JPH05501064A

JPH05501064A - Ｉｂｄｖタンパク質に関連する特異的ｄｎａ配列並びにベクター、宿主およびワクチン

Info

Publication number: JPH05501064A
Application number: JP3510163A
Authority: JP
Inventors: バカリア，ビクラム
Original assignee: ユニバーシティ　オブ　メリーランド　アット　カレッジ　パーク
Priority date: 1990-05-04
Filing date: 1991-04-30
Publication date: 1993-03-04
Also published as: WO1991016925A1; AU7955591A; CA2058598A1; EP0481072A4; EP0481072A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】から成る群から選択される、請求項１６の宿主。

１８、請求項ＩのＲＮＡセグメントによりコードされるアミノ酸配列の少なくともｌコピーを含んで成る、生物学的に純粋なポリペプチド。

１９、前記アミノ酸配列が、表６，７および８のアミノ酸配列、５．７４．８４．２１３．２２２．２３９．２４９．２５３．２５４．２５８．２６４゜２６９、２７０．２７２．２７９．２８０．２８４．２８６．２９７．２９９．３０５．３１８゜３２１、３２３．３２６．３２８．３３０．３３２および４３３からなる群から選択された少なくとも１つの位置において異なるアミノ酸を有するそれの類似体、それの機能性断片、それの機能性前駆体並びにそれの組合せから成る群から選択された配列を含んで成る、請求項１８のポリペプチド。

明　細　書２０、家禽およびそれの子孫をｔＢＤから保護する方法でありって、所望の効果を獲得するのに有効な量の請求項９０組換えベクターを家禽に投与することを含んで成る方法。

２１、前記組換えベクターが眼内に、注入により、鼻内にまたは経口的に対象物に投与される、請求項２０の方法。

２２、前記組換えベクターが約１０２〜１０’　ｐｆｕの量で対象物に投与される、請求項２３の方法。

２３、家禽およびそれの子孫を［ＢＤから保護する方法でありって、所望の効果を獲得するのに有効な量の請求項７の生物学的に純粋なりＮＡ上セグメント家禽に投与することを含んで成る方法。

２４４前記ＤＮＡが眼内に、注入により、経鼻的にまたは経口的に対象物に投与される、請求項２３の方法。

２５、前記ＤＮＡが約１０２〜１０’　ｐｆｕの量で対象物に投与される、請求項２３の方法。

により特徴づけられる明白な感染を有する。

ＩＢＤＶタンパク質に関連する特異的ＤＮＡ配列並びにベクター、宿主およびワクチン技術分野本発明は、幼若のニワトリのガンボロ（Ｇｕｍｂｏｒｏ）病に関係づけられる感染性滑液嚢病ウィルス（ＩＢＤＶ）に関する。より詳しくは、本発明は、該ウィルスのＶＰ２タンパク質に関連する生物学的に純粋なりＮＡ、ＲＮＡおよびポリペプチド配列、広域スペクトルＩＢＤＶワクチン、並びに他の関連技術に関する。

本発明の技術は、ウィルスに対する免疫応答を惹起せしめる立体配座エピトープの生体内生産のためのワクチンに適用することができる。こうして、該ワクチンの投与は、接種される対象物、例えば家禽にだけでなく、その子孫にも、ｒＢＤＶに対する保護を与える。

背景の記載感染性滑液嚢病（ＩＢＤ）またはガンポロ病は、ファブリーキウス嚢中のリンパ濾胞の破壊により特徴づけられる幼若のニワトリの高伝染性ウィルス病である。

３〜６週齢の高感染性ニワトリ群において、臨床的病気は重い免疫抑制を引き起こ臨床的には病気の外面的徴候を表さないが、嚢の著しい病変二の病気の症状に関連づけられるウィルスは、感染性滑液嚢病ウィルス（ｒＢＤＶ）と呼ばれる。

ＩＢＤＶは国内および世界の家禽産業にとって経済的に重要な主な病原体である。それはファブリーキウス嚢中の抗体産生Ｂ細胞の前駆体の破壊により、幼若のニワトリにおいて重度の免疫不全を引き起こす。

免疫抑制は他の病気に対する感受性を増大させ、ニューカッスル病、マレク病および感染性気管支炎病ウィルスに対して効果的な予防接種を妨害する。

ｒＢＤＶには２つの既知の血清型が存在する。血清型■ウィルスはニワトリに対して病原性であり、血清型■ウィルスはニワトリとシチメンチョウに感染する。

シチメンチョウの感染は臨床的意味が現在未知である。

最近まで、幼若のニワトリにおいてＩＢＤを抑制する主な方法は［ＢＤＶの非毒性株を予防接種することによるか、または生もしくは死ＩＢＤワクチンの投与により誘導された高レベルの母性抗体を種部に移すことによるものであった（Ｗｙｅｔｈ、　Ｐ、Ｊ。

およびＣｕ１ｌｅｎ、　Ｇ、Ａ、、　Ｖｅｔ、　Ｒｅｃ、　１０４．１８８−１９３　（１９７９））。

近年、特に合衆国東部におけるＩＢＤの野外発生は、標準的な血清型ＩのＩＢＤＶに対する抗体により完全には中和されない変異ウィルスによる家禽の感染を示した（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ、　Ｊ、Ｋ。

ら、Ｐｒｏｃ、ｏｆ　ｔｈｅ　２０ｔｈ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｎ　ＰｏｕｌｔｒｙＨｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｃｏｎｄｅｍｎａｔｉｏｎｓ、　９４−１０１　（１９８５）　；　５ｎｙｄｅｒ、　Ｄ、Ｂ。

ら、Ｐｒｏｃ、　２３ｒｄ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｎ　Ｐｏｕｌｔｒｙ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄＣｏｎｄｅｍｎａｔｉｏｎｓ、０ｃｅａｎ　Ｃ１ｔｙ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　（１９８８））　。

ＩＢＤＶは、ビルナウイルス科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）と呼ばれるウィルスのグループに属し、このグループには他の二本鎖ＲＮＡウィルス、例えば感染性膵臓壊死ウィルス（魚類）、ベニ貝ウィルスおよびカキウィルス（収穀軟体動物）並びにショウジヨウバエＸウィルス（ショウジヨウバエ）が含まれる。

それらのウィルスは全て高分子量（ＭＷ）二本鎖ＲＮＡゲノムを含む。

ＩＢＤＶピリオンのカプシドは少なくとも４つの構造タンパク質から成る。９つほどの構造タンパク質が報告されているが、それらのうちの幾つかが前駆体−生成物関係を有するという証拠がある。この４つのウィルスタンパク質（ＶＰ）の名称および分子量を下の表１に示す。

ウィルスタンパク質　分子量ＶＰＩ　９０　ｋＤａＶＰ２　４１　ｋＤａＶＰ３　３２　ｋＤａＶＰ４　２８　ｋＤａ４７　ｋＤａの追加のタンパク質■ＰＸはＶＰ２の前駆体であることが決定された。

シチメンチョウ（ＯＨ，オハイオ株）から得られたＩＢＤＶ血清型Ｉ　（ＳＴ− Ｃ，標準チャレンジウィルスおよび弱毒化ウィルスＢＢ）と血清型■のヌクレオチド配列が比較されており、予備情報を提供している（Ｊａｃｋｗｏｏｄ、　Ｄ、Ｊ、ら、６９ｔｈ　ＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｏｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｗｏｒｋｅｒｓ　ｉｎ　ＡｎｉｍａｌＤｉｓｅａｓｅ、　Ａｂｓ、　Ｎｏ、　３４６．　Ｃｈｉｃａｇｏ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　（１９８８）　）。

ＩＢＤＶゲノムにおいて二本鎖ＲＮＡの２セグメントが同定された。１つは３４００塩基対を含み２．０６Ｘ　１０＠の分子量を有し、もう１つは２９００塩基対を含み］、　７６Ｘ　１０’の分子量を有する。

該ウィルスの変性ゲノムＲＮＡの試験管内翻訳は、大きい方のＲＮＡセグメントが３つの構造タンパク質、即ちＶＰ２．　ＶＰ３およびＶＰ４をコードし、そして小さい方のＲＮＡセグメントが１つのタンパク質ＶＰＩのみをコードすることを示した。

０３株とは異なるＩＢＤＶのオーストラリア株の２セグメントが最近クローニングされ、配列決定された（Ｈｕｄｓｏｎ、　Ｐ、Ｊ、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４．５００１−５０１２　（１９８６）　；　Ｍｏｒｇａｎ、　Ｍ、Ｍ。

ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６３．２４０−２４２　（１９８８））　。大きい方のセグメントの完全ヌクレオチド配列は、それらのタンパク質がＶＰ２゜ＶＰ４およびＶＰ３の順序でコードされ、そしてそれらが１つの転写解読枠に含まれることを示した。加えて、更なるヌクレオチド配列データによって、小さい方のＲＮＡセグメントがＶＰＩタンパク質のみをコードすることが立証された（Ｍｏｒｇａｎ。

Ｍ、　Ｍ、ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６３．２４０−２４３（１９８８））　。

このタンパク質はウィルス粒子の少量成分であり、ウィルスＲＮＡポリメラーゼであると推定される。［ＢＤＶては、ＶＰＩタンパク質が２つのゲノムセグメントの両端にしっかりと結合し、それが効果的に分子を巡回する。

