CN110684118B - 一种靶向cd19的t细胞抗原耦合器及其表达载体和应用 - Google Patents

一种靶向cd19的t细胞抗原耦合器及其表达载体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向CD19的T细胞抗原耦合器及其表达载体和应用，属于肿瘤免疫药物领域。所述靶向CD19的T细胞抗原耦合器，包括：依次连接的信号肽、靶向CD19的单链抗体、连接序列、靶向CD3的单链抗体、突变的CD8α铰链区、CD8α跨膜区、胞内区、P2A连接肽、IL2信号肽和抗PD1单链抗体分泌区，信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，靶向CD19的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，连接序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，突变的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。该靶向CD19的T细胞抗原耦合器能降低T细胞治疗过程中产生的细胞因子风暴，同时分泌抗PD‑1的单链抗体，从而封闭PD‑1：PD‑L1/PD‑L2之间的免疫抑制信号。

Description

一种靶向CD19的T细胞抗原耦合器及其表达载体和应用
技术领域
本发明涉及肿瘤免疫药物领域，特别涉及一种靶向CD19的T细胞抗原耦合器及其表达载体和应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，据不完全统计，目前中国的恶性肿瘤年发病病例达到400多万例，其中淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤等血液肿瘤的发病率居高不下。嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)技术是近些年发展非常迅速的一种细胞治疗技术，用于治疗恶性肿瘤。目前，虽然CAR-T细胞可以有效的杀死肿瘤细胞，但同时也带来了细胞因子风暴的不良反应，严重时可导致患者死亡。因此，亟需一种安全的T细胞受体用于治疗恶性肿瘤。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种靶向CD19的T细胞抗原耦合器及其表达载体和应用。所述技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种靶向CD19的T细胞抗原耦合器，包括：依次连接的信号肽、靶向CD19的单链抗体、连接序列、靶向CD3的单链抗体、突变的CD8α铰链区、CD8α跨膜区、胞内区和抗PD1单链抗体分泌区，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述靶向CD19的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述连接序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述突变的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，所述CD8α跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述胞内区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，所述P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，所述IL2信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：8所示，所述抗PD1单链抗体分泌区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：9所示。
具体地，所述靶向CD3的单链抗体为UCHT1、OKT3、L2K或F6A。
优选地，所述靶向CD3的单链抗体为UCHT1，所述靶向CD3的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。
另一方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括载体和上述T细胞抗原耦合器。
具体地，所述载体为慢病毒载体。
又一方面，本发明提供了一种上述靶向CD19的T细胞抗原耦合器的应用，所述应用包括：将所述靶向CD19的T细胞抗原耦合器作为抗肿瘤药物。
具体地，所述肿瘤包括：急性淋巴细胞白血病、慢性B-淋巴细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明提供了一种靶向CD19的T细胞抗原耦合器，其信号传导更接近天然TCR复合体，并能降低T细胞治疗过程中产生的细胞因子风暴，同时，该T细胞抗原耦合器(T cell antigen coupler，TAC)构建的T细胞可发挥更强的抗肿瘤效果，从而展现出良好的应用前景。此外，该靶向CD19的T细胞抗原耦合器还能够分泌抗PD-1的单链抗体，从而封闭PD-1：PD-L1/PD-L2之间的免疫抑制信号，减少T细胞抑制信号。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例一提供的靶向CD19的T细胞抗原耦合器的结构示意图；
图2是本发明实施例二提供的慢病毒转染效率图；
图3是本发明实施例二提供的细胞因子IFNγ分泌量的对比图，其中T为不表达TAC的T细胞；
图4是本发明实施例二提供的细胞因子IL-2分泌量的对比图，其中T为不表达TAC的T细胞；
图5为本发明实施例二提供的细胞杀伤效率对比图，其中，A为本发明实施例提供的靶向CD19的T细胞抗原耦合器构建的TAC-T细胞对Raji细胞的杀伤能力，B为不含TAC结构的T细胞对Raji细胞的杀伤能力，横坐标为效应细胞与靶细胞的个数比，纵坐标为细胞杀伤效率，单位为％。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例一
