CN104829733A - 抗原结合单元稳定的嵌合抗原受体及制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗原结合单元稳定的嵌合型抗原受体，其中包含胞外的抗原结合单元、跨膜结构域、以及细胞内共刺激信号域，其中所述抗原结合单元相对于肿瘤特异性靶点表达稳定，所述抗原结合单元包含通过由SEQ ID NO.2氨基酸序列编码的铰链相连接的重链以及轻链，本发明还涉及表达该受体的细胞及其应用。
Description
技术领域
本发明涉及含有高稳定性的抗原结合单元的嵌合抗原受体，及其制备方法，含有所述人工嵌合抗原受体的细胞，以及其应用。
背景技术
过继免疫治疗采用的是未经基因修改的T细胞，并且已经在治疗某些癌症以及病毒感染上展示其潜在的能力。例如通过供体淋巴输入(DLI)引发的移植物抗白血病效应(GVL)用于复发性白血病的治疗以及通过注射体外扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)结合治疗前淋巴细胞消除用于治疗晚期黑色素瘤。然后无论是DLI还是TIL治疗都具有严重的副作用以及没有特异性而限制了其功效。现今已经尝试发现有效的免疫原性抗原用于对效应T细胞的修改，其可以有选择性的针对白血病或者其他肿瘤。
T细胞过继免疫治疗是指将自体或者异体肿瘤激活的T细胞进行体外分离并且扩增用于治疗肿瘤病人。它对于治疗转移性黑色素瘤具有卓越的成效，并且该反应以及在50％的病人身上得到了客观的验证。
含有肿瘤特异性受体的肿瘤浸润淋巴细胞是来源于一些肿瘤病人的，而过继T细胞治疗则通过引入循环淋巴细胞抗原而得到发展。为了做到这一天，基因编码的T细胞受体可以来源于活动性高，肿瘤特异性T细胞或者来源于嵌合型抗原受体，它们包含了类似于抗体的外部结构和细胞内T细胞信号域，例如CD3ζ，而这些可通过逆转录病毒以及慢病毒进行引入。因为嵌合型抗原受体T细胞其对肿瘤细胞的攻击是不受MHC限制的，因此他扩大了T细胞过继免疫治疗的应用。目前，多种CART相关的，用于淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，黑色素瘤以及成神经细胞瘤的临床治疗研究正在进行中。
B细胞淋巴瘤患者是一个很大的群体，其中慢性淋巴细胞白血病患者会死于这个疾病。而其中一个能够治疗这些病人的方法就是通过基因改造将能够针对肿瘤细胞上特异性表达的抗原的嵌合型抗原受体表达在T细胞上。嵌合型抗原受体(CAR)是一种设计出来不依赖于人类白细胞抗原并且可识别细胞膜表面抗原的抗原受体。人们正在尝试利用这种表达CAR的基因改造的T细胞用于治疗一些类型的病人(Brentjens et al.,2010,Molecular Therapy,18:4,666-668；Morgan et al.,2010,MolecularTherapy,published online Feb.23,2010,pages 1-9；and,Till et al.,2008,Blood,112:2261-2271)。
在许多肿瘤中，肿瘤特异性抗原并没有被发现，但在B细胞淋巴瘤中，CD19是一个非常有潜力的肿瘤抗原。CD19仅表达于正常B细胞以及B细胞淋巴瘤上，所以CD19是被广泛接受并且可以安全用于CART的抗原。虽然CARs触发T细胞激活的方式与内源性T细胞受体激活的方式类似，但该技术用于临床应用的主要障碍是CART细胞在体内的扩增，以及其注射后细胞的迅速消失和令人失望的临床活动(Jena,et al.,Blood,2010,116:1035-1044；Uckun,et al.Blood,1988,71:13-29)。
