KR20170032441A - 코로나바이러스 - Google Patents

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사라 키프
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Abstract

본 발명은 비-구조 단백질(들) (nsp)-10, nsp-14, nsp-15 또는 nsp-16 중 하나 이상의 것에 돌연변이를 포함하는 다단백질을 코딩하는 변이체 레플리카제 유전자를 포함하는 생, 약독화된 코로나바이러스를 제공한다. 코로나바이러스는 대상체에서 질환, 예컨대, 감염성 기관지염을 치료 및/또는 예방하기 위한 백신으로서 사용될 수 있다.

Description

코로나바이러스 {CORONAVIRUS}
본 발명은, 바이러스가 감소된 병원성을 가지도록 하는 변이체 레플리카제 유전자를 포함하는 약독화된 코로나바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 백신에서의 상기 코로나바이러스의 용도에 관한 것이다.
감염성 기관지염 (IB)의 병인체인, 조류 감염성 기관지염 바이러스 (IBV)는 주로 기도에서 복제되지만, 소화관, 신장 및 난관의 상피 세포에서도 복제가 되는, 가금류의 고도로 감염성이며 전염성인 병원체이다. IBV는 니도비랄레스(Nidovirales) 목, 코로나비리다에(Coronaviridae) 과, 코로나비리나에(Coronavirinae) 아과, 및 감마코로나바이러스(Gammacoronavirus) 속의 구성원이고; 유전적으로 매우 유사한 코로나바이러스는 칠면조, 호로새, 및 꿩에서 질환을 유발한다.
IB의 임상적 징후로는 재채기, 기관 수포음, 비루 및 쌕쌕거림을 포함한다. 육용형 조류는 체중 증가가 감소되는 반면, 산란 조류는 달걀을 더 적게 낳고, 품질이 불량한 달걀을 생산한다. 기도 감염은 닭이 2차 박테리아 감염에 걸리게 만드는데, 이는 병아리에서는 치명적일 수 있다. 바이러스는 또한 특히 병아리에서 난관에 영구적인 손상을 유발함으로써, 달걀 생산 및 품질을 저하시킬 수 있고; 신장에 상기와 같은 손상을 유발함으로써, 종종, 치명적일 수 있는 신장 질환을 일으킬 수 있다.
IBV는 양계업에 임의의 다른 감염성 질환보다 더 큰 경제적 손실을 일으키는 원인이 된다고 보고되었다. 비록 IBV 통제에서 생, 약독화된 백신 및 불활성화된 백신이 보편적으로 사용되고 있지만, 백신접종을 사용함으로써 획득하게 되는 보호는 백신 파괴로 인해, 또는 사용된 백신과 관련이 없는 새로운 IBV 혈청형의 도입으로 인해 상실될 수 있으며, 이는 양계업에 위험을 야기한다.
추가로, 양계업에서는 백신접종 프로그램의 효율성 및 비용 효과를 개선시키기 위해 난내(in ovo) 사용하는 데 적합한 백신을 개발하는 것이 요구되고 있다. 난내 백신접종과 관련된 주된 도전과제는 바이러스가 배아에는 병원성을 띠지 않으면서, 바이러스에 대한, 모체로부터 유래된 항체의 존재하에서 복제가 가능하여야 한다는 것이다. 현 IBV 백신은 발육란에서의 다회에 걸친 계대접종 이후에 유래된 것이며, 그 결과로 닭에 대해 병원성이 감소된 바이러스를 얻을 수 있고, 이로써, 이 백신은 생, 약독화된 백신으로서 사용될 수 있다. 그러나, 상기 바이러스는 거의 항상 배아에 대해 증가된 병독성을 보이고, 따라서 이 바이러스는 부화력을 감소시키기 때문에 난내 백신접종을 위해서는 사용될 수 없다. 일부 경우에서는 부화력이 70% 감소되는 것이 관찰된다.
발육란에서의 다회에 걸친 계대접종 이후의 약독화는 또한 다른 단점을 가지고 있다. 바이러스의 약독화는 무작위적이고, 매번 바이러스 계대접종시마다 달라질 것이기 때문에, 약독화 목적으로 다른 시리즈의 난을 거쳐 같은 바이러스를 계대접종하게 되면, 약독화를 일으키는 다른 돌연변이 세트의 유도가 이루어지게 되는 실험적 방법이다. 상기 프로세스와 연관된 효능상에도 문제가 존재하는데: 일부 돌연변이는 바이러스의 복제에 영향을 줄 것이고, 돌연변이 중 일부는 바이러스를 너무 크게 약독화시킬 수 있다. 돌연변이는 또한 S 유전자에 존재할 수 있고, 이 또한 면역원성에 영향을 줄 수 있으며, 이로써, 원하는 면역 반응이 영향을 받게 되고, 잠재적인 백신은 원하는 혈청형에 대해 보호하지 못할 수 있다. 추가로, 백신의 병독성 복귀 및 안정성과 관련된 문제도 존재한다.
IBV 통제를 위해서 신규하고, 더욱 안전한 백신 개발이 중요하다. 따라서, 상기 문제들과 관련이 없는 IBV 백신, 특히, 난내 백신접종을 위해 사용될 수 있는 백신이 요구되고 있다.
본 발명자들은 IBV를 합리적으로 약독화시키기 위해 역유전학 접근법을 사용하여 왔다. 이 접근법은 발육란에서의 다회에 걸친 계대접종 이후의 무작위 약독화보다 훨씬 더 통제가 될 수 있는데, 그 이유는 각 돌연변이 위치가 알려져 있고, 그가 바이러스에 미치는 효과, 즉, 약독화 이유를 도출해 낼 수 있기 때문이다.
그의 역유전학 접근법을 사용하여, 본 발명자들은 바이러스가 감소된 병원성 수준을 가지도록 유발하는 다양한 돌연변이를 확인하게 되었다. 바이러스가 발육란에 투여되는 경우 배아에는 병원성을 띠지 않으면서 복제가 가능하도록, 병원성 수준을 감소시킬 수 있다. 상기 바이러스는 난내 백신접종에 접종할 수 있으며, 이는 발육란에서의 다회에 걸친 계대접종 이후에 제조되는 약독화된 IBV 백신보다 상당히 유리하고, 개선점을 가진다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 비-구조 단백질(들) (nsp)-10, nsp-14, nsp-15 또는 nsp-16 중 하나 이상에 돌연변이를 포함하는 다단백질을 코딩하는 변이체 레플리카제 유전자를 포함하는 생, 약독화된 코로나바이러스를 제공한다.
변이체 레플리카제 유전자는 하기 목록:
서열식별번호(SEQ ID NO): 6의 85번 위치에서의 Pro → Leu,
서열식별번호: 7의 393번 위치에서의 Val → Leu;
서열식별번호: 8의 183번 위치에서의 Leu → Ile;
서열식별번호: 9의 209번 위치에서의 Val → Ile로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
레플리카제 유전자는 서열식별번호: 6의 85번 위치에 아미노산 돌연변이 Pro → Leu를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
레플리카제 유전자는 서열식별번호: 7의 393번 위치에 아미노산 돌연변이 Val → Leu; 서열식별번호: 8의 183번 위치에 Leu → Ile; 및 서열식별번호: 9의 209번 위치에 Val → Ile를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
레플리카제 유전자는 서열식별번호: 6의 85번 위치에 아미노산 돌연변이 Pro → Leu; 서열식별번호: 7의 393번 위치에 Val → Leu; 서열식별번호: 8의 183번 위치에 아미노산 돌연변이 Leu → Ile; 및 서열식별번호: 9의 209번 위치에 Val → Ile를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
레플리카제 유전자는 하기 목록:
서열식별번호: 1에 제시된 서열과 비교하여,
뉴클레오티드 위치 12137번 위치에서의 C → T,
뉴클레오티드 위치 18114번 위치에서의 G → C,
뉴클레오티드 위치 19047번 위치에서의 T → A, 및
뉴클레오티드 위치 20139번 위치에서의 G → A로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함할 수 있다.
코로나바이러스는 감염성 기관지염 바이러스 (IBV)일 수 있다.
코로나바이러스는 IBV M41일 수 있다.
코로나바이러스는, 적어도 일부가 M41 이외의 다른 IBV 혈청형으로부터의 것인 S 단백질을 포함할 수 있다.
예를 들어, S1 서브유니트 또는 전체 S 단백질은 M41 이외의 다른 IBV 혈청형으로부터의 것일 수 있다.
본 발명의 제1 측면에 따른 코로나바이러스는 상응하는 야생형 레플리카제를 발현하는 코로나바이러스와 비교하여 감소된 병원성을 가지며, 이로써 바이러스가 발육란에 투여되는 경우 배아에는 병원성을 띠지 않으면서, 복제가 가능하다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면과 관련하여 정의되는 변이체 레플리카제 유전자를 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제2 측면에 따른 변이체 코로나바이러스 레플리카제 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 제공한다.
제4 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제2 측면에 따른 레플리카제 유전자를 포함하는 플라스미드를 제공한다.
제5 측면에서, 본 발명은 하기 단계:
(i) 본 발명의 제4 측면에 따른 플라스미드로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계;
(ii) 레플리카제 유전자를 갖는 코로나바이러스 주의 게놈을 포함하는 재조합 바이러스로 숙주 세포를 감염시키는 단계;
(iii) 플라스미드 중의 레플리카제 유전자 서열과 재조합 바이러스 게놈 중의 상응하는 서열 사이에 상동 재조합이 이루어질 수 있도록 허용하여 변형된 레플리카제 유전자를 제조하는 단계; 및
(iv) 변형된 레플리카제 유전자를 포함하는 재조합 바이러스에 대해 선별하는 단계를 포함하는, 본 발명의 제1 측면에 따른 코로나바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.
재조합 바이러스는 백시니아 바이러스일 수 있다.
본 방법은 또한
(v) 단계 (iv)로부터의 재조합 바이러스로부터의 DNA로부터, 변형된 레플리카제 유전자를 포함하는 재조합 코로나바이러스를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
제6 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 코로나바이러스를 생산할 수 있는 세포를 제공한다.
제7 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 코로나바이러스 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 백신을 제공한다.
제8 측면에서, 본 발명은 대상체에게 본 발명의 제7 측면에 따른 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 측면은
· 대상체에서 질환을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 제7 측면에 따른 백신,
· 대상체에서 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 백신의 제조에서 본 발명의 제1 측면에 따른 코로나바이러스의 용도를 제공한다.
질환은 감염성 기관지염 (IB)일 수 있다.
백신 투여 방법은 점안 투여, 비내 투여, 음용수 투여, 부화 후 주사 및 난내 주사로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
백신접종은 난내 백신에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 제6 측면에 따른 세포를 본 발명의 제1 측면에 따른 코로나바이러스로 감염시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 제7 측면에 따른 백신을 제조하는 방법을 제공한다.
도 1 - CK 세포 상에서의 M41-CK (M41 EP4) 대비 M41-R-6 및 M41-R-12의 성장 동역학.
도 2 - M41-CK (M41 EP4) 및 Beau-R 대비 M41-R-6 및 M41-R-12와 연관된 임상적 징후, 스니킹 및 쌕쌕거림 (막대는 각 시점의 좌측에서부터 우측 방향으로 모의, Beau-R, M41-R 6, M41-R 12, M41-CK EP4를 나타낸다).