本发明提供了一种靶向CD19的T细胞抗原耦合器，包括：依次连接的信号肽(人CD8α信号区，CD8 α leader)、靶向CD19的单链抗体(aCD19)、连接序列(L)、靶向CD3的单链抗体、突变的CD8α铰链区(164位和181位半胱氨酸突变为丝氨酸的人CD8α铰链区)、CD8α跨膜区(人CD8α跨膜区)、胞内区、P2A连接肽、IL2信号肽和抗PD1单链抗体分泌区，信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，靶向CD19的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQID NO：2所示，连接序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，突变的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，CD8α跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：5所示，胞内区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，IL2信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：8所示，抗PD1单链抗体分泌区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：9所示。
具体地，靶向CD3的单链抗体可以为UCHT1、OKT3、L2K或F6A。
优选地，靶向CD3的单链抗体可以为UCHT1，在本实施例中，靶向CD3的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。
在本实施例中，抗PD1单链抗体分泌区包括：重链可变区VH和轻链可变区VL。重链可变区VH和轻链可变区VL之间通过柔性序列连接，柔性序列可以为连接肽(G4S)3，具体地，抗PD1单链抗体分泌区的结构为重链可变区VH、连接肽(G4S)3和轻链可变区VL。
从NCBI网站数据库搜索到人CD8α信号区、人CD8α铰链区、人CD8α跨膜区和胞内区基因序列信息，靶向CD19的单链抗体(aCD3)的克隆号为FMC 63，抗PD1单链抗体分泌区(αPD1 scFV)的重链可变区VH、连接肽(G4S)3和轻链可变区VL序列可在网站http：//sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，在保证编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。该靶向CD19的T细胞抗原耦合器的结构如图1所示，基因全合成T细胞抗原耦合器基因序列，结构为CD8 α leader-aCD19-L-aCD3-CD8 α hinge-CD8α transmembrane-CD8αintra cellular-P2A-IL2-αPD1，图1中，CD8 α hinge包括突变的CD8α铰链区和CD8α跨膜区，标记为CD19-TAC。
该T细胞抗原耦合器的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：11所示，相应地，该T细胞抗原耦合器的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：12所示。
实施例二
本发明提供了一种表达载体，表达载体包括载体和T细胞抗原耦合器。载体可以为慢病毒载体。
下面简单介绍一下该表达载体的制备方法，具体如下：
通过PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增并获得CD19-TAC基因序列，在CD19-TAC基因序列的两端分别添加酶切位点Xba I和酶切位点EcoR I，得到待酶切物，将其与慢病毒载体质粒pCDH-EF1-MCS-T2A-c opGFP分别进行Xba I和EcoR I的双酶切反应，得到含有CD19-TAC的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段。酶切反应条件为：酶切温度为37℃，酶切时间为30min。酶切体系(总体积50μL)包括：5μL的10×buf fer；5μg的待酶切物的DNA；2μL的XbaI酶；2μL的EcoRI酶；用去离子水将酶切体系的体积补至50μL。
将含有CD19-TAC的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段分别利用浓度为1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后分别将含有CD19-TAC的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段的条带切下，并分别放在两个洁净的EP管中，然后将琼脂糖凝胶中的DNA纯化回收，得到CD19-TAC酶切产物和pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物。
将得到的CD19-TAC酶切产物和pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物在16℃下过夜连接，得到连接产物pCDH-EF1-CD19TAC-T2A-copGFP，即表达载体。其中，总体积为10μL的连接体系包括：1μL的pCDH-EF1-MCS-T2A-copG FP酶切产物、7μL的CD19-TAC酶切产物、1μL的T4 DNA连接酶和1μL的10×T4 DNA连接酶Buffer。
将连接产物转入Stbl3感受态细胞(购置于TRANSGEN BIOTECH)中，具体方法如下：
取出保存在-80℃冰箱中的Stbl3感受态细胞，并置于冰上解冻。将连接产物加入Stbl3感受态细胞中，冰浴30min后，于42℃下热击45s，然后再冰浴2min，得到转化产物。
将转化产物加入900μL未添加抗生素的液体LB培养基中，于37℃下摇床的转速为200rpm，发酵培养45min，得到发酵液。未添加抗生素的液体LB培养基的制备方法包括：取5g进口酵母提取物、10g进口蛋白胨、10g无水氯化钠和1L无菌水混匀后，经121℃灭菌20min后使用。