最近、ＶＰ２タンパク質が［ＢＤＶの主要な宿主保護免疫原でああり、そして中和抗体の誘導の原因となる抗原性領域を含むことが証明された。中和部位を含む領域は高い立体配座依存性であることが示されている。ＶＰ３タンパク質は、それが血清型Ｉと■の両方のウィルス株からのものに対して向けられたモノクローナル抗体により認識されるので、グループ特異的抗原であると考えられる。ＶＰ４タンパク質は、ＶＰ２．　ＶＰ３およびＶＰ４タンパク質の前駆体ポリタンパク質のプロセシングに関与する、ウィルスによりコードされるプロテアーゼであると思われる。しかしながら、タンパク質分解が起こる正確な様式はまだ明らかでない。

ＩＢＤＶ単離物間の抗原変異の発生が最近報告された。モノクローナル抗体（ＭＣＡ）Ｂ２９．　Ｒ６３，Ｂ６９．１７９．８に９および５７の使用は、合衆国の現地における３つの別々の抗原型の［ＢＤＶの発生の認識に至った。それらのデータを下の表２に示す。

表２　：　［ＢＤＶの保存単離体、実験室／参考文献およびワクチン株のＡＣ− ＥＬ［ＳＡ特徴づけＩＢＤＶの古典型Ｄ７８とＧＬＳ株に対して特異的に作製された上記の２つのＭＣＡＢ６９と５７は、ウィルス中和試験により親ウィルスのみを中和することがわかった。３番目のＭＣＡ　Ｒ６３は、ＧＬＳ変異ウィルスを除く全ての血清型ＩのＩＢＤＶを中和することが示された。他の２つのＭＣＡ　１７９とＢＫ４４は、今までに研究された全ての血清型ＩのＩＢＤＶを有力に中和することがわかった。

全ての血清型工のＩＢＤＶは抗原捕捉エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（ＡＣ−ＢＬＴＳＡ）においてＭＣＡ　Ｂ２９に結合する。しかしながら、Ｂ２９　ＭＣＡは中和ＭＣＡではない。他方、Ｂ６９とＲ６３は両方とも中和ＭＣＡである。Ｂ６９　ＭＣＡとの反応性に基づいて新規変異体の予想を行うことができる。ＡＣ−ＥＬＩＳＡにおいてこのＭＣＡに結合しないウィルスは、おそらく標準型（「古典型」）と抗原的に有意に異なり、従って変異ウィルスと呼ばれるだろう。プラウエア型Ｅ　（Ｅ！／ＤＥＬ）でもＧＬＳ変異体でもないＩＢＤＶはＢ６９　ＭＣＡ、と反応する。更に、Ｅ／ＤＥＬ変異体はＲ６３ＭＣＡとの反応性に基づいてＧＬＳ変異ウィルスと区別することができる。ＧＬＳ変異ウィルスは、上の表２に示されるように、ＡＣ−ＥＬＩＳＡにおいてＲ６３ＭＣＡに結合しない。

抗原捕捉ＥＬｒＳＡ試験に基づいて新規ＧＬＳ変異体が最近発見されたＣ３ｎｙｄｅｒ、　Ｄ、Ｂ、ら、Ｐｒｏｃ、　２３ｒｄ　Ｎａｔ、　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｎＰｏｕｌｔｒｙ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｃｏｎｄｅｍ、、　０ｃｅａｎ　Ｃ１ｔｙ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　（１９８８）〕。このＩＢＤＶ株は現在プラウエア変異体にとって代わっており、既にデルマーバ半島において発生する最も優勢なＩＢＤＶ型になっている。モノクローナル抗体（ＭＣＡ）　Ｒ６３，Ｂ２９を使って得られたＩＢＤＶ型に関するデータを下の表３に示す。

表３　：　ＭＣＡ　Ｒ６３，Ｂ６９およびＢ２９を基剤としたＡＣ−ＥＬｒＳＡを用いて決定されたＩＢＤＶ型の地理的分布合計６２７市場には現在入手可能な９種類の弱毒化された非毒性の「生Ｊワクチンが存在する。ワクチン株は全て、ＭＣＡ　ＡＣ−ＥＬｒＳＡ試験においてＢ２９．　Ｂ６９およびＲ６３と反応する。従って、それらのウィルスは上の表２に示される「古典型」に分類される。

それらのワクチンの商標名および入手源を下の表４に示す。

表４：ＩＢＤＶ用ワクチンワクチン　会社名Ｃ１ｏｎｅ−ｖａｃ　Ｄ７８　１ｎｔｅｒｖｅｔ　ＡｍｅｒｉｃａＵｎｉｖａｘ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｃｉ、　Ｌａｂ。

Ｂｕｒｓｉｎｅ　５ａｌｉｓｂｕｒｙＢｉｏ−Ｂｕｒｓ　ＫｅｅＶｅｔＢｉｏ−Ｂｕｒｓ　Ｉ　ＫｅｅＶｅｔＩＢＤ　Ｂｌｅｎｄ　ＣｅｖａＢｕｒｓａ−ｖａｃ　ＳｔｅｒｗｉｎＶｒ−Ｂｕｒ−Ｇ　ＶｉｎｅｌａｎｄＳ７０６　５ｅｌｅｃｔ上記のワクチン株は変異ウィルスと同様に毒性でなく、「生」で提供することができる。よって、それらはワクチンとして使用するために不活性化または「死滅コさせる必要がない。しかしながら、それらのワクチンは変異ウィルスによる感染に対して保護する場合に完全には有効でない。上記ワクチン株で免疫処置されたニワトリのうち限定された数が実際にプラウエア（約６０％）とＧＬＳ　（約３０％）変異ウィルスでのチャレンジに対して保護される。

加えて、現在日常的に行われているＩＢＤＶの「古典型」株（表４参照）による免疫処置は、プラウエア（ＤＥＬ）およびＧＬＳ変異ウィルスに対してのみ部分的に保護された免疫処置鳥類にする。

「死Ｊ　［ＢＤＶワクチンはＭｉｌｌｓｂｏｒｏ、　ＤｅｌａｗａｒｅのＩｎｔｅｒｖｅｔＣｏ、から入手可能であり、これは標準的（「古典型Ｊ）プラウエアおよびＧＬＳ変異ウィルス型を含む。上記の「生」および「死」ワクチンの使用はとりわけ下記の欠点を有する。

ウィルス番組織培養において増殖させなければならず、これは時間と費用がかかる。

「死Ｊワクチンでは、使用前にウィルスを不活性化しなければならず、これは費用がかかる追加の段階を必要とする。

もし「死」ワクチンが適切に不活性化されなければ、発病の危険があり、ウィルス変異体および結果として生じる病気に対する広域保護を提供しない。

かくして、種々の病原性ＩＢＤＶ株により引き起こされるｒＢＤの治療において効果的である改良ワクチンペの要望が明らかに存在する。

発明の開示本発明は、約３０〜１０１２アミノ酸のポリペプチドの少なくとも１コピーをコードするＲＮＡ配列の少なくとも１から２０までのコピーを含んで成る、生物学的に純粋なＲＮＡセグメントに関する。ここで前記ポリペプチドはＢ／ＤＥＬおよびＧＬＳから成る群から選択された少なくとも１つのＵＳ変異体のＩＢＤＶＶＰ２タンパク質の抗体結合特性を有する。

また、本発明の一部は、組換えベクターであって、それに結合している構造ＤＮＡ配列を宿主中で増殖および発現させることができるベクター：および該ベクターに読み枠において結合している上述のＤＮＡセグメントの少なくとも１から２０までのコピー、を含んで成る組換えベクターに関する。ＤＮＡセグメントの複数のコピーの直列結合も本発明の一部として提供される。

本明細書において、組換えベクターに結合した構造ＤＮＡ配列を宿主中で増殖および発現させることができるベクターと該ベクターに読み枠において結合している上述のＤＮＡセグメントの少なくとも１から２０までのコピーとを含んで成る組換えベクターにより形質転換された宿主も提供される。

本発明は、広域スペクトルＩＢＤ家禽ワクチンであって、家禽保護量の前記組換えベクター：および生理学的に許容される担体を含んで成る広域スペクトルＩＢＤ家禽ワクチンにも関する。

本発明のＲＮＡセグメントによりコートされる約３０〜１０１２アミノ酸のアミノ酸配列の少なくともＩから２０までのコピーを含んで成る生物学的に純粋なポリペプチドも本発明に包含される。

家禽およびその子孫をＩＢＤから保護する方法も本発明の一部である。該方法は、ＩＢＤの症状から家禽を保護するであろう免疫応答を獲得するのに有効な量の本発明の組換えベクターを家禽に投与することを含んで成る。

本発明の他の目的、利点および特徴は、下記の記載から当業者に明らかになるであろう。

発明実施の最良の形態本発明は、合衆国において新たに出現するＩＢＤＶ変異体に対する家禽の保護に関する従来技術における改善の必要性から発生した。

［ＢＤＶゲノムの構造的構成、特に該ウィルスのＶＦ６．　ＶＦ６およびＶＰ４タンパク質のそれを研究することによりこれを試みた。

従って本発明は、複数のｆＢＤＶ　ＶＦ６１ＪＳ変異体の代表的なりＮＡワクチンを提供する。家禽を予防接種するのにこのＤＮＡを使用すると、それは既知のＩＢＤＶ変異体によるその後の感染に対するだけでなく、今後に出現する変異体に対する広域保護を付与することが仮定される。このＤＮＡワクチンにより家禽に与えられる保護の大きさは、０３株自身の間の変異体以外にもＵＳ株から広範囲に分岐することが知られている他のＩＢＤＶ株にも及ぶ。

従って、本発明は、約３０〜１０１２アミノ酸の長さのポリペプチドの少なくともｌコピーをコードするＲＮＡ配列の少なくとも１から２０までのコピーを含んで成る生物学的に純粋なＲＮＡセグメントを提供する。ここで前記ポリペプチドは［ＢＤＶＶＰ２タンパク質の少なくとも１つのＵＳ変異体の抗体結合特性を有する。ＵＳ変異体の例はＧＬＳおよびＥ／ＤＥＬ変異体である。