在许多肿瘤中，肿瘤特异性抗原并没有被发现，但在B细胞淋巴瘤中，得力于淋巴细胞消除的发展CART的临床结果也得到了提高，通过抗CD19的嵌合型抗原受体T细胞在B细胞淋巴瘤的应用证明了以基因改造T细胞为基础的过继免疫治疗其在临床抗肿瘤的许多问题得到了解决。但是，在这个治疗方案被广泛接受之前还是有许多没有解决的问题。其中的一个问题就是单链可变区片段(scFv)作为一个融合蛋白在细胞膜表面表达的稳定性。正如大家所知道的scFv作为抗体的单元是不稳定的，以及在早前研究中也发现CAR的胞外部分的稳定性会影响T细胞的功能(gene Therapy,6,412)。由于CAR在肿瘤治疗使用中其组分以及方法的稳定性将影响其功能，因对于其组分稳定性的研究以及方法的建立是迫切需要的。本发明恰好解决了这一需要。
发明内容
本发明提供了一种抗原结合单元(antigen binding unit,Abu)稳定的嵌合型抗原受体(CAR)，其包含胞外的抗原结合单元、跨膜结构域、以及细胞内共刺激信号域，其中所述抗原结合单元相对于肿瘤特异性靶点表达稳定，所述抗原结合单元包含通过铰链相连接的重链以及轻链，所述铰链由SEQ ID NO.2氨基酸序列编码。
其中，所述肿瘤特异性靶点为血液学恶性肿瘤相关抗原或实体瘤相关抗原，更进一步的，所述肿瘤特异性靶点选自如下单一抗原或几个抗原的组合，CD19,CD20,EGFR or EGFRvIII,CEA,CD22,ROR1,间皮素,CD33/IL3Ra,c-Met,PSMA,糖脂F77,GD-2,NY-ESO-1TCR,MAGE A3TCR。
其中，嵌合型抗原受体(CAR)针对肿瘤特异靶点CD19的稳定抗原结合单元的重链由SEQ ID NO.1氨基酸序列编码，轻链由SEQ ID NO.3的氨基酸序列编码。
其中，嵌合型抗原受体(CAR)针对肿瘤特异靶点CD20的稳定抗原结合单元的重链由SEQ ID NO.4的氨基酸序列编码，轻链由SEQ ID NO.5的氨基酸序列编码。
其中，嵌合型抗原受体(CAR)针对肿瘤特异靶点癌胚抗原CEA的稳定抗原结合单元的重链由SEQ ID NO.6的氨基酸序列编码，轻链由SEQ ID NO.7的氨基酸序列编码。
其中，嵌合型抗原受体(CAR)针对肿瘤特异靶点EGFRvIII的稳定抗原结合单元的重链由SEQ ID NO.8氨基酸序列编码，轻链由SEQ IDNO.9的氨基酸序列编码。
其中，跨膜结构域由SEQ ID NO.10氨基酸序列编码。
其中，所述细胞内共刺激信号域为融合CD3ζ信号域和CD28及CD137的细胞内结构域的混合型细胞内共刺激信号域。
其中，所述CAR的共刺激信号域中包含了细胞内的混合型共刺激结构域，其选择可以来源于CD27,CD28,4-1BB,OX40,CD30,CD40,PD-1,ICOS,淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1),CD2,CD7,LIGHT,NKG2C,B7-H3，CD83的特异性配基以及其中的任意组合。
其中，其中，编码CAR中细胞内混合型信号域的氨基酸序列SEQ IDNO.11中含有SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13氨基酸序列。
其中，所述CD3ζ信号域由SEQ ID NO.14氨基酸序列编码，所述CD28的信号域由SEQ ID NO.12氨基酸序列编码，所述CD137的信号域由SEQID NO.13氨基酸序列编码。
其中，嵌合型抗原受体(CAR)的抗原结合单元由一个抗体或者一个抗原结合单元组成，优选所述抗原结合单元是经过稳定性设计的单链抗体scFv。
本发明还提供一种制备表达所述CAR的细胞的方法，其包括如下步骤，(a)获得外周血单核细胞(PBMCs)；(b)转化或感染PBMC细胞，将编码CAR的表达框DNA整合到细胞染色体。
其中，表达所述CAR的细胞选自T细胞(细胞毒性T淋巴细胞、调节性T细胞)，NK细胞，其中T细胞是自体、同种异体或异种T细胞。
本发明还提供了含有表达所述CAR的细胞在制备抗肿瘤相关药物中的用途。
其中，患者至少对一种化疗药物产生抵抗。
其中，所述肿瘤是淋巴细胞白血病，且为CD19+的难治性白血病和淋巴瘤。