将发酵液经过4000rpm离心5min，弃去上清液，保留沉淀物，将沉淀物采用100μL的液体LB培养基进行重悬，得到重悬液。
将重悬液涂抹至Amp抗性的固体LB平板培养基(购自上海科玛嘉微生物技术有限公司)上，将固体LB平板培养基置于37℃的细菌培养箱中，过夜培养。
在固体LB平板培养基上挑取阳性克隆。
鉴定得到的阳性克隆，具体方法如下：
将得到的阳性克隆经Xba I和EcoR I双酶切反应，具体操作参见上述待酶切物的双酶切反应，将由阳性克隆获得的酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定目标片段，获得了大小约为3000bp的目标片段。经测序鉴定可知该目标序列为CD19-TAC基因序列。
提取质粒：将测序正确的阳性克隆制备成原始菌液接种至100mL的Amp抗性的液体LB培养基中，于37℃下，摇床转速为200rpm，进行过夜培养，得到原始菌发酵液。
将原始菌发酵液经过4000rpm离心10min，弃去上清液，保留沉淀物(菌体)。
采用无内毒素质粒大提试剂盒(购自天根公司)提取菌体的质粒，具体方法按照该试剂盒的说明书进行。
慢病毒载体质粒包装：在转染前6h，以每皿约8.5×106个细胞将293T细胞接种至直径为10cm的培养皿中。确保转染时细胞的汇合度在80％左右，且均匀分布于培养皿中。
制备溶液A和溶液B，其中，溶液A包括：4mL的2×HEPES buffer缓冲液(8个培养皿一起包装的量)，溶液B包括：72ug质粒(target plasmid)、37.04ug包装质粒PLP1、34.8ug包装质粒PLP2、24.08ug包装质粒PLP-VSVG和400μL 2.5M钙离子溶液，溶液B的总体积为4mL。充分混匀溶液B，轻轻涡旋溶液A的同时，向溶液A中逐滴加入溶液B，静置3～5min，得到混合液。轻轻涡旋混合液，将混合液逐滴加入含293T细胞的培养皿上，每个培养皿中加入1mL该混合液，轻轻前后晃动培养皿使混合液均匀分布在培养皿的表面(注意晃动时不要旋转培养皿)，将培养皿放置于37℃培养箱中培养。培养12h后，更换新鲜的培养基，继续培养。培养48h后，将培养基经过1500rpm/min离心5min后保留上清液，收集含慢病毒载体质粒的上清液，将上清液用规格为0.45μm的滤膜过滤，得到含慢病毒载体质粒的滤液。
将含慢病毒载体质粒的滤液转移至超速离心管中，在超速离心管的底部小心地铺上一层浓度为20％的蔗糖(每8mL含慢病毒载体质粒的滤液加1mL蔗糖)。以PBS(phosphatebuffer saline，磷酸缓冲盐溶液)平衡超速离心管，在4℃下于27600rpm/min离心2h，小心取出超速离心管，倒掉上清液，倒置该超速离心管去掉残余上清液，保留沉淀物。向超速离心管中加入150μLPBS，使用微量移液枪在超速离心管的底部轻轻吹打几次，使沉淀物溶解在PBS中，得到浓缩的慢病毒(T细胞抗原耦合器的基因质粒载体)，在实现时可将浓缩的慢病毒分装于离心管，置于-80℃保存。
慢病毒滴度检测：取浓缩的慢病毒0.5μL、5μL和50μL分别感染293T细胞(1×105个/孔)24h，24h后换液，72h后提取细胞基因组DNA，并将基因组DNA浓度稀释至5～100ng/μL。采用TransLvTM Lentivirus qPCR Titration Kit(购自TransGen)，具体方法按照其说明书进行。经检测可知该慢病毒滴度为3.6×108TU/mL。
制备T细胞抗原耦合器的T细胞(TAC-T)，具体方法如下：
PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell，外周血单个核细胞)的制备：采集志愿者20mL外周血，将外周血加入至含有肝素的50mL离心管中，经过2000rpm离心10min，将上层血浆转移至新的离心管内冻存。向离心管中加入与沉淀等体积的37℃预热的生理盐水，充分混匀，进行血细胞沉淀重悬，得到重悬细胞液。另取一只50mL离心管，加入20mL预温的淋巴细胞分离液。将20mL重悬细胞液缓慢的加至淋巴细胞分离液的上层。于800rpm离心20min。匀速吸去上层血浆，当血浆距白膜层2～3cm时停止吸去血浆，然后快速吸去白膜层细胞，并转移至另一新的50mL离心管中，用生理盐水将其体积补充至45mL，于1200rpm离心5min，重复2次，用于清洗细胞。使用RPMI1640+浓度为10％的FBS培养基重悬细胞沉淀，并计算T细胞数量。在本实施例中，T细胞数量为1.2×107个。
慢病毒转染人的T细胞：在本实施例中，将T细胞密度调整到1×106/mL，将T细胞按照1mL/孔接种到抗人50ng/mL CD3抗体和50ng/mL CD28抗体中，再加入200IU/mL的白细胞介素2，刺激培养48h。T细胞活化培养两天后，将慢病毒以MOI＝5的感染系数进行转染，并添加8μg/mL的polybrene，于37℃培养培养箱中培养。转染24h后，更换培养基，并持续观察细胞生长状况，培养时间为8～13天。得到转染的CAR-T细胞。
慢病毒转染效率检测：转染完成后，定时使用倒置荧光显微镜下观察转染细胞。吸取转染的TAC-T细胞，于1000rpm离心5min收集沉淀物，将沉淀物用PBS溶液洗涤。使用流式细胞仪FITC通道检测转染的TAC-T细胞的表达GFP荧光的细胞比例。其转染效率如图2所示。
TAC-T细胞的细胞因子分泌检测，具体如下：
为了检测经过慢病毒转染后的TAC-T细胞是否被有效激活，本实施例采用TAC-T细胞分别与不表达TAC的T细胞共培养后通过ELISA试剂盒检测细胞因子IFNγ和细胞因子IL-2的分泌量。具体地，分别将每孔1×106个TAC-T细胞和每孔1×105个靶细胞接种至6孔板中，于37℃、浓度为5％的CO2中培养24h。吸取培养的上清液，于1000rpm离心5min去除细胞沉淀，收获培养上清液。按照ELISA剂盒说明书检测培养上清液中的细胞因子IFNγ和细胞因子IL-2。如图3和图4所示，图3为细胞因子IL-2分泌量的对比图，图4为细胞因子IFNγ分泌量的对比图。结合图3和图4可知，本发明实施例提供的TAC-T细胞分泌的细胞因子IFNγ和细胞因子IL-2均增加，同时，可知该经过慢病毒转染后的TAC-T细胞已经被有效激活。