도 3 - 감염된 병아리로부터 채취된 기관으로부터 단리된 기관 연골윤에서의 바이러스의 섬모 운동. 100% 섬모 운동은 바이러스에 의해 영향을 받지 않았음; 비병원성을 나타내고, 0% 운동은 섬모 운동의 완전한 손실인, 완전한 섬모정체를 나타내며, 이는 바이러스가 병원성이라는 것을 시사한다 (막대는 각 시점의 좌측에서부터 우측 방향으로 모의, Beau-R, M41-R 6, M41-R 12, M41-CK EP4를 나타낸다).
도 4 - M41-R-12 및 M41-CK (M41 EP5) 대비 M41R-nsp10rep 및 M41R-nsp14,15,16rep와 연관된 임상적 징후, 스니킹 (막대는 각 시점의 좌측에서부터 우측 방향으로 모의, M41-R12; M41R-nsp10rep; M41R-nsp14,15,16rep 및 M41-CK EP5를 나타낸다).
도 5 - 감염된 병아리로부터 채취된 기관으로부터 단리된 기관 연골윤에서의 M41-R-12 및 M41-CK 대비 M41R-nsp10rep 및 M41R-nsp14,15,16rep의 섬모 운동 (막대는 각 시점의 좌측에서부터 우측 방향으로 모의; M41-R12; M41R-nsp10rep; M41R-nsp14,15,16rep 및 M41-CK EP5를 나타낸다).
도 6 - M41-CK 대비 M41R-nsp10, 15rep, M41R-nsp10, 14, 15rep, M41R-nsp10, 14, 16rep, M41R-nsp10, 15, 16rep 및 M41-K와 연관된 임상적 징후, 스니킹 (막대는 각 시점의 좌측에서부터 우측 방향으로 모의, M41R-nsp10,15rep1; M41R-nsp10,14,16rep4; M41R-nsp10,15,16rep8; M41R-nsp10,14,15rep10; M41-K6 및 M41-CK EP4를 나타낸다).
도 7 - M41-CK 대비 M41R-nsp10, 15rep, M41R-nsp10, 14, 15rep, M41R-nsp10, 14, 16rep, M41R-nsp10, 15, 16rep 및 M41-K와 연관된 임상적 징후, 쌕쌕거림 (막대는 각 시점의 좌측에서부터 우측 방향으로 모의, M41R-nsp10,15rep1; M41R-nsp10,14,16rep4; M41R-nsp10,15,16rep8; M41R-nsp10,14,15rep10; M41-K6 및 M41-CK EP4를 나타낸다).
도 8 - 감염된 병아리로부터 채취된 기관으로부터 단리된 기관 연골윤에서의M41-CK 대비 M41R-nsp10, 15rep, M41R-nsp10, 14, 15rep, M41R-nsp10, 14, 16rep, M41R-nsp10, 15, 16rep 및 M41-K의 섬모 운동 (막대는 각 시점의 좌측에서부터 우측 방향으로 모의, M41R-nsp10,15rep1; M41R-nsp10,14,16rep4; M41R-nsp10,15,16rep8; M41R-nsp10,14,15rep10; M41-K6 및 M41-CK EP4를 나타낸다).
도 9 - CK 세포 상에서의 M41-CK 대비 rIBV의 성장 동역학. 도 9A는 M41-R 및 M41-K에 대한 결과를 보여주는 것이다. 도 9B는 M41-nsp10 rep; M41R-nsp14, 15, 16 rep; M41R-nsp10, 15 rep; M41R-nsp10, 15, 16 rep; M41R-nsp10, 14, 15 rep; 및 M41R-nsp10, 14, 16에 대한 결과를 보여주는 것이다.
도 10 - 돌연변이화된 nsp10, nsp14, nsp15 및 nsp16 서열에서의 아미노산 돌연변이의 위치.
도 11 - M41-CK 대비 rIBV M41R-nsp 10,14 rep 및 rIBV M41R-nsp 10,16 rep의 A) 스니킹; B) 호흡기 증상 (조합된 쌕쌕거림 및 수포음) 및 C) 섬모 운동 (막대는 각 시점의 좌측에서부터 우측 방향으로 모의, M41R-nsp10,14rep; M41R-nsp10,16rep 및 M41-K를 나타낸다).
본 발명은 코로나바이러스에서 발현되는 경우, 바이러스가, 야생형 레플리카제 유전자를 포함하는 상응하는 코로나바이러스와 비교하여 감소된 병원성을 가지도록 유발하는 변이체 레플리카제 유전자를 포함하는 코로나바이러스를 제공한다.
코로나바이러스
감마코로나바이러스는 코로나비리다에 과에 속하는 동물 바이러스 속이다. 코로나바이러스는 (+) 센스 단일 가닥 RNA 게놈 및 나선 대칭을 가지는 외피보유 바이러스이다.
코로나바이러스의 게놈 크기는 대략 27 내지 32 킬로베이스 범위이고, 임의의 공지된 RNA 바이러스에 대하여 가장 큰 크기이다.
코로나바이러스는 주로 포유동물 및 조류의 상기도 또는 위장관을 감염시킨다. 현재 공지된 것 중 5 내지 6개의 상이한 코로나바이러스 주가 인간을 감염시킨다. 중증 급성 호흡 증후군 (SARS)을 유발하는 것인, 가장 많이 널리 알려져 있는 인간 코로나바이러스인 SARS-CoV는 상기도 및 하기도 감염, 둘 모두를 유발하고, 위장염 또한 유발할 수 있기 때문에, 독특한 발병기전을 가진다. 중동 호흡 증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV) 또한 인간에서 하기도 감염을 유발한다. 코로나바이러스는 성인 인간에서 모든 형태의 감기를 상당한 백분율로 유발하는 것으로 간주된다.
코로나바이러스는 또한 가축 동물 및 길들인 애완동물에서 다양한 질환을 유발하며, 그 중 일부는 중증일 수 있고, 농업에 대해 위협이 된다. 경제적으로 중요한, 가축 동물의 코로나바이러스로는, 주로 닭에서 호흡기 질환을 유발하고, 전세계적으로 양계업에 심각한 영향을 미치는 감염성 기관지염 바이러스 (IBV); 둘 모두 어린 동물에서 설사를 일으키는 돼지 코로나바이러스 (전염성 위장염, TGE) 및 소 코로나바이러스를 포함한다. 고양이 코로나바이러스는 2가지 형태를 가지며, 고양이 장 코로나바이러스는 임상적 중요성이 작은 병원체이지만, 상기 바이러스의 자연 돌연변이는 높은 사망률과 연관된 질환인 고양이 감염성 복막염 (FIP)을 일으킬 수 있다.
개 코로나바이러스 (CCoV)에는 2가지 유형이 있는데, 그 하나는 경미한 위장관 질환을 유발하는 것이며, 하나는 호흡기 질환을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 마우스 간염 바이러스 (MHV)는 특히, 실험실용 마우스의 콜로니 중에서 높은 사망률로 유행성 뮤린 질병을 유발하는 코로나바이러스이다.
코로나바이러스는 하기 제시된 바와 같이, 4개 군으로 분류된다:
알파
· 개 코로나바이러스 (CCoV)
· 고양이 코로나바이러스 (FeCoV)
· 인간 코로나바이러스 229E (HCoV-229E)
· 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)
· 전염성 위장염 바이러스 (TGEV)
· 인간 코로나바이러스 NL63 (NL 또는 뉴 헤이븐(New Haven)).
베타
· 소 코로나바이러스 (BCoV)
· 개 호흡기 코로나바이러스 (CRCoV) - 동남아시아 및 미크로네시아에서 일반적
· 인간 코로나바이러스 OC43 (HCoV-OC43)
· 마우스 간염 바이러스 (MHV)
· 돼지 혈구응집성 뇌척수염 바이러스 (HEV)
· 래트 코로나바이러스 (RCV). 래트 코로나바이러스는 그가 2008년 3월/4월 현재 토종 및 야생 설치류 콜로니 사이에서 발견이 된 지역인 호주 동부에 매우 널리 퍼져 있다.
· (아직까지는 일반명이 없는) (HCoV-HKU1)
중증 급성 호흡 증후군 코로나바이러스 (SARS-CoV)
· 중동 호흡 증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV).
감마
· 감염성 기관지염 바이러스 (IBV)
· 칠면조 코로나바이러스 (블루콤병((Bluecomb disease) 바이러스)
· 꿩 코로나바이러스
· 호로새 코로나바이러스.
델타
· 불불(Bulbul) 코로나바이러스 (BuCoV)
· 개똥지빠귀 코로나바이러스 (ThCoV)
· 부리새 코로나바이러스 (MuCoV)
· 돼지 코로나바이러스 (PorCov) HKU15.
본 발명의 코로나바이러스의 변이체 레플리카제 유전자는 알파코로나바이러스, 예컨대, TGEV; 베타코로나바이러스, 예컨대, MHV; 또는 감마코로나바이러스, 예컨대, IBV로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "~로부터 유래된"이라는 것은 레플리카제 유전자가 관련 코로나바이러스의 야생형 레플리카제 유전자와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 변이체 레플리카제 유전자는 야생형 레플리카제 서열과 최대 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 동일성을 가질 수 있다. 변이체 코로나바이러스 레플리카제 유전자는 비-구조 단백질의 야생형 서열과 비교하였을 때, 비-구조 단백질 (nsp)-10, nsp-14, nsp-15 또는 nsp-16 중 하나 이상의 것에 돌연변이를 포함하는 단백질을 코딩한다.
IBV
조류 감염성 기관지염 (IB)은 상당한 경제적 손실을 일으키는, 닭의, 고도로 전염성인 급성 호흡기 질환이다. 본 질환은 가쁜 호흡, 기침, 재채기, 기관 수포음, 및 비루를 비롯한 호흡기 징후를 특징으로 한다. 영계에서, 중증 호흡 곤란이 발생할 수 있다. 산란계에서의 호흡 곤란, 신염, 달걀 생산 감소, 및 달걀 내부 품질 및 달걀 껍질의 품질 손실이 일반적이다.
브로일러에서는 기침 및 그르렁 그르렁거리는 소리를 내는 것은 일반적인 임상적 징후이며, 구역내의 모든 조류로 빠르게 확산된다. 백신접종을 받지 않은 계군(flock)에서의 이환율은 100%이다. 사망률은 연령, 바이러스 주, 및 2차 감염에 따라 달라지지만, 백신접종을 받지 않은 계군에서의 사망률은 최대 60%까지에 달할 수 있다.
최초로 확인된 IBV 혈청형은 매사추세츠형(Massachusetts)이었지만, 미국에서는 현재 처음에 확인된 매사추세츠 유형 이외에도, 알칸사스형(Arkansas) 및 델라웨어형(Delaware)을 비롯한, 수개의 혈청형이 순환하고 있다.
IBV 주 보우데트형(Beaudette)은 병아리 배아에서의 적어도 150회의 계대접종 이후에 유래되었다. IBV 보우데트형은 부화된 닭에서는 더 이상 병원성을 띠지 않지만, 배아를 빠르게 사망시킨다.
H120은 발육계란에서 대략 120회의 계대접종에 의해 약독화된, 시판용 생, 약독화된 IBV 매사추세츠 혈청형 백신 주이다. H52는 또 다른 매사추세츠 백신으로서, H120 개발 동안 더 이전 단계에 있고, 약간 더 큰 병원성을 띠는 계대접종물 바이러스 (계대접종물 52대)를 나타낸다. H120 기반 백신이 통상 사용된다.