本发明还提供了含有表达所述CAR的细胞在制备刺激T细胞介导针对目标细胞群或病人组织的免疫反应相关药物中的用途。
附图说明
图1A显示PBMC细胞经OKT-3和IL-2刺激后的生长扩增曲线；
图1B显示PBMC细胞经OKT-3和IL-2刺激后生长的细胞活力变化；
图2显示用不同MOI值的慢病毒感染T细胞的感染效率(用FITC-标记的蛋白L检测scFv在T细胞的表达)；
图3显示不同E：T比例的CD19特异性的CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用，图3A为K562细胞(CD19表达阴性)，图3B为稳定表达CD19的K562稳定细胞系。
具体实施方式
1.慢病毒包装
使用四质粒系统进行慢病毒包装。4质粒系统分别表达慢病毒载体包装所需的gag/pol,Rev,VSV-G,及工程稳定的单链抗体构成的人工嵌合抗原受体。将4质粒按比较进行瞬时转染。总质量为10μg。将上述质粒加入至一定体积的无菌水中，而后加入62.5μl的2M CaCl2溶液，最后加入500μl 2×HBS(PH＝7.05)缓冲液。将上述溶液加入至铺有细胞的10cm培养皿中，轻轻混匀。于37℃、5％CO2细胞培养箱培养6h.6h后更换新鲜培养基，继续进行培养。并且加入10mM的丁酸钠溶液。49-72小时后收集慢病毒的培养上清进行纯化检测。
2.T细胞的扩增
每位志愿者采30ml的全血。将外周血与生理盐水1:1进行稀释，在离心管内加入Ficoll，缓缓加入稀释后的外周血。1500rpm离心30min轻轻吸取PBMC层移入另一离心管内。用生理盐水洗涤PBMC多次，转入X-VIVO培养基(含50ng/ml的OKT3，300IU/ml的IL-2)中进行培养。PBMC分离后，需要用含50ng/ml的OKT3，300IU/ml的IL-2的X-VIVO进行激活，2日后将培养基更换成含300IU/ml的X-VIVO进行扩大培养，而后每两天进行一次计数并更换含300IU/ml的X-VIVO，并且将细胞浓度维持在0.5×106-1×106/ml。连续观察10天。
结果表明，经过刺激培养10天后，T细胞扩增比例高于初始T细胞100倍，经过上述的培养方式，可以在短时间内扩增T细胞。图1A中可以看到，从志愿者外周血中分离得到的PBMC，扩增10天后扩增了100倍，图1B中可以看到每日用台盼蓝对细胞进行活力测定，细胞活力逐渐提高。
3.慢病毒感染T细胞
利用RetroNectin提高慢病毒对T细胞的感染效率。将30μg的RetroNectin，包被于6孔板内。放于37°细胞培养箱2h。吸取RetroNectin，利用含2.5％BSA的Hank’s溶液封闭包被后的6孔板。放于37°细胞培养箱0.5h。吸取封闭液，利用含2％Hepes的Hank’s溶液洗涤6孔板。加入X-VIVO培养基，加入适量的慢病毒溶液，2000G，离心2h。弃上清，加入1×106的T细胞(CD3阳性>90％)，1000G，离心10min。于37℃、5％CO2和一定湿度的细胞培养箱内培养，第二日重复上述过程。
感染5天后测定scFv的表达，利用Protein L与Kappa轻链的结合，通过流式细胞仪检测scFv的表达。结果显示，经过慢病毒感染后T细胞表面表达高阳性的scFv，如图2所示，同时再次培养15天后，其scFv的表达仍有87.2％。并未丢失表达。
4.细胞毒性检测
利用LDH检测CART细胞对K562，以及CD19表达阳性的K562的细胞毒性。将T，CART，K562以及K562-CD19离心，并且用无血清，无酚红的1640培养基多次洗涤，并计数。取1×106的K562，K562-CD19各50ul，铺板于90孔板内，作为靶细胞。按靶细胞：效应细胞＝1:1,1:3,1:10。分别加T，以及CART分别铺板于含靶细胞的90孔板内。于37℃、5％CO2和一定湿度的细胞培养箱内培养4h。4h加入裂解液作为阳性对照，而后250g离心5min。每孔取100ul培养上清，加入新的96孔板内。加入20ul反应液。放于暗室中反应20-30min酶标仪490nm测定。
