CN110684119B

CN110684119B - 一种靶向her2的嵌合抗原受体及其表达载体和应用

Info

Publication number: CN110684119B
Application number: CN201910967261.3A
Authority: CN
Inventors: 张坤
Original assignee: Sinoneural Shanghai Cell And Gene Engineering Holdings Co ltd
Current assignee: Huaxiayuan Cell Engineering Group Co ltd
Priority date: 2019-10-12
Filing date: 2019-10-12
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2039-10-12
Also published as: CN110684119A

Abstract

本发明公开了一种靶向HER2的嵌合抗原受体及其表达载体和应用，属于肿瘤免疫药物领域。靶向HER2的嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向HER2的单链抗体、加长CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子、胞内信号肽、P2A连接肽、IL2信号肽和抗PD1单链抗体分泌区，信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，靶向HER2的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，加长CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，胞内信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，IL2信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：7所示。该嵌合抗原受体在具备高抗肿瘤活性的同时产生更少的细胞因子。

Description

一种靶向HER2的嵌合抗原受体及其表达载体和应用

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫药物领域，特别涉及一种靶向HER2的嵌合抗原受体及其表达载体和应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，其中，乳腺癌是影响女性健康最常见的恶性肿瘤之一，其中HER2阳性乳腺癌患者占乳腺癌患者总数的15%~30%。

嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor，CAR）技术是近些年发展非常迅速的一种细胞治疗技术，用于治疗HER2阳性乳腺癌。目前，虽然CAR-T细胞可以有效的杀死HER2阳性乳腺癌，但同时也带来了细胞因子风暴的不良反应，严重时可导致患者死亡。因此，亟需一种安全的嵌合抗原受体用于治疗HER2阳性乳腺癌。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种靶向HER2的嵌合抗原受体及其表达载体和应用。所述技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种靶向HER2的嵌合抗原受体，包括：依次连接的信号肽、靶向HER2的单链抗体、加长CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子、胞内信号肽、P2A连接肽、IL2信号肽和抗PD1单链抗体分泌区，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述靶向HER2的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述加长CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQID NO:4所示，所述胞内信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，所述P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，所述IL2信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQID NO:7所示，所述抗PD1单链抗体分泌区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。

具体地，所述共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。

进一步地，所述共刺激因子为4-1BB，且所述共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示。

另一方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括载体和上述嵌合体抗原受体。

具体地，所述载体为慢病毒载体。

又一方面，本发明提供了一种上述嵌合体抗原受体的应用，所述应用包括：将所述嵌合体抗原受体作为抗乳腺癌药物。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一种靶向HER2的嵌合抗原受体及其表达载体和应用，靶向HER2的嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向HER2的单链抗体、加长CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子、胞内信号肽、P2A连接肽、IL2信号肽和抗PD1单链抗体分泌区，该嵌合抗原受体在具备高抗肿瘤活性的同时产生更少的细胞因子，为开发新型的CAR免疫细胞疗法提供了新思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例一提供的靶向HER2的嵌合抗原受体的结构示意图；

图2是本发明实施例二提供的慢病毒转染效率图；

图3是本发明实施例二提供的细胞因子IFNγ分泌量的对比图，其中，CAR-T为转染CAR结构的CAR-T细胞，T为未转染的T细胞；

图4是本发明实施例二提供的细胞因子IL-2分泌量的对比图，其中，CAR-T为转染CAR结构的CAR-T细胞，T为未转染的T细胞；

图5是本发明实施例二提供的CART01与CART02的IL-2分泌对比图；

图6是本发明实施例二提供的CART01与CART02的IFNγ分泌对比图；

图7是本发明实施例二提供的CART01与CART02的TNFα分泌对比图；

图8是本发明实施例二提供的CART01与CART02的IL-4分泌对比图；

图9为本发明实施例二提供的细胞杀伤效率对比图，其中，A为本发明实施例提供的靶向HER2的嵌合抗原受体构建的CAR-T细胞对SK-BR-3细胞的杀伤能力，B为未转染的T细胞对SK-BR-3细胞的杀伤能力，横坐标为效应细胞与靶细胞的个数比，纵坐标为细胞杀伤效率，单位为%。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例一

