CN107245107A

CN107245107A - 一种基于cd20的嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN107245107A
Application number: CN201710587265.XA
Authority: CN
Inventors: 李昱琛; 张政维
Original assignee: Shenzhen Institute Of Immune Gene Therapy
Current assignee: Shenzhen Institute Of Immune Gene Therapy
Priority date: 2017-07-18
Filing date: 2017-07-18
Publication date: 2017-10-13
Anticipated expiration: 2037-07-18
Also published as: CN107245107B

Abstract

本发明涉及一种基于CD20的嵌合抗原受体及其应用，具体为以肿瘤特异靶点CD20为基础的嵌合抗原受体T(CAR‑T)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域串联而成；其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原为CD20。本发明的嵌合抗原受体通过对所述针对肿瘤表面抗原CD20的单链抗体进行特定的基因改造，改造后的抗体能够使抗原‑抗体结合力更强，不容易发生突变，且相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，靶点的表达量高，使得CAR‑T细胞的免疫效果增强，增强了CAR‑T细胞的治疗效果。

Description

一种基于CD20的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种基于CD20的嵌合抗原受体及其应用，具体为以肿瘤特异靶点CD20为基础的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用。

背景技术

随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimericantigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。一般，嵌合抗原受体CAR由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。通常，CAR包含抗体的单链片段可变(Single chain fragmentvariable，scFv)区或对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)具有特异性的结合结构域，其通过铰链和跨膜区与T细胞信号传导分子的胞质结构域偶联。最常见的淋巴细胞活化部分包括与T细胞效应物功能触发(例如CD3ζ)部分串联的T细胞共刺激结构域。CAR介导的过继性免疫疗法允许CAR-移植的T细胞以非HLA限制性方式直接识别靶肿瘤细胞上的TAA。

大多数患有B细胞恶性肿瘤(包括B细胞急性淋巴细胞性白血病(B cell acutelymphocytic leukemia,leukemia,B-ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(chroniclymphocytic leukemia,CLL))的患者将由于其疾病而死亡。治疗这些患者的一种方法是通过CAR的表达，对T细胞进行遗传修饰以靶向在肿瘤细胞上表达的抗原。CAR是经设计以人白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)非依赖性方式识别细胞表面抗原的抗原受体。尝试使用表达CAR的遗传修饰细胞来治疗这些类型的患者已经取得了有前景的成功。

CD19分子是治疗B淋巴细胞系肿瘤潜在的靶点，也是CAR研究中的热点，CD19的表达局限于正常和恶性B细胞，是广泛接受的用来安全测试的CAR靶标。靶向CD19分子的嵌合抗原受体基因修饰的T细胞(CD19 CAR-T)在治疗多发性、难治性的急性B淋巴细胞白血病上取得巨大成功，而在难治性、复发性慢性B淋巴细胞白血病和B淋巴细胞系淋巴瘤的治疗中疗效明显较差。

CN 104788573 A公开了一种嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ及其用途，该嵌合抗原受体由抗人CD19单克隆抗体HI19a轻链和重链可变区(hCD19scFv)、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3ζ胞内区结构串联构成，该专利中的CD19在进行一次CAR-T细胞回输后，CD19的表达量会降低，容易逃过免疫机制。

因此，制备一种嵌合抗原受体能够解决CD19存在的易突变和表达量降低的问题显得尤为重要。

发明内容

针对目前CAR-T技术治疗肿瘤中靶向不十分理想，以及肿瘤微环境影响CAR-T技术治疗效果的情况，本发明提供一种基于CD20的嵌合抗原受体及其应用，本发明制备的嵌合抗原受体通过将CD20靶点进行基因改造，从而提高了靶点的免疫效果，增强了CAR-T细胞的治疗效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种基于CD20的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域和可诱导自杀融合结构域串联而成；

其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原为CD20。

本发明中，通过将抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原CD20，再通过对抗原结合结构域即针对肿瘤表面抗原CD20的单链抗体进行特定的人源基因码优化改造，从而使得肿瘤表面抗原CD20能够特异的结合在本申请的嵌合抗原受体上，且相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，靶点的表达量高，使得CAR-T细胞的免疫效果增强。

根据本发明，所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原CD20的单链抗体(scFv)，所述针对肿瘤表面抗原CD20的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述针对肿瘤表面抗原CD20的单链抗体氨基酸序列(SEQ ID NO.1)如下：

DIQMTQSPSTMSTSVGDRVSVNCKASQNVGTNVAWYQQKPGKSPKGLIYSASFRYSGVPSRFTGSGSGTDFTLTIFNVQPDDLAEYFCQQYNNYPLTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSSEGSTKGEVQVEESGGGLVQPGGSMRLSCVASGFSFNNYWMNWVRQSPGKGLEWVAEIRLKSNNYATHYVDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGWDDYAMDHWGQGISVTVSS.

本发明中，所述针对肿瘤表面抗原CD20的单链抗体进行了特异性改造，使得改造后的序列表达出来的抗体的抗原-抗体结合力更强。

根据本发明，所述抗原结合结构域还包括针对肿瘤表面抗原CD20的突变体的单链抗体，所述针对肿瘤表面抗原CD20的突变体的单链抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列有90％以上的相似度。

根据本发明，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，在一些具体实施方案中，可以通过氨基酸替换来选择或修饰跨膜结构域。

根据本发明，所述共刺激信号传导区为CD28信号传导结构域、CD127信号传导结构域、IL-15Ra信号传导结构域或CD137信号传导结构域中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28信号传导结构域、CD127信号传导结构域、IL-15Ra信号传导结构域和CD137信号传导结构域的组合，所述CD28信号传导结构域、CD127信号传导结构域、IL-15Ra信号传导结构域和CD127信号传导结构域的排列，本领域技术人员可以根据需要进行调整，CD28信号传导结构域、CD127信号传导结构域、IL-15Ra信号传导结构域和CD137信号传导结构域不同的排列不会对所述嵌合抗原受体产生影响，本申请优选采用CD28-CD127-IL-15Ra-CD137的顺序组合。

根据本发明，所述可诱导自杀融合结构域为包含胱天蛋白酶9结构域，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)如下：

GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGGGGSGAMVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSAS.

根据本发明，所述可诱导自杀融合结构域通过2A序列与CD3ζ信号传导结构域相串联，所述2A序列会使所述可诱导自杀融合结构域表达的蛋白与所述嵌合抗原受体蛋白断裂开，从而使得所述嵌合抗原受体能够发挥作用，而通过注入激活剂，从而使得可诱导自杀融合结构域激活，从而导致嵌合抗原受体失去作用。

根据本发明，所述嵌合抗原受体还包括信号肽，所述信号肽为能够指导嵌合抗原受体跨膜转移的信号肽，本领域技术人员可以根据需要选择本领域常规的信号肽，所述信号肽可以为任何一个分泌蛋白基因的信号肽，本发明所述信号肽为Secretory信号肽，所述Secretory信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5-6所示。

优选地，所述Secretory信号肽为CD8a基因的信号肽，所述Secretory信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列如下：MALPVTALLLPLALLLHAARP。

优选地，所述Secretory信号肽为GMCSFR基因的信号肽，所述Secretory信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述SEQ ID NO.6所述的氨基酸序列如下：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP。

本发明的嵌合抗原受体还可以包括铰链区，所述铰链区本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，在此不做特殊限定，铰链区的存在不会对本发明的嵌合抗原受体的性能产生影响。

根据本发明，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和可诱导自杀融合结构域串联而成。

作为优选技术方案，所述嵌合抗原受体为Secretory信号肽、CD20抗原结合结构域，CD8α和/或CD28跨膜结构域，CD28信号传导结构域、CD127信号传导结构域、IL-15Ra信号传导结构域和CD137信号传导结构域，CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域串联而成，具体排列如下：

Secretory-CD20-CD28-CD127-IL-15Ra-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9。

根据本发明，所述嵌合抗原受体Secretory-CD20-CD28-CD127-IL-15Ra-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)如下：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSTMSTSVGDRVSVNCKASQNVGTNVAWYQQKPGKSPKGLIYSASFRYSGVPSRFTGSGSGTDFTLTIFNVQPDDLAEYFCQQYNNYPLTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSSEGSTKGEVQVEESGGGLVQPGGSMRLSCVASGFSFNNYWMNWVRQSPGKGLEWVAEIRLKSNNYATHYVDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGWDDYAMDHWGQGISVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSASGGGGSGGGGSKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQSRGGGGSGGGGSTSGGGGSGGGGSKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHLGGGGSGGGGSTSGGGGSGGGGSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSGGGGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGGGGSGAMVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSAS.

根据本发明，所述嵌合抗原受体Secretory-CD20-CD28-CD127-IL-15Ra-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)如下：

ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTCCTGCTGATCCCCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCACCATGAGCACCAGCGTGGGCGACAGAGTGAGCGTGAACTGCAAGGCCAGCCAGAACGTGGGCACCAACGTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGAGCCCCAAGGGCCTGATCTACAGCGCCAGCTTCAGATACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTTCAACGTGCAGCCCGACGACCTGGCCGAGTACTTCTGCCAGCAGTACAACAACTACCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCCGGCAGCAGCGAGGGCAGCACCAAGGGCGAGGTGCAGGTGGAGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCATGAGACTGAGCTGCGTGGCCAGCGGCTTCAGCTTCAACAACTACTGGATGAACTGGGTGAGACAGAGCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCGAGATCAGACTGAAGAGCAACAACTACGCCACCCACTACGTGGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGAGACGACAGCAAGAGCAGCGTGTACCTGCAGATGAACAACCTGAGAGCCGAGGACACCGGCATCTACTACTGCACCGGCTGGGACGACTACGCCATGGACCACTGGGGCCAGGGCATCAGCGTGACCGTGAGCAGCGCCGCCGCCATCGAGGTGATGTACCCCCCCCCCTACCTGGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCCAGCCCCCTGTTCCCCGGCCCCAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGAGAAGCAAGAGAAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGAAGACCCGGCCCCACCAGAAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGAAGCGCCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCAAGAAGAGAATCAAGCCCATCGTGTGGCCCAGCCTGCCCGACCACAAGAAGACCCTGGAGCACCTGTGCAAGAAGCCCAGAAAGAACCTGAACGTGAGCTTCAACCCCGAGAGCTTCCTGGACTGCCAGATCCACAGAGTGGACGACATCCAGGCCAGAGACGAGGTGGAGGGCTTCCTGCAGGACACCTTCCCCCAGCAGCTGGAGGAGAGCGAGAAGCAGAGACTGGGCGGCGACGTGCAGAGCCCCAACTGCCCCAGCGAGGACGTGGTGATCACCCCCGAGAGCTTCGGCAGAGACAGCAGCCTGACCTGCCTGGCCGGCAACGTGAGCGCCTGCGACGCCCCCATCCTGAGCAGCAGCAGAAGCCTGGACTGCAGAGAGAGCGGCAAGAACGGCCCCCACGTGTACCAGGACCTGCTGCTGAGCCTGGGCACCACCAACAGCACCCTGCCCCCCCCCTTCAGCCTGCAGAGCGGCATCCTGACCCTGAACCCCGTGGCCCAGGGCCAGCCCATCCTGACCAGCCTGGGCAGCAACCAGGAGGAGGCCTACGTGACCATGAGCAGCTTCTACCAGAACCAGAGCAGAGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCACCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCAAGAGCAGACAGACCCCCCCCCTGGCCAGCGTGGAGATGGAGGCCATGGAGGCCCTGCCCGTGACCTGGGGCACCAGCAGCAGAGACGAGGACCTGGAGAACTGCAGCCACCACCTGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCACCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGTGGTGAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGATTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGAACCAGCGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGGCGTGCAGGTGGAGACCATCAGCCCCGGCGACGGCAGAACCTTCCCCAAGAGAGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGCATGCTGGAGGACGGCAAGAAGGTGGACAGCAGCAGAGACAGAAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGCAAGCAGGAGGTGATCAGAGGCTGGGAGGAGGGCGTGGCCCAGATGAGCGTGGGCCAGAGAGCCAAGCTGACCATCAGCCCCGACTACGCCTACGGCGCCACCGGCCACCCCGGCATCATCCCCCCCCACGCCACCCTGGTGTTCGACGTGGAGCTGCTGAAGCTGGAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGCCATGGTGGGCGCCCTGGAGAGCCTGAGAGGCAACGCCGACCTGGCCTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGCGGCCACTGCCTGATCATCAACAACGTGAACTTCTGCAGAGAGAGCGGCCTGAGAACCAGAACCGGCAGCAACATCGACTGCGAGAAGCTGAGAAGAAGATTCAGCAGCCTGCACTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACCGCCAAGAAGATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCCAGACAGGACCACGGCGCCCTGGACTGCTGCGTGGTGGTGATCCTGAGCCACGGCTGCCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCCGGCGCCGTGTACGGCACCGACGGCTGCCCCGTGAGCGTGGAGAAGATCGTGAACATCTTCAACGGCACCAGCTGCCCCAGCCTGGGCGGCAAGCCCAAGCTGTTCTTCATCCAGGCCTGCGGCGGCGAGCAGAAGGACCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCCGAGGACGAGAGCCCCGGCAGCAACCCCGAGCCCGACGCCACCCCCTTCCAGGAGGGCCTGAGAACCTTCGACCAGCTGGACGCCATCAGCAGCCTGCCCACCCCCAGCGACATCTTCGTGAGCTACAGCACCTTCCCCGGCTTCGTGAGCTGGAGAGACCCCAAGAGCGGCAGCTGGTACGTGGAGACCCTGGACGACATCTTCGAGCAGTGGGCCCACAGCGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGAGAGTGGCCAACGCCGTGAGCGTGAAGGGCATCTACAAGCAGATGCCCGGCTGCTTCAACTTCCTGAGAAAGAAGCTGTTCTTCAAGACCAGCGCCAGCTGA.

本发明中，所述嵌合抗原受体还包括启动子，所述启动子为EF1a、CMV-TAR或CMV中的任意一种或至少两种的组合。

根据本发明，所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到T细胞中表达。

根据本发明，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mRNA序列中的任意一种或至少两种的组合转染到T细胞，优选为通过病毒载体转染到T细胞。

优选地，所述病毒载体为慢病毒载体和/或逆转录病毒载体，优选为慢病毒载体。

第二方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第一方面所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSVG共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

根据本发明，所述哺乳细胞为293细胞，293T细胞或TE671细胞中的任意一种或至少两种的组合。

第三方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括如第一方面所述的嵌合抗原受体和/或如第二方面所述的重组慢病毒。

