CN111254155A

CN111254155A - 一种植物作为宿主表达病毒疫苗的方法

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Publication number: CN111254155A
Application number: CN202010077246.4A
Authority: CN
Inventors: 王跃驹
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-01-25
Filing date: 2020-01-25
Publication date: 2020-06-09

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种植物作为宿主表达2019新型冠状病毒(2019‑nCoV)疫苗的方法。植物作为宿主在表达肺炎2019新型冠状病毒(2019‑nCoV)疫苗中，本发明利用生菜来瞬时表达疫苗以应对2019新型冠状病毒，在较短的时间内(4d)可产生高含量的疫苗蛋白质用于鼻腔喷雾接种或者静脉注射接种。本发明最大限度地减少了生物安全问题，生菜基本不含有植物有毒物质，而且其本身纤维少，利于下游的蛋白纯化。本发明试验结果表明，利用植物如生菜系统生产疫苗可以大大缩短生产周期和生产成本。

Description

一种植物作为宿主表达病毒疫苗的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达新型冠状病毒疫苗中的应用。

背景技术

2019年12月以来，发现多起病毒性肺炎病例，经相关病毒分型检测，2020年1月7日，确认系一种新型冠状病毒，1月10日完成了病原核酸检测，1月12日，世界卫生组织正式将造成肺炎疫情的新型冠状病毒命名为“2019新型冠状病毒(2019-nCoV)”。截至1月21日24时，国家卫健委收到国内13省(区、市)，累计报告新型冠状病毒感染的肺炎确诊病例440例，死亡9例。在境外，分别在美国、泰国、日本、韩国以及澳大利亚都有发现疑似肺炎病例。冠状病毒是病毒中变异性很高的一类，可以引发普通感冒，也可以引发重症肺部感染。此前的传染性非典型肺炎SARS病毒、中东呼吸综合征MERS病毒都属此列。通过对新型冠状病毒基因组与SARS冠状病毒、“中东呼吸综合征”MERS冠状病毒进行了全基因组比对，发现平均分别有～70％和～40％的序列相似性，其中可产生病毒表面糖蛋白“S”基因差异尤为明显。此外，通过分子结构模拟的计算方法，对冠状病毒S-蛋白和人ACE2 蛋白进行了结构对接研究，结果表明冠状病毒可能是通过S-蛋白与人ACE2 互作的分子机制，来感染人的呼吸道上皮细胞，这为该病毒的致病机理研究提供了一些理论参考。

2019新型冠状病毒(2019-nCoV)对公众构成威胁。出现了人传人和医务人员感染，存在一定范围的社区传播。疫情传播途径以呼吸道传播为主，病毒存在变异的可能，疫情存在着进一步扩散的风险。特别令人担心的是，目前没有有效的药物或疫苗可用。因此，迫切需要发展预防性治疗，如疫苗。 2019-nCoV包膜突出的刺突糖蛋白(S)在病毒感染过程中起重要作用。它识别和结合宿主细胞表面上存在的血管紧张素转换酶(angiotensinconverting enzyme (ACE)-2)受体，然后导致病毒进入细胞。已经证明类似的冠状病毒如SARS 以及MERS-CoV S刺突糖蛋白与受体结合结构域(RBD)引起对冠状病毒本身产生中和抗体。本研究基于S蛋白和RBD的候选疫苗的开发，针对2019-nCoV新型冠状病毒的疫苗，并且显示出有希望作为针对2019-nCoV感染的治疗性干预。

冠状病毒S蛋白中的RBD结构域特异性结合宿主细胞膜上的ACE-2受体，已被报道可能作为针对冠状病毒感染的亚单位疫苗。目前重组的冠状病毒如 SARS或者MERS-CoV均是基于RBD的亚单位疫苗，主要在人类胚胎肾细胞 (HEK293T)中产生。然而，目前来自HEK293T细胞的蛋白质产量相对较低，仅在实验室测试中使用足够的产量。而且动物细胞培养需要价格昂贵的培养液，严格的厂房条件，操作复杂，时间周期至半年。动物细胞生产能力低，造成成本极高。有时候动物细胞所带的病毒可以侵染人类，造成安全性低。

