CN112159480B

CN112159480B - 一种鸡传染性法氏囊病病毒多抗原表位蛋白及其应用

Info

Publication number: CN112159480B
Application number: CN202011099954.4A
Authority: CN
Inventors: 吴异健; 陈强; 刘珍妮; 李明慧; 廖吕燕; 李娜
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2020-10-15
Filing date: 2020-10-15
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2040-10-15
Also published as: CN112159480A

Abstract

本发明提供的是一种鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）多抗原表位蛋白及其应用，所述蛋白其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，本申请将鸡免疫球蛋白IgG重链部分恒定区（γCH）作为多表位融合蛋白的载体蛋白，将IBDV代表性毒株VP2和VP3上的B细胞表位和T细胞表位基因进行串联合成后与γCH编码基因相连接，构建重组质粒pET‑VP₂₊₃‑γCH，并转化至大肠杆菌BL21中进行表达。重组多抗原表位融合蛋白pVP₂₊₃‑γCH经过纯化和鉴定后通过SPF鸡进行的免疫攻毒保护试验，初步显示出了良好的免疫保护效果。本研究成功构建和表达重组多抗原表位蛋白pVP₂₊₃‑γCH，为IBDV多表位疫苗的研发奠定基础。

Description

一种鸡传染性法氏囊病病毒多抗原表位蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种鸡传染性法氏囊病病毒多抗原表位蛋白及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

目前，临床上使用的畜禽病毒病疫苗主要是弱毒苗和灭活苗。弱毒苗在临床应用中可能会存在毒株返强以及疫苗株与野生型毒株基因重组等安全性问题。而灭活苗更倾向于诱导体液免疫，其诱导细胞免疫的能力相对较弱。一个理想的疫苗除应具有安全性之外，还应同时诱导机体的特异性体液免疫和细胞免疫。通过诱导体液免疫产生高亲和力中和抗体，阻止病毒与靶细胞受体的结合。而诱导细胞免疫则产生特异性细胞毒性T细胞(CTL)，CTL识别靶细胞后能够直接裂解靶细胞或者诱导靶细胞的凋亡，从而抑制病毒在体内的复制。除了常规的灭活苗和弱毒苗，目前研究的较多的亚单位疫苗和DNA疫苗。这几种新型疫苗有较多优点，但也存在一些不足的地方。亚单位疫苗一般通过生物技术手段直接得到较纯的病毒主要中和抗原，免疫动物后能直接迅速诱导机体产生大量的中和抗体。亚单位疫苗存在的不足是以目前的技术手段想要得到很纯的亚单位蛋白成本相对比较高昂，而亚单位蛋白纯度不够临床免疫效果也受影响。有关DNA疫苗研究已有很多年，传统的DNA疫苗是将病原的主要抗原的基因克隆到真核表达质粒上，通过重组的真核质粒对动物进行免疫，免疫后外源的病毒蛋白可在动物体内表达，作为动物机体来说外源蛋白的表达将会刺激机体产生免疫应答，产生相应的抗体，从而保护机体。但是DNA疫苗还有许多不足，主要是真核表达质粒在动物机体表达外源蛋白不容易，即使表达有蛋白但是表达的蛋白能否引起机体免疫应答也是其中一个问题；同时大量提纯质粒成本还是比较高昂，不易实现大规模的应用。多表位疫苗是近年发展起来的一种基于目标抗原表位设计的新型疫苗，相对于传统弱毒疫苗，其安全性更高。将病毒蛋白上的多个B细胞或T细胞表位整合到特定载体上构建的多表位疫苗能够有效刺激机体产生针对多个表位的B细胞或T细胞克隆，从而有利于控制病毒的感染。多表位疫苗在抑制病毒复制和对抗免疫逃逸株等方面都具有独特优势，是目前疫苗研究的一个热点。