本发明实施例提供了一种靶向HER2的嵌合抗原受体，如图1所示，该嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽（人CD8α信号肽，CD8αleader）、靶向HER2的单链抗体（HER2 scFv）、加长CD8α铰链区（人CD8α铰链区，CD8αHinge）、跨膜区（人CD8α跨膜区，CD8αtransmembrane）、共刺激因子、胞内信号肽（人CD3ζ胞内信号肽，CD3ζsignal）、P2A连接肽、IL2信号肽（IL2 signal）和抗PD1单链抗体分泌区（aPD1 scFv），信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，靶向HER2的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，加长CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，胞内信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，IL2信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:7所示，抗PD1单链抗体分泌区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。

具体地，共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。

进一步地，共刺激因子为4-1BB（4-1BB signal），且共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示。

在本实施例中，靶向HER2的单链抗体包括重链可变区V_H和轻链可变区V_L，重链可变区V_H和轻链可变区V_L采用接头序列连接，接头序列可以为连接肽（G₄S）₃。

从NCBI网站数据库搜索到人CD8α信号肽、人CD8α铰链区、人CD8α跨膜区、4-1BB的胞内区、人CD3ζ胞内信号肽的基因序列信息，靶向HER2的单链抗体和抗PD1单克隆抗体的重链和轻链可变区，这些序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。基因全合成嵌合抗原受体基因序列，结构为CD8αleader-HER2 scFv-CD8αHinge-CD8αtransmembrane-（4-1BB signal）-CD3ζsignal-P2A-IL2 signal -aPD1 scFv，标记为CAR01。

本实施例中，该靶向HER2的嵌合抗原受体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示。相应地，该靶向HER2的嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示。

实施例二

本发明提供了一种表达载体，表达载体包括载体和实施例一提供的嵌合抗原受体。载体可以为慢病毒载体。

下面简单介绍一下该表达载体的制备方法，具体如下：

通过PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）扩增并获得CAR01基因序列，在CAR01基因序列的两端分别添加酶切位点Xba I和酶切位点EcoR I，得到待酶切物，将其与慢病毒载体质粒pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP分别进行Xba I和EcoR I的双酶切反应，得到含有CAR01的酶切片段和含有ppCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段。酶切反应条件为：酶切温度为37℃，酶切时间为30min。酶切体系（总体积50μL）包括：5μL的10×buffer；5μg的待酶切物的DNA；2μL的Xba I酶；2μL的EcoR I酶；用去离子水将酶切体系的体积补至50μL。

将含有CAR01的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段分别利用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后分别将含有CAR01的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段的条带切下，并分别放在两个洁净的EP管中，然后将琼脂糖凝胶中的DNA纯化回收，得到CAR01酶切产物和pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物。

将得到的CAR01酶切产物和pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物在16℃下过夜连接，得到连接产物pCDH-EF1-CAR01-T2A-copGFP，即表达载体。其中，总体积为10μL的连接体系包括：1μL的pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物、7μL的CAR01酶切产物、1μL的T4 DNA连接酶和1μL 的10×T4 DNA连接酶Buffer。

将连接产物转入Stbl3感受态细胞（购买于TRANSGEN BIOTECH）中，具体方法如下：

取出保存在-80℃冰箱中的Stbl3感受态细胞，并置于冰上解冻。将连接产物加入Stbl3感受态细胞中，冰浴30min后，于42℃下热击45s，然后再冰浴2min，得到转化产物。

将转化产物加入900μL未添加抗生素的液体LB培养基中，于37℃下摇床的转速为200rpm，发酵培养45min，得到发酵液。未添加抗生素的液体LB培养基的制备方法包括：取5g进口酵母提取物、10g进口蛋白胨、10g无水氯化钠和1L无菌水混匀后，经121℃灭菌20min后使用。

将发酵液经过4000rpm离心5min，弃去上清液，保留沉淀物，将沉淀物采用100μL的液体LB培养基进行重悬，得到重悬液。

将重悬液涂抹至Amp抗性的固体LB平板培养基（购自上海科玛嘉微生物技术有限公司）上，将固体LB平板培养基置于37℃的细菌培养箱中，过夜培养。

在固体LB平板培养基上挑取阳性克隆。

鉴定得到的阳性克隆，具体方法如下：

将得到的阳性克隆经Xba I和EcoR I双酶切反应，具体操作参见上述待酶切物的双酶切反应，将由阳性克隆获得的酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定目标片段，获得了大小约为2000bp的目标片段。经测序鉴定可知该目标序列为CAR01基因序列。

