CN110218257A

CN110218257A - 植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用

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Publication number: CN110218257A
Application number: CN201910549744.1A
Authority: CN
Inventors: 王跃驹; 马磊; 唐辉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-06-24
Filing date: 2019-06-24
Publication date: 2019-09-10

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达Antis15抗体的应用。本发明利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台，利用简单以及有效的农杆菌介导真空渗透方法来表达Antis15抗体。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4天后就可以收集。利用Western Blot蛋白杂交法确定Antis15抗体成功表达，用AKTA蛋白纯化系统成功纯化出Antis15单抗。活性测试结果表明Antis15在小鼠模型上一直肿瘤生长效果与PD‑1单抗持平。

Description

植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用。

背景技术

迄今为止，“谈癌色变”依旧是常态。大多数恶性肿瘤患者在确诊时已处于晚期，失去了手术机会，而肿瘤免疫逃逸的恶果始终难以遏制，导致肿瘤对许多传统疗法不敏感，预后不佳，因此，在很多人眼中“患癌”就是接到了“阎王令”。近年来，免疫疗法已经在癌症治疗上取得不小的成功，其中最有代表性的就是靶向PD-1/PD-L1通路的免疫检查点抑制剂。尽管如此，PD-1/PD-L1抗体只对少于40％的实体瘤有作用，寻找能弥补PD-1/PD-L1抗体不足的新靶点迫在眉睫。然而，晚期人类癌症的肿瘤微环境(TME)中的免疫逃避机制是高度异质的。大量证据表明，除了PD-1/PD-L1通路之外，许多其他分子或细胞机制也能导致TME中免疫功能失调。这些机制包括但不限于：免疫细胞浸润不足、调节性T细胞的积聚、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和髓系来源抑制细胞(MDSCs)的存在，以及抑制性分子、细胞因子、代谢物的上调。不过，有个问题是，上述的许多机制缺乏肿瘤微环境特异性，靶向这些途径可能会导致免疫系统的广泛激活，最终导致自身免疫疾病。

那么，在TME中，是否有其他类似PD-1/PD-L1的分子也能调节免疫反应从而调控肿瘤的发展？陈列平教授团队发现的Siglec-15(S15)，给免疫治疗带来了新思路。S15并不简单，它的表达水平与PD-L1的表达是互斥的。简单来说，对绝大多数肿瘤而言，有PD-L1高表达就没有Siglec-15；有Siglec-15高表达就没有PD-L1。这就意味着，那些对PD-1/PD-L1抗体不响应的肿瘤，S15抗体可以完美的补足PD-1/PD-L1抗体的不足。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用。本发明提供了植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用。本发明利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了Antis15抗体。并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明植物尤其是生菜表达平台可以成功用来生产Antis15抗体蛋白。时间短(4d)，纯化简单，生产便捷。消除基因污染，消除感染人体的潜在病虫害等。大大降低生产成本，提高产品安全性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

植物瞬时表达技术是在植物生长到一定阶段，利用多种不同的技术方式将含有目标蛋白的质粒转移到植物细胞中，在植物细胞中建立高效、可控的表达系统，获得该基因短暂的可控表达的技术。与稳定表达相比，瞬时表达所需时间短，不需要将外源基因整合到宿主植物染色体中，仅需几天的时间就可拿到实验结果。与细菌表达系统相比，植物表达系统可以对所表达的蛋白进行正确的折叠、加工、修饰，所生产的蛋白活性高于细菌表达系统；与动物细胞表达系统相比，植物表达系统的成本非常低，仅为其千分之一到千分之二。

在上述研究的基础上，本发明还提供了一种表达载体，包括Antis15抗体的重链序列或轻链序列以及载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述Antis15抗体的重链序列或轻链序列为氨基酸序列，将Antis15抗体的重链、Antis15抗体的轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化Antis15抗体的重链序列或优化的Antis15抗体轻链序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述优化的Antis15抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述优化的Antis15抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述优化的Antis15抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述优化的Antis15抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

在本发明的一些具体实施方案中，所述载体为双元植物载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：

步骤1：分别将Antis15抗体重链、Antis15抗体轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得：

ⅰ.优化的Antis15抗体的重链序列；

ⅱ.优化的Antis15抗体的轻链序列；

步骤2：在所述优化的Antis15抗体的重链序列的5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入Sac I位点；

在所述优化的Antis15抗体的轻链序列的5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sac I位点；