体外抗肿瘤效果：①组：在96孔板中取其中40个孔并分成八个小组，每个小组设置五个复孔，第一组中均只加入200μL培养基(记作Ab)，第二组中均加入100μL培养基和100μL1×104个靶细胞(记作Ack)，第三组中均加入100μL培养基和100μL 1×104个效应细胞(记作Acn)，第四组中均加入100μL 1×104个靶细胞和100μL 1×104个效应细胞(记作As，效应细胞个数∶靶细胞个数＝1∶1)，第五组中均加入100μL培养基和100μL 5×104个效应细胞(记作Acn)，第六组中均加入100μL 1×104个靶细胞和100μL 5×104个效应细胞(记作As，效应细胞个数∶靶细胞个数＝5∶1)，第七组中均加入100μL培养基和100μL 1×105个效应细胞(记作Acn)，第八组中均加入100μL 1×104个靶细胞和100μL 1×105个效应细胞(记作As，效应细胞个数∶靶细胞个数＝10∶1)。①组靶细胞为含CD19靶蛋白的Raji，效应细胞为转染TAC结构的TAC-T细胞。
②组：将96孔板另外的40个孔分成八个小组，每个小组设置五个复孔，分组方法与①组相同，且②组的靶细胞为含CD19靶蛋白的Raji，效应细胞为未转染的T细胞。
将96孔板孵育4h后每孔加入20uL的CCK-8溶液，将96孔板在培养箱内再孵育2h。用酶标仪在450nm处测定吸光度。根据吸光度分别计算①组和②组的细胞杀伤效率＝[1-(As-Acn)/(Ack-Ab)]×100％，式中，As为试验孔(含有靶细胞的培养基、效应细胞和CCK-8)，Ack为靶细胞对照孔(含有靶细胞的培养基和CCK-8溶液)，Acn为效应细胞对照孔(含有效应细胞的培养基、CCK-8溶液)，Ab为空白对照(不含细胞的培养基和CCK-8溶液)。图5为本发明实施例提供的细胞杀伤效率对比图，如图5所示，CD19 TAC-T细胞对Raji细胞杀伤能力明显优于不合TAC结构的T细胞。由此可见，本发明实施例提供的表达载体具有良好的抗肿瘤效果。
又一方面，本发明提供了一种上述靶向CD19的T细胞抗原耦合器的应用，应用包括：将靶向CD19的T细胞抗原耦合器作为抗肿瘤药物。
具体地，肿瘤可以包括：急性淋巴细胞白血病、慢性B-淋巴细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
本发明提供了一种靶向CD19的T细胞抗原耦合器，其信号传导更接近天然TCR复合体，并能降低T细胞治疗过程中产生的细胞因子风暴，同时，该T细胞抗原耦合器构建的TAC(T cell antigen coupler)-T细胞可发挥更强的抗肿瘤效果，从而展现出良好的应用前景。此外，该靶向CD19的T细胞抗原耦合器还能够减少T细胞抑制信号。
在实现时，靶向CD3的单链抗体可以连接到内源性天然T细胞受体(TCR)，使该T细胞抗原耦合器能更接近于天然TCR复合体并发挥功能。连接序列为EAAAK重复序列连接，这类连接序列自身能够形成α螺旋，可有效隔开两个结构域，并在中间形成相对稳定的二级结构，从而在一定程度上减少被蛋白酶攻击的可能性，这对保持靶向CD19的单链抗体和靶向CD3的单链抗体的功能非常重要。突变的CD8α铰链区能够使靶向CD19的T细胞抗原耦合器更稳定。CD8α跨膜区和胞内区能够使靶向CD19的T细胞抗原耦合器锚定在T细胞表面的同时提供共受体结构域。抗PD1单链抗体分泌区能够阻断PD1与PD-L1的结合，阻断负向调控信号，封闭PD-1：PD-L1/PD-L2之间的免疫抑制信号，使T细胞恢复活性，从而增强免疫应答。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002230892090000101
Figure BDA0002230892090000111
Figure BDA0002230892090000121
Figure BDA0002230892090000131
Figure BDA0002230892090000141
Figure BDA0002230892090000151
Figure BDA0002230892090000161
Figure BDA0002230892090000171
Figure BDA0002230892090000181
Figure BDA0002230892090000191
Figure BDA0002230892090000201
序列表
<110> 华夏源(上海)细胞基因工程股份有限公司
<120> 一种靶向CD19 的T细胞抗原耦合器及其表达载体和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 2
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300
gggactaagt tggaaataac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360
ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420
tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480
cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540
tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600
ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660
tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 720
tcctca 726
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaagccgccg caaaggaagc tgctgccaaa gaagcagccg ctaag 45
<210> 4
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcggccgcat tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 60
ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtcc 120
cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctc tgatatctac 180
atctgggcg 189
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaac 60
<210> 6
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cacaggaacc gaagacgtgt ttgcaaatgt ccccggcctg tggtcaaatc gggagacaag 60
cccagccttt cggcgagata cgtc 84
<210> 7
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60
<210> 9
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caagtccaat tggtggagtc tggcggtggg gtagttcagc ccggccgatc cctgcgcctg 60
gactgcaaag cttctggaat tacgttctca aactccggaa tgcactgggt gcggcaagca 120
cctgggaaag ggctggagtg ggttgcggtg atttggtacg atggctctaa gaggtactac 180
gcagacagcg ttaaaggcag atttactata tcccgagata actctaaaaa tacgctcttc 240
ctccaaatga atagcctgag ggcagaagac acagccgttt actattgtgc taccaatgat 300
gattactggg gacagggcac cctggttacc gtaagttccg gcggtggtgg aagtggagga 360
gggggatccg gaggcggggg ttctgagatc gtcctgaccc agtctccagc cactctctcc 420
ctgtctccag gcgagcgcgc tacactgagt tgtagagctt cccagtccgt gagcagctat 480
ctggcctggt atcagcagaa gcctgggcag gctccacggt tgctgattta tgacgcctcc 540
aaccgcgcga ctgggatacc agctaggttt tccggatcag gcagcggcac tgattttaca 600
ctgaccatct catctctcga gccggaagat ttcgccgttt actattgtca acagagttca 660
aactggccac ggacattcgg tcaggggacc aaggttgaaa ttaag 705
<210> 10
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggcta ctcctttacc ggctacacta tgaactgggt gcgtcaggcc 120
ccaggtaagg gcctggaatg ggttgcactg attaatcctt ataaaggtgt tagtacctat 180
aaccagaagt tcaaggaccg tttcactata agcgtagata aatccaaaaa cacagcctac 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac actgccgtct attattgtgc tagaagcgga 300
tactacggcg atagtgactg gtattttgac gtctggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctcgggcg gcgggggttc tggtggcggc ggcagcggcg gtggaggatc agatatccag 420
atgacccagt ccccgagctc cctgtccgcc tctgtgggcg atagggtcac catcacctgc 480
cgtgccagtc aggacatccg taattatctg aactggtatc aacagaaacc aggaaaagct 540
ccgaaactac tgatttacta tacctcccgc ctggagtctg gagtcccttc tcgcttctct 600
ggttctggtt ctgggacgga ttacactctg accatcagca gtctgcaacc ggaagacttc 660
gcaacttatt actgtcagca aggtaatact ctgccgtgga cgttcggaca gggcaccaag 720
gtggagatca aacgaact 738
<210> 11
<211> 2736
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacta agttggaaat aacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480
ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540
cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600
tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720
cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 780
gtctcctcag aagccgccgc aaaggaagct gctgccaaag aagcagccgc taaggaggtt 840
cagctggtgg agtctggcgg tggcctggtg cagccagggg gctcactccg tttgtcctgt 900
