TWI605124B - 新穎桿狀病毒載體及使用方法 - Google Patents

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Description

新穎桿狀病毒載體及使用方法
本發明大致關於基因重組桿狀病毒。
桿狀病毒會感染昆蟲，且對於人類並無致病性，但可能轉導多種哺乳動物細胞及鳥類細胞。由於對生物安全且具有強大複製能力和低細胞毒性，同時於轉導之細胞中不會複製，並易於處理和製造，桿狀病毒成為廣受歡迎之基因轉移載體，適合多種應用，例如抗病毒療法、癌症療法、再生藥物及疫苗。
美國專利第7,527,967號揭露一種基因重組桿狀病毒，其於桿狀病毒之表面展現融合異種多胜肽，而可用於在需要治療之個體體內對抗產生一異種蛋白或病毒之抗體或免疫反應。其中之融合異種多胜肽係經由融合一異種抗原與桿狀病毒GP64蛋白之羧基端第227至529位胺基酸殘基(圖2C)所產生。其中之架構包含GP64胞外區域(extracellular domain)之大部分，包括B12D5結合位點。當用於免疫接種(immunization)時，GP64之胞外區域可誘發免疫反應，並產生非預期之抗體，例如無用的抗GP64 B12D5抗體(Zhou et al.Virology 2006；352(2)：427-437)。GP64 B12D5抗體係一對抗桿狀病毒本身而非特定外來抗原之中和抗體。此外，桿狀病毒對豬隻僅略具免疫原性。
台灣專利第I368656號揭露一種方法，其係使用來自GP64之訊號胜肽(signal peptide,SP)、跨膜區域(transmembrane domain,TM)及細胞質轉導區 (cytoplasmic transduction domain,CTD)呈現一抗原。其中之架構僅含該跨膜區域及細胞質轉導區域，而無GP64之胞外區域(圖2D)。其較無法表達外來抗原，且對去活化劑(inactivation reagent)敏感(Premanand et al.PLoS ONE 2013；8(2)：e55536)。
因此，本技藝中確實需要一種能夠解決上述缺失及不足之方案，特別是一種對於去活化劑不敏感且具有較佳免疫原性之桿狀病毒載體。
於一態樣中，本發明提供一載體，其係包含對一融合蛋白編碼之轉基因，該融合蛋白包含：(a)一訊號胜肽(signal peptide,SP)，其係位於該融合蛋白之該N端；(b)一異種抗原(heterologous antigen)；以及(c)桿狀病毒外膜套GP64蛋白之C端區域，其至少具有100個胺基酸殘基之長度，且缺乏位於GP64蛋白中央鹼性區域內之B12D5結合決定位(binding epitope)；其中該異種抗原係位於該訊號胜肽與該GP64蛋白C端區域之間。
在本發明一實施例中，本發明之載體係一基因重組桿狀病毒。
於另一態樣中，本發明係提供一種基因重組桿狀病毒，於其外膜上展現一融合蛋白，該融合蛋白包含：(i)一異種抗原；以及(ii)桿狀病毒外膜套GP64蛋白之C端區域，其具有至少100個胺基酸殘基之長度，且缺乏位於GP64蛋白中央鹼性區域內之B12D5結合決定位。
在本發明一實施例中，該基因重組桿狀病毒之基因組包含一編碼一融合蛋白之轉基因(transgene)，該融合蛋白包含：(a)一訊號胜肽；(b)該異種抗原；以及(c)桿狀病毒外膜套GP64蛋白之C端區域；其中該抗原係位於該訊號胜肽與該GP64蛋白C端區域之間。
於本發明另一實施例中，該轉基因係以可操作之方式連結至一啟動子。
於本發明另一實施例中，該啟動子係多角體蛋白(polyhedrin)。
於本發明另一實施例中，該GP64蛋白之C端區域長度為186至220個胺基酸。
於本發明另一實施例中，該GP64蛋白之C端區域缺乏序列識別號：2、3或4之胺基酸序列。
於本發明另一實施例中，該GP64蛋白之C端區域包含序列識別號：1之第293至512位胺基酸殘基。
於本發明另一實施例中，該GP64蛋白之C端區域包含序列識別號：1之第327至512位胺基酸殘基。
於本發明另一實施例中，該GP64蛋白之C端區域具有一N端，該N端介於序列識別號：1之第292至328位胺基酸殘基之間。
於本發明另一實施例中，該訊號胜肽包含一胺基酸序列係選自以下群組：序列識別號：5、6、7、8、9、10、11及12。
更於另一態樣，本發明係關於一昆蟲細胞或一以本發明載體或基因重組桿狀病毒轉導之細胞。
