CN111100204A

CN111100204A - 靶向cd20的抗体、其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111100204A
Application number: CN201911174622.5A
Authority: CN
Inventors: 黄宁
Original assignee: Shandong Lifei Biological Industry Co ltd
Current assignee: Shandong Lifei Biological Industry Co ltd
Priority date: 2019-11-26
Filing date: 2019-11-26
Publication date: 2020-05-05
Anticipated expiration: 2039-11-26
Also published as: CN111100204B

Abstract

本发明提供了一种靶向CD20的抗体、其制备方法和应用。具体地，本发明提供了一种新的抗CD20单克隆抗体。本发明的抗体能够高特异性地结合CD20抗原，具有很高的亲和力及很低的免疫原性，并且用于制备预防或治疗CD20相关的疾病。

Description

靶向CD20的抗体、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及靶向CD20的抗体、其制备方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高居第二位。非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin’s lymphoma，NHL)是临床最常见的淋巴系统恶性肿瘤，其中B细胞来源的约占85％，好发于青壮年，发病率和病死率呈逐年上升趋势。根据病情特点，NHL可分为低、中、高三度。其中低度和部分中度NHL病程进展缓慢，统称为惰性NHL。它们对首次化疗敏感，但很容易复发或耐药，当再次化疗或放疗时，疗效明显降低，因而被认为是难以治愈的恶性肿瘤。近年来，单克隆抗体及其导向治疗NHL的临床试验研究取得了重大进展，其中被广泛使用且富有成效的是抗CD20的单抗制剂。

目前采用抗CD20抗体治疗非霍奇金淋巴瘤已取得了较好的疗效。Rituxan(Rituximab，C2B8)为美国基因科技公司研制的以CD20为靶点的单克隆抗体，它是一种人鼠嵌合基因工程抗体，包含了鼠单克隆抗体的可变区基因和人抗体的恒定区基因。Rituxan已于1997年11月获FDA的批准上市，用于复发性或顽固性低度或滤泡性非霍奇金淋巴瘤的临床治疗。尽管C2B8抗体在临床治疗中已显示出较好的疗效，仍有52％的病人对C2B8治疗不产生反应。

因此，寻求更为有效用于治疗B淋巴瘤的CD20抗体药物显得尤为迫切。

发明内容

本发明目的是提供了一种抗CD20的抗体、其制备方法和用途。

本发明的第一方面，提供了一种抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中，

所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID NO.:1所示的CDR1，SEQID NO.:2所示的CDR2，和SEQ ID NO.:3所示的CDR3；

所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID NO.:4所示的CDR1’，SEQID NO.:5所示的CDR2’，和SEQ ID NO.:6所示的CDR3’。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:7所示；和/或

所述抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:8所示。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:9所示；和/或

所述抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:10所示。

在另一优选例中，所述抗体包括序列如SEQ ID NO.:7所示的重链可变区；和序列如SEQ ID NO.:8所示轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体包括序列如SEQ ID NO.:9所示的重链可变区；和序列如SEQ ID NO.:10所示轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述抗体为单特异性、双特异性或者多特异性。

本发明的第二方面，提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：

(a)抗体部分，所述抗体部分为本发明第一方面所述的抗体；和

(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。

本发明的第三方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)如本发明第一方面所述的抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。

在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。

在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。

本发明的第四方面，提供了一种嵌合抗原受体，所述的嵌合抗原受体的抗原结合区域为特异性结合于CD20的结合区，并且所述抗原结合区域具有重链可变区和轻链可变区，其中

本发明的第五方面，提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明第四方面所述的嵌合抗原受体。

在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：NK细胞、T细胞。

在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。

本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：

(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的抗体、或如本发明第二方面所述的抗体药物偶联物、或如本发明第三方面所述的重组蛋白、或如本发明第四方面所述的嵌合抗原受体、或如本发明第五方面所述的免疫细胞、或其组合；以及

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。

在另一优选例中，所述药物组合物还含有选择性杀伤肿瘤细胞的其他药物(如核酸药物、抗体药物、靶向性药物，其他免疫细胞药物、其他CAR-T药物、化疗药物、或其组合)。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤为高表达CD20的肿瘤。

本发明的第七方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的抗体、或如本发明第二方面所述的抗体药物偶联物、或如本发明第三方面所述的重组蛋白、或如本发明第四方面所述的嵌合抗原受体、或如本发明第五方面所述的免疫细胞、或其组合，所述活性成分用于所述活性成分用于(a)制备检测试剂或试剂盒；(b)制备预防和/或治疗CD20相关疾病的药物或制剂；和/或(c)制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述活性成分用于预防和/或治疗CD20相关疾病。

