JP2005200420A - 感染性嚢疾患ウイルスのキメラｃＤＮＡクローン、それらをベースとした発現物質およびワクチン - Google Patents
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Abstract
【課題】感染性嚢疾患ウィルス（ＩＢＤＶ）による攻撃から家禽類を防御する。
【解決手段】ＩＢＤＶのＶＰ２アミノ酸配列を含有し、当該ＶＰ２アミノ酸の２７９番目がＡｓｐである非発病性免疫原、ならびにＩＢＤＶ致死株に結合するとともに受託細胞株によって発現されるモノクロナール抗体のエピトープ結合特性を有するモノクロナール抗体。
【選択図】なし
【解決手段】ＩＢＤＶのＶＰ２アミノ酸配列を含有し、当該ＶＰ２アミノ酸の２７９番目がＡｓｐである非発病性免疫原、ならびにＩＢＤＶ致死株に結合するとともに受託細胞株によって発現されるモノクロナール抗体のエピトープ結合特性を有するモノクロナール抗体。
【選択図】なし
Description
本発明は、古典的および変異ＩＢＤＶ株による病毒性かつ致死的な攻撃に対して積極的な防御を行うキメラＩＢＤＶ免疫原、ならびにこれらのキメラ免疫原を含むワクチンを得る方法およびワクチンに関する。
感染性嚢疾患ウイルス（infectious bursal disease virus 、ＩＢＤＶ）は、幼令のニワトリの強伝染性免疫抑制疾患の要因であり、世界的に家禽産業に重大な損失をもたらす（非特許文献１に論評がある）。毒性ＩＢＤＶ株に感受性を有するニワトリの感染は、感染性嚢疾患（ＩＢＤ）として知られる高度に伝染性の免疫抑制状態をもたらす。ファブリキウス嚢のリンパ結節および脾臓 に対する損傷は、他剤による感染を増悪させ、またワクチンに対するニワトリの応答性をも減退させる（非特許文献２）。
ＩＢＤＶには２つの血清型がある（非特許文献３）。血清型１ウイルス類はニワトリに対して病原性であり、またその病毒力には著しい差異がある（非特許文献４）のに対し、七面鳥から単離された血清型２ウイルス類はニワトリに対して無病毒性である（非特許文献５、非特許文献６）。
ＩＢＤＶには２つの血清型がある（非特許文献３）。血清型１ウイルス類はニワトリに対して病原性であり、またその病毒力には著しい差異がある（非特許文献４）のに対し、七面鳥から単離された血清型２ウイルス類はニワトリに対して無病毒性である（非特許文献５、非特許文献６）。
ＩＢＤＶはＢｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科の１員であり、そのゲノムは２本鎖ＲＮＡの２つのセグメントからなる（非特許文献７）。小セグメントＢ（〜２８００ｂｐ）はＶＰ１、即ちｄｓＲＮＡポリメラーゼをコードする。大ゲノムセグメントＡ（〜３０００ｂｐ）は、単一オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中の１１０ｋＤａの前駆体ポリ蛋白質をコードし、これは成熟ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４に成熟変換される（非特許文献８）。ポリ蛋白質ＯＲＦと部分的に重複する小ＯＲＦのセグメントＡもＶＰ５（即ち機能が未知の１７ｋＤａ蛋白質）をコードする（非特許文献９）。
ＶＰ２およびＶＰ３はビリオンの主要構造蛋白質であるが、ＶＰ２は主要な宿主防衛免疫原で、中和抗体を誘発させる（非特許文献１０、非特許文献１１）。ＶＰ３はグループ特異性の抗原と考えられているが、これは血清型１と２の両株のＶＰ３に対するモノクローナル抗体群（Ｍａｂｓ）によって認識されるからである（非特許文献１２）。ＶＰ４はウイルスでコードされたプロテアーゼであり、前駆体蛋白質の成熟変換に関与する（非特許文献１３）。
ＶＰ２およびＶＰ３はビリオンの主要構造蛋白質であるが、ＶＰ２は主要な宿主防衛免疫原で、中和抗体を誘発させる（非特許文献１０、非特許文献１１）。ＶＰ３はグループ特異性の抗原と考えられているが、これは血清型１と２の両株のＶＰ３に対するモノクローナル抗体群（Ｍａｂｓ）によって認識されるからである（非特許文献１２）。ＶＰ４はウイルスでコードされたプロテアーゼであり、前駆体蛋白質の成熟変換に関与する（非特許文献１３）。
従来、幼令ニワトリのＩＢＤＶ感染のコントロールは、無毒性株による生ワクチン投与によるか、または主として繁殖用雌鶏に対する生ＩＢＤＶワクチンもしくは不活化ＩＢＤＶワクチンの投与によって誘発される母性抗体の移行によって行われてきた。不幸なことに、米国において近年ＩＢＤＶの病毒性変異株がワクチン投与済みの１群から単離されている（非特許文献１４、非特許文献１５）。各種のＩＢＤＶ株に対して用意されたモノクローナル抗体の選択用パネルを使用することにより、天然のＧＬＳ、ＤＳ３２６、ＲＳ５９３およびデラウエア変異ウイルスが米国において同定された。これらの抗原性変異体（デラウエアおよびＧＬＳ）が実地（飼育場）で出現したことによって蒙る経済的損失は極めて大きい（非特許文献１６、係属中の特許文献１）。これらの変異株は、１９８５年以前に単離された最も典型的なＩＢＤＶの古典的株とは抗原性が異なり、中和モノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）Ｂ６９およびＲ６３によって規定されるエピトープが欠如している（非特許文献１７、非特許文献１４、非特許文献１６）。これら変異株が実地に出現して以来、実地に蔓延していると認められるウイルスのより広範な抗原範囲に適合できるように、ＩＢＤＶに対する多くの市販の生および不活化ワクチンの処方変更が行われてきた。
ＩＢＤＶに対するリコンビナントワクチンを開発するための努力が行われ、ＩＢＤＶのゲノムがクローン化された（非特許文献８）。ＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子がクローン化され、酵母で発現（非特許文献１８）されるとともに、リコンビナント鷄痘ウイルスでも発現された（非特許文献１９）。酵母から発現されたＶＰ２抗原でニワトリを免疫すると、抗血清がニワトリにＩＢＤＶ感染に対する受動的防御を与えた。能動免疫研究に使用した場合、鷄痘ウイルスをベクターとするＶＰ２抗原は死亡率を抑えたが、ファブリキウス嚢を障害から守ることはなかった。
ＩＢＤＶに対するリコンビナントワクチンを開発するための努力が行われ、ＩＢＤＶのゲノムがクローン化された（非特許文献８）。ＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子がクローン化され、酵母で発現（非特許文献１８）されるとともに、リコンビナント鷄痘ウイルスでも発現された（非特許文献１９）。酵母から発現されたＶＰ２抗原でニワトリを免疫すると、抗血清がニワトリにＩＢＤＶ感染に対する受動的防御を与えた。能動免疫研究に使用した場合、鷄痘ウイルスをベクターとするＶＰ２抗原は死亡率を抑えたが、ファブリキウス嚢を障害から守ることはなかった。
最近、バキュロウイルス発現系中での変異ＧＬＳ ＩＢＤＶ株のＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４構造蛋白質の合成についての報告がなされている（非特許文献２０）。ＳＰＦニワトリにおける能動免疫研究においては、最初の２用量でバキュロウイルス発現ＧＬＳタンパクは毒性ＧＬＳ攻撃に対して７９％の防御を与えることができた（非特許文献２０）。それに続く能動交叉免疫の発展研究では、バキュロウイルス発現ＧＬＳタンパクの抗原量を増やすことによって、１用量で変異ＧＬＳおよびＥ／Ｄｅｌ株に対する完全な防御が得られたが、古典的ＳＴＣ株に対しては２用量を投与しなければ部分的防御しか得られなかった。
近年、５つの血清型１のＩＢＤＶ株の大セグメントＡの完全なヌクレオチド配列；００２〜７３（非特許文献２１）、Ｃｕ−１、ＰＢＧ９８、５２／７０（非特許文献２２）、ＳＴＣ（非特許文献２３）、並びに血清型２のＯＨ株（非特許文献６）が決定された。さらに、病毒性の日本ＩＢＤＶ株のＶＰ２遺伝子（非特許文献２４）およびデラウエア変異ＡおよびＥ（非特許文献２５、非特許文献２６）の配列も明らかとなった。しかしながら、米国ＩＢＤＶ変異株のいずれについても、その全長セグメントのクローン化や特徴付けは完全にはなされていない。
米国特許出願第０８／２１６，８４１号、１９９４年３月２４日出願、特許代理人事件番号第２７４７−０５３−２７号、スナイダー、本件と併願係属中
キベンジ[Kibenge]・（１９８８）"Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．"、６９：１７５７〜１７７５
コスグローブ[Cosgrove]（１９６２）"ＡｖｉａｎＤｉｓ．"、６：３８５〜３８９４
マクフェラン[McFerran]ら（１９８０）"Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈ．"９：３９５〜４０４
ウインターフィールド[Winterfield]・ら（１９７８）、"Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．"、５：２５３〜２６０
イスマイル[Ismail]ら（１９８８）、"ＡｖｉａｎＤｉｓ．"、３２：７５７〜７５９
キベンジ[Kibenge]・（１９９１） "Ｖｉｒｏｌｏｇｙ"１８４：４３７〜４４０
ドボス[Dobos]・ら（１９７９）"Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．"、３２：５９３〜６０５
アサド[Azad]ら（１９８５）"Ｖｉｒｏｌｏｇｙ"１４３：３５〜４４
キベンジ[Kibenge]・ら（１９９１）"Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．"、７１：５６９〜５７７