第四方面，本发明提供如第一方面所述的嵌合抗原受体、如第二方面所述的重组慢病毒或如第三方面所述的组合物在制备嵌合抗原受体T细胞及其在肿瘤治疗药物中的应用；

优选地，所述肿瘤为血液相关的肿瘤疾病和/或实体瘤，所述肿瘤疾病选自但不限于白血病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的嵌合抗原受体通过对CD20肿瘤表面抗原进行特定的基因改造，改造后的抗体能够使抗原-抗体结合力更强；

(2)本发明的嵌合抗原受体能特异性的识别肿瘤表面抗原CD20，CD20在白血病及淋巴瘤瘤中表达量高，且嵌合抗原受体上的针对肿瘤表面抗原CD20的单链抗体不容易发生突变，相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，使得CAR-T细胞的免疫效果增强，增强了CAR-T细胞的治疗效果；

(3)本发明的嵌合抗原受体在进行CAR-T细胞回输后，肿瘤表面CD20的表达量不会降低，不容易逃过免疫机制，能够更好的进行治疗。

附图说明

图1为本发明的嵌合抗原受体的合成基因序列图谱；

图2为CD20抗体流式细胞分析结果图，其中，灰色区域为同型阴性对照，图2(a)为人淋巴瘤细胞，图2(b)B淋巴细胞瘤1，图2(c)B淋巴细胞瘤2；

图3(a)为B细胞淋巴瘤(BLCL)肿瘤靶细胞的流式细胞分析结果图，图3(b)为ALCL肿瘤靶细胞的细胞凋亡结果图；

图4(a)为GD2 CAR T细胞与BLCL肿瘤靶细胞共培养3小时的流式细胞分析结果图，图4(b)为GD2 CAR T细胞与BLCL肿瘤靶细胞共培养3小时的细胞凋亡结果图；

图5(a)为CD19 CAR T细胞与BLCL肿瘤靶细胞共培养3小时的流式细胞分析结果图，图5(b)为GD2 CAR T细胞与BLCL肿瘤靶细胞共培养3小时的细胞凋亡结果图；

图6(a)为CD20 CAR T细胞与BLCL肿瘤靶细胞共培养3小时的流式细胞分析结果图，图6(b)为CD20 CAR T细胞与BLCL肿瘤靶细胞共培养3小时的细胞凋亡结果图；

图7(a)为一般T细胞与ALCL(间变性大细胞淋巴瘤)靶细胞共培养1小时的流式细胞分析结果图，图7(b)为一般T细胞与ALCL靶细胞共培养1小时的细胞凋亡结果图；

图8(a)为GD2 CAR T细胞与ALCL靶细胞共培养1小时的流式细胞分析结果图，图8(b)为GD2 CAR T细胞与ALCL靶细胞共培养1小时的细胞凋亡结果图；

图9(a)为CD20 CAR T细胞与ALCL靶细胞共培养1小时的流式细胞分析结果图，图9(b)为CD20 CAR细胞与ALCL靶细胞共培养1小时的细胞凋亡结果图；

图10(a)为一般T细胞与Daudi(人淋巴瘤细胞)靶细胞共培养1小时的流式细胞分析结果图，图10(b)为一般T细胞与Daudi靶细胞共培养1小时的细胞凋亡结果图；

图11(a)为CD20 CAR T细胞与Daudi靶细胞共培养1小时的流式细胞分析结果图，图11(b)为CD20 CAR T细胞与Daudi靶细胞共培养1小时的细胞凋亡结果图；

图12(a)为一般T细胞与B细胞淋巴瘤靶细胞共培养6天后的流式细胞分析结果图，图12(b)为CD20 CAR T细胞与B细胞淋巴瘤靶细胞共培养6天后的流式细胞分析结果图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1：嵌合抗原受体的构建

(1)通过全基因合成Secretory信号肽、CD20抗原结合结构域，CD8α和/或CD28跨膜结构域，CD28信号传导结构域、CD127信号传导结构域、IL-15Ra信号传导结构域和CD137信号传导结构域，CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域，如图1所示，即

Secretory-CD20-CD28-CD127-IL-15Ra-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9；

所述嵌合抗原受体的核苷酸序列SEQ ID NO.3如下：

实施例2：慢病毒包装

(1)用六孔板分别培养293T细胞，1×10⁶个细胞/孔，培养17-18小时；

(2)加入600μL/孔的新鲜的DMEM，内含10％的FBS；

(3)在无菌离心管中加入以下试剂：每孔取75μL的DMEM的上清液，2.7μg的helperDNA mix(1.8μg pNHP，0.5μg pHEF-VSV-G，0.2μg pHEF-GFP，)以及0.8μg的pTYF DNA载体，漩涡振荡；