IB QX는 IBV의 병독성이 있는 야생형 단리물이다. 이는 원래 1990년대 중반 중국 칭다오 지역에서 질환의 발병 이후에 단리되었기 때문에, 종종 "차이니즈형(Chinese) QX"로서 알려져 있다. 그 때 이후로 상기 바이러스는 유럽 쪽으로 천천히 퍼지기 시작하였다. 2004년부터 서유럽 일부에서, 대개는 네덜란드에서 매우 유사한 바이러스와 관련하여 심각한 달걀 생산 문제가 확인되었고, 그 지역 뿐만 아니라, 독일, 프랑스, 벨기에, 덴마크 및 영국으로부터도 그러한 문제가 보고되었다.
더치형(Dutch) 사례로부터 단리된 바이러스는 데벤테르 소재의 네덜란드 연구소(Dutch Research Institute)에 의해 신규한 바이러스 주로서 확인되었고, 이는 D388로 명명되었다. 차이니즈형 관련물은 상기 바이러스가 차이니즈형 QX 바이러스와 99% 유사하였다고 밝힌 추가 시험으로부터 얻게 되었다. 생, 약독화된 QX-유사 IBV 백신 주가 현재 개발되고 있다.
IBV는 세포 세포질에서 복제되고, 비-분절형, 단일 가닥, (+) 센스 RNA 게놈을 함유하는 외피보유 바이러스이다. IBV는 27.6 kb RNA 게놈을 가지며, 모든 코로나바이러스와 같이, 4개의 구조 단백질; 스파이크 당단백질 (S), 소형 막 단백질 (E), 내재 막 단백질 (M) 및 뉴클레오캡시드 단백질 (N) (게놈 RNA와 상호작용)을 함유한다.
게놈은 하기: 5'UTR - 폴리머라제 (레플리카제) 유전자 - 구조 단백질 유전자 (S-E-M-N) - UTR 3' (여기서, UTR은 비번역 영역이다) (IBV에서 각각 ~500개의 뉴클레오티드)인 방식으로 조직화된다.
지질 외피는 3개의 막 단백질: S, M 및 E를 함유한다. IBV S 단백질은 소포체에서 올리고머화되는 I형 당단백질이고, 막횡단 도메인을 통해 비리온 막에 삽입된 동종삼량체 내로 어셈블리되고, 비공유 상호작용을 통하여 M 단백질과 회합된다. 코로나바이러스 입자로의 도입 후, S 단백질은 표적 세포 수용체에의 결합 및 바이러스 막과 세포 막의 융합을 담당한다. S 당단백질은 4개의 도메인: 합성 동안 절단되는 신호 서열; 비리온 입자 바깥쪽에 존재하는 엑토도메인; S 단백질을 비리온 입자의 지질 이중층으로 고정시키는 역할을 담당하는 막횡단 영역; 및 세포질 테일로 이루어진다.
모든 코로나바이러스는 또한 시험관내에서 복제를 위해서는 필요하지 않지만, 발병기전에서 중요한 역할을 할 수 있는, 기능이 공지되지 않은 보조 단백질 유전자 세트를 코딩한다. IBV는 2개의 보조 유전자인 유전자 3 및 5를 코딩하는데, 이 둘 모두 각각 2개의 보조 단백질 3a, 3b 및 5a, 5b를 발현한다.
본 발명의 코로나바이러스의 변이체 레플리카제 유전자는 IBV로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, IBV는 IBV 보우데트형, H120, H52, IB QX, D388 또는 M41일 수 있다.
IBV는 IBV M41일 수 있다. M41은 1941년 미국에서 단리된 원형의 매사추세츠 혈청형이다. 이는 세계 전 지역에 걸쳐 많은 실험실에서 병원성 실험실용 주로서 사용되는 단리물이며, 이는 ATCC (VR-21TM)로부터 입수할 수 있다. 약독화된 변이체는 또한 필드에서 문제를 일으키는 매사추세츠 혈청형에 대한 IBV 백신으로서 여러 백신 생산자에 의해 사용된다. 본 발명자들은 수년 동안에 걸쳐 상기 바이러스에 관해 연구해 왔기 때문에, 그리고, 완전한 바이러스 게놈의 서열이 이용가능하기 때문에, 상기 바이러스 주를 사용하기로 선택하였다. 본 발명자에 의해 사용된, M41 단리물인 M41-CK를 1차 병아리 신장 (CK) 세포에서 성장하도록 적합화시켰고, 이로써, 이는 완전한 게놈의 cDNA로부터 감염성 바이러스로서 쉽게 회수될 수 있는 것으로 간주되었다. 이는 대표적인 병원성 IBV이며, 그러므로 병원성의 손실 또는 감소를 유발하는 돌연변이에 대하여 분석될 수 있다.
IBV M41-CK의 게놈 서열은 서열식별번호: 1로서 제공된다.
서열식별번호: 1 IBV M41-CK 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
레플리카제
구조 유전자 및 보조 유전자 이외에도, 코로나바이러스 게놈 중 ⅔는 (게놈의 5' 단부에) 레플리카제 유전자를 포함하는데, 이는 2개의 다단백질, pp1a 및 pp1ab로서 발현되며, 여기서, pp1ab는 -1 리보솜 이동 기전의 결과로서 수득되는 pp1a의 확장 생성물이다. 상기 두 다단백질은 2가지 유형의 바이러스 코딩된 프로테이나제에 의해 절단되고, 이로써, 보통은 16개의 비-구조 단백질 (Nsp1-16)에 의해 생성되며; IBV에는 Nsp1이 결실되어 있고, 이로써, Nsp2-16을 코딩한다.
따라서, IBV 중의 진(Gene) 1은 15개의 (다른 코로나바이러스에서는 16개) 비-구조 단백질 (nsp2-16)을 코딩하며, 이는 RNA 복제 및 전사와 연관이 있다.
본원에서 사용되는 바, '레플리카제 단백질'이라는 용어는 pp1a 및 pp1ab 다단백질 또는 개별 nsp 서브유니트를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, '레플리카제 유전자'라는 용어는 레플리카제 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다.
코로나바이러스 nsp 단백질의 기능에 관한 요약은 하기 표 1에 제시되어 있다.
<표 1>
Figure pct00010
본 발명의 코로나바이러스에 의해 코딩되는 변이체 레플리카제 유전자는 nsp-10, nsp-14, nsp-15 또는 nsp-16을 코딩하는 서열 섹션 중 하나 이상에 돌연변이를 포함한다.
nsp10은 RNA-결합 활성을 가지며, pp1a/pp1ab 영역으로부터의 다른 nsp 내의 동종 및/또는 이종형 상호작용에 관여하는 것으로 보인다. 5개의 α-나선, 1개의 310-나선 및 3개의 β-가닥으로 구성된 α/β 폴드를 채용한다. 보존적 시스테인 잔기 및 1개의 히스티딘 잔기에 의해 형성된 2개의 아연-결합 부위가 확인되었다 (Cys-74/Cys-77/His-83/Cys-90; Cys-117/Cys-120/Cys-128/Cys-130). 단백질은 어떤 뚜렷한 특이성 없이 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA 및 DNA에 결합하는 것으로 확인되었다. nsp-10은 nsp-9와 가교될 수 있고, 이는 nsp-7, -8, -9 및 -10을 포함하는 단백질-단백질 상호작용의 복합적 네트워크가 존재한다는 것을 시사한다. 추가로, nsp-10은 nsp-14 및 nsp-16과 상호작용하는 것으로 공지되어 있다.
nsp-14는 아미노-말단 영역에 3'-→-5' 엑소리보뉴클레아제 (ExoN) 활성 도메인을 포함한다. SARS-CoV ExoN은, 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA, 둘 모두에 대해 작용하나 DNA에는 작용하지 않는 금속 이온 의존성 3'-→-5' 엑소리보뉴클레아제 활성을 가지는 것으로 입증되었다. nsp-14는 교정 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 이 nsp는 또한 카르복실-말단 영역에 N7-메틸트랜스퍼라제 (MT) 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다.
nsp-15 관련 NendoU (U에 특이적인, 니도바이러스 엔도리보뉴클레아제) RNase 활성이 ARS-CoV, MHV 및 IBV를 비롯한, 다수의 코로나바이러스에 대해 보고되었다. 상기 활성은 일관되게 Mn2 + 이온에 의해 현저히 증가되는 것으로 보고되었고, Mg2 + 및 Ca2 +의 존재하에서는 거의 활성이 없었다. NendoU는 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA, 둘 모두에서 우리딜레이트 잔기의 3' 측에서 절단한다. 코로나바이러스 NendoU의 생물학적으로 관련된 기질(들)은 아직 미확인 상태이다.
nsp-16은 리보스-2'-O-메틸트랜스퍼라제 (2'-O-MTase) 활성을 매개하는 것으로 예측되었고, 역유전학적 실험을 통해 2'-O-MTase 도메인은 HCoV-229E 및 SARS-CoV에서 바이러스 RNA 합성에 필수적인 것으로 밝혀졌다. 이 효소는 코로나바이러스 RNA의 캡 1 구조 생산에 관여할 수 있고, 이는 또한 다른 RNA 프로세싱 경로에서 NendoU 및 ExoN과 협력할 수 있다. 2'-O-MTase는 또한 NendoU-매개 절단으로부터 특이 RNA를 보호하기 위해 그 특이 RNA를 메틸화시킬 수도 있다.
nsp-10, -14, -15 및 -16에 대한 게놈 및 단백질 서열은 각각 서열식별번호: 2-5 및 6-9로서 제공된다.
서열식별번호: 2 ( nsp -10 뉴클레오티드 서열 - 서열식별번호:1의 뉴클레오티드 11884-12318)
Figure pct00011
서열식별번호: 3 ( nsp -14 뉴클레오티드 서열 - 서열식별번호:1의 뉴클레오티드 16938-18500)
Figure pct00012
서열식별번호: 4 ( nsp -15 뉴클레오티드 서열 - 서열식별번호:1의 뉴클레오티드 18501-19514)
Figure pct00013
서열식별번호: 5 ( nsp -16 뉴클레오티드 서열 - 서열식별번호:1의 뉴클레오티드 19515-20423)
Figure pct00014
서열식별번호: 6 ( nsp -10 아미노산 서열)
Figure pct00015
서열식별번호: 7 ( nsp -14 아미노산 서열)
Figure pct00016
서열식별번호: 8 ( nsp -15 아미노산 서열)
Figure pct00017
서열식별번호: 9 ( nsp -16 아미노산 서열)
Figure pct00018
감소된 병원성
본 발명의 생, 약독화된 코로나바이러스는 바이러스가 상응하는 야생형 유전자를 발현하는 코로나바이러스와 비교하여 감소된 병원성을 가지도록 유발하는 변이체 레플리카제 유전자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "약독화된"이라는 용어는 바이러스가 상기 감소된 병원성을 보이고, 비-병독성인 것으로 분류될 수 있다는 것을 의미한다. 생, 약독화된 바이러스는 여전히 면역 반응을 자극시킬 수 있고, 면역을 일으킬 수는 있지만, 실제로 질병은 유발하지는 않는 복제가 약화된 바이러스이다.
본원에서 사용되는 바, "병원성"이라는 용어는 그의 일반적인 의미에 따라 바이러스가 대상체에서 질환을 유발할 수 있는 잠재능이 있음을 의미한다. 전형적으로, 코로나바이러스의 병원성은 질환 관련 증상, 예를 들어, 재채기, 스니킹(snicking) 및 기관 섬모 운동 감소를 검정함으로써 측정된다.
