CN109593134A

CN109593134A - 抗cd20的人源化单克隆抗体及其制剂

Info

Publication number: CN109593134A
Application number: CN201811640540.0A
Authority: CN
Inventors: 杨林; 游凤涛
Original assignee: PERSONGEN BIOMEDICINE (SUZHOU) CO Ltd
Current assignee: PERSONGEN BIOMEDICINE (SUZHOU) CO Ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-04-09
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109593134B

Abstract

本发明提供了抗CD20的人源化单克隆抗体及其制剂。具体地，本发明提供了一种新的抗CD20人源化抗体。本发明的抗体能够高特异性地结合CD20抗原，具有较高的亲和力和生物活性，以及低的免疫原性，结构稳定，成药性良好。并且本发明人源化抗体在本发明抗体制剂中的稳定性非常好，用于制备预防或治疗CD20相关的疾病的药物。

Description

抗CD20的人源化单克隆抗体及其制剂

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地涉及抗CD20的人源化单克隆抗体及其制剂。

背景技术

人源化抗体是指在嵌合抗体的基础上进一步减少鼠源成分，及保留鼠抗CDR区，其它部分用人抗体部分替换，在疾病治疗中，人源化抗体之所以优于鼠源抗体，是因为抗体中鼠源性成分的减少可以降低机体的免疫排斥反应，人源化抗体的另一个优点是它在体内的半衰期长，鼠源抗体的半衰期不到一天，而人源化抗体可达数天有时甚至更长时间。

由于鼠单抗在临床治疗时会引起人抗鼠抗体反应(human anti-mouse antibody，HAMA)，因此在临床治疗上受到限制。

因此，本领域仍然需要开发适于治疗患者的抗CD20人源化抗体。

发明内容

本发明的目的是对鼠源CD20抗体(Leu-16克隆)进行人源化设计及表达，获得与鼠源抗体亲和力在一个数量级的人源化抗体，最大程度降低鼠源抗体在人体内可能引起的免疫原性。

本发明又目的是提供了一种高亲和力高生物活性的CD20人源化抗体及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述抗体重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO.:1所示的CDR1，

SEQ ID NO.:2所示的CDR2，和

SEQ ID NO.:3所示的CDR3，

并且，所述重链可变区的亲和力与鼠源的SEQ ID NO.:17所示的重链可变区的亲和力在一个数量级。

在另一优选例中，所述重链可变区在对应于SEQ ID NO.:17所示序列的选自下组的一个或多个氨基酸发生突变：

第1位的谷氨酸(E)、第5位的谷氨酰胺(Q)、第11位的缬氨酸(V)、第20位的甲硫氨酸(M)、第38位的赖氨酸(K)、第40位的苏氨酸(T)、第48位的异亮氨酸(I)、第67位的赖氨酸(K)、第68位的丙氨酸(A)、第70位的亮氨酸(L)、第72位的丙氨酸(A)、第74位的赖氨酸(K)、第76位的丝氨酸(S)、第82位的谷氨酰胺(Q)、第87位的苏氨酸(T)、第91位的丝氨酸(S)、第93位的天冬氨酸(D)、第114位的丙氨酸(A)。

在另一优选例中，所述重链可变区对应于SEQ ID NO.:17所示序列的突变选自下组：

E1Q、Q5V、V11L、M20V、K38R、T40A、I48M、K67R、A68V、L70M、L70I、A72R、K74T、S76T、S76A、A79V、Q82E、T87R、S91T、D93V、A114Q、或其组合。

在另一优选例中，所述重链可变区还在对应于SEQ ID NO.:17所示序列的选自下组的氨基酸发生突变：

在另一优选例中，所述重链可变区对应于SEQ ID NO.:17所示序列的突变还选自下组：G44R。

在另一优选例中，所述重链可变区选自下组：

(1)序列如SEQ ID NO.13或14所示的重链可变区；

(2)将SEQ ID NO.13或14所示的氨基酸序列经过至少一个(如1-20个、较佳地1-15个、更佳地1-10个、更佳地1-8个、更佳地1-3个、最佳地1或2个)氨基酸残基的取代、缺失、修饰和/或添加而形成的，具有(1)所述重链可变区功能的由SEQ ID NO.13或14所示序列衍生的重链可变区。