ベシェ[Becht]・ら（１９８８）"Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．"６９：６３１〜６４０
ファヘイ[Fahey]・ら（１９８９）"Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．"、７０：１４７３〜１４８１
ベシェ [Becht]・ら（１９８８）"Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．"６９：６３１〜６４０
ジャガディシュ[Jagadish]ら（１９８８）"Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．"、６２：１０８４〜１０８７
スナイダー[Snyder]ら（１９８８ｂ）"Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．"、３２：５３５〜５３９
ヴァンデルマレル[Van der Marel]ら（１９９０）"Ｄｔｓｃｈ．Ｔｉｅｒａｒｚｔｌ．Ｗｓｃｈｒ．"、９７：８１〜８３
スナイダー[Snyder]ら（１９９２）"Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．"、１２７：８９〜１０１
スナイダー[Snyder]ら（１９８８ａ）"ＡｖｉａｎＤｉｓ．"、３２：５２７〜５３４
マクレディ[Macreadie]・ら（１９９０）"Ｖａｃｃｉｎｅ"８：５４９〜５５２
ベイリス[Bayliss]・ら（１９９１）"Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．"、１２０：１９３〜２０５
バハリア[Vakharia]ら（１９９３）"Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．"、７４：１２０１〜１２０６
ハドソン[Hudson]ら（１９８６）"Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．"１４：００１〜５０１２
ベイリス[Bayliss]・ら（１９９０）"Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．"、７１：１３０３〜１３１２
キベンジ[Kibenge]・（１９９０）"Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．"、７１：５６９〜５７７
リン[Lin]・ら（１９９３）、"Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．"、３７：３１５〜３２３
ラナ[Lana]ら（１９９２）"Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ"、６：２４７〜２５９
ハイン[Heine]・ら（１９９１）"Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．"、２２：１８３５〜１８４３
発明者らは、抗原性変異の要因となるＩＢＤＶゲノムの領域を特定するに至った。ＶＰ２タンパクの中心的な可変領域を含むＤＮＡ配列、並びにこの配列を組み込んだプラスミドを構築した。このＤＮＡ配列は、すべてのＩＢＤＶ株の望ましいウイルス中和エピトープまたは免疫原性ポリペプチドを作り出すように操作することができる。次いで、これらの免疫原性セグメントを新しいリコンビナントＩＢＤＶワクチンに組み込むことができる。
定義
ＩＢＤ − 上述の感染性嚢疾患。
ＩＢＤＶ − 感染性嚢疾患ウイルス、即ち少なくとも感染家禽中のファブリキウス嚢に損傷を誘発する能力を有するウイルス。
エピトープ決定基 − １以上のモノクローナル抗体により認識されるエピトープに対応するアミノ酸またはアミノ酸配列。適当なＯＲＦ位置のアミノ酸またはアミノ酸配列は、ポリペプチドにそれに対応するエピトープを発現させる。エピトープ決定基はアミノ酸の同一性および配列位置によって同定される。
ＩＢＤ − 上述の感染性嚢疾患。
ＩＢＤＶ − 感染性嚢疾患ウイルス、即ち少なくとも感染家禽中のファブリキウス嚢に損傷を誘発する能力を有するウイルス。
エピトープ決定基 − １以上のモノクローナル抗体により認識されるエピトープに対応するアミノ酸またはアミノ酸配列。適当なＯＲＦ位置のアミノ酸またはアミノ酸配列は、ポリペプチドにそれに対応するエピトープを発現させる。エピトープ決定基はアミノ酸の同一性および配列位置によって同定される。
遺伝エピトープ決定基 −エピトープ決定基をコードするＯＲＦのヌクレオチド配列。
高次エピトープ −ＩＢＤＶポリペプチドの四次（三次元）構造によって部分的または全体が誘導されたエピトープ。高次エピトープは、ＩＢＤＶとモノクローナル抗体間の結合を強化したり、または結合を誘発するのに対し、高次エピトープの欠如した同じ配列は抗体とＩＢＤＶポリペプチド間の結合を全く誘発しない。
高次エピトープ −ＩＢＤＶポリペプチドの四次（三次元）構造によって部分的または全体が誘導されたエピトープ。高次エピトープは、ＩＢＤＶとモノクローナル抗体間の結合を強化したり、または結合を誘発するのに対し、高次エピトープの欠如した同じ配列は抗体とＩＢＤＶポリペプチド間の結合を全く誘発しない。
ウイルス様粒子 −（大ゲノムセグメントＡによりコードされた）ＩＢＤＶの三次元構造を模倣した天然またはリコンビナントアミノ酸配列の三次元粒子で、ウイルス性ＲＮＡが欠如しているもの。ウイルス様粒子は同様の配列の天然ウイ ルスにより発現される高次エピトープを発現する。ウイルス様粒子は、適当なＯＲＦ中にＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ３構造蛋白質をコードするＤＮＡの適切な発現により作り出される。
エピトープ決定基領域 −エピトープ決定基を充分に有するＩＢＤＶのＶＰ２アミノ酸配列の限定された領域で、この限定領域内のアミノ酸の変異は、異なるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープの数を増やすことになる。
２以上の天然ＩＢＤＶのエピトープを発現するリコンビナント免疫原性ポリペプチド、ならびに２以上の天然ＩＢＤＶのエピトープおよび高次エピトープを発現するリコンビナントウイルス様粒子は、ワクチン用の有効な免疫原であり、接種家禽類のさまざまなＩＢＤＶ攻撃に対する防御を与えるために使用することができる。リコンビナントポリペプチドおよびウイルス様粒子は、ベースＩＢＤＶのＶＰ２領域に、少なくとも第２のＩＢＤＶのエピトープ決定基を挿入することによって調製されたキメラＤＮＡを発現させることによって得られる。これは、図７に示されている位置のアミノ酸同一性の遺伝エピトープ決定基を置換することによって最も簡単に得られる。従って、第２のＩＢＤＶのエピトープ決定基がベースＩＢＤＶのそれと異なる場合には、その異なる第２のＩＢＤＶの遺伝エピトープ決定基を、ベースＩＢＤＶのその位置の遺伝エピトープ決定基の代わりに挿入する。Ｄ７８、Ｅ／Ｄｅｌ２２およびＤＳ３２６ ＩＢＤＶのエピトープ決定基を、ベースのＧＬＳ ＩＢＤＶへ組み込む一例が図１Ａ〜図１Ｂに示されている。このようにして、複数の天然ＩＢＤＶの遺伝子エピトープ決定基を有する１つのＤＮＡ配列を調製することができる。これらのリコンビナントプラスミドは、バキュロウイルス、鷄痘ウイルス、七面鳥ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよび類似のトランスフェクションベクターなどの各種のパッケージ／発現ベクター中に挿入できる。これらのベクターは、ＳＦ９細胞、ニワトリ胚線維芽細胞株、ニワトリ胚腎臓細胞、ベロ細胞および類似の発現ベヒクルのような従来の発現細胞を感染させるために使用できる。トランスフェクション方法、および発現の方法、並びにトランスフェクションベヒクルへのプラスミド挿入は周知のものであり、それら自身は本発明を特徴付ける要素ではない。
本発明のキメラｃＤＮＡの発現によって免疫原性ポリペプチドが作られるが、これらは複数の天然ＩＢＤＶのエピトープを反映するものであり、リコンビナントＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ３ ｃＤＮＡセグメントの発現で、ＶＰ２領域に少なくとも２つの天然ＩＢＤＶの遺伝子エピトープ決定基を含むものは、免疫原性ウイルス様粒子となる。
免疫原性ポリペプチド類およびウイルス様粒子は、常法により採収することができる（ドボス[Dobos]・ら、“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．”、３２：５９３〜６０５（１９７９）。このポリペプチドおよびウイルス様粒子は、接種家禽を防御するワクチンを調製するために使用することができ、特にニワトリ、および好ましい実施態様ではブロイラー鷄に対して、接種物中に存在する複数のエピトープ決定基に反映されたそれぞれのＩＢＤＶが有するエピトープからの攻撃に対する保護を与える。このように、各ＩＢＤＶの遺伝子エピトープ決定基がキメラｃＤＮＡ中に組み込まれているため、単一の免疫原で各種のＩＢＤＶに対する免疫を与えることになる。
