CN107082813A - 靶向pd‑1的嵌合抗原受体分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种靶向PD‑1的嵌合抗原受体分子及其应用；本发明提供一种靶向PD‑1的嵌合抗原受体分子，包括依次串联的胞外区肽段、跨膜区肽段和胞内结构域肽段，所述胞外区肽段包括依次相连的抗PD‑1单链抗体肽段、连接肽段、以及PD‑L1胞外区肽段，所述胞外区肽段的序列如SEQ ID NO：1所示；同时提供应用该靶向PD‑1的嵌合抗原受体分子的核苷酸、重组载体和重组细胞；本发明的靶向PD‑1的嵌合抗原受体分子具有与肿瘤表面PD‑1分子更高亲和力。

Description

靶向PD-1的嵌合抗原受体分子及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及靶向PD-1的嵌合抗原受体分子及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是一种严重威胁人类生命的疾病。恶性肿瘤或癌症的发病机理多种多样，其共同的表现在于变异的肿瘤细胞不受机体免疫系统的清除，能够无限制的繁殖和扩散，破坏周围组织的正常细胞和功能。长期以来，医药学界在尝试医治和控制肿瘤疾病的病程方面做了大量的努力，但收效甚微。目前，在恶性肿瘤的治疗上，除根除手术外，主流医学界的临床辅助治疗手段仍然是放射线治疗、化学药物治疗和抗体治疗。
1985年，美国科学家尝试分离病人的单个核细胞，并在体外用各种细胞因子诱导、激活、产生杀伤性T细胞(Cytokine-induced killer cells，CIK)，继而发现这些细胞通过静脉滴注回输给病人后，对肿瘤的生长有杀伤作用。经过近三十年的临床应用和技术发展，用免疫杀伤细胞治疗肿瘤已经成为第四种公认的恶性肿瘤辅助治疗手段。常见的用于临床治疗的免疫杀伤细胞：自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK)、γδT细胞、细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTL)、NK样T淋巴细胞(Natural killer-like Tcells，NKT)、Th1效应细胞(Effector cells)等。抗原提呈细胞之一树突状细胞(Dentriticcells，DC)也常用于免疫细胞治疗的应用，DC可以提高免疫杀伤细胞的特异性、加强免疫杀伤细胞的活力。
免疫活性细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤效果，取决于肿瘤细胞膜表面的受体分子表达，至少有两方面的因素导致体内的T淋巴细胞不能很好地识别癌细胞：(1)癌细胞下调抗原呈递分子的表达，(2)被呈递的抗原与T细胞受体亲和力很弱。虽然癌症患者体内存在癌细胞高度特异性的T淋巴细胞，但是数量太少起不到治疗癌症的作用。为了克服免疫杀伤细胞特异性低下的缺点，美国科学家发明一种转基因的方法：将识别肿瘤表面特异性抗原的单克隆抗体高变区序列在体外重组、亚克隆为单链抗体片段(Single chain antibodyfragment of variable regions，scFv)，再与其他基因的跨膜蛋白片段和胞内信号肽融合形成人造的嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，转染至T细胞内而形成嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor，CAR-T)。嵌合抗原受体主要由两部分构成，一端位于细胞外能够特异性识别癌细胞表面的某一抗原，另一端位于胞内含有信号激活元件(如T细胞受体的Zeta链)，起传递信号激活T细胞的作用。