於本發明另一實施例中，該抗原係選自以下群組中之至少一者：一病原體蛋白(pathogen protein)、一癌細胞蛋白(cancer cell protein)以及一免疫檢查點蛋白(immune checkpoint protein)。
該病原體可為選自以下群組中之至少一者：人類乳突病毒(human papillomavirus,HPV)、豬生殖與呼吸綜合症病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、人類免疫不全病毒-1(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)、登革熱病毒(Dengue virus)、C型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)、B型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、豬環狀病毒2(porcine circovirus 2,PCV2)、豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)、新城病病毒(Newcastle disease virus,NDA)、傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、豬流行性下痢病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、流行性感冒病毒(influenza virus,)、假性狂犬病病毒(pseudorabies virus)、微小病毒(parvovirus)、豬水疱病病毒(swine vesicular disease virus,SVDV)、痘瘡病毒(poxvirus)、輪狀病毒(rotavirus)、肺炎黴漿菌(Mycoplasma pneumonia)、單純疱疹病毒(herpes virus)、傳染性支氣管炎(infectious bronchitis)、傳染性華氏囊病病毒(infectious bursal disease virus)。癌症可為選自以下群組中之至少一者：非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)、乳癌(breast carcinoma)、黑色素瘤(melanoma)、淋巴瘤(lymphomas)、結腸癌(colon carcinoma)、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)，及其任何組合。免疫檢查點可為選自以下群組中之至少一者：PD-1、PD-L1、PD-L2及CTLA-4。
於本發明另一實施例中，該抗原係選自以下群組中之至少一者：豬瘟病毒外膜套醣蛋白E2(classical swine fever virus envelope glycoprotein E2)、豬流行性下痢病毒S1蛋白(porcine epidemic diarrhea virus S1 protein)、計畫性細胞凋亡蛋白1(programmed cell death protein 1)以及一腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen,TAA)。
於再一態樣中，本發明提供一種於需要治療之個體體內誘發一抗原特異性免疫原性反應之方法，包含對該需要治療之個體施予一治療上有效量 之本發明載體或該基因重組桿狀病毒。本發明亦關於所述載體或基因重組桿狀病毒在製造一藥劑之用途，該藥劑係可於需要治療之個體體內誘發一抗原特異性免疫原性反應。或者，本發明係關於所述載體或基因重組桿狀病毒在於需要治療之個體體內誘發一抗原特異性免疫原性反應之用途。
上述及其他態樣將藉由以下較佳實施例之說明參照附圖加以陳明，然其可為不脫離本發明新穎概念之精神和範疇之變化及修改。
附圖繪示本發明之一或多種實施例，連同書面描述，用以解說本發明之原理。於可能之情況下，所有圖面係使用相同之示數指稱一實施例中相同或類似之元件。
圖1A係一概要圖，繪示依據本發明一實施例之桿狀病毒載體平台設計。圖1B係一概要圖，繪示一外來抗原或外來基因不僅可鑲嵌於病毒外膜套上，亦可藉由本發明的gBac表面展現平台表達於昆蟲細胞之該細胞膜部分。其中矩形代表病毒。