临床常用的IBD疫苗主要是灭活苗和弱毒苗，灭活苗主要是通过扩增病毒后经过灭活使病毒失去致病型但仍有免疫原性而能够诱发鸡产生相应的抗体；弱毒苗是通过不断的传代使病毒逐渐失去原有的毒力以及高致病性，能导致鸡发生免疫反应而提高抗体水平又不会使鸡严重感染和发病。这两种疫苗临床效果一直都比较良好，基本可以控制预防IBD的发生，IBD的爆发因此而相对被控制。不过值得注意的是虽然常规疫苗可以一定程度上抑制疾病的发生，但是现在有一些关于免疫失败的报道，接种过IBDV疫苗的鸡场因免疫失败而爆发此病。这其中导致免疫失败的原因很多，而病毒本身与疫苗株差异直接导致了免疫接种产生的抗体无法抵抗病毒的攻击是免疫失败的主要原因。IBDV容易发生变异，许多免疫失败的报道表明对新型疫苗的研究刻不容缓。本发明构建表达了以鸡免疫球蛋白IgG重链部分恒定区为载体蛋白的包含IBDV代表性毒株VP2和VP3上的B细胞表位和T细胞表位的重组多抗原表位融合蛋白pVP₂₊₃-γCH，该蛋白免疫保护效果，为 IBDV多表位疫苗的研发奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸡传染性法氏囊病病毒多抗原表位蛋白及其应用，提供鸡传染性法氏囊病病毒多抗原表位蛋白的制备方法，以及通过研究比较本发明制备的蛋白与两种IBDV商品疫苗对鸡的免疫效果，为IBDV疫苗的研制和该病的防治提供帮助。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

将鸡免疫球蛋白IgG重链部分恒定区（γCH）作为多表位免疫原的载体蛋白，将IBDV代表性毒株VP2和VP3上的B细胞表位和T细胞表位基因进行串联合成后与γCH编码基因相连接，构建重组质粒pET-VP₂₊₃-γCH；重组质粒pET-VP₂₊₃-γCH转化至大肠杆菌 BL21中进行表达，重组多抗原表位融合蛋白pVP₂₊₃-γCH经过纯化和鉴定后通过SPF鸡进行的免疫攻毒保护试验，初步显示出了良好的免疫保护效果。重组多抗原表位融合蛋白pVP₂₊₃-γCH，序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1： MSLDAKLRCLVVNLPSDSSLSVTWTREKSGNLRPDPMVLQEHFNGTYSASSAVPVSTQDWLSGERFTCTVQHEELPLPLSKSVYRNTGPTTPPLIYPFAPHPEELSLSRVTLSCLVRGFRPRDIEIRWLRDHRAVPATEFVTTAVLPEERTANGAGGDGDTFFVYSKVDKLMEMKHRNPRRAGGGGAGSKSQRAKYGGGGNGHRGPSPGQLGGGGLQSDGNYKFDGGGGSKNDGQAGEQMGGGGVTEYGRFDPGAMNGGGGVSRSLTVRSSTL。

所述鸡传染性法氏囊病病毒重组多抗原表位蛋白在制备鸡传染性法氏囊病病毒疫苗中的应用

本发明的优点在于：

本发明构建的以鸡免疫球蛋白IgG重链恒定区CH₂₊₃（γCH）为载体，针对IBDV主要结构蛋白和保护性抗原的VP2蛋白和调控病毒复制的VP3蛋白的多表位的原核表达的重组多抗原表位融合蛋白pVP₂₊₃-γCH，该多抗原表位融合蛋白含有IBDV VP2和VP3多个B细胞和T细胞抗原表位，能够有效刺激机体产生针对多个表位的B细胞或T细胞克隆，从而有利于控制病毒的感染。弱毒苗在临床应用中可能会存在毒株返强以及疫苗株与野生型毒株基因重组等安全性问题；而灭活苗更倾向于诱导体液免疫，其诱导细胞免疫的能力相对较弱。相较于弱毒苗和灭活苗存在的不足，多表位疫苗在抑制病毒复制和对抗免疫逃逸株等方面都具有独特优势。动物免疫攻毒试验结果表明：pVP₂₊₃-γCH、亚单位疫苗和灭活疫苗在免疫接种后都能对攻毒后的鸡产生保护作用，但从诱导产生的VP2抗体水平上来看，pVP₂₊₃-γCH比亚单位疫苗和灭活病毒诱导产生抗体的作用更快更强，多抗原表位融合蛋白融合有鸡IgG重链恒定区CH₂₊₃，免疫效果比亚单位抗原好；同时pVP₂₊₃-γCH重组多抗原表位蛋白的制备成本低，构建好表达质粒后可以大批量工业化表达生产，易于纯化。该IBDV VP2和VP3重组多抗原表位融合蛋白的构建表达为临床预防IBD的发生奠定基础。

附图说明

图1 多抗原表位融合蛋白VP₂₊₃-γCH氨基酸序列的Protean软件分析结果。

图2 pVP₂₊₃-γCH蛋白的诱导表达情况的Western Blot分析。M，标准蛋白分子质量；1，未经IPTG诱导得到的蛋白；2，经IPTG诱导得到的蛋白；3，超声后的上清可溶性蛋白；4，超声后沉淀包涵体蛋白。

