CN101560255A - 抗狂犬病病毒单克隆抗体及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明抗狂犬病病毒单克隆抗体及其制备方法、应用涉及的是生物医学领域，具体涉及一种能识别狂犬病病毒的单克隆抗体的制备及其应用。本发明单克隆抗体经间接酶联免疫法筛选，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析、斑点ELISA、免疫印迹分析等方法鉴定了其与抗原结合的特异性和亲和力等特性。本发明的抗狂犬病毒单克隆抗体可应用于狂犬病病毒的抗原的多种检测方法中，也可应用于制备狂犬病病毒检测试剂盒。一种抗狂犬病病毒的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC No.3014的抗狂犬病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株2C5所分泌。

Description

抗狂犬病病毒单克隆抗体及其制备方法、应用

技术领域

本发明抗狂犬病病毒单克隆抗体及其制备方法、应用涉及的是生物医学领域，具体涉及一种能识别狂犬病病毒的单克隆抗体的制备及其应用。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus)引起的世界性人兽共患传染病。人和动物一旦发病死亡率高达100％。全球每年约有55,000人死于狂犬病，主要集中在亚非拉发展中国家。人类患者多因病畜咬伤而感染，出现以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁等为主要特征的中枢神经系统感染疾病。该病流行广、宿主多，几乎所有温血动物都能被感染，以各种哺乳动物为主要宿主，是一种危害非常严重的人畜共患急性传染病，是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，也是人类尚未能有效控制的疫病之一。

狂犬病毒属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒属。病毒颗粒由外壳和核心两部分组成。外壳为一紧密完整的脂蛋白双层包膜，表面嵌有数量众多的由病毒糖蛋白构成的槌状包膜突起，它覆盖了除平端外的整个病毒表面，是病毒主要的表面抗原，也是病毒惟一的糖基化蛋白。病毒包膜内侧主要是膜蛋白，亦称基质蛋白。膜蛋白内侧为病毒核心，即一个直径为40nm的核衣壳，由核酸和紧密包在它外面的核蛋白所构成，呈紧密的连续性螺旋形式，有30～35个卷曲，另外2种核衣壳核心的蛋白为大转录酶蛋白或称RNA多聚酶和磷酸化蛋白。

目前，对于狂犬病病毒检测的方法主要有病毒形态学观察、组织病理学检测、小鼠颅内接种分离狂犬病病毒法等，但操作较为繁琐，或需要使用电镜等设备。近年来从动物和人类唾液中检测狂犬病毒抗原的方法也有较大发展，如酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光技术(IFA)，具有快速、特异敏感、不受标本量限制、节约试剂和试验成本费用较低等优点。Kohler和Milstein于1975年创立的B淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体(monoclonal antibodies，McAb)技术，作为一类用于基础研究，实验室诊断，临床治疗和预防的新型产物，其应用价值和开发前景已获得普遍的肯定。

而目前在我国流行的狂犬病病毒株主要有CNX、CGX、CVS、PG、CTN株等。明平刚(2006)等从系统进化树上分析表明，CTN株与我国街毒株的抗原关系比其它毒株近。

发明内容

本发明的目的是针对上述检测方法操作较为繁琐，或需要使用电镜等设备不足之处，提供一种抗狂犬病病毒单克隆抗体及其制备方法、应用，是一种能识别狂犬病病毒的鼠源性单克隆抗体，该抗体对狂犬病病毒的选择性强。

本发明公开的能识别狂犬病病毒的鼠源单克隆抗体是一种以与我国街毒株的抗原关系比其它毒株近的CTN株灭活病毒为抗原，同时用该病毒包被ELISA板，对得到的抗体进行筛选而获得的抗狂犬病病毒的单克隆抗体。

本发明抗狂犬病病毒的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCCNo.3014的抗狂犬病病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C5所分泌的。

抗狂犬病病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C5已于2009年04月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.3014。该鼠源杂交瘤细胞株2C5也属于本发明的保护范围。

抗狂犬病病毒的单克隆抗体的制备方法：

1、免疫原准备与免疫

免疫原的制备采用灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒(纯度99％以上，武汉病毒所张爱华惠赠)。