ワクチンの投与は、すでに確立されている手法に従って効果的に実施できる。米国特許第５，０６４，６４６号中に、新たに単離したＧＬＳ ＩＢＤＶをベースとしたヒヨコへの効果的な接種の方法が記述されている。なお、この米国特許第５，０６４，６４６号を本明細書の一部としてここに引用する。同様の投与方法および容量をここでも採用することができる。これらのポリペプチドおよびウイルス様粒子はウイルス性ＲＮＡが欠如しているので、これらは無毒性である。従ってワクチンは、これらの免疫原性ポリペプチドおよびウイルス様粒子を医薬用キャリヤ中に、典型的には懸濁液または混合物の形で、単純に組み入れることによって調製することができる。適当な用量は、毒性攻撃に対して完全な交叉免疫を誘発するように、誘発される抗体価および／または含まれるエピトープ量を変えながら、通常の試行錯誤法により最適値を求めることができる。一般的には、リン酸塩緩衝生理食塩水、細胞培養培地、マレック[Marek's]・のウイルスワクチン希釈油アジュバントおよびその他のアジュバントのような薬理学的に許容されるキャリヤを使用することができる。投与は、好ましくは、毒性の実地強度ＩＢＤＶによる早期の感染を防止するために、卵からヒヨコに受動的に移行する抗体を誘発させるように雌鳥の抱卵期間に行う。或いは、リコンビナントワクチンをニワトリの生存期間中いつでも、好ましくは１日令中に、複製ベクターの形で投与してもよい。保護のレベルは一般に２回目の接種によって改善されることが経験上明らかとなっている。
本発明は下記の具体的な実施例を参照することによりさらに理解を深めることができるであろう。
背景となる方法論
ＩＢＤＶの分子による抗原性変異を調べるために、４つのＩＢＤＶ株、即ちＧＬＳ、ＤＳ３２６、デラウエア変異Ｅ（Ｅ／Ｄｅｌ）およびＤ７８をクローン化し、配列による特徴付けを行った。これらの株から推測されるアミノ酸配列を、既知の他の血清型１および２の配列と比較することによって、種々の中和モノクローナル抗体との結合に関与すると推定されるアミノ酸残基を同定し、ＩＢＤＶ構造蛋白質の系統的関係を調べた。
ＩＢＤＶのＧＬＳ、ＤＳ３２６およびＳＴＣ株を、特定病原性非存在のニワトリ（ＳＰＡＦＡＳ，Ｉｎｃ．、米国コネチカット州ノーウィッチ）の嚢で増殖させた。組織培養向けのＩＢＤＶのＥ／Ｄｅｌ−２２、Ｄ７８およびＯＨ（血清型２）の各株を、１０日令の孵化卵（ＳＰＡＦＡＳ，Ｉｎｃ．）に由来する一次ニ ワトリ胎児性線維芽細胞中で増殖させ、スナイダー[Snyder]ら“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３２：５２７〜５３４（１９８８ａ）の記述のように精製した。ＩＢＤＶの各種株に対するモノクローナル抗体を、すでに概要を示したプロトコル（スナイダー[Snyder]ら（１９８８ａ）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３２：５２７〜５３４、スナイダー[Snyder]ら（１９８８ｂ）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３２：５３５〜５３９）を使用して作り、特徴付けを行った。Ｄ７８株に対してモノクローナル抗体 Ｂ６９およびＲ６３を調製し、一方ＧＬＳ株に対してモノクローナル抗体８、１０、５７および１７９を調製した。
ＩＢＤＶの分子による抗原性変異を調べるために、４つのＩＢＤＶ株、即ちＧＬＳ、ＤＳ３２６、デラウエア変異Ｅ（Ｅ／Ｄｅｌ）およびＤ７８をクローン化し、配列による特徴付けを行った。これらの株から推測されるアミノ酸配列を、既知の他の血清型１および２の配列と比較することによって、種々の中和モノクローナル抗体との結合に関与すると推定されるアミノ酸残基を同定し、ＩＢＤＶ構造蛋白質の系統的関係を調べた。
ＩＢＤＶのＧＬＳ、ＤＳ３２６およびＳＴＣ株を、特定病原性非存在のニワトリ（ＳＰＡＦＡＳ，Ｉｎｃ．、米国コネチカット州ノーウィッチ）の嚢で増殖させた。組織培養向けのＩＢＤＶのＥ／Ｄｅｌ−２２、Ｄ７８およびＯＨ（血清型２）の各株を、１０日令の孵化卵（ＳＰＡＦＡＳ，Ｉｎｃ．）に由来する一次ニ ワトリ胎児性線維芽細胞中で増殖させ、スナイダー[Snyder]ら“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３２：５２７〜５３４（１９８８ａ）の記述のように精製した。ＩＢＤＶの各種株に対するモノクローナル抗体を、すでに概要を示したプロトコル（スナイダー[Snyder]ら（１９８８ａ）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３２：５２７〜５３４、スナイダー[Snyder]ら（１９８８ｂ）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３２：５３５〜５３９）を使用して作り、特徴付けを行った。Ｄ７８株に対してモノクローナル抗体 Ｂ６９およびＲ６３を調製し、一方ＧＬＳ株に対してモノクローナル抗体８、１０、５７および１７９を調製した。
さらに、新しいモノクローナル抗体 ６７を調製したが、これはＥ／Ｄｅｌ株を中和し、それに特異性のものである。抗原捕捉ＥＬＩＳＡ（ＡＣ−ＥＬＩＳＡ） 修正法によるＩＢＤＶ抗原の同定を、（スナイダー[Snyder]ら（１９９２）“Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．”、１２７：８９〜１０１）に記述されているように実施した。
各種のＩＢＤＶ株を、中和モノクローナル抗体のパネルに対するそれらの反応性により、表１に示すように特徴付けを行った。
モノクローナル抗体Ｂ６９と反応しなかったＰＢＧ９８（英国ワクチン株、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ、英国）を除いて、すべての標準血清型１ウイルスは、モノクローナル抗体Ｂ６９、Ｒ６３、１７９および８と反応した。対照的に、米国の変異ウイルス類はすべてウイルス中和Ｂ６９エピトープが欠如していた。さらに、ＧＬＳおよびＤＳ３２６変異種はＲ６３エピトープが欠如しているが、モノクローナル抗体５７により規定される共通エピトープを有する。このようにして、各種モノクローナル抗体に対する反応性に基づいて、これらのウイルスを抗原性によって、古典型、ＧＬＳ、ＤＳ３２６およびＥ／Ｄｅｌ変異にグループ分けされた。
各種ＩＢＤＶ株の大ＲＮＡセグメントの全コード領域を含むｃＤＮＡクローンを、標準クローン化手順および方法（バハリア[Vakharia]ら（１９９２） “Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ”３６：７３６〜７４２）；バハリア[Vakharia]ら（１９９３）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”７４：１２０１〜１２０６）を使用して調製した。これらのｃＤＮＡクローンの完全なヌクレオチド配列を、シーケナーゼＤＮＡ配列キット（オハイオ州コロンバス、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｏｒｐ．）を使用するジデオキシ法により決定した。ＤＮＡ配列および推測されたアミノ酸配列を、ＰＣ／ＧＥＮＥソフトウェアパッケージ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）により解析した。これらを図５Ａ〜図５Ｋおよび図６Ａ〜図６Ｍに示す。ＧＬＳ株のヌクレオチド配列データはＧｅｎＢａｎｋデータライブラリに寄託し、受託番号Ｍ９７３４６が付与された。
各種ＩＢＤＶ株の大ＲＮＡセグメントの全コード領域を含むｃＤＮＡクローンを、標準クローン化手順および方法（バハリア[Vakharia]ら（１９９２） “Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ”３６：７３６〜７４２）；バハリア[Vakharia]ら（１９９３）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”７４：１２０１〜１２０６）を使用して調製した。これらのｃＤＮＡクローンの完全なヌクレオチド配列を、シーケナーゼＤＮＡ配列キット（オハイオ州コロンバス、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｏｒｐ．）を使用するジデオキシ法により決定した。ＤＮＡ配列および推測されたアミノ酸配列を、ＰＣ／ＧＥＮＥソフトウェアパッケージ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）により解析した。これらを図５Ａ〜図５Ｋおよび図６Ａ〜図６Ｍに示す。ＧＬＳ株のヌクレオチド配列データはＧｅｎＢａｎｋデータライブラリに寄託し、受託番号Ｍ９７３４６が付与された。
ＧＬＳ株のヌクレオチド配列（３２３０ｂｐ長）と８つの血清型１および１つの血清型２ ＩＢＤＶ株との比較では、それぞれ９２％以上および８２％以上の配列相同性を示したが、これはこれらのウイルスが密接に関連したものであることを示すものである。Ｄ７８、ＰＢＧ９８、およびＣｕ１株の間には６〜９の塩基置換があるだけであり、これが約０．２％〜０．３％の差異に相当することが判明したのは興味深い（結果は表示していない）。図３Ａ〜図３Ｉおよび表２は、本研究に使用した４つのＩＢＤＶ株を含む１０個のＩＢＤＶ株から推測されたアミノ酸配列およびセグメントＡの大ＯＲＦの相同性パーセントの比較を示したものである。
これらの比較は蛋白質が高度に保存されていることを示している。アミノ酸配列の差異の程度は、Ｄ７８とＣｕ−１との比較での０．４％から血清型１（Ｅ／Ｄｅｌ）と血清型２（ＯＨ）との比較での１０．３％の範囲である（表２）。