"감소된 병원성"이라는 용어는 코로나바이러스의 병원성 수준이 상응하는, 야생형 코로나바이러스와 비교하여 감소, 완화 또는 약해진 것을 기술하는 것으로 사용된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 코로나바이러스는 그의 유래 기점이 된 모체 M41-CK 바이러스 또는 대조군 코로나바이러스와 비교하여 감소된 병원성을 갖는다. 대조군 코로나바이러스는 병원성이 공지되어 있는 코로나바이러스, 예를 들어, 야생형 레플리카제 단백질을 발현하는 발현하는 코로나바이러스일 수 있다.
코로나바이러스의 병원성은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 전형적으로, 병원성은 바이러스로 시험감염된 대상체, 예를 들어, 닭에서 임상 증상을 검정함으로써 평가된다.
한 예로서, 닭 연령이 8-24일째일 때, 비강 또는 안구 접종에 의해 시험감염시켰다. IBV 감염과 관련된 임상 증상을 감염 후 3-10일째에 평가할 수 있다. 코로나바이러스, 예를 들어, IBV의 병원성을 측정하는 데 일반적으로 평가되는 임상 증상으로는 가쁜호흡, 기침, 재채기, 스니킹, 우울감, 러플형 깃털 및 기관 섬모 운동 손실을 포함한다.
본 발명의 변이체 레플리카제는 코로나바이러스에서 발현되었을 때, 야생형 레플리카제를 발현하는 코로나바이러스와 비교하여 감소된 수준의 임상 증상을 유발할 수 있다.
예를 들어, 변이체 레플리카제를 발현하는 코로나바이러스는 야생형 레플리카제를 발현하는 바이러스에 의해 유발되는 스니킹 횟수의 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만 또는 10% 미만인, 조류 1마리당 분당 스니킹 횟수를 유발할 수 있다.
본 발명에 따른 변이체 레플리카제를 발현하는 코로나바이러스는 야생형 레플리카제를 발현하는 바이러스로 감염된 계군 중의 조류 마리수의 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만 또는 10% 미만인 조류에서 쌕쌕거림을 유발할 수 있다.
본 발명에 따른 변이체 레플리카제를 발현하는 코로나바이러스는 감염되지 않은 조류에서의 기관 섬모 운동 수준의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%인 수준으로 기관 섬모 운동을 일으킬 수 있다.
본 발명에 따른 변이체 레플리카제를 발현하는 코로나바이러스는 하기 표 2에 정의된 바와 같은 임상 증상을 야생형 레플리카제를 발현하는 코로나바이러스보다 더 낮은 수준으로 유발할 수 있다.
<표 2>
임상적 징후에 기반한 IBV 중증도 한계:
Figure pct00019
본 발명의 변이체 레플리카제는 코로나바이러스에서 발현되는 경우, 바이러스를 난내에서 비-병원성 수준으로 복제시킬 수 있다.
난내에서 닭 배아로 투여하고자 하는 백신을 개발함과 동시에, 모체 항체가 백신에 미치는 효과, 및 상기 백신이 배아에 미치는 효과라는 2가지 쟁점에 주목하여야 한다. 모체 항체는 능동 면역화를 방해하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 온화한 주 (strain)를 이용하는 백신은 모체 항체와 함께 브로일러 닭에게 투여되었을 때에는 보호 항체 수준을 유도하지 않는데, 그 이유는 상기 주가 모체 항체에 의해 중화되기 때문이다.
따라서, 바이러스 입자는, 그가 확실하게 바이러스에 대한 모체로부터 유래된 항체에 의해 중화되지 않도록 복제 및 증식되는 데 있어서 충분한 효율성을 가져야 한다. 모체로부터 유래된 항체는 유효 항체로 이루어진 한정 풀이며, 이는 닭이 노화됨에 따라 감소되며, 이러한 방식으로 이루어지는 바이러스의 중화는 배아/병아리를 위한 장기간의 면역화 확립과 동일하지 않다. 바이러스에 대한 장기간의 면역을 발생시키기 위해서는, 배아 및 부화된 닭은 모체로부터 유래된 항체의 효과에 특유한, 적절한 보호 면역 반응을 발생시켜야 한다.
난내 백신접종에 있어 유용하게는, 바이러스는 또한 바이러스가 배아에 대하여 병원성을 띠게 유발하는 수준으로 복제 및 증식되지 않아야 한다.
배아와 관련하여 감소된 병원성이란, 상응하는, 야생형 대조군 코로나바이러스와 비교하였을 때, 코로나바이러스가 부화력 감소를 더 적게 유발한다는 것을 의미할 수 있다. 따라서, 본 발명와 관련하여 "배아에는 병원성을 띠지 않으면서"라는 용어는 대조군 코로나바이러스와 비교하였을 때, "부화력 감소를 유발하지 않으면서"라는 것을 의미할 수 있다.
적합한 변이체 레플리카제는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 모체로부터 유래된 항체를 사용하여 또는 그를 사용하지 않고, 배아를 난내 백신접종한 후, 비교 시험감염 실험을 수행할 수 있다 (즉, 산란계를 IBV에 대하여 백신접종하거나, 또는 백신접종하지 않고 실험을 수행할 수 있다).
변이체 레플리카제가, 바이러스가 매우 높은 수준으로 증식할 수 있도록 한다면, 배아는 부화되지 못하거나, 또는 부화 이후에 생존하지 못하게 될 것이다 (즉, 바이러스는 배아에 대하여 병원성을 띤다). 배아에 대하여 병원성을 띠는 바이러스는 배아를 사망시킬 수 있다.
변이체 레플리카제가 바이러스 복제 및 증식을 너무 크게 감소시킨다면, 바이러스는 모체로부터 유래된 항체에 의해 중화될 것이다. 그러므로, 바이러스에 대한 효과적인 면역 발생이 실패하게 되는 바, 이에, IBV에 의해 추후 이루어지는 병아리의 시험감염은 시험감염된 병아리에서 임상 증상 (예를 들어, 쌕쌕거림, 스니킹, 섬모 운동 손실)을 발생시키고, 질환을 발병시킬 것이다.
변이체
본원에서 사용되는 바, '변이체'라는 용어는 '돌연변이체'와 동의어이고, 이는 상응하는 야생형 서열과 비교하였을 때, 상이한 핵산 또는 아미노산 서열을 의미한다.
변이체/돌연변이체 서열은 천연적으로 발생할 수 있거나, 또는 인공적으로 (예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발법에 의해) 생성될 수 있다. 돌연변이체는 야생형 서열의 상응하는 부분과 적어도 70, 80, 90, 95, 98 또는 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 돌연변이체는 야생형 서열의 상응하는 부분에 대하여 20, 10, 5, 4, 3, 2 또는 1개 미만의 돌연변이(들)를 가질 수 있다.
"야생형"이라는 용어는 각각 천연 유전자 또는 단백질 (즉, 바이러스 유전자 또는 단백질)과 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 가지는 유전자 또는 단백질을 의미하는 것으로 사용된다.
동일성 비교는 육안으로, 또는 더욱 일반적으로는 쉽게 이용가능한 서열 비교 프로그램의 도움을 받아 수행될 수 있다. 이러한 상업적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 사이의 동일성(%)을 계산할 수 있다. 상기 정렬을 실행하는 데 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG 위스콘신 베스트핏(GCG Wisconsin Bestfit) 패키지 (미국 위스콘신 대학 (University of Wisconsin); 문헌 [Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387])이다. 서열 비교를 실행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예로는 BLAST 패키지 (문헌 [Ausubel et al., 1999 ibid - Chapter 18] 참조), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) 및 GENEWORKS 비교 도구 묶음, 클러스터X(ClustalX) (문헌 [Larkin et al. (2007) Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23:2947-2948] 참조)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. BLAST 및 FASTA, 둘 모두 오프라인 및 온라인 검색에 이용가능하다 (문헌 [Ausubel et al., 1999 ibid, pages 7-58 to 7-60] 참조). 그러나, 일부 어플리케이션의 경우에는 GCG 베스트핏 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 시퀀시스(BLAST 2 Sequences)로 불리는 새로운 도구 또한 단백질 및 뉴클레오티드 서열 비교를 위해 이용가능하다 (문헌 [FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50]; [FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8] 및 tatiana@ncbi.nlm.nih.gov 참조).
서열은 침묵 변이를 일으키고, 기능상 등가인 분자를 생성하는 아미노산 잔기의 하나 이상의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 의도된 아미노산 치환은, 활성이 유지되는 한, 잔기의 극성, 전하, 가용성, 소수성, 친수성, 및/또는 양쪽성 성질의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양으로 하전된 아미노산으로는 리신 및 아르기닌을 포함하고; 친수성 값이 유사한 비하전된 극성 헤드 기를 가지는 아미노산으로는 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌, 및 티로신을 포함한다.
보존적 치환은 예를 들어, 하기 표에 따라 이루어질 수 있다. 제2열의 같은 블록내에 있는 아미노산, 및 바람직하게는, 제3열의 같은 줄에 있는 아미노산이 서로 치환될 수 있다.
Figure pct00020
본 발명의 코로나바이러스는 서열식별번호: 6, 7, 8 또는 9 중 어느 하나와 비교하여 돌연변이를 포함하는 단백질을 코딩하고, 코로나바이러스에서 발현되었을 때, 바이러스가, 상응하는 야생형 레플리카제를 발현하는 코로나바이러스와 비교하여 감소된 병원성을 가지도록 유발하는 변이체 레플리카제 유전자를 포함할 수 있다.
변이체 레플리카제 유전자는 nsp-10, nsp-14, nsp-15 및 nsp-16의 임의의 조합에 적어도 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
본 발명의 코로나바이러스의 변이체 레플리카제 유전자는 도 10에 제시된 M41 mod 서열에 정의된 바와 같은 돌연변이를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
본 발명의 코로나바이러스의 변이체 레플리카제 유전자는 하기 목록:
서열식별번호: 6의 85번 위치에서의 Pro → Leu,
서열식별번호: 7의 393번 위치에서의 Val → Leu;
서열식별번호: 8의 183번 위치에서의 Leu → Ile;
서열식별번호: 9의 209번 위치에서의 Val → Ile로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
본 발명의 코로나바이러스의 변이체 레플리카제 유전자는 nsp-2, nsp-3, nsp-6 또는 nsp-13에 돌연변이를 포함하지 않는 단백질을 코딩할 수 있다.
본 발명의 코로나바이러스의 변이체 레플리카제 유전자는 암메이야판(Ammayappan) 등 (Arch Virol (2009) 154:495-499)에 의해 보고된 유전자 중 뉴클레오티드 위치 12,008번 위치에서의 돌연변이에 의해 유발된 트레오닌에서 이소류신으로의 돌연변이에 상응하는 돌연변이를 nsp10에 포함하지 않는 단백질을 코딩할 수 있다.
(상기) 암메이야판 등은 IBV 주 알칸사스형 DPI의 약독화를 담당하는 서열 변이 확인을 보고하였다. 본 연구를 통해서 발육란에서의 다회에 걸친, 대략 100회의 바이러스 계대접종 이후에, 다양한 IBV 단백질에서 17개의 아미노산 변이를 확인하게 되었다. 약독화된 바이러스 (Ark DPI 101)가, 배아에는 병원성을 띠지 않으면서, 바이러스에 대한 모체로부터 유래된 항체의 존재하에 난내에서 복제할 수 있는지 여부를 조사되지 않았다. 상기 바이러스가 고전적 IBV 백신에 대한 것과 유사한 방법인, SPF 발육란에서의 다회에 걸친 계대접종에 의해 생산되었다고 가정하였을 때, 상기 바이러스는 배아에 대하여 병원성을 띨 수 있는 가능성이 있다. 암탉이 유사 혈청형으로 백신접종을 받았다면, 바이러스는 또한 모체로부터 유래된 항체에 대하여 감수성을 띨 수도 있다.