克隆到pUC57载体中，分别获得pAntis15-H，pAntis15-L克隆载体；

步骤3：通过Xbal/Sacl分别从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段，克隆至双元植物载体pCam35S，分别获得表达载体p35S-Antis15-H，p35S-Antis15-L。

本发明还提供了所述的表达载体在表达Antis15抗体中的应用。

在上述研究的基础上，本发明提供了一种植物作为宿主表达Antis15抗体的方法，将所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，提取、分离蛋白质，获得Antis15抗体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：

步骤1：抽真空25～45s；

步骤2：保持真空(-95kPa)压力30～60s；

步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；

重复上述步骤2～3次，避光处理4d。

本发明利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台，利用简单以及有效的农杆菌介导真空渗透方法来表达Antis15抗体。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4天后就可以收集。利用Western Blot蛋白杂交法确定Antis15抗体成功表达，用AKTA蛋白纯化系统成功纯化出Antis15单抗。活性测试结果表明Antis15在小鼠模型上一直肿瘤生长效果与PD-1单抗持平。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1(A)示克隆载体pAntis15-H示意图；图1(B)示pAntis15-L示意图；

图2示Antis15植物双元表达载体p35S-Antis15-H(重链)以及p35S-Antis15-L(轻链)构建流程；利用限制性内切酶(Xbal/SacI)双酶切，从图1(A)、图1(B)克隆载体分别切下Antis15重链，连接入pCam35S的Xbal/SacI位点，生成植物双元表达载体p35S-Antis15-H；利用限制性内切酶(Xbal/SacI)双酶切，从图1克隆载体分别切下Antis15抗体轻链，重链，连接入pCam35S的Xbal/SacI位点，生成植物双元表达载体p35S-Antis15-L；

LB and RB:Ti质粒左右边界；35S，具有烟草花叶病毒(TMV)5‘UTR的CaMV 35S启动子；NPT II，用于卡那霉素抗性的编码nptII基因的表达；Nos 3’，终止子；

图3(A)示SDS-PAGE凝胶电泳结果；图3(B)示非变性凝胶电泳结果；泳道1：非侵染生菜；泳道2：生菜表达的Antis15抗体；泳道3：Antis15抗体阳性对照；

图4示生菜纯化的Antis15对肿瘤生长的影响，具有显著的生物学活性。

具体实施方式

本发明公开了植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

有鉴于此，本发明提供了植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用。本发明利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了Antis15抗体。并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明植物尤其是生菜表达平台可以成功用来生产Antis15抗体蛋白。时间短(4d)，纯化简单，生产便捷。消除基因污染，消除感染人体的潜在病虫害等。大大降低生产成本，提高产品安全性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用。优选的，所述抗体为单克隆抗体。所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。本发明还提供了一种表达载体，包括Antis15抗体的重链序列或轻链序列以及载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述Antis15抗体的重链序列或轻链序列为将Antis15抗体重链、Antis15抗体轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化的Antis15抗体的重链序列或优化的Antis15抗体的轻链序列。

所述优化的Antis15抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述优化的Antis15的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

ⅰ.优化的Antis15抗体的重链序列；

ⅱ.优化的Antis15抗体的轻链序列；

由金斯瑞克隆到pUC57载体中，分别获得pAntis15-H，pAntis15-L克隆载体；

具体的，为了提供外援蛋白在植物中的高效表达，本发明将人Antis15抗体重链以及轻链(https://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？dr:D10541)氨基酸序列利用反翻译软件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/)得到核苷酸序列，并将其密码子优化为植物偏好的密码子，由金斯瑞公司(南京，中国)合成。在优化的Antis15抗体重链序列5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入Sacl位点。在Antis15抗体轻链序列5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入SacI位点。并由金斯瑞克隆到pUC57载体中，分别获得pAntis15-H，pAntis15-L克隆载体(图1)。基因片段通过XbaI/Sacl分别从克隆载体中分离，并克隆到双元植物载体pCam35S，分别产生植物表达载体p35S-Antis15-H，p35S-Antis15-L(图2)。

本发明还提供了所述的表达载体在表达Antis15抗体中的应用。

此外，本发明还提供了一种植物作为宿主表达Antis15抗体的方法，将本发明提供的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，提取、分离蛋白质，获得Antis15抗体。

具体的，将两种植物表达载体p35S-Antis15-H，p35S-Antis15-L分别通过用Multiporator(Eppendorf，Hamburg，Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5L YEB(酵母提取物肉汤，5g/L蔗糖，5g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/L MgSO₄，pH7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/L卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加YEB培养基测量OD600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mMMES，10mM MgSO4)中至O.D.600为0.5。