提取质粒：将测序正确的阳性克隆制备成原始菌液接种至100mL的Amp抗性的液体LB培养基中，于37℃下，摇床转速为200rpm，进行过夜培养，得到原始菌发酵液。

将原始菌发酵液经过4000rpm离心10min，弃去上清液，保留沉淀物（菌体）。

采用无内毒素质粒大提试剂盒（购买于天根公司）提取菌体的质粒，具体方法按照该试剂盒的说明书进行。

慢病毒载体质粒包装：在转染前6h，以每皿约8.5×10⁶个细胞将293T细胞接种至直径为10cm的培养皿中。确保转染时细胞的汇合度在80%左右，且均匀分布于培养皿中。

制备溶液A和溶液B，其中，溶液A包括：4mL的2×HEPES buffer缓冲液（8个培养皿一起包装的量），溶液B包括：72ug质粒（target plasmid）、37.04ug包装质粒PLP1、34.8ug包装质粒PLP2、24.08ug包装质粒PLP-VSVG和400μL 2.5M钙离子溶液，溶液B的总体积为4mL。充分混匀溶液B，轻轻涡旋溶液A的同时，向溶液A中逐滴加入溶液B，静置3~5min，得到混合液。轻轻涡旋混合液，将混合液逐滴加入含293T细胞的培养皿上，每个培养皿中加入1mL该混合液，轻轻前后晃动培养皿使混合液均匀分布在培养皿的表面（注意晃动时不要旋转培养皿），将培养皿放置于37℃培养箱中培养。培养12h后，更换新鲜的培养基，继续培养。培养48h后，将培养基经过1500rpm/min离心5min后保留上清液，收集含慢病毒载体质粒的上清液，将上清液用规格为0.45μm的滤膜过滤，得到含慢病毒载体质粒的滤液。

将含慢病毒载体质粒的滤液转移至超速离心管中，在超速离心管的底部小心地铺上一层浓度为20%的蔗糖（每8mL含慢病毒载体质粒的滤液加1mL蔗糖）。以PBS（phosphatebuffer saline，磷酸缓冲盐溶液）平衡超速离心管，在4℃下于27600rpm/min离心2h，小心取出超速离心管，倒掉上清液，倒置该超速离心管去掉残余上清液，保留沉淀物。向超速离心管中加入150μLPBS，使用微量移液枪在超速离心管的底部轻轻吹打几次，使沉淀物溶解在PBS中，得到浓缩的慢病毒（嵌合抗原受体的基因质粒载体），在实现时可将浓缩的慢病毒分装于离心管，置于-80℃保存。

慢病毒滴度检测：取浓缩的慢病毒 0.5μL、5μL和50μL分别感染293T细胞（1×10⁵个/孔）24h，24h后换液，72h后提取细胞基因组DNA, 并将基因组DNA浓度稀释至5~100ng/μL。采用TransLv ^TM Lentivirus qPCR Titration Kit（购自TransGen），具体方法按照其说明书进行。经检测可知该慢病毒滴度为3.6×10⁸TU/mL。

制备嵌合抗原受体的T细胞，具体方法如下：

PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell，外周血单个核细胞）的制备：采集志愿者20mL外周血，将外周血加入至含有肝素的50mL离心管中，经过2000rpm离心10min，将上层血浆转移至新的离心管内冻存。向离心管中加入与沉淀等体积的37℃预热的生理盐水，充分混匀，进行血细胞沉淀重悬，得到重悬细胞液。另取一只50mL离心管，加入20mL预温的淋巴细胞分离液。将20mL重悬细胞液缓慢的加至淋巴细胞分离液的上层。于800rpm离心20min。匀速吸去上层血浆，当血浆距白膜层2～3cm时停止吸去血浆，然后快速吸去白膜层细胞，并转移至另一新的50mL离心管中，用生理盐水将其体积补充至45mL，于1200rpm离心5min，重复2次，用于清洗细胞。使用RPMI1640+浓度为10%的FBS培养基重悬细胞沉淀，并计算T细胞数量。在本实施例中，T细胞数量为1.2×10⁷个。