gcagcttctg gctactcctt taccggctac actatgaact gggtgcgtca ggccccaggt 960
aagggcctgg aatgggttgc actgattaat ccttataaag gtgttagtac ctataaccag 1020
aagttcaagg accgtttcac tataagcgta gataaatcca aaaacacagc ctacctgcaa 1080
atgaacagcc tgcgtgctga ggacactgcc gtctattatt gtgctagaag cggatactac 1140
ggcgatagtg actggtattt tgacgtctgg ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctcg 1200
ggcggcgggg gttctggtgg cggcggcagc ggcggtggag gatcagatat ccagatgacc 1260
cagtccccga gctccctgtc cgcctctgtg ggcgataggg tcaccatcac ctgccgtgcc 1320
agtcaggaca tccgtaatta tctgaactgg tatcaacaga aaccaggaaa agctccgaaa 1380
ctactgattt actatacctc ccgcctggag tctggagtcc cttctcgctt ctctggttct 1440
ggttctggga cggattacac tctgaccatc agcagtctgc aaccggaaga cttcgcaact 1500
tattactgtc agcaaggtaa tactctgccg tggacgttcg gacagggcac caaggtggag 1560
atcaaacgaa ctgcggccgc attcgtgccg gtcttcctgc cagcgaagcc caccacgacg 1620
ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc 1680
ccagaggcgt cccggccagc ggcggggggc gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc 1740
tctgatatct acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg 1800
gttatcaccc tttactgcaa ccacaggaac cgaagacgtg tttgcaaatg tccccggcct 1860
gtggtcaaat cgggagacaa gcccagcctt tcggcgagat acgtcggaag cggagctact 1920
aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac gtggaggaga accctggacc tatgtacagg 1980
atgcaactcc tgtcttgcat tgcactaagt cttgcacttg tcacaaacag tcaagtccaa 2040
ttggtggagt ctggcggtgg ggtagttcag cccggccgat ccctgcgcct ggactgcaaa 2100
gcttctggaa ttacgttctc aaactccgga atgcactggg tgcggcaagc acctgggaaa 2160
gggctggagt gggttgcggt gatttggtac gatggctcta agaggtacta cgcagacagc 2220
gttaaaggca gatttactat atcccgagat aactctaaaa atacgctctt cctccaaatg 2280
aatagcctga gggcagaaga cacagccgtt tactattgtg ctaccaatga tgattactgg 2340
ggacagggca ccctggttac cgtaagttcc ggcggtggtg gaagtggagg agggggatcc 2400
ggaggcgggg gttctgagat cgtcctgacc cagtctccag ccactctctc cctgtctcca 2460
ggcgagcgcg ctacactgag ttgtagagct tcccagtccg tgagcagcta tctggcctgg 2520
tatcagcaga agcctgggca ggctccacgg ttgctgattt atgacgcctc caaccgcgcg 2580
actgggatac cagctaggtt ttccggatca ggcagcggca ctgattttac actgaccatc 2640
tcatctctcg agccggaaga tttcgccgtt tactattgtc aacagagttc aaactggcca 2700
cggacattcg gtcaggggac caaggttgaa attaag 2736
<210> 12
<211> 912
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Ala Pro Ala Ile Gly Met Thr Gly Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Ala Ala Val Thr Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Ala Ile Ser Leu Thr Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Ala Gly Thr
50 55 60
Val Leu Leu Leu Ile Thr His Thr Ser Ala Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Thr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ala Leu Gly Gly Gly Ala Ile Ala Thr Thr Pro Cys Gly Gly Gly
