RBD) гликопротеина S с трансмембранным регионом была проведена посредством нормализации кодонного состава и исключения из последовательностей элементов, оказывающие негативное влияние на уровень экспрессии или стабильность мРНК. Нуклеотидные последовательности искусственных генов были химически синтезированы и использованы для получения рекомбинантных конструкций для обратной генетики репликационно-компетентного вируса везикулярного стоматита.
Вирус везикулярного стоматита использован в качестве вектора в силу безопасности, широкого клеточного тропизма, а также из-за отсутствия предсуществующего иммунитета у большинства людей, что является необходимым требованием для проведения эффективной иммунизации. Показано, что использование векторов на основе других циркулирующих в человеческой популяции агентов (аденовирусы, герпесвирусы, респираторно-синцитиальный вирус и т.д.) может быть осложнено наличием специфического иммунитета против вируса «дикого типа», в результате чего не будет происходить продуктивного инфицирования клеток рекомбинантным вирусом и, как следствие, не будет обеспечена экспрессия целевого трансгена. Важным свойством, позволяющим рекомендовать рабдовирусы в качестве вакцинных вирусных векторов, является высокий титр накопления в перевиваемых культурах клеток (до 1010 ТЦД50/мл), а также относительно низкие иммунизирующие дозы (105 - 107 ТЦД50). Показано также, что рекомбинантные вирусы везикулярного стоматита, экспрессирующие гликопротеины гетерологичных вирусов (Эбола, Марбург, Ласса и т.д.) обеспечивают формирование протективного иммунитета в отношении широкого круга инфекционных заболеваний.
Изобретение также представляет собой штамм рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащий оптимизированную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO:1) искусственного гена, кодирующего искусственный белок-иммуноген рецептор-связывающего домена (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c гетерологической сигнальной последовательностью пептида гемагглютинина (HA) вируса гриппа А, трансмембранным регионом, линкером и P2A-пептидом для расщепления полипротеина во время трансляции, гликопротеином G с мутацией M(1)>P(1), благодаря чему достигается независимый синтез антигена SARS-CoV-2 и поверхностного белка слияния.
Способ индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2, предусматривает: 1-, 2- или 3-кратное введение в организм человека или животного одного, двух или более иммуногенных композиций на основе заявляемого штамма рекомбинантного вируса везикулярного стоматита.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Получение конструкционного варианта гликопротеина S RBD вируса SARS-CoV-2.
Прототипом для дизайна синтетической конструкции вариантов гликопротеина S, выступала аминокислотная последовательность, кодируемая геном S (Spike), представленным в депонированной полногеномной последовательности вируса SARS-CoV-2 (GenBank: NC_045512). Химерный синтетический иммуноген представляет собой трансмембранный рецептор-связывающий домен (RBD) гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 c гетерологической сигнальной последовательностью, С-концевым трансмембранным регионом, линкером и P2A-пептидом, обеспечивающим независимый синтез коронавирусного антигена и белка вируса везикулярного стоматита G (SEQ ID NO:2). При экспрессии данного варианта в эукариотических клетках происходит синтез и необходимые посттрансляционные модификации RBD гликопротеина S, после чего коронавирусный антиген транспортируется и экспонируется на клеточной мембране, что обеспечивает индукцию иммунного ответа, в том числе, на конформационные антигенные детерминанты. P2A-пептид обеспечивает отщепление коронавирусного антигена на этапе трансляции, с последующим независимым синтезом и фолдингом белка G, необходимого для репродукции вируса. Данная стратегия обеспечивает более высокую стабильность целевого трансгена за счет того, что возникновение любых мутаций, приводящих к сдвигу рамки считывания (инсерции, делеции, инверсии и т.д.), исключает возможность синтеза необходимого для полноценного репродуктивного цикла вирусного белка, находящегося после P2A-пептида.
Пример 2. Получение генетической конструкции.
Для получения генетической конструкции гликопротеина S и RBD был рассчитан оптимизированный искусственный ген с нуклеотидной последовательностью (SEQ ID NO:1, фиг. 3). Оптимизация гена была направлена на нормализацию кодонного состава искусственного гена и исключения из последовательностей элементов, оказывающих негативное влияние на уровень экспрессии или стабильность мРНК.
Нуклеотидные последовательности генов были получены методом химического синтеза ЗАО «Биокад» и ЗАО «Евроген».