慢病毒转染人的T细胞：在本实施例中，将T细胞密度调整到1×10⁶/mL，将T细胞按照1mL/孔接种到抗人50ng/mL CD3抗体和50ng/mL CD28抗体中，再加入200IU/mL的白细胞介素2，刺激培养48h。T细胞活化培养两天后，将慢病毒以MOI=5的感染系数进行转染，并添加8μg/mL的polybrene，于37℃培养培养箱中培养。转染24h后，更换培养基，并持续观察细胞生长状况，培养时间为8~13天。得到转染的CAR-T细胞。

慢病毒转染效率检测：转染完成后，定时使用倒置荧光显微镜下观察转染细胞。吸取转染的CAR-T细胞，于1000rpm离心5min收集沉淀物，将沉淀物用PBS溶液洗涤。使用流式细胞仪FITC通道检测转染的CAR-T细胞的表达GFP荧光的细胞比例。其转染效率如图2所示。

CAR-T细胞的细胞因子分泌检测，具体如下：

为了检测经过慢病毒转染后的CAR-T细胞是否被有效激活，本实施例采用CAR-T细胞分别与不表达CAR的T细胞共培养后通过ELISA试剂盒检测细胞因子IFNγ和细胞因子IL-2的分泌量。具体地，分别将每孔1×10⁶个CAR-T细胞和每孔1×10⁵个靶细胞（含HER2靶蛋白的SK-BR-3细胞）接种至6孔板中，于37℃、浓度为5%的CO₂中培养24h。吸取培养的上清液，于1000rpm离心5min去除细胞沉淀，收获培养上清液。按照ELISA剂盒说明书检测培养上清液中的细胞因子IFNγ和细胞因子IL-2。如图3和图4所示，图3为细胞因子IL-2分泌量的对比图，图4为细胞因子IFNγ分泌量的对比图。结合图3和图4可知，该经过CAR01慢病毒转染后的CAR-T细胞已经被有效激活。

检测不同嵌合抗原受体构建的CAR-T细胞分泌细胞因子的情况，具体操作如下：

将本发明实施例提供的嵌合抗原受体构建的CAR-T细胞记作CART01，将现有技术中常用的嵌合抗原受体（购买于Novartis公司）构建的CAR-T细胞记作CART02，其中，CART02的序列如序列表中SEQ ID NO:12所示，将未转染的T细胞、CART01和CART02分别与含HER2靶蛋白的SK-BR-3细胞（靶细胞）共培养后，并检测IL-2、IFNγ、TNFα和IL-4的分泌情况。具体地，按照每孔1×10⁶个CAR-T细胞和每孔1×10⁵个靶细胞接种至6孔板中，于37℃浓度为5%的CO₂培养箱中培养24h。吸取每个孔内的上清液，于1000rpm离心5min，去除细胞沉淀，得到培养上清液。按照ELISA剂盒说明书的操作方法检测该培养上清液中的IL-2、IFNγ、TNFα和IL-4的分泌量，结果如图5~图8所示。由图5~图8可知，本发明实施例提供的CART01的细胞因子分泌量明显少于CART02的细胞因子分泌量，可见，本发明实施例提供的嵌合抗原受体构建的CAR-T细胞能够有效减少细胞因子分泌。

体外抗肿瘤效果：①组：在96孔板中取其中40个孔并分成八个小组，每个小组设置五个复孔，第一组中均只加入200μL培养基（记作Ab），第二组中均加入100μL培养基和100μL1×10⁴个靶细胞（记作Ack），第三组中均加入100μL培养基和100μL 1×10⁴个效应细胞（记作Acn），第四组中均加入100μL 1×10⁴个靶细胞和100μL 1×10⁴个效应细胞（记作As，效应细胞个数：靶细胞个数=1:1），第五组中均加入100μL培养基和100μL 5×10⁴个效应细胞（记作Acn），第六组中均加入100μL 1×10⁴个靶细胞和100μL 5×10⁴个效应细胞（记作As，效应细胞个数：靶细胞个数=5:1），第七组中均加入100μL培养基和100μL 1×10⁵个效应细胞（记作Acn），第八组中均加入100μL 1×10⁴个靶细胞和100μL 1×10⁵个效应细胞（记作As，效应细胞个数：靶细胞个数=10:1）。①组靶细胞为含HER2靶蛋白的SK-BR-3细胞，效应细胞为转染CAR结构的CAR-T细胞。