在正常情况下，人体的血液循环中存在少量的活性杀伤细胞，如NK，γδT细胞等，其作用在于清除衰老、变异的组织细胞或抵御病毒入侵。免疫细胞的活性主要受到T调节细胞(Regulatory T cells，Treg)的控制，当T调节细胞的控制减弱时，会造成免疫功能亢进或产生自身免疫性疾病；当控制增强时，会使免疫功能低下，滋生肿瘤或其他病毒性皮肤病。目前确认的参与负调节的蛋白因子有细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen-4，CTLA4)和程序性死亡蛋白1/程序性死亡蛋白1配基1(Programmed cell death protein 1/Programmed cell death protein 1 ligand 1，PD-1/PD-L1)等分子。抑制性T调节细胞表达CTLA4，可以与免疫细胞DC和T细胞表面的B7族蛋白亚基相互作用，抑制免疫细胞功能。B7蛋白家族成员有B7-H1(PD-L1)，B7-H2(PD-1L2)等。B7-H1(PD-L1)也可以通过结合淋巴细胞PD-1分子，进一步抑制靶细胞的活性功能。PD-1和PD-L1相互作用对T细胞功能的抑制是免疫细胞治疗肿瘤的一个主要障碍。在大多数实体瘤组织中，癌细胞表达PD-L1/PD-1的水平增高，对浸润到癌组织的活化淋巴细胞产生直接的抑制，这也是肿瘤逃逸机体免疫监管的机制之一；活化T细胞表面PD-1的表达增加，更容易受到负调节的抑制。最新的抗体药物keytruda和opdivo已被美国FDA批准临床治疗恶性肿瘤，其作用原理是阻断CTLA4/B7以及PD-1/PD-L1的相互结合，从而解除体内T调节细胞或癌细胞对活性T杀伤细胞的抑制，让体内免疫活性细胞对肿瘤细胞进行杀伤、清除。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种具有与肿瘤表面PD-1分子更高亲和力的靶向PD-1的嵌合抗原受体分子及其应用。
本发明第一方面提供一种靶向PD-1的嵌合抗原受体分子，包括依次串联的胞外区肽段、跨膜区肽段和胞内结构域肽段，所述胞外区肽段包括依次相连的抗PD-1单链抗体肽段、连接肽段、以及PD-L1胞外区肽段，所述胞外区肽段的序列如SEQ ID NO：1所示。
应当说明的是，所述跨膜区肽段为蛋白质序列中跨越细胞膜的区域，通常为α-螺旋结构，约20～25个氨基酸残基，其氨基酸大部分是疏水性氨基酸；其中，所述跨膜区肽段包括但不限于CD28跨膜区肽段、CD8跨膜区肽段或PD-L1跨膜区肽段，当跨膜区肽段为CD8跨膜区肽段时，所述PD-L1胞外区肽段与CD8跨膜区肽段还通过CD8的hinge区肽段相连。CD8跨膜区肽段的序列如SEQ ID NO：2所示，CD8的hinge区肽段的序列如SEQ ID NO：3所示，PD-L1跨膜区肽段的序列如SEQ ID NO：4所示。
进一步的，所述胞内结构域肽段为共刺激信号分子，选自4-1BB(又称CD137)、CD28、CD3ζ的胞内结构域肽段中的一种或多种。优选的，所述胞内结构域肽段选自相互连接的4-1BB和CD3ζ胞内结构域肽段，其序列分别如SEQ ID NO：5和6所示。
进一步的，所述嵌合抗原受体分子还包括信号肽。信号肽可以提高嵌合抗原受体分子这种融合蛋白分泌的效果，在信号肽与融合蛋白其它氨基酸序列一起被表达后，最终被蛋白酶切除。蛋白酶具有一定的识别序列，而信号肽与其后面的肽段融合后构成新的氨基酸序列，所以如果选择的信号肽不当，可能会导致蛋白酶的误切，蛋白失活。信号肽可选自免疫球蛋白轻链的信号肽、或是PD-1蛋白分泌的信号肽，其序列分别如SEQ ID NO：7和8所示。
优选的，本发明的靶向PD-1的嵌合抗原受体分子，由免疫球蛋白轻链的信号肽、抗PD-1单链抗体肽段、连接肽段、PD-L1胞外区肽段、CD28的跨膜区和胞内区肽段和CD3ζ胞内结构域肽段依次连接而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