圖2A 係一概要圖，顯示全長GP64蛋白，其包含：GP64最小片段(GP64 minimum)(GP64327-482)，GP64跨膜區域(transmembrane domain,TM)(GP64483-505)；細胞質轉導區(cytoplasmic transduction domain,CTD)(GP64506-512)。
圖2B係一概要圖，顯示依據本發明一實施例之桿狀病毒載體。SP：訊號胜肽；TM：跨膜區域，CTD：細胞質轉導區。
圖2C係一概要圖，顯示美國專利第7527967號之桿狀病毒載體設計。
圖2D係一概要圖，顯示台灣專利第I368656號之桿狀病毒載體設計。
圖3係一圖表，顯示接種後小鼠體內由桿狀病毒載體引發之免疫反應(左欄)以及小鼠體內之E2-gBac次單位疫苗中和血清(neutralization serum,SN)滴定量(右欄)。顯示之各ELISA值為五隻小鼠之平均值。E2-gBac與E2-Bac群組之差異為統計上顯著，P≦0.05。使用之桿狀病毒株為AcNPV。「SN」代表中和血清。「E2-gBac」代表依據圖2B載體設計之「桿狀病毒載體CSFV E2-gBac」。「E2-gBac(減活)」代表該桿狀病毒在用於免疫接種前先經減除活性(inactivated)。「E2-Bac」代表圖依據2D載體設計之「桿狀病毒載體CSFV E2-Bac」。
圖4係一圖表，顯示接種後豬隻體內由桿狀病毒載體引發之免疫反應。顯示之各ELISA值為三頭豬隻之平均值。E2-gBac與E2-gp64群組之差異為統計上顯著，P≦0.05。「E2-gp64」代表依據圖2C載體設計之「桿狀病毒載體CSFV E2-gp64」。
圖5係一圖表，顯示三頭特定不帶病原體(SPF)並以桿狀病毒載體PEDV S1-gBac接種後之豬隻體內對抗豬流行性下痢病毒(PEDV)之抗體滴定量。上述三頭SPF豬隻分別標號為73、74及75。「IFA」代表免疫螢光抗體(immunofluorescent antibody)。結果顯示PED病毒能夠識別自接種豬隻取得之血清。
圖6A-B為西方墨點圖，顯示Sf9細胞樣本偵測到CSFV E2-gBac之E2抗原(圖6A)及PEDV S1-gBac之S1抗原(圖6B)。
圖6C-D為西方墨點圖，顯示抗gp64 mAb(左欄)及人類PD-1抗體(右欄)分別辨識並偵測到樣本中hPD-1-gBac之抗原。
為更詳述本發明，於此提供下列實例，惟其僅屬說明性質，且熟悉此技藝人士應瞭解可為諸多修改變化。現在詳述本發明之各種實施例。參照附圖，各圖中係以類似之號碼指述類似之組件。如在本說明書及申請專利範圍 中所使用，除非上下文另有明確之不同指定，否則「一」及「該」之意義包括複數指稱。此外，如在本說明書及下開申請專利範圍中所使用，除非上下文另有明確之不同指定，否則「在其中」之意義包括「在其中」及「在其上」。再者，說明書中所用之標題或副標係便利為讀者，不應對本發明之範圍構成影響。此外，本說明書中所涉部分用語係採如下定義。
定義
本說明書中所用語彙一般而言具有其於在此技藝中與本發明語境相關範圍及所用處之特定語境範圍內通常具有之意義。於此處或本說明書中他處針對用於本發明之特定語彙加以陳述，提供額外指引以利閱讀本發明之實行者瞭解。為便於閱讀，某些語彙可能以強調方式表達，例如使用斜體字及/或引號。強調方式之使用並不對於語彙之範圍及意義構成影響；在同一語境中，語彙不論是否以強調方式表達，其範圍及意義俱為相同。應知一事可以多種方式表述。因此，在此討論之一或多項用語可使用替代語言及同義字，且一語彙不論是否在此受到闡述或討論，均不增減其重要性。在此提供某些用語之同義字。使用一或多種同義字並不排除其他同義字之使用。於本說明書中任何部分之實例使用若包括任何在此討論用語之範例，僅屬說明性質，且絕不對本發明或任何例示用語之範圍及意義構成限制。同樣，本發明並不限於本說明書中所提供之各種實施例。
除非另有不同定義，在此使用所有技術及科學語彙與在本技藝中具有通常知識之人共同瞭解之意義相同。若有牴觸，應以本文件及其所提供之定義為準。
載體(vector)係一媒介物，用於將遺傳物質傳遞至目標細胞。病 毒載體(viral vector)係一經修改後之病毒，可將外來遺傳物質遞送至細胞之中。
「基因轉導(gene transduction)」、「轉導(transduce)」或「轉導變異(transduction)」係使用病毒載體將外來DNA導入另一細胞之程序。
訊號序列(signal sequence)或訊號胜肽(signal peptide,SP)(有時亦稱為訊號序列、導向訊號、局部化訊號、局部化序列、運輸胜肽、領導序列或領導胜肽)係一短胜肽(5-30個胺基酸長)，其存在於多數新近合成用於分泌路徑之蛋白N端。此等蛋白包括位於特定胞器(內質網、高基氏體或核內體)的內部、由細胞分泌出去或被插入大部分細胞膜中者。