重なったそれらのセグメントはＶＰ２タンパク質に属する配列より多くをコードする。少なくとも約１０１２アミノ酸配列をコードする各セグメントはＶＰ２タンパク質の結合能力、並びにＶＦ６およびＶＦ６１ＢＤＶタンパク質に相当する配列を含んで成る。

そのようなＲＮＡ配列は、少な（とも１つのＵＳ　ＩＢＤＶ変異体の抗体結合特性を有するポリペプチドの唯一のコピー、もしくは約２０までのコピー、好ましくは約１〜５コピー、それの抗体結合性機能性断片、それの機能性前駆体、またはそれらの組合せをコードすることができる。該ＲＮＡ配列は更に、別〕ＬＩＳ　ＴＢＤＶ変異体、例えばＥ／ＤＥＬ、ｒ古典型」またはＧＬＳ変異体のｖＰタンパク質の抗体結合特性を有するポリペプチドの少なくともｌコピーをコードすることかできる。該ＲＮＡ配列は、上記に定義したそれらのポリペプチド、それの機能性断片、それの機能性前駆体いずれか１つをコードしてもよい。更に、該ＲＮＡ配列は、他のＩＢＤＶ株、例えばオーストラリアＩＢＤＶ変異体（１９８８年１２月２９日公開のＷＯ８８／１０２９８　；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎｕｃｔｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１４（１２）、　５００１−５０１２　（１９８６）　、１またはヨーロッパｒＢＤＶ株Ｃ３ｐｉｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１７（１９）、　７９８２　（１９８９）　）のＶＰ２タンパク質の抗体結合活性を更にコードすることができる。それらがドイツＣｕ−１（ヨーロッパ）およびオーストラリアのＶＰ２タンパク質のＤＮＡ、ＲＮＡおよびポリペプチド並びに関連配列の獲得に必要である限りにおいて、それらの論文の前内容は本明細書に参考として組み込まれる。

１つの好ましい態様において、該ＲＮＡ配列によりコードされるポリペプチドは、少なくとも１つのＵＳ変異体のＶＰ２タンパク質のアミノ酸２００〜３３０の抗体結合特性を含んで成る。

本発明の別の好ましい態様では、該ＲＮＡセグメントは、約９０〜９０００塩基、より好ましくは約１５０〜５０００塩基、更に好ましくは約３００〜７５０塩基を含んで成る。本明細書の実施例において得られる特定のクローンは約３．３キロ塩基の長さである。

該ＲＮＡ配列は、好ましくは表６および７のようなアミノ酸配列、５．７４．８４．２１３．２２２．２３９．２４９．２５３．２５４．２５８゜２６４．２６９．２７０．２７２．２７９．２８０．２８４．２８６．２９７．２９９．３０５゜３１８．３２１．３２３．３２６．３２８．３３０．３３２および４３３のような位置において異なっている少なくとも１つのアミノ酸および２９までの異なるアミノ酸を有するそれの類似体、それの機能性断片、それの機能性前駆体並びにそれの組合せの少なくとも１コピーをコードすることができる。

異なるｒＢＤＶ　ＶＦ６　ＵＳ変異体の抗体結合性を有するポリペプチドの機能性前駆体は、約３０〜１０１２アミノ酸の長さであることができ、ある状況では約１００〜３５０アミノ酸の長さであることができる。しかしながら、他のサイズのポリペプチドも、それらが少なくとも１つのＵＳ変異体のＶＰ２タンパク質の抗体結合特性を有する対応するポリペプチド中に含まれる最終番号のアミノ酸より大きい数を含むならば、前駆体の定義内に入ると考えられる。

該ポリペプチドの機能性断片は、約５〜４５０アミノ酸の長さ、より好ましくは約５〜４０アミノ酸の長さであることができる。それらの断片は、当業界において既知であるようなＩＢＤＶに対する抗体に関する結合特性および／または該ポリペプチドを抗原性にするエピトープのアミノ酸配列を含んで成Ｅ／ＤＥＬおよびＧＬＳ変異体由来の［ＢＤＶ　ＶＰ２タンパク質の機能性ポリペプチド類似体は、ＶＰ２タンパク質のサイズを有してもよく、またはそれの前駆体および断片について上述したようにそれより大きくても小さくてもよい。類似体はアミノ酸配列中に約１〜８０個の変異、好ましくは約１〜３０個の変異、より好ましくは５．７４．８４．２１３，２２２．２３９．２４９．２５３．２５４゜２５８、２６４，２６９．２７０．２７２．２７９．２８０．２８４．２８６．２９７．２９９゜３０５、３１８，３２１．３２３．３２６．３２８．３３０．３３２および４３３位またはそれらの組合せにおいて変異を有することができる。

しかしながら、該ポリペプチドの抗原結合能力が破壊されない限り、他の位置が独力で変更されてもよい。

本発明の他の態様において、該ＲＮＡ配列は、ＧＬＳ　ＩＢＤＶＶＰ２タンパク質、Ｅ／ＤＥＬ　ＩＢＤＶ　ＶＰ２タンハ’）　ｆｆｆ、セレノ機能性類似体、それの機能性断片、それの機能性前駆体およびそれらの組合せの少なくとも１コピーをコードする。特に好ましい態様では、該ＲＮＡ配列はＧＬＳおよびＥ／ＤＥＬ　［ＢＤＶ　ＶＰ２タンパク質の少なくともｌコピー、そして２０コピーまで、好ましくは５〜１０コピーをコードする。

更に他の態様では、該ＲＮＡ配列は［ＢＤＶ　Ｅ／ＤＥＬ、　ＧＬＳまたはその両方のＶＦ６．　ＶＦ６およびＶＰ４タンパク質またはＶＦ６およびＶＰ４タンパク質の全配列の１〜２０コピーをコードする。

更に、前記のＲＮＡセグメントに対応する一本鎖ＤＮＡ配列を含んで成る、生物学的に純粋なりＮＡ上セグメント提供される。特に好ましい態様では、該ＤＮＡセグメントは二本鎖である。このＤＮＡ配列は、ＧＬＳおよびＥ／ＤＥＬから成る群から選択された少なくとも１つのＵＳ変異体のＩＢＤＶ　ＶＰ２タンパク質の抗体結合特性をコードする。

遺伝暗号の縮重のため、特定のアミノ酸配列をコードする多数のＲＮＡおよびＤＮＡ配列を得ることが可能である。従って、本明細書に記載の抗体結合特性を有するポリペプチドの発現をもたらす全てのＲＮＡおよびＤＮＡ配列が本発明に含まれる。

本発明の特に好ましい態様では、該ＤＮＡ配列は、表６および７に示されるＤＮＡ配列、約１０〜７５０塩基対の長さ、より好ましくは約２０〜３５０塩基対の長さのそれの機能性断片、約１００−１３５０塩基対の長さ、より好ましくは約２００〜１０００塩基対の長さのそれの機能性前駆体、並びに約３０〜１０１２塩基対の長さ、より好ましくは約１５〜４５０塩基対の長さのそれの類似体を含んで成り、ポリペプチドについて上述したアミノ酸変異に該当する。

変異：ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアミノ酸配列の総数の適当な比率は、約０．１〜ｌＯ％、より好ましくは約１〜５％である。

しかしながら、生産物の機能が保存される限り他の比率も考慮される。

本明細書において、組換えベクターであって、それに結合した構造ＤＮＡ配列を宿主中で増殖および発現させることができるベクター；および本発明のＤＮＡセグメントの少なくともｌから約２０でのコピーを含んで成る組換えベクターが提供され、ここで該セグメントは前記ベクターに作用可能に連結している。

前記組換えベクターは、当業界に周知のような他の必要な配列、例えば発現調節配列、マーカー、増幅遺伝子、シグナル配列、プロモーター等も含んで成ることができる。

この目的に有用なベクターはプラスミド、並びにウィルス、ックスウイルス、例えば鶏痘ウィルス等である。特に好ましいベクターは、既知の組換え鶏痘ウィルス系である（ＢｏｙｌｅおよびＣｏｕｐａｒ、　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１０：　３４３−３５６　（１９８８）　；Ｔａｙｌｏｒ、　Ｊ、ら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６４：　１４４１−１４５０　（１９９０）　；これらの全文献は、ポックスウィルスベクターの調製および利用並びに家禽ワクチンにおけるそれらの利用を可能にするのに必要な程度に参考として本明細書中に組み込まれる〕。

本発明の特に好ましい態様では、数組換えウィルスは、作用物質、例えば特に気管支炎ウィルス、鳥類しオウイルス、ニワトリ貧血因子またはニューカッスル病ウィルス（ＮＤ）により生ずる他の病気に対する保護を提供する少なくとも１つのポリペプチドをコードする追加のＤＮＡ配列を含んで成る。

それらのＤＮＡ配列は、それらが宿主中で発現できるように読み枠において組換えベクターに作用可能に連結される。このベクターに担持される別の構造ＤＮＡ配列は、タンパク質が別々に発現されるように終結および開始配列により分離されてもよいし、またはそれらが単一の読み枠の一部となり当業界で既知の方法（Ｔａｙ　ｆｏｒら、前掲）により融合タンパク質として生産されてもよい。