动物免疫将上述灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒经测定蛋白浓度为0.67mg/mL，按1∶1加入弗氏完全佐剂混合，振荡乳化半小时，皮下按100μg(0.3mL/只)免疫BALB/c小鼠；2周后，改用弗氏不完全佐剂乳化抗原，以同样方法进行再次免疫；二免后2周，腹腔注射200μg纯化抗原加强免疫，三天后融合。

2、杂交瘤细胞的融合

按常规方法进行杂交瘤细胞的融合。在融合前摘眼球法取阳性血备用。取脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞用PEG-2000融合。同时，分别从BALB/c免疫小鼠、提供饲养细胞的ICR小鼠采血，作为筛选单抗时对照用的阳性、阴性血清。融合后的细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板，置37℃，5％CO₂培养箱内培养，5-7d换加新鲜HAT，经常观察，适时换液和检测。

3、杂交瘤细胞的检测

酶标板的包被在酶标板上，做方阵试验，即以灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒为抗原，横向用PBS倍比稀释包被ELISA板，以阳性血清为一抗，纵向以100倍、200倍、400倍、800倍稀释，根据反应结果选择包被浓度。酶标板的包被简述如下：取纯化的抗原蛋白，以碳酸盐缓冲液，即0.2mol/L Na₂CO₃ 8mL，0.2mol/L NaHCO₃ 17mL，加去离子水至100mL，pH9.6，稀释至包被浓度，同时设阴性对照；以100μL/孔加入ELISA板中，37℃，3小时；PBST，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+0.5％Tween-20，洗涤3次，5分钟/次；加PBS/FCS，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+10％FCS或1％BSA，200μL/孔，37℃封闭3小时或4℃过夜；PBST洗3次，5分钟/次，晾干，-20℃或4℃存放备用。

杂交瘤细胞的检测用上述包被的ELISA板，常规间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清，以待检杂交瘤细胞上清和灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒反应的值，以SP2/0细胞培养上清为阴性对照，P/N≥2.1为阳性判定标准。

经常规ELISA检测，根据所设的判定标准，得到七个阳性反应的细胞株，分别经过三次亚克隆后发现其中三株阳性反应丢失，弃去；其余四株杂交瘤细胞株仍保持了分泌抗狂犬病病毒抗体的能力，其中一株命名为2C5。

4、细胞株的建立与腹水制备、纯化

细胞株的建立按上述判定标准，将筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，取分泌抗体稳定的和四次亚克隆后细胞形态良好，生长旺盛的强阳性单克隆细胞，命名建株并扩大培养，一部分液氮冻存，一部分用于单抗腹水制备。

腹水制备每只BALB/c小鼠注射0.5mL降植烷与弗氏不完全佐剂的等体积混合物，7天后腹腔分别注射2C5、2G4、3C7和5E11株的杂交瘤细胞，接种量为5倍105个细胞，约经过一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，5000转/分钟离心15分钟，取上清，等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水，即VBS：0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg²⁺，0.3mmol/L Ca²⁺稀释；然后以每10ml腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清得腹水。腹水0.22μm微孔滤膜过滤，备用。

抗体纯化用结合缓冲液，即20mM磷酸盐缓冲液，pH7.0，平衡HiTrap Protein G HP层析柱。用结合缓冲液稀释样品后通过层析株。待蛋白峰下降后，用0.1M甘氨酸缓冲液，pH2.7，洗脱层析柱，收集洗脱液。用1M Tris，pH 9.0调节pH至7，PBS透析，纯化的抗体进行SDS-PAGE电泳，用ELISA检测抗体效价。