在另一优选例中，所述重链可变区在对应于SEQ ID NO.:13或14所示序列的框架区可进行一个或多个(1-20个、较佳地1-15个、更佳地1-10个、更佳地1-8个、更佳地1-3个、最佳地1或2个)氨基酸的突变。

在另一优选例中，所述重链可变区的序列如SEQ ID NO.:13或14所示。

本发明第二方面提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明第一方面所述的重链可变区。

在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。

在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的，较佳地为人源的。

本发明第三方面提供了一种抗体的轻链可变区，所述抗体轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO.:4所示的CDR1，

SEQ ID NO.:5所示的CDR2，和

SEQ ID NO.:6所示的CDR3，

并且，所述轻链可变区的亲和力与鼠源的SEQ ID NO.:18所示的轻链可变区的亲和力在一个数量级。

在另一优选例中，所述轻链可变区在对应于SEQ ID NO.:18所示序列的选自下组的一个或多个氨基酸发生突变：

第1位的天冬氨酸(D)、第10位的异亮氨酸(I)、第13位的丙氨酸(A)、第18位的赖氨酸(K)、第19位的缬氨酸(V)、第21位的甲硫氨酸(M)、第22位的苏氨酸(T)、第37位的赖氨酸(K)、第41位的丝氨酸(S)、第42位的丝氨酸(S)、第44位的赖氨酸(K)、第45位的脯氨酸(P)、第46位的色氨酸(W)、第54位的缬氨酸(V)、第56位的丙氨酸(A)、第66位的丝氨酸(S)、第67位的酪氨酸(Y)、第68位的丝氨酸(S)、第70位的酪氨酸(Y)、第74位的缬氨酸(V)、第76位的丙氨酸(A)、第79位的丙氨酸(A)、第80位的苏氨酸(T)、第100位的亮氨酸(L)。

在另一优选例中，所述轻链可变区对应于SEQ ID NO.:18所示序列的突变选自下组：D1E、I10T、A13L、K18R、V19A、M21L、T22S、K37Q、S41Q、S42A、K44R、P45L、W46L、V54I、A56D、S66D、Y67F、S68T、Y70T、V74L、A76P、A79F、T80V、L100V、或其组合。

在另一优选例中，所述轻链可变区还在对应于SEQ ID NO.:18所示序列的选自下组的一个或多个氨基酸发生突变：

第73位的精氨酸(R)、第96位的甘氨酸(G)。

在另一优选例中，所述轻链可变区对应于SEQ ID NO.:18所示序列的突变还选自下组：R73S、G96Q、或其组合。

在另一优选例中，所述轻链可变区选自下组：

(1)序列如SEQ ID NO.15或16所示的轻链可变区；

(2)将SEQ ID NO.15或16所示的氨基酸序列经过至少一个(如1-20个、较佳地1-15个、更佳地1-10个、更佳地1-8个、更佳地1-3个、最佳地1或2个)氨基酸残基的取代、缺失、修饰和/或添加而形成的，具有(1)所述轻链可变区功能的由SEQ ID NO.15或16所示序列衍生的轻链可变区。

在另一优选例中，所述轻链可变区在对应于SEQ ID NO.:15或16所示序列的框架区可进行一个或多个(1-20个、较佳地1-15个、更佳地1-10个、更佳地1-8个、更佳地1-3个、最佳地1或2个)氨基酸的突变。

在另一优选例中，所述轻链可变区的序列如SEQ ID NO.:15或16所示。

本发明第四方面提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明第三方面所述的轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体的轻链还包括轻链恒定区。

在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的，较佳地为人源的。

本发明第五方面提供了一种抗体，所述抗体具有：

(1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或

(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区；

在另一优选例中，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。

在另一优选例中，所述抗体具有如SEQ ID NO.13或14所示的重链可变区；和/或如SEQ ID NO.15或16所示的轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.15或16所示；和/或所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.13或14所示。

在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.15所示；并且所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.13所示。

在另一优选例中，所述抗体具有序列如SEQ ID NO.16所示的轻链可变区；并且所述抗体具有序列如SEQ ID NO.14所示的重链可变区。

在另一优选例中，所述抗体为人源化抗体。

在另一优选例中，所述抗体为特异性结合CD20。

在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为双特异性抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。

6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：

(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。

在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。

在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。

本发明第七方面提供了一种抗体制剂，所述的抗体制剂包括：

(a)如本发明第五方面所述的抗体；以及

(b)载体，所述的载体包括：缓冲剂、无菌水，任选的表面活性剂。

本发明第八方面提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有本发明第七方面所述的抗体制剂，以及盛装所述抗体制剂的容器。