本発明の組換えベクターにより形質転換された宿主もまた提供される。該宿主は真核宿主てあっても原核宿主であってもよい。適当な例は、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　、昆虫細胞系、例えば５ｆ−９、ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞、ニワトリ肝腎ｍ　（ＣＥＫ）細胞等である。後者の２細胞はＨＶＴおよびポックスウィルスの増殖に有用である。混合ワクチンには、９９　Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１３−１２０に従った不活性化ワクチンの基準、特にニュー力・ソスル病ウィルス（ＮＤＶ）を含む混合ワクチンについては９　Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１３−１２５に従った基準、を満たすような用量において、本発明の［ＢＤＶに不活性化抗原を添加することができる。しかしながら、当業界で既知の他の宿主およびベクターを使用してもよい。

広域スペクトルＩＢＤＶ家禽ワクチンであって、ベクターに結合した構造ＤＮＡ配列を宿主中で増殖および発現させるベクターを含んで成る家禽保護量の組換えベクター：および生理学的に許容される担体、を含んで成る広域スペクトルＩＢＤＶ家禽ワクチンも本発明の一部を構成する。

本発明のワクチンは、免疫系を刺激しそしてＩＢＤに対する抵抗性を付与するのに十分な量で投与される。該ワクチンは、好ましくは約ｌｏｇ　２〜約ｌｏｇ　５　ＥＩｎｓ。（胚感染量、。）、より好ましくは約ｌｏｇ　３〜約］、ｏｇ　４　ＥＩＤｓｏの範囲の用量で投与される。ワクチンを家禽に投与する時に使用する量は様々に異なることができる。適切な量は約１０２〜１０’プラーク形成単位（ｐｆｕ）の組換えベクター、より好ましくは約１０３〜１０４ｐｆｕの組換えベクターである。６週齢以上の動物に、約０．０１〜約２ｍｌのワクチン、より好ましくは約０．１〜約１ｍｌのワクチンを、例えば羽組織（＊ｉｎｇ−ｗｅｂ）法により、注射針を使って投与することができる。適切には、医薬上許容される無菌担体中に再構成した時、ウィルス価は約１０４〜ｌ０７ｐｆｕ／ｍｉであろう。該ワクチンは一回量形態として粉末形で、または密封容器あたり約１〜１０００用量、好ましくは約１〜１０００量のワクチンにおいて提供することができる。

家禽の予防接種のための生理学的に許容される担体は当業界で周知であり、本明細書においてこれ以上記載する必要はない。家禽に生理学的に許容されることに加えて、担体はワクチンにより惹起される免疫応答および／またはそれのポリペプチド生産物の発現を妨害してはならない。

他の添加剤、例えば特にアジュバントおよび安定剤も当業界で既知の量においてワクチンに含まれてもよい。好ましくは、アジュバント、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、植物油および動物油等が、ｒＢＤＶに対する免疫応答を増強するのに十分な量で、ワクチンと共に投与される。ワクチンに添加されるアジュバントの量は、アジュバントの性質に依存して異なり、通常はＩＢＤＶの重量の約０．１〜約１００倍、好ましくは［ＢＤＶの重量の約１〜約１０倍である。

本発明のワクチンは種々の安定剤も含むことができる。任意の適当な安定剤を使用することができ、それらとしては炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、デンプン、シヨ等、デキストリンまたはグルコース；タンパク質、例えばアルブミンまたはカゼイン：および緩衝液、例えばアルカリ金属リン酸塩等が挙げられる。安定剤は凍結乾燥により乾燥ワクチン製剤を調製する場合に特に有利である。

弱毒化ワクチンは、任意の適当な既知の家禽接種方法、例えば経鼻的、経眼的、注射により、飲料水中に、飼料中に、暴露により、等の方法により投与することができる。好ましくは、該ワクチンは大量投与技術、例えばワクチンを飲料水中に入れることによるかまたは動物環境に噴霧することにより投与される。本発明のワクチンは注射により投与することもてきる。注射により投与する時、ワクチンは好ましくは非経口投与される。本明細書において使用する非経口投与とは、静内、皮下、筋向または腹腔内注射を意味する。既知の技術、例えばＢｅａ、に −ｏ−Ｖａｃ投与が好ましい。

本発明のワクチンは、［ＢＤを予防するために鼾化の前または後の任意の時期に家禽に投与される。好ましくは、該ワクチンは誕生前と動物が約６週齢になった後に投与される。家禽とは、ニワトリ、オントリ、メントリ、ブロイラー、ロースタ−１積電、産卵鶏、シチメンチョウおよびアヒルを包含するものと定義される。

該ワクチンは無菌容器内に一回量形または他の量で提供することができる。−２０°Ｃ以下、好ましくは一７０°Ｃ以下で凍結保存することが好ましい。それは使用前に解凍され、その後すぐに再凍結することができる。家禽への投与のために、組換えＤＮＡ材料またはベクターは、約１０’　〜１０７ｐｆｕ　／ｍｌ。

より好ましくは約１０５〜１０’　ｐｆｕ　／ｄ担体、例えば食塩溶液、の量て担体中に懸濁され得る。当業界で既知の他の担体を使用してもよい。医薬上許容される担体の例は、当業界で既知の希釈剤および不活性の医薬担体である。好ましくは、担体または希釈剤は大量投与技術によるワクチンの投与と適合できるものである。しかしながら、担体および希釈剤は他の投与方法、例えば注射、点眼、点鼻等とも適合できる。

前記ＤＮＡセグメントによりコードされる約３０〜１０１２アミノ酸のアミノ酸配列の少なくとも１コピーを含んで成るポリペプチドも本発明により提供される。該ポリペプチドのアミノ酸配列は本発明のＲＮＡセグメントによりコードされるものでもある。

上記のＲＮＡおよびＤＮＡセグメントの場合と同様に、該アミノ酸配列は約３０〜１０１２アミノ酸の長さのポリペプチドの少なくとも１から２０までのコピー（ここで該ポリペプチドは少なくとも１つのＵＳ変異体の［ＢＤＶ　ＶＰタンパク質の抗体結合特性を有する）、それの機能性前駆体、それの機能性断片、それの機能性類似体およびそれの機能性組合せを含んで成ることができる。

該ポリペプチドのアミノ酸配列は、約３０〜１０１２アミノ酸の長さ、より好ましくは約１００〜８００アミノ酸の長さであることができ；それの機能性前駆体の各配列は約４０〜２０００アミノ酸の長さ、より好ましくは約５０〜１５００アミノ酸の長さであることができ：それの機能性断片の各配列は約５〜５００アミノ酸の長さ、より好ましくは約５〜５００ミノ酸の長さであることができ；そしてそれの機能性類似体の各配列は約３０〜ｌ０１２アミノ酸の長さ、より好ましくは約１００〜８００アミノ酸の長さであることができる。該ポリペプチドが有する点変異の数および種類は、ＲＮＡおよびＤＮＡセグメントについで上述したものの中に残っている。

特に好ましい態様では、該ポリペプチドは表６，７および／または８に示されたアミノ酸配列を含んで成る。別の好ましい態様では、該ポリペプチドはＶＰ２タンパク質のアミノ酸２００〜３３０の結合特性を含んで成る。しかしながら、該ポリペプチドは他の配列、例えば他の［ＢＤＶ変異体のＶＰ２タンパク質の配列またはそれの機能性断片を含んで成ってもよい。

更に、ｒＢＤから家禽およびその子孫を保護する方法であって、所望の効果を獲得するのに有効な量の本発明の組換えベクターを家禽に投与することを含んで成る方法も提供される。

他の量で投与することもてきるが、各動物に、好ましくは担体中において、−再投与あたり約１０’〜１０’　ｐｆｕの該ＤＮＡ、より好ましくは約１０３〜１０’　ｐｆｕの該ＤＮＡが投与される。ワクチンはＩＢＤに対して成る程度の保護を与えるために１回投与するか、または予め決められた間隔で繰り返し投与してもよい。あるいは鼾化後の任意の時期に該ワクチンを再投与してもよい。再予防接種の典型的な間隔は約１日から約６か月、好ましくは約１０日から約４か月である。しかしながら、該ワクチンを他の時期にブースター投与してもよい。

本発明の一部として提供される種々の生成物は、当業者が利用可能であり且つ既知である標準技術および商業的に入手可能な材料を利用することにより得ることができる。

今まで本発明を一般的に記載してきたが、幾つかの特定例またはそれのいずれかの態様を参照することにより一層理解されるだろう。この例は例示のためてあり決して本発明の限定であるとみなしてはならない。

精製デルマーバ半島において流行している血清型ｒのｒＢＤＶの２種類の天然変異体、プラウエア株（Ｅ／ＤＥＬまたはＤＥＬ）ＣＲｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｊ、に、ら、Ｐｒｏｃ、２０ｔｈ　Ｎａｔ、　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ＰｏｕｔｒｙＨｅａｌｔｈ　Ｃｏｎｄｅｍｎ、　（１９８５））およびＧＬＳ７５株（Ｓｎｙｄｅｒ、　Ｄ、Ｂ、ら、Ｐｒｏｃ、　２３ｒｄ　Ｎａｔ、　Ｍｅｅｔｉｎｇ　Ｐｏｕｔｒｙ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｃｏｎｄｅｍｎ、、　０ｃｅａｎＣｉｔｙ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　（１９８５）　）を使用した。

［ＢＤＶのＧＬＳおよびＥ／ＤＥＬ株を、病原体フリーの白色レグホン種のニワトリの滑液嚢中で増殖させた。２〜３週齢のニワトリにＧＬＳまたはＥ／ＤＥＬ原株ウィ小株ウィルスｄｅｒ、　Ｄ、Ｂ、ら、Ｙｅｔ、　Ｉｍｒｎｕｎｏｐａｔｈｏｌ、　９：　３０３−３１７　（１９８５））を経口接種した。