结果表明，获得纯化抗体10mg。SDS-PAGE电泳结果表明，在还原剂的作用下，抗体分解为两个片段，分别为约50KD的重链和约25KD的轻链，结果附图1。

5、单克隆抗体的鉴定

单克隆抗体亚类鉴定使用捕获ELISA试剂盒检测单克隆抗体的亚类：1)将表位特征性抗体IgA，IgG1，IgG2b，IgG2a，IgG3，IgM分别用PBS进行1∶1000稀释，100ul/孔包被，每种特征性抗体包被两孔，37℃孵育1小时。2)用洗涤液PBST洗涤3次，5分钟/次。3)每孔加入100ul待检测的单抗上清，37℃孵育1小时。4)用洗涤液洗涤3次，5分钟/次。5)用PBST将辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG抗体进行1∶1000稀释，每孔100ul，37℃孵育30分钟。6)用洗涤液洗涤三次，5分钟/次。7)每孔加入新鲜配置的底物溶液100μl，37℃避光孵育20分钟。8)每孔加入50ul 2M H₂SO₄终止反应。在酶标仪上读取OD₄₅₀的值，以OD值明显高于其他各个孔的表位特征性抗体判为其单抗亚类。

间接ELISA灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒以5μg/mL的浓度100μl/孔包被ELISA板，37℃湿盒作用2.5小时，PBST洗3次，5分钟/次；拍干后用含5％小牛血清的PBS封闭，37℃湿盒作用2.5小时，PBST洗3次，5分钟/次，拍干后加入100倍、200倍、400倍、800倍稀释、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍、25600、51200稀释的本研究制备的单抗腹水，37℃湿盒作用90分钟，PBST洗3次，5分钟/次，拍干后加入1∶1000稀释的过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，37℃湿盒作用90分钟，以TMB显色，设正常ICR小鼠的血清为阴性对照。

结果显示，本研究制备的单抗腹水与灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒的反应为阳性，与正常ICR小鼠的阴性血清的反应为阴性，表1和附图2。

斑点ELISA(Dot-ELISA)将灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒，稀释至浓度为5μg/mL，分别滴加于硝酸纤维素膜上，2μL/点，37℃温箱烘干，用含1％BSA的PBS溶液37℃封闭2小时，PBS洗三次，5分钟/次，然后将其浸入1∶1000稀释的2C5、2G4、3C7和5E11株杂交瘤细胞的单抗腹水，37℃作用60分钟，漂洗后浸入1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，37℃作用60分钟，PBS洗三次，5分钟/次，以DAB显色，蒸馏水终止反应。以SP2/0培养上清为阴性对照。

四株单克隆抗体的腹水、阳性血清均能与灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒为抗原的点显色为阳性；而以SP2/0细胞培养上清与之显色为阴性，结果见附图3。

免疫印迹(Western-blot)检测单克隆抗体的特异性分别以灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒、GST融合表达的狂犬病糖蛋白的IPTG诱导表达的GST-RVG蛋白和pGEX-6p-1的诱导裂解物为电泳样品进行SDS-PAGE，按常规方法将蛋白转印于NC膜上。转印结束后，取出硝酸纤维素膜，作好标记，放入平皿中，用PBST(含5％脱脂奶粉)室温封闭过夜，将硝酸纤维素膜转移到封闭液稀释的杂交瘤上清中，室温作用2小时之后，用PBS洗膜3次，每次10分钟。再分别将膜转移入用封闭液1∶100倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体中，室温作用2小时后，再用PBS洗3遍，每次10分钟，DAB进行显色。

免疫印迹结果表明此四株单克隆抗体均能与狂犬病CTN株病毒反应，其中2C5株还能与融合表达的狂犬病糖蛋白GST-RVG(另文报道)反应，而与GST载体菌蛋白不反应，表明此单克隆抗体针对的是狂犬病糖蛋白的，见图4。

单克隆抗体腹水的ELISA效价测定灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒以5μg/mL的浓度包被ELISA板，100μL/孔，腹水以PBS倍比稀释，做间接ELISA反应，以P/N≥2.1为阳性判定标准。