(4)从每孔板中央吸取7μL的Superfect加至离心管中吹打5次，室温静置7-10分钟；

(5)将离心管中的DNA-Superfect混合液逐滴加入至每个培养孔中，漩涡打匀；

(6)37℃3％CO₂培养箱里培养4-5小时；

(7)吸走培养基的培养液，用1.5mL AIM-V冲洗培养基，并加入1.5mL的AIM-V继续培养；

(8)将培养基放回3％CO₂培养箱中培养过夜，第2-3天早上用荧光显微镜观察转染效率。

实施例3：慢病毒的纯化和浓缩

1)病毒纯化

通过离心(1000g，5分钟)除去细胞碎片，得到病毒上清液，用一个0.45微米的低蛋白结合过滤器将病毒上清液过滤，病毒被分装成小份，储存在-80℃；

通常情况下，在每毫升的培养基中，转染细胞可以产生10⁶到10⁷转导单位滴定的慢病毒载体。

2)用Centricon过滤器浓缩慢病毒载体

(1)在生物安全柜中，取Centricon管，用70％酒精消毒1次，然后用无菌PBS清洗3次；

(2)每个Centricon P-20过滤管中加入18ml的病毒上清液，然后在2500g下离心30分钟或者直到病毒体积减小到0.5ml；

(3)震荡过滤管，然后在400g下，离心2分钟，收集浓缩的病毒到收集杯中。最后将所有管中的病毒集中到一个离心管中。

实施例4：CAR-T细胞的转染

将活化后的T细胞以5×10⁶接种到24孔板，加入50μl的浓缩目标基因的慢病毒，以100g离心力的速度，室温离心100分钟后，置于37℃培养24h，加入1ml的含有2％人血清，与细胞培养因子的AIM-V基，培养2-3天后，将细胞收获并计数，以1×10⁷接种到12孔板，培养2-3天，用慢病毒载体携带GFP感染靶细胞并用annexinV/PI染色法观察细胞毒杀效果，结果如图2所示。

从图2可以看出，Daudi细胞(人淋巴瘤细胞)、BLCL1细胞和BLCL2细胞表面都有CD20的表达，本发明选用的CD20 CAR能够用于治疗类似于Daudi、BLCL1和BLCL2的B细胞肿瘤。

实施例5CAR-T细胞的BLCL体外肿瘤杀伤

(1)将CD19 CAR-T细胞、GD2 CAR-T细胞和本申请制备的专一性的4GS-CD20 CAR-T细胞与BLCL肿瘤靶细胞共培养，置于37度5％CO₂培养箱共培养3小时；

(2)体外评估CD20 CAR-T细胞与非特异性CAR-T比较对靶细胞的识别杀伤功能，靶细胞为钙黄绿素标记或感染LV-GFP；

结果如图3-图6所示，从图3(a)没有CAR-T、图4(a)GD2 CAR-T、图5(a)CD19 CAR-T和图6(a)CD20 CAR-T对比可以看出，荧光强度为10²以上的细胞为BLCL肿瘤靶细胞，挑选图3(a)、图4(a)、图5(a)和图6(a)中荧光强度为10²以上的细胞做进一步分析，从图3(b)可以看出，8.07％的靶细胞濒临凋亡，5.71％的靶细胞凋亡，从图4(b)可以看出，7.54％的靶细胞濒临凋亡，6.53％的靶细胞凋亡，从图5(b)可以看出，9.93％的靶细胞濒临凋亡，7.32％的靶细胞凋亡，从图6(b)可以看出，16.5％的靶细胞濒临凋亡，14.0％的靶细胞凋亡，可见，CD20 CAR-T细胞的靶细胞濒临凋亡(16.5％)以及靶细胞凋亡数(14％)明显高于其他对照组，因此CD20 CAR-T细胞对BLCL肿瘤靶细胞有较好的毒杀作用。

实施例6CAR-T细胞的大细胞淋巴瘤(ALCL)体外肿瘤杀伤

(1)将非专一性的mesothelin CART细胞、GD2 CAR-T细胞和本申请制备的专一性的CD20 CAR-T细胞与BLCL肿瘤靶细胞共培养，置于37度5％CO₂培养箱共培养1h；

(2)体外评估CAR-T细胞对靶细胞的识别杀伤功能，靶细胞为钙黄绿素标记或感染LV-GFP；

结果如图7-图9所示，从图7(a)对照没有CAR-T、图8(a)GD2 CAR-T和图9(a)CD20CAR-T对比可以看出，荧光强度为10³以上的细胞为CD20阳性的ALCL肿瘤靶细胞，挑选图7(a)、图8(a)和图9(a)中荧光强度为10³以上的细胞做进一步分析，从图7(b)可以看出，6.2％的靶细胞濒临凋亡，1.4％的靶细胞凋亡，从图8(b)可以看出，8.7％的靶细胞濒临凋亡，3.1％的靶细胞凋亡，从图9(b)可以看出，10.5％的靶细胞濒临凋亡，2.6％的靶细胞凋亡，可见，CD20 CAR-T细胞的靶细胞濒临凋亡以及靶细胞凋亡数明显高于其他对照组，因此CD20 CAR-T细胞对ALCL肿瘤靶细胞有较好的毒杀作用。