「B12D5」意指抗gp64之單株抗體。B12D5具有一位於gp64之第277-287位胺基酸殘基的結合決定位KKRPPTWRHNV(序列識別號：3)，或HRVKKRPPTW(序列識別號：2)位於gp64之從殘基271至292(序列識別號：4)的中央區域內。請參閱Zhou et al.(2006)Supra；Wu et al(2012)“A pH-Sensitive Heparin-Binding Sequence from Baculovirus gp64 Protein Is Important for Binding to Mammalian Cells but Not to Sf9 Insect Cells”Journal of Virology,Vol.86(1)484-491。
計畫性細胞凋亡蛋白1亦稱為PD-1及CD279[分化簇(cluster of differentiation)279]，係一在人體內由PDCD1基因所編碼之蛋白。PD-1為細胞表面受體，屬於免疫球蛋白超家族，且表達於T細胞及祖B細胞(pro-B cells)上。PD-1結合兩個配體，PD-L1及PD-L2。PD-1之功能為免疫檢查點，藉由預防T細胞之活化而有助於向下調節免疫系統，從而降低自動免疫性並促進自體耐受性。PD-1一方面促進淋巴結中抗原特異性T細胞中之細胞凋亡(計畫性細胞凋亡)，另一方面減少調節T細胞(regulatory T cells)[抑制性T細胞(suppressor T cells)]之細胞凋 亡，以此雙重機制達成抑制作用。PD-1抑制劑為一種新類型PD-1阻斷藥品，可活化免疫系統以攻擊腫瘤，因此於治療某些癌症上具有程度不一之功效。
抗原可為一致病蛋白、多胜肽或胜肽，其可能造成因病原體產生之疾病，或能夠誘發受病原體或腫瘤相關抗原(TAA)感染之宿主體內免疫學反應。所述腫瘤相關抗原(TAA)為特別表達於腫瘤細胞內之多胜肽，可選自一病原體或癌症細胞，包括但不限於，人類乳突病毒(HPV)、豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)、人類免疫不全病毒-1(HIV-1)、登革熱病毒、C型肝炎病毒(HCV)、B型肝炎病毒(HBV)、豬環狀病毒2(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、新城病病毒(NDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性下痢病毒(PEDV)、流行性感冒病毒、假性狂犬病病毒、微小病毒、假性狂犬病病毒、豬水疱病病毒(SVDV)、痘瘡病毒、輪狀病毒、肺炎黴漿菌、單純疱疹病毒、傳染性支氣管炎、或傳染性華氏囊病病毒、非小細胞肺癌、乳癌、黑色素瘤、淋巴瘤、結腸癌、肝細胞癌及其任何組合。例如，HPV E7蛋白(E7)、HCV核心蛋白(HCV core)、HBV X蛋白(HBx)即為選定之疫苗開發抗原。抗原可為一融合抗原，由選自一或多種致病蛋白之二或多種抗原融合而成。例如，PRRSV ORF6片段與ORF5片段之融合抗原，或PRRSV與PCV2病原體抗原之融合。
或者，一抗原可為一抑制性免疫檢查點蛋白例如PD-1、PD-L1、PD-L2及CTLA-4等等。
「免疫檢查點蛋白(immune checkpoint protein)」及「免疫檢查點(Immune checkpoint)」等語可互換使用。免疫檢查點會影響免疫系統功能。免疫檢查點可為刺激性或抑制性。腫瘤可利用此等檢查點保護自身不受免疫系統攻擊。檢查點療法之作用為阻斷抑制性檢查點，恢復免疫系統功能。跨膜計畫性 細胞凋亡1蛋白(PDCD1，PD-1；亦稱為CD279)與其PD-1配體1(PD-L1，CD274)間之交互作用為一個正在研究中之配體與受體的交互作用。細胞表面之PD-L1結合至免疫細胞表面上之PD1，其能夠抑制免疫細胞的活性。PD-L1之功能包括調節T細胞活動。癌症導致的細胞表面PD-L1之向上調節(upregulation)可抑制T細胞之攻擊。結合至PD-1或PD-L1且因此阻斷其交互作用之抗體可允許T細胞去攻擊腫瘤。Ipilimumab為FDA核准之第一個檢查點抗體，可阻斷抑制性免疫檢查點CTLA-4。