目前，检测狂犬病毒中和抗体的方法主要有小鼠中和试验(MNT)、快速荧光灶抑制试验(RFFIT)等。MNT法实验费用高，操作繁琐且周期长，同时由于影响动物试验的因素较多，使得实验结果误差较大，重复性较低。RFFIT法周期短，准确率较高，但操作较为复杂，成本相对较高，且对基础设施有较高的要求，不利于推广。ELISA法操作简单、快速、灵敏、经济并且适用于批量处理，是蛋白多肽药代动力学研究的常用方法。本发明利用单克隆抗体技术，制备了抗狂犬病病毒的抗体，并制备了单抗腹水，对其生物学活性进行鉴定，并建立了Dot-ELISA、间接ELISA等狂犬病病毒检测方法，从检测方法的结果看，Dot-ELISA和间接ELISA法操作简单，结果易于判断且比较准确。

目前在我国流行的狂犬病病毒株主要有CNX、CGX、CVS、PG、CTN株等。明平刚(2006)等从系统进化树上分析表明，CTN株与我国街毒株的抗原关系比其它毒株近。本发明在制备抗狂犬病病毒单克隆抗体时，选择了与我国街毒株的抗原关系比其它毒株近的CTN株灭活病毒为抗原，同时用该病毒包被ELISA板，对得到的抗体进行筛选而获得的抗狂犬病病毒的单克隆抗体。

附图说明

以下将结合附图对本发明作进一步说明。

图1为单克隆抗体的纯化的SDS-PAGE。

图2为用间接ELISA方法检测制备的四株单抗腹水与病毒的结合。

图3为用Dot-ELISA方法检测制备的四株单抗腹水与病毒的结合。

图4为2C5株单抗与病毒的免疫印迹。

具体实施方式

抗狂犬病病毒单克隆抗体其制备方法、应用

实施例1免疫原准备与免疫

免疫原的制备采用灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒(纯度99％以上，武汉病毒所张爱华惠赠)。

动物免疫将上述灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒，测定蛋白浓度为0.67mg/mL，按1∶1加入弗氏完全佐剂混合，振荡乳化半小时，皮下按100μg免疫BALB/c小鼠；2周后，改用弗氏不完全佐剂乳化抗原，以同样方法进行再次免疫；二免后2周，腹腔注射200μg纯化抗原加强免疫，三天后融合。

实施例2杂交瘤细胞的融合

按常规方法进行杂交瘤细胞的融合。在融合前摘眼球法取阳性血备用。取脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞用PEG-2000融合。同时，分别从BALB/c免疫小鼠、提供饲养细胞的ICR小鼠采血，作为筛选单抗时对照用的阳性、阴性血清。融合后的细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板，置37℃，5％CO₂培养箱内培养，5-7d换加新鲜HAT，经常观察，适时换液和检测。

实施例3杂交瘤细胞的检测

酶标板的包被在酶标板上，做方阵试验，即：以灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒为抗原，横向用PBS倍比稀释包被ELISA板，以阳性血清为一抗，纵向以100倍、200倍、400倍、800倍稀释，根据反应结果选择最佳包被浓度(5μg/mL)。酶标板的包被简述如下：取纯化的抗原蛋白，以碳酸盐缓冲液，即0.2mol/L Na₂CO₃ 8mL，0.2mol/L NaHCO₃ 17mL，加去离子水至100mL，pH9.6，稀释至包被浓度，同时设阴性对照；以100μL/孔加入ELISA板中，37℃，3小时；PBST，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+0.5％Tween-20，洗涤3次，5分钟/次；加PBS/FCS，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+10％FCS或1％BSA，200μL/孔，37℃封闭3小时或4℃过夜；PBST洗3次，5分钟/次，晾干，-20℃或4℃存放备用。

杂交瘤细胞的检测用上述包被的ELISA板，常规间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清，以待检杂交瘤细胞上清和灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒反应的值，以SP2/0细胞培养上清为阴性对照，P/N≥2.1为阳性判定标准。

经常规ELISA检测，根据所设的判定标准，得到七个阳性反应的细胞株，分别经过三次亚克隆后发现其中三株阳性反应丢失，弃去；其余四株杂交瘤细胞株仍保持了分泌抗狂犬病病毒抗体的能力，其中一株命名为2C5。