Для получения рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, с формированием бицистронной структуры трансгенов с гликопротеином G посредством саморасщепляющегося P2A-пептида (для стабилизации трансгенов в составе рекомбинантных вирусов), нуклеотидная последовательность гена, кодирующего трансмембранный конструкционный вариант RBD гликопротеина S, был клонирован в плазмидном векторе для обратной генетики вируса везикулярного стоматита pStem-rVSV_P2A_G. Схема клонирования приведена на фиг. 1. Направленное клонирование проведено по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикций NheI и SmaI, располагающихся в полилинкере транскрипционной кассеты гена G в геномной кДНК последовательности. Для этого 2 мкг плазмидной ДНК pStem-rVSV_P2A_G гидролизовали эндонуклеазой рестрикции SmaI (NEB) в буфере CutSmart при 25 °C 1 час, после чего вносили 10 е.а. рестриктазы NheI (NEB) и 2 е.а. рекомбинантной щелочной фосфатазы креветок (rSAP) (NEB), необходимой для предотвращения «самолигирования» вектора, с инкубацией при 37 °C 1 час. Продукты гидролиза разделяли методом электрофореза, фрагменты ДНК, соответствующие гидролизованному вектору (~13500 п.н.), выделяли из агарозного геля с использованием коммерческого набора QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Нуклеотидную вставку, кодирующую целевой трансген, возможно подготовить посредством постановки гидролиза клонировочной плазмиды, амплификацией нуклеотидных последовательностей в LAMP или ПЦР, либо любым другим методом, доступным исследователю. Клонирование может быть проведено любым из существующих методов (лигирование, метод Гибсона, гомологической рекомбинации и др.), при этом в целевом трансгене должен присутствовать старт-кодон (ATG) в оптимальном фланкирующем контексте (консенсусная последовательность Козак; GCCACC) и не должна нарушаться рамка считывания гликопротеина G. На фиг. 1 представлена схема «тупого-липкого» клонирования трансгена, с формированием единой рамки считывания. Для этого 1 мкг гидролизованного вектора pStem-rVSV_P2A_G/SmaI+NheI смешивали с гидролизованным по NheI фрагментом ДНК трансгена в эквимолярном соотношении, добавляли реакционный буфер и T4 ДНК лигазу. После инкубации при 20 °C 1 час, лигазную смесь использовали для трансформации компетентных клеток E.coli. Скрининг клонов-трансформантов проводили с использованием методов ПЦР и рестрикционного анализа рекомбинантных плазмид.
Корректность нуклеотидных последовательностей плазмидных конструкций подтверждена секвенированием по Сэнгеру. Получена генетическая конструкция, кодирующая нуклеотидную последовательность конструкционного варианта антигена SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1, фиг. 3).
Рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2 имеет молекулярную массу 8,92⋅106 дальтон, размер 14417 п.н. и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 2 целевой искусственный ген по п. 1, кодирующий искусственный белок-иммуноген RBD гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с трансмембранным регионом, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 (фиг. 4) длиной 820 а.к.о. и находящийся под контролем вирусного промотора, обеспечивающего его экспрессию в клетках млекопитающих и состоящая из следующих фрагментов:
- ORI - (ORI, origin of replication) точка начала репликации плазмидного вектора pUC (координаты 13591-14179 п.н.);
- AmpR - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость трансформантов E.coli к селективному антибиотику ампициллину (координаты 12560-13420 п.н.);
- T7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага T7, необходимая для транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 166-183 п.н.);
- T7 terminator - нуклеотидная последовательность терминатора бактериофага T7, необходимая для терминации транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 12332-12438 п.н.);
- HDV-Rbz - нуклеотидная последовательность рибозима HDV, которая после транскрибирования отщепляется с формированием аутентичной 3’-концевой некодирующей последовательности (координаты 12245-12327 п.н.);
- N - открытая рамка считывания гена N (нуклеопротеин) (координаты 247- 1515 п.н.);
- P - открытая рамка считывания гена P (фосфопротеин) (координаты 1579- 2376 п.н.);
- L - открытая рамка считывания гена L (РНК-зависимая РНК-полимераза) (координаты 5816-12145 п.н.);
- VSV-G - открытая рамка считывания гликопротеина G с мутацией M(1)>P(1) (координаты 4198-5730 п.н.);
- P2A - 2A-пептид тешовируса-1, обеспечивающий расщепление полипротеина на этапе трансляции (координаты 4138-4197 п.н.);
- Transmembrane region -трансмембранный регион гликопротеина S SARS-CoV-2, обеспечивающий экспонирование целевого антигена на поверхности клеток и вирионов (координаты 4045-4122 п.н.);
- Signal peptide - сигнальный пептид гемагглютинина (HA) вируса гриппа А, обеспечивающий эффективный внутриклеточный транспорт синтезируемого полипротеина (координаты 3268-3321 п.н.);
- Spike protein - фрагмент гена S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 3322-4037 п.н.);
- Receptor-binding domain (RBD) - рецептор-связывающий домен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 3334-4002 п.н.).
Пример 3. Получение репликационно-компетентного штамма rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2 вируса везикулярного стоматита, экспрессирующего антиген SARS-CoV-2.