본 발명의 코로나바이러스의 변이체 레플리카제 유전자는 상기 목록에 제공된 하나 이상의 아미노산 돌연변이의 임의의 조합을 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변이체 레플리카제 유전자는 서열식별번호: 6의 85번 위치에 아미노산 돌연변이 Pro → Leu를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변이체 레플리카제 유전자는 서열식별번호: 7의 393번 위치에 아미노산 돌연변이 Val → Leu를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변이체 레플리카제 유전자는 서열식별번호: 8의 183번 위치에 아미노산 돌연변이 Leu → Ile를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변이체 레플리카제 유전자는 서열식별번호: 9의 209번 위치에 아미노산 돌연변이 Val → Ile를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변이체 레플리카제 유전자는 서열식별번호: 6의 85번 위치에 아미노산 돌연변이 Pro → Leu, 및 서열식별번호: 7의 393번 위치에 아미노산 돌연변이 Val → Leu를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변이체 레플리카제 유전자는 서열식별번호: 6의 85번 위치에 아미노산 돌연변이 Pro → Leu, 및 서열식별번호: 8의 183번 위치에 아미노산 돌연변이 Leu → Ile를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변이체 레플리카제 유전자는 서열식별번호: 6의 85번 위치에 아미노산 돌연변이 Pro → Leu, 및 서열식별번호: 9의 209번 위치에 아미노산 돌연변이 Val → Ile를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변이체 레플리카제 유전자는 서열식별번호: 7의 393번 위치에 아미노산 돌연변이 Val → Leu, 및 서열식별번호: 8의 183번 위치에 아미노산 돌연변이 Leu → Ile를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변이체 레플리카제 유전자는 서열식별번호: 7의 393번 위치에 아미노산 돌연변이 Val → Leu, 및 서열식별번호: 9의 209번 위치에 아미노산 돌연변이 Val → Ile를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변이체 레플리카제 유전자는 서열식별번호: 8의 183번 위치에 아미노산 돌연변이 Leu → Ile, 및 서열식별번호: 9의 209번 위치에 아미노산 돌연변이 Val → Ile를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변이체 레플리카제 유전자는 서열식별번호: 6의 85번 위치에 아미노산 돌연변이 Pro → Leu, 서열식별번호: 7의 393번 위치에 아미노산 돌연변이 Val → Leu, 및 서열식별번호: 8의 183번 위치에 아미노산 돌연변이 Leu → Ile를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변이체 레플리카제 유전자는 서열식별번호: 6의 85번 위치에 아미노산 돌연변이 Pro → Leu, 서열식별번호: 8의 183번 위치에 아미노산 돌연변이 Leu → Ile, 및 서열식별번호: 9의 209번 위치에 아미노산 돌연변이 Val → Ile를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변이체 레플리카제 유전자는 서열식별번호: 6의 85번 위치에 아미노산 돌연변이 Pro → Leu, 서열식별번호: 7의 393번 위치에 아미노산 돌연변이 Val → Leu, 및 서열식별번호: 9의 209번 위치에 아미노산 돌연변이 Val → Ile를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변이체 레플리카제 유전자는 서열식별번호: 7의 393번 위치에 아미노산 돌연변이 Val → Leu, 서열식별번호: 8의 183번 위치에 아미노산 돌연변이 Leu → Ile, 및 서열식별번호: 9의 209번 위치에 아미노산 돌연변이 Val → Ile를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변이체 레플리카제 유전자는 서열식별번호: 6의 85번 위치에 아미노산 돌연변이 Pro → Leu, 서열식별번호: 7의 393번 위치에 아미노산 돌연변이 Val → Leu, 서열식별번호: 8의 183번 위치에 아미노산 돌연변이 Leu → Ile, 및 서열식별번호: 9의 209번 위치에 아미노산 돌연변이 Val → Ile를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변이체 레플리카제 유전자는 또한 뉴클레오티드 수준으로 정의될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 코로나바이러스의 변이체 레플리카제 유전자의 뉴클레오티드 서열은 하기 목록: 서열식별번호: 1의 11884-12318, 16938-18500, 18501-19514 및 19515-20423으로부터 선택되는 영역 내에 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 코로나바이러스의 변이체 레플리카제 유전자의 뉴클레오티드 서열은 하기 목록:
서열식별번호: 1에 제시된 서열과 비교하여,
뉴클레오티드 위치 12137번 위치에서의 C → T,
뉴클레오티드 위치 18114번 위치에서의 G → C,
뉴클레오티드 위치 19047번 위치에서의 T → A, 및
뉴클레오티드 위치 20139번 위치에서의 G → A로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "치환"이라는 용어는 돌연변이라는 용어와 동의어이며, 이는 확인된 위치의 뉴클레오티드가 야생형 뉴클레오티드 서열의 것과 상이하다는 것을 의미한다.
뉴클레오티드 서열은 하기 목록:
서열식별번호: 1에 제시된 서열과 비교하여,
뉴클레오티드 위치 12137번 위치에서의 C → T,
뉴클레오티드 위치 18114번 위치에서의 G → C,
뉴클레오티드 위치 19047번 위치에서의 T → A, 및
뉴클레오티드 위치 20139번 위치에서의 G → A로부터 선택되는 뉴클레오티드 치환의 임의 조합을 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 C12137T를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 G18114C를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 T19047A를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 G20139A를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 C12137T 및 G18114C를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 C12137T 및 T19047A를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 C12137T 및 G20139A를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 G18114C 및 T19047A를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 G18114C 및 G20139A를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 T19047A 및 G20139A를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 C12137T, G18114C 및 T19047A를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 C12137T, T19047A 및 G20139A를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 C12137T, G18114C 및 G20139A를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 G18114C, T19047A 및 G20139A를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 C12137T, G18114C, T19047A 및 G20139A를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 (상기) 암메이야판 등에 보고된 C12008T 치환에 상응하는 치환을 포함하지 않을 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 천연, 합성 또는 재조합인 것일 수 있다. 이는 이중 또는 단일 가닥일 수 있고, 이는 DNA 또는 RNA, 또는 그의 조합일 수 있다. 예를 들어, cDNA, PCR 생성물, 게놈 서열 또는 mRNA일 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 선택된 숙주/숙주 세포에서의 생산을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
이는 단리될 수 있거나, 또는 플라스미드, 바이러스 또는 숙주 세포의 일부로서 존재할 수 있다.
플라스미드
플라스미드는 독립적으로 염색체 DNA를 복제할 수 있는, 염색체 DNA와 독립된, 염색체외 DNA 분자이다. 이는 일반적으로 고리형 및 이중 가닥이다.
(종종 알려져 있는 바와 같이) 플라스미드, 또는 벡터는 숙주 세포에서 단백질을 발현시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 단백질을 발현시키기 위해, 상기 단백질을 코딩할 수 있는 플라스미드로 박테리아 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있다. 상기 용어는 또한 더욱 긴 장쇄의 DNA 부위를 수용할 수 있는 효모 인공 염색체 및 박테리아 인공 염색체를 포함한다.
본 발명의 플라스미드는 정의된 레플리카제 단백질 영역을 코딩할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이는 또한 하나 이상의 추가의 코로나바이러스 뉴클레오티드 서열(들) 또는 하나 이상의 다른 코로나바이러스 단백질을 코딩할 수 있는 뉴클레오티드 서열(들), 예컨대, S 유전자 및/또는 유전자 3을 포함할 수 있다.
플라스미드는 또한 저항성 마커, 예컨대, 크산틴 및 히포크산틴의 존재하에서 미코페놀산 (MPA)에 대한 저항성을 부여하고, 백시니아 바이러스 P7.5 조기/후기 프로모터에 의해 제어되는, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 구아닌 크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자 (gpt)를 포함할 수 있다.
재조합 백시니아 바이러스
본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 변이체 레플리카제 유전자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스 (rVV)에 관한 것이다.
재조합 백시니아 바이러스 (rVV)는 역유전학 시스템에 기반하여 백시니아-바이러스를 사용하여 제조될 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명은 또한
(i) 이전 섹션에 기술된 바와 같은 플라스미드로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계;
(ii) 레플리카제 유전자를 갖는 코로나바이러스 주의 게놈을 포함하는 재조합 바이러스로 숙주 세포를 감염시키는 단계;
(iii) 플라스미드 중의 레플리카제 유전자 서열과 재조합 바이러스 게놈 중의 상응하는 서열 사이에 상동 재조합이 이루어질 수 있도록 허용하여 변형된 레플리카제 유전자를 제조하는 단계;
(iv) 변형된 레플리카제 유전자를 포함하는 재조합 바이러스에 대해 선별하는 단계를 포함하는, 바이러스 입자를 제조하는 방법을 제공한다.
'변형된 레플리카제 유전자'라는 용어는 본 발명의 제1 측면와 관련하여 기술된 변이체 레플리카제 유전자를 포함하는 레플리카제 유전자를 의미한다. 구체적으로, 본 용어는 야생형 레플리카제 유전자로부터 유래되었지만, 본원에 정의된 바와 같은 변이체 레플리카제 단백질을 코딩하도록 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 유전자를 의미한다.
재조합은 레플리카제 유전자 모두 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 재조합은 nsp-10, nsp-14, nsp-15 및/또는 nsp-16의 임의 조합을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 재조합은 상기 정의된 바와 같이, 아미노산 돌연변이를 코딩하거나, 또는 뉴클레오티드 치환을 포함하는 것인, 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
코로나바이러스 주의 게놈에는 본 플라스미드가 제공하는 부분에 상응하는 레플리카제 단백질의 부분이 결실되어 있을 수 있으며, 이로써, 변형된 단백질은 본 플라스미드가 제공하는 뉴클레오티드 서열의 삽입을 통해 형성된다.
재조합 바이러스는 그의 게놈과 플라스미드 사이에 상동 재조합이 이루어질 수 있도록 허용하는 데 적합한 것이다. 백시니아 바이러스 게놈에 대하여 서열을 삽입 및 결실시키는 데에는 통상적으로 상동 재조합이 사용되는 바, 백시니아 바이러스가 특히 적합하다.
상기 방법은 임의적으로
(v) 단계 (iv)로부터의 재조합 바이러스로부터의 DNA로부터, 변형된 레플리카제 유전자를 포함하는 재조합 코로나바이러스를 회수하는 단계를 포함한다.
재조합 코로나바이러스, 예컨대, 재조합 IBV를 회수하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (문헌 [Britton et al. (2005) see page 24]; 및 PCT/GB2010/001293 참조).
예를 들어, 단계 (iv)로부터의 재조합 바이러스로부터의 DNA를 플라스미드 내로 삽입할 수 있고, 이를 사용하여 세포질 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 세포를 형질감염시킬 수 있다. 세포를 예를 들어, T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 계두 바이러스로 미리 감염시킬 수 있다. 이어서, 재조합 코로나바이러스를 예를 들어, 성장 배지로부터 단리시킬 수 있다.
플라스미드를 백시니아 바이러스 게놈 내로 삽입할 때, 불안정한 중간체가 형성된다. 예컨대, 플라스미드 상의 저항 마커를 사용하여 플라스미드를 포함하는 재조합물을 선별할 수 있다.
이어서, 양성 재조합물을 예를 들어, PCR 및 서열분석에 의해 변형된 레플리카제 유전자를 함유한다는 것에 관하여 확인할 수 있다.