图3 pVP₂₊₃-γCH包涵体蛋白Ni-NTA纯化方法的优化。 M，标准蛋白分子质量；1，纯化前含8 M尿素包涵体平衡液的pVP₂₊₃-γCH融合蛋白；2，上样流出液；3，平衡液洗涤流出液；4，20 mM咪唑洗涤流出液；5，100 mM咪唑洗脱液；6，150 mM咪唑洗脱液；7，200 mM咪唑洗脱流出液；8，300 mM咪唑洗脱液。

图4 pVP₂₊₃-γCH蛋白的梯度透析复性和浓缩后的SDS-PAGE分析； M，标准蛋白分子质量；1，经IPTG诱导的pVP₂₊₃-γCH蛋白；2，超声后的包涵体蛋白；3，透析后得到的pVP₂₊₃-γCH蛋白；4，透析后浓缩得到的pVP₂₊₃-γCH蛋白。

图5间接ELISA检测免疫接种前后各组鸡血清VP2抗体水平的变化。

图6攻毒对照组和免疫攻毒组鸡在攻毒后的相关病理变化。A-D：分别为多抗原表位蛋白抗原组、亚单位疫苗组和灭活疫苗组的鸡免疫后攻毒的剖检变化，攻毒后均未见明显的发病的临床症状，鸡群精神活跃、饮食饮水正常，与空白对照组鸡形态行为无明显差异；E：攻毒对照组在攻毒后死亡的鸡肛门处粘连白色粪便并有腹膜混浊的现象；F：攻毒对照组死亡的鸡剖检后出现的腹腔积水和肾脏花斑状病变；G：免疫组鸡（左）与攻毒对照组鸡（右）两侧肾脏对比情况，免疫组鸡肾脏质地和色泽均正常，攻毒对照组鸡明显呈灰白色并出现了花斑条索状病变；H和I：攻毒对照组鸡死亡后剖检发现其法氏囊较免疫攻毒组鸡有轻微肿大和出血，个别病鸡肺脏出现黑色坏死灶，脾脏有轻微肿大，法氏囊有少量的出血点剖开可见明显的淡黄色粘液。

具体实施方式

实施例1

1、传染性法氏囊病病毒多抗原表位融合蛋白的制备

（1）传染性法氏囊病病毒抗原表位的预测与筛选

使用ABCpred预测方法，结合DNAStar软件Protean程序对GenBank数据库中IBDV参考毒株HLJ0504 （GQ451330）、Gx （AY444873）、YS07（FJ695138）、E（AF133904）的VP2蛋白和VP3蛋白进行抗原表位的预测，综合两种算法筛选得到数个B细胞抗原位点和T细胞抗原位点，相关信息见表1。

表1 IBDV多表位蛋白相关的抗原位点

设计好的多抗原表位蛋白氨基酸序列通过Protean软件进行分析，结果如图1，重新串联排列的多抗原表位蛋白抗原指数较高，表面可能性较大，可用于原核表达制备多表位蛋白疫苗。

（2）多抗原表位蛋白核苷酸序列的设计与合成

分别从筛选出的数个B细胞抗原表位和T细胞抗原表位中选出3个VP2蛋白抗原表位、2个VP3蛋白B细胞抗原表位、1个VP2蛋白T细胞抗原表位和1个VP3蛋白T细胞抗原表位，通过4个甘氨酸（GGGG）将各抗原表位进行串联排列，得到预期的多抗原表位蛋白的氨基酸序列，通过Protean软件分析多抗原表位蛋白的抗原位点情况，并命名为VP₂₊₃。将多抗原表位蛋白的氨基酸序列推导为核苷酸序列，尽可能选择大肠杆菌优势密码子，同时在序列两端分别加上Hind III和Xho I酶切位点。将设计好的多表位蛋白核苷酸序列送生物公司进行基因合成，获得IBD多表位蛋白核苷酸序列见SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.3：AAGCTTATGGAGATGAAGCATCGCAATCCCAGGCGGGCTGGTGGTGGTGGTGCAGGCAGCAAGTCACAAAGGGCCAAGTACGGTGGTGGTGGTAATGGGCATCGAGGGCCAAGCCCCGGCCAGCTAGGTGGT GGTGGTCTGCAGAGCGATGGGAACTACAAGTTCGATGGTGGTGGTGGTTCCAAAAATGATGGCCAGGCAGGGGAACAGATGGGTGGTGGTGGTGTCACAGAATACGGCCGATTCGACCCAGGAGCCATGAACGGTGGTGGTGGTGTGAGTCGGAGTCTCACAGTAAGGTCAAGCACACTCTAACTCGAG，