本发明第九方面提供了一种CAR构建物，所述的CAR构建物的抗原结合区域的scFv段为特异性结合于CD20的结合区，并且所述scFv具有如本发明第一方面所述的重链可变区和如本发明第三方面所述的轻链可变区。

本发明第十方面提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明第九方面所述的CAR构建物。

在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：NK细胞、T细胞。

在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。

本发明第十一方面提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：

(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、或其组合；和

(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。

本发明第十二方面提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第十方面所述的免疫细胞、如本发明第十一方面所述的抗体药物偶联物、或其组合，所述活性成分用于

(a)制备检测试剂或试剂盒；

(b)制备预防和/或治疗CD20相关疾病的药物或制剂；和/或

(c)制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金淋巴瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、或其组合。

在另一优选例中，所述肿瘤为高表达CD20的肿瘤。

在另一优选例中，所述药物或制剂用于制备预防和/或治疗与CD20(表达阳性的)相关的疾病的药物或制剂。

在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物(ADC)形式。

在另一优选例中，所述的检测试剂或试剂盒用于诊断CD20相关疾病。

在另一优选例中，所述检测试剂或试剂盒用于检测样品中CD20蛋白。

在另一优选例中，所述的检测试剂为检测片。

本发明第十三方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：

(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第十方面所述的免疫细胞、如本发明第十一方面所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及

(ii)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述细胞的浓度为1×10³-1×10⁹个细胞/ml，较佳地1×10⁵-1×10⁸个细胞/ml。

在另一优选例中，所述药物组合物还含有选择性杀伤肿瘤细胞的其他药物(如核酸药物、抗体药物、靶向性药物，其他免疫细胞药物、其他CAR-T药物、化疗药物、或其组合)。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤为高表达CD20的肿瘤。

本发明第十四方面提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：

(1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；或

(2)如本发明第六方面所述的重组蛋白；

(3)如本发明第九方面所述的CAR构建物。

本发明第十五方面提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第十四方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

本发明第十六方面提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第十五方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第十四方面所述的多核苷酸。

本发明第十七方面提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，包括以下步骤：

(A)提供一待改造的免疫细胞；和

(B)将第一表达盒导入到所述待改造的免疫细胞，其中所述第一表达盒表达如本发明第九方面所述的CAR构建物，从而获得工程化的免疫细胞。

在另一优选例中，所述第一表达盒含有编码本发明第九方面所述的CAR构建物的核酸序列。

在另一优选例中，所述的第一表达盒位于载体上或整合在所述工程化的免疫细胞的染色体中。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、溶瘤病毒载体、其他基因转移系统、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体为病毒载体(如慢病毒载体)。

在另一优选例中，所述的载体为转座子载体。

在另一优选例中，所述免疫细胞为T细胞或NK细胞。

在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

本发明第十八方面提供了一种体外检测样品中CD20蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(1)在体外，将所述样品与如本发明第五方面所述的抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在CD20蛋白。

在另一优选例中，所述方法是非诊断和非治疗的。

本发明第十九方面提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第十一方面所述的抗体药物偶联物。

本发明第二十方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：

第一容器，以及位于第一容器内的第一核酸序列，所述第一核酸序列含有表达权利要求9所述的CAR构建物的第一表达盒。

本发明第二十一方面提供了一种诊断试剂盒，包括：

(1)第一容器，所述第一容器中含有本发明第五方面所述的抗体；和/或

(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明第五方面所述的抗体的二抗。

在另一优选例中，所述试剂盒含有本发明第十九方面所述的检测板。

本发明第二十二方面提供了一种重组多肽的制备方法，所述方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第十六方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第六方面所述的重组蛋白。

本发明第二十三方面提供了一种治疗与CD20相关的疾病的方法，所述方法包括：给需要的对象施用如本发明第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的重组蛋白、本发明第九方面所述的CAR构建物、本发明第十方面所述的免疫细胞、本发明第十一方面所述的抗体药物偶联物、本发明第十三方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述与CD20相关的疾病包括CD20阳性的癌症或肿瘤。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了不同的人源化全抗体流式检测图。