在另一优选例中，所述的检测试剂或试剂盒用于诊断CD20相关疾病。

在另一优选例中，所述检测试剂或试剂盒用于检测样品中CD20蛋白。

在另一优选例中，所述的检测试剂为检测片。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金淋巴瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、或其组合。

在另一优选例中，所述肿瘤为高表达CD20的肿瘤。

本发明的第八方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：

(1)如本发明第一方面所述的抗体；或

(2)如本发明第三方面所述的重组蛋白；或

(3)如本发明第四方面所述的嵌合抗原受体。

本发明的第九方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第八方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

本发明的第十方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第九方面所述的载体或基因组中整合有本发明第八方面所述的多核苷酸。

本发明的第十一方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第十方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明第一方面所述的抗体或如本发明第三方面所述的重组蛋白。

本发明的第十二方面，提供了一种CD20相关疾病的方法，所述方法包括：给需要的对象施用如本发明第一方面所述的抗体、或如本发明第二方面所述的抗体药物偶联物、或如本发明第三方面所述的重组蛋白、或如本发明第五方面所述的免疫细胞、或其组合。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，意外地获得一种具有极其优异的亲和力和特异性的抗CD20单克隆抗体，基于该抗体而获得的人源化抗体。本发明抗体能够高特异性地结合CD20抗原，而对于哺乳动物本身没有可见的毒副作用。在此基础上完成了本发明。

术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括抗CD20抗体与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。

如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种CD20结合物及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。

如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。

本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,100％。

CD20

CD20表达于除浆细胞外的发育分化各阶段的B细胞的表面，过调节跨膜钙离子流动直接对B细胞起作用，在B细胞增殖和分化中起重要的调节作用。CD20抗原是一种B细胞分化抗原，仅位于前B细胞和成熟B细胞，它在95％以上的B细胞性淋巴瘤中表达，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达。因此CD20是靶向治疗B细胞淋巴瘤和白血病的理想靶点。

抗体

如本文所用，术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的不同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为a、d、e、g、和m。IgG代表免疫球蛋白中最重要的一类，由于化学结构和生物功能差异，它又可以分为4个子类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ或λ链。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的FR区(FR)。4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区，即轻链高变区(LCDR),指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR区，即重链高变区(HCDR),指HCDR1、HCDR2和HCDR3。发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。天然重链和轻链可变区中的四个FR区大致上呈b-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分b折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

如本文所用，术语“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。

如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。

如本文所用，术语“单克隆抗体”指得自单个细胞来源的克隆分泌的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原表位。所述的细胞可能是真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。

如本文所用，术语“嵌合抗体”是由鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染宿主细胞表达的抗体分子。既保留了亲本鼠抗体的高特异性和亲和力，又使其人源Fc段能有效介导生物学效应功能。

如本文所用，术语“人源化抗体”，是本发明鼠抗的一种可变区改造形式，具有源自(或基本上源自)非人类抗体(优选小鼠单克隆抗体)的CDR区，和基本源自人源抗体序列的FR区和恒定区；即将鼠抗的CDR区序列嫁接到不同类型的人种系抗体构架序列上。因为CDR序列负责大部分的抗体-抗原相互作用，所以可以通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体性质的重组抗体。

在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。

在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

本发明提供一种针对CD20的高特异性和高亲和力的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。

优选地，重链可变区(VH)氨基酸序列和轻链可变区(VL)氨基酸序列的各自CDR选自下组：

a1)SEQ ID NO.:1；

a2)SEQ ID NO.:2；

a3)SEQ ID NO.:3；

a4)SEQ ID NO.:4；

a5)SEQ ID NO.:5；

a6)SEQ ID No.:6；

a7)上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-5、1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸的具有CD20结合亲和力的序列。

在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。

本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。

本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab’、(Fab’)₂或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。

其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。

本发明抗体可以是靶向人CD20的鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。

在本发明的一种更优选实施例中，VH CDR1、CDR2、CDR3分别独立地选自SEQ IDNO.:1-3中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有CD20结合亲和力的序列；VL CDR1、CDR2、CDR3分别独立地选自SEQ ID NO.:4-6中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有CD20结合亲和力的序列。

本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。

在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。

抗体的制备

任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本发明的抗CD20抗体。例如，可以用连接或天然存在的CD20同源二聚体或其片段免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。

