CN106117368A - 一种抗cd20特异性嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗CD20特异性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由人抗CD20单链抗体，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞内信号结构串联构成。本发明还公开了上述抗CD20特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的淋巴细胞可用于CD20基因表达相关肿瘤的治疗。

Description

一种抗CD20特异性嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及细胞免疫技术领域，尤其涉及一种抗CD20特异性嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
B淋巴细胞肿瘤是起源于B细胞的恶性血液系统疾病，主要包括：B细胞源行的急性淋巴系统白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)及大部分的慢性淋巴系统白血病(CLL)。其中ALL的发病率最高，并且有逐年增高的趋势。目前的治疗主要通过全身化疗和造血干细胞的移植。大剂量的放化疗，毒副作用强，患者耐受性差，免疫力大大降低，虽然可以缓解，但是复发率高。而且造血干细胞的来源稀缺，配型成功率低。
嵌合抗原受体修饰的T细胞(chimeric antigen receptor；CAR-T)治疗是利用基因工程技术，借助逆转录病毒或者慢病毒载体或者mRNA转导，使得T细胞获得可以识别肿瘤表面抗原，杀伤肿瘤的嵌合抗原受体。CAR-T治疗相比于传统的治疗方法展现出巨大的优势，具体体现在杀伤肿瘤精准性高，CAR-T细胞治疗采用抗原抗体特异性结合的技术，只有肿瘤表面抗原表达的肿瘤细胞被杀伤，对正常细胞的伤害小；杀伤肿瘤范围广泛，只要表达肿瘤相关抗原，CAR-T细胞就能清除，对于转移性肿瘤复发性肿瘤均有效；对于患者而言避免了放化疗的痛苦，恢复健康迅速。
CD20是一种磷酸化蛋白质分子，分子质量约为35kD，属于4次跨膜的蛋白质超家族，为B淋巴细胞表面特有的分化抗原，其可能参与B细胞的增殖、分化、信号转导和钙离子的跨膜传递。CD20分子具有不易脱落、与抗体结合后不内化、在人体血清中无游离形式存在等特征，它表达于90％以上的B淋巴瘤细胞和正常B淋巴细胞CD20特异性的表达于B淋巴细胞的表面，并且各个阶段的B细胞的表面均有表达。CD20表达于95％以上的B细胞肿瘤，包括NHL和CLL。因此CD20成为治疗血液系统肿瘤最具有潜力的靶点。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种抗CD20特异性嵌合抗原受体。
本发明的目的还在于提供上述嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列。
本发明的目的还在于提供上述嵌合抗原受体的应用。
为了实现上述目的，本发明提出的一种抗CD20特异性嵌合抗原受体，由人抗CD20单链抗体，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞内信号结构串联构成。
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述人抗CD20单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述人抗CD20单链抗体的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述人抗CD20单链抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.10所示。
优选地，所述人抗CD20单链抗体的重链分子和轻链分子之间有一个连接肽，其氨基酸序列为：
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个信号肽，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，CD137的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
优选地，CD137的核酸序列如SEQ ID NO.8所示。
优选地，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞内信号结构串联构成的结构域为T细胞共刺激信号传导结构，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明还提出的上述抗CD20特异性嵌合抗原受体在制备治疗CD20相关肿瘤药物中的应用。
其中，CD20表达于95％以上的B细胞肿瘤，包括NHL和CLL等等。
本发明根据实验室从全人源抗体库筛选出CD20抗体Fab，经过密码子优化，基因合成抗CD20的ScFv序列，并将合成ScFv克隆到pSFG-CD8TM-CD137-CD3ζ中，即构建成CD20-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ嵌合抗原受体，即获得本发明的嵌合抗原受体CD20-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ。