图2显示了全抗的表达纯化的电泳图。

图3显示了人源化抗体LeuH2L2与鼠源抗体Leu16重链可变区的序列对比。

图4显示了人源化抗体LeuH2L2与鼠源抗体Leu16轻链可变区的序列对比。

图5显示了人源化抗体LeuH1L3与鼠源抗体Leu16重链可变区的序列对比。

图6显示了人源化抗体LeuH1L3与鼠源抗体Leu16轻链可变区的序列对比。

图7显示了不同浓度的鼠源Leu16抗体与Raji细胞结合的流式分析图。

图8显示了不同浓度的人源化LeuH1L3抗体与Raji细胞结合的流式分析图。

图9显示了不同浓度的人源化LeuH2L2抗体与Raji细胞结合的流式分析图。

图10显示了不同浓度的3种抗体与Raj i细胞结合的平均荧光强度统计图。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，意外地获得一种具有亲和力优异的和良好的结构稳定性的抗CD20人源化抗体。具体地，本发明对人源抗体模板的骨架区进行人源化。人源化后的抗体达到与鼠源抗体相近的亲和力，为一个数量级。

具体地，本发明对鼠源CD20抗体(Leu-16克隆)进行了人源化设计及改造，并表达了相应的人源化抗体，经过流式验证和亲和力验证，最终获得了2个和鼠源抗体亲和力一致(达到一个数量级)的人源化抗体序列(LeuH1L3、LeuH2L2)。在此基础上完成了本发明。

术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括抗CD20抗体与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。

如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种抗CD20抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。

如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。

本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,100％。

CD20

CD20表达于除浆细胞外的发育分化各阶段的B细胞的表面，过调节跨膜钙离子流动直接对B细胞起作用，在B细胞增殖和分化中起重要的调节作用。CD20抗原是一种B细胞分化抗原，仅位于前B细胞和成熟B细胞，它在95％以上的B细胞性淋巴瘤中表达，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达。因此CD20是靶向治疗B细胞淋巴瘤和白血病的理想靶点。

鼠源Leu-16克隆可变区序列信息

鼠源Leu-16克隆单抗的轻链可变区(SEQ ID NO.18)

DIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSSGVPARFSGSGS GTSYSLYISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIK

鼠源Leu-16克隆单抗的重链可变区(SEQ ID NO.17)

EVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQK FKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSS

人源化LeuH1L3可变区序列信息

人源化单抗LeuH1L3轻链可变区(SEQ ID NO.16)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVNYMDWYQQKPGQAPRLLIYATSSGIPARFSGSGS GTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQGTKLEIK

人源化单抗LeuH1L3重链可变区(SEQ ID NO.14)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQRLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSNYYGSSYWFFDVWGQGTTVTVSS

人源化LeuH2L2可变区序列信息

人源化单抗LeuH2L2轻链可变区(SEQ ID NO.15)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVNYMDWYQQKPGQAPRLLIYATSSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGGGTKVEIK

人源化单抗LeuH2L2重链可变区(SEQ ID NO.13)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSNYYGSSYWFFDVWGQGTTVTVSS

抗体

如本文所用，术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其较链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1，IgG2、IgG3，IgG4。轻链根据恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

本发明所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。

在本发明中，本发明所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到竣基端依次排列的顺序序为:FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1，HCDR2和HCDR3。

术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的抗CD20的单克隆抗体。制备时用CD20抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源CD20抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。

术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。

术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。人源化抗体可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。

术语“抗体的抗原结合片段”(或简称“抗体片段”)是指抗体的保持特异性结合抗原(例如，CD20)的能力的一个或多个片段。己显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语“抗体的抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括

(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；

(ii)F(ab’)₂片段，包含通过较链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；

(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；

(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段。

Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。

术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。

术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位(例如，CD20分子上的特定部位)。表位通常以独特的空间构象包括至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个连续或非连续的氨基酸。

术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10^-7M，例如大约小于1O^-8M、1O^-9M或lO^-10M或更小的亲和力(KD)结合。

术语“竞争结合”是指与本发明的单克隆抗体识别CD20的胞外区上的相同表位(也称为抗原决定簇)或相同表位的一部分并与所述抗原结合的抗体。与本发明的单克隆抗体结合相同表位的抗体是指识别并结合于本发明的单克隆抗体所识别的CD20的氨基酸序列的抗体。

术语“KD”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本发明的抗体以小于大约10^-7M，例如小于大约10^-8M、10^-9M或l0^-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合CD20。