将制备好的含有p35S-Antis15-H，p35S-Antis15-L农杆菌等量混匀至O.D.600为0.5；将培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(Welch Vacuum，Niles，IL，USA)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。

步骤1：抽真空25～45s；

步骤2：保持真空(-95kPa)压力30～60s；

步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；

重复上述步骤2～3次，避光处理4d。

在本发明的一些具体实施方案中，农杆菌具体为根癌土壤杆菌GV3101。

本发明所述克隆pAntis15-H，pAntis15-L基因片段(图1)，并且构建两种双元植物表达载体p35S-Antis15-H，p35S-Antis15-L(图2)，在完成构建体后，用特异性限制酶消化证实基因片段是完整的。渗透后，绝大多数生菜组织在真空浸润过程中淹没，除了坚固的中肋区域外，其余部分均在真空渗透4天后显示淡黄褐色区域。

提取、分离蛋白质具体为：将经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mM KPi，pH7.8；5mM EDTA；10mMβ-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1～2min。将匀浆物调节至pH8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g离心15min以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60min。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15min。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60min，再次在4℃下以10,000g离心15min。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5mL缓冲液(20mM KPi，pH 7.8；2mM EDTA；10mMβ-巯基乙醇)中并在4℃下储存。

SDS-PAGE凝胶电泳具体为：收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5μL)热变性(95℃)加载缓冲液(Biorad，Hercules，CA，USA)在4-12％Bis-TrisPlus SDS-变性凝胶(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)跑电泳。同样，在非变性凝胶电泳中检测抗体的亲和程度。然后用考马斯蓝G250(Biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。

植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。我们用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。重组Antis15抗体经过变性凝胶SDS-PAGE分离我们在泳道中观察到估计分子量大约分别为23kDa以及50kDa(图3A，泳道2)，与商业Antis15抗体跑带大小一致(图3A，泳道3)，符合Antis15抗体轻重链的蛋白大小。而非侵染的生菜提取液当中没有发现条带。在非变性的凝胶电泳中观察到大约150kDa(图3B，泳道2)的条带，证明生菜重组轻重链成功的结合为抗体结构，符合Antis15抗体蛋白分子量(图3B，泳道3，商业Antis15抗体)。基于Bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量大约为1.85mg/g。

将抗Siglec-15单克隆抗体Antis15用在小鼠肿瘤模型中，发现Antis15可成功阻断Siglec-15的免疫抑制作用，进而提高体内抗肿瘤免疫反应。本发明利用生菜来瞬时表达Antis15抗体，在较短的时间内(4d)可产生高含量的蛋白质。生菜是高等植物，可以进行翻译后修饰过程，即表达的蛋白自动具有活性。而且这种方法最大限度地减少了生物安全问题，因为处理过的生菜组织通常是在完全封闭的设施或容器中开发，不存在生物污染问题。生菜不含有植物有毒物质，而且其本身蛋白含量少，利于下游的蛋白纯化。利用生菜系统生产Antis15单克隆抗体，可以大大缩短生产周期和生产成本。

本发明通过实验发现，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台，是一种快速的瞬时表达重组蛋白质的方法。本发明描述的真空农杆菌渗透方法简单，快速，而且可以提高重组蛋白产量。生菜可以通过承受真空压力而增加蛋白质产量，并允许每片叶子更完整的渗透。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产，因此比其他瞬时表达植物，如烟草等更容易获得并且更便宜，并且由于不需要复杂的特殊生产设备，成本可显著降低。综上所述，本发明可以利用生菜系统短时间内大规模生产Antis15单克隆抗体。

本发明提供的植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1植物瞬时表达载体的构建

为了将外源蛋白在植物中的高效表达，将Antis15抗体重链，轻链，(https://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？dr:D10541)氨基酸序列利用反翻译软件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/)得到核苷酸序列，并将其密码子优化为植物偏好的密码子，由金斯瑞公司(南京，中国)合成。在优化的Antis15重链序列5'末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3'末端分别加入SacI位点。在Antis15轻链序列5'末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3'末端分别加入Sacl位点。并由金斯瑞公司克隆到pUC57载体中，分别获得pAntis15-H，pAntis15-L克隆载体(图1A、B)，基因片段通过Xbal/Sacl分别从克隆载体中分离，并克隆到双元植物载体，pCam35S，分别产生植物表达载体p35S-Antis15-H，p35S-Antis15-L(图2)。将两种植物表达载体分别通过用Multiporator(Eppendorf，Hamburg，Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5L YEB(酵母提取物肉汤，5g/L蔗糖，5g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/L MgSO4，pH7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/L卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加YEB培养基测量OD600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mM MES，10mM MgSO₄)中至O.D.600为0.5。