感染後４〜５日目に嚢を切除し、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）および１５０［１１Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液（ＴＮＢ緩衝液）中でホモジナイズした。ｍ織の完全な乳化を促進するために等容量のＴＮＢ緩衝液を添加した。

ホモジネートを３回凍結−解凍し、大きいサイズのプローブと共に３０秒間の２回の破壊により超音波処理した。ウィルス懸濁液から細胞破片を１５．０００Ｘｇての１０分間の遠心によりペレット化した。次いて上清を０．８μｍのフィルターに通過させ、濾液を分離した。濾液中に存在するウィルスを４°Ｃ１５０、０００Ｘ　ｇでの１．５時間の遠心によりペレット化した。

ペレット化したウィルスを１０ｍ１のリン酸塩緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）、　ｐＨ７，２中に再懸濁し、そして不連続ショ糖勾配（３０％〜５５％ショ糖）　（Ｓｎｙｄｅｒら（１９８５）、前掲〕上で４　’Ｃにて９０、０００　Ｘ　ｇでの３時間の遠心により更に精製した。

ウィルスバンドを回収し、ＰＢＳで希釈し、そして４°Ｃにて５０、０００　Ｘ　ｇでの１．５時間の遠心により再ペレット化した。

実施例２：ウィルスＲＮＡの単離および精製下記のようにしてプロテイナーゼにで処理することによりウィルスから全ウィルスＲＮＡを単離した。ペレット化したウィルスを、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５，１２ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１５０ｍＭ　Ｎａ１ｌを含む反応緩衝液中に懸濁し、モして３７°Ｃにて１時間プロテイナーゼＫ　（ｉ！Ｌ終濃度２００μｇ／ｍＮ、）で消化した。

混合物を水飽和フェノールで２回、およびクロロホルム：イソアミルアルコール混合物（２４＋１）で２回抽出した。水相中に存在するＲＮＡを一２０°Ｃでの２．５容のエタノールの添加により沈澱せしめ、遠心により回収した。

抽出されたウィルスＲＮＡを低融点アガロースゲル上での分画により精製した（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）　）　、　ＲＮＡ試料を１％アガロースゲル上に負荷し、８９ｍＭ　Ｔｒｉｓ−はう酸塩、　ＩｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．０５％臭化エチジウム、　ｐ）［８，３，を含む緩衝液を使ってゲルを電気泳動した。Ｂｓｔ　ＥＩＩで消化したラムダＤＮＡ鎖もゲルに適用し、サイズマーカーとして使用した。

ＤＮＡおよびＲＮＡ断片を上記条件下で臭化エチジウム染色し、紫外光下で視覚化した。電気泳動は、ＩＢＤＶの大小ＲＮＡ断片がよく分離するまで行った。約３４００塩基対の大ＲＮＡ断片をゲルから溶出せしめ、上記と同様にフェノール抽出により回収した。

実施例３　：　Ｅ／ＤＥＬおよびＧＬＳ株の大ゲノムセグメントの第−鎖ｃＤＮＡおよび相補鎖ＤＮＡの合成ｃＤＮＡ合成の前に下記のようにしてウィルスＲＮＡを変性させた。ＩＢＤＶ　ＲＮＡの大セグメント約５μｇを９μｌの５＋ｎＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）中に入れ、１００℃で２分間加熱し、次いで急冷した。ＲＮＡを解凍した後、　１μｍの１００ｍＭ水酸化メチル水銀を添加し、そして混合物を室温で１０分間放置した。

２μｌの７００ｍＭ　２−メルカプトエタノールの添加により過剰な水酸化メチル水銀をクエンチングし、更に室温で５分間発表された［ＢＤＶオーストラリア株の配列（Ｈｕｄｓｏｎ、　Ｐ、　Ｊ、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４．５００１−５０１２　（１９８６）　）および発表されたドイツＣｕ−Ｉ　ＩＢＤＶ株の配列Ｃ３ｐｉｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　１７（１９）、　７９８２　（１９８６））にそれぞれ基づいて、ＶＰ２遺伝子配列の３′末端および大ゲノムセグメント配列の３′末端に特異的に結合する特定のプライマーを合成し、ｃＤＮＡ合成を開始させるのに用いた。

ＶＰ２プライマー：　５’−ＣＡＡＴＴＧＣＡＴＧＧＧＣＴＡＧ−３’３′末端プライマー：　５’　−ＡＡＣＧＡＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＧＡＴ−３’合成したオリゴヌクレオチドがｃＤＮＡ合成を開始させることができなかった時、ランダムプライマーも使用した。ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎの方法（Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｕ、およびＨｏｆｆｍａｎ、　Ｂ、　Ｊ、　。

Ｇｅｎｅ　２５．２６３−２６９　（１９８３）　）に従って二本鎖ｃＤＮＡを合成した。

第−鎖ｃＤＮＡの合成は、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐｔ（８，３，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２゜１０ｍＭジチオトレイトール、　４ｍＭビロリン酸ナトリウム、　１．２５ｍＭ　ｄＧＴＰ、　１．２５ｍＭ　ｄＡＴＰ、　０．５ｍＭ　ｃｃＴＰ、　２０μＣｉ　”Ｐ−ｄＣＴＰ。

５μｇのプライマー、５μｇのＲＮＡおよび１００単位の逆転写酵素を含む５０ μ！の反応液量において４２℃にて１時間行った。

２　μｌ　（８０，５Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨｓ、　０の添加により反応を停止させた。

次いでフェノール／クロロホルム（１：１）で反応生成物を抽出し、２Ｍ酢酸アンモニウムの存在下でエタノール沈澱させた。

ＤＮＡの第二鎖の合成および二本鎖ＤＮＡ断片の形成は、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ− ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、　５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　１０ｍＭ　（ＮＨ４）２Ｓ８４．１００ｍＭ　ＫＣｌ、　０．１５ｍＭ　β−ＮＡＤ、５ＭｇＢＳＡ、４０ＭＭｄＮＴＰ、　１単位の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＲＮａｓｅ　Ｈ，２５単位のＤＮＡポリメラーゼＩおよび１単位の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＤＮＡリガーゼを含む１００μｌの反応液量において行った。この反応混合物を１２℃にて１時間、２２℃にて１時間順次インキュベートし、そして１０μｍの０．５Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０の添加により反応を停止させた。

上記と同様にして反応生成物をフェノール抽出し、エタノール沈澱させた。

実施例４：ベクターへのＤＮＡ断片の連結二本ｇｃＤＮＡをＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、次いで低融点アガロース上で分画した（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）　）。

大きいサイズの断片、例えば５００塩基対より大きいもの、を上記と同様なフェノール抽出によりゲルから回収した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で１４°Ｃにて一晩インキユベートすることにより、平滑末端化されたｃＤＮＡｆ：　ＥｃｏＲｒアダプター（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を連結せしめた（ＭａｎｉａＨｓ、　Ｔ、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｊｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２））。

ＥｃｏＲＩ末端を有するｃＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの存在下でリン酸化し、脱リン酸されたＥｃｏＲＩ切断ｐＧＥＭ−７２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）と連結せしめ、次いで形質転換に使用した。

実施例５：組換えベクターによる細菌宿主の形質転換法のようにして大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＪＭ　１０９細胞をコンピテントにした。５ｄのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ　（ＬＢ）ブロス中での大腸菌ＪＭ１０９細胞の一晩培養物を使って、２５０ｍ１のアーレンマイヤーフラスコに入った４０ｒＩＬｌのＬＢブロス（１：　１００）に接種し、これを３７°Ｃで穏やかに振盪した。０Ｄ６５゜９．が約０．５に達した時、フラスコを氷冷し、そして４°Ｃにて４０００Ｘｇでの５分間の遠心により細胞をペレット化した。上清を捨て、細胞を２０ｍ１Ｏ形質転換緩衝液（５０ｍＭ　ＣａＣｌ２．２５０ｍＭ　ＫＣＩ、　５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。

ｐＨ７，５，および５ｍＭ　ＭｇＣ１２）中に懸濁した。次いで細胞を氷ｒ　上で２０分間インキュベートし、遠心によってもう１回ペレット化し、２ｍｔ’の形質転換緩衝液中に再懸濁し、モして４°Ｃに一装置いた。

０．２−のコンピテント細胞を連結ｃＤＮＡに添加し、混合物をまず氷上で１時間、次いで４２°Ｃて２分間インキュベートした。

１ｍｌの［、Ｂブロスを添加し、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。

実施例６：ウィルスＤＮＡ挿入断片を有する宿主の選択プラスミドｐＧＥＭ−７２はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子マーカーを含む。よって組換え体の選択のために、形質転換混合物を、アンピシリン、イソプロピルチオ−Ｐ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および色素産生物質５−プロモー４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）を含む培養プレート上に塗布した。

挿入断片を存するアンピシリン耐性白色コロニーを選択し、増殖させ、そして１５％グリセロール中−１５°Ｃで保存した。

実施例７：組換えクローンのスクリーニング上記の実施例６で得られたアンピシリン耐性白色コロニーを、サザンハイプリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、Ｍ、。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９８．５０３−５１７　（１９７５））によりウィルス特異的配列の存在についてスクリーニングした。

簡単に言えば、プラスミドＤＮＡを含む組換え細菌を２ｍｌのＬＢジブロス中増殖させ、確立された方法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ。

およびＤｏｌｙ、Ｊ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７．１５１３−１５２０　（１９７９）　）によりプラスミドＤＮＡを単離した。次いで精製したプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲ［酵素で消化し、１％アガロースゲル上で分離し、挿入断片のサイズを決定した。Ｈｉｎｄ埠およびＥｃｏＲＩで消化したラムダＤＮＡの断片をサイズマーカーとして使用した。ＤＮＡをＧｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　（ＤｕＰｏｎｔ、　Ｉｎｃ、）に移行することにより、遊離した挿入断片を同定し、３２ｐ標識プローブとハイブリダイズせしめた。