目前为止，还没有疫苗应对因此2019-nCoV。我们迫切需要一个更有效的生产系统来快速生产疫苗，并且足够数量用于响应任何2019-nCoV的疫情。霍乱毒素B亚单位(CTB)是霍乱毒素分子的一个无毒部分，它与GM1神经节苷脂受体结合，将抗原与CTB偶联可增加抗原的免疫原性，因为它可增加受体介导的抗原摄取和随后由APCs呈递抗原。本发明将CTB与2019-nCoV 的RBD融合，生产出CTB-RBD融合蛋白疫苗，以提高免疫效果。预期在动物试验中，鼻腔喷雾接种植物疫苗引起粘膜和全身免疫反应。

Fc片段是指可结晶段(fragment crystallizable，Fc)，相当于Ig的CH2和 CH3结构域，是Ig与效应分子或者细胞相互作用的部位。我们将2019-nCoV 的RBD与Fc融合成为RBD-Fc疫苗蛋白，由植物瞬时系统生产。RBD-Fc 结构域也能使这些分子与Fc受体相互作用。预期在动物试验中，注射植物源 RBD-Fc疫苗将引起全身免疫反应。

因此，本发明提供一种植物作为宿主在表达新型冠状病毒2019-nCoV疫苗具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供植物作为宿主在表达新型冠状病毒的疫苗中的应用。本发明利用生菜系统瞬时表达鼻腔喷雾(CTB-RBD)以及注射(RBD-Fc) 接种疫苗，时间短(4d)。生菜基本不含有植物有毒物质，而且其本身纤维少，利于下游的蛋白纯化，大大降低生产成本。生菜培育简单，简化操作步骤。而且植物病毒不感染人类，大大增加其安全性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了植物作为宿主在表达新型冠状病毒2019-nCoV的疫苗中的应用。

在本发明的一种植物作为宿主表达2019-nCoV病毒疫苗的方法，包括：

S1、选取植物器官；

S2、构建表达载体；

S3、将所述的表达载体转化到农杆菌中；

S4、通过所述农杆菌介导真空渗透入植物组织；

S5、提取、分离蛋白质，获得病毒疫苗。

优选地，步骤S1中所述植物器官包括生菜、烟草、白菜、水稻、玉米、大豆或小麦的叶片、种子、根茎或整株植物。

优选地，步骤S2中的表达载体包括：CTB、新型病毒2019-nCoV Spike receptorbinding domain(RBD)、Fc以及载体。

优选地，所述载体为双元植物载体。

优选地，步骤S2构建表达载体包括：

S2.1、将所述CTB以及所述RBD融合为一个蛋白，获得CTB-RBD疫苗蛋白；

S2.2、将所述CTB-RBD疫苗蛋白的密码子优化为植物偏好的密码子，获得CTB-RBD的优化序列；

S2.3、将所述CTB-RBD的优化序列5’末端加入Kpnl限制性酶切位点，在3’末端加入Sacl和Pacl位点，生成pCTB-RBD载体；

S2.4、通过Kpnl/Sacl获得基因片段CTB-RBD，并克隆到植物表达载体 pCam35S，获得瞬时表达载体p35S-CTB-RBD。

优选地，步骤S2构建表达载体包括：

S2.1、将所述RBD以及所述Fc融合为一个蛋白，获得RBD-Fc疫苗蛋白；

S2.2、将所述RBD-Fc疫苗蛋白的密码子优化为植物偏好的密码子，获得 RBD-Fc的优化序列；

S2.3、将所述RBD-Fc的优化序列5’末端加入Kpnl限制性酶切位点，在 3’末端加入Sacl和Pacl位点，生成pRBD-Fc载体；

S2.4、通过Kpnl/Sacl获得基因片段RBD-Fc，并克隆到植物表达载体 pCam35S，获得瞬时表达载体p35S-RBD-Fc。

优选地，步骤S2.2中所述CTB-RBD的优化序列包括CTB-RBD密码子优化的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示和CTB-RBD的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选地，步骤S2.2中所述RBD-Fc的优化序列包括RBD-Fc密码子优化的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示和RBD-Fc的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选地，步骤S4通过农杆菌介导真空渗透包括：