实施例7CAR-T细胞的CD20阳性的B细胞肿瘤Daudi细胞体外肿瘤杀伤

(1)将非专一性的对照组T细胞和本申请制备的专一性的CD20 CAR-T细胞与Daudi肿瘤靶细胞共培养，置于37度5％CO₂培养箱共培养1小时；

结果如图10-图11所示，从图10(a)没有CAR-T和图11(a)CD20 CAR T对比可以看出，荧光强度为10³以上的细胞为Daudi肿瘤靶细胞，挑选图10(a)和图11(a)中荧光强度为10³以上的细胞做进一步分析，从图10(b)可以看出，26.5％的靶细胞濒临凋亡，5.9％的靶细胞凋亡，从图11(b)可以看出，31.7％的靶细胞濒临凋亡，18.1％的靶细胞凋亡，可见，CD20 CAR-T细胞在一小时的杀伤测试后的靶细胞濒临凋亡以及靶细胞凋亡数明显高于对照组，因此CD20 CAR-T细胞对Daudi肿瘤靶细胞有较好的毒杀作用。

实施例8CAR-T细胞的B细胞淋巴瘤体外肿瘤杀伤

(1)将非专一性的mesothelin CAR T细胞和本申请制备的专一性的CD20 CAR-T细胞与B细胞淋巴瘤肿瘤靶细胞共培养，置于37度5％CO₂培养箱共培养6天；

(2)体外评估CAR-T细胞对B细胞淋巴瘤靶细胞的识别杀伤功能，靶细胞为钙黄绿素标记或感染LV-GFP；

结果如图12所示，从图12(a)对照没有CAR-T组可以看出，一般T细胞毒杀后B细胞淋巴瘤细胞存活率为8.8％，从图12(b)CD20 CAR-T组可以看出，CD20 CAR-T细胞毒杀后B细胞淋巴瘤细胞存活率为0.3％，显示多数肿瘤细胞死亡，因此CD20 CAR-T细胞对B细胞淋巴瘤肿瘤靶细胞毒杀效果强烈有效，特异性强。

综上所述，本发明的嵌合抗原受体的针对CD20肿瘤表面抗原的单链抗体不容易发生突变，且相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，使得CAR-T细胞的免疫效果增强，增强了CAR-T细胞的治疗效果。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市免疫基因治疗研究院

<120> 一种基于CD20的嵌合抗原受体及其应用

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Gly Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Phe Asn Val Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln

115 120 125

Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Met Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr Trp Met Asn

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile

165 170 175

Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Val Asp Ser Val Lys

180 185 190

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu

195 200 205

Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr

210 215 220

Gly Trp Asp Asp Tyr Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly Ile Ser Val

225 230 235 240

Thr Val Ser Ser

<210> 2

<211> 1264

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 2

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr

20 25 30

Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Asn Cys Lys Ala Ser

35 40 45

Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ser Pro Lys Gly Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Phe Asn Val Gln Pro Asp Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln

100 105 110

Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Glu Val Gln Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Met Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ser Phe

165 170 175

Asn Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His

195 200 205

Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser

210 215 220

Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr

225 230 235 240

Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Gly Trp Asp Asp Tyr Ala Met Asp His Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Ile Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val

260 265 270

Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile

275 280 285

Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly

290 295 300

Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala

305 310 315 320

Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg

325 330 335

Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

340 345 350

Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro

355 360 365

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

370 375 380

Gly Gly Gly Ser Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu

385 390 395 400

Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys

405 410 415

Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile

420 425 430

His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu

435 440 445

Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu

450 455 460

Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile

465 470 475 480

Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly

485 490 495

Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu

500 505 510

Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu

515 520 525

Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser

530 535 540

Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro

545 550 555 560

Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met

565 570 575

Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

580 585 590

Gly Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys

595 600 605

Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val Glu Met Glu Ala Met Glu

610 615 620

Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser Arg Asp Glu Asp Leu Glu

625 630 635 640

Asn Cys Ser His His Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

645 650 655

Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Val Lys Arg

660 665 670

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

675 680 685

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

690 695 700

Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

705 710 715 720

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

725 730 735

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

740 745 750

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

755 760 765

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

770 775 780

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

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Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

805 810 815

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

820 825 830

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Thr Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe

835 840 845

Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met

850 855 860

Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro

865 870 875 880

Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp

885 890 895

Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe

900 905 910

Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala

915 920 925

Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr

930 935 940

Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr

945 950 955 960

Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Met Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg

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Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly His

995 1000 1005

Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu

1010 1015 1020

Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg

1025 1030 1035

Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu

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Thr Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu Ala Arg Gln

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Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr Gly

1085 1090 1095

Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe

1100 1105 1110

Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe

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Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro

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Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp

1160 1165 1170

Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe

1175 1180 1185

Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro

1190 1195 1200

Lys Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu

1205 1210 1215

Gln Trp Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val

1220 1225 1230

Ala Asn Ala Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly

1235 1240 1245

Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser Ala

1250 1255 1260

Ser

<210> 3

<211> 3795

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc cttcctgctg 60

atccccgaca tccagatgac ccagagcccc agcaccatga gcaccagcgt gggcgacaga 120

gtgagcgtga actgcaaggc cagccagaac gtgggcacca acgtggcctg gtaccagcag 180

aagcccggca agagccccaa gggcctgatc tacagcgcca gcttcagata cagcggcgtg 240

cccagcagat tcaccggcag cggcagcggc accgacttca ccctgaccat cttcaacgtg 300

cagcccgacg acctggccga gtacttctgc cagcagtaca acaactaccc cctgaccttc 360

ggcggcggca ccaagctgga gatcaagggc agcaccagcg gcagcggcaa gcccggcagc 420

agcgagggca gcaccaaggg cgaggtgcag gtggaggaga gcggcggcgg cctggtgcag 480

cccggcggca gcatgagact gagctgcgtg gccagcggct tcagcttcaa caactactgg 540

atgaactggg tgagacagag ccccggcaag ggcctggagt gggtggccga gatcagactg 600

aagagcaaca actacgccac ccactacgtg gacagcgtga agggcagatt caccatcagc 660

agagacgaca gcaagagcag cgtgtacctg cagatgaaca acctgagagc cgaggacacc 720

ggcatctact actgcaccgg ctgggacgac tacgccatgg accactgggg ccagggcatc 780

agcgtgaccg tgagcagcgc cgccgccatc gaggtgatgt accccccccc ctacctggac 840

aacgagaaga gcaacggcac catcatccac gtgaagggca agcacctgtg ccccagcccc 900

ctgttccccg gccccagcaa gcccttctgg gtgctggtgg tggtgggcgg cgtgctggcc 960

tgctacagcc tgctggtgac cgtggccttc atcatcttct gggtgagaag caagagaagc 1020

agactgctgc acagcgacta catgaacatg acccccagaa gacccggccc caccagaaag 1080

cactaccagc cctacgcccc ccccagagac ttcgccgcct acagaagcgc cagcggcggc 1140

ggcggcagcg gcggcggcgg cagcaagaag agaatcaagc ccatcgtgtg gcccagcctg 1200

cccgaccaca agaagaccct ggagcacctg tgcaagaagc ccagaaagaa cctgaacgtg 1260

agcttcaacc ccgagagctt cctggactgc cagatccaca gagtggacga catccaggcc 1320

agagacgagg tggagggctt cctgcaggac accttccccc agcagctgga ggagagcgag 1380

aagcagagac tgggcggcga cgtgcagagc cccaactgcc ccagcgagga cgtggtgatc 1440

acccccgaga gcttcggcag agacagcagc ctgacctgcc tggccggcaa cgtgagcgcc 1500

tgcgacgccc ccatcctgag cagcagcaga agcctggact gcagagagag cggcaagaac 1560

ggcccccacg tgtaccagga cctgctgctg agcctgggca ccaccaacag caccctgccc 1620

ccccccttca gcctgcagag cggcatcctg accctgaacc ccgtggccca gggccagccc 1680

atcctgacca gcctgggcag caaccaggag gaggcctacg tgaccatgag cagcttctac 1740

cagaaccaga gcagaggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcaccag cggcggcggc 1800

ggcagcggcg gcggcggcag caagagcaga cagacccccc ccctggccag cgtggagatg 1860

gaggccatgg aggccctgcc cgtgacctgg ggcaccagca gcagagacga ggacctggag 1920

aactgcagcc accacctggg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcac cagcggcggc 1980

ggcggcagcg gcggcggcgg cagcgtggtg aagagaggca gaaagaagct gctgtacatc 2040

ttcaagcagc ccttcatgag acccgtgcag accacccagg aggaggacgg ctgcagctgc 2100

agattccccg aggaggagga gggcggctgc gagctgggcg gcggcggcag cggcggcggc 2160

ggcagcggcg gcggcggcag cagagtgaag ttcagcagaa gcgccgacgc ccccgcctac 2220

cagcagggcc agaaccagct gtacaacgag ctgaacctgg gcagaagaga ggagtacgac 2280

gtgctggaca agagaagagg cagagacccc gagatgggcg gcaagcccag aagaaagaac 2340

ccccaggagg gcctgtacaa cgagctgcag aaggacaaga tggccgaggc ctacagcgag 2400

atcggcatga agggcgagag aagaagaggc aagggccacg acggcctgta ccagggcctg 2460

agcaccgcca ccaaggacac ctacgacgcc ctgcacatgc aggccctgcc ccccagaacc 2520

agcggcagcg gcgccaccaa cttcagcctg ctgaagcagg ccggcgacgt ggaggagaac 2580

cccggcccca tgggcgtgca ggtggagacc atcagccccg gcgacggcag aaccttcccc 2640

aagagaggcc agacctgcgt ggtgcactac accggcatgc tggaggacgg caagaaggtg 2700

gacagcagca gagacagaaa caagcccttc aagttcatgc tgggcaagca ggaggtgatc 2760

agaggctggg aggagggcgt ggcccagatg agcgtgggcc agagagccaa gctgaccatc 2820

agccccgact acgcctacgg cgccaccggc caccccggca tcatcccccc ccacgccacc 2880

ctggtgttcg acgtggagct gctgaagctg gagggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 2940