변형된 레플리카제 유전자를 포함하는 재조합 바이러스의 큰 스톡, 예컨대, 재조합 백시니아 바이러스 (rVV)를 성장시킬 수 있고, 단계 (v)를 수행하기 위해 DNA를 추출할 수 있다.
적합한 역유전학 시스템은 관련 기술분야에 공지되어 있다 ([Casais et al (2001) J. Virol 75:12359-12369]; [Casais et al (2003) J. Virol. 77:9084-9089]; [Britton et al (2005) J. Virological Methods 123:203-211]; [Armesto et al (2008) Methods in Molecular Biology 454:255-273]).
세포
코로나바이러스는 세포를 감염시키는 데 사용될 수 있다.
코로나바이러스 입자를 관련 기술분야에 공지되어 있는 방법에 의해 예를 들어, 상청액으로부터 수거할 수 있고, 임의적으로, 정제할 수 있다.
세포를 사용하여 코로나바이러스 입자를 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 하기 단계:
(i) 세포를 본 발명에 따른 코로나바이러스로 감염시키는 단계;
(ii) 바이러스가 세포에서 복제될 수 있도록 허용하는 단계; 및
(iii) 자손 바이러스를 수거하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 역유전학 시스템을 사용하여 본 발명에 따른 코로나바이러스를 생산할 수 있는 세포를 제공한다. 예를 들어, 세포는 본 발명의 레플리카제 유전자를 코딩할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 바이러스 게놈을 포함할 수 있다.
세포는 레플리카제 유전자를 함유하는 재조합 재조합(recombinant recombining) 바이러스 (예컨대, 백시니아 바이러스)를 제조할 수 있다.
대안적으로, 세포는 역유전학 시스템에 의해 재조합 코로나바이러스를 제조할 수 있다. 재조합 바이러스 입자를 구제하기 위해 세포는 T7 폴리머라제를 발현할 수 있거나, 또는 그를 발현하도록 유도될 수 있다.
백신
코로나바이러스를 사용하여 백신을 제조할 수 있다. 백신은 본 발명의 코로나바이러스의 생, 약독화된 형태일 수 있고, 이는 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 정의된 바와 같이, 본 발명에서의 사용을 위해 적합한 "제약상 허용되는 담체"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 상기 담체로는 제한 없이, 물, 염수, 완충처리된 염수, 포스페이트 완충제, 알콜/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 종래 기술에 따라 통상적으로 사용되는 다른 희석제 및 부형제가 첨가될 수 있다. 상기 담체로는 에탄올, 폴리올, 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 및 주사용 유기 에스테르를 포함할 수 있다. 완충제 및 pH 조절제 또한 사용될 수 있다. 완충제로는 제한 없이, 유기산 또는 염기로부터 제조되는 염을 포함한다. 대표적인 완충제로는 제한 없이, 유기산 염, 예컨대, 시트르산의 염, 예컨대, 시트레이트, 아스코르브산, 글루콘산, 히스티딘-Hel, 카본산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산, 또는 프탈산, 트리스(Tris), 트리메탄민 히드로클로라이드, 또는 포스페이트 완충제를 포함한다. 비경구적 담체로는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스, 트레할로스, 수크로스, 및 염화나트륨, 락테이티드 링거 또는 고정 오일을 포함할 수 있다. 정맥내 담체로는 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제, 예컨대, 링거 덱스트로스에 기반한 것 등을 포함할 수 있다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대, 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제 (예컨대, EDTA), 불활성 기체 등도 또한 제약 담체에 제공될 수 있다. 본 발명은 담체 선택에 의해 제한되지 않는다. 상기 기술된 성분들로부터, 적절한 pH 등장성, 안정성 및 다른 통상의 특징들을 가지는 상기와 같은 제약상 허용되는 조성물을 제조하는 것은 관련 기술분야 범위 내에 있다. 예컨대, 교재, 예컨대, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed, Lippincott Williams & Wilkins, pub!., 2000]; 및 [The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4.sup.th edit., eds. R. C. Rowe et al, APhA Publications, 2003]을 참조할 수 있다.
본 발명의 백신은 "치료학상 유효량"으로 투여되게 되는데, 상기 치료학상 유효량이란, 대상체 또는 환자에게 투여되었을 때, 유익한 또는 원하는 결과를 발휘하는 데 충분한, 활성 성분, 예컨대, 본 발명에 따른 작용제의 양을 지칭한다. 유효량이 1회 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 치료학상 유효량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 본 발명과 관련하여, "치료학상 유효량"은 유익한 또는 원하는 결과를 발휘하는 데 충분할 정도로, 감염성 기관지염 병태와 관련된 하나 이상의 파라미터에 대해 객관적으로 측정되는 변화를 일으키는 것이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 약물, 화합물, 또는 제약 조성물의 유효량은 감염성 기관지염의 이환율을 감소시키는 데 충분한 양이다. 본원에서 사용되는 바, "치료학적"이라는 용어는 질환, 병태, 또는 장애에 대한 전 범위의 처치를 포함한다. 본 발명의 "치료"제는 위험이 있는 것으로 확인될 수 있는 동물을 표적화하도록 디자인된 방법을 포함하는 것 (약물 유전학)을 비롯한, 예방적 또는 예방 방식으로; 또는 사실상 호전적 또는 치유적인 방식으로 작용할 수 있거나; 또는 치료되는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상의 진행 속도 또는 정도를 저속화시키는 작용을 할 수 있다.
본 발명은 또한 세포, 예를 들어, 베로(Vero) 세포를 본 발명의 제1 측면과 관련하여 정의된 레플리카제 단백질을 포함하는 바이러스 입자로 감염시키는 단계를 포함하는, 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.
백신접종 방법
본 발명의 코로나바이러스는 질환을 치료 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다.
"치료"한다는 것은 질환과 연관된 적어도 하나의 증상을 경감, 감소, 또는 호전시키기 위해 및/또는 질환의 진행을 저속화, 감소 또는 차단하기 위해, 현 질환을 앓는 대상체에게 백신을 투여하는 것을 의미한다.
"예방"한다는 것은 질환 (예컨대, 감염)의 원인을 막거나, 손상시키기 위해, 또는 질환과 연관된 적어도 하나의 증상의 발생을 감소시키거나, 또는 막기 위해, 아직 질환을 앓지 않고/거나, 질환의 어떤 증상도 보이지 않는 대상체에게 백신을 투여하는 것을 의미한다.
질환은 코로나바이러스에 의해 유발되는 임의의 질환, 예컨대, 호흡기 질환, 및 및/또는 인간에서의 위장염, 및 다른 동물에서의 간염, 위장염, 뇌염, 또는 호흡기 질환일 수 있다.
질환은 감염성 기관지염 (IB); 돼지 유행성 설사; 전염성 위장염; 마우스 간염 바이러스; 돼지 혈구응집성 뇌척수염; 중증 급성 호흡 증후군 (SARS); 또는 불루콤병 질환일 수 있다.
질환은 감염성 기관지염일 수 있다.
백신은 예를 들어, 점안 또는 비내 투여에 의해 부화된 병아리 또는 닭에게 투여될 수 있다. 비록 이 방법이 정확하기는 하지만, 예컨대, 브로일러 계군이 클 경우, 비용이 많이 들 수 있다. 대안으로는 음용수에 투여하는 분무 접종을 포함하지만, 상기 방법을 사용하여 확실하게 백신이 균일하게 적용될 수 있도록 하는 것은 어려울 수 있다.
백신은 그의 투여에 적합한 형태로, 예컨대, 안구내 사용을 위한 점안제로 제공될 수 있다.
백신은 난내 접종에 의해, 예를 들어, 발육란 주사에 의해 투여될 수 있다. 난내 백신접종은 조기 단계에 질환에 대한 저항성을 제공한다는 장점을 가지고 있다. 이는 또한 음용수를 통한 투여 및 분무 접종과 달리, 대상체마다 균일한 용량으로 쉽게 투여가 이루어질 수 있도록 이를 촉진시킨다.
백신은 요막액, 난황낭, 양막, 폐포 또는 배아를 비롯한, 난의 임의의 적합한 구획에 투여될 수 있다. 난 (폐포) 막 및 장뇨막 아래에 투여될 수 있다.
보통, 백신은 배아 발생 중 후기 단계 동안에, 일반적으로, 인큐베이션 기간 중 마지막 사분기 기간 동안에, 예컨대, 부화되기 3-4일 전에 주사된다. 닭에서, 백신은 21일의 인큐베이션 기간 중 15-19일째 사이에, 예를 들어, 17일째 또는 18일째에 투여될 수 있다.
본 프로스세는 로보트식 주사 프로세스, 예컨대, WO 2004/078203에 기술된 것을 사용하여, 자동화될 수 있다.
백신은 하나 이상의 다른 백신, 예를 들어, 예컨대, 뉴캐슬병 바이러스 (NDV)와 같은, 다른 질환용 백신과 함께 투여될 수 있다. 본 발명은 또한 하나 이상의 다른 백신(들)과 함께 본 발명에 따른 백신을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 별개, 순차적, 또는 동시 투여를 위한, 하나 이상의 다른 백신(들)과 함께 본 발명에 따른 백신을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 백신 또는 백신 조성물을 사용하여 인간, 동물 또는 조류 대상체를 치료할 수 있다. 예를 들어, 대상체는 병아리, 닭 또는 마우스 (예컨대, 실험실용 마우스, 예컨대, 트랜스제닉 마우스)일 수 있다.
전형적으로, 의사 또는 수의사가 개별 대상체 또는 대상체 군에게 가장 적합한 실제 투여량을 결정하게 될 것이며, 이는 특정 대상체(들)의 연령, 체중 및 방법에 따라 달라지게 될 것이다.
조성물은 임의적으로 제약상 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 애주번트를 포함할 수 있다. 제약 담체, 부형제 또는 희석제 선택은 의도되는 투여 경로 및 표준 제약 관행과 관련하여 선택될 수 있다. 제약 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서 (또는 그 이외에도) 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁화제(들), 코팅제(들), 가용화제(들), 및 바이러스의 전달 또는 면역원성에 도움을 주거나, 또는 그를 증가시킬 수 있는 다른 담체 작용제를 포함할 수 있다.
이제, 본 발명은 실시예에 의해 추가로 기술되게 되는데, 이 실시예는 본 발명을 수행할 때 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 도움을 주는 역할을 하는 것으로 여겨지며, 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1 - M41-CK에 기반한 IBV 역유전학 시스템 생성
앞서 PCT/GB2010/001293 (본원에서 참조로 포함된)에 기술된 백시니아 바이러스 역유전학 시스템 중의 보우데트형 cDNA를 M41 컨센서스 서열로부터 유래된 합성 cDNA로 대체함으로써 M41-CK 전장의 cDNA를 제조하였다.