S4.1、抽真空25～45s；

S4.2、保持真空-95kPa压力，30～60s；

S4.3、释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；

重复上述步骤2～3次，避光处理4d。

优选地，所述农杆菌为根癌土壤杆菌GV3101。

本发明利用生菜来瞬时表达鼻腔喷雾疫苗或者注射用疫苗以应对新型冠状病毒2019-nCoV，在较短的时间内(4d)可产生高含量的蛋白质。这种方法最大限度地减少了生物安全问题，因为处理过的植物(如生菜)组织通常是在完全封闭的设施或容器中开发，不存在生物污染问题。生菜基本不含有植物有毒物质，而且其本身纤维少，利于下游的蛋白纯化。利用生菜系统生产鼻腔喷雾疫苗可以大大缩短生产周期和生产成本。

本发明结果表明，植物系统可以是更有效的表达平台，为快速，瞬时表达重组蛋白质提供了方法。生菜真空农杆菌渗透方法简单，快速，减少坏死，而且可以提高重组蛋白产量。植物可以通过承受真空压力而增加蛋白质产量，并允许每片叶子在生菜叶片中更完整的渗透。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产，因此比其他瞬时表达植物，如烟草等，更容易获得并且更便宜。本研究利用搅拌机进行匀浆，证明可以用于大规模生产重组蛋白质，因为在更短的时间内可以用搅拌机处理更多的生菜组织。通过适度修饰，该系统可用于在短时间内高水平生产功能重组蛋白。总之，本研究的结果为利用生菜系统工业化大规模生产生物活性成分的药用蛋白提供了可行性的实验依据。也为突发性新型冠状病毒2019-nCoV提供了疫苗蛋白。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示优化合成的CTB-RBD基因克隆载体；

图2示优化合成的RBD-Fc基因克隆载体；

图3示植物双元表达载体p35S-CTB-RBD构建流程图；

图4示植物双元表达载体p35S-RBD-Fc构建流程图；

图5示p35S-CTB-RBD以及p35S-RBD-Fc基因片段酶切(KpnI/SacI)鉴定；

图6示SDS-PAGE检测纯化CTB-RBD以及RBD-Fc与angiotensin converting enzyme(ACE)-2亲和反应。

具体实施方式

本发明公开了植物作为宿主在表达新型冠状病毒的疫苗中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明利用生菜作为重组蛋白生产的有效平台。用于真空农杆菌渗透的植物(烟草或者生菜)的生长时间通常为4至6周。本发明消除了植物遗传工程生长周期，大大节省了前期培育植物的时间。用生菜系统表达并且在温和的条件下成功分离出外源2019-nCoV重组疫苗蛋白CTB-RBD以及 RBD-Fc，证明生菜表达平台可以用来生产2019-nCoV疫苗以应对大规模突发性新型冠状病毒冠状病毒。

在本发明的一种植物作为宿主表达病毒疫苗的方法，包括：

S1、选取植物器官，所述植物器官包括生菜、烟草、白菜、水稻、玉米、大豆或小麦的叶片、种子、根茎或整株植物；

S2、构建表达载体，所述表达载体包括：CTB、新型病毒2019-nCoV Spike receptorbinding domain(RBD)、Fc以及双元植物载体；