②组：将96孔板另外的40个孔分成八个小组，每个小组设置五个复孔，分组方法与①组相同，且②组的靶细胞为含HER2靶蛋白的SK-BR-3细胞，效应细胞为未转染的T细胞（不表达CAR结构的T细胞）。

将96孔板孵育4h后每孔加入20uL的CCK-8溶液，将96孔板在培养箱内再孵育2h。用酶标仪在450nm处测定吸光度。根据吸光度分别计算①组和②组的细胞杀伤效率＝[1-(As-Acn)/(Ack-Ab)]×100%，式中，As为试验孔（含有靶细胞的培养基、效应细胞和CCK-8），Ack为靶细胞对照孔（含有靶细胞的培养基和CCK-8溶液），Acn为效应细胞对照孔（含有效应细胞的培养基、CCK-8溶液），Ab为空白对照（不含细胞的培养基和CCK-8溶液）。图9为本发明实施例提供的细胞杀伤效率对比图，如图9所示，本发明实施例提供的靶向HER2的嵌合抗原受体构建的CAR-T细胞对SK-BR-3细胞杀伤能力明显优于不含CAR 结构的T细胞。由此可见，本发明实施例提供的表达载体具有良好的抗肿瘤活性。

又一方面，本发明提供了一种上述靶向HER2的嵌合抗原受体的应用，应用包括：将靶向HER2的嵌合抗原受体作为抗乳腺癌药物。

本发明实施例提供了一种靶向HER2的嵌合抗原受体及其表达载体和应用，靶向HER2的嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向HER2的单链抗体、加长CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子、胞内信号肽、P2A连接肽和抗PD1单链抗体分泌区，该嵌合抗原受体在具备高抗肿瘤活性的同时产生更少的细胞因子，为开发新型的CAR免疫细胞疗法提供了新思路。此外，该嵌合抗原受体能够有效激活T细胞，并产生颗粒酶、穿孔素和PD1单链抗体，从而促使肿瘤细胞发生凋亡。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华夏源(上海)细胞基因工程股份有限公司

<120> 一种靶向Her2的嵌合抗原受体及其表达载体和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 2

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctagcttctc aggtacaact gcagcagtct ggacctgaac tgaagaagcc tggagagaca 60

gtcaagatct cctgcaaggc ctctgggtat cctttcacaa actatggaat gaactgggtg 120

aagcaggctc caggacaggg tttaaagtgg atgggctgga ttaacacctc cactggagag 180

tcaacatttg ctgatgactt caagggacgg tttgacttct ctttggaaac ctctgccaac 240

actgcctatt tgcagatcaa caacctcaaa agtgaagaca tggctacata tttctgtgca 300

agatgggagg tttaccacgg ctacgttcct tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtt 360

tcctctggcg gtggcggttc tggtggcggt ggctccggcg gtggcggttc tgacatccag 420

ctgacccagt ctcacaaatt cctgtccact tcagtaggag acagggtcag catcacctgc 480

aaggccagtc aggatgtgta taatgctgtt gcctggtatc aacagaaacc aggacaatct 540

cctaaacttc tgatttactc ggcatcctcc cggtacactg gagtcccttc tcgcttcact 600

ggcagtggct ctgggccgga tttcactttc accatcagca gtgtgcaggc tgaagacctg 660

gcagtttatt tctgtcagca acattttcgt actccattca cgttcggctc ggggacaaaa 720

ttggagatc 729

<210> 3

<211> 189

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcggccgcat tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 60

ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 120

cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 180

atctgggcg 189

<210> 4

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaac 60

cacaggaac 69

<210> 5

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 6

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60

<210> 8

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caagtccaat tggtggagtc tggcggtggg gtagttcagc ccggccgatc cctgcgcctg 60

gactgcaaag cttctggaat tacgttctca aactccggaa tgcactgggt gcggcaagca 120

cctgggaaag ggctggagtg ggttgcggtg atttggtacg atggctctaa gaggtactac 180

gcagacagcg ttaaaggcag atttactata tcccgagata actctaaaaa tacgctcttc 240

ctccaaatga atagcctgag ggcagaagac acagccgttt actattgtgc taccaatgat 300

gattactggg gacagggcac cctggttacc gtaagttccg gcggtggtgg aagtggagga 360

gggggatccg gaggcggggg ttctgagatc gtcctgaccc agtctccagc cactctctcc 420

ctgtctccag gcgagcgcgc tacactgagt tgtagagctt cccagtccgt gagcagctat 480

ctggcctggt atcagcagaa gcctgggcag gctccacggt tgctgattta tgacgcctcc 540

aaccgcgcga ctgggatacc agctaggttt tccggatcag gcagcggcac tgattttaca 600

ctgaccatct catctctcga gccggaagat ttcgccgttt actattgtca acagagttca 660

aactggccac ggacattcgg tcaggggacc aaggttgaaa ttaag 705

<210> 9

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 10

<211> 2343

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgctagctt ctcaggtaca actgcagcag tctggacctg aactgaagaa gcctggagag 120

acagtcaaga tctcctgcaa ggcctctggg tatcctttca caaactatgg aatgaactgg 180

gtgaagcagg ctccaggaca gggtttaaag tggatgggct ggattaacac ctccactgga 240

gagtcaacat ttgctgatga cttcaaggga cggtttgact tctctttgga aacctctgcc 300

aacactgcct atttgcagat caacaacctc aaaagtgaag acatggctac atatttctgt 360

gcaagatggg aggtttacca cggctacgtt ccttactggg gccaagggac cacggtcacc 420

gtttcctctg gcggtggcgg ttctggtggc ggtggctccg gcggtggcgg ttctgacatc 480

cagctgaccc agtctcacaa attcctgtcc acttcagtag gagacagggt cagcatcacc 540

tgcaaggcca gtcaggatgt gtataatgct gttgcctggt atcaacagaa accaggacaa 600

tctcctaaac ttctgattta ctcggcatcc tcccggtaca ctggagtccc ttctcgcttc 660

actggcagtg gctctgggcc ggatttcact ttcaccatca gcagtgtgca ggctgaagac 720

ctggcagttt atttctgtca gcaacatttt cgtactccat tcacgttcgg ctcggggaca 780

aaattggaga tcgcggccgc attcgtgccg gtcttcctgc cagcgaagcc caccacgacg 840

ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc 900

ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc 960

tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg 1020

gttatcaccc tttactgcaa ccacaggaac aaacggggca gaaagaaact cctgtatata 1080

ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc 1140

cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactgagag tgaagttcag caggagcgca 1200

gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 1260

agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 1320

ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 1380

gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 1440

ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 1500

ctgccccctc gcggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg 1560

gaggagaacc ctggacctat gtacaggatg caactcctgt cttgcattgc actaagtctt 1620

gcacttgtca caaacagtca agtccaattg gtggagtctg gcggtggggt agttcagccc 1680

ggccgatccc tgcgcctgga ctgcaaagct tctggaatta cgttctcaaa ctccggaatg 1740

cactgggtgc ggcaagcacc tgggaaaggg ctggagtggg ttgcggtgat ttggtacgat 1800

ggctctaaga ggtactacgc agacagcgtt aaaggcagat ttactatatc ccgagataac 1860

tctaaaaata cgctcttcct ccaaatgaat agcctgaggg cagaagacac agccgtttac 1920

tattgtgcta ccaatgatga ttactgggga cagggcaccc tggttaccgt aagttccggc 1980

ggtggtggaa gtggaggagg gggatccgga ggcgggggtt ctgagatcgt cctgacccag 2040

tctccagcca ctctctccct gtctccaggc gagcgcgcta cactgagttg tagagcttcc 2100

cagtccgtga gcagctatct ggcctggtat cagcagaagc ctgggcaggc tccacggttg 2160

ctgatttatg acgcctccaa ccgcgcgact gggataccag ctaggttttc cggatcaggc 2220

agcggcactg attttacact gaccatctca tctctcgagc cggaagattt cgccgtttac 2280

tattgtcaac agagttcaaa ctggccacgg acattcggtc aggggaccaa ggttgaaatt 2340

aag 2343

<210> 11

<211> 781

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Ala Pro Leu Ala Ser Gly Val Gly Leu Gly Gly Ser Gly