本发明第二方面提供一种核苷酸，其编码本发明第一方面提供的嵌合抗原受体分子。
本发明第三方面提供一种重组载体，其包含本发明第二方面提供的核苷酸。
进一步的，所述载体为慢病毒载体，其可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。
应当说明的是，本发明中所用的慢病毒载体，应当包括但不限于pRRSLIN慢病毒表达载体和pLVX载体，优选为pRRSLIN慢病毒表达载体。
本发明第四方面提供一种重组细胞，其包含本发明第三方面提供的重组载体。所述重组细胞优选为T细胞或NK细胞。该嵌合抗原受体的编码基因能够通过前述载体被转移至T细胞或NK细胞内，用于修饰T细胞或NK细胞，成为CAR-T或CAR-NK细胞；利用该嵌合抗原受体修饰的T细胞或NK细胞，能够通过识别肿瘤细胞表面的组织因子，杀死肿瘤细胞，进行肿瘤治疗。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：本发明的嵌合抗原受体分子，具有与肿瘤表面PD-1分子更高亲和力，将其组装在CAR-T细胞表面，用来识别肿瘤细胞，具有更高的亲和力和杀伤活性。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是慢病毒表达载体构建示意图；
图2是靶向PD-1的嵌合抗原受体分子的设计原理图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1慢病毒表达载体制备
本发明提供一种用于表达靶向PD-1的嵌合抗原受体分子的慢病毒表达载体的制备方法，包括以下步骤：
S1、采用经典的免疫时间表，对BALB/c小鼠免疫，免疫原为hPD-1(人源PD-1)蛋白，以使动物产生抗hPD-1的抗体，将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合制备杂交瘤细胞，ELISA结合方法进行初筛，细胞结合以及细胞抑制实验进行复筛，得到阳性克隆；提取阳性克隆总RNA，逆转录制备cDNA，分别用Leader primer扩增抗体的重链及轻链可变区，测序分析后得到抗PD-1抗体的氨基酸序列，分析处理后得到抗PD-1单链抗体序列；
S2、从GenBank数据库中搜寻已知的人PD-L1胞外区序列、人CD28的跨膜区和胞内区序列和CD3ζ胞内区基因序列；
S3、将上述基因序列依次按免疫球蛋白轻链的信号肽、抗PD-1单链抗体肽段、连接肽段、PD-L1胞外区肽段、CD28的跨膜区和胞内区肽段和CD3ζ胞内结构域肽段进行连接，在各序列连接处引入不同的酶切位点，形成完整的PD-1-CAR基因序列信息，
S4、将PD-1-CAR基因序列通过酶切转化连接到pRRSLIN载体中，基因上游为EP-1α启动子。将载体转化到Stbl3大肠杆菌菌株后，转种到含有氨苄青霉素的固体培养基中进行繁殖，筛选，获得阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定克隆，通过测序确认载体构建成功，获得pRRSLIN-PD-1慢病毒表达载体，慢病毒表达载体构建示意图如图1所示，靶向PD-1的嵌合抗原受体分子的设计原理图如图2所示。
实施例2慢病毒制备
本发明提供实施例1中慢病毒表达载体表达制备慢病毒的方法，包括以下步骤：
S1、转染前24小时，以每皿约8×106将293T细胞接种至15cm培养皿中。确保转染时细胞在80％左右的汇合度且均匀分布于培养皿中。
S2、准备溶液A和溶液B
溶液A：6.25mL 2×HEPES buffer缓冲液
溶液B：分别加入以下质粒的混合物：112.5μg pRRLSIN-PD-1(target plasmid)；39.5μg pMD2.G(VSV-G envelop)；73μg pCMVR8.74(gag，pol，tat，rev)；625μL 2M钙离子溶液。