如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。

如本文所用，术语“单克隆抗体”指得自单个细胞来源的克隆分泌的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原表位。所述的细胞可能是真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。

在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。

在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

抗CD20人源化抗体

本发明提供抗CD20人源化抗体(以下简称CD20抗体)。具体地，本发明提供一种针对CD20的高特异性和高亲和力的人源化抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。

1986年Jones等人首次将鼠单抗重链CDR移植到人抗体重链骨架区，然后与鼠单抗轻链组装成完整抗体并保持了与原鼠单抗相似的亲和力，为抗体人源化技术的发展提供了思路。1989年Queen等人通过CDR移植的方法，成功构建抗CD25人源化抗体，该方法使用的是人抗体Eu骨架区进行人源化，在骨架区部分位点保留了鼠源抗体氨基酸以保持亲和力。1992年Presta等人报道了以人抗体亚群共有序列(consensus sequence)为模板进行CDR移植成功构建人源化的方法。1994年Pedersen等人报道了用表面重塑(resurfacing)的方法对抗体人源化。1994年Hsiao等人报道了以人抗体Germline序列骨架区进行CDR移植的人源化方法。1994年Jespers等人用噬菌体库(shuffling library)的方法成功构建人源化方法。

抗体人源化中人骨架区的选择通常有两种，一种是已知的成熟抗体，一种是人Germline序列。已知的成熟抗体骨架区通常含有体细胞突变位点，可能带来潜在的免疫原性。相比已成熟抗体，人Germline序列骨架区理论上免疫原性更低，而且结构更灵活，可塑性强，容易接受不同的CDR区。人抗体Germline基因在人体中的使用频率具有一定的偏向性，选择使用频率高的Germline骨架区人源化后的抗体具有免疫原性低、表达量高、结构稳定等优点，因此本发明在人源化时并未选择与鼠源抗体相似度最高的Germline序列，而是兼顾相似性及人体使用频率，经过大量实验筛选，选择了IGKV3-20*01和IGHV1-69*01两个序列的骨架区进行人源化。本发明选用人抗体Germline骨架区进行CDR移植，这样构建的人源化抗体结构更加稳定、表达量高、免疫原性低、成药性更高。

具体地，如本发明第一方面至第五方面所述：

人源化单抗LeuH1L3轻链可变区(SEQ ID NO.16)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVNYMDWYQQKPGQAPRLLIYATSSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQGTKLEIK

人源化单抗LeuH1L3重链可变区(SEQ ID NO.14)

人源化单抗LeuH2L2轻链可变区(SEQ ID NO.15)

人源化单抗LeuH2L2重链可变区(SEQ ID NO.13)

在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。

本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以优选为全人源化抗体。

本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab’、(Fab’)₂、或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。

本发明抗体可以是靶向CD20的人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。

本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。

本发明对CD20鼠单抗成功进行了人源化改造，人源化后的抗体达到与嵌合抗体相近的亲和力(可达一个数量级)，通过对该人源化抗体溶解度及内源荧光的初步研究，证实该人源化已具备初步的成药性，未来有进一步开发成靶向治疗的人源化单抗药物。

在本发明中，本发明的人源化抗体的重链可变区或轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别如图3-6中横线处所示。

抗体的制备

任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本发明的CD20抗体。例如，可以用连接或天然存在的CD20蛋白或其片段免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。

任何合适形式的CD20都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对CD20特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。免疫原可以由天然来源纯化，或者在遗传修饰的细胞中产生。编码免疫原的DNA在来源上可以是基因组或非基因组的(例如cDNA)。可以使用合适的遗传载体表达编码免疫原的DNA，所述载体包括但不限于腺病毒载体、杆状病毒载体、质粒和非病毒载体。

人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。同样，任一类轻链都可以在本文的化合物和方法中使用。具体地说，κ、λ链或其变体在本发明的化合物和方法中是可以用的。

人源化本发明CD20抗体的示例性方法描述于实施例1。

本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。

术语“载体”是指能够运输己与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物或动物细胞(如哺乳动物细胞)。

本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域熟知的技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，转化子表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，用常规培养基在合适的条件下培养。