任何合适形式的CD20都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对CD20特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。激发免疫原可以是全长的成熟人CD20，包括天然的同源二聚体，或含单个/多个表位的肽。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。免疫原可以由天然来源纯化，或者在遗传修饰的细胞中产生。编码免疫原的DNA在来源上可以是基因组或非基因组的(例如cDNA)。可以使用合适的遗传载体表达编码免疫原的DNA，所述载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体、质料和非病毒载体。

人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本发明中，抗体是IgG抗体，使用IgG1亚型。通过用下文实施例中描述的生物学测定筛选抗体易于实现必需恒定结构域序列的最优化，以产生所需生物学活性。

同样，任一类轻链都可以在本文的化合物和方法中使用。具体地说，κ、λ链或其变体在本发明的化合物和方法中是可以用的。

本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、CHO-K1、HEK-293细胞。

本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域熟知的技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，转化子表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，用常规培养基在合适的条件下培养。

通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。

本发明的药物组合物可直接用于结合CD20蛋白分子，因而可用于预防和治疗CD20相关的疾病。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的药物组合物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

检测用途和试剂盒

本发明的抗体可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。

本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。

本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。

本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。

本发明的主要优点

本发明抗体具有优异的生物活性和特异性，并具有很高的亲和力，而对于哺乳动物本身没有可见的毒副作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1抗人CD20的小鼠单克隆抗体的制备方法

1.1制备产生鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞

首先用人的CD20蛋白作为抗原，与佐剂乳化后对BALB/c小鼠进行多点皮下免疫，监测免疫小鼠血清效价，达到要求后取小鼠的脾细胞与骨髓瘤(Sp2/0)细胞进行融合，经过HAT筛选，获得的杂交瘤多克隆细胞。

1.2间接ELISA——杂交瘤细胞的筛选方法

使用ELISA检测方法筛选出高特异性结合的多克隆，进行单克隆化培养，再使用ELISA方法筛选高特异性结合的单克隆细胞株；然后用Biacore方法分析亲和力及半衰期，最终得到表达CD20抗体的单克隆细胞。

将人CD20用CBS配制成1μg/ml包被液，50μL/孔加入酶标板，2～8℃包被12小时以上弃去包板残液，加入3％牛奶，每孔200μL，室温封闭1小时。每孔加入不少于200μL的PBST洗1次，将杂交瘤上清稀释至100μg/ml，再10倍稀释10个梯度，100μL/孔加入酶标板。室温孵育1小时，每孔加不少于200μL的PBST，洗涤4次后加入3％牛奶-PBST稀释25000倍的HRP偶联的羊抗鼠IgG Fc，100μL/孔加样。室温孵育1小时后，每孔加不少于200μL的PBST，洗涤6次，拍干。加入TMB显色液，每孔100μL。室温反应5分钟后加2M H₂SO₄终止反应，50μL/孔。将中止反应的酶标板置酶标仪上，读取450nm波长读取吸光度A450值。

表1.杂交瘤对人CD20结合活性比较

样品名称	EC<sub>50</sub>(ng/mL)
		A2B3	910.9
A8D1	334.6
		B11F3	744.4
D8C6	260.1
		E1D9	326.7
E5H6	198.9
		G11F3	418.6

结果如表1所示。由表1可以看出，在众多筛选出的抗体中，杂交瘤E5H6产生的抗体与人CD20结合活性较高。

实施例2抗CD20抗体的V-基因序列克隆

测定由杂交瘤E5H6表达的小鼠抗体(命名为M12)可变区的编码DNA序列和氨基酸序列。测序结果显示杂交瘤E5H6表达的抗CD20抗体M12的可变区序列如下：

抗CD20抗体M12的重链可变区序列VH(SEQ ID NO：7)

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASSYMHAVGMNWVKEAPGKAFKWMGWIYADSGTGGVTYVKGIIPTYAEDFKGRFAFSLDSSATSAFLQISNLKDDDTGTYFCDYYDGLYGMDVYGAGSFWGQGTTLTVSS

其中，下划线为CDR1、CDR2、CDR3(SEQ ID NO.:1-3)。

抗CD20抗体M12的轻链可变区序列VL(SEQ ID NO：8)

DVVMTQTPLSLPVSLRDQASISCISSSYLARASSVSLHWYLQKPGQSPKLLIYDASNARTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAADLGVYFCQSRSDWPTTFGGGTKLEIK

其中，下划线为CDR1’、CDR2’、CDR3’(SEQ ID NO.:4-6)。

表2:鼠源抗CD20抗体M12的CDR序列

实施例3人源化抗体的制备

3.1人源化抗体的制备

通过将PCR克隆的小鼠抗体M12的VH和VL区cDNA分别与人IgG1和k恒定区连接，来构建嵌合重链和轻链。并将抗体的可变链序列与NCBI蛋白质数据库中的可用序列比较，通过鉴定和分析，最终确定了合适在其上构建CDR移植重链和轻链的人构架。