Выделение плазмидной ДНК генетической конструкции для обратной генетики вируса везикулярного стоматита, кодирующего антигены SARS-CoV-2, выполнено с использованием коммерческого набора QIAGEN Plasmid Maxi Kit, согласно инструкции производителя.
Получение репликационно-компетентного вируса везикулярного стоматита проведено с использованием методов обратной генетики в перевиваемой линии клеток Vero и/или 4647 (коллекция культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ Вектор Роспотребнадзора). Для этого монослой клеточной культуры (конфлюентность 90%) трансфецировали с использованием липофектамина 3000 (Thermo Scientific, США) полученной генетической плазмидной конструкцией pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2 совместно с хелперными плазмидами pStem-vN, pStem-vP, pStem-vL обеспечивающими экспрессию белковой репликативной машинерии вируса везикулярного стоматита (N, P и L), а также ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага T7. Количество каждой из плазмидных конструкций составило: pStem-N - 0,25 мкг; pStem-P - 0,25 мкг; pStem-L - 1,0 мкг; pStem-T7 - 1,5 мкг; pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2 (конструкционный вариант) - 2 мкг. Через сутки производили смену питательной среды на поддерживающую с 2% фетальной сыворотки крови, с последующим культивированием 48-72 часа в CO2-инкубаторе (5% CO2; 37 °C; влажная атмосфера). При оптической микроскопии по истечению срока культивирования отмечали полную деструкцию монослоя клеток. Вируссодержащую культуральную жидкость рекомбинантного вируса собирали, осветляли посредством центрифугирования (10 мин при 10 тыс об/мин), аликвотировали и хранили до использования при минус 80 °C.
Штамм идентифицирован в ФБУН ГНЦ ВБ Вектор» Роспотребнадзора в апреле 2020 г. и депонирован в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-983.
Инфекционную активность рекомбинантного вируса везикулярного стоматита оценивали при постановках классических вирусологических методов титрования в чувствительную культурах клеток Vero и/или 4647, с выражением в 50 % тканевых цитопатических дозах (ТЦД50), либо в бляшкообразующих единицах (БОЕ). При изучении культуральных свойств установлено, что полученный рекомбинантный вирус сохранил основные свойства исходного штамма вируса везикулярного стоматита (клеточная чувствительность, характер цитопатического действия, оптимальные параметры культивирования и др.).
Титр накопления в культуре клеток Vero рекомбинантного штамма вируса везикулярного стоматита, кодирующий нуклеотидную последовательность антигена SARS-CoV-2 (SEQ ID NO:1) составил - 6,67 ± 0,12 lg ТЦД50/мл.
Пример 4. Подтверждение наличия гена Stbl_RBD_TrM_SC2, кодирующего антиген SARS-CoV-2, в составе генома заявляемого штамма rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита.
Подтверждение наличия и экспрессии искусственного гена Stbl_RBD, кодирующего антиген (рецептор-связывающий домен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с трансмембранным регионом), проводили в полимеразной цепной реакции совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Выделение РНК из образцов культуральных сред, полученных после инфицирования монослоя клеток Vero рекомбинантным вирусом везикулярного стоматита, проводили с использованием набора реагентов «Рибо-преп» (Интерлабсервис, Россия) согласно инструкции производителя. Для оценки экспрессии и наличия трансгенов использовали специфические олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие открытые рамки считывания химерных генов:
F-Sig_NheI (5’-ACAAAGCTAGCCACCATGAAGGCAATACTAGTAGTTC TG-3’) и R-vG_SbfI (5’- TTTTGCCCTGCAGGAGTGCGGCCGCTTAC-3’), а также F-NCR (5’-ACGAAGACAAACAAACCATTATTATCATTAAAAGGC-3’) и R-VSV_1_seq (5’-TTGTGTTCTGCCCACTCTGT-3’).
Синтез первой цепи кДНК проводили с использованием набора реагентов «обратная транскриптаза RNAscribe RT» (Биолабмикс, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Амплификацию фрагментов кДНК вируса везикулярного стоматита проводили с Phusion-полимеразы (NEB, США) в соответствии с инструкцией производителя. Продукты амплификации анализировали посредством электрофоретического разделения в агарозном геле и последующего окрашивания гелей рабочим раствором этидия бромида (0,5 мкг/мл). Корректность открытых рамок считывания трансгенов подтверждали секвенированием по Сэнгеру элюированных из агарозного геля целевых ампликонов.
Наличие и функциональная активность гена G, кодирующего поверхностный гликопротеин вируса везикулярного стоматита подтверждается секвенированием ампликонов трансгена по Сэнгеру, а также репродукцией рекомбинантного вируса в пермиссивных клеточных линиях (Vero, 4647, BHK-21/13 и т.д.) с культуральными свойствами, аналогичными «дикому типу» ВВС.