100 105 110
Ala Thr Leu Pro Thr Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Val Leu Leu Gly Gly Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Ala Thr Gly
165 170 175
Val Ser Thr Ile Ala Gly Pro Pro Ala Leu Gly Leu Gly Thr Leu Gly
180 185 190
Val Ile Thr Gly Ser Gly Thr Thr Thr Thr Ala Ser Ala Leu Leu Ser
195 200 205
Ala Leu Thr Ile Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ser Gly Val Pro Leu Leu
210 215 220
Met Ala Ser Leu Gly Thr Ala Ala Thr Ala Ile Thr Thr Cys Ala Leu
225 230 235 240
His Thr Thr Thr Gly Gly Ser Thr Ala Met Ala Thr Thr Gly Gly Gly
245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Ala Ala Ala Leu Gly Ala Ala Ala
260 265 270
Leu Gly Ala Ala Ala Leu Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly
275 280 285
Leu Val Gly Pro Gly Gly Ser Leu Ala Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
290 295 300
Thr Ser Pro Thr Gly Thr Thr Met Ala Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly
305 310 315 320
Leu Gly Leu Gly Thr Val Ala Leu Ile Ala Pro Thr Leu Gly Val Ser
325 330 335
Thr Thr Ala Gly Leu Pro Leu Ala Ala Pro Thr Ile Ser Val Ala Leu
340 345 350
Ser Leu Ala Thr Ala Thr Leu Gly Met Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala
355 360 365
Thr Ala Val Thr Thr Cys Ala Ala Ser Gly Thr Thr Gly Ala Ser Ala
370 375 380
Thr Thr Pro Ala Val Thr Gly Gly Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
385 390 395 400
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
405 410 415
Ile Gly Met Thr Gly Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Ala
420 425 430
Ala Val Thr Ile Thr Cys Ala Ala Ser Gly Ala Ile Ala Ala Thr Leu
435 440 445
Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly Leu Ala Pro Leu Leu Leu Ile Thr
450 455 460
Thr Thr Ser Ala Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser Ala Pro Ser Gly Ser
465 470 475 480
Gly Ser Gly Thr Ala Thr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gly Pro Gly
485 490 495
Ala Pro Ala Thr Thr Thr Cys Gly Gly Gly Ala Thr Leu Pro Thr Thr
500 505 510
Pro Gly Gly Gly Thr Leu Val Gly Ile Leu Ala Thr Ala Ala Ala Pro
515 520 525
Val Pro Val Pro Leu Pro Ala Leu Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Ala
530 535 540
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gly Pro Leu Ser Leu Ala
545 550 555 560
Pro Gly Ala Ser Ala Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Ala Gly
565 570 575
Leu Ala Pro Ala Ser Ala Ile Thr Ile Thr Ala Pro Leu Ala Gly Thr
580 585 590
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Thr Cys Ala His
595 600 605
Ala Ala Ala Ala Ala Val Cys Leu Cys Pro Ala Pro Val Val Leu Ser
610 615 620
Gly Ala Leu Pro Ser Leu Ser Ala Ala Thr Val Gly Ser Gly Ala Thr