通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。

抗体制剂

抗体在不同的制剂缓冲液中具有不同的稳定性，表现为电荷异质性的变化、抗体分子的降解、聚合等，这些质量性质的变化与抗体本身的理化性质相关，因此，在抗体药物开发过程，需根据不同抗体的理化性质筛选适合其自身的制剂缓冲液。目前常用的抗体制剂缓冲体系有磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、组氨酸缓冲液等，同时根据抗体性质会添加不同浓度的盐离子或山梨醇、海藻糖、蔗糖等赋形剂，以及适量的吐温20或吐温80等表面活性剂，以维持抗体的稳定性。

本发明抗体制剂如本发明第七方面所述。

本发明的抗体药物组合制剂可有效抑制本发明人源化抗体的聚集沉淀、水解、氧化及脱酰胺等副反应，同时能有效提高产品在加压(高温、强光照射及冻融等)、加速及长期冷藏条件下的稳定性。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。

本发明的药物组合物可直接用于结合CD20蛋白分子，因而可用于预防和治疗CD20相关的疾病。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的药物组合物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内。

检测用途和试剂盒

本发明的抗体可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。

本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。

本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。

本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。

本发明的主要优点

(1)本发明首次开发了一种亲和力与鼠源抗体接近(可达一个数量级)的人源化的CD20抗体。

(2)本发明首次获得了一种人源化的CD20抗体序列。

(3)本发明的人源化抗体可以降低鼠源CD20抗体在人体产生的免疫排斥。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

本发明实施例或测试例中未注明具体条件的实验，通常按常规条件进行，或按照原料/商品制造商建议的条件；未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1

一、实验步骤1、人源化设计

根据CD20抗体重链和轻链的氨基酸序列信息(Leu-16克隆)进行人源化设计，保留原始抗体的CDR区序列不变，根据germline alignment的结果以及抗体结果模拟的结果，重链和轻链分别选择不同的人源抗体模版，并设计以下候选的人源化抗体序列。

人源化候选抗体氨基酸序列信息：

>H1

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQRLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSNYYGSSYWFFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.:14)

>H2

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSNYYGSSYWFFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.:13)

>H3

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATSNYYGSSYWFFDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO.:7)

>L1

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVNYMDWYQQKPGQAPRLLIYATSSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO.:8)

>L2

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVNYMDWYQQKPGQAPRLLIYATSSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO.:15)

>L3

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVNYMDWYQQKPGQAPRLLIYATSSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO.:16)

对应的核酸编码序列信息如下：

>H1

CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCAGCTACAACATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCCAAAGACTTGAATGGATGGGCGCCATCTATCCCGGCAACGGCGACACCTCCTACAACCAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCATCACCAGAGACACATCTGCCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAAGCAACTACTACGGCAGCAGCTACTGGTTCTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTTTCTTCT(SEQ IDNO.:9)

>H2

CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCAGCTACAACATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGACAAGGACTTGAATGGATGGGCGCCATCTATCCCGGCAACGGCGACACCTCCTACAACCAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCATGACCAGAGACACCAGCACAAGCACCGTGTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAAGCAACTACTACGGCAGCAGCTACTGGTTCTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTTTCTTCT(SEQ IDNO.:10)

>H3

CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGTGTCCGGCTACACCTTTACCAGCTACAACATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGATGGGCGCCATCTATCCCGGCAACGGCGACACCTCCTACAACCAGAAATTCAAGGGCAGAGTGACCATGACCGAGGACACCAGCACCGATACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAAGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCAGCAACTACTACGGCAGCAGCTACTGGTTCTTCGACGTGTGGGGCAAGGGCACCACCGTGACAGTTTCTTCT(SEQ IDNO.:11)

>L1

GAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGCACACTGTCACTGTCTCCAGGCGAAAGAGCCACACTGAGCTGTAGAGCCAGCAGCAGCGTGAACTACATGGACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCTAGACTGCTGATCTACGCCACAAGCAGCGGCATCCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGACTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAATCCTCCTACCTTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG(SEQ ID NO.:12)

>L2

GAGATCGTGCTGACACAGTCTCCCGCCACACTGTCACTGTCTCCAGGCGAAAGAGCCACACTGAGCTGTAGAGCCAGCAGCAGCGTGAACTACATGGACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCTAGACTGCTGATCTACGCCACAAGCAGCGGCATCCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGACTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAATCCTCCTACCTTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG(SEQ ID NO.:19)

>L3

GAGATCGTGCTGACACAGTCTCCCGCCACACTGTCACTGTCTCCAGGCGAAAGAGCCACACTGAGCTGTAGAGCCAGCAGCAGCGTGAACTACATGGACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCTAGACTGCTGATCTACGCCACAAGCTCTGGCATCCCCGCCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATAAGCAGCCTGGAACCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAATCCTCCTACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG(SEQ ID NO.:20)