划线部分分别代表酶切位点Hind III和Xho I，分别对应原核表达质粒pET-32a(+)中的Hind III和XhoI酶切位点。其中黑体加粗为抗原表位的核苷酸序列，斜体部分为将各抗原表位进行串联排列的4个甘氨酸核苷酸序列。

（3）载体蛋白序列的扩增

选择鸡免疫球蛋白IgG的重链恒定区CH₂和CH₃的部分序列作为IBDV多表位蛋白的载体蛋白。参照NCBI鸡IgG重链序列（GenBank登录号：X07174.1和KJ489311.3）设计一对特异性引物，包括重链恒定区CH₂和CH₃的部分序列，序列全长501 bp，命名为γCH，上游引物P3序列：5′-CCGGAATTCATGAGCTTAGACGCCAAACTGAGGT-3′（EcoR I），下游引物P4序列：5′-GCGGTCGACCTTACTGTACACGAAGAAGGT-3′（Sal I），由生物公司合成。目的基因序列如SEQ IDNO.2所示，具体见下：

GAATTCATGAGCTTAGACGCCAAACTGAGGTGCCTGGTGGTCAACCTGCCCAGCGATTCCAGCCTCAGCGTCACCTGGACCAGGGAGAAGAGTGGGAACCTCCGGCCCGACCCGATGGTCCTCCAAGAACACTTCAACGGCACCTACAGCGCCAGCAGCGCCGTCCCCGTCAGCACCCAGGATTGGTTATCCGGGGAGAGGTTCACCTGCACCGTGCAGCACGAGGAGCTGCCCCTGCCGCTCAGCAAGAGCGTCTACAGGAATACGGGACCCACCACCCCACCTCTGATCTACCCCTTCGCCCCCCACCCGGAAGAGCTGTCCCTCTCCCGCGTCACCTTGAGCTGCCTGGTCCGCGGCTTCCGCCCACGTGACATCGAGATCCGGTGGCTCCGCGACCACCGCGCCGTTCCCGCCACCGAATTCGTCACCACCGCCGTCCTACCGGAAGAGAGAACCGCAAACGGCGCCGGCGGTGACGGCGACACCTTCTTCGTGTACAGTAAG GTCGAC，

划线部分分别代表酶切位点EcoR I和Sal I，分别对应原核表达质粒pET-32a(+)中的EcoR I和Sal I酶切位点。

（4）载体蛋白原核表达质粒的构建

对（3）扩增的目的基因片段和pET-32a(+)质粒进行EcoR I和Sal I的双酶切反应，双酶切产物回收后进行连接，连接完毕转化至DH5α感受态细胞，涂板后次日挑取白色单菌落培养，提取质粒，命名为pET-γCH。

（5）多抗原表位融合蛋白原核表达质粒的构建与鉴定

以步骤（4）中构建好经测序无误的阳性质粒作为载体，以步骤（2）中设计好并直接合成的多表位蛋白基因作为目的基因，通过Hind III和Xho I两个酶切位点，将目的基因插入到pET-γCH阳性质粒中。将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂板后次日挑取单个分散的菌落进行培养。培养13 h后提取质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定，质粒命名为pET-VP₂₊₃-γCH送生物公司测序。测序结果如下，测序结果与所设计的目的序列一致，未出现碱基突变和移码等。

pET-VP₂₊₃-γCH重组质粒测序结果：

TTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCGAATTCATGAGCTTAGACGCCAAACTGAGGTGCCTGGTGGTCAACCTGCCCAGCGATTC CAGCCTCAGCGTCACCTGGACCAGGGAGAAGAGTGGGAACCTCCGGCCCGACCCGATGGTCCTCCAAGAACACTTC AACGGCACCTACAGCGCCAGCAGCGCCGTCCCCGTCAGCACCCAGGATTGGTTATCCGGGGAGAGGTTCACCTGCA CCGTGCAGCACGAGGAGCTGCCCCTGCCGCTCAGCAAGAGCGTCTACAGGAATACGGGACCCACCACCCCACCTCT GATCTACCCCTTCGCCCCCCACCCGGAAGAGCTGTCCCTCTCCCGCGTCACCTTGAGCTGCCTGGTCCGCGGCTTC CGCCCACGTGACATCGAGATCCGGTGGCTCCGCGACCACCGCGCCGTTCCCGCCACCGAATTCGTCACCACCGCCG TCCTACCGGAAGAGAGAACCGCAAACGGCGCCGGCGGTGACGGCGACACCTTCTTCGTGTACAGTAAGGTCGACGGTGGACCCACAGAAGCTTGCATGGAGATGAAGCATCGCAATCCCAGGCGGGCTGGTGGTGGTGGTGCAGGCAGCAAG TCACAAAGGGCCAAGTACGGTGGTGGTGGTAATGGGCATCGAGGGCCAAGCCCCGGCCAGCTAGGTGGTGGTGGTC TGCAGAGCGATGGGAACTACAAGTTCGATGGTGGTGGTGGTTCCAAAAATGATGGCCAGGCAGGGGAACAGATGGG TGGTGGTGGTGTCACAGAATACGGCCGATTCGACCCAGGAGCCATGAACGGTGGTGGTGGTGTGAGTCGGAGTCTC ACAGTAAGGTCAAGCACACTCTAACTCGAG。