实施例4细胞株的建立与腹水制备、纯化

细胞株的建立按上述判定标准，将筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，取分泌抗体稳定的和四次亚克隆后细胞形态良好，生长旺盛的强阳性单克隆细胞，命名建株并扩大培养，一部分液氮冻存，一部分用于单抗腹水制备。

腹水制备每只BALB/c小鼠注射0.5mL降植烷与弗氏不完全佐剂的等体积混合物，7天后腹腔分别注射2C5、2G4、3C7和5E11株的杂交瘤细胞，接种量为5×105个细胞，约经过一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，5000转/分钟离心15分钟，取上清，等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水，即：VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg²⁺，0.3mmol/L Ca²⁺稀释；然后以每10ml腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清得腹水。腹水0.22μm微孔滤膜过滤，备用。

抗体纯化用结合缓冲液，即20mM磷酸盐缓冲液，pH7.0，平衡HiTrap Protein G HP层析住。用结合缓冲液稀释样品后通过层析株。待蛋白峰下降后，用0.1M甘氨酸缓冲液pH2.7，洗(脱层析柱，收集洗脱液。用1M Tris，pH 9.0，调节pH至7，PBS透析，纯化的抗体进行SDS-PAGE电泳，用ELISA检测抗体效价。

实验结果表明，获得纯化抗体10mg。SDS-PAGE电泳结果表明，在还原剂的作用下，抗体分解为两个片段，分别为约50KD的重链和约25KD的轻链，结果附图1。

实施例5单克隆抗体的鉴定

单克隆抗体亚类鉴定使用捕获ELISA试剂盒检测单克隆抗体的亚类：(1)将表位特征性抗体IgA，IgG1，IgG2b，IgG2a，IgG3，IgM分别用PBS进行1∶1000稀释，100ul/孔包被，每种特征性抗体包被两孔，37℃孵育1小时。(2)用洗涤液PBST洗涤3次，5分钟/次。(3)每孔加入100ul待检测的单抗上清，37℃孵育1小时。(4)用洗涤液洗涤3次，5分钟/次。(5)用PBST将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(Fab片段)进行1∶1000稀释，每孔100ul，37℃孵育30分钟。(6)用洗涤液洗涤三次，5分钟/次。(7)每孔加入新鲜配置的底物溶液100μl，37℃避光孵育20分钟。(8)每孔加入50ul 2M H2SO4终止反应。在酶标仪上读取OD490的值，以OD值明显高于其他各个孔的表位特征性抗体判为其单抗亚类。

鉴定结果表明，本发明制备的抗狂犬病病毒单克隆抗体2C5株产生的抗体亚类为IgG2a。

间接ELISA灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒以5μg/mL的浓度100μl/孔包被ELISA板，37℃湿盒作用2.5小时，PBST洗3次，5分钟/次；拍干后用含5％小牛血清的PBS封闭，37℃湿盒作用2.5小时，PBST洗3次，5分钟/次，拍干后加入100、200倍、400倍、800倍稀释、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍、25600、51200稀释的本研究制备的单抗腹水，37℃湿盒作用90分钟，PBST洗3次，5分钟/次，拍干后加入1∶1000稀释的过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，37℃湿盒作用90分钟，以TMB显色，设正常ICR小鼠的血清为阴性对照。

结果显示，本研究制备的单抗腹水与灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒的反应为阳性，与正常ICR小鼠的阴性血清的反应为阴性，表1和附图2。

表1间接ELISA结果

斑点ELISA(Dot-ELISA)将灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒，稀释至浓度为5μg/mL，分别滴加于硝酸纤维素膜上，2μL/点，37℃温箱烘干，用含1％BSA的PBS溶液37℃封闭2小时，PBS洗三次，5分钟/次，然后将其浸入1∶1000稀释的2C5、2G4、3C7和5E11株杂交瘤细胞的单抗腹水，37℃作用60分钟，漂洗后浸入1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，37℃作用60分钟，PBS洗三次，5分钟/次，以DAB显色，蒸馏水终止反应。以SP2/0培养上清为阴性对照。