2、人源化抗体基因合成及表达载体构建

将上述设计的人源化抗体的重链和轻链分别进行基因合成，重链亚克隆至pcDNA3.1-IgG1Fc表达载体，轻链亚克隆至pcDNA3.1-IgKc表达载体。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备无内毒素质粒。

3、人源化抗体表达及纯化

3.1从冰箱中取出LVTransm转染试剂及单链抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS或HBSS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入65μg pcDNA3.1-IgG1Fc和65μg pcDNA3.1-IgKc，移液枪上下吹打充分混匀后，加入400μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

3.2将上述DNA/LVTransm复合物加入到50mL 293F-SVP16细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱，130RPM培养6～8小时后，加入50mL新鲜的CD-CHO培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。

3.3连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化单链抗体。

4流式鉴定人源化抗体与靶蛋白的结合

4.1从液氮中复苏Raji细胞，使用1640、10％FBS完全培养基调整细胞状态至对数生长期。

4.2将Raji细胞分为若干份，每份细胞的数量为1*10^6个细胞，使用1mL PBS重悬细胞，分别加入纯化的人源化全抗体，充分混匀后，室温孵育半小时。

4.3 800xg室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次；

4.4加入2uL PE标记的Anti-human IgG，充分混匀后，室温避光孵育30min；

4.5 800xg室温离心5分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；

4.6使用500uL PBS重悬细胞，进行流式分析

实验结果

1.人源化抗体的重链和轻链表达载体测序结果

所有构建的重链和轻链表达载体均经Sanger测序，测序结果与目的序列一致。

结果表明，测序结果同本发明的序列是完全一致的。

2.人源化全抗体流式细胞检测结果

结果：根据流式检测结果(如图1所示)，从不同的人源化抗体中选取2个流式检测亲和力较高的人源化载体(LeuH1L3和LeuH2L2)进行大量全抗体的表达纯化。

3、全抗的表达纯化

如图2所示，结果表明人源化抗体在蛋白水平上正常表达。

4、抗体人源化前后序列对比

结果如图3，4,5，6所示，为两个人源化抗体与鼠源抗体的重链和轻链可变区比对结果。

5、流式亲和力检测

Leumab抗体梯度稀释检测结果如图7所示。

LeuH1L3抗体梯度稀释检测结果如图8所示。

LeuH2L2抗体梯度稀释检测结果如图9所示。

如图10所示，MFI代表平均荧光强度，为制剂通过流式仪得出的数据。结果分析：根据亲和力检测结果，人源化抗体LeuH1L3、LeuH2L2与嵌合抗体Leumab的亲和力处于相一致，可达到一个数量级。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 博生吉医药科技（苏州）有限公司

<120> 抗CD20的人源化单克隆抗体及其制剂

<130> P2018-2419

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Tyr Pro Gly Asn Gly Asp

1 5

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val

1 5 10

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Ser Ser Val Asn Tyr

1 5

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

1 5 10

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met

20 25 30

Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala

65 70 75 80

Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly

85 90 95

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100

<210> 9

<211> 366

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Thr Cys

1 5 10 15

Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys Gly Ala Ala Gly Thr

20 25 30

Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys

35 40 45

Thr Cys Thr Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr

50 55 60

Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr Ala

65 70 75 80

Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Thr Ala Cys

85 90 95

Ala Ala Cys Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys

100 105 110

Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala

115 120 125

Ala Ala Gly Ala Cys Thr Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Ala Thr Gly

130 135 140

Gly Gly Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys Thr Ala Thr Cys Cys Cys Gly

145 150 155 160

Gly Cys Ala Ala Cys Gly Gly Cys Gly Ala Cys Ala Cys Cys Thr Cys

165 170 175

Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Ala Ala Ala Thr Thr Cys

180 185 190

Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Ala

195 200 205

Thr Cys Ala Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Ala Cys Ala Thr Cys

210 215 220

Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Thr Ala Cys

225 230 235 240

Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys

245 250 255

Thr Gly Ala Gly Ala Ala Gly Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys

260 265 270

Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys

275 280 285

Gly Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys Thr

290 295 300

Ala Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Ala Cys Thr Gly

305 310 315 320

Gly Thr Thr Cys Thr Thr Cys Gly Ala Cys Gly Thr Gly Thr Gly Gly

325 330 335

Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Cys Ala Gly

340 345 350

Thr Gly Ala Cys Ala Gly Thr Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr

355 360 365

<210> 10

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacaaca tgcactgggt ccgacaggcc 120

cctggacaag gacttgaatg gatgggcgcc atctatcccg gcaacggcga cacctcctac 180

aaccagaaat tcaagggccg cgtgaccatg accagagaca ccagcacaag caccgtgtac 240

atggaactga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaagcaac 300

tactacggca gcagctactg gttcttcgac gtgtggggcc agggcaccac agtgacagtt 360

tcttct 366

<210> 11

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60

tcctgcaagg tgtccggcta cacctttacc agctacaaca tgcactgggt ccgacaggcc 120

cctggcaaag gacttgaatg gatgggcgcc atctatcccg gcaacggcga cacctcctac 180

aaccagaaat tcaagggcag agtgaccatg accgaggaca ccagcaccga taccgcctac 240

atggaactga gcagcctgcg gagcgaagat accgccgtgt actactgcgc caccagcaac 300

tactacggca gcagctactg gttcttcgac gtgtggggca agggcaccac cgtgacagtt 360

tcttct 366

<210> 12

<211> 309

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

gagatcgtgc tgacacagag ccctggcaca ctgtcactgt ctccaggcga aagagccaca 60

ctgagctgta gagccagcag cagcgtgaac tacatggact ggtatcagca gaagcccgga 120

caggccccta gactgctgat ctacgccaca agcagcggca tccccgatag attttctggc 180

agcggctccg gcaccgactt caccctgaca atcagcagac tggaacccga ggacttcgcc 240

gtgtactact gccagcagtg gtccttcaat cctcctacct ttggcggagg caccaaggtg 300

gaaatcaag 309

<210> 13

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 15

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met

20 25 30

Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala

65 70 75 80

Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly

85 90 95

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100

<210> 16

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met

20 25 30

Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala

65 70 75 80

Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln

85 90 95

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100

<210> 17

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met

20 25 30

Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Thr Ser Tyr Ser Leu Tyr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala

65 70 75 80

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly

85 90 95

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100

<210> 19

<211> 309

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

gagatcgtgc tgacacagtc tcccgccaca ctgtcactgt ctccaggcga aagagccaca 60

ctgagctgta gagccagcag cagcgtgaac tacatggact ggtatcagca gaagcccgga 120

caggccccta gactgctgat ctacgccaca agcagcggca tccccgatag attttctggc 180

agcggctccg gcaccgactt caccctgaca atcagcagac tggaacccga ggacttcgcc 240

gtgtactact gccagcagtg gtccttcaat cctcctacct ttggcggagg caccaaggtg 300

gaaatcaag 309

<210> 20

<211> 309

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

gagatcgtgc tgacacagtc tcccgccaca ctgtcactgt ctccaggcga aagagccaca 60

ctgagctgta gagccagcag cagcgtgaac tacatggact ggtatcagca gaagcccgga 120

caggccccta gactgctgat ctacgccaca agctctggca tccccgccag attttctggc 180

agcggctctg gcaccgattt caccctgacc ataagcagcc tggaacctga ggacttcgcc 240

gtgtactact gccagcagtg gtccttcaat cctcctacct ttggccaggg caccaagctg 300

gaaatcaag 309

Claims

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述抗体重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO.:1所示的CDR1，

SEQ ID NO.:2所示的CDR2，和

SEQ ID NO.:3所示的CDR3，

2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。

3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述抗体轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO.:4所示的CDR1，

SEQ ID NO.:5所示的CDR2，和

SEQ ID NO.:6所示的CDR3，

4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区。

5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：

(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或

(2)如权利要求3所述的轻链可变区。

6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：

(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

7.一种抗体制剂，其特征在于，所述的抗体制剂包括：

(a)如权利要求5所述的抗体；以及

8.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有权利要求7所述的抗体制剂，以及盛装所述抗体制剂的容器。

9.一种CAR构建物，其特征在于，所述的CAR构建物的抗原结合区域的scFv段为特异性结合于CD20的结合区，并且所述scFv具有如权利要求1所述的重链可变区和如权利要求3所述的轻链可变区。

10.一种重组的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞表达外源的如权利要求9所述的CAR构建物。