具体的：

S2.2、分别将CTB-RBD疫苗蛋白以及RBD-Fc疫苗蛋白的密码子优化为植物偏好的密码子，分别获得CTB-RBD以及RBD-Fc的优化序列；

S2.3、将CTB-RBD或RBD-Fc优化序列5’末端加入Kpnl限制性酶切位点，在3’末端加入Sacl和Pacl位点，分别生成pCTB-RBD载体或pRBD-Fc 载体；

S2.4、通过Kpnl/Sacl分别获得基因片段CTB-RBD或RBD-Fc，并克隆到植物表达载体pCam35S，分别获得瞬时表达载体p35S-CTB-RBD或 p35S-RBD-F；

上述步骤S2.2中所述CTB-RBD的优化序列包括CTB-RBD密码子优化的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示和CTB-RBD的氨基酸序列如SEQ ID No.2 所示。所述RBD-Fc的优化序列包括RBD-Fc密码子优化的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示和RBD-Fc的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。

S3、将所述的表达载体转化到农杆菌中；所述农杆菌为根癌土壤杆菌 GV3101。

S4、通过所述农杆菌介导真空渗透入植物组织；

具体的：

S4.1、抽真空25～45s；

S4.2、保持真空-95kPa压力，30～60s；

S4.3、释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；

重复上述步骤2～3次，避光处理4d。

S5、提取、分离蛋白质，获得病毒疫苗。

需要说明的是，农杆菌介导的真空渗透为：将制备好的农杆菌培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。用刀将前10％的生菜切除，将其倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(Welch Vacuum，Niles，IL，USA)打开以抽空，大约25～45s，直到观察到叶片空间上的气泡形成。并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。

本发明提供的植物作为宿主在表达新型冠状病毒2019-nCoV疫苗中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1植物瞬时表达载体的构建

为了改善蛋白质在生菜系统的表达和翻译，本发明重新设计了CTB-RBD 以及RBD-Fc序列，以优先匹配植物中发现的密码子频率(序列如SEQ ID No.1、2所示)。霍乱毒素B亚基(CTB)可以显示增加抗原摄取并有效诱导粘膜反应。为了提高鼻内疫苗的免疫原性，我们将CTB(Genbank ID: AY475128.1)融合到RBD(Genbank ID:ATO98205.1)中形成CTB-RBD融合蛋白。为了增强体内的免疫原性，我们将RBD(Genbank ID:ATO98205.1 融合到Fc(Genbank ID:BC156864.1)中形成RBD-Fc融合蛋白。对CTB-RBD 以及RBD-Fc的密码子进行优化并合成。

在CTB-RBD以及RBD-Fc优化序列5’末端加入Kpnl限制性酶切位点，在3’末端加入Sacl和Pacl位点，生成pCTB-RBD以及pRBD-Fc载体中。通过Kpnl/Sacl分离基因片段，并克隆到双元植物表达载体，pCam35S，分别产生瞬时表达载体p35S-CTB-RBD以及p35S-RBD-Fc，载体经双酶切鉴定大小完整。将两种植物表达构建体分别通过用Multiporator(Eppendorf，Hamburg， Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育 2d后，挑取单菌落接种到0.5L YEB(酵母提取物肉汤，5g/L蔗糖，5g/L 胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/L MgSO4，pH7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/L卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以 25～28℃孵育72h。通过添加YEB培养基测量OD600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10 mM MES，10mM MgSO₄)中至O.D.600为0.5。

所述克隆优化基因片段CTB-RBD以及RBD-Fc(如图1和图2所示，并且构建两种基于双元植物表达载体p35S-CTB-RBD和p35S-RBD-Fc，如图3、图4所示，其中，图3示植物双元表达载体p35S-CTB-RBD构建流程图；利用限制性内切酶(KpnI/SacI)双酶切，从图1克隆载体切下CTB-RBD片段，连接入pCam35S的KpnI/SacI位点，生成植物双元表达载体p35S-CTB-RBD。图4示植物双元表达载体p35S-RBD-Fc构建流程图；利用限制性内切酶 (KpnI/SacI)双酶切，从图2克隆载体切下RBD-Fc片段，连接入pCam35S 的KpnI/SacI位点，生成植物双元表达载体p35S-RBD-Fc。