结果如图3显示，将CART与CD19阴性细胞K562以及CD19阳性细胞CD19-K562共同作用，发现CART可以特异性的杀伤CD19阳性细胞。说明我们制备的CD19特异性的CART具有杀伤CD19阳性细胞的功能。
Claims (9)
1.一种抗原结合单元稳定的嵌合型抗原受体，其中包含胞外的抗原结合单元、跨膜结构域、以及细胞内共刺激信号域，其中所述抗原结合单元相对于肿瘤特异性靶点表达稳定，所述抗原结合单元包含通过铰链相连接的重链以及轻链，所述铰链由SEQ ID NO.2氨基酸序列编码。
2.如权利要求1所述的嵌合型抗原受体，其中所述肿瘤特异性靶点为血液学恶性肿瘤相关抗原或实体瘤相关抗原，其中所述肿瘤特异性靶点选自如下单一抗原或几个抗原的组合，CD19,CD20,EGFR or EGFRvIII,CEA,CD22,ROR1,间皮素,CD33/IL3Ra,c-Met,PSMA,糖脂F77,GD-2,NY-ESO-1 TCR,MAGE A3 TCR。
3.如权利要求1所述的嵌合型抗原受体，其中嵌合型抗原受体针对肿瘤特异靶点CD19的稳定抗原结合单元的重链由SEQ ID NO.1氨基酸序列编码，轻链由SEQ ID NO.3的氨基酸序列编码,其中，嵌合型抗原受体针对肿瘤特异靶点CD20的稳定抗原结合单元的重链由SEQ ID NO.4的氨基酸序列编码，轻链由SEQ ID NO.5的氨基酸序列编码；嵌合型抗原受体针对肿瘤特异靶点癌胚抗原CEA的稳定抗原结合单元的重链由SEQ ID NO.6的氨基酸序列编码，轻链由SEQ ID NO.7的氨基酸序列编码；其中嵌合型抗原受体针对肿瘤特异靶点EGFRvIII的稳定抗原结合单元的重链由SEQ ID NO.8氨基酸序列编码，轻链由SEQ ID NO.9的氨基酸序列编码。
4.如权利要求1所述的嵌合型抗原受体，其中跨膜结构域由SEQ IDNO.10氨基酸序列编码，其中所述细胞内共刺激信号域为融合CD3ζ信号域和CD28及CD137的细胞内结构域的混合型细胞内共刺激信号域；其中所述CAR的共刺激信号域中包含了细胞内的混合型共刺激结构域，其选择可以来源于CD27,CD28,4-1BB,OX40,CD30,CD40,PD-1,ICOS,淋巴细胞功能相关抗原-1,CD2,CD7,LIGHT,NKG2C,B7-H3，CD83的特异性配基以及其中的任意组合；其中编码CAR中细胞内混合型信号域的氨基酸序列SEQ ID NO.11中含有SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13氨基酸序列；其中所述CD3ζ信号域由SEQ ID NO.14氨基酸序列编码，所述CD28的信号域由SEQ ID NO.12氨基酸序列编码，所述CD137的信号域由SEQID NO.13氨基酸序列编码。
5.如权利要求1所述的嵌合型抗原受体，其中嵌合型抗原受体的抗原结合单元由一个抗体或者一个抗原结合单元组成，优选所述抗原结合单元是经过稳定性设计的单链抗体scFv。
6.制备表达如权利要求1-5所述嵌合型抗原受体的细胞的方法，其包括如下步骤，(a)获得外周血单核细胞；(b)转化或感染外周血单核细胞，将编码嵌合型抗原受体的表达框DNA整合到细胞染色体。
7.如权利要求6所述的方法，其中表达所述嵌合型抗原受体的细胞选自T细胞，NK细胞，其中T细胞是细胞毒性T淋巴细胞、调节性T细胞，是自体、同种异体或异种T细胞。
8.表达如权利要求1-5所述的嵌合型抗原受体的细胞在制备抗肿瘤相关药物中的用途。
9.如权利要求8所述的细胞在制备抗肿瘤相关药物中的用途，其中患者至少对一种化疗药物产生抵抗，其中所述肿瘤是淋巴细胞白血病，且为CD19+的难治性白血病和淋巴瘤。
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