図３Ａ〜図３Ｉにおいて、１０個のＩＢＤＶ株（本研究に使用した４つを含む）から推測された大ＯＲＦのアミノ酸配列（１０１２残基）は、アミノ酸変化の殆どが、既にベイリス[Bayliss]・ら（１９９０）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”、７１：１３０３〜１３１２）によって示されているように、ＶＰ２蛋白質の残基２１３および３３２の間の中心的な可変領域で起きていることを示している。米国の変異種のすべて（ＧＬＳ、ＤＳ３２６およびＥ／Ｄｅｌ）が図３Ａ〜図３Ｉに示されている２つの親水性領域（残基２１２〜２２３および残基３１４〜３２４）において他の株とは異なることが注目される。これら２つの親水性領域は、中和モノクローナル抗体の結合に重要であることが示されており、従ってウイルス中和エピトープの形成に関与するものであろう（ハイン[Heine]・ら（１９９１）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”、２２：１８３５〜１８４３））。最近我々は、コンフォメーション依存のモノクローナル抗体Ｂ６９、Ｒ６３、８、１７９、１０、および５７（表２参照）はＶＰ２蛋白質を免疫沈降させることを明らかにした（スナイダー[Snyder]ら（１９９２）“Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．”、１２７：８９〜１０１）。さらに、Ｅ／Ｄｅｌ特異性モノクローナル抗体６７もまたＶＰ２蛋白質に結合する。従って、ウイルス中和エピトープの形成に関与する、従って抗原性変異に関与するアミノ酸を同定するために、我々は古典的および変異ウイルスのＶＰ２蛋白質のアミノ酸配列を比較した。
Ｄ７８配列とＰＢＧ９８配列の比較では、位置７６、２４９、２８０および３２６の４つのアミノ酸が置換されているだけであることが示されている。しかしながら、ＳＴＣおよび５２／７０株もまたＤ７８配列とは位置７６、２８０および３２６で異なるものの、これらのウイルスはモノクローナル抗体Ｂ６２に結合する。このことは位置２４９のＧｌｎ（Ｇｌｎ２４９）がモノクローナル抗体Ｂ６９の結合に関与している可能性を示している。米国変異ウイルス類のすべてがこの位置にＧｌｎ→Ｌｙｓ置換を有し、従って中和モノクローナル抗体Ｂ６９ の結合を免れることが注目される。同様に、可変領域についてＧＬＳ配列と ＤＳ３２６配列とを比較すると、位置２２２、２５３、２６９、２７４、３１１および３２０の６つのアミノ酸置換が存在する。しかしながら、モノクローナル抗体１７９に結合する他のＩＢＤＶ株は、本質的に保存的な位置２２２、２５３、２６９および２７４にアミノ酸置換を有する。従って、このことはモノクローナル抗体１７９の結合にはＧｌｕ３１１およびＧｌｎ３２０が関与している可能性を示唆している。また、ＧＬＳおよびＤＳ３２６配列とその他すべてのＩＢＤＶ配列との比較では、位置３２１でのユニークなＡｌａ→Ｇｌｕ置換を示しており、これはこの残基がモノクローナル抗体５７の結合に寄与していることを示唆している。モノクローナル抗体５７はモノクローナル抗体Ｒ６３とは競合しないことから、Ａｌａ３２１がモノクローナル抗体Ｒ６３の結合に寄与する可能性があると思われる。同様に、Ｅ／Ｄｅｌ配列とその他の配列の比較では、位置２１３、２８６、３０９、３１８および３２３の５つのユニークな置換が示されている。しかしながら、このＥ／Ｄｅｌ配列（組織培養から取り出されたウイルス）とすでに発表されているＶＰ２ Ａ／ＤｅｌおよびＥ／Ｄｅｌ配列（嚢から取り出されたウイルス）との比較では、位置２１３および３０９の残基がＡ／ＤｅｌおよびＥ／Ｄｅｌ配列でそれぞれ置換されていないことから、モノクローナル抗体６７の結合にはＩｌｅ２８６、Ａｓｐ３１８、Ｇｌｕ３２３が関与することが示唆される(・ハイン[Heine]・ら（１９９１）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”、２２：１８３５〜１８４３）；ラナ[Lana]ら（１９９２）“Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ”、６：２４７〜２５９；バハリア[Vakharia]ら（１９９２）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３６：７３６〜７４２）。
アミノ酸配列の比較ではまた、血清型１と血清型２配列の間の際だった差異も示されている。血清型２のＯＨ株では、位置２４９にアミノ酸残基（セリン）の挿入、また位置６８０に１残基の欠失がある。従来、血清型２ウイルスは本来無 毒性で、ニワトリにはなんら病原性障害を起こさないことが示されている（イスマイル[Ismail]ら（１９８８）、“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３２：７５７〜７５９）。従って、血清型２ＯＨ株の構造蛋白質のこの微妙な変化がウイルス の病原性に重要な役割を果たすのであろう。さらに、アミノ酸配列のＳ−Ｗ−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｇ−Ｓ構造単位（残基３２６〜３３２）は毒性株にのみ保存され、毒性に関与するであろうという仮説が立てられている（ハイン[Heine]ら（１９９１）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”、２２：１８３５〜１８４３）。この配列構造単位は日本で単離されたＩＢＤＶの各種病原性株にもまた保存されている（リン[Lin]ら（１９９３）、“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３７：３１５〜３２３）。このヘプタペプチド領域のアミノ酸配列の比較で、非病原性血清型２のＯＨ株は３つの置換を有するのに対し、血清型１の弱病原性株（Ｄ７８、Ｃｕ−１、ＰＢＧ９８および００２〜７３）はこの領域に１つまたは２つの置換を有することが明かとなった。その上、血清型１の変異株および血清型２のＯＨ株の可変領域（アミノ酸２１３〜３３２）の親水性の比較では、血清型２の第２の親水性ピーク領域（アミノ酸残基３１４〜３２４）が著しく減っていることが示された（結果は表示していない）。抗原性の変動をもたらす殆どのアミノ酸残基はこの領域に存在することから、これらの残基が血清型特異性と同様にウイルス中和エピトープ並びに血清型特異性を形成するのに重要な役割を果たしているのであろう。
各種ＩＢＤＶ株の構造蛋白質の抗原性の関連性を評価するために、本研究で調査した米国変異株を含む１０のＩＢＤＶ株の大ＯＲＦ配列をベースとして系統樹を構築した（図４）。明確に区分できる３つの系統が形成された。他と最も異なる１番目のものは血清型２のＯＨ株であり、２番目は地理的に遠いオーストラリア血清型１株（００２〜７３）である。３番目の系統は４つの異なるグループで構成される。第１および第２グループは高度に病原性の株、即ち米国の標準攻撃株（ＳＴＣ）と英国の実地株（５２／７０）を含む。３番目のグループはすべてのヨーロッパ株、即ちワクチン株Ｄ７８（オランダ）、ＰＢＧ９８（英国）、および弱毒性株Ｃｕ−１（ドイツ）を含む。４番目のグループは米国変異株で構成され、その中でＥ／Ｄｅｌは別のサブグループを形成する。系統的分析により形成されたグループは、モノクローナル抗体反応パターンと非常によく相関している（表１参照）。図４に示すように、Ｂ６９エピトープが欠如しているすべての米国変異ウイルスは１つの異なるグループを形成し、一方Ｂ６９エピトープを含むすべての古典的ウイルスは別のグループを形成した（ＰＢＧ９８以外）。加えて、共にモノクローナル抗体５７エピトープを含み、且つＲ６３エピトープが欠如していて関連性の高いＧＬＳおよびＤＳ３２６株は、その他の変異Ｅ／Ｄｅｌ株から分離することができた。
この情報に基づき、リコンビナントワクチンを以下のように構築した。
キメラＩＢＤＶ遺伝子を含むリコンビナント・バキュロウイルス・クローンの構築
ＧＬＳ株のキメラＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４構造蛋白質を発現するリコンビナント・バキュロウイルスクローンを構築し、評価した。このリコンビナントバキュロウイルスは、ＧＬＳ中和部位で規定されるすべてのモノクローナル抗体を含むキメラＶＰ２蛋白質、並びにＩＢＤＶの古典的株に特異性の１つの中和部位（Ｂ６９）をＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３セグメントの形で含むキメラＶＰ２蛋白質を発現した。
ＧＬＳ株のキメラＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４構造蛋白質を発現するリコンビナント・バキュロウイルスクローンを構築し、評価した。このリコンビナントバキュロウイルスは、ＧＬＳ中和部位で規定されるすべてのモノクローナル抗体を含むキメラＶＰ２蛋白質、並びにＩＢＤＶの古典的株に特異性の１つの中和部位（Ｂ６９）をＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３セグメントの形で含むキメラＶＰ２蛋白質を発現した。