20 25 30

Pro Gly Leu Leu Leu Pro Gly Gly Thr Val Leu Ile Ser Cys Leu Ala

35 40 45

Ser Gly Thr Pro Pro Thr Ala Thr Gly Met Ala Thr Val Leu Gly Ala

50 55 60

Pro Gly Gly Gly Leu Leu Thr Met Gly Thr Ile Ala Thr Ser Thr Gly

65 70 75 80

Gly Ser Thr Pro Ala Ala Ala Pro Leu Gly Ala Pro Ala Pro Ser Leu

85 90 95

Gly Thr Ser Ala Ala Thr Ala Thr Leu Gly Ile Ala Ala Leu Leu Ser

100 105 110

Gly Ala Met Ala Thr Thr Pro Cys Ala Ala Thr Gly Val Thr His Gly

115 120 125

Thr Val Pro Thr Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile

145 150 155 160

Gly Leu Thr Gly Ser His Leu Pro Leu Ser Thr Ser Val Gly Ala Ala

165 170 175

Val Ser Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gly Ala Val Thr Ala Ala Val Ala

180 185 190

Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly Gly Ser Pro Leu Leu Leu Ile Thr Ser

195 200 205

Ala Ser Ser Ala Thr Thr Gly Val Pro Ser Ala Pro Thr Gly Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Pro Ala Pro Thr Pro Thr Ile Ser Ser Val Gly Ala Gly Ala

225 230 235 240

Leu Ala Val Thr Pro Cys Gly Gly His Pro Ala Thr Pro Pro Thr Pro

245 250 255

Gly Ser Gly Thr Leu Leu Gly Ile Ala Ala Ala Pro Val Pro Val Pro

260 265 270

Leu Pro Ala Leu Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Ala Pro Pro Thr Pro

275 280 285

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gly Pro Leu Ser Leu Ala Pro Gly Ala Cys

290 295 300

Ala Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Ala Gly Leu Ala Pro Ala

305 310 315 320

Cys Ala Ile Thr Ile Thr Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

325 330 335

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Thr Cys Ala His Ala Ala Leu Ala

340 345 350

Gly Ala Leu Leu Leu Leu Thr Ile Pro Leu Gly Pro Pro Met Ala Pro

355 360 365

Val Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys Ser Cys Ala Pro Pro Gly

370 375 380

Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Ala Val Leu Pro Ser Ala Ser Ala

385 390 395 400

Ala Ala Pro Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ala Gly Leu Thr Ala Gly Leu

405 410 415

Ala Leu Gly Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Gly

420 425 430

Ala Ala Pro Gly Met Gly Gly Leu Pro Ala Ala Leu Ala Pro Gly Gly

435 440 445

Gly Leu Thr Ala Gly Leu Gly Leu Ala Leu Met Ala Gly Ala Thr Ser

450 455 460

Gly Ile Gly Met Leu Gly Gly Ala Ala Ala Gly Leu Gly His Ala Gly

465 470 475 480

Leu Thr Gly Gly Leu Ser Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Ala Ala Leu

485 490 495

His Met Gly Ala Leu Pro Pro Ala Gly Ser Gly Ala Thr Ala Pro Ser

500 505 510

Leu Leu Leu Gly Ala Gly Ala Val Gly Gly Ala Pro Gly Pro Met Thr

515 520 525

Ala Met Gly Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu Val Thr

530 535 540

Ala Ser Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Val Val Gly Pro

545 550 555 560

Gly Ala Ser Leu Ala Leu Ala Cys Leu Ala Ser Gly Ile Thr Pro Ser

565 570 575

Ala Ser Gly Met His Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu Gly

580 585 590

Thr Val Ala Val Ile Thr Thr Ala Gly Ser Leu Ala Thr Thr Ala Ala

595 600 605

Ser Val Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala Ser Leu Ala Thr

610 615 620

Leu Pro Leu Gly Met Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala Thr Ala Val Thr

625 630 635 640

Thr Cys Ala Thr Ala Ala Ala Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Val Thr

645 650 655

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

660 665 670

Gly Ser Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser

675 680 685

Pro Gly Gly Ala Ala Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Ser

690 695 700

Ser Thr Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly Gly Ala Pro Ala Leu