利用嵌合抗原受体与慢病毒包装质粒RD114在GP2-293T细胞包装成N慢病毒，利用该病毒感染T淋巴细胞。利用Elisa检测CAR-T细胞在抗原刺激下IFN-γ的分泌及通过流式检测对CD20阳性的癌细胞的杀伤作用。
本发明公布抗CD20特异性的嵌合抗原受体的结构，体外感染T淋巴细胞，修饰后的T淋巴细胞释放IFN-γ等杀伤肿瘤细胞。抗CD20特异性的嵌合抗原受体可以用于CD20基因表达相关肿瘤的靶向治疗。
附图说明
图1为本发明实施例1所得CD20scFv目的片段的电泳图，其中M为标准标记物，scFv为Her2-scFv目的片段。
图2为本发明实施例1所得CD8TM-CD137-CD3ζ目的片段的电泳图，其中M为标准标记物。
图3为本发明实施例2中采用Western Blotting检测本发明所得抗CD20特异性嵌合抗原受体转染293T细胞后的表达。
图4为Western Blotting检测不同的对数生长期肿瘤细胞中CD20的表达。
图5为本发明所得抗CD20特异性嵌合抗原受体修饰的T细胞对肿瘤细胞的杀伤检测。
图6为本发明所得抗CD20特异性嵌合抗原受体修饰的T细胞在受到CD20抗原刺激后IFN-γ的表达。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1：抗CD20特异性嵌合抗原受体慢病毒载体的构建
1.利用本实验室筛选的抗CD20的Fab序列，选出其中VH和VL的序列，用于设计CAR载体中的scFv序列，采用金斯瑞生物技术公司OptimumGeneTM基因设计软件对密码子进行进一步优化，在优化的序列两端分别加上NcoI、BamHI酶切位点，优化后的序列由南京金斯瑞生物技术公司完成基因合成，合成后的序列克隆在pUC57载体，质粒命名为CD20-scFv-pUC57。
2.CD20-scFv-pUC57用限制性内切酶NcoI和BamH I酶切，酶切体系如下：2μgCD20-scFv-pUC57、1μL NcoI、1μL BamH I、2μL 10×酶切缓冲液，用水补到20μL，37℃水浴中过夜，酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外下切取目的条带，采用DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)回收目的片段；其结果如图1所示，pUC57-CD20-ScFv载体经NcoI和BamH I酶切释放目的条带。
用同样的方法NcoI和BamH I酶切pSFG-CD8TM-CD137-CD3ζ载体，用琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。其结果如图2所示，pSFG-CD8TM-CD137-CD3ζ载体经NcoI和BamH I酶切释放目的条带。
将回收后的CD20-ScFv与酶切载体通过T4DNA连接酶连接，反应体系如下：2μLCD20-ScFv、2μL载体酶切产物、1μL 10×连接缓冲液、1μL连接酶，用水补到10μL，16℃水浴中过夜。取连接产物加入到DH5TM感受态中[参考《分子克隆》第三版中大肠杆菌感受态制备(CaCl2法)]，放置37℃细菌培养箱中过夜培养。挑取单个菌落，扩大培养，提取阳性克隆的质粒，经酶切和测序，将正确的载体命名为CD20-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ。
实施例2：抗CD20特异性嵌合抗原受体表达鉴定
参照无内毒素质粒大提试剂盒内(天根生物)的操作说明书提取逆转录病毒载体CD20-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ，提取的质粒，用PI转染试剂转染到人胚肾细胞293T中，48h后，用PBS洗一遍，用细胞蛋白提取试剂(RIPA)裂解细胞，提取转染后的293T细胞的蛋白经10％的SDS-PAGE进行分离后，恒流(300mA，1h)转印至PVDF膜上，用抗CD3ζ(1：1000)抗体孵育，4℃孵育过夜。用PBST洗涤3遍后，用HRP羊抗小鼠的二抗(1：5000)室温孵育1h。加入ECL显色后，用Bio-Rad公司的ChemiDoc XRS System进行成像，其结果如图3所示。
由图3可知：本发明所构建的重组质粒能够检测到目的条带的表达，大小与阳参CD19一致，而未转染的293T细胞没有条带。
实施例3：抗CD20特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞的制备
1.含抗CD20嵌合抗原受体慢病毒的包装
用无内毒素质粒大提试剂盒内(天根生物)的操作说明书提取逆转录病毒包装载体RD114和CD20-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ逆转录病毒载体共转染到GP2-293T细胞中，转染后48h收集细胞上清，4000rpm离心10min，去除上清中的细胞及细胞碎片。用0.45μm的滤膜过滤，分装冻存，备用。
2.T淋巴细胞的制备
采取20mL健康志愿者的新鲜抗凝血，用淋巴分离液(GE公司)分立外周血单核细胞(PBMC)。分离后的细胞用CD3和CD28平板刺激48h，用T淋巴细胞培养基GT-T551(TAKARA公司)加3％自身血浆进行诱导，得到T淋巴细胞。
3.CAR-T细胞的制备
用50μg/mL的RetroNectin(TAKARA公司)包被非组织培养板24孔板，每孔加入500μL，4℃过夜。每孔再加入500μL病毒上清，37℃孵育30min。去除病毒上清，再加入500μL病毒上清，37℃孵育30min，除病毒上清，每孔加入1.5mL病毒上清，再加入0.5mL稀释后的T淋巴细胞。从而获得CD20-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζT细胞即抗CD20特异性CAR-T细胞。