ウィルスＲＮＡの塩基加水分解大セグメントをγ−２２ｐ−ＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼ（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｃ，Ｃ，、Ｐｒｏｃ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　２．８１５−８１９　（１９７１））で５′末端標識することによりプローブを調製し、１００℃で２分間加熱することにより変性させ、次いで０°Ｃに急冷した。

膜を５０％ホルムアミド、ＩＭ　ＮａＣ１、Ｉ％ＳＤＳおよび２０％硫酸デキストランを含む予備ハイブリダイゼーション混合物と少なくとも１５分間予備ハイブリダイズせしめた。次いで予備ハイブリダイゼーション混合物に１００μｇ／ｒｄの変性サケ精子ＤＮＡと変性放射性プローブを添加した。連続攪拌下で４２ °Ｃにて１６時間ハイブリダイゼーションを行った。

ハイブリダイゼーション後、膜を０．３Ｍ　ＮａＣ１，０，０３Ｍクエン酸ナトリウム、　ｐＨ７，０（２ｘＳＳＣ）および１％ＳＤＳを含む緩衝液で６５°Ｃにて２０分間洗浄し、次いで０．ｌＸ５ＳＣ！衝液て室温にて２０分間洗浄した。オートラジオグラフィーによりハイブリダイゼーションを検出し、最大の挿入断片を有する陽性ｃＤＮＡクローンを選択した。

オーバーラツプしているクローンをハイブリダイゼーションと制限酵素マツピングの両方により同定した。

下の表５に示すように種々のクローンがマツピングされた。

実施例８：ＧＬＳおよびＥ／ＤＥＬ　ｃＤＮＡクローンのマツピングＧＬＳ−１，ＧＬＳ〜２．　ＧＬＳ−３およびＧＬＳ−４並びにＥ／ＤＥＬ−２ｃＤＮＡクローンを完全に配列決定し、そして“Ｍｉｃｒｏｇｅｎｉｅ”コンピュータープログラムを使ってそれらの配列をＩＢＤＶのオーストラリア株のＤＮＡ配列と比較した。

配列相同性に基づいて、上記クローンを下の表５に示すように［ＢＤＶゲノム上にマツピングした。

表５　：　ＩＢＤＶ−大セグメントｃＤＮＡクローン（ＧＬＳ−１，ＧＬＳ−２゜ＧＬＳ−３，ＧＬＳ−４およびＥ／ＤＥＬ−２’）ＶＰ２　ＶＰ４　ＶＰ：１実施例９　：　Ｅ／ＤＥＬおよびＧＬＳ　ＩＢＤＶ株（７）ＶＰ２遺伝子断片の配列決定各々ＩＢＤＶのＥ／ＤＥＬ株およびＧＬＳ株のｃＤＮＡセグメントを含む組換え細菌を、　１００μｇ／−のアンピシリンを含むＬＢジグロス中増殖させた。アルカリ溶菌法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，およびＤｏｌｙ、Ｊ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７．１５１３−Ｉ５２０　（１９７９）　）により大規模でのプラスミドＤＮＡの単離を行った。次いて塩化セシウム勾配遠心分離（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）　）によりプラスミドＤＮＡを精製した。

それらのｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を、５ｅｑｕｅｎａｓｅ　”システムキット（Ｕ、Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）を使って、ＳＦ３とＴ７プロモーターブライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてジデオキシチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、ら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７４．５４６３−５４６７　（１９７７）　）の変法により決定した。

ＩＢＤＶの大ゲノムセグメントのＶＰ２領域に相当する選択された１セツトのオリゴヌクレオチドを合成し、配列決定反応においてプライマーとして使用した。

その例は次のものである（５′から３′末端）。

（１）　ＴＡＴＴＣＴＧＴＡＡＣＣＡＧＧＴＴ＜２）　ＣＡＣＴＡＴＣＴＣＣＡＧＴＴＴＧＡＴ＜３）　ＴＡＣＧＡＧＧＡＣＴＧＡＣＧＧＧＴＣＴＴ標識断片を４５または６０ｃｍの８％ポリアクリルアミド−尿素ゲル上で分画し、オートラジオグラフィーにより検出した。

実施例１０　：　ＧＬＳ　ＩＢＤＶ株のＶＦ６およびＶＰ４遺伝子断片の配列決定ｃＤＮＡクローンＧＬＳ−３およびＧＬＳ−４のヌクレオチド配列を、５ｅｑｕｅｎａｓ６　”システムキット（Ｕ、Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）を使って、ＳＦ３とＴ７プロモーターブライ７−（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてジデオキシチェーンターミネ・−ジョン法の変法（参考文献は実施例９を参照のこと）により決定した。

ＩＢＤＶの大ゲノムセグメントのＶＦ６およびＶＰ４領域に相当する特定の′１セットのオリゴヌクレオチドを合成し、配列決定反応においてプライマーとして使用した。その例は次のものである（５′から３′末端）。

（１）　ＴＴＣＡＡＡＧＡＣＡＴＡＡＴＣＣＧＧ（２）　ＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＡＧＡＡＴＣＣＣ（３）　ＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＡ＜４）　ＧＴＡＴＧＧＡＡＧＧＴＴＧＡＧＧＴＡ（５）　ＧＧＧＡＴＴＣＴＴＧＣＴＴＣＡＣＣＣ（６）　ＡＣＧＴＴＣＡＴＣＡＡＡＣＧＴＴＴＣＣＣ（７）　ＴＴＧＣＡＡＡＣＧＣＡＣＣＡＣＡＡＧＣＡ（８１ＣＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＧＡＴ（９）　ＧＴＧＴＣＧＧＧＡＧＡＣＴＣＣＣＡ幾つかの断片についての配列を得、その情報をオーバーラツプしているセグメントから得られた情報に従ってまとめた。

Ｅ／ＤＥＬウィルス断片について得られたＩ）ＮＡ配列を表６に示し、そしてＧＬＳ断片について得られたＤＮＡ配列を表７に示す。

実施例１１：コンピュータープログラムを使ったＤＮＡ配列の比較ゲルリーダーの助けをかりてヌクレオチド配列データを１８Ｍコンピューターに入力し、そして’Ｍｉｃｒｏｇｅｎｉｅ”ソフトウェアプログラム（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使って解析した。このプログラムは、次のようなＩＢＤＶ株の特徴の情報を提供する。

（１）共通真核生物開始部位配列（Ｋｏｚａｋ、Ｍ、、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｒｅｖ。

４７、１−４９　（１９８３）　）内の主要開始部位からの転写解読枠の存在。

（２）完全な推定アミノ酸配列。

（３）得られた配列と発表されたＩＢＤＶオーストラリア株（Ｈｕｄｓｏｎ、　Ｐ、　Ｊ、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１４．　５００１−５０１２　（１９８６））およびドイツＣｕ−１ＩＢＤＶ株１：５ｐｉｅｓら（１９８９）　、前掲〕の配列データとの比較および相同性整列。

酸配列次の表６は、１４７１ヌクレオチドを含むＥ／ＤＥＬ−２クローンについて得られたＤＮＡ配列を示す。表６は前記ＤＮＡ配列から推定される対応するアミノ酸配列も示す。

表６・Ｅ／ＤＥＬ−２クローンのＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列Ｐｒｏ　Ｐｒｏ＾１ａ＾ｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｌｍ　Ｒ４ｓ　Ａｌｍ　Ｉ１ｇ実施例１３　：　ＧＬＳ−１，ＧＬＳ−２，ＧＬＳ−３およびＧＬＳ−４クローンのＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列次の表７は、上記で得られたＧＬＳ−１，ＧＬＳ−２，ＧＬＳ−３およびＧＬＳ −４クローンのＤＮＡ配列およびコンピュータープログラムを使って該ＤＮＡ配列から得られた推定アミノ酸配列を提供する。

配列および推定アミノ酸配列Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　［ＩＬｓ　Ｅｎｄ　丁ｒｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｉｌ＠　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　ＩＩｓ　Ａｉ香@Ａｌｍ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　人１ｎＳＩＸ　５４２１１ｅ　ｋｓｎ　Ａｌｉ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｈ＠　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｔ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　丁ｈ「＾ｓｐ　Ｖａｌ　rｅｒ　Ｔｙｒ　＾ｓｎ　ＧｌｙＬｅｕＭｅｔＳｅｒＡｌａＴｈｒ＾１ｍＡｊｎｌｉｅ＾３ｎ＾５ｐＬｙｓＩｌａＧｌｙ＾ｓｎＶ＆ＩＬｅｕＶａｌＧｌｙＧｌｕＧｌｙＧｌｕＶａｌ＾１ａＬｙｓＶａ１丁ｙｒＧｌｕＩｌａＡｇＩＩＩｉｒｓＧｌｙＡｒｇＧｌｙＰｒｏ＾ａｎＧｌｎＧｌｕＧｉｎＭｅｔＬｙｓＡｓｐ　Ｌｓｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｏｒ＾ｌａ　Ｍｓｔ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ＾ｒｇ　Ａ撃＝@Ｐｒｏ　Ｐｒａ　ＬｙｓＰｒｏＬｙｓＰｒｏＡｒｇＰｒｏ人ｓｎ＾１ａＰｒｏＴｈｒＧｉｎ＾ｒｇＰｒｏＰｒｏＧ１ｙ人ｒ３ＬａｕＧ１ｙ＾ｒｇＴｒｐＩｌｅ＾ＰＣＴｈｒ　Ｖａｎ　Ｓｅｒ　ＡＱ　Ｇ１．ｕ　ＡＪｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｅｎｄ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　^ｕｐ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ｋｇ＾１ａＧ１．ｙＶａｌＡｓｐ丁ｈｒＡｓｎ５＠ｒ＾１ａＬａｕＧｉｎＦｉｔｓＰｒｏＬｙｓＬｅｕ人５ｐＰｒ。