문헌 [Armesto, Cavanagh and Britton (2009). PLoS ONE 4(10): e7384. doi:10.1371/journal.pone.0007384]에 기술되어 있는 것으로서, IBV 보우데트형 주로부터 유래된 레플리카제, 및 IBV M41-CK로부터의 구조 및 보조 유전자 및 3' UTR로 이루어진, 재조합 백시니아 바이러스 (rVV) 내의 IBV cDNA rVV-BeauR-Rep-M41 구조는, 보우데트형 5' UTR-Nsp2-Nsp3 서열을 IBV M41-CK로부터의 상응하는 서열로 대체함으로써 추가로 변형시켰다. 생성된 IBV cDNA는 M41로부터의 5' UTR-Nsp2-Nsp3, 보우데트형으로부터의 Nsp4-Nsp16, 및 M41로부터의 구조 및 보조 유전자 및 3' UTR로 이루어졌다. 이 cDNA는, 보우데트형 Nsp4-Nsp16 서열의 결실에 의해 추가로 변형시켰다. Nsp4-16이 결실되어 있는 생성된 cDNA를 추가의 4 단계로 변형시켰으며, 여기서, 결실된 Nsp는 순차적으로 M41-CK로부터의 상응하는 서열로 대체하였으며, 대체물 cDNA는 M41-CK Nsp4-8, Nsp9-12, Nsp12-14 및 마지막으로 Nsp15-16으로 표시된다. 각 대체물 cDNA는 앞서 삽입된 가장 3' 쪽의 M41 서열에 상응하는 5' 단부에 대략 500개의 뉴클레오티드, 및 M41 S 유전자 서열에 상응하는 3' 단부에 대략 500개의 뉴클레오티드를 함유하였다. 이를 통하여 상동 재조합에 의한 M41 cDNA 서열의 삽입, 및 연속된 M41 레플리카제 유전자 서열의 순차적 부가가 이루어질 수 있었다. 본 발명자에 의해 앞서 기술된 일과성 우성 선택 (TDS) 시스템 (PCT/GB2010/001293 참조)을 사용하여 상동 재조합에 의해 M41-유래 Nsp 서열을 함유하는 합성 cDNA를 부가하였다. 도 10에 제시되어 있는 바와 같이, M41 Nsps-10, -14, -15 및 -16에 상응하는 서열을 함유하는 M41-유래 cDNA는 각각 85번, 393번, 183번 및 209번 위치에 변형된 아미노산을 함유하였다.
M41-CK의 게놈을 나타내는 전장의 cDNA는 합성 서열을 나타내는 백시니아 바이러스에서 생성하였다. M41-R-6 및 M41-R-12인, 2개의 rIBV를 구제하였고, 이는 M41-CK와 유사한 방식으로 성장하는 것으로 나타났다 (도 1).
실시예 2 - 구제된 M41 바이러스의 병원성 측정
실시예 1에서 구제된 바이러스를 사용하여 안구 및 비강 접종에 의해 8일된 무특이 병원체 (SPF) 병아리를 감염시켜 감염 후 3-7일째부터 매일 임상적 징후에 의해, 및 감염 후 4일째 및 6일째 섬모 운동에 대하여 관찰되는 그의 병원성에 대하여 시험하였다. 섬모 운동 손실은 IBV의 병원성을 측정하는 데 있어 잘 확립되어 있는 방법이다. 두 M41-R 바이러스는 비록 감염되지 않은 대조군 병아리와 비교하였을 때에는 일부 임상적 징후를 보이기는 하였지만, M41-CK와 비교하였을 때에는 비병원성을 띠는 것으로 나타났고 (도 2), 그러나, 일부는 일관되지 않는 섬모 운동 손실을 보였다 (도 3).
따라서, M41-CK의 M41-R 분자 클론은 모체 바이러스 M41-CK와 비교하였을 때에는 병원성을 띠지 않았다.
본 발명자들은 M41-CK 서열과 비교하였을 때, M41-R에서의 수개의 뉴클레오티드 차이를 확인하게 되었다. 이들 대다수는, 뉴클레오티드 변이가 서열과 연관된 단백질의 아미노산 서열에는 영향을 주지 않는 바, 돌연변이와 동의 돌연변이였다. 그러나, 4개의 비-동의 돌연변이는 레플리카제 유전자의 Nsp-10, Nsp-14, Nsp-15 및 Nsp-16 성분에 특이적인 IBV 레플리카제 유전자에서 확인되었고, 이들 돌연변이를 통해 아미노산 변이가 이루어졌다 (하기 표 3).
<표 3>
M41-R 전장의 게놈의 Nsp에서 확인된 비-동의 돌연변이
Figure pct00021
실시예 3 - M41-R rIBV의 수복
확인된 돌연변이가 M41-R과 연관된 병원성 손실의 원인이 되는지 여부를 측정하기 위해, Nsp10 돌연변이를 수복시키고, Nsp-14, -15 & -16에서의 돌연변이를 수복시켰고, 이들은 M41-CK와 유사한 방식으로 성장하는 것으로 나타났다 (도 9). 따라서, 본 발명자들은 본 발명자에 의해 앞서 기술된 (TDS) 시스템 (PCT/GB2010/001293 참조)을 사용하여, 올바른 뉴클레오티드를 함유하는 합성 cDNA를 이용함으로써 rIBV인, M41R-nsp10rep 및 M41R-nsp14, 15, 16rep를 생성하였다.
앞서 기술된 바와 같이 병아리에서의 병원성에 대하여 rIBV를 평가하였다. 두 rIBV 모두 M41-R과 비교하였을 때에는 증가된 병원성을 보였지만, M41-CK 경우에 관찰되는 수준으로까지 증가하지는 않았다 (도 4 및 5). M41R-nsp14, 15, 16rep는 M41R-nsp10rep보다 더 많이 임상적 징후를 보였고, 섬모 운동을 더 크게 감소시켰으며, 전반적으로 이러한 결과는 4개의 Nsp와 연관된 변이가 병원성에 영향을 주는 것으로 보인다는 것을 시사하였다.
병원성에서의 Nsp의 역할을 측정하기 위해, TDS 시스템을 이용하여 올바른 뉴클레오티드를 함유하는 합성 cDNA 사용함으로써 M41R-nsp10rep에 상응하는 전장의 cDNA를 사용하여 Nsp14, 15 & 16에서의 돌연변이를 수복시켰다.
하기 rIBV가 제조되었다: -
M41R-nsp10, 15rep - Nsp-10 및 Nsp-15에서의 돌연변이가 수복된 M41-R
M41R-nsp10, 14, 15rep - Nsp-10, -14 및 -15에서의 돌연변이가 수복된 M41-R
M41R-nsp10, 14, 16rep - Nsp-10, -14 및 -16에서의 돌연변이가 수복된 M41-R
M41R-nsp10, 15, 16rep - Nsp-10, -15 및 -16에서의 돌연변이가 수복된 M41-R
M41-K - M41-R에서 4개의 돌연변이, Nsp-10,-14,-15 & -16 모두 수복된 것.
rIBV는 M41-CK와 유사한 방식으로 성장하는 것으로 나타났고 (도 9), 앞서 기술된 바와 같이 병원성에 대하여 평가하였다. (4개의 돌연변이가 모두 수복된 것인) M41-K는 감염 후 4일째까지는 임상적 징후 및 100%의 섬모 운동 손실 (완전한 섬모정체)을 일으켰다 (도 6, 7 & 8). 다른 rIBV는, 본질적으로 비병원성을 띤 M41R-nsp10, 15, 16rep를 제외하고, 다양한 수준의 병원성을 보였다. 본 결과를 통해 4개의 Nsp 모두를 수복시키는 것이 M41-R로의 병원성을 복구시켰다는 것을 확인할 수 있었고; 이는 또한 4개의 Nsp에 기술된 돌연변이가 M41-CK를 약독화시키는 데 있어 연루되어 있다는 이전 증거를 뒷받침한다.
본 발명자들은 또한 rIBV M41R-nsp 10, 14 rep (nsp 10 및 14는 수복되고, nsp 15 및 16은 돌연변이를 함유한다) 및 rIBV M41R-nsp 10, 16 rep (nsp 10 및 16은 수복되고, nsp 14 및 15는 돌연변이를 함유한다)을 생성하고, 이들 바이러스의 병원성에 대하여 평가하였다.
rIBV M41R-nsp 10, 14 rep는 감염 후 4-6일째 M41-K보다는 작은 병원성을 띠었지만, 대략 50%의 섬모정체를 일으켰다. rIBV M41R-nsp 10, 16 rep는 거의 비병원성을 띠었고, 어떤 섬모정체도 일으키지 않았다 (도 11a-c 참조).
따라서, M41-R과 연관된 게놈은 합리적으로 약독화된 IBV에 대한 잠재적 백본 게놈이다.
실시예 4 - M41-R을 이용한 백신접종/시험감염 연구
수정계란을 배아형성 18일째 난내에서 백신접종하였고, 접종받은 난의 부화력을 측정하는 연구에서 후보 백신 바이러스를 시험하였다. 닭의 임상적 건강 상태를 조사하고, 닭 연령 21일째에 닭을 병독성 IB M41 시험감염 바이러스로 1회 투약당 103.65 EID50으로 시험감염시켰다.
시험감염 후 백신에 의한 보호에 관하여 임상적 징후를 조사하고, 시험감염 후 5일째 섬모정체 검사를 수행하여 시험감염 바이러스가 섬모 운동에 미치는 효과, 및 백신에 의해 이루어지는 섬모정체 (섬모 운동 억제)에 대한 보호를 조사하였다.
시판용 브로일러 난에서의 난내 백신접종
실험 디자인은 하기 표 4에 제시되어 있고, 임상 결과는 하기 표 5에 제시되어 있다. IB M41-R을 접종받은 난의 부화력은 우수하였고, 닭은 건강하였다. IB M41-R은 브로일러에서 시험감염 후 임상적 징후로부터 보호하였다 (위약: 19마리 중 19마리 이환, IB M41-R: 18마리 중 3마리 이환 및 1마리 사망). 섬모정체 검사 결과는 하기 표 6에 제시되어 있다. IB M41-R은 섬모정체로부터 보호하였다.
<표 4>
시판용 난에서의 부화력 , 안전성, 효능 연구 디자인
Figure pct00022
1 투약 부피 0.1 ml, NA 해당 없음
2 1회 투약당 103.65 EID50
<표 5>
시판용 닭에서의 시험감염 전후의 부화 백분율 및 임상 데이터 (디자인에 대해서는 표 1 참조)
Figure pct00023
1 호흡계 장애
2 쌕쌕거림
3 목소리 변성
4 호흡 곤란
5 안와내 부비강 팽윤
6 불균등 성장
7 약함
<표 6>
시험감염 이후의 섬모정체 검사 결과 (디자인에 대해서는 표 1 참조)
Figure pct00024
무-특이 병원체 (SPF) 난에서의 난내 백신접종
SPF 난에서의 연구 디자인은 하기 표 7에 제시되어 있고, 시판용 브로일러를 이용한 연구 디자인과 유사하지만, IB M41-R에 대한 백신접종 용량은 더 높았다 (1회 투약당 105 EID50).
결과 (하기 표 8)는 IB M41-R 부화에 대한 부화 백분율은 낮았고, 40마리 중 19마리가 부화되었고, 병아리는 약했다는 결과를 나타낸다. 8마리의 병아리가 사망하였다. 남은 11마리의 닭을 시험감염하였고, 염수로 접종을 받은 난으로부터 부화된 병아리 중 11마리를 시험감염시켰다.
시험감염 이후의 섬모정체 검사에서 IB M41-R로 난내에서 백신접종을 받은 닭 모두 보호된 반면, 대조군은 어느 것도 보호받지 못한 것으로 보였다 (하기 표 9 참조).
<표 7>
SPF 난에서의 부화력 , 안전성, 효능 연구 디자인
Figure pct00025
1 투약 부피 0.1 ml, NA 해당 없음
2 시험감염 용량 0.2 ml 중 103.3 EID50
<표 8>
SPF 닭에서의 시험감염 전후의 부화 백분율 및 임상 데이터 (디자인에 대해서는 표 7 참조)
Figure pct00026
<표 9>
시험감염 이후의 섬모정체 검사 결과 (디자인에 대해서는 표 7 참조)
Figure pct00027
결론적으로, IB M41-R은 시판용 난에서 안전하였고, 임상적 징후로부터 보호하였으며, 섬모정체에 대해 반하는 정도로 보호하였다.