实施例2农杆菌介导的真空渗透

将制备好的含有p35S-Antis15-H以及p35S-Antis15-L农杆菌等量混匀至O.D.600为0.5。将培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(Welch Vacuum，Niles，IL，USA)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60秒。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2至3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4天。

实施例3蛋白质提取和分离

经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mM KPi，pH7.8；5mM EDTA；10m Mβ-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1-2分钟。将匀浆物调节至pH 8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g离心15分钟以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60分钟。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15分钟。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60分钟，再次在4℃下以10,000g离心15分钟。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5mL缓冲液(20mM KPi，pH 7.8；2mM EDTA；10mMβ-巯基乙醇)中并在4℃下储存。

植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。我们用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。

实施例4 SDS-PAGE凝胶电泳

收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5μL)热变性(95℃)加载缓冲液(Biorad，Hercules，CA，USA)在4～12％Bis-Tris Plus SDS-变性凝胶(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)跑电泳。同样，在非变性凝胶电泳中检测抗体的亲和程度。然后用考马斯蓝G250(Biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。重组Antis15抗体经过变性凝胶SDS-PAGE分离我们在泳道中观察到估计分子量大约为23kDa以及50kDa条带(图3A)，符合Antis15抗体轻，重链的蛋白大小。在非变性的凝胶电泳中观察到大约150kDa(图3B)的条带，证明生菜重组轻重链成功的结合为抗体结构，符合Antis15抗体蛋白分子量。基于Bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量大约为1.85mg/g。

实施例5 Antis15对肿瘤活性检测

将MC38-S15+细胞皮下注射至WT C57BL/6小鼠(4×10⁵每只)。用200μgAntis15或对照抗体从第六天开始，每4天4剂量。统计肿瘤直径大小，数据为平均值±标准差。(每组5只小鼠)。P值采用双向方差分析。结果表明Antis15与对照抗体相比可以显著的降低MC38小鼠肿瘤的大小(毫米)。

表1肿瘤大小统计

天数

4

8

12

16

24

28

阴性对照

4.7±0.2

5.5±0.2

5.7±0.4

6.4±1.1*

7.8±1.1**

8.8±1.2**

Antis 15

4.4±0.1

4.5±0.1

4.7±0.1

4.4±0.2

4.8±0.2

5.5±0.7

注：^*示与Antis 15组比较具有显著差异(P＜0.05)；^**示与Antis 15组比较具有极显著差异(P＜0.01)。

实施例6

对照组：利用动物细胞生产Antis15抗体；

实验组1：本发明提供的植物生产Antis15抗体；

实验组2：利用烟叶生产Antis15抗体；

表2 Antis15抗体

^*示与对照组相比P≤0.05；^**示与对照组相比P≤0.01；

^#示与实验组2相比P≤0.05；^##示与实验组2相比P≤0.01；

由表1可知，实验组1与对照组的动物系统相比，本发明提供的生菜瞬时表达Antis15抗体，极显著(P≤0.01)缩短了生产周期，极显著(P≤0.01)提高了蛋白含量，简化了蛋白纯化的难易程度，极显著(P≤0.01)降低了生产成本。

实验组1与实验组2的烟叶系统相比，生菜瞬时表达Antis15抗体，显著(P≤0.05)缩短了生产周期，显著(P≤0.05)提高了蛋白含量，简化了蛋白纯化的难易程度，极显著(P≤0.01)降低了生产成本。

实验组2与对照组相比，烟叶瞬时表达Antis15抗体比动物系统显著(P≤0.05)缩短了生产周期，简化了蛋白纯化的难易程度，显著(P≤0.05)降低了生产成本。综合上述试验结果表明，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台。能够快速瞬时表达重组蛋白质，可以在短时间内大规模生产Antis15单克隆抗体。

本发明利用生菜来瞬时表达抗体，在较短的时间内(4d)可产生高含量的蛋白质。生菜是高等植物，可以进行翻译后修饰过程，即表达的蛋白自动具有活性。而且这种方法最大限度地减少了生物安全问题，因为处理过的生菜组织通常是在完全封闭的设施或容器中开发，不存在生物污染问题。生菜不含有植物有毒物质，而且其本身蛋白含量少，利于下游的蛋白纯化。利用生菜系统生产单克隆抗体，可以大大缩短生产周期和生产成本。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 王跃驹