Пример 5. Исследование и использование штамма rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2 рекомбинантного ВВС, экспрессирующего антиген коронавируса SARS-CoV-2 (RBD с трансмембранным регионом), и индуцирующего специфический иммунный ответ к SARS-CoV-2.
Композиции могут включать приемлемые адъюванты, стабилизаторы, наполнители и заявляемый штамм рекомбинантного везикулярного стоматита, экспрессирующего антигены коронавируса SARS-CoV-2. Индукция специфического иммунного ответа к антигенам SARS-CoV-2 обеспечивается путем введения в организм человека или животного иммуногенных композиций на основе заявляемого штамма rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, экспрессирующего антигены коронавируса SARS-CoV-2, любым из известных способов (внутримышечно, внутривенно, подкожно, интраназально и др.).
Изучение иммуногенных свойств заявляемого штамма rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, проводили посредством однократной внутримышечной иммунизации мышей и хорьков рекомбинантным вирусом везикулярного стоматита, экспрессирующим антигены коронавируса SARS-CoV-2, в дозе 2×107 БОЕ. Однократная иммунизация данной дозы оправдана результатами предыдущих исследований в Центре, при разработке вакцинных препаратов против ООВИ, а также актуальными публикациями, при разработке кандидатных вакцинных препаратов на данной платформе.
Иммуногенные свойства оценивали по титру вирусспецифических антител в твердофазном иммуноферментном анализе с использованием инактивированного природного культурального антигена SARS-CoV-2. Для выявления комплекса «антиген-антитело» использовали конъюгаты антивидовые, либо протеин G.
Таблица 1.
| Группа животных | Титр вирусспецифических антител на 28 сутки после иммунизации |
| rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2 | <1:100 - 7 шт 1:200 - 1 шт 1:400 - 1 шт |
| rVSV контроль | <1:100 - 9 шт |
В таблице 1 приведены титры вирусспецифических антител в сыворотках крови лабораторных мышей после иммунизации рекомбинантным вирусом везикулярного стоматита, кодирующий рецептор-связывающий домен (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c гетерологической сигнальной последовательностью, трансмембранным регионом, P2A-пептид и гликопротеин G (SEQ ID NO:1).
В таблице 2 представлены титры вирусспецифических антител в сыворотках крови хорьков после иммунизации рекомбинантным штаммом вируса везикулярного стоматита, кодирующего рецептор-связывающий домен (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c гетерологической сигнальной последовательностью, трансмембранным регионом, P2A-пептид и гликопротеин G (SEQ ID NO:1).
Таблица 2.
| Группа животных | Титр вирусспецифических антител на 28 сутки после иммунизации |
| rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2 | <1:100 - 1 шт 1:200 - 1 шт |
| rVSV контроль | <1:100 - 2 шт |
Иммуногенная композиция на основе заявляемого штамма rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, экспрессирующего антиген коронавируса SARS-CoV-2, может рассматриваться в качестве кандидатного вакцинного препарата против коронавирусной инфекции COVID-19 (SARS-CoV-2).
--->
Перечень последовательностей
<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора)
<120> Искусственный ген Stbl_RBD_TrM_SC2, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецептор-связывающего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, трансмембранного региона, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, используемого для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2
<160> SEQ ID NO 2
<210> SEQ ID NO:1
<211> 2355
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность искусственного гена Stbl_RBD_TrM_SC2, кодирующая искусственный белок-иммуноген, представляющий собой бицистронную структуру, состоящую из последовательностей рецептор-связывающего домена (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, гетерологического сигнального пептида гемагглютинина (HA) вируса гриппа А, трансмембранного региона, линкера, P2A-пептида для расщепления полипротеина во время трансляции, и гликопротеина G с мутацией M(1)>P(1), предотвращающей альтернативную инициацию трансляции.