ＧＬＳ−１クローンのＤＮＡ配列はヌクレオチド１で始まり、ヌクレオチド３４８で終わり、従って３４８塩基対の長さである。

ＧＬＳ〜２クローンの配列はヌクレオチド２８３で始まり、ヌクレオチド１２５２で終わり、従って９７０塩基対の長さである。ＧＬＳ−４クローンの配列はヌクレオチド９９９で始まり、ヌクレオチド２６２０て終わり、従って１６２２塩基対の長さである。ＧＬＳ−３クローンの配列はヌクレオチドエフ２２で始まり、ヌクレオチド３２３゜て終わり、従って１５０９塩基対の長さである。

実施例１４　：　［ＢＤＶのウィルス中和エピトープの位置決定［ＢＤＶに対して生産された３種のモノクローナル抗体（ＭＣＡ）のパネルを用いて、中和抗体の誘導の原因となる抗原決定基を位置決定した。２種のＭＣＡ　Ｂ６９と５７はそれぞれ従来型Ｄ７８とＧＬＳ　ＩＢＤＶ株に対して特異的に生起され、それらの両方とも親のＩＢＤＶ株のみを中和する。第二のＭＣＡ　ｌ？６３はＤ７８　ＩＢＤＶ株に対して生起され、これは該ウィルスのＧＬＳ変異体を除いて全ての血清型ＩのｒＢＤＶを中和する。それらの中和抗体は全て、放射線免疫沈澱アッセイにおいてＩＢＤＶのＶＦ６　（４１ｋＤａ）構造タンパク質に結合する（未発表のデータ）。

従って、ＭＣＡはＶＰ２タンパク質上に位置するエピトープの領域を認識する。

幾つかの部位は結合に重要であることがわかっており、従ってエピトープに関連すると思われる。それらの例は、特に、ＶＰ２タンパク質のアミノ酸７４．８４．２１３゜２２２、２４９．２５３．２５４．２５８．２６４．２６９．２７０．２７２．２７９．２８０゜２８４、２８６．２９７．２９９．３０５．３１８．３２１．３２３．３２６．３２８．３３０゜３３２および４３３に対応する部位である。それらのアミノ酸部位に関する情報を下の表１２に示す。

それらの部位は独立にまたはグループになって、特異的ＭＣＡの結合を招くかまたはそれに関連する。それらのアミノ酸をコードする部位における相補的ＤＮＡ配列（またはウィルスＲＮＡ）の変異は、既知のウィルス株に対して生起させた特異的ワクチンの失敗を導く遺伝的浮動の基礎を提供するかもしれない。

相同性並びに特異的アミノ酸変異上記のコンピューター法によりＧＬＳ−５クローンとＥ／ＤＥＬクローンのＤＮＡ配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を調へ、そしてそれらの比較を行った。下の表９は、ウィルスのＵＳ変異体についてＤＮＡレベルとアミノ酸レベルで認められた相同性を示す。

よびタンパク質配列の比較相同性％ヌクレオチドレベルでの相同性　９８．１％推定アミノ酸の相同性　９８．０％表９および１０は、ＧＬＳ−５およびＥ／ＤＥＬクローンのＶＰ２配列間に認められるアミノ酸の変異を示す。

列の比較アミノ酸の相違ＧＬＳ−５Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　５ｅｒＢ／ＤＥＬ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　ｒｌｅ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ互ＩＩ　：　ＩＢＤＶ　ＶＰ２変異体についてのアミノ酸度化ｖＰ２中のアミノ酸残基番号８４２１３２２２２４９２５３２５４２６９２７０２８０２８４％６３１８３２１３部３２６羽０４４３ＧＬＳ−５Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＡＩａ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　ｋ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　rｅｒ　５ｅｒＥ／ＤＥＬ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｌａ　ｒｌｅ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｓ■秩@Ｓｅｒ　Ａｓｎおよびアミノ酸の相同性オーストラリア株（００２−７８３）とＧＬＳ−５ウイルスＤＮＡセグメントとの間およびオーストラリア株とＥ／ＤＥＬセグメントとの間に認められるＶＰ２　ＤＮＡの相同性を下の表１２に示す。オーストラリア株とＵ、Ｓ、　ＧＬＳ− ５変異体との間およびオーストラリア株とＥ／ＤＥＬ変異体との間に認められるアミノ酸相同性も示す。

表１２　：　ＩＢＤＶのオーストラリア単離物とアメリカ単離物とのｖＰ２遺伝子配列およびタンパク質配列の比較ヌクレオチドレベルでの相同性％Ｅ／ＤＥＬ　９２．１％推推定アミノ酸列の相同性％ＧＬＳ−５９６，２％Ｅ／ＤＥＬ　９５．６％リア株およびドイツＣｕ−１ＩＢＤＶ株間のＶＰ２タンパク質についてのアミノ酸残基の変化Ｕ、　Ｓ、変異体ＧＬＳ−５およびＥ／ＤＥＬ並びにオーストラリア株およびドイツＣｕ−Ｉ　ＩＢＤＶ株間の推定アミノ酸配列の比較は、ＶＰ２タンパク質のアミノ酸占有特定位置における種々の相違を示した。ＩＢＤＶの２つのＵ、　Ｓ、変異体ＧＬＳ−５およびＥ／ＤＥＬ　、オーストラリア株およびドイツＣｕ− ［株についてのＶＰ２タンパク質の特定領域におけるアミノ酸残基の変化を下の表１３に示す。

イルスのＶＰ−２におけるアミノ酸変化ＶＰ２のアミノ酸残基番号ウィルス　５　７４　８４　２１３　２２２　２３９　２４９　２５３　２５４　２５８　２６４　２６９　２７０　２７２　２７９オーストラリ了　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ@ＧｌｙＧＬＳ−５Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　［１ｅ　Ａｓ■ Ｅ／ＤＥＬ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　［］ｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ａ唐■ ドイツＣｕ−Ｉ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ@ＡｓｎＶＰ２のアミノ酸残基番号変異ウィルス　２８０　２８４　２８６　２９７　２９９　３０５　３１８　３２１　３２３　３２６　３２８　３３０　３３２　４３３オーストラリ了　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖａｔ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　ＡｓｎＧＬＳ−５Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　５ｅｒＥ／ＤＥＬ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　ｌｉｅ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＡｓｎドイツＣｕ−ｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　［１ｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ実施例１８二合成ペプチドの調製３つのＩＢＤＶ株、即ちＧＬＳ−５，Ｅ／ＤｅｌａｗａｒｅおよびドイツＣｕ− ［株について構造タンパク質ＶＰ２をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を比較する。ヌクレオチド配列から推定されたアミノ酸変化に基づいて、自動ペプチド合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）上て製造業者の指示に従って特定のペプチドを合成する。逆相（Ｃ１８）高性能液体クロマトグラフィーにより０．１％トリフルオロ酢酸中でのアセトニトリル勾配を使ってペプチドを精製し、そしてＡｍ１ｎｏ　Ｑｕａｎｔ分析装置（Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ）においてアミノ酸含量について分析する。

合成ペプチドを完全に水溶性であれば０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓｌｏ、２５ＭＮａＣ１，、ｐＨ７，５緩衝液中に溶解し、そうでなければ８Ｍ尿素、１％２−メルカプトエタノール１０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，３緩衝液中に溶解し、そして使用するまで一７０°Ｃで保存する。

実施例１９コ競合抗原結合アッセイ記載された通りに（Ｍｕｌ　Ｉｅｒ、　ＨｌおよびＢｅｃｈｔ、Ｈ，、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ。

４４、３８４−３９２　（１９８２））　、ＩＢＩ）Ｖタンパク質の放射能標識を行う。

単層のＣＥＦ細胞を１０　ｐｆｕ／ｍ胞の感染多重度でＩＢＤＶに感染させ、３７℃でインキュベートする。１時間後、細胞を２回洗浄し、メチオニンを含まないイーグル最少必須培地ＣＭＥＭ＞と共に１時間インキュベートする。感染の２時間後、上記培地を除去し、■００μＣｉの２５３−メチオニンを含むＭＩＥＭと交換する。

２５Ｓ−メチオニンでＩ２時間短期標識した後、標識されたウィルス粒子を培地から沈降させ、そして上述のシヨ糖勾配遠心分離により更に精製する。

アッセイ抗原として精製３５３−標識ウィルス粒子抗原を使用すること以外は、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎらにより記載された通りに（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｂ、Ｈ，ら、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、１．　４８９−５００　（１９８４））競合結合アッセイを行う。

簡単に言えば、阻害剤の非存在下で添加ウィルスの７０〜８０％を結合するＭＣＡを標識ウィルスに対して予め滴定する。アッセイを実施する直前に一連の希釈液に合成ペプチドを添加する。ロジット一対数変換直線回帰解析（Ｔｒａｕｔｍａｎ、　Ｒ，およびＨａｒｒｉｓ、Ｗ、Ｆ、、　５ｃａｎｄ、　Ｊ、Ｉｍｒｎｕｎｏｌ、　６．８３１−８４１　（１９７７）　）により、最大結合の５０％阻害（Ｉｇ。用量）のところで滴定の終点を決定する。　ｌｏｇｌｏ添加した阻害剤のモル量に対する阻害率として結果をプロットする。