其中γCH 序列大小501bp，多表位序列，不含TAA终止子共206bp。

（6）转化

将pET-VP₂₊₃-γCH阳性重组质粒转化BL21感受态细胞，涂板后待13 h后挑取单个分散的菌落接种新培养基。

（7）多抗原表位融合蛋白的诱导表达

接种培养的菌液重新接种到含Amp的LB培养基中，37 ℃、200 r/min培养3 h至OD_600nm=0.6时，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L进行蛋白诱导，同时设立不加IPTG的对照组，培养3 h后分别取菌液提取总蛋白进行SDS-PAGE分析。另取部分诱导后的菌体加入适量PBS（pH=7.4）进行超声破碎，菌液经超声变清亮后取上清液和沉淀提取总蛋白，进行SDS-PAGE分析。将诱导得到多抗原表位融合蛋白命名为pVP₂₊₃-γCH。如图2所示，未加入IPTG进行诱导的在47.5 ku处未见明显条带（第一泳道），经IPTG诱导的在47.5 ku处有一明显条带（第二泳道）。经IPTG诱导的菌体加PBS（pH=7.4）重悬后超声破碎，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，结果如图2，超声后上清可溶性蛋白并无明显的目的条带（第三泳道），沉淀中包涵体蛋白有明显大小约47.5 ku的条带（第四泳道），即成功大量诱导表达得到了以包涵体为主的pVP₂₊₃-γCH目的蛋白。

（8） pVP₂₊₃-γCH蛋白的镍柱亲和纯化

将超声破碎后得到的pVP₂₊₃-γCH包涵体蛋白进行镍柱亲和纯化。目的蛋白上样后，经过10倍柱体积的包涵体平衡液洗涤后，分别用20 mM、100 mM、150 mM、200 mM和300mM咪唑进行洗脱，SDS-PAGE分析蛋白洗脱情况，得到最适宜的咪唑洗脱浓度。以最适宜的咪唑洗脱浓度进行pVP₂₊₃-γCH包涵体蛋白纯化时的洗脱浓度。如图3所示，上样前的包涵体蛋白（第1泳道）上样后的流出液（第2泳道）含有大量的杂蛋白，基本不含目的蛋白；上样完，使用包涵体平衡液进行洗涤后的流出液（第3泳道）同样含有大量的杂蛋白以及少量的目的蛋白；包涵体平衡液洗涤完毕，分别前后使用20 mM、100 mM、150 mM、200 mM、和300 mM咪唑洗脱液进行洗脱（第四至第八泳道），其中200 mM浓度的咪唑洗脱液即可大量的洗脱出目的蛋白。即pVP₂₊₃-γCH包涵体蛋白纯化方法的优化为：上样后，通过包涵体平衡液和20 mM咪唑洗脱液分别洗涤10倍柱体积，洗涤完毕即可用200 mM咪唑洗脱液大量洗脱得到较纯的pVP₂₊₃-γCH包涵体蛋白。

（9） pVP₂₊₃-γCH蛋白的透析复性和浓缩

将纯化得到的pVP₂₊₃-γCH蛋白在含6 M、4 M、2 M、0.1 M和0 M尿素的PBS（pH=7.4）溶液进行梯度透析，以去除纯化后pVP₂₊₃-γCH蛋白溶液中存在的高浓度尿素和咪唑。透析复性后，使用PEG20 000进行浓缩，得到浓度较高的pVP₂₊₃-γCH包涵体蛋白，取透析复性后的蛋白和浓缩后的蛋白分别进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE分析结果如图4，透析后蛋白（第3泳道）可见一条较淡的目的条带和一条杂带，经浓缩后（第4泳道）可见一条较浓的目的条带，即本实验成功表达并纯化了设计好的多抗原表位蛋白，其序列如SEQ ID NO.1所示。