「治療(treating or treatment)」意指對罹有癌症，或受感染，或展現該等疾病之症狀或傾向，而需治療之個體投以有效量之融合蛋白，以期治療、緩和、減輕、醫治、改善或預防疾病、其症狀或其傾向。此一個體可由健康照護專業人士基於任何適當診斷方法之結果加以辨識。
「有效量(effective amount)」意指活性化合物足以對受治療個體產生治療效果之需要量。有效劑量可能依據投藥路徑、輔藥使用及與其他治療方式共用等因素而變化，如熟悉此技藝人士所知者。
實施例
於不限制本發明範圍之前提下，以下提供本發明實施例之範例儀器、裝置、方法及其相關結果。標題或副標之使用僅為便利讀者，而不應構成對於本發明範圍之限制。此外，以下亦提及並揭露某些理論。然而，只要本發明可依據本發明實施而不拘於任何特定理論或行動方案，則不論此等理論正確與否，均不應構成對於本發明範圍之限制。
實施例1
載體之架構與基因重組桿狀病毒、似病毒粒子及蛋白之產生
圖1A顯示一gBac平台。外來基因[例如優化豬瘟病毒(CSFV)E2或豬流行性下痢病毒(PEDV)刺突基因(spike genes)]之取得方式為先以PCR合成，而後使用IN-FUSION ®複製套件(Clontech)經由限制酵素位點(例如SacI/NotI)複製入一gBac載體。此gBac載體係取自桿狀病毒轉移載體pBACPAK8TM(GENBANKTM編錄號U02446)。使用圖1A之gBac表面展現平台，外來抗原或外來基因可鑲嵌於病毒外膜套上，且亦表達於昆蟲細胞之細胞膜部分(圖1B)。
圖2A顯示全長GP64。桿狀病毒GP64外膜套融合蛋白(GP64 envelope fusion protein,GP64 EFP)為許多桿狀病毒之外膜套融合醣蛋白。其在感染細胞及出芽病毒表面上以三合體(homotrimer)之方式出現。桿狀病毒經入胞作用進入宿主細胞，而後藉由一低pH所誘導的病毒外膜套與內體膜(endosomal membrane)之融合，允許病毒進入細胞質。上述之細胞膜融合，以及感染細胞之病毒粒子有效出芽，均取決於GP64。
圖2B-D顯示三種載體之對照：gBac(或Reber-gBac)、抗原gp64(US 7527967縮寫為「gp64」)以及抗原Bac(TW I368656縮寫為「Bac」)。gBac載體係由訊號胜肽(SP)以及GP64之C端區域從第327至513位胺基酸殘基建構而成。gp64載體係由SP以及GP64之C端區域從第227至513位胺基酸殘基建構而成。Bac載體包含昆蟲訊號胜肽(SP)、TM(跨膜區域)及GP64之CTD(細胞質轉導區)且不包含GP64胞外區域的胺基酸。「SP」前之三角符號代表多角體蛋白啟動子(polyhedrin promoter)，位於嵌入基因起始密碼子之-1位點。
編碼SP之DNA片段分別由PCR以正股及反股引子5’-GAGCTCATGGTAAGC-3’(序列識別號：19)及5’-AGGCAGAATGCG-3’(序列識別號：20)產生及擴增。gp64基因之C端部分(編碼GP64從aa 327至aa 513) 分別由PCR以正股及反股引子5’-GCGTGTCTGCTCA-3’(序列識別號：21)及5’-TTAATATTGTCTA-3(序列識別號：22)產生及擴增。gp64基因之C端部分(編碼GP64從aa 227至aa 513)分別由PCR以正股及反股引子5’-ATCAACAAGCTAA-3’(序列識別號：23)及5’-TTAATATTGTCTA-3’(序列識別號：24)產生及擴增。上述外來基因分別複製入pBACPAK8TM轉移載體。
使用2B(或圖1A)之gBac平台產生兩種桿狀病毒載體：桿狀病毒載體CSFV E2-gBac及桿狀病毒載體PEDV S1-gBac(依據圖2B設計)。前者轉導一編碼豬瘟病毒(CSFV)外膜套醣蛋白E2的基因，後者轉導一編碼豬流行性下痢病毒S1蛋白的基因。
為提供平行對照，亦使用圖2C及2D之載體產生另兩種桿狀病毒載體：桿狀病毒載體CSFV E2-gp64(依據圖2C設計)，以及桿狀病毒載體CSFV E2-Bac(依據圖2D設計)，其用以轉導一編碼CSFV E2抗原之外來基因。
gBac、gp64及Bac載體(分別為圖2B-D設計)中之融合基因經定序確認其身分。包含有基因重組GP64基因且無轉移載體骨架之基因重組桿狀病毒是藉由同源重組而被製備。建構及再結合之方法為本技藝中所習知。利用此等基因重組病毒製備抗原。將修改後之GP64基因以PCR嵌入桿狀病毒轉移載體之多角體啟動子下以形成gBac載體。由於gBac載體具有兩個同源重組位點，當gBac質體及野生桿狀病毒共轉染時，野生桿狀病毒之原始多角體位置被gBac序列所取代。