IB M41 R로 백신접종을 받은 SPF 난에서는 비교적 낮은 마리수의 닭이 부화되었다. 이는 난 1개당 105 EID50의 IB M41-R이 사용된 것에 기인할 수 있다. 이는, 부화력 수준이 더 높았던 이전 연구에서 사용된 용량보다 10배 더 높은 양이었다. 다른 연구에서는 배아 사망률 수준 또한 앞서 관찰된 것보다 더 높았는 바, 더 낮은 부화 백분율은 또한 바이러스에 대한 SPF 난 배치의 특히 높은 감수성에 의해 유발되는 것일 수도 있다.
시험감염 이후, 부화 이후에 생존한 모든 닭은 섬모정체로부터 완전하게 보호되었다. 결론적으로, IB M41-R은 난내 투여되는 백신으로서의 큰 잠재능을 가진다.
상기 명세서에서 언급된 모든 공개문헌은 본원에서 참조로 포함된다. 본 발명의 범주 및 정신으로부터 벗어남 없이 수행된 본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 수정 및 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 비록 본 발명이 구체적인 바람직한 실시양태와 관련하여 기술되기는 하였지만, 청구된 본 발명이 상기 구체적인 실시양태로 제한되지 않아야 한다는 것을 이해하여야 한다. 실제로, 분자 생물학, 바이러스학 또는 관련 분야의 통상의 기술자에게 자명한, 본 발명을 수행하기 위한 기술된 모드의 다양한 수정도 하기 특허청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Pirbright Institute <120> Coronavirus <130> P104637PCT <150> GB 1413020.7 <151> 2014-07-23 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27500 <212> DNA <213> Infectious bronchitis virus <400> 1 acttaagata gatattaata tatatctatc acactagcct tgcgctagat ttccaactta 60 acaaaacgga cttaaatacc tacagctggt cctcataggt gttccattgc agtgcacttt 120 agtgccctgg atggcacctg gccacctgtc aggtttttgt tattaaaatc ttattgttgc 180 tggtatcact gcttgttttg ccgtgtctca ctttatacat ccgttgcttg ggctacctag 240 tatccagcgt cctacgggcg ccgtggctgg ttcgagtgcg aagaacctct ggttcatcta 300 gcggtaggcg ggtgtgtgga agtagcactt cagacgtacc ggttctgttg tgtgaaatac 360 ggggtcacct ccccccacat acctctaagg gcttttgagc ctagcgttgg gctacgttct 420 cgcataaggt cggctatacg acgtttgtag ggggtagtgc caaacaaccc ctgaggtgac 480 aggttctggt ggtgtttagt gagcagacat acaatagaca gtgacaacat ggcttcaagc 540 ctaaaacagg gagtatctcc caaactaagg gatgtcattc ttgtatccaa agacattcct 600 gaacaacttt gtgacgcttt gtttttctat acgtcacaca accctaagga ttacgctgat 660 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bronchitis virus <400> 5 tcagcatgga cgtgtggtta taatatgcct gaactttata aagttcagaa ttgtgttatg 60 gaaccttgca acattcctaa ttatggtgtt ggaatagcgt tgccaagtgg tattatgatg 120 aatgtggcaa agtatacaca actctgtcaa tacctttcga aaacaacaat gtgtgtaccg 180 cataatatgc gagtaatgca ttttggagct ggaagtgaca aaggagtggt gccaggtagt 240 actgttctta aacaatggct cccagaaggg acactccttg tcgataatga tattgtagac 300 tatgtgtctg atgcacatgt ttctgtgctt tcagattgca ataaatataa gacagagcac 360 aagtttgatc ttgtgatatc tgatatgtat acagacaatg attcaaaaag aaagcatgaa 420 ggcgtgatag ccaataatgg caatgatgac gttttcatat atctctcaag ttttcttcgt 480 aataatttgg ctctaggtgg tagttttgct gtaaaagtga cagagacaag ttggcacgaa 540 gttttatatg acattgcaca ggattgtgca tggtggacaa tgttttgtac agcagtgaat 600 gcctcttctt cagaagcatt cttgattggt gttaattatt tgggtgcaag tgaaaaggtt 660 aaggttagtg gaaaaacgct gcacgcaaat tatatatttt ggaggaattg taattattta 720 caaacctctg cttatagtat atttgacgtt gctaagtttg atttgagatt gaaagcaacg 780 ccagttgtta atttgaaaac tgaacaaaag acagacttag tctttaattt aattaagtgt 840 ggtaagttac tggtaagaga tgttggtaac acctctttta ctagtgactc ttttgtgtgt 900 actatgtag 909 <210> 6 <211> 145 <212> PRT <213> Infectious bronchitis virus <400> 6 Ser Lys Gly His Glu Thr Glu Glu Val Asp Ala Val Gly Ile Leu Ser 1 5 10 15 Leu Cys Ser Phe Ala Val Asp Pro Ala Asp Thr Tyr Cys Lys Tyr Val 20 25 30 Ala Ala Gly Asn Gln Pro Leu Gly Asn Cys Val Lys Met Leu Thr Val 35 40 45 His Asn Gly Ser Gly Phe Ala Ile Thr Ser Lys Pro Ser Pro Thr Pro 50 55 60 Asp Gln Asp Ser Tyr Gly Gly Ala Ser Val Cys Leu Tyr Cys Arg Ala 65 70 75 80 His Ile Ala His Pro Gly Gly Ala Gly Asn Leu Asp Gly Arg Cys Gln 85 90 95 Phe Lys Gly Ser Phe Val Gln Ile Pro Thr Thr Glu Lys Asp Pro Val 100 105 110 Gly Phe Cys Leu Arg Asn Lys Val Cys Thr Val Cys Gln Cys Trp Ile 115 120 125 Gly Tyr Gly Cys Gln Cys Asp Ser Leu Arg Gln Pro Lys Pro Ser Val 130 135 140 Gln 145 <210> 7 <211> 521 <212> PRT <213> Infectious bronchitis virus <400> 7 Gly Thr Gly Leu Phe Lys Ile Cys Asn Lys Glu Phe Ser Gly Val His 1 5 10 15 Pro Ala Tyr Ala Val 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265 270 Leu Val Phe Asn Leu Ile Lys Cys Gly Lys Leu Leu Val Arg Asp Val 275 280 285 Gly Asn Thr Ser Phe Thr Ser Asp Ser Phe Val Cys Thr Met 290 295 300

Claims (27)

  1. 비-구조 단백질(들) (nsp)-10, nsp-14, nsp-15 또는 nsp-16 중 하나 이상에 돌연변이를 포함하는 다단백질을 코딩하는 변이체 레플리카제 유전자를 포함하는 생, 약독화된 코로나바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 변이체 레플리카제 유전자가 하기 목록:
    서열식별번호(SEQ ID NO): 6의 85번 위치에서의 Pro → Leu,
    서열식별번호: 7의 393번 위치에서의 Val → Leu;
    서열식별번호: 8의 183번 위치에서의 Leu → Ile;
    서열식별번호: 9의 209번 위치에서의 Val → Ile로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 단백질을 코딩하는 것인 코로나바이러스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 레플리카제 유전자가 서열식별번호: 6의 85번 위치에 아미노산 돌연변이 Pro → Leu를 포함하는 단백질을 코딩하는 것인 코로나바이러스.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 레플리카제 유전자가 서열식별번호: 7의 393번 위치에 아미노산 돌연변이 Val → Leu; 서열식별번호: 8의 183번 위치에 Leu → Ile; 및 서열식별번호: 9의 209번 위치에 Val → Ile를 포함하는 단백질을 코딩하는 것인 코로나바이러스.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 레플리카제 유전자가 서열식별번호: 6의 85번 위치에 아미노산 돌연변이 Pro → Leu; 서열식별번호: 7의 393번 위치에 Val → Leu; 서열식별번호: 8의 183번 위치에 Leu → Ile; 및 서열식별번호: 9의 209번 위치에 Val → Ile를 포함하는 단백질을 코딩하는 것인 코로나바이러스.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 레플리카제 유전자가 하기 목록:
    서열식별번호: 1에 제시된 서열과 비교하여,
    뉴클레오티드 위치 12137번 위치에서의 C → T,
    뉴클레오티드 위치 18114번 위치에서의 G → C,
    뉴클레오티드 위치 19047번 위치에서의 T → A, 및
    뉴클레오티드 위치 20139번 위치에서의 G → A로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함하는 것인 코로나바이러스.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 감염성 기관지염 바이러스 (IBV)인 코로나바이러스.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, IBV M41인 코로나바이러스.
  9. 제8항에 있어서, 적어도 일부가 M41 이외의 다른 IBV 혈청형으로부터의 것인 S 단백질을 포함하는 코로나바이러스.
  10. 제9항에 있어서, S1 서브유니트가 M41 이외의 다른 IBV 혈청형으로부터의 것인 코로나바이러스.
  11. 제9항에 있어서, S 단백질이 M41 이외의 다른 IBV 혈청형으로부터의 것인 코로나바이러스.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상응하는 야생형 레플리카제를 발현하는 코로나바이러스와 비교하여 감소된 병원성을 가지며, 이로써 바이러스가 발육란에 투여되는 경우 배아에는 병원성을 띠지 않으면서 복제가 가능한 것인 코로나바이러스.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 정의된 변이체 레플리카제 유전자.
  14. 제13항에 따른 변이체 코로나바이러스 레플리카제 유전자에 의해 코딩된 단백질.
  15. 제13항에 따른 레플리카제 유전자를 포함하는 플라스미드.
  16. 하기 단계:
    (i) 제15항에 따른 플라스미드로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계;
    (ii) 레플리카제 유전자를 갖는 코로나바이러스 주의 게놈을 포함하는 재조합 바이러스로 숙주 세포를 감염시키는 단계;
    (iii) 플라스미드 중의 레플리카제 유전자 서열과 재조합 바이러스 게놈 중의 상응하는 서열 사이에 상동 재조합이 이루어질 수 있도록 허용하여 변형된 레플리카제 유전자를 제조하는 단계; 및
    (iv) 변형된 레플리카제 유전자를 포함하는 재조합 바이러스에 대해 선별하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 코로나바이러스를 제조하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 재조합 바이러스가 백시니아 바이러스인 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    (v) 단계 (iv)로부터의 재조합 바이러스로부터의 DNA로부터, 변형된 레플리카제 유전자를 포함하는 재조합 코로나바이러스를 회수하는 단계를 또한 포함하는 방법.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 코로나바이러스를 생산할 수 있는 세포.
  20. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 코로나바이러스 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 백신.
  21. 대상체에게 제20항에 따른 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법.
  22. 제20항에 있어서, 대상체에서 질환을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 것인 백신.
  23. 대상체에서 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 백신의 제조에서 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 코로나바이러스의 용도.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 감염성 기관지염 (IB)인 방법, 백신, 또는 용도.
  25. 제21항에 있어서, 투여 방법이 점안 투여, 비내 투여, 음용수 투여, 부화 후 주사 및 난내 주사로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 백신접종이 난내 백신접종인 방법.
  27. 제19항에 따른 세포를 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 코로나바이러스로 감염시키는 단계를 포함하는, 제20항에 따른 백신을 제조하는 방법.

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