agcggcgcca tggtgggcgc cctggagagc ctgagaggca acgccgacct ggcctacatc 3000

ctgagcatgg agccctgcgg ccactgcctg atcatcaaca acgtgaactt ctgcagagag 3060

agcggcctga gaaccagaac cggcagcaac atcgactgcg agaagctgag aagaagattc 3120

agcagcctgc acttcatggt ggaggtgaag ggcgacctga ccgccaagaa gatggtgctg 3180

gccctgctgg agctggccag acaggaccac ggcgccctgg actgctgcgt ggtggtgatc 3240

ctgagccacg gctgccaggc cagccacctg cagttccccg gcgccgtgta cggcaccgac 3300

ggctgccccg tgagcgtgga gaagatcgtg aacatcttca acggcaccag ctgccccagc 3360

ctgggcggca agcccaagct gttcttcatc caggcctgcg gcggcgagca gaaggaccac 3420

ggcttcgagg tggccagcac cagccccgag gacgagagcc ccggcagcaa ccccgagccc 3480

gacgccaccc ccttccagga gggcctgaga accttcgacc agctggacgc catcagcagc 3540

ctgcccaccc ccagcgacat cttcgtgagc tacagcacct tccccggctt cgtgagctgg 3600

agagacccca agagcggcag ctggtacgtg gagaccctgg acgacatctt cgagcagtgg 3660

gcccacagcg aggacctgca gagcctgctg ctgagagtgg ccaacgccgt gagcgtgaag 3720

ggcatctaca agcagatgcc cggctgcttc aacttcctga gaaagaagct gttcttcaag 3780

accagcgcca gctga 3795

<210> 4

<211> 423

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 4

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro

20 25 30

Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His

35 40 45

Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp

50 55 60

Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg

65 70 75 80

Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly

100 105 110

Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys

115 120 125

Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Met Val

130 135 140

Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile Leu

145 150 155 160

Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe

165 170 175

Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys

180 185 190

Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu Val

195 200 205

Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu

210 215 220

Ala Arg Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile Leu

225 230 235 240

Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr

245 250 255

Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe

260 265 270

Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe

275 280 285

Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val Ala

290 295 300

Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro Asp

305 310 315 320

Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp Ala

325 330 335

Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr

340 345 350

Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp Tyr

355 360 365

Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp

370 375 380

Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys Gly

385 390 395 400

Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu

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Phe Phe Lys Thr Ser Ala Ser

420

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 5

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 6

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

Claims

1.一种基于CD20嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域和可诱导自杀融合结构域串联而成；

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原CD20的单链抗体，所述针对肿瘤表面抗原CD20的单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；

优选地，所述抗原结合结构域还包括针对肿瘤表面抗原CD20的突变体的单链抗体；

优选地，所述针对肿瘤表面抗原CD20的突变体的单链抗体的氨基酸序列与SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列有90％以上的相似度。

3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域；

优选地，所述共刺激信号传导区为CD28信号传导结构域、CD127信号传导结构域、IL-15Ra信号传导结构域或CD137信号传导结构域中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28信号传导结构域、CD127信号传导结构域、IL-15Ra信号传导结构域和CD137信号传导结构域的组合。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述可诱导自杀融合结构域为包含胱天蛋白酶9结构域；

优选地，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

优选地，所述可诱导自杀融合结构域通过2A序列与CD3ζ信号传导结构域相串联。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和可诱导自杀融合结构域串联而成；

优选地，所述嵌合抗原受体为Secretory信号肽、CD20抗原结合结构域，CD8α和/或CD28跨膜结构域，CD28信号传导结构域、CD127信号传导结构域、IL-15Ra信号传导结构域和CD137信号传导结构域，CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域串联而成。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为Secretory-CD20-CD28-CD127-IL-15Ra-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9；

优选地，所述嵌合抗原受体Secretory-CD20-CD28-CD127-IL-15Ra-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述嵌合抗原受体Secretory-CD20-CD28-CD127-IL-15Ra-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到T细胞中表达；

优选地，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mRNA序列中的任意一种或至少两种的组合转染到T细胞，优选为通过病毒载体转染到T细胞；

8.一种重组慢病毒，其特征在于，将包含如权利要求1-7中任一项所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSVG共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒；

优选地，所述哺乳细胞为293细胞，293T细胞或TE671细胞中的任意一种或至少两种的组合。

9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1-7中任一项所述的嵌合抗原受体和/或如权利要求8所述的重组慢病毒。

10.如权利要求1-7中任一项所述的嵌合抗原受体、如权利要求8所述的重组慢病毒或如权利要求9所述的组合物在制备嵌合抗原受体T细胞及其在肿瘤治疗药物中的应用；

优选地，所述肿瘤为血液相关的肿瘤疾病；

优选地，所述血液相关的肿瘤疾病为白血病和/或淋巴瘤。