ＧＬＳおよびＤ７８ ＩＢＤＶ株の大ＲＮＡセグメントの全コード領域を 含む補体ＤＮＡクローンを、前述の標準クローン化手順および方法（バハリア [Vakharia]ら（１９９２）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３６：７３６〜７４２；バハリア[Vakharia]ら（１９９３）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”７４：１２０１〜１２０６）を使用して調製した。Ｄ７８ ＩＢＤＶ株のＢ６９エピトープをコードする遺伝子配列を挿入するために、プラスミドｐＢ６９ＧＬＳを以下のように構築した（図１Ａ、図１Ｂ参照）。Ｄ７８およびＧＬＳの全長ｃＤＮＡクローン（プラスミドｐＤ７８およびｐＧＬＳ−５）をＮｄｅＩ−ＮａｒＩおよびＮａｒＩ−ＳｐｅＩ酵素で消化し、ＮｄｅＩ−ＮａｒＩ（０．２６ｋｂ）およびＮａｒＩ−ＳｐｅＩ（０．２８ｋｂ）フラグメントをそれぞれ分離した。これら２つのフラグメントを次にＮｄｅＩ−ＳｐｅＩ切断プラスミドｐＧＬＳ−５に連結し、キメラプラスミドｐＢ６９ＧＬＳを得た。この挿入により、ＧＬＳ ＶＰ ２蛋白質の３つのアミノ酸が置換された。これらの置換位置は、ＶＰ２蛋白質の可変領域中の位置２２２（Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）、２４９（Ｌｙｓ−Ｇｌｎ）および２５４（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）である（バハリア[Vakharia]ら（１９９３） “Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”、３６：７３６〜７４２）。キメラＩＢＤＶ構造遺伝子をバキュロウイルスゲノムに挿入するために、プラスミドｐＢ６９ＧＬＳをＢｓｔＥＩＩ酵素を使用して、また部分的にＢａｍＨＩ酵素を使用して完全に消化し、ＮｈｅＩ−ＢｓｔＥＩＩフラグメント（プラスミドｐＧＬＳＢａｃＩから誘導したもの、バハリア[Vakharia]ら（１９９３）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”、７４：１２０１〜１２０６参照）と組合せ、次いでＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ切断トランスファーベクターｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．、カリフォルニア州サンディエゴ）に連結した。最後に、前述の手順（バハリア[Vakharia]ら（１９９３）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”７４：１２０１〜１２０６）を用いて、リコンビナントバキュロウイルスＩ−７を得た。表３参照。
免疫用接種物の調製
１細胞当り５ＰＦＵのＩ−７リコンビナントバキュロウイルスで複数回感作したＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ＳＦ９細胞を、１０％ウシ胎児血清を添加したヒンク[Hink's]のＴＮＭ−ＦＨ培地（ＪＨＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カンザス州レンクサ）を含む１リットルフラスコ中で、懸濁液培養物として２８℃で３ないし４日間増殖させた。感作された細胞を低速遠心分離で回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、そして最少量のＰＢＳ中に再懸濁した。この細胞スラリーを氷浴上で、２分間の休止を入れて１分間ずつ３回超音波処理し、低速遠心分離で清澄にした。各細胞溶離物のアリコートを、抗−ＩＢＤＶモノクローナル抗体を用いたＡＣ−ＥＬＩＳＡにより検査し、抗原性物質の存在量を推定した（スナイダー[Snyder]ら（１９９８ｂ）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ”、３２：５３５〜５３９）。最も高い抗原性質量を有する調製物を集め、ＡＣ−ＥＬＩＳＡにより以前の研究で使用したＶ−ＩＢＤＶ−７−１リコンビナントバキュロウイルスＩＢＤＶワクチン（バハリア[Vakharia]ら（１９９３）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”７４：１２０１〜１２０６）に対する比較滴定を行った。グループ特異性の中和モノクローナル抗体８を用いたＡＣ−ＥＬＩＳＡで求められたＩ−７リコンビナント調製物の抗原性質量を、Ｖ−ＩＢＤＶ−７−１ワクチンと同じものとなるように希釈し、次いで等量のフロインド[Freund's]不完全アジュバントに乳化させ、接種用とした。
１細胞当り５ＰＦＵのＩ−７リコンビナントバキュロウイルスで複数回感作したＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ＳＦ９細胞を、１０％ウシ胎児血清を添加したヒンク[Hink's]のＴＮＭ−ＦＨ培地（ＪＨＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カンザス州レンクサ）を含む１リットルフラスコ中で、懸濁液培養物として２８℃で３ないし４日間増殖させた。感作された細胞を低速遠心分離で回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、そして最少量のＰＢＳ中に再懸濁した。この細胞スラリーを氷浴上で、２分間の休止を入れて１分間ずつ３回超音波処理し、低速遠心分離で清澄にした。各細胞溶離物のアリコートを、抗−ＩＢＤＶモノクローナル抗体を用いたＡＣ−ＥＬＩＳＡにより検査し、抗原性物質の存在量を推定した（スナイダー[Snyder]ら（１９９８ｂ）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ”、３２：５３５〜５３９）。最も高い抗原性質量を有する調製物を集め、ＡＣ−ＥＬＩＳＡにより以前の研究で使用したＶ−ＩＢＤＶ−７−１リコンビナントバキュロウイルスＩＢＤＶワクチン（バハリア[Vakharia]ら（１９９３）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”７４：１２０１〜１２０６）に対する比較滴定を行った。グループ特異性の中和モノクローナル抗体８を用いたＡＣ−ＥＬＩＳＡで求められたＩ−７リコンビナント調製物の抗原性質量を、Ｖ−ＩＢＤＶ−７−１ワクチンと同じものとなるように希釈し、次いで等量のフロインド[Freund's]不完全アジュバントに乳化させ、接種用とした。
ウイルス
攻撃ウイルス：古典株ＩＭおよびＳＴＣならびに変異株Ｅ／ＤｅｌおよびＧＬＳ−５を以前公知の供給源（スナイダー[Snyder]ら（１９８８ａ） “Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”３２：５２７〜５３４；スナイダー[Snyder]ら（１９９２）“Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．”１２７：８９〜１０１）から得た。眼内点滴注入の後、攻撃ウイルスを、特定病原性非存在（ＳＰＦ）のニワトリ（ＳＰＡＦＡＳ，Ｉｎｃ．、コネチカット州ストアーズ）の嚢に滴下した。ＳＴＣ、Ｅ／ＤｅｌおよびＧＬＳ−５の各株について、１００羽のひなの５０％感染用量（１００ＣＩＤ５０）を、体重に対する嚢の重さの測定値に基づいて決定した。ＩＭ株の１００致死量（１００ＬＤ）は、接種後（ＰＩ）８日目の死亡率に基づいて算出した。
攻撃ウイルス：古典株ＩＭおよびＳＴＣならびに変異株Ｅ／ＤｅｌおよびＧＬＳ−５を以前公知の供給源（スナイダー[Snyder]ら（１９８８ａ） “Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”３２：５２７〜５３４；スナイダー[Snyder]ら（１９９２）“Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．”１２７：８９〜１０１）から得た。眼内点滴注入の後、攻撃ウイルスを、特定病原性非存在（ＳＰＦ）のニワトリ（ＳＰＡＦＡＳ，Ｉｎｃ．、コネチカット州ストアーズ）の嚢に滴下した。ＳＴＣ、Ｅ／ＤｅｌおよびＧＬＳ−５の各株について、１００羽のひなの５０％感染用量（１００ＣＩＤ５０）を、体重に対する嚢の重さの測定値に基づいて決定した。ＩＭ株の１００致死量（１００ＬＤ）は、接種後（ＰＩ）８日目の死亡率に基づいて算出した。
ニワトリの接種とＩＢＤＶ攻撃
白色レグホン種のＳＰＦニワトリをＨＥＰＡフィルター付きの隔離ユニット（モンネア・アンダーソン、ジョージア州、ピーチツリー・シティー）内で孵化させて飼育した。８週令のニワトリを予備放血し、個々のニワトリの羽にバンドを付し、一群１５羽で１０グループに分け、次のように処理した。グループＩ〜Ｖのニワトリには接種を行わず、これらを陰性あるいは陽性の攻撃コントロールとして用いた。グループＶ〜Ｘのニワトリには、リコンビナントバキュロウイルスに感染させた細胞破砕物から上記のように調整した接種物Ｉ−７を０．５ｍｌ筋注で接種した。接種後（ＰＩ）３週間目に、全てのニワトリを放血し、グループＩＩ〜ＩＸのニワトリには適量のＩＢＤＶ攻撃株を眼内注入した。４日後各群から５羽のニワトリを人道的方法で犠牲にし、総排出嚢を摘出した。それぞれの嚢を処理して、文献記載に従ってＩＢＤＶ抗原の存否をＡＣ−ＥＬＩＳＡによって確認した（スナイダー[Snyder]ら（１９８８ｂ）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”３２：５３５〜５３９）。また、ＩＭで攻撃した群のニワトリは死亡と判定され、ＩＭ攻撃によって死に際していることが明らかになった時点で人道的に犠牲にした。感染後８日目に全群の残りのニワトリを犠牲にして計量した。各ニワトリのファブリキウス嚢を注意深く摘出して、計量した。体重に対する嚢の重量の比を、ルシオ[Lucio] とヒッチナー[Hitchner]によって記載された方法に従って各ニワトリについて算出した（ルシオ[Lucio] ら（１９７９）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ.・”２３：４６６〜４７８）。対応するコントロール群の平均値からプラスマイナス２標準偏差単位の範囲に入る値を示した個々のウイルス攻撃されたニワトリは、ＩＢＤＶ感染の陽性インジケータとして数えた。切開した各嚢を１０％の中性緩衝フォルマリンに浸漬して固定した。嚢の横断部を等級分けされたアルコールとキシレンとで処理し、パラフィンに包埋し、切片を作成し、ヘマトキシリン−エオジンで染色して、光学顕微鏡で検査した。ウイルス攻撃に対する防御は、ファブリキウス嚢におけるＩＢＤＶに誘発された損傷の不存在として定義した。