<400> 1
ATGAAGGCAATACTAGTAGTTCTGCTATATACATTTGCAACCGCAAACGCAGATA 55
CCAGCAACTTCCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCAC 110
CAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTAC 165
GCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACA 220
ACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAA 275
CGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAA 330
GTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGC 385
TGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACTC 440
CAAAGTCGGCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTG 495
AAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAGCACCCCTT 550
GTAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTTCA 605
GCCCACAAATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAA 660
CTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATCTCGTGA 715
AGAACAAATGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACCGGCGGGAAGTA 770
CGAGCAGTACATCAAGTGGCCCTGGTACATCTGGCTGGGCTTTATCGCCGGACTG 825
ATTGCCATCGTGATGGTCACAATCATGCTGTGTTGCATGACCAGCGGGGCCACCA 880
ACTTCAGCCTCCTTAAACAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCTGGCCCCAAGTG 935
CCTTTTGTACTTAACCTTTTTATTCATTGGGGTGAATTGCAAGTTCACCATAGTT 990
TTTCCACACAACCAAAAAGGAAACTGGAAAAATGTTCCTTCTAATTACCATTATT 1045
GCCCGTCAAGCTCAGATTTAAATTGGCATAATGACTTAATAGGCACAGCCTTACA 1100
AGTCAAAATGCCCAAGAGTCACAAGGCTATTCAAGCAGACGGTTGGATGTGTCAT 1155
GCTTCCAAATGGGTCACTACTTGTGATTTCCGCTGGTATGGACCGAAGTATATAA 1210
CACATTCCATCCGATCCTTCACTCCATCTGTAGAACAATGCAAGGAAAGCATTGA 1265
ACAAACGAAACAAGGAACTTGGCTGAATCCAGGCTTCCCTCCTCAAAGTTGTGGA 1320
TATGCAACTGTGACGGATGCCGAAGCAGTGATTGTCCAGGTGACTCCTCACCATG 1375
TGCTGGTTGATGAATACACAGGAGAATGGGTTGATTCACAGTTCATCAACGGAAA 1430
ATGCAGCAATTACATATGCCCCACTGTCCATAACTCTACAACCTGGCATTCTGAC 1485
TATAAGGTCAAAGGGCTATGTGATTCTAACCTCATTTCCATGGACATCACCTTCT 1540
TCTCAGAGGACGGAGAGCTATCATCCCTGGGAAAGGAGGGCACAGGGTTCAGAAG 1595
TAACTACTTTGCTTATGAAACTGGAGGCAAGGCCTGCAAAATGCAATACTGCAAG 1650
CATTGGGGAGTCAGACTCCCATCAGGTGTCTGGTTCGAGATGGCTGATAAGGATC 1705
TCTTTGCTGCAGCCAGATTCCCTGAATGCCCAGAAGGGTCAAGTATCTCTGCTCC 1760
ATCTCAGACCTCAGTGGATGTAAGTCTAATTCAGGACGTTGAGAGGATCTTGGAT 1815
TATTCCCTCTGCCAAGAAACCTGGAGCAAAATCAGAGCGGGTCTTCCAATCTCTC 1870
CAGTGGATCTCAGCTATCTTGCTCCTAAAAACCCAGGAACCGGTCCTGCTTTCAC 1925
CATAATCAATGGTACCCTAAAATACTTTGAGACCAGATACATCAGAGTCGATATT 1980
GCTGCTCCAATCCTCTCAAGAATGGTCGGAATGATCAGTGGAACTACCACAGAAA 2035
GGGAACTGTGGGATGACTGGGCACCATATGAAGACGTGGAAATTGGACCCAATGG 2090
AGTTCTGAGGACCAGTTCAGGATATAAGTTTCCTTTATACATGATTGGACATGGT 2145
ATGTTGGACTCCGATCTTCATCTTAGCTCAAAGGCTCAGGTGTTCGAACATCCTC 2200
ACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGA 2255
TACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGG 2310
AAAAGCTCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCT 2365
TGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAAAGCACACCAAGAAAAG 2420
ACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGTAA 2463
<210> SEQ ID NO:2
<211> 784
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аминокислотная последовательность трансмембранного рецептор-связывающего домена (RBD) гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 c гетерологической сигнальной последовательностью, трансмембранным регионом, линкером и P2A-пептидом, обеспечивающим независимый синтез коронавирусного антигена и белка G вируса везикулярного стоматита.
<400> 2
MKAILVVLLYTFATANADTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVY 55
AWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDE 110
VRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNL 165
KPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFE 220
LLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGL 275
IAIVMVTIMLCCMTSGATNFSLLKQAGDVEENPGPKCLLYLTFLFIGVNCKFTIV 330
FPHNQKGNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQADGWMCH 385
ASKWVTTCDFRWYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTWLNPGFPPQSCG 440
YATVTDAEAVIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNYICPTVHNSTTWHSD 495
YKVKGLCDSNLISMDITFFSEDGELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGGKACKMQYCK 550
HWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILD 605
YSLCQETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYIRVDI 660
AAPILSRMVGMISGTTTERELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHG 715
MLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSW 770
KSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK* 820
<---
Claims (17)
1. Искусственный ген Stbl_RBD_TrM_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2, кодирующий искусственный белок-иммуноген, представляющий собой бицистронную структуру, состоящую из последовательностей рецепторсвязывающего домена (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, гетерологического сигнального пептида гемагглютинина (HA) вируса гриппа А, трансмембранного региона, линкера, P2A-пептида для расщепления полипротеина во время трансляции и гликопротеина G с мутацией M(1)>P(1), предотвращающей альтернативную инициацию трансляции, представленных в SEQ ID NO:1 длиной 2463 п.н.
2. Рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, используемая для получения рекомбинантного вируса везикулярного стоматита и вакцины на его основе против коронавируса SARS-CoV-2, имеющая молекулярную массу 8,92⋅106 дальтон, размер 14417 п.н. и содержащая в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 2, целевой ген по п. 1, кодирующий искусственный белок-иммуноген RBD гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с трансмембранным регионом, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 длиной 820 а.к.о. и находящийся под контролем вирусного промотора, обеспечивающего его экспрессию в клетках млекопитающих, и состоящая из следующих фрагментов:
- ORI - (ORI, origin of replication) точка начала репликации плазмидного вектора pUC (координаты 13591-14179 п.н.);
- AmpR - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость трансформантов E.coli к селективному антибиотику ампициллину (координаты 12560-13420 п.н.);
- T7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага T7, необходимая для транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 166-183 п.н.);
- T7 terminator - нуклеотидная последовательность терминатора бактериофага T7, необходимая для терминации транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 12332-12438 п.н.);
- HDV-Rbz - нуклеотидная последовательность рибозима HDV, которая после транскрибирования отщепляется с формированием аутентичной 3’-концевой некодирующей последовательности (координаты 12245-12327 п.н.);
- N - открытая рамка считывания гена N (нуклеопротеин) (координаты 247-1515 п.н.);
- P - открытая рамка считывания гена P (фосфопротеин) (координаты 1579-376 п.н.);
- L - открытая рамка считывания гена L (РНК-зависимая РНК-полимераза) (координаты 5816-12145 п.н.);
- VSV-G - открытая рамка считывания гликопротеина G с мутацией M(1)>P(1) (координаты 4198-5730 п.н.);
- P2A - 2A-пептид тешовируса-1, обеспечивающий расщепление полипротеина на этапе трансляции (координаты 4138-4197 п.н.);
- Transmembrane region - трансмембранный регион гликопротеина S SARS-CoV-2, обеспечивающий экспонирование целевого антигена на поверхности клеток и вирионов (координаты 4045-4122 п.н.);
- Signal peptide - сигнальный пептид гемагглютинина (HA) вируса гриппа А, обеспечивающий эффективный внутриклеточный транспорт синтезируемого полипротеина (координаты 3268-3321 п.н.);
- Spike protein - фрагмент гена S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 3322-4037 п.н.);
- Receptor-binding domain (RBD) - рецепторсвязывающий домен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 3334-4002 п.н.).
3. Рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, полученный с использованием рекомбинантной плазмиды pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2 по п. 2, обеспечивающий независимый синтез антигена коронавируса SARS-CoV-2 и белка G вируса везикулярного стоматита, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 и депонированный в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-983.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020125809A RU2733832C1 (ru) | 2020-07-28 | 2020-07-28 | Искусственный ген Stbl_RBD_TrM_SC2, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецепторсвязывающего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, трансмембранного региона, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020125809A RU2733832C1 (ru) | 2020-07-28 | 2020-07-28 | Искусственный ген Stbl_RBD_TrM_SC2, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецепторсвязывающего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, трансмембранного региона, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2733832C1 true RU2733832C1 (ru) | 2020-10-07 |
Family
ID=72927152
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020125809A RU2733832C1 (ru) | 2020-07-28 | 2020-07-28 | Искусственный ген Stbl_RBD_TrM_SC2, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецепторсвязывающего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, трансмембранного региона, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2733832C1 (ru) |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2738081C1 (ru) * | 2020-10-14 | 2020-12-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 с использованием пептидных иммуногенов |
| CN112618707A (zh) * | 2020-10-15 | 2021-04-09 | 广州达博生物制品有限公司 | 一种SARS-CoV-2冠状病毒疫苗及其制备方法 |
| RU2751485C1 (ru) * | 2021-06-14 | 2021-07-14 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Вакцина против гриппа типа А, гриппа типа B и COVID-19 |
| CN113186204A (zh) * | 2021-06-11 | 2021-07-30 | 北京华芢生物技术有限公司 | 新型冠状病毒巴西株p．1突变株rbd的基因及其应用 |