實施例2
蛋白表達與抗原之純化
Sf-9細胞用於重組桿狀病毒之繁殖與感染。桿狀病毒於秋行軍蟲 (Spodoptera frugiperda)Sf-9細胞株中繁殖並置於無血清培養基中以26℃培養。以5-10之MOI感染Sf-9細胞並在感染三天後收穫，製得基因重組桿狀病毒。為大規模生產桿狀病毒，可於生物反應器中培養並感染細胞。從感染細胞之培養上清液中分離出桿狀病毒部分。使用適當蛋白篩截膜(protein cut-off membrane)及0.45μm無菌膜，以切向流過濾(Tangential Flow Filtration,TFF)技術收集桿狀病毒粒子。
為測試抗原之生產，將部分純化之桿狀病毒或感染細胞溶解產物置於8-10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)中後轉移至硝化纖維膜。外來抗原是以小鼠抗gp64 mAb(商業管道購得且以1：5,000比例稀釋)作為初級抗體而被偵測到。二級抗體為與鹼性磷酸酶結合之羊抗兔或羊抗鼠mAb(1：5,000稀釋)。使用ECL PLUSTM西方墨點偵測試劑(GE Healthcare)顯現蛋白帶。於桿狀病毒表面展現系統中，外來抗原可先表達於昆蟲細胞膜，而後出芽桿狀病毒取用部分細胞膜以形成其外膜套。結果，桿狀病毒展現抗原可從感染細胞的溶解產物(細胞膜部分)以及病毒表面而被收穫。
實施例3
基因重組病毒之抗原表達
以gBac疫苗進行免疫接種之前，為確認融合蛋白CSFV E2-gBac或PEDV S1-gBac是否成功展現於桿狀病毒外膜套上，先藉由離心及TFF收集基因重組桿狀病毒。將基因重組桿狀病毒懸浮於不同p.f.u/μl濃度之PBS中。以西方墨點法使用抗gp64 mAb(eBioscience)分析基因重組蛋白併入桿狀病毒粒子之情形。測得融合蛋白CSFV E2-gBac之分子量為約80kDa，融合蛋白PEDV S1-gBac之分子量為約130kDa。
實施例4
疫苗製備與免疫接種
將基因重組桿狀病毒展現抗原與水包油包水(water-in-oil-in-water,w/o/w)佐劑(MONTANIDE ISA 206 VG,SEPPIC.)混合以製備疫苗。將購自中華民國台灣國家實驗研究院動物中心之四週大雌性BALB/c小鼠分為四組，每組5隻小鼠。小鼠從第0天至第14天每天兩次以200μl含有107p.f.u.基因重組桿狀病毒之溶液進行皮下免疫(圖3)。將含有CSFV外膜套醣蛋白E2之E2-gBac、E2-gp64及E2-Bac病毒(依據圖2B-D)減活並配製成疫苗。作為陰性對照組，小鼠接受野生型桿狀病毒(107p.f.u.)或PBS注射。於第六週從尾部靜脈收集血液樣本。使用二乙醯亞胺(Binary ethylenimine,BEI)減低桿狀病毒活性。製備方式為在37℃下溶解0.1M 2-溴乙胺氫溴酸鹽(2-bromoethylamine hydrobromide,BEA)於0.2N NaOH中歷時1小時。為減活桿狀病毒，在病毒培養基中加入4mM BEI，將病毒在37℃下培養16小時。減活後，將硫代硫酸鈉(Na2S2O3)以一為最後BEI濃度之10倍的最終濃度而被添加入培養基中以停止減活。
實施例5
基因重組病毒產生抗原之免疫原性(Immunogenicity)
免疫接種後，分析小鼠之血清，確認有無抗CSFV E2抗體存在，使用IDEXX CSFV Ab測試套件(IDEXX)偵測豬瘟病毒(CSFV)的抗體。計算血清中CSFV E2特定抗體之含量，若阻斷百分比高於40%則為陽性(圖3)。結果顯示桿狀病毒載體有展現融合蛋白CSFV E2-Bac。圖3顯示不論桿狀病毒此否經過減活，桿狀病毒載體CSFV E2-gBac相較於桿狀病毒載體CSFV E2-Bac在小鼠體內可誘發更高之抗CSFV E2抗體滴定量(antibody titer)。
在此亦比較三種桿狀病毒載體於誘發豬隻免疫原性反應之效果。三隻SPF(不帶特定病原體)豬隻接受免疫兩次(6週齡及9週齡)，採肌內路徑，分別使用108pfu之基因重組桿狀病毒載體E2-gBac、E2-gp64、E2-Bac及PBS。免疫接種後，分析豬隻血清確認有無抗CSFV E2抗體存在，使用IDEXX CSFV Ab測試套件(IDEXX)。計算CSFV E2特定中和抗體在血清中之含量，若阻斷百分比高於43%則判定為陽性且有效。