、构建表达的传染性法氏囊病病毒重组抗原pVP2+3-γCH免疫效果

（1）实验动物分组和处理

取健康、体态正常的14日龄的SPF雏鸡100只，随机分组为空白对照组、多抗原表位蛋白抗原组、亚单位疫苗组、灭活疫苗组和攻毒对照组，每组20只。免疫当天空白对照组随机取5只通过翼下静脉采血分离血清采用间接ELISA方法检测血清中VP2抗体水平。空白对照组和攻毒对照组：腿部肌肉注射生理盐水0.2 mL/羽；多表位蛋白抗原组：将纯化好的多抗原表位蛋白用生理盐水稀释至1 mg/mL，再与等体积弗氏佐剂混合，乳化后即用于免疫，多表位蛋白终浓度为0.5 mg/mL，免疫剂量为0.2 mL/羽，免疫方式为腿部肌肉和皮下注射；亚单位疫苗组：鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗（商品苗），按说明书推荐免疫剂量为0.2 mL/羽，免疫方式为腿部肌肉和皮下注射；灭活病毒组：鸡新城疫、传染性法氏囊病二联灭活疫苗（商品苗），按说明书推荐免疫剂量为0.2 mL/羽，免疫方式为腿部肌肉和皮下注射。各组试验鸡正常隔离饲养，免疫后24 h内观察接种疫苗的试验鸡是否出现应激或其他不适的症状。免疫后第1、2、4周各试验组随机抓5只试验鸡采血分离血清，采用间接ELISA检测血清中VP2抗体水平。免疫后第4周除空白对照组外，其余各组试验鸡用10^4.33EID₅₀/0.2ml的 BC6/85囊毒株经口服、点眼途径攻毒，每只鸡0.2 mL（其中滴鼻点眼和口服各 0.1mL），攻毒后观察鸡的临床症状，并于攻毒后第14天剖杀所有试验鸡观察法氏囊等的病变情况。综合中和抗体效价、临床症状、法氏囊病变情况，以亚单位疫苗组和灭活疫苗的免疫效果为对照，评价本研究构建表达的多抗原表位蛋白抗原的免疫效果。

（2）ELISA检测免疫后传染性法氏囊病病毒VP2血清抗体水平

采用鸡传染性法氏囊病病毒VP2抗体诊断试剂盒（哈尔滨国生生物科技股份有限公司）检测免疫前、免疫后1周、2周和4周试验鸡血清进行血清中VP2抗体水平，检测结果见表2，检测结果使用SPSS 17.0 进行差异显著性分析。差异性分析结果如图5，免疫前随机各组取5只鸡采血清检测，检测结果表明VP2抗体水平呈阴性（OD_450nm＜0.1571）；免疫后1周各组鸡血清VP2抗体水平基本无明显的变化（p＞0.05）；免后2周，亚单位疫苗组和灭活疫苗组相比免疫后1周的VP2抗体水平显著升高（p＜0.05），多抗原表位蛋白抗原组相比免疫后1周的VP2抗体水平极显著升高（p＜0.01）；免疫后4周，多抗原表位蛋白抗原组和亚单位疫苗组相比免疫后1周VP2抗体水平都极显著升高（p＜0.01），灭活疫苗组比免疫后1周VP2抗体水平显著升高（p＜0.05）。VP2抗体水平检测结果表明多抗原表位蛋白抗原和亚单位疫苗在免疫后2周至4周时间抗体水平极显著升高，灭活疫苗在免疫后2周至4周可产生较显著的抗体水平上升。

表2 免疫前后各试验组鸡IBDV-VP2血清抗体的间接ELISA检测结果

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）；肩标不同大写字母表示差异极显著（p＜0.01）；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(p＞0.05)。

（3）免疫攻毒保护试验

免疫后第4周除空白对照组外，其余各组试验鸡用10^4.33EID₅₀/0.2 ml的 BC6/85囊毒株经口服、点眼途径攻毒，每只鸡0.2 mL（其中滴鼻点眼和口服各 0.1 mL），攻毒后观察鸡的临床症状，并于攻毒后第14天剖杀所有试验鸡观察法氏囊的病变情况。综合中和抗体效价、临床症状和法氏囊病变情况，以亚单位疫苗组和灭活疫苗的免疫效果为对照，评价本研究构建表达的多抗原表位蛋白抗原的免疫效果。