705 710 715 720

Leu Ile Thr Ala Ala Ser Ala Ala Ala Thr Gly Ile Pro Ala Ala Pro

725 730 735

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

740 745 750

Gly Pro Gly Ala Pro Ala Val Thr Thr Cys Gly Gly Ser Ser Ala Thr

755 760 765

Pro Ala Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Val Gly Ile Leu

770 775 780

<210> 12

<211> 2298

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgctagctt ctcaggtaca actgcagcag tctggacctg aactgaagaa gcctggagag 120

acagtcaaga tctcctgcaa ggcctctggg tatcctttca caaactatgg aatgaactgg 180

gtgaagcagg ctccaggaca gggtttaaag tggatgggct ggattaacac ctccactgga 240

gagtcaacat ttgctgatga cttcaaggga cggtttgact tctctttgga aacctctgcc 300

aacactgcct atttgcagat caacaacctc aaaagtgaag acatggctac atatttctgt 360

gcaagatggg aggtttacca cggctacgtt ccttactggg gccaagggac cacggtcacc 420

gtttcctctg gcggtggcgg ttctggtggc ggtggctccg gcggtggcgg ttctgacatc 480

cagctgaccc agtctcacaa attcctgtcc acttcagtag gagacagggt cagcatcacc 540

tgcaaggcca gtcaggatgt gtataatgct gttgcctggt atcaacagaa accaggacaa 600

tctcctaaac ttctgattta ctcggcatcc tcccggtaca ctggagtccc ttctcgcttc 660

actggcagtg gctctgggcc ggatttcact ttcaccatca gcagtgtgca ggctgaagac 720

ctggcagttt atttctgtca gcaacatttt cgtactccat tcacgttcgg ctcggggaca 780

aaattggaga tcgctagcac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 840

atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 900

gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 960

acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag 1020

aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1080

gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag 1140

ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200

ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260

gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1320

aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1380

aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1440

cttcacatgc aggccctgcc ccctcgcgga agcggagcta ctaacttcag cctgctgaag 1500

caggctggag acgtggagga gaaccctgga cctatgtaca ggatgcaact cctgtcttgc 1560

attgcactaa gtcttgcact tgtcacaaac agtcaagtcc aattggtgga gtctggcggt 1620

ggggtagttc agcccggccg atccctgcgc ctggactgca aagcttctgg aattacgttc 1680

tcaaactccg gaatgcactg ggtgcggcaa gcacctggga aagggctgga gtgggttgcg 1740

gtgatttggt acgatggctc taagaggtac tacgcagaca gcgttaaagg cagatttact 1800

atatcccgag ataactctaa aaatacgctc ttcctccaaa tgaatagcct gagggcagaa 1860

gacacagccg tttactattg tgctaccaat gatgattact ggggacaggg caccctggtt 1920

accgtaagtt ccggcggtgg tggaagtgga ggagggggat ccggaggcgg gggttctgag 1980

atcgtcctga cccagtctcc agccactctc tccctgtctc caggcgagcg cgctacactg 2040

agttgtagag cttcccagtc cgtgagcagc tatctggcct ggtatcagca gaagcctggg 2100

caggctccac ggttgctgat ttatgacgcc tccaaccgcg cgactgggat accagctagg 2160

ttttccggat caggcagcgg cactgatttt acactgacca tctcatctct cgagccggaa 2220

gatttcgccg tttactattg tcaacagagt tcaaactggc cacggacatt cggtcagggg 2280

accaaggttg aaattaag 2298

Claims

1.一种靶向HER2的嵌合抗原受体，其特征在于，包括：依次连接的信号肽、靶向HER2的单链抗体、加长CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子、胞内信号肽、P2A连接肽、IL2信号肽和抗PD1单链抗体分泌区，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述靶向HER2的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述加长CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，所述胞内信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，所述P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，所述IL2信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，所述抗PD1单链抗体分泌区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激因子为4-1BB，且所述共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括载体和如权利要求1~3任一项所述的嵌合体抗原受体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述载体为慢病毒载体。

6.一种如权利要求1~3任一项所述的嵌合体抗原受体的应用，其特征在于，将所述嵌合体抗原受体用于制备抗乳腺癌药物的应用。