<120> 植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用

<130> MP1906715

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1335

<212> DNA

<213> Antis15重链(heavy chain of Antis15 )

<400> 1

caggtccaag tgcagcagcc tggggctgaa attgtgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gattggactg attaatccta ccaacggtcg tactaactac 180

aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagggggg 300

gacggggact actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcagcctca 360

acgaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 420

gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccagctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc 600

tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt 660

tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca cctgtggcag gaccgtcagt cttccgcttc 720

cccccaaaac ccaaggacac ccgcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780

gtggatgtga gccacgaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 840

gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc 900

agcgtcctca ccgttgtgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960

tccaacaaag gcctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc 1020

cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtg 1080

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1140

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acacctccca tgctggactc cgacggctcc 1200

ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1260

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1320

tctccgggta aatga 1335

<210> 2

<211> 444

<212> PRT

<213> Antis15重链(heavy chain of Antis15 )

<400> 2

Gln Val Gln Val Gln Gln Pro Gly Ala Glu Ile Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Arg Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Arg Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 3

<211> 659

<212> DNA

<213> Antis15轻链(light chain of Antis15 )

<400> 3

gatattgtga tgacccaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60

atctcctgca ggtctactaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120

ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180

tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 240

agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactcta tgcaacatat agaatatcct 300

tcacgttcgg aggggggacc aagctggaaa aaaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct 360

tcatcttccc gccatctgat gagcagtaga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc 420

agaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat 480

cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca 540

gcagcaccca gacgcagagc aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag 600

tcacccatca gggccagaac tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgttag 659

<210> 4

<211> 219

<212> PRT

<213> Antis15轻链(light chain of Antis15 )

<400> 4

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Ser Met Gln His

85 90 95

Ile Glu Tyr Pro Ser Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Lys Asn

100 105 110

Gly Leu Trp Leu His His Leu Ser Ser Ser Ser Arg His Leu Met Ser

115 120 125

Ser Arg Asn Leu Glu Leu Pro Leu Leu Cys Ala Cys Arg Ile Thr Ser

130 135 140

Ile Pro Glu Arg Pro Lys Tyr Ser Gly Arg Trp Ile Thr Pro Ser Asn

145 150 155 160

Arg Val Thr Pro Arg Arg Val Ser Gln Ser Arg Thr Ala Arg Thr Ala

165 170 175

Pro Thr Ala Ser Ala Ala Pro Arg Arg Arg Ala Lys Gln Thr Thr Arg

180 185 190

Asn Thr Lys Ser Thr Pro Ala Lys Ser Pro Ile Arg Ala Arg Thr Arg

195 200 205

Pro Ser Gln Arg Ala Ser Thr Gly Glu Ser Val

210 215

Claims

1.植物作为宿主在表达Antis 15抗体中的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

2.一种表达载体，其特征在于，包括Antis 15抗体的重链序列或轻链序列以及载体。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述Antis 15抗体的重链序列或轻链序列为氨基酸序列，将Antis 15抗体的重链、Antis 15抗体的轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化Antis 15抗体的重链序列或优化的Antis 15抗体轻链序列。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述优化的Antis 15抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述优化的Antis 15抗体的重链的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示；

所述优化的Antis 15抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述优化的Antis15抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

5.根据权利要求2至4任一项所述的表达载体，其特征在于，所述载体为双元植物载体。

6.根据权利要求2至5任一项所述的表达载体，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：

步骤1：分别将Antis 15抗体重链、Antis 15抗体轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得：

ⅰ.优化的Antis 15抗体的重链序列；

ⅱ.优化的Antis 15抗体的轻链序列；

步骤2：在所述优化的Antis 15抗体的重链序列的5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入Sac I位点；

在所述优化的Antis 15抗体的轻链序列的5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sac I位点；

克隆到pUC57载体中，分别获得pAntis 15-H，pAntis 15-L克隆载体；

步骤3：通过Xbal/Sacl分别从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段，克隆至双元植物载体pCam35S，分别获得表达载体p35S-Antis 15-H，p35S-Antis 15-L。

7.根据权利要求2至6任一项所述的表达载体在表达Antis 15抗体中的应用。

8.一种植物作为宿主表达Antis 15抗体的方法，其特征在于，将如权利要求2至6任一项所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，提取、分离蛋白质，获得Antis 15抗体。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：

步骤1：抽真空25～45s；

步骤2：保持真空(-95kPa)压力30～60s；

步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；

重复上述步骤2～3次，避光处理4d。