S3、充分混匀溶液B，轻轻涡旋溶液A的同时，逐滴加入溶液B，静置2-3分钟。轻轻涡旋上述A和B的混合溶液，逐滴加入含293T细胞的培养皿中，轻轻前后晃动培养皿使DNA与钙离子的混合物均匀分布。放置于培养箱中培养16-18小时。更换新鲜培养基，继续培养，在转速500g，温度25℃下离心10min，使用PES膜(0.45μm)过滤；以70％乙醇消毒离心管，并置于紫外灯下消毒30min；将已过滤的含慢病毒的上清液转移至离心管中，在离心管底部小心铺上一层20％蔗糖(每8mL上清液加1mL蔗糖)，以PBS平衡离心管，在转速25000rpm、温度4℃下离心2h；小心取出离心管，倒掉上清液，倒置离心管去掉残余液体；加入100μL PBS，密封离心管，在4℃放置2h，每20min轻轻涡旋一次，500g离心1min(25℃)，收集病毒上清；冰上冷却后，置于-80℃保存。
实施例3PD-1-CAR-T细胞制备
本发明提供实施例2中慢病毒侵染细胞制备PD-1-CAR-T细胞的方法，包括以下步骤：
S1、取0.5mL血进行快速的病原微生物检测；无菌条件下，用肝素瓶采血50mL(肝素抗凝)。
S2、室温离心后收集上层血浆，留下沉淀层；收集的自体血浆经56℃，30min灭活，4℃放置15min后，900g，离心30min(4℃)，取上清备用。
S3、将上述富集的血细胞用生理盐水稀释，用移液管把稀释后的血细胞液缓缓加入到盛有人淋巴分离液的离心管中，注意勿打破人淋巴分离液的界面。将加好的血细胞液放入离心机，调至最小的升降速率，常温2000rpm离心20min。收集两管的中层白细胞层于离心管中，加入5mL生理盐水洗两次，得外周血单核细胞(PBMC)。
S4、配置完全生长培养基，将分离得到的PBMC用培养基稀释成2×106/mL，取50μL流式检测PBMC中T细胞的纯度。
S5、Day 0，配置缓冲液，选用微珠作为细胞培养载体，将微珠振荡30s或手动上下摇匀5min，按照微珠与T细胞的用量比为3∶1取CD3/CD28微珠置于1.5mL EP管中，添加1mL缓冲液清洗微珠，之后使用磁铁从EP管向外吸微珠1min，弃洗液，重复两次，再使用培养基将微珠重悬到原体积，将细胞和微珠混合后按2×106PBMC/mL加到合适的培养瓶中。
S6、Day 2将细胞密度调整至3-5×106/mL，按慢病毒与细胞的比例为1∶5添加实施例2制备得到的慢病毒，同时添加聚凝胺(polybrene)4μg/mL和40ng/mL IL-2。4h之后，补加新鲜的完全培养基将细胞密度调整至1×106/mL继续培养。将所有的细胞离心，加入新鲜的培养基，继续培养。
S7、每隔2-3天进行半量换液，维持细胞密度在0.5-1×106/mL。
S8、Day 10-12，细胞数量达到109级别，在400g下离心5min得到免疫细胞，再用预冷的PBS洗涤两遍。
S9、用血球计数板计数，流式细胞仪检测细胞类群，PD-1-CAR-T细胞比例。每天观察培养基的颜色变化、细胞密度、细胞形态并作相应记录。逐步扩大培养过程中，加入总体积所需的白细胞介素-2。
实施例4PD-1-CAR-T细胞体外活性检测
采用LDH释放法检测PD-1-CAR-T细胞对高表达PD1的肿瘤细胞的杀伤效应，通过ELISA方法检测LDH释放，包括以下步骤：
S1、用含5％小牛血清的RPMI-1640培养液将靶细胞调整到5×104/mL。
S2、在96孔细胞培养板中加入靶细胞，每孔加100μL。取3个孔作为效应细胞(PD-1-CAR-T细胞)自然释放对照孔，不加靶细胞，仅加100μL培养液。
S3、向各孔加100μL效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例10∶1；5∶1；1∶1。自然释放孔不加效应细胞只加100μL培养液，效应细胞与靶细胞共孵育6小时，每个实验置三个复孔。
S4、最大释放孔中(阳性对照)加10μL Lysis Solution(10×)，孵育45min-60min，每个实验置三个复孔。