在完成构建体后，用特异性限制酶消化证实基因片段是完整的，如图5 所示，图中，泳道1示CTB-RBD；泳道2示RBD-Fc。渗透后，绝大多数生菜组织在真空浸润过程中淹没，除了坚固的中肋区域外，其余部分均在真空渗透4d后显示淡黄褐色区域。

实施例2农杆菌介导的真空渗透

将制备好的农杆菌培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。用刀将前 10％的生菜切除，将其倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(Welch Vacuum，Niles，IL，USA)打开以抽空，大约25～45s，直到观察到叶片空间上的气泡形成。并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2至3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。

实施例3蛋白质提取和分离

经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mM KPi，pH7.8；5mM EDTA；10mMβ-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1～2min。将匀浆物调节至pH为8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g 离心15min以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60min。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15min。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60min，再次在4℃下以10,000g离心15min。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5mL 缓冲液(20mMKPi，pH 7.8；2mM EDTA；10m Mβ-巯基乙醇)中并在4℃下储存。纯化的蛋白经过进一步His-标记的蛋白质提纯。约200μL的蛋白质提取物与1mL平衡的Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)混合缓冲液A(50mM NaH₂PO₄， 300mM NaCl，pH8.0)，并与4℃下在摇床上1h。然后将混合物加入到预先平衡的1mL-聚丙烯柱中用1mL缓冲液B(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl， 5mM咪唑，pH8.0)。之后，将混合物用10mL缓冲液A洗涤，随后用5mL 洗涤缓冲液B通过重力流出。用洗脱缓冲液(50mM)洗脱纯化的His-标记的蛋白质NaH₂PO₄，300mM NaCl，1M咪唑，pH8.0)。蛋白浓度进行Bradford 测定Bradford试剂盒(Bio-rad)用于定量纯化的重组蛋白。

植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。本发明用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。重组CTB-RBD以及RBD-Fc疫苗蛋白经过SDS-PAGE分离，在泳道中观察到估计分子量大约为41kDa以及55kDa的条带(如图6所示，泳道1，2)，在隐形对照泳道中没有明显的对应条带。基于Bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量为每克植物叶片分别产生0.86mg以及0.89mg的重组CTB-RBD以及RBD-Fc疫苗蛋白。另外，angiotensin convertingenzyme(ACE)-2与CTB-RBD-Fc亲和反应也检测到大约125kDa以及 140kDa的条带(如图6所示，泳道4，5)，与预测结果大小一致。

这里需要说明的是，图6示SDS-PAGE检测纯化CTB-RBD以及RBD-Fc 与DPP4亲和反应。泳道1:纯化重组CTB-RBD(5μg)；泳道2：纯化重组 RBD-Fc(5μg)；泳道3：ACE-2(5μg)；泳道4：ACE-2+CTB-RBD(5μg)；泳道5：ACE-2+RBD-Fc(5μg)；泳道6:非真空渗透叶片洗脱液阴性对照。

实施例4 SDS-PAGE凝胶电泳以及Western Blot蛋白印迹杂交

收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5μL)热变性 (95℃)加载缓冲液(Biorad，Hercules，CA，USA)在4-12％

Bis-Tris Plus SDS-凝胶(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)跑电泳，然后用考马斯蓝G250(Biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。

对于重组蛋白的Western Blot蛋白印迹杂交，10μl的重组样品 (Biovision)分别在10～20％

Bis-Tris Plus聚丙烯酰胺凝胶上分离，并将其电泳转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用HisProbe-HRP试剂检测His 标记的蛋白质试剂盒(ThermoFischerScientific)根据制造商的说明书。将膜在