如圖4所示，以E2-gBac免疫之豬隻能夠經受CSFV挑戰，顯示豬隻體內誘發適當中和抗體(SN滴定量16，IDEXX阻斷率43%)。此結果證明gBac平台為一疫苗平台。圖4顯示桿狀病毒載體CSFV E2-gBac相較於桿狀病毒載體CSFV E2-Bac及CSFV E2-gp64在豬隻體內可誘發更高之抗CSFV E2抗體滴定量。結果顯示本發明之gBac表面展現平台可較前案桿狀病毒載體誘發更強之免疫性。
在此亦產生桿狀病毒載體以將豬流行性下痢病毒S1蛋白(PEDV S1)轉導入細胞以供接種運用，並測試其誘發免疫原性反應之效果。簡言之，三頭9週齡之SPF豬隻(分別標號為73、74及75)各經由肌內路徑以108pfu之基因重組桿狀病毒載體PEDV S1-gBac或PBS免疫接種兩次。免疫接種後，使用PED病毒之ELISA檢驗以分析豬隻血清(接種後1至4週)，確認有無抗PEDV抗體存在。圖5顯示三頭豬隻體內桿狀病毒載體PEDV S1-gBac誘發之對抗豬流行性下痢病毒抗體滴定量。
圖6A-B為西方墨點圖，顯示Sf-9細胞樣本偵測到CSFV E2-gBac之E2抗原(圖6A)及PEDV S1-gBac之S1抗原(圖6B)。於細胞溶解產物及收集而得之病毒載入不同細胞數及病毒滴定量。在此亦建構桿狀病毒載體人類計畫 性細胞凋亡蛋白1-gBac(hPD-1-gBac)。為測試抗原之生產，將基因重組桿狀病毒或感染細胞溶解產物置入8-10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)後轉移至硝化纖維膜。外來抗原是藉由小鼠抗gp64 mAb(圖6C)及抗PDCD-1抗體(圖6D)(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)作為初級抗體而被偵測。使用ECL PLUSTM西方墨點偵測試劑(GE Healthcare)顯示蛋白帶。圖6D顯示桿狀病毒在外膜套上展現人類PD-1抗原，且展現之PD-1抗原可被商購抗PDCD-1抗體(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)所辨識。
綜言之，本發明之載體對去活化劑不敏感(如圖3)並展現較高之免疫原性(如圖4)。表1顯示胜肽序列及序列識別號。
*全長GP64：GP64訊號胜肽(SP)(GP641-20)加底線並以斜體表示。GP64最小片段(GP64 minimum or GP64 mini)(GP64327-482)為加底線且非斜體。GP64跨膜區域(TM)(GP64483-505)僅以粗體表示。GP64細胞質轉導區(CTD)(GP64506-512)僅以斜體表示。
E2-gBac蛋白(SP-E2-GP64 mini-TM/CTD)：GP64訊號胜肽(SP)(GP641-20)加底線並以斜體表示。GP64最小片段(GP64327-482)為加底線且非斜體。GP64跨膜區域(TM)(GP64483-505)僅以粗體表示。GP64細胞質轉導區(CTD)(GP64506-512)僅以斜體表示。
S1-gBac蛋白(SP-S1-GP64 mini-TM/CTD)：GP64訊號胜肽(SP)(GP641-20)加底線並以斜體表示。GP64最小片段(GP64327-482)為加底線且非斜體。GP64跨膜區域(TM)(GP64483-505)以粗體表示。GP64細胞質轉導區(CTD)(GP64506-512)僅以斜體表示。
hPD1-gBac蛋白(SP-hPD1-GP64 mini-TM/CTD)：GP64訊號胜肽(SP)(GP641-20)加底線並以斜體表示。GP64最小片段(GP64327-482)為加底線且非斜體。GP64跨膜區域(TM)(GP64483-505)以粗體表示。GP64細胞質轉導區 (CTD)(GP64506-512)僅以斜體表示。
雖然本發明在此以多項實施例加以闡述說明，熟悉本技藝人士應可為各種修改及改良。本發明並不限於所述特定形式，且所有不脫離本發明精神之範疇之修改俱應屬於所附申請專利範圍所定義之範疇。實施例及實例之選擇與描述係為解說本發明之原理及其實務應用，以利其他熟悉本技藝人士運用本發明、各種實施例連同各種適合其實務應用之修改。熟悉本發明所屬技藝之人士應可思及不脫離本發明精神及範圍之替代實施例。據此，本發明之範圍係由所附申請專利範圍界定，而非上開說明及在此描述之示範實施例。