改装时，根据人抗体FR区保守的氨基酸残基以及抗体FR区中重要的氨基酸残基，设计改造位点，对嵌合抗体的重轻链的可变区分别进行人源化突变设计，利用PCR技术扩增并构建人源化点突变抗体表达质粒。将人源化点突变抗体表达质粒分别经CHO-K1(ATCC，NO.CCL-61)细胞分别表达，纯化后得到人源化抗体蛋白。利用ELISA，受体结合抑制实验，Biacore和细胞活性检测等，获得了一种性能非常优异的人源化抗体HB12。

HB12抗体的VH和VL序列分别如SEQ ID NO.:9和10所示：

HB12抗体的重链可变区序列VH(SEQ ID NO：9)

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASSYMHAVGMNWVKQAPGQGFEWMGWIYADSGTGGVTYVKGIIPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYYCDYYDGLYGMDVYGAGSFWGQGTTVTVSS

HB12抗体的重链可变区序列VH(SEQ ID NO：10)

DVVMTQTPPSLPVNPGEPASISCRSSSYLARASSVSLHWYLQKPGQSPQLLIYDASNARTNHLSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISWVEAEDVGVYFCQSRSDWPTTFGGGTKLEIK

3.2人源化抗体的测定

方法同实施例1，用M12抗体和HB12抗体代替杂交瘤上清，用HRP偶联的兔抗人IgGFc抗体代替HRP偶联的羊抗鼠IgG Fc，测定与重组人CD20结合活性。

表3.HB12抗体对人CD20结合活性比较

样品	EC<sub>50</sub>(ng/ml)
		阴性对照(PBS)	-
M12抗体	38.3
		HB12抗体	25.6

实验结果表明，经过人源化改造，本发明人意外地获得了对人CD20结合活性不仅没有下降，反而有进一步提高的人源化抗体HB12。实验结果表明，与鼠源抗体相比，人源化抗体HB12具有更好的亲和力和特异性，本发明抗体HB12的EC₅₀值更低，具有与人CD20更强的结合活性。

实施例4人源化单克隆抗体的亲和性检测

用氨基偶联试剂盒在S系列传感器芯片(Sereis S Sensor Chip CM5)上氨基偶联固定人抗体捕获抗体(Human Antibody Capture Antiboy)，抗人捕获-CM5芯片(Anti-Human Capture-CM5芯片)。室温平衡20～30min，将芯片装入仪器。用平衡缓冲液稀释抗原，稀释抗原10nM起始稀释度5个浓度梯度，并设置2个零浓度(即平衡缓冲液)和一个重复浓度(一般为最低浓度重复)。用平衡缓冲液将抗体样品稀释至实验工作浓度，2～8℃密封备用。样品分析完成后，选用对应的分析程序对数据分析，确认无明显参照结合(referencebinding)，选用动力学，1：1结合模型(Kinetics，1:1binding modle)，拟合分析获得样品的动力学参数。

结果显示，HB12抗体与人CD20亲和力的KD(M)值为2.18E-11。与人CD20的亲和力常数(KD(M))的结果显示，本发明HB12抗体的亲和力具有很强的亲和力。

实施例5人源化单克隆抗体HB12的功能初步鉴定

5.1细胞增殖-抑制实验检测抗CD20重组抗体对Raji细胞的抑制功能

Raji细胞培养：以含10％胎牛血清的RPMI medium 1640(solarbio)完全培养基，于37℃、5％CO₂的培养箱中进行培养，当细胞汇合度达到80％时进行传代。

Raji细胞以3×10⁴个/孔接种于96孔板，加入构建的重组载体表达的抗CD20人源化抗体HB12，转染空载体的细胞裂解液作为对照组，于37℃共孵育24h，加入CCK-8溶液，10μl/孔，37℃孵育后于酶标仪读取A450。

抑制率＝[(Ac-As)]/[(Ac-Ab)]×100％

Ac：对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8，不含表达抗体)

As：实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8，表达的抗体)

Ab：空白孔(不含有细胞的培养基、CCK-8，不含表达抗体)

结果显示，HB12抗体对Raji细胞的抑制率约为31％，对照组(空载体组)对Raji细胞的抑制率约为10％，从而表明HB12抗体对Raji细胞具有致凋亡作用。

5.2细胞增殖-抑制实验检测抗CD20重组抗体对Raji细胞的补体依赖的细胞毒功能(CDC)检测

Raji细胞接种于96孔板，加入抗CD20人源化抗体HB12，转染空载体的细胞裂解液作为对照组，37度共孵育1h，加入健康人血清30μl，37℃共孵育4h，加入CCK-8溶液，10μl/孔，37℃孵育后于酶标仪读取A450。