Working溶液中共培育并暴露于CL-曝光膜(ThermoFischer Scientific)。

实施例5ACE-2和重组2019-nCoV CTB-RBD以及RBD-Fc结合的体外分析

ACE-2是新型病毒2019-nCoV的功能受体，在调节免疫应答方面非常重要。我们进行共免疫沉淀测定以分析2019-nCoV RBD与ACE-2的结合亲和力。将重组人ACE-2(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)与重组CTB-RBD以及 RBD-Fc分别一起温育。样品将使用SDS-PAGE分离，以检查所得复合物的大小。

当将重组人ACE-2与重组2019-nCoV融合RBD蛋白一起温育时， SDS-PAGE分离出大约125kDa以及140kDa的条带，证明重组2019-nCoV融合RBD蛋白CTB-RBD以及RBD-Fc与重组人ACE-2亲和力显著。

实施例6

对照组1：利用动物细胞生产新型冠状病毒2019-nCoV融合疫苗RBD-Fc；

对照组2：利用动物细胞生产新型冠状病毒2019-nCoV融合疫苗 CTB-RBD；

实验组1：本发明提供植物生产新型冠状病毒2019-nCoV疫苗CTB-RBD；

实验组2：本发明提供的植物生产新型冠状病毒2019-nCoV疫苗RBD-Fc；

实验组3：利用烟叶生产新型冠状病毒的疫苗2019-nCoV疫苗CTB-RBD；

实验组4：利用烟叶生产新型冠状病毒的疫苗2019-nCoV疫苗RBD-Fc；

表1新型冠状病毒的疫苗

^*示与对照组1、2相比P≤0.05；^**示与对照组1、2相比P≤0.01；

^#示与实验组3、4相比P≤0.05；^##示与实验组3、4相比P≤0.01；

由表1可知，与对照组的动物细胞表达系统相比，本发明提供的生菜瞬时表达新型冠状病毒的疫苗，极显著(P≤0.01)缩短了生产周期，极显著(P ≤0.01)提高了蛋白含量，简化了蛋白纯化的难易程度，极显著(P≤0.01) 降低了生产成本。

与实验组3和4的烟叶系统相比，生菜瞬时表达新型冠状病毒的疫苗，显著(P≤0.05)缩短了生产周期，显著(P≤0.05)提高了蛋白含量，简化了蛋白纯化的难易程度，极显著(P≤0.01)降低了生产成本。

实验组3、4与对照组1、2相比，烟叶瞬时表达新型冠状病毒的疫苗比动物细胞系统显著(P≤0.05)缩短了生产周期，显著(P≤0.05)提高了蛋白含量，简化了蛋白纯化的难易程度，显著(P≤0.05)降低了生产成本。

综合上述试验结果表明，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台。能够快速瞬时表达重组蛋白质，可以在短时间内大规模生产新型冠状病毒的疫苗。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 王跃驹