実施例２０　：　ＩＢＤＶ　ＭＣＡ結合のための予想される幾つかのエピトープ種々のＩＢＤＶ株に対する多数の中和ＭＣＡを使って種々のＩＢＤＶ抗原変異体との反応性を試験した。下の表１４は、ＡＣ−ＥＬＩＳＡシステムにおける［ＢＤＶの種々の抗原変異体とのＭＣＡの反応性パターンを示す。（５ｙｎｄｅｒ、　Ｄ、　Ｂ、ら、Ｐｒｏｃ、　２３ｒｄ　Ｎａｔ、　ＭｅｅｔｉｎｇＰｏｕｌｔｒｙ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｃｏｎｄｅｍｎ、、　０ｃｅａｎ　Ｃ１ｔｙ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　（１９８８））。

表１４　：　ＡＣ−ＥＬＩＳＡシステムにおいて中和ＭＣＡと反応するＩＢＤＶの抗原変異体［ＢＤＶ変異体　Ｒ６９Ｒ６３ＢＫ４４　１７９　８　４２　５７“古典型”　＋十＋十＋＋− 入手可能なヌクレオチド配列および対応する推定アミノ酸配列に基づいて、それらのＭＣＡとの結合に関与するであろうアミノ酸の領域の推定を行うことができる。言い換えれば、それらのアミノ酸はＩＢＤＶの中和エピトープの一部分であることができ、そしてそれらをコードする塩基対は該タンパク質の外側結合領域を最少にする特別の配列（立体配座エピトープ）の一部分であることができる。

ＢＫ４４．　ＢＫ１７９およびＢＫ８　ＭＣＡは全てのＩＢＤＶと反応するので、それらは全てのウィルスにおいてほとんど同じであるアミノ酸領域を認識するに違いない。従って、それらのＭＣＡの結合領域は予想することができない。

しかしながら、放射線免疫沈澱アッセイに基づいて、それらの全ＭＣＡがＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質に結合することは知られている。よってそれらのＭＣＡは、直線状連続エピトープまたは立体配座エピトープのいずれかを認識し得る。

ＶＰ２アミノ酸残基への上記４種のＭＣＡの結合は、下の表１５に示されるように、入手可能なヌクレオチド配列に基づいて予想することができる。

ＭＣＡ　Ｒ６９残基番号　３１４３１５３１６３１７３１８３１９３２０３２１３２２３２３３２４Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　ＧｉｎＣＡ　４２残基番号　２７９２８０２８１２８２２８３２８４２８５２８６２８７２８８２８９Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　ＬｅｕＭＣＡ　Ｒ６３残基番号　２６４２６５２６６２６７２６８２６９２７０２７１２７２２７３２７４１ｉｅ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　ＡｒｇＣＡ　５７残基番号　３１５３１９３２０３２１３２２３２３３２４３２５３２６３２７３２８Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　５ｅｒ従って、それらの配列は全ての型のＩＢＤＶに存在し、そしてそれらをコードするＤＮＡセグメントを鳥類の予防接種に使用することができる。

本発明を十分に記載してきたが、本明細書中に記載されるような本発明の精神または範囲から逸脱することなく多数の変更および改良を行い得ることは当業者に明らかであろう。

要　約　書ＩＢＤＶタンパク質に関連する特異的ＤＮＡ配列並びにベクター、宿主およびワクチン生物学的に純粋なポリペプチドは３０〜１０１２アミノ酸のアミノ酸配列を含んで成りそして少なくとも１つのＵＳ変異体のＩＢＤＶ　ＶＰ２タンパク質の抗体結合特性を有する。生物学的に純粋なＲＮＡおよびＤＮＡセグメントは前記生物学的に純粋なポリペプチドの少なくとも１コピーをコードする配列を含んで成る。組換えベクターは、少なくとも１つのＵＳ変異体のＩＢＤＶ　ＶＰ２タンパク質並びに所望によりＶＦ６およびＶＰ４タンパク質の抗体結合特性を有する１〜２０のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントの少なくとも１コピーを含んで成る。

宿主は前記組換えベクターにより形質転換される。ＩＢＤから家禽を保護する方法は、［ＢＤＶに対する免疫応答を増強するのに有効な量の前記ＤＮＡまたは組換えベクターを家禽に投与することを含んで成る。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｅ／ＤＥＬおよびＧＬＳ株から成る群から選択された少なくとも１つのＵＳ変異体から誘導されたＩＢＤＶＶＰ２タンパク質の抗体結合特性を有するポリペプチドの少なくとも１コピーをコードするＲＮＡ配列を含んで成る、生物学的に純粋なＲＮＡセグメント。
２．コードされるポリペプチドがＶＰ２タンパク質のアミノ酸２００〜３３０の抗体結合特性を含んで成る、請求項１のＲＮＡセグメント。
３．約３．２Ｋ塩基対を含んで成る、請求項１のＲＮＡセグメント。
４．前記ＲＮＡ配列が表６および７のアミノ酸配列、５，７４，８４，２１３，２２２，２３９，２４９，２５３，２５４，２５８，２６４，２６９，２７０，２７２，２７９，２８０，２８４，２８６，２９７，２９９，３０５，３１８，３２１，３２３，３２６，３２８，３３０，３３２および４３３からなる群から選択された少なくとも１つの位置において異なるアミノ酸を有するそれの類似体、それの機能性断片、それの機能性前駆体並びにそれらの組合せから成る群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド断片をコードする、請求項１のＲＮＡセグメント。
５．ＧＬＳおよびＥ／ＤＥＬＩＢＤＶのＶＰ２，ＶＰ３およびＶＰ４タンパク質をコードするＲＮＡ配列を含んで成る、請求項４のＲＮＡ配列。
６．請求項１のＲＮＡセグメントに対応する一本鎖ＤＮＡ配列を含んで成る、生物学的に純粋なＤＮＡセグメンド。
７．二本鎖形の請求項６のＤＮＡセグメンド。
８．前記ＤＮＡ配列が表６，７または８のＤＮＡ配列を含んで成る、請求項６のＤＮＡセグメント。
９．組換えベクターであって、ベクターに結合した構造ＤＮＡ配列を宿主中で増殖および発現することができるベクター；および読み枠において該ベクターに結合した請求項７のＤＮＡセグメントの少なくとも１つのコピー、を含んで成る組換えベクター。
１０．前記ベクターが組換え鶏痘ウイルスまたはシテメンチヨウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）を含んで成る、請求項９の組換えベクター。
１１．「古典型」ＵＳＩＢＤＶ変異体、またはオーストラリア、ドイツもしくはヨーロッパＩＢＤＶ株に対する保護を提供する少なくとも１つのポリペプチドをコードする追加のＤＮＡ配列を更に含んで成り、前記追加のＤＮＡ配列が読み枠において該ベクターに持合している、請求項９の組換えベクター。
１２．広域スペクトルＩＢＤＶ家禽ワクチンであって、家禽保護量の請求項９の組換えベクター；および生理学的に許容される担体、を含んで成る広域スペクトルＩＢＤＶ家禽ワクチン。
１３．担体１ｍｌあたり約１０４〜１０７ｐｆｕ単位の組換えベクターを含んで成る、請求項１２の広域スペクトルワクチン。
１４．広域スペクトルＩＢＤＶ家禽ワクチンであって、家禽保護量の生物学的に純粋な請求項７のＤＮＡセグメント；および生理学的に許容される担体、を含んで成る広域スペクトルＩＢＤＶ家禽ワクチン。
１５．担体ｌｍあたり約１０４〜１０７ｐｆｕ単位の組換えベクターを含んで成る、請求項１４の広域スペクトルＩＢＤＶ家禽ワクチン。
１６．請求項９の組換えベクターを有する宿主。
１７．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）；昆虫細胞系Ｓｆ−９；ニワトリ胚織維芽（ＣＥＦ）細胞；ニワトリ胚腎臓（ＣＥＫ）細胞；およびＶｅｒｏ細胞から成る群から選択される、請求項１６の宿主。
１８．請求項１のＲＮＡセグメントによりコードされるアミノ酸配列の少なくとも１コピーを含んで成る、生物学的に純粋なポリペプチド。
１９．前記アミノ酸配列が、表６，７および８のアミノ酸配列、５，７４，８４，２１３，２２２，２３９，２４９，２５３，２５４，２５８，２６４，２６９，２７０，２７２，２７９，２８０，２８４，２８６，２９７，２９９，３０５，３１８，３２１，３２３，３２６，３２８，３３０，３３２および４３３からなる群から選択された少なくとも１つの位置において異なるアミノ酸を有するそれの類似体、それの機能性断片、それの機能性前駆体並びにそれの組合せから成る群から選択された配列を含んで成る、請求項１８のポリペプチド。
２０．家禽およびそれの子孫をＩＢＤから保護する方法であっって、所望の効果を獲得するのに有効な量の請求項９の組換えベクターを家禽に投与することを含んで成る方法。
２１．前記組換えベクターが眼内に、注入により、鼻内にまたは経口的に対象物に投与される、請求項２０の方法。
２２．前記組換えベクターが約１０２〜１０８ｐｆｕの量で対象物に投与される、請求項２３の方法。
２３．家禽およびそれの子孫をＩＢＤから保護する方法であっって、所望の効果を獲得するのに有効な量の請求項７の生物学的に純粋なＤＮＡセグメントを家禽に投与することを含んで成る方法。
２４．前記ＤＮＡが眼内に、注入により、経鼻的にまたは経口的に対象物に投与される、請求項２３の方法。
２５．前記ＤＮＡが約１０２〜１０６ｐｆｕの量で対象物に投与される、請求項２３の方法。