白色レグホン種のＳＰＦニワトリをＨＥＰＡフィルター付きの隔離ユニット（モンネア・アンダーソン、ジョージア州、ピーチツリー・シティー）内で孵化させて飼育した。８週令のニワトリを予備放血し、個々のニワトリの羽にバンドを付し、一群１５羽で１０グループに分け、次のように処理した。グループＩ〜Ｖのニワトリには接種を行わず、これらを陰性あるいは陽性の攻撃コントロールとして用いた。グループＶ〜Ｘのニワトリには、リコンビナントバキュロウイルスに感染させた細胞破砕物から上記のように調整した接種物Ｉ−７を０．５ｍｌ筋注で接種した。接種後（ＰＩ）３週間目に、全てのニワトリを放血し、グループＩＩ〜ＩＸのニワトリには適量のＩＢＤＶ攻撃株を眼内注入した。４日後各群から５羽のニワトリを人道的方法で犠牲にし、総排出嚢を摘出した。それぞれの嚢を処理して、文献記載に従ってＩＢＤＶ抗原の存否をＡＣ−ＥＬＩＳＡによって確認した（スナイダー[Snyder]ら（１９８８ｂ）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”３２：５３５〜５３９）。また、ＩＭで攻撃した群のニワトリは死亡と判定され、ＩＭ攻撃によって死に際していることが明らかになった時点で人道的に犠牲にした。感染後８日目に全群の残りのニワトリを犠牲にして計量した。各ニワトリのファブリキウス嚢を注意深く摘出して、計量した。体重に対する嚢の重量の比を、ルシオ[Lucio] とヒッチナー[Hitchner]によって記載された方法に従って各ニワトリについて算出した（ルシオ[Lucio] ら（１９７９）“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ.・”２３：４６６〜４７８）。対応するコントロール群の平均値からプラスマイナス２標準偏差単位の範囲に入る値を示した個々のウイルス攻撃されたニワトリは、ＩＢＤＶ感染の陽性インジケータとして数えた。切開した各嚢を１０％の中性緩衝フォルマリンに浸漬して固定した。嚢の横断部を等級分けされたアルコールとキシレンとで処理し、パラフィンに包埋し、切片を作成し、ヘマトキシリン−エオジンで染色して、光学顕微鏡で検査した。ウイルス攻撃に対する防御は、ファブリキウス嚢におけるＩＢＤＶに誘発された損傷の不存在として定義した。
血清学的評価
古典Ｄ７８株および細胞培養で作成したＩＢＤＶの変異ＧＬＳ株を一次ニワトリ胚繊維芽細胞中で生育させ、ウイルス中和（ＶＮ）試験に付して、基本的にスナイダー[Snyder]らが記載する方法でトライアルワクチンの血清を試験した（“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”３２：５２７〜５３４（１９８８ａ））。トライアル群の血清についても、抗−ＩＢＤＶ抗体が存在するかどうかを調べた。これには市販のＩＢＤＶ抗体ＥＬＩＳＡキットを使用した（キルケガード・アンド・ペリー[Kirkegaard and Perry]、メリーランド州、ゲイザーズバーグ）。
古典Ｄ７８株および細胞培養で作成したＩＢＤＶの変異ＧＬＳ株を一次ニワトリ胚繊維芽細胞中で生育させ、ウイルス中和（ＶＮ）試験に付して、基本的にスナイダー[Snyder]らが記載する方法でトライアルワクチンの血清を試験した（“Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．”３２：５２７〜５３４（１９８８ａ））。トライアル群の血清についても、抗−ＩＢＤＶ抗体が存在するかどうかを調べた。これには市販のＩＢＤＶ抗体ＥＬＩＳＡキットを使用した（キルケガード・アンド・ペリー[Kirkegaard and Perry]、メリーランド州、ゲイザーズバーグ）。
ワクチンと攻撃ウイルスの評価
Ｉ−７ＧＬＳキメラＩＢＤＶワクチンの抗原量の評価は、ＶＰ２およびＶＰ３特異性モノクローナル抗体のパネルを用いてＡＣ−ＥＬＩＳＡで行った。
Ｉ−７ワクチンにおいて発現した各エピトープの相対抗原量を、予め試験済の
バキュロウイルス発現未修飾ＧＬＳサブユニットワクチンのロットと比較した（バハリア[Vakharia]ら（１９９３）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”、７４：１２０１〜１２０６）。Ｉ−７キメラのワクチンにおける、エピトープを規定した各モノクローナル抗体の状態についてもまた、本Ｉ−７ワクチンの効力評価に用いられる野性型ＩＢＤＶ攻撃ウイルスに見られるＭａｂ（モノクローナル抗体）規定のエピトープの状態と比較した。表３から、本Ｉ−７キメラワクチンにおける８、５７、およびＢ２９の各エピトープでの抗原量レベルは、最近試験された未修飾のＶ−ＩＢＤＶ−７−１ ＧＬＳサブユニットワクチンに類似しているが、元の未修飾Ｖ−ＩＢＤＶ−７ ワクチンよりも約４倍高いことが判る。
Ｉ−７ＧＬＳキメラＩＢＤＶワクチンの抗原量の評価は、ＶＰ２およびＶＰ３特異性モノクローナル抗体のパネルを用いてＡＣ−ＥＬＩＳＡで行った。
Ｉ−７ワクチンにおいて発現した各エピトープの相対抗原量を、予め試験済の
バキュロウイルス発現未修飾ＧＬＳサブユニットワクチンのロットと比較した（バハリア[Vakharia]ら（１９９３）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”、７４：１２０１〜１２０６）。Ｉ−７キメラのワクチンにおける、エピトープを規定した各モノクローナル抗体の状態についてもまた、本Ｉ−７ワクチンの効力評価に用いられる野性型ＩＢＤＶ攻撃ウイルスに見られるＭａｂ（モノクローナル抗体）規定のエピトープの状態と比較した。表３から、本Ｉ−７キメラワクチンにおける８、５７、およびＢ２９の各エピトープでの抗原量レベルは、最近試験された未修飾のＶ−ＩＢＤＶ−７−１ ＧＬＳサブユニットワクチンに類似しているが、元の未修飾Ｖ−ＩＢＤＶ−７ ワクチンよりも約４倍高いことが判る。
Ａ： 各Ｍａｂエピトープの相対レベルはＡＣ−ＥＬＩＳＡで決定し、各モノクローナル抗体エピトープのレベルは、従前用いたＶ−ＩＢＤ−７ワクチンに対して１と設定した（１５）。最高レベルは９である。各１．０の増加は、元のＶ−ＩＢＤ−７ ワクチン中に存在するエピトープの量の約２倍量のエピトープの存在を示す。Ｖ−ＩＢＤ−７−１ ワクチンも従前報告済のもの（１６）。
Ｂ： Ｍａｂエピトープの状態は、ＡＣ−ＥＬＩＳＡで決定し、存在（＋）または不存在（−）で示す。
Ｃ： 中和ＭａｂエピトープはＩＢＤＶのＶＰ２上に存在する。
Ｄ： 非中和ＭａｂエピトープはＩＢＤＶのＶＰ３上に存在する。
Ｅ： 未修飾大セグメントＡ ＧＬＳタンパクを含むリコンビナントバキュロウイルスワクチン
Ｆ： 修飾キメラ大セグメントＡ ＧＬＳタンパクを含む本発明リコンビナントバキュロウイルスワクチン
Ｂ： Ｍａｂエピトープの状態は、ＡＣ−ＥＬＩＳＡで決定し、存在（＋）または不存在（−）で示す。
Ｃ： 中和ＭａｂエピトープはＩＢＤＶのＶＰ２上に存在する。
Ｄ： 非中和ＭａｂエピトープはＩＢＤＶのＶＰ３上に存在する。
Ｅ： 未修飾大セグメントＡ ＧＬＳタンパクを含むリコンビナントバキュロウイルスワクチン
Ｆ： 修飾キメラ大セグメントＡ ＧＬＳタンパクを含む本発明リコンビナントバキュロウイルスワクチン
未修飾ワクチンとキメラ性ワクチンとの主な違いは、キメラ性のＧＬＳ産物中の古典Ｂ６９エピトープの外観であった。Ｂ６９エピトープのレベルは、未修飾ＧＬＳサブユニットワクチンに対する比較が出来なかったため、任意に９と設定した。攻撃ウイルス上でのＭａｂ規定エピトープの状態を未修飾およびキメラ性ＧＬＳサブユニットワクチンと比較すると（表３）、キメラ産物は、古典ＳＴＣおよびＩＭ攻撃ウイルス上に見いだされるＢ６９エピトープを発現していた一方、同一ＧＬＳエピトープをすべて保持していたことが判る。
能動交叉防御
表４に、交叉防御トライアルの結果およびウイルス攻撃に先立って行った血清学的検査の結果を示す。
表４に、交叉防御トライアルの結果およびウイルス攻撃に先立って行った血清学的検査の結果を示す。
Ａ： ワクチン接種は８週令で行った。
Ｂ： 攻撃ウイルスは、免疫後３週目（コントロールについては１１週令）に眼に点滴注入することにより行った。
Ｃ： 防御は、攻撃後４日目に各群の１／３によってＡＣ−ＥＬＩＳＡ法で決定した。
Ｄ： 防御は、組織学的に行うとともに、８日目における嚢／体重の比で決定した。
Ｅ： ５羽のニワトリは攻撃後８日目に先立つＩＭ攻撃により、死亡と判定された。
Ｆ： １標準偏差
Ｂ： 攻撃ウイルスは、免疫後３週目（コントロールについては１１週令）に眼に点滴注入することにより行った。
Ｃ： 防御は、攻撃後４日目に各群の１／３によってＡＣ−ＥＬＩＳＡ法で決定した。
Ｄ： 防御は、組織学的に行うとともに、８日目における嚢／体重の比で決定した。
Ｅ： ５羽のニワトリは攻撃後８日目に先立つＩＭ攻撃により、死亡と判定された。
Ｆ： １標準偏差