S5、取上述3和4中待测样品和对照样品各50μL，加入新鲜的96孔酶标板中，再加入反应液和底物，避光30min。
S6、加入50μL终止液。
S7、在酶联检测仪上测定各孔的光密度(OD值)，检测波长490nm或492nm，在1小时内测完。
S8、特异性杀伤效率计算
杀伤率＝实验组LDH(OD)/最大LDH释放组(OD)。
计算公式：杀伤效率＝(实验组-效应自然释放-靶自然释放)/(靶最大释放-靶自然释放)×100％。
S9、通过CBA试剂盒测定细胞因子分泌情况，同时计算PD-1-CAR-T细胞各组中的增殖情况，并利用CD3和CD8抗体染色，确认增殖的T细胞中CD8阳性的T细胞的比例。杀伤效率如表1所示，可见PD-1-CAR-T细胞对SMC7721肿瘤细胞的杀伤效率明显高于其它肿瘤细胞，高表达PD-1的MCF7细胞株的杀伤效率明显高于普通MCF7细胞株。
表1PD-1-CAR-T细胞杀伤效率对比表
效应细胞∶靶细胞 Hela MCF7 MCF7-PD-1 SMC7721
10∶1 30.6％ 50.3％ 70.1％ 85.2％
5∶1 22.4％ 33.6％ 40.5％ 50.9％
1∶1 7.1％ 11.3％ 15.5％ 32.8％
实施例5PD-1-CAR-T细胞体内对肿瘤杀伤活性检测
收集对数生长期的U251肿瘤细胞，计数细胞数量后调整细胞浓度，每只小鼠右侧背部皮下接种1×107个细胞。待肿瘤体积达到300-400mm3时，计数PD-1-CAR-T细胞浓度调整至2×108个/mL，尾静脉注射小鼠100μL/只，隔一天注射一次，共三次；对照组注射未转染慢病毒的T淋巴细胞。接种肿瘤30天后，用游标卡尺测量肿瘤的长与宽，计算肿瘤体积并统计生存率。结果如表2所示，可见PD-1-CAR-T细胞体内对肿瘤细胞的杀伤效果较高。
表2PD-1-CAR-T细胞体内对肿瘤杀伤活性检测结果
对照组 PD-1-CAR-T细胞组
肿瘤体积(mm3) 1301±98 287±27
生存率(％) 0 81.3
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种靶向PD-1的嵌合抗原受体分子，其特征在于：包括依次串联的胞外区肽段、跨膜区肽段和胞内结构域肽段，所述胞外区肽段包括依次相连的抗PD-1单链抗体肽段、连接肽段、以及PD-L1胞外区肽段，所述胞外区肽段的序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的靶向PD-1的嵌合抗原受体分子，其特征在于：所述跨膜区肽段包括但不限于CD28跨膜区肽段、CD8跨膜区肽段或PD-L1跨膜区肽段，当跨膜区肽段为CD8跨膜区肽段时，所述PD-L1胞外区肽段与CD8跨膜区肽段还通过CD8的hinge区肽段相连。
3.根据权利要求1所述的靶向PD-1的嵌合抗原受体分子，其特征在于：所述胞内结构域肽段选自4-1BB、CD28、CD3ζ的胞内结构域肽段中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的靶向PD-1的嵌合抗原受体分子，其特征在于：所述嵌合抗原受体分子还包括信号肽。
5.根据权利要求1所述的靶向PD-1的嵌合抗原受体分子，其特征在于：其序列如SEQ IDNO：9所示。
6.一种核苷酸，其特征在于：其编码根据权利要求1至5任一项所述的靶向PD-1的嵌合抗原受体分子。
7.一种重组载体，其特征在于：其包含根据权利要求5或6所述的的核苷酸。
8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为pRRSLIN慢病毒表达载体。
9.一种重组细胞，其特征在于：其包含根据权利要求7或8任一项所述的重组载体。
10.根据权利要求9所述的重组细胞，其特征在于：所述重组细胞优选为T细胞或NK细胞。
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