四株单克隆抗体的腹水、阳性血清均能与灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒为抗原的点显色为阳性；而以SP2/0细胞培养上清与之显色为阴性，结果见附图3。

免疫印迹(Western-blot)检测单克隆抗体的特异性分别以灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒、GST融合表达的狂犬病糖蛋白的IPTG诱导表达的GST-RVG蛋白和pGEX-6p-1的诱导裂解物为电泳样品进行SDS-PAGE，按常规方法将蛋白转印于NC膜上。转印结束后，取出硝酸纤维素膜，作好标记，放入平皿中，用PBST(含5％脱脂奶粉)室温封闭过夜，将硝酸纤维素膜转移到封闭液稀释的杂交瘤上清中，室温作用2小时之后，用PBS洗膜3次，每次10分钟。再分别将膜转移入用封闭液1∶100倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体中，室温作用2小时后，再用PBS洗3遍，每次10分钟，DAB进行显色。

免疫印迹结果表明此四株单克隆抗体均能与狂犬病CTN株病毒反应，其中2C5株还能与融合表达的狂犬病糖蛋白GST-RVG(另文报道)反应，而与GST载体菌蛋白不反应，表明此单克隆抗体针对的是狂犬病糖蛋白的，见图4。

四株单克隆抗体腹水的ELISA效价测定灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒以5μg/mL的浓度包被ELISA板，100μL/孔，腹水以PBS倍比稀释，做间接ELISA反应，以P/N≥2.1为阳性判定标准。

实验结果表明，本研究制备的2C5单抗腹水效价分别为1∶25600。

Claims (7)

1、一种抗狂犬病病毒的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCCNo.3014的抗狂犬病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株2C5所分泌。

2、权利要求1所述的抗狂犬病病毒的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：

(1)免疫原准备与免疫

免疫原的制备采用灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒

动物免疫将上述灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒，测定蛋白浓度为0.67mg/mL，按1∶1加入弗氏完全佐剂混合，振荡乳化半小时，皮下按100μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠；2周后，改用弗氏不完全佐剂乳化抗原，以同样方法进行再次免疫；二免后2周，腹腔注射200μg纯化抗原加强免疫，三天后融合；

(2)杂交瘤细胞的融合

在融合前摘眼球法取阳性血备用；取脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞用PEG-2000融合，同时，分别从BALB/c免疫小鼠、提供饲养细胞的ICR小鼠采血，作为筛选单抗时对照用的阳性、阴性血清，融合后的细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板，置37℃，5％CO₂培养箱内培养，5-7d换加新鲜HAT，经常观察，适时换液和检测；

(3)杂交瘤细胞的检测

酶标板的包被在酶标板上，做方阵试验，即以灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒为抗原，横向用PBS倍比稀释包被ELISA板，以阳性血清为一抗纵向以100倍、200倍、400倍、800倍稀释，根据反应结果选择包被浓度，酶标板的包被简述如下：取纯化的抗原蛋白，以碳酸盐缓冲液，即：0.2mol/L Na₂CO₃ 8mL，0.2mol/L NaHCO₃ 17mL，加去离子水至100mL，pH9.6，稀释至包被浓度，同时设阴性对照；以100μL/孔加入ELISA板中，37℃，3小时；PBST，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+0.5％Tween-20洗涤3次，5分钟/次；加PBS/FCS，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+10％FCS或1％BSA，200μL/孔，37℃封闭3小时或4℃过夜；PBST洗3次，5分钟/次，晾干，-20℃或4℃存放备用；

杂交瘤细胞的检测用上述包被的ELISA板，常规间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清，检测杂交瘤细胞上清和灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒反应的值，以SP2/0细胞培养上清为阴性对照，P/N≥2.1为阳性判定标准；

经常规ELISA检测，根据所设的判定标准，得到七个阳性反应的细胞株，分别经过三次亚克隆后发现其中三株阳性反应丢失，弃去；其余四株杂交瘤细胞株仍保持了分泌抗狂犬病病毒抗体的能力，其中一株命名为2C5；