多抗原表位蛋白抗原组、亚单位抗疫苗组和灭活疫苗组的试验鸡和空白对照组的试验鸡免疫后以及攻毒前生长情况均正常，未出现发病和死亡的情况；攻毒后，空白对照组试验鸡生长情况正常，攻毒对照组试验鸡在攻毒后精神逐渐萎靡不振、闭目嗜睡、排灰白色粪便等症状，分别在第5天、第8天和第9天各死亡一只；多抗原表位蛋白抗原组、亚单位疫苗组和灭活疫苗组的鸡在攻毒后无明显的发病症状，生长发育状况良好。

（4）临床症状和病理变化的观察

攻毒后每天分别记录鸡的生长情况，观察鸡的临床表现，是否有拉稀等明显症状，对于可能出现死亡的鸡进行解剖观察病理变化，攻毒后第14天剖杀所有试验鸡，观察法氏囊、肝脏、脾脏、肾脏、腿肌外侧等有无明显的肿大、出血点、坏死点以及渗出物等，对攻毒后的各试验组进行比较分析。

多抗原表位蛋白抗原组、亚单位疫苗组和灭活疫苗组的试验鸡攻毒后均未见明显的发病的临床症状，鸡群精神活跃、饮食饮水正常，与空白对照组的试验鸡形态行为无明显差异，如图6A、B、C和D图；攻毒对照组的鸡在攻毒后有不同程度的精神沉郁、嗜睡、出现灰白色粪便并且黏连肛门、羽毛变脏乱等临床症状。多抗原表位蛋白抗原组、亚单位疫苗组和灭活疫苗组的鸡在攻毒后未出现死亡，攻毒对照组分别在第5天、第8天和第9天各死亡一只，病鸡明显肛门有白色粪便黏连（图6E），剖检后可见腹膜大面积出现混浊并伴有腹水（图6F），两侧肾脏呈灰白色花斑状表明覆盖着白色尿酸盐渗出物（图6G），个别病鸡肺脏出现黑色坏死灶，脾脏有轻微肿大，法氏囊有少量的出血点剖开可见明显的淡黄色粘液（图6H、I）。综合接种免疫后的抗体水平的变化和攻毒后的临床症状以及剖检变化，本发明成功构建重组抗原pVP₂₊₃-γCH，并在试验鸡中初步显示出了良好的免疫效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种鸡传染性法氏囊病病毒多抗原表位蛋白及其应用

<130> 6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 273

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Leu Asp Ala Lys Leu Arg Cys Leu Val Val Asn Leu Pro Ser

1 5 10 15

Asp Ser Ser Leu Ser Val Thr Trp Thr Arg Glu Lys Ser Gly Asn Leu

20 25 30

Arg Pro Asp Pro Met Val Leu Gln Glu His Phe Asn Gly Thr Tyr Ser

35 40 45

Ala Ser Ser Ala Val Pro Val Ser Thr Gln Asp Trp Leu Ser Gly Glu

50 55 60

Arg Phe Thr Cys Thr Val Gln His Glu Glu Leu Pro Leu Pro Leu Ser

65 70 75 80

Lys Ser Val Tyr Arg Asn Thr Gly Pro Thr Thr Pro Pro Leu Ile Tyr

85 90 95

Pro Phe Ala Pro His Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Arg Val Thr Leu

100 105 110

Ser Cys Leu Val Arg Gly Phe Arg Pro Arg Asp Ile Glu Ile Arg Trp

115 120 125

Leu Arg Asp His Arg Ala Val Pro Ala Thr Glu Phe Val Thr Thr Ala

130 135 140

Val Leu Pro Glu Glu Arg Thr Ala Asn Gly Ala Gly Gly Asp Gly Asp

145 150 155 160

Thr Phe Phe Val Tyr Ser Lys Val Asp Lys Leu Met Glu Met Lys His

165 170 175

Arg Asn Pro Arg Arg Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ser Lys Ser Gln

180 185 190

Arg Ala Lys Tyr Gly Gly Gly Gly Asn Gly His Arg Gly Pro Ser Pro

195 200 205

Gly Gln Leu Gly Gly Gly Gly Leu Gln Ser Asp Gly Asn Tyr Lys Phe

210 215 220

Asp Gly Gly Gly Gly Ser Lys Asn Asp Gly Gln Ala Gly Glu Gln Met

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Val Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met