グループＩＩ〜Ｖは攻撃コントロールとして使用したが、ＡＣ−ＥＬＩＳＡ、嚢／体重比、および組織学的評価の結果によって示されるように、使用した全株について、ワクチン接種を受けなかった全ニワトリが毒性ＩＢＤＶの攻撃に完全に感受性を示した。ＩＭ攻撃によって、コントロール群のニワトリの１／３において致死がもたらされた。対照的に、グループＶＩ〜ＩＸの８週令のニワトリはＧＬＳキメラのワクチンを１回接種されたが、接種後３週間目において、ワクチン接種を受けた全ニワトリが、コントロールにおいてＩＭ株で生じた致死的疾病状態を含む、どの攻撃ウイルスの攻撃からも完全に防御された。血清学的には、Ｄ７８およびＧＬＳ組織培養ウイルスで予め攻撃したものの血清について複数回試行した交叉ＶＮ試験から得られた力価は、基本的に互いに２倍以内であった。平均ＥＬＩＳＡ力価は比較的低かったが、ワクチン接種を行ったグループ間では均一であった。
ワクチンの特徴付け
バキュロウイルス発現サブユニットＧＬＳワクチンを用いた初期の研究では、２用量の投与の後、Ｖ−ＩＢＤＶ−７ ＧＬＳワクチン（表３）のみが活性な抗体レベルを誘発し、同一種ＧＬＳの攻撃に対し７９％の防御を提供できた（バハリア[Vakharia]ら（１９９３年）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”７４：１２０１〜１２０６）。引き続く研究では、元のＶ−ＩＢＤＶ−７ワクチンの抗原量を約４倍増加し（グループ特異的なＭａｂ８部位にて計算）、Ｖ−ＩＢＤＶ−７−１と命名した未修飾のＧＬＳサブユニットワクチンを用いた１用量と２用量のワクチン接種交叉攻撃トライアルを開始した（表３）。このトライアルでは、２用量のワクチンにより毒性ＳＴＣ、Ｅ／ＤＥＬおよびＧＬＳの攻撃に対して完全な交 叉防御が得られた。しかし、ワクチンの１用量トライアルでは、変異株Ｅ／ＤＥＬおよびＧＬＳウイルスによる攻撃に対して完全な防御が達成できたものの、より関係の遠い古典的なＳＴＣウイルスに対しては４４％の防御しか達成できなかった。これらの研究は、抗体量および／またはワクチンの用量を単に増加させるだけで上記の良好な交叉防御が得られることを意味するものともいえる。しかし、同一種のワクチン接種をしない場合には、ＧＬＳ Ｖ−１ＢＤＶ−７−１サブユニットワクチンの１用量によって誘発された低い抗体レベルでは、古典的なＩＢＤＶ攻撃に対しては充分に交叉防御を発揮できないこともまた明らかであった。これは、漸消する母性の抗体の場合のように抗体のレベルがより低い場合には、交叉防御が更に減少することを意味する。事実、ＳＴＣウイルスによる攻撃ではないが、異なる用量のＶ−ＩＢＤＶ−７ワクチンを使用して行った幾つかの受動的母性抗体の研究では、同等のＧＬＳ防御は生じたが、ワクチン接種した雌鶏の子孫は、より近い関係のＥ／ＤＥＬの攻撃に対して５７％しか防御できなかった。
バキュロウイルス発現サブユニットＧＬＳワクチンを用いた初期の研究では、２用量の投与の後、Ｖ−ＩＢＤＶ−７ ＧＬＳワクチン（表３）のみが活性な抗体レベルを誘発し、同一種ＧＬＳの攻撃に対し７９％の防御を提供できた（バハリア[Vakharia]ら（１９９３年）“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”７４：１２０１〜１２０６）。引き続く研究では、元のＶ−ＩＢＤＶ−７ワクチンの抗原量を約４倍増加し（グループ特異的なＭａｂ８部位にて計算）、Ｖ−ＩＢＤＶ−７−１と命名した未修飾のＧＬＳサブユニットワクチンを用いた１用量と２用量のワクチン接種交叉攻撃トライアルを開始した（表３）。このトライアルでは、２用量のワクチンにより毒性ＳＴＣ、Ｅ／ＤＥＬおよびＧＬＳの攻撃に対して完全な交 叉防御が得られた。しかし、ワクチンの１用量トライアルでは、変異株Ｅ／ＤＥＬおよびＧＬＳウイルスによる攻撃に対して完全な防御が達成できたものの、より関係の遠い古典的なＳＴＣウイルスに対しては４４％の防御しか達成できなかった。これらの研究は、抗体量および／またはワクチンの用量を単に増加させるだけで上記の良好な交叉防御が得られることを意味するものともいえる。しかし、同一種のワクチン接種をしない場合には、ＧＬＳ Ｖ−１ＢＤＶ−７−１サブユニットワクチンの１用量によって誘発された低い抗体レベルでは、古典的なＩＢＤＶ攻撃に対しては充分に交叉防御を発揮できないこともまた明らかであった。これは、漸消する母性の抗体の場合のように抗体のレベルがより低い場合には、交叉防御が更に減少することを意味する。事実、ＳＴＣウイルスによる攻撃ではないが、異なる用量のＶ−ＩＢＤＶ−７ワクチンを使用して行った幾つかの受動的母性抗体の研究では、同等のＧＬＳ防御は生じたが、ワクチン接種した雌鶏の子孫は、より近い関係のＥ／ＤＥＬの攻撃に対して５７％しか防御できなかった。
１用量のワクチン接種による交叉攻撃トライアルで、古典的なＢ６９中和エピトープを組み込んだキメラＧＬＳ Ｉ−７ワクチンを評価した。本発明のトライアルを従前のトライアルと比較できるようにするため、ＡＣ−ＥＬＩＳＡによりＩ−７キメラサブユニットワクチンの相対抗原量を、以前に使用した未修飾のＶ−ＩＢＤＶ−７−１ワクチンとほぼ同一になるようにＩ−７ワクチンを調製した（表３）。表４は、Ｉ−７ワクチンを１用量投与した後における交叉攻撃の結果を示す。結果は、ＧＬＳとＥ／ＤＥＬ株に対しての防御は完全であるという点において、以前に使用した未修飾のＶ−ＩＢＤＶ−７−１について得られた結果と類似していた。しかし、Ｉ−７ワクチンは、古典的なＳＴＣとＩＭ株による病原的かつ致死的な攻撃に対して完全な防御を提供した。Ｖ−ＩＢＤＶ−７およびＩ−７ワクチン上のグループに共通のエピトープとＧＬＳの抗原量とは、注意深く平衡化して同等にしてあるので、古典的ＩＢＤＶ株による攻撃に対してのＩ−７の効果が比較的向上したことは、ＧＬＳ ＶＰ２タンパク配列への古典的ＩＢＤＶ Ｂ６９中和エピトープの組み込みのみが原因となっているとの結論を出すことができる。
ウイルス様粒子
上記のように、本発明による組み換えｃＤＮＡとそれによって発現された免疫原は、ＶＰ２免疫原性領域に閉じ込めてもよい。即ち、ＧＬＳ等のベースとなるＩＢＤＶおよびＤ７８等の２番目のＩＢＤＶエピトープ決定基に対して、エピトープ決定基をコードするｃＤＮＡクローンを調製すれば充分であろう。ＶＰ２エピトープ決定領域に存在する他のエピトープ決定基は、何れも上記したように組み込んで、クローン化し、発現できるであろう。
図２Ａ、図２Ｂに反映されているように、ウイルス様粒子はＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３構造タンパク配列をコードするＤＮＡの発現によって発生する。このウイルス様粒子免疫原は、モノクローナル抗体の面からみても、および電気泳動、クロマトグラフィー等の従来の分離手法の何れによっても対応するＶＰ２だけの免疫原から分離できる。しかし、モノクローナル抗体との反応性の相違は、ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３構造タンパク配列から誘導されたウイルス様粒子に存在するエピトープは、同一のＶＰ２のみの領域によって発現された免疫原には存在しないことを示している。このエピトープは、“直線的かつ高次の”エピトープである。高次エピトープは直線的エピトープと相違し、実際のウイルスのアミノ酸配列だけでなく、コンフォメーションにも反映する。その結果、組み換えによるウイルス様粒子を家禽に接種すると、ＶＰ２領域のみの免疫原による接種に比べて、ＩＢＤＶによる飼育場の攻撃に対してより優れた防御を提供する。これは、ウイルスの全ての構造要素の自然発生的組立によるものである。
上記のように、本発明による組み換えｃＤＮＡとそれによって発現された免疫原は、ＶＰ２免疫原性領域に閉じ込めてもよい。即ち、ＧＬＳ等のベースとなるＩＢＤＶおよびＤ７８等の２番目のＩＢＤＶエピトープ決定基に対して、エピトープ決定基をコードするｃＤＮＡクローンを調製すれば充分であろう。ＶＰ２エピトープ決定領域に存在する他のエピトープ決定基は、何れも上記したように組み込んで、クローン化し、発現できるであろう。
図２Ａ、図２Ｂに反映されているように、ウイルス様粒子はＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３構造タンパク配列をコードするＤＮＡの発現によって発生する。このウイルス様粒子免疫原は、モノクローナル抗体の面からみても、および電気泳動、クロマトグラフィー等の従来の分離手法の何れによっても対応するＶＰ２だけの免疫原から分離できる。しかし、モノクローナル抗体との反応性の相違は、ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３構造タンパク配列から誘導されたウイルス様粒子に存在するエピトープは、同一のＶＰ２のみの領域によって発現された免疫原には存在しないことを示している。このエピトープは、“直線的かつ高次の”エピトープである。高次エピトープは直線的エピトープと相違し、実際のウイルスのアミノ酸配列だけでなく、コンフォメーションにも反映する。その結果、組み換えによるウイルス様粒子を家禽に接種すると、ＶＰ２領域のみの免疫原による接種に比べて、ＩＢＤＶによる飼育場の攻撃に対してより優れた防御を提供する。これは、ウイルスの全ての構造要素の自然発生的組立によるものである。
出願人は、ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３構造タンパクの単一のセグメントの一部としてのＶＰ２領域の発現により、図２Ａ、図２Ｂに示すようなウイルス様粒子が生じることを発見した。この粒子は、抗体と反応することが示されたが、この抗体は同一の組み換えＶＰ２免疫原とは同じように反応しない。したがって、家禽宿主をそれによって接種した場合、ウイルス様粒子はより高い抗体力価および／または僅かに異なった（より広い）防御を生じる。
したがって、本発明は、（１）少なくとも２種の異なったＩＢＤＶ株のエピトープ決定基を含む組み換えＶＰ２免疫原、（２）ＶＰ２領域が少なくとも２つの異なったＩＢＤＶ株のエピトープ決定基および１と２の両方をコードする塩基配列を含むＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３セグメントのウイルス様粒子、およびこれを用いたワクチンを包含する。