实施例4：抗CD20特异性CAR-T细胞对CD20相关肿瘤的杀伤作用
1.Western Blotting检测肿瘤细胞中CD20的表达
选取对数生长期的白血病细胞Nalm-6和人乳腺癌细胞MCF-7，用细胞蛋白提取试剂(RIPA)裂解细胞，提取细胞蛋白，进行Western Blotting检测，检测结果如图4所示。
2.CAR-T细胞对肿瘤的杀伤力检测
将肿瘤细胞用培养基调整到5×106/mL，每孔50μL，按E：T(效应细胞和靶细胞比)为16：1、8：1、4：1、2：1，分别加入肿瘤细胞2.5×106个、1.25×106个、6.25×105个、3.125×105个；待细胞完全贴壁后，收集T细胞和CAR-T细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，每孔50μL，培养12h。弃上清加入100μL稀释的CCK8，孵育4～6小时，酶标仪检测OD450的吸光值。
上述肿瘤细胞为白血病细胞Nalm-6和人乳腺癌细胞MCF-7。
检测结果如图5所示：CAR-T细胞对CD20表达的肿瘤的杀伤率高于T细胞。
3.ELISPOT检测CAR-T细胞在受到CD20抗原刺激后IFN-γ的表达
用无菌包被液稀释IFN-γ抗体后加入ELISPOT(Millipore，Cat.No.MAIPS4510)平板中，每孔100μL，4℃放置过夜。第二天用无菌的包被液将平板洗涤2遍。每孔加入200μL完全培养基，室温封闭1h。洗去含血清的细胞培养液RPMI-1640，用PBS洗三遍。准备CD20胞外区多肽，稀释在含血清的细胞培养液RPMI-1640，调至终浓度1μg/mL，每孔100μL。调整待检测CAR-T细胞浓度为1×106/mL，每孔加入100μL，37℃，5％CO2放置24h，弃去细胞及培养基，用ELISPOT洗涤液洗涤3遍。每孔加入生物素标记的检测抗体，100μL/孔，4℃放置过夜。再用ELISPOT洗涤液洗涤4遍。每孔加入HRP标记的亲和素，100μL/孔，室温放置45min。用ELISPOT洗涤液洗涤3遍后，用PBS洗涤2遍。每孔加入100μL ACE显色底物，室温显色20～60min。待出现明显集落点后，用无菌水洗涤3遍终止反应。空气中晾干平板，用ELISPOT读板机计算形成的斑点数，其结果如图6所示。由图6可知：CAR-T细胞在特异性CD20抗原刺激下能够分泌IFN-γ。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗CD20特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由人抗CD20单链抗体，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞内信号结构串联构成。
2.根据权利要求1所述抗CD20特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述抗CD20特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述抗CD20特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述人抗CD20单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；优选地，所述人抗CD20单链抗体的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述抗CD20特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述人抗CD20单链抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；优选地，所述重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.10所示。
6.根据权利要求1-5任一项所述抗CD20特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述人抗CD20单链抗体的重链分子和轻链分子之间有一个连接肽，其氨基酸序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。
7.根据权利要求1-6任一项所述抗CD20特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个信号肽，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
8.根据权利要求1-7任一项所述抗CD20特异性嵌合抗原受体，其特征在于，CD137的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；优选地，CD137的核酸序列如SEQ ID NO.8所示。
9.根据权利要求1-8任一项所述抗CD20特异性嵌合抗原受体，其特征在于，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞内信号结构串联构成的结构域为T细胞共刺激信号传导结构，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
10.如权利要求1-9任一项所述抗CD20特异性嵌合抗原受体在制备治疗CD20相关肿瘤药物中的应用。
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