245 250 255

Asn Gly Gly Gly Gly Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr

260 265 270

Leu

<210> 2

<211> 513

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaattcatga gcttagacgc caaactgagg tgcctggtgg tcaacctgcc cagcgattcc 60

agcctcagcg tcacctggac cagggagaag agtgggaacc tccggcccga cccgatggtc 120

ctccaagaac acttcaacgg cacctacagc gccagcagcg ccgtccccgt cagcacccag 180

gattggttat ccggggagag gttcacctgc accgtgcagc acgaggagct gcccctgccg 240

ctcagcaaga gcgtctacag gaatacggga cccaccaccc cacctctgat ctaccccttc 300

gccccccacc cggaagagct gtccctctcc cgcgtcacct tgagctgcct ggtccgcggc 360

ttccgcccac gtgacatcga gatccggtgg ctccgcgacc accgcgccgt tcccgccacc 420

gaattcgtca ccaccgccgt cctaccggaa gagagaaccg caaacggcgc cggcggtgac 480

ggcgacacct tcttcgtgta cagtaaggtc gac 513

<210> 3

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagcttatgg agatgaagca tcgcaatccc aggcgggctg gtggtggtgg tgcaggcagc 60

aagtcacaaa gggccaagta cggtggtggt ggtaatgggc atcgagggcc aagccccggc 120

cagctaggtg gtggtggtct gcagagcgat gggaactaca agttcgatgg tggtggtggt 180

tccaaaaatg atggccaggc aggggaacag atgggtggtg gtggtgtcac agaatacggc 240

cgattcgacc caggagccat gaacggtggt ggtggtgtga gtcggagtct cacagtaagg 300

tcaagcacac tctaactcga g 321

<210> 4

<211> 1390

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttccctctag aataattttg tttaacttta agaaggagat atacatatga gcgataaaat 60

tattcacctg actgacgaca gttttgacac ggatgtactc aaagcggacg gggcgatcct 120

cgtcgatttc tgggcagagt ggtgcggtcc gtgcaaaatg atcgccccga ttctggatga 180

aatcgctgac gaatatcagg gcaaactgac cgttgcaaaa ctgaacatcg atcaaaaccc 240

tggcactgcg ccgaaatatg gcatccgtgg tatcccgact ctgctgctgt tcaaaaacgg 300

tgaagtggcg gcaaccaaag tgggtgcact gtctaaaggt cagttgaaag agttcctcga 360

cgctaacctg gccggttctg gttctggcca tatgcaccat catcatcatc attcttctgg 420

tctggtgcca cgcggttctg gtatgaaaga aaccgctgct gctaaattcg aacgccagca 480

catggacagc ccagatctgg gtaccgacga cgacgacaag gccatggctg atatcggatc 540

cgaattcatg agcttagacg ccaaactgag gtgcctggtg gtcaacctgc ccagcgattc 600

cagcctcagc gtcacctgga ccagggagaa gagtgggaac ctccggcccg acccgatggt 660

cctccaagaa cacttcaacg gcacctacag cgccagcagc gccgtccccg tcagcaccca 720

ggattggtta tccggggaga ggttcacctg caccgtgcag cacgaggagc tgcccctgcc 780

gctcagcaag agcgtctaca ggaatacggg acccaccacc ccacctctga tctacccctt 840

cgccccccac ccggaagagc tgtccctctc ccgcgtcacc ttgagctgcc tggtccgcgg 900

cttccgccca cgtgacatcg agatccggtg gctccgcgac caccgcgccg ttcccgccac 960

cgaattcgtc accaccgccg tcctaccgga agagagaacc gcaaacggcg ccggcggtga 1020

cggcgacacc ttcttcgtgt acagtaaggt cgacggtgga cccacagaag cttgcatgga 1080

gatgaagcat cgcaatccca ggcgggctgg tggtggtggt gcaggcagca agtcacaaag 1140

ggccaagtac ggtggtggtg gtaatgggca tcgagggcca agccccggcc agctaggtgg 1200

tggtggtctg cagagcgatg ggaactacaa gttcgatggt ggtggtggtt ccaaaaatga 1260

tggccaggca ggggaacaga tgggtggtgg tggtgtcaca gaatacggcc gattcgaccc 1320

aggagccatg aacggtggtg gtggtgtgag tcggagtctc acagtaaggt caagcacact 1380

ctaactcgag 1390

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccggaattca tgagcttaga cgccaaactg aggt 34

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcggtcgacc ttactgtaca cgaagaaggt 30

Claims

1.一种鸡传染性法氏囊病病毒多抗原表位蛋白，其特征在于，所述蛋白其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述鸡传染性法氏囊病病毒多抗原表位蛋白在制备鸡传染性法氏囊病病毒疫苗中的应用。