組み換えエピトープ決定基の組み合わせ
上記の実施例に示されているように、ＩＢＤＶ株に対する遺伝的エピトープ決定基は、異なったベースのＩＢＤＶ遺伝子配列のＶＰ２領域に挿入し、次いで両方のＩＢＤＶのためのエピトープを示す免疫原を発現するために使用する。事実、上記の例は、少なくとも３個の異なったＩＢＤＶエピトープ決定基の組み合わせを示している。さらに多くのものを組み合わせることもできる。得られたワクチンは活性成分、一種類の株または株の一つのファミリーに対して防御を提供する従来のウイルスによるワクチンとは異なり、広範なＩＢＤＶに対して攻撃の防御を提供する発現した免疫原を含む。
上記の実施例に示されているように、ＩＢＤＶ株に対する遺伝的エピトープ決定基は、異なったベースのＩＢＤＶ遺伝子配列のＶＰ２領域に挿入し、次いで両方のＩＢＤＶのためのエピトープを示す免疫原を発現するために使用する。事実、上記の例は、少なくとも３個の異なったＩＢＤＶエピトープ決定基の組み合わせを示している。さらに多くのものを組み合わせることもできる。得られたワクチンは活性成分、一種類の株または株の一つのファミリーに対して防御を提供する従来のウイルスによるワクチンとは異なり、広範なＩＢＤＶに対して攻撃の防御を提供する発現した免疫原を含む。
図７は、７個の異なったＩＢＤＶのためのエピトープ決定領域のアミノ酸の同一性を示す。これらは、限定を意図するものではなく、代表的なものである。必要とされる組み換え免疫原、即ちＶＰ２のみおよびウイルス様粒子ＶＰ２− ＶＰ４−ＶＰ３の免疫原は、図７において特定された位置の変化するアミノ酸についての遺伝子エピトープ決定基を置換することによって作られる（特定されていない位置はＩＢＤＶ株全体を通じて保存されている）。これには、本発明の免疫原の発現が含まれる。可能性のある組み合わせは、数は多いが、明らかに限定され、ルーチン技術により検索できる。代表的な組み合せは、優勢なＩＢＤＶについてのエピトープ決定基の組み合わせを反映する傾向を持つであろう。
Ｅ／Ｄｅｌ／ＧＬＳ組み換え体は、位置２１３、Ａｓｎ−Ａｓｐ、２５３ Ｇｌｎ−Ｈｉｓおよび１６９ Ｔｈｒ ＳｅｒにおけるＥ／Ｄｅｌエピトープ決定領域の変化を含むことができる。
ＤＳ３２６／Ｄ７８組み換え遺伝子はアミノ酸と、７６Ｓｅｒ−Ｇｌｙ、２４９Ｌｙｓ−Ｇｌｎ、２５３Ｇｌｎ−Ｈｉｓおよび２７０Ａｌａ−Ｔｈｒ置換体に対応するヌクレオチド置換体を含むことができる。
明らかに、広範な組み合わせが可能であり、これらは当業者には明らかとなるであろう。ＶＰ２領域のアミノ酸５−４３３から始まる領域をほぼ含むエピトープ決定基領域は、組み換え“カセット”を構成する。このカセットは、アミノ酸の挿入および／または削除を行って所望の組み換えｃＤＮＡクローン、ポリペプチド、ウイルス様粒子、および広範なＩＢＤＶに対して改善された防御機能を有するワクチンを提供するために、部位特異性の突然変異誘発によって作成される。
致死的ＩＢＤＶ、モノクローナル抗体、およびそれらためのワクチン
上記のように、典型的には、ＩＢＤＶの感染は免疫抑制状態を作り出し、ファブリキウス嚢における病変を引き起こす。これが米国で起きている典型的なＩＢＤＶである。しかし、致死的なＩＢＤＶ、即ち、ＩＢＤＶ感染が直接原因となって鶏の死亡につながるＩＢＤＶ感染も存在する。これらのＩＢＤＶの分離に基づくワクチンが開発されたが、得られるワクチンは“ホット”、即ち、それら自体が免疫抑制状態を作りだすかまたは誘導するものであって、接種した鶏は、他の感染性成分に対する抗体を用いて免疫強化しなければならない。この防御方法は好ましくなく、ヨーロッパにおける殆どの商業家禽場で使用が中止された。致死的ＩＢＤＶに対する適切な安全なワクチンが現在のところ入手できない。
上記のように、典型的には、ＩＢＤＶの感染は免疫抑制状態を作り出し、ファブリキウス嚢における病変を引き起こす。これが米国で起きている典型的なＩＢＤＶである。しかし、致死的なＩＢＤＶ、即ち、ＩＢＤＶ感染が直接原因となって鶏の死亡につながるＩＢＤＶ感染も存在する。これらのＩＢＤＶの分離に基づくワクチンが開発されたが、得られるワクチンは“ホット”、即ち、それら自体が免疫抑制状態を作りだすかまたは誘導するものであって、接種した鶏は、他の感染性成分に対する抗体を用いて免疫強化しなければならない。この防御方法は好ましくなく、ヨーロッパにおける殆どの商業家禽場で使用が中止された。致死的ＩＢＤＶに対する適切な安全なワクチンが現在のところ入手できない。
本発明者らは、モノクロール抗体Ｍａｂ２１を開発した。これは、ブタぺスト条約の条件に基づき、寄託登録番号ＡＴＣＣ ＨＢ １１５６６としてアメリカ ン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている。このモノクロー ナル抗体は特異的であり、致死的ＩＢＤＶ株を中和する。その特異性を表５に示すが、他のモノクローナル抗体と異なり、Ｍａｂ２１は、致死の可能性を有するＩＢＤＶ株のみによって表されたエピトープに特異的であることを示している。
＊：実地株：米国で分離された、現在までにテストされた全ての古典的な実地株は２１マーカーを有する。
注：１）ＬｕｌｅｒｔおよびＳＴＣはＥｄｇａｒ派生物である。
２）ＵｎｉｖａｘはＢｕｒｓａ Ｖｅｃの派生物である。
３）Ｂｕｒｓａ Ｂｌｅｎｄは２５１２ Ｗｉｎｔｅｒｆｉｅｌｄの派生物である。
注：１）ＬｕｌｅｒｔおよびＳＴＣはＥｄｇａｒ派生物である。
２）ＵｎｉｖａｘはＢｕｒｓａ Ｖｅｃの派生物である。
３）Ｂｕｒｓａ Ｂｌｅｎｄは２５１２ Ｗｉｎｔｅｒｆｉｅｌｄの派生物である。
本明細書を全体を通して、本願発明による組み換えキメラ免疫原における異なったＩＢＤＶのエピトープの存在を確認するために使用される種々のモノクローナル抗体が参照されることに注意されたい。これらのモノクローナル抗体もブダぺスト条約で定められた条件に基づき寄託されており、自由に入手可能である。しかし、本発明の実施には必要でなく、本発明の態様を構成するものではない。これはＭａｂ２１の場合と比較されるべきである。
ＩＢＤＶのために発明者が開発した他のＭａｂのように、ＩＢＤＶの致死株に対しての受動的免疫、特に均一で標準化されたレベルでの免疫を達成し、致死性ＩＢＤＶの実地感染に対する母親から得た免疫レベルを増大させるように設計された受動的免疫は、接種された鶏に対する防御を強化するのに充分な量のＭａｂ２１が存在する上記したような薬理学的に許容されるキャリヤを含むワクチンを用いて１日齢の鶏を接種することによって得られる。
防御に必要なレベルは、卵内への１用量のワクチンの投与により、または１マイクログラム〜１ミリグラムの間のＭａｂ２１濃度を有する１日齢の鶏によって、若しくは少ない有効用量の接種を長期間行うことによって与えられる。もし繰り返し接種を行う場合には、用量のレベルは１マイクログラム〜１ミリグラムとすべきである。年齢のより多い鶏の接種に必要な濃度レベルは、鶏の重さとともに増加し、経験的に決められる。
エピトープ決定基領域における致死的株のアミノ酸配列を更に調査したところ、非致死的株ではＶＰ２の位置２７９に２７９特定Ａｓｎが高度に保存されており、致死的株の同じ位置にはＡｓｐが保存されていることが明らかとなった。したがって、致死株に特有の、Ｍａｂ２１によって認識される致死的株エピトープ決定基は、置換２７９ Ａｓｐ−Ａｓｎによる非致死的ＩＢＤＶとは経験的に相違する。上記の方法に従って、以前は如何なる形式のワクチンを用いても免疫抑制状態を誘発することなしには調製不可能であった、致死的ＩＢＤＶに対して効果的な防御を与えるキメラ組み換え免疫原が、ＧＬＳ等の非致死的なベースＩＢＤＶ内に２７９Ａｓｐのための遺伝子エピトープ決定基を挿入することによって調製できる。これは、ベースＩＢＤＶ、致死的ＩＢＤＶ、および遺伝子エピトープ決定基が挿入されたその他全てのＩＢＤＶに対する防御を提供する。これらの免疫原から調製されたワクチンは、ＶＰ２のみであるかＶＰ２−ＶＰ−ＶＰ３セグメントのウイルス様粒子の形態であるかに関わらず、上記したと同様に使用される。
Claims (7)
- 家禽に接種することによってＩＢＤＶ致死株の攻撃から当該家禽を保護することが確認される非発病性の免疫原であって、当該免疫原はＩＢＤＶのＶＰ２アミノ酸配列を含有し、当該ＶＰ２アミノ酸の２７９番目がＡｓｐである、非発病性免疫原。
- 前記免疫原が、ＩＢＤＶ構造タンパク質ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３に対するアミノ酸配列をこの順に有するものである、請求項１に記載の免疫原。
- ウイルス様粒子の形態である、請求項２に記載の免疫原。
- ＡＣ−ＥＬＩＳＡの条件の下でＩＢＤＶ致死株に結合するとともに、受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ １１５６６として寄託された細胞株によって発現されるモノクローナル抗体のエピトープ結合特性を有するモノクローナル抗体。
- 前記細胞株から直接的にまたは間接的に得られる、請求項４に記載のモノクローナル抗体。
- 前記細胞株によって発現される抗体である、請求項５に記載のモノクローナル抗体。
- 家禽に接種することによってＩＢＤＶ致死株の攻撃に対して受動免疫を与える調製物であって、活性成分として請求項４〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗体の有効量と、生理学的に許容される担体とを含有する調製物。
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