| RU2754230C1 (ru) * | 2021-03-23 | 2021-08-30 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Плазмидная ДНК-матрица pVAX-RBD, молекул мРНК-RBD, полученная с использованием ДНК-матрицы pVAX-RBD, обеспечивающая синтез и секрецию белка RBD SARS-CoV 2 в клетках организма млекопитающих и комплекс в виде наночастиц, содержащих молекулы мРНК-RBD, индуцирующих SARS-CoV-специфические антитела, обладающие вируснейтрализующей активностью |
| WO2021195286A1 (en) * | 2020-03-27 | 2021-09-30 | Svenska Vaccinfabriken Produktion Ab | Compositions and methods for treating and preventing coronaviruses |
| WO2021210686A1 (en) * | 2020-04-17 | 2021-10-21 | Vlp Therapeutics, Inc. | Coronavirus vaccine |
| CN113583137A (zh) * | 2021-06-15 | 2021-11-02 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 一种新型冠状病毒南非突变株的重组亚单位疫苗及其应用 |
| RU2760301C1 (ru) * | 2020-12-21 | 2021-11-23 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Вакцина на основе AAV5 для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 и/или профилактики коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2 |
| RU2761378C1 (ru) * | 2021-05-24 | 2021-12-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Ген, кодирующий открытую рамку считывания М-сегмента ККГЛ, и рекомбинантная конструкция, обеспечивающая экспрессию структурных гликопротеинов вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки |
| RU2761879C1 (ru) * | 2021-07-27 | 2021-12-13 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Вакцина на основе AAV5 для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 и/или профилактики коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2 |
| CN114456241A (zh) * | 2021-03-01 | 2022-05-10 | 成都威斯克生物医药有限公司 | 抗SARS-CoV-2感染的蛋白及疫苗 |
| WO2022191742A1 (en) * | 2021-03-11 | 2022-09-15 | Dukhovlinov Ilya Vladimirovich | A method for assessment of the cellular immune |
| RU2782531C1 (ru) * | 2022-04-15 | 2022-10-28 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Рекомбинантный вакцинный штамм для живой интраназальной вакцины, обеспечивающей сочетанную профилактику гриппозной и коронавирусной инфекций |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110974950A (zh) * | 2020-03-05 | 2020-04-10 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗 |
| RU2720614C1 (ru) * | 2020-04-23 | 2020-05-12 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты) |
| RU2723008C1 (ru) * | 2020-05-19 | 2020-06-08 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение |
| CN111358953A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-07-03 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种高效诱导机体体液免疫应答的疫苗载体、其制备方法及用途 |
-
2020
- 2020-07-28 RU RU2020125809A patent/RU2733832C1/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110974950A (zh) * | 2020-03-05 | 2020-04-10 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗 |
| CN111358953A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-07-03 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种高效诱导机体体液免疫应答的疫苗载体、其制备方法及用途 |
| RU2720614C1 (ru) * | 2020-04-23 | 2020-05-12 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты) |
| RU2723008C1 (ru) * | 2020-05-19 | 2020-06-08 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение |
Cited By (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021195286A1 (en) * | 2020-03-27 | 2021-09-30 | Svenska Vaccinfabriken Produktion Ab | Compositions and methods for treating and preventing coronaviruses |
| WO2021210686A1 (en) * | 2020-04-17 | 2021-10-21 | Vlp Therapeutics, Inc. | Coronavirus vaccine |
| RU2783313C1 (ru) * | 2020-08-28 | 2022-11-11 | Акционерное общество "БИОКАД" | Вакцина на основе AAV5 для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 и/или профилактики коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2 |
| RU2738081C1 (ru) * | 2020-10-14 | 2020-12-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 с использованием пептидных иммуногенов |
| WO2022081042A1 (ru) * | 2020-10-14 | 2022-04-21 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Вакцинная композиция против коронавирусной инфекции covid-19 |
| CN112618707B (zh) * | 2020-10-15 | 2023-07-04 | 广州达博生物制品有限公司 | 一种SARS-CoV-2冠状病毒疫苗及其制备方法 |
| CN112618707A (zh) * | 2020-10-15 | 2021-04-09 | 广州达博生物制品有限公司 | 一种SARS-CoV-2冠状病毒疫苗及其制备方法 |
| RU2760301C1 (ru) * | 2020-12-21 | 2021-11-23 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Вакцина на основе AAV5 для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 и/или профилактики коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2 |
| CN114456241A (zh) * | 2021-03-01 | 2022-05-10 | 成都威斯克生物医药有限公司 | 抗SARS-CoV-2感染的蛋白及疫苗 |
| CN114456241B (zh) * | 2021-03-01 | 2023-11-21 | 成都威斯克生物医药有限公司 | 抗SARS-CoV-2感染的蛋白及疫苗 |
| WO2022191742A1 (en) * | 2021-03-11 | 2022-09-15 | Dukhovlinov Ilya Vladimirovich | A method for assessment of the cellular immune |