625 630 635 640
Ala Pro Ser Leu Leu Leu Gly Ala Gly Ala Val Gly Gly Ala Pro Gly
645 650 655
Pro Met Thr Ala Met Gly Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala
660 665 670
Leu Val Thr Ala Ser Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Val
675 680 685
Val Gly Pro Gly Ala Ser Leu Ala Leu Ala Cys Leu Ala Ser Gly Ile
690 695 700
Thr Pro Ser Ala Ser Gly Met His Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu
705 710 715 720
Gly Leu Gly Thr Val Ala Val Ile Thr Thr Ala Gly Ser Leu Ala Thr
725 730 735
Thr Ala Ala Ser Val Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala Ser
740 745 750
Leu Ala Thr Leu Pro Leu Gly Met Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala Thr
755 760 765
Ala Val Thr Thr Cys Ala Thr Ala Ala Ala Thr Thr Gly Gly Gly Thr
770 775 780
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
785 790 795 800
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Pro Ala Thr Leu
805 810 815
Ser Leu Ser Pro Gly Gly Ala Ala Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
820 825 830
Ser Val Ser Ser Thr Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly Gly Ala
835 840 845
Pro Ala Leu Leu Ile Thr Ala Ala Ser Ala Ala Ala Thr Gly Ile Pro
850 855 860
Ala Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Thr Ile
865 870 875 880
Ser Ser Leu Gly Pro Gly Ala Pro Ala Val Thr Thr Cys Gly Gly Ser
885 890 895
Ser Ala Thr Pro Ala Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Val Gly Ile Leu
900 905 910

Claims (5)

1.一种靶向CD19的T细胞抗原耦合器，其特征在于，包括：依次连接的信号肽、靶向CD19的单链抗体、连接序列、靶向CD3的单链抗体、突变的CD8α铰链区、CD8α跨膜区、胞内区、P2A连接肽、IL2信号肽和抗PD1单链抗体分泌区，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，所述靶向CD19的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示，所述连接序列的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：3所示，所述突变的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：4所示，所述CD8α跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：5所示，所述胞内区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：6所示，所述P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：7所示，所述IL2信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：8所示，所述抗PD1单链抗体分泌区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：9所示，所述靶向CD3的单链抗体为UCHT1，所述靶向CD3的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：10所示。
2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括载体和如权利要求1所述的T细胞抗原耦合器。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述载体为慢病毒载体。
4.一种如权利要求1所述的靶向CD19的T细胞抗原耦合器在制备药物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述靶向CD19的T细胞抗原耦合器作为抗肿瘤药物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括：急性淋巴细胞白血病、慢性B-淋巴细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
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