<120> 一种植物作为宿主表达新型冠状病毒疫苗的方法

<141> 2020-01-25

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1494

<212> DNA

<213> RBD-Fc

<400> 1

atgcctaaca taaccaattt gtgcccattt ggagaggtgt ttaatgcaac tactttccct 60

agtgtatacg catgggaacg taagaggata tctaactgcg tagccgacta ttctgtactg 120

tataactcca catcatttag cacattcaaa tgttatggtg tgtcagccac aaaattgaat 180

gacttgtgtt tctcaaacgt ttatgcagat tcttttgttg taaaagggga tgatgttcga 240

caaattgcac ccggacagac gggcgtcata gcagactaca attataagtt accggatgac 300

tttacagggt gtgtccttgc ttggaacaca cgtaatatcg atgctaccca gaccggaaac 360

tacaattaca aatacaggtc actccgtcac ggaaagctta ggcccttcga aagagacatt 420

agtaacgtac cttttagtcc agatggaaaa ccatgcacac cccctgcctt caattgctat 480

tggccattga acgattatgg gttttacatt actaacggga ttggttatca accctataga 540

gtagtagtgc tgtcattcga gttattgaac gcacctgcaa ccgtgtgtgg accgaagctg 600

tccactgact tgatcaaaaa ccaatgtgta aactttaact tcaatgggct tacagggacc 660

ggcgtgctta ctcccagctc taagcgattt cagccatttc aacaattcgg tagagatgtg 720

agtgacttta cagattcagt gcgagatcca aaaacgtcag aaggtggagg tggctccggc 780

gggggcggat caggtggtgg cggatcagca gagtctaagt atgggcctcc ttgccctcca 840

tgcccagctc ccgaagccgc tggtggtcct tccgtgtttc tcttcccgcc aaaacctaaa 900

gacacgttaa tgatcagccg aacgccagaa gttacatgcg tggttgtcga tgtctcacaa 960

gaggaccctg aagtacaatt caattggtat gtagacggcg ttgaggtcca caacgccaag 1020

actaagccca gagaagaaca gtttaacagc acatacaggg tagtttcagt cttaacagtg 1080

cttcaccagg attggttaaa cggcaaagaa tacaaatgca aagttagtaa caagggttta 1140

ccaagttcca tagagaagac tataagcaag gctaagggac agcctcgtga acctcaggtg 1200

tacactttgc ctccttccca ggaggagatg acaaaaaatc aggtatccct cacttgcctg 1260

gtcaaaggct tctatccctc agacatagcc gttgagtggg agtccaatgg tcagccggag 1320

aataattata agacgacacc gccagtatta gactcagatg gtagcttttt cctgtactca 1380

cgtctgacgg tagacaaaag tcgttggcag gagggtaatg tattctcttg cagtgtcatg 1440

cacgaggctt tgcacaacca ttatacgcag aaatcactca gtttgtcatt agga 1494

<210> 2

<211> 498

<212> PRT

<213> RBD-Fc ORF

<400> 2

Met Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala

1 5 10 15

Thr Thr Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Arg Ile Ser Asn

20 25 30

Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Thr

35 40 45

Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe

50 55 60

Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg

65 70 75 80

Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys

85 90 95

Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn

100 105 110

Ile Asp Ala Thr Gln Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Ser Leu

115 120 125

Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro

130 135 140

Phe Ser Pro Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Phe Asn Cys Tyr

145 150 155 160

Trp Pro Leu Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Ile Thr Asn Gly Ile Gly Tyr

165 170 175

Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro

180 185 190

Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln

195 200 205

Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr

210 215 220

Pro Ser Ser Lys Arg Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val

225 230 235 240

Ser Asp Phe Thr Asp Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Gly Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser

260 265 270

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

275 280 285

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

290 295 300

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

305 310 315 320

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

325 330 335

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr

340 345 350

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

355 360 365

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

370 375 380

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

385 390 395 400

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

405 410 415

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

420 425 430

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

435 440 445

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val

450 455 460

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

465 470 475 480

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

485 490 495

Leu Gly

<210> 3

<211> 1095

<212> DNA

<213> CTB-RBD

<400> 3

atgactccac aaaatataac ggacctctgt gctgagtacc ataacacaca aatttatacg 60

ttaaacgaca aaattttctc ctacactgag tcattggccg ggaaaagaga gatggccatt 120

ataactttca aaaatggggc aatcttccaa gttgaagtcc cgggctccca acacatagat 180

tctcagaaaa aggccataga gcgaatgaaa gacacattaa gaattgctta cttgacagaa 240

gctaaggttg agaagttgtg cgtttggaat aacaaaacgc cacacgccat cgccgccatc 300

tcaatggcta atgggcccgg cccacgaagg aaacgaccaa acattacgaa cctttgcccc 360

tttggagaag ttttcaacgc aactacattt ccgtccgtct acgcttggga aagaaaacgt 420

atctcaaatt gtgtggccga ttattcagtt ctttataatt ctactagctt tagcacattt 480

aagtgctatg gcgtgtcagc aacaaaactc aacgacttat gttttagcaa tgtgtacgcc 540

gatagtttcg ttgttaaggg cgatgacgtt agacaaatag cacccggtca aaccggcgtt 600

atcgccgact acaattataa gcttcctgat gacttcactg gatgtgtcct cgcttggaat 660

acccgaaaca tcgacgccac gcaaaccggg aactataact acaagtatcg atcactgcga 720

catggaaagt tacgtccttt cgagagagac atcagcaatg tgccattctc acctgatggc 780

aaaccgtgca ctcctccagc ttttaactgc tactggccat taaacgatta cggtttctat 840

ataactaacg gcatcggtta tcaaccctac cgagtcgttg tgctttcatt cgagttgttg 900

aatgcccccg ctactgtttg cgggcccaaa ctctctactg acctcatcaa gaatcagtgt 960

gttaacttca attttaatgg tctgacagga accggggtcc tcacaccttc cagtaaaagg 1020

tttcaaccgt tccaacagtt cggacgtgac gtgtccgatt ttactgattc agtgagggac 1080

ccgaaaacat ctgaa 1095

<210> 4

<211> 365

<212> PRT

<213> CTB-RBD ORF

<400> 4

Met Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr

1 5 10 15

Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu

20 25 30

Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile

35 40 45

Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys

50 55 60

Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu

65 70 75 80

Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala

85 90 95

Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Gly Pro Gly Pro Arg Arg Lys Arg

100 105 110

Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr

115 120 125

Thr Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys

130 135 140

Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Thr Phe

145 150 155 160

Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser

165 170 175

Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln

180 185 190

Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu

195 200 205

Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile

210 215 220

Asp Ala Thr Gln Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Ser Leu Arg

225 230 235 240

His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe

245 250 255

Ser Pro Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Phe Asn Cys Tyr Trp

260 265 270

Pro Leu Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Ile Thr Asn Gly Ile Gly Tyr Gln

275 280 285

Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala

290 295 300

Thr Val Cys Gly Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys

305 310 315 320

Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro

325 330 335

Ser Ser Lys Arg Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser

340 345 350

Asp Phe Thr Asp Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu

355 360 365

Claims

1.一种植物作为宿主表达新型病毒2019-nCoV疫苗的方法，其特征在于，包括：

S1、选取植物器官；

S2、构建表达载体；

S3、将所述的表达载体转化到农杆菌中；

S4、通过所述农杆菌介导真空渗透入植物组织；

S5、提取、分离蛋白质，获得病毒疫苗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述植物器官包括生菜、烟草、白菜、水稻、玉米、大豆或小麦的叶片、种子、根茎或整株植物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中的表达载体包括：CTB、新型病毒2019-nCoV Spike receptor binding domain(RBD)、Fc以及载体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述载体为双元植物载体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2构建表达载体包括：

S2.4、通过Kpnl/Sacl获得基因片段CTB-RBD，并克隆到植物表达载体pCam35S，获得瞬时表达载体p35S-CTB-RBD。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2构建表达载体包括：

S2.2、将所述RBD-Fc疫苗蛋白的密码子优化为植物偏好的密码子，获得RBD-Fc的优化序列；

S2.3、将所述RBD-Fc的优化序列5’末端加入Kpnl限制性酶切位点，在3’末端加入Sacl和Pacl位点，生成pRBD-Fc载体；

S2.4、通过Kpnl/Sacl获得基因片段RBD-Fc，并克隆到植物表达载体pCam35S，获得瞬时表达载体p35S-RBD-Fc。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2.2中所述CTB-RBD的优化序列包括CTB-RBD密码子优化的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示和CTB-RBD的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2.2中所述RBD-Fc的优化序列包括RBD-Fc密码子优化的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示和RBD-Fc的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4通过农杆菌介导真空渗透包括：

S4.1、抽真空25～45s；

S4.2、保持真空-95kPa压力，30～60s；

S4.3、释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；

重复上述步骤2～3次，避光处理4d。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述农杆菌为根癌土壤杆菌GV3101。