抑制率＝[(Ac-As)]/[(Ac-Ab)]×100％

Ac：对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8，不含表达抗体)

As：实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8，表达的抗体)

Ab：空白孔(不含有细胞的培养基、CCK-8，不含表达抗体)

结果显示，抗CD20人源化抗体HB12对Raji细胞的抑制率约为27％，对照组对Raji细胞的抑制率约为8％。可以看出，抗体HB12具有优于对照组的CDC作用，说明抗体HB12对Raji细胞具有补体依赖的细胞毒功能。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 山东立菲生物产业有限公司

<120> 靶向CD20的抗体、其制备方法和应用

<130> QHI191060

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

Ser Tyr Met His Ala Val

1 5

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

Tyr Ala Asp Ser Gly Thr Gly Gly Val Thr Tyr Val Lys Gly Ile Ile

1 5 10 15

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 3

Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Tyr Gly Met Asp Val Tyr Gly Ala Gly Ser

1 5 10 15

Phe

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 4

Ser Tyr Leu Ala Arg Ala Ser Ser Val Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 5

Asp Ala Ser Asn Ala Arg Thr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 6

Gln Ser Arg Ser Asp Trp Pro Thr Thr

1 5

<210> 7

<211> 133

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 7

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Ser Tyr Met His Ala Val Gly

20 25 30

Met Asn Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Lys Ala Phe Lys Trp Met Gly

35 40 45

Trp Ile Tyr Ala Asp Ser Gly Thr Gly Gly Val Thr Tyr Val Lys Gly

50 55 60

Ile Ile Pro Thr Tyr Ala Glu Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser

65 70 75 80

Leu Asp Ser Ser Ala Thr Ser Ala Phe Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys

85 90 95

Asp Asp Asp Thr Gly Thr Tyr Phe Cys Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Val Tyr Gly Ala Gly Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr

115 120 125

Leu Thr Val Ser Ser

130

<210> 8

<211> 115

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 8

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Arg

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Ile Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Arg Ala

20 25 30

Ser Ser Val Ser Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Ala Arg Thr Asn Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

65 70 75 80

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Ala Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Gln Ser Arg Ser Asp Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100 105 110

Glu Ile Lys

115

<210> 9

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Ser Tyr Met His Ala Val Gly

20 25 30

Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Phe Glu Trp Met Gly

35 40 45

Trp Ile Tyr Ala Asp Ser Gly Thr Gly Gly Val Thr Tyr Val Lys Gly

50 55 60

Ile Ile Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser

65 70 75 80

Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys

85 90 95

Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Val Tyr Gly Ala Gly Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr

115 120 125

Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 10

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Pro Val Asn Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Arg Ala

20 25 30

Ser Ser Val Ser Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Gln Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Ala Arg Thr Asn His Leu Ser

50 55 60

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

65 70 75 80

Leu Lys Ile Ser Trp Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Gln Ser Arg Ser Asp Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100 105 110

Glu Ile Lys

115

Claims

1.一种抗体，其特征在于，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中，

所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID NO.:1所示的CDR1，SEQ IDNO.:2所示的CDR2，和SEQ ID NO.:3所示的CDR3；

所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID NO.:4所示的CDR1’，SEQ IDNO.:5所示的CDR2’，和SEQ ID NO.:6所示的CDR3’。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:7所示；和/或

所述抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:8所示。

3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:9所示；和/或

所述抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:10所示。

4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体选自下组：动物源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

5.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体为单特异性、双特异性或者多特异性。

6.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物含有：

(a)抗体部分，所述抗体部分为权利要求1所述的抗体；和

7.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：

(i)如权利要求1所述的抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

8.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体的抗原结合区域为特异性结合于CD20的结合区，并且所述抗原结合区域具有重链可变区和轻链可变区，其中

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：

(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、或如权利要求6所述的抗体药物偶联物、或如权利要求7所述的重组蛋白、或如权利要求8所述的嵌合抗原受体、或其组合；以及

(ii)药学上可接受的载体。

10.一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、或如权利要求6所述的抗体药物偶联物、或如权利要求7所述的重组蛋白、或权利要求8所述的嵌合抗原受体、或其组合，其特征在于，所述活性成分用于(a)制备检测试剂或试剂盒；(b)制备预防和/或治疗CD20相关疾病的药物或制剂；和/或(c)制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。