| RU2754230C1 (ru) * | 2021-03-23 | 2021-08-30 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Плазмидная ДНК-матрица pVAX-RBD, молекул мРНК-RBD, полученная с использованием ДНК-матрицы pVAX-RBD, обеспечивающая синтез и секрецию белка RBD SARS-CoV 2 в клетках организма млекопитающих и комплекс в виде наночастиц, содержащих молекулы мРНК-RBD, индуцирующих SARS-CoV-специфические антитела, обладающие вируснейтрализующей активностью |
| RU2761378C1 (ru) * | 2021-05-24 | 2021-12-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Ген, кодирующий открытую рамку считывания М-сегмента ККГЛ, и рекомбинантная конструкция, обеспечивающая экспрессию структурных гликопротеинов вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки |
| CN113186204A (zh) * | 2021-06-11 | 2021-07-30 | 北京华芢生物技术有限公司 | 新型冠状病毒巴西株p．1突变株rbd的基因及其应用 |
| RU2751485C1 (ru) * | 2021-06-14 | 2021-07-14 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Вакцина против гриппа типа А, гриппа типа B и COVID-19 |
| CN113583137A (zh) * | 2021-06-15 | 2021-11-02 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 一种新型冠状病毒南非突变株的重组亚单位疫苗及其应用 |
| RU2761879C1 (ru) * | 2021-07-27 | 2021-12-13 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Вакцина на основе AAV5 для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 и/или профилактики коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2 |
| RU2782531C1 (ru) * | 2022-04-15 | 2022-10-28 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Рекомбинантный вакцинный штамм для живой интраназальной вакцины, обеспечивающей сочетанную профилактику гриппозной и коронавирусной инфекций |
| RU2802058C1 (ru) * | 2022-12-28 | 2023-08-22 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа имени А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Рекомбинантный вирус гриппа, предназначенный для профилактики covid-19 и гриппа, способ его получения и применения |
| RU2822355C1 (ru) * | 2023-12-26 | 2024-07-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук ( ГНЦ ИБХ РАН) | ПОЛИПЕПТИД С АНТИ-SARS-CoV-2 АКТИВНОСТЬЮ И ПРОЛОНГИРОВАННЫМ ВРЕМЕНЕМ ЦИРКУЛЯЦИИ В КРОВОТОКЕ |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2733832C1 (ru) | Искусственный ген Stbl_RBD_TrM_SC2, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецепторсвязывающего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, трансмембранного региона, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 | |
| RU2733834C1 (ru) | Искусственный ген EctoS_SC2, кодирующий эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с C-концевым тримеризующим доменом, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-EctoS_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 | |
| RU2733831C1 (ru) | Искусственный ген, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецептор-связующего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_SC2, используемого для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 | |
| Weiss et al. | Coronavirus pathogenesis | |
| CN112618707B (zh) | 一种SARS-CoV-2冠状病毒疫苗及其制备方法 | |
| CN117752779A (zh) | 一种冠状病毒刺突蛋白包膜替换型载体疫苗及其构建方法 | |
| JP6230527B2 (ja) | サルアデノウイルス及び雑種アデノウイルスベクター | |
| ES2869199T3 (es) | Sistemas de expresión | |
| TWI605124B (zh) | 新穎桿狀病毒載體及使用方法 | |
| Ferko et al. | Hyperattenuated recombinant influenza A virus nonstructural-protein-encoding vectors induce human immunodeficiency virus type 1 Nef-specific systemic and mucosal immune responses in mice | |
| KR101279636B1 (ko) | 백신인 복제―결핍 ｒｎａ 바이러스 | |
| EA038250B1 (ru) | Рекомбинантный белок gl цитомегаловируса с мутацией в сайте распознавания протеазой, которая уменьшает протеазное расщепление | |
| CN112175914A (zh) | 蛋白水解靶向病毒、其活疫苗及其制备方法和用途 | |
| JP2023511444A (ja) | 安定化されたｎａを有する組換えインフルエンザウイルス | |
| Tan et al. | Coexpression of double or triple copies of the rabies virus glycoprotein gene using a ‘self-cleaving’2A peptide-based replication-defective human adenovirus serotype 5 vector | |
| Li et al. | A single immunization with a recombinant canine adenovirus expressing the rabies virus G protein confers protective immunity against rabies in mice | |
| KR20180085730A (ko) | 키메라 rsv, 면역원성 조성물, 및 사용 방법 | |
| JP2004531232A (ja) | 高められた転写および複製能力をもつインフルエンザウイルス | |
| CN111527213A (zh) | 具有两个编码rsv抗原蛋白或片段的表达盒的腺病毒载体 | |
| WO2014195692A1 (en) | Avian cells for improved virus production | |
| CN111479926A (zh) | 具有两个表达盒的猿猴腺病毒载体 | |
| Wang et al. | Parainfluenza virus 5 is a next‐generation vaccine vector for human infectious pathogens | |
| WO2006009011A1 (ja) | コロナウイルススパイクｓ１融合蛋白及びその発現ベクター | |
| KR20240118795A (ko) | 인간 메타뉴모바이러스 바이러스 벡터-기반 백신 | |
| KR20240001198A (ko) | Apmv hn 및 f 단백질을 발현하는 키메라 뉴캐슬병 바이러스 |