(4)细胞株的建立与腹水制备、纯化

细胞株的建立按上述判定标准，将筛选得到的阳性杂交瘤细胞2C5进行亚克隆，取分泌抗体稳定的和四次亚克隆后细胞形态良好，生长旺盛的强阳性单克隆细胞，命名建株并扩大培养，一部分液氮冻存，一部分用于单抗腹水制备；

腹水制备每只BALB/c小鼠注射0.5mL降植烷与弗氏不完全佐剂的等体积混合物，7天后腹腔分别注射2C5株的杂交瘤细胞，接种量为5倍105个细胞，约经过一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，5000转/分钟离心15分钟，取上清，等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水，即VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg²⁺，0.3mmol/LCa²⁺稀释；然后以每10ml腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清得腹水。腹水0.22μm微孔滤膜过滤，备用；

抗体纯化用结合缓冲液，即20mM磷酸盐缓冲液，pH7.0，平衡HiTrap Protein G HP层析柱，用结合缓冲液稀释样品后通过层析柱待蛋白峰下降后，用0.1M甘氨酸缓冲液，pH2.7，洗脱层析柱，收集洗脱液。用1M Tris，pH 9.0，调节pH至7，PBS透析，纯化的抗体进行SDS-PAGE电泳，用ELISA检测抗体效价；

(5)单克隆抗体的鉴定

单克隆抗体亚类鉴定使用捕获ELISA试剂盒检测单克隆抗体的亚类：1)将表位特征性抗体IgA，IgG1，IgG2b，IgG2a，IgG3，IgM分别用PBS进行1∶1000稀释，100ul/孔包被，每种特征性抗体包被两孔，37℃孵育1小时。2)用洗涤液PBST洗涤3次，5分钟/次。3)每孔加入100ul待检测的单抗上清，37℃孵育1小时。4)用洗涤液洗涤3次，5分钟/次。5)用PBST将辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG抗体进行1∶1000稀释，每孔100ul，37℃孵育30分钟。6)用洗涤液洗涤三次，5分钟/次。7)每孔加入新鲜配置的底物溶液100μl，37℃避光孵育20分钟。8)每孔加入50ul 2M H₂SO₄终止反应。在酶标仪上读取OD₄₅₀的值，以OD值明显高于其他各个孔的表位特征性抗体判为其单抗亚类。

间接ELISA灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒以5μg/mL的浓度100μl/孔包被ELISA板，37℃湿盒作用2.5小时，PBST洗3次，5分钟/次；拍干后用含5％小牛血清的PBS封闭，37℃湿盒作用2.5小时，PBST洗3次，5分钟/次，拍干后加入100倍、200倍、400倍、800倍稀释、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍、25600倍、51200倍稀释的本研究制备的单抗腹水，37℃湿盒作用90分钟，PBST洗3次，5分钟/次，拍干后加入1∶1000稀释的过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，37℃湿盒作用90分钟，以TMB显色，设正常ICR小鼠的血清为阴性对照。

结果显示，本发明制备的单抗腹水与灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒的反应为阳性，与正常ICR小鼠的阴性血清的反应为阴性；

斑点ELISA将灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒，稀释至浓度为5μg/mL，分别滴加于硝酸纤维素膜上，2μL/点，37℃温箱烘干，用含1％BSA的PBS溶液37℃封闭2小时，PBS洗三次，5分钟/次，然后将其浸入1∶1000稀释的2C5、2G4、3C7和5E11株杂交瘤细胞的单抗腹水，37℃作用60分钟，漂洗后浸入1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，37℃作用60分钟，PBS洗三次，5分钟/次，以DAB显色，蒸馏水终止反应。以SP2/0培养上清为阴性对照；

本单克隆抗体的腹水、阳性血清均能与灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒为抗原的点显色为阳性；而以SP2/0细胞培养上清与之显色为阴性；

免疫印迹检测单克隆抗体的特异性分别以灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒、GST融合表达的狂犬病糖蛋白的IPTG诱导表达的GST-RVG蛋白和pGEX-6p-1的诱导裂解物为电泳样品进行SDS-PAGE，按常规方法将蛋