本發明引用及討論之參照資料可能包括專利、專利申請及各種公開文獻。此等參照資料之引用及/或討論僅為澄清本發明之描述，並非承認任何此等參考資料為本發明之「前案」。所有在本說明書中引述及討論之參照資料俱以其參照而整體合併於此，如同各參照資料個別合併於此。

Claims (17)

  1. 一種基因重組桿狀病毒，在其外膜上展現一融合蛋白，該融合蛋白包含：(i)一異種抗原；以及(ii)一桿狀病毒外膜套GP64蛋白之C端區域，其至少為100個胺基酸殘基之長度，且缺乏如序列識別號：2或3所示的B12D5結合決定位的序列。
  2. 如請求項1所述之基因重組桿狀病毒，其基因組包含一編碼一融合蛋白之轉基因，該融合蛋白包含：(a)一訊號胜肽；(b)該異種抗原；以及(c)該桿狀病毒外膜套GP64蛋白之C端區域；其中該異種抗原係位於該訊號胜肽與該GP64蛋白C端區域之間。
  3. 一種載體，其係包含一編碼一融合蛋白之轉基因，該融合蛋白包含：(a)一訊號胜肽，位於該融合蛋白之N端；(b)一異種抗原；以及(c)一桿狀病毒外膜套GP64蛋白之C端區域，其至少為100個胺基酸殘基之長度，且缺乏如序列識別號：2或3所示的B12D5結合決定位的序列；其中該異種抗原係位於該訊號胜肽與該GP64蛋白C端區域之間。
  4. 如請求項3所述之載體，其係一基因重組桿狀病毒。
  5. 如請求項3所述之載體或如請求項2所述之基因重組桿狀病毒，其中該轉基因係以可操作之方式連結至一啟動子。
  6. 如請求項1所述之基因重組桿狀病毒，其中該GP64蛋白之C端區域缺乏序列識別號：4之胺基酸序列。
  7. 如請求項1所述之基因重組桿狀病毒，其中該GP64蛋白之C端區域包含序列識別號：1之第327至512位胺基酸殘基。
  8. 如請求項1所述之基因重組桿狀病毒，其中該GP64蛋白之該C端區域具有一N端，該N端介於序列識別號：1之第292至328位胺基酸殘基之間。
  9. 如請求項1所述之基因重組桿狀病毒，其中該訊號胜肽包含一胺基酸序列，該胺基酸序列係選自以下群組：序列識別號：5、6、7、8、9、10、11及12。
  10. 一種昆蟲細胞，其被如請求項1所述之基因重組桿狀病毒所轉導。
  11. 如請求項1所述之基因重組桿狀病毒，其中該異種抗原係選自以下群組中之至少一者：一病原體蛋白、一癌細胞蛋白以及一免疫檢查點蛋白。
  12. 如請求項11所述之基因重組桿狀病毒，其中：(i)該病原體係選自以下群組中之至少一者：人類乳突病毒、豬生殖與呼吸綜合症病毒、人類免疫不全病毒-1、登革熱病毒、C型肝炎病毒、B型肝炎病毒、豬環狀病毒2、豬瘟病毒、口蹄疫病毒、新城病病毒、傳染性胃腸炎病毒、豬流行性下痢病毒、流行性感冒病毒、假性狂犬病病毒、微小病毒、豬水疱病病毒、痘瘡病毒、輪狀病毒、肺炎黴漿菌、單純疱疹病毒、傳染性支氣管炎、傳染性華氏囊病病毒；(ii)該癌症係選自以下群組中之至少一者：非小細胞肺癌、乳癌、黑色素瘤、淋巴瘤、結腸癌、肝細胞癌及其任何組合；以及(iii)該免疫檢查點係選自以下群組中之至少一者：PD-1、PD-L1、PD-L2及CTLA-4。
  13. 如請求項1所述之基因重組桿狀病毒，其中該異種抗原係選自以下群組中之至少一者：豬瘟病毒外膜套醣蛋白E2、豬流行性下痢病毒S1蛋白、計畫性細胞凋亡蛋白1以及一腫瘤相關抗原。
  14. 如請求項3所述之載體，其中該異種抗原係選自以下群組中之至少一者：一病原體蛋白、一癌細胞蛋白以及一免疫檢查點蛋白。
  15. 一種如請求項3所述之載體或如請求項1所述之基因重組桿狀病毒供用於製備一醫藥品之用途，該醫藥品可於需要治療之個體體內誘發一抗原特異性免疫原性反應。
  16. 一種基因重組桿狀病毒，在其外膜上展現一融合蛋白，該融合蛋白包含：(i)一異種抗原；以及(ii)一桿狀病毒外膜套GP64蛋白之C端區域，其至少為100個胺基酸殘基之長度，且缺乏B12D5結合決定位的序列，該B12D5結合決定位的序列位於一具有如序列識別號：4所示序列的GP64蛋白中央鹼性區域內。
  17. 一種載體，其係包含一編碼一融合蛋白之轉基因，該融合蛋白包含：(a)一訊號胜肽，位於該融合蛋白之N端；(b)一異種抗原；以及(c)一桿狀病毒外膜套GP64蛋白之C端區域，其至少為100個胺基酸殘基之長度，且缺乏B12D5結合決定位的序列，該B12D5結合決定位的序列位於一具有如序列識別號：4所示序列的GP64蛋白中央鹼性區域內；其中該異種抗原係位於該訊號胜肽與該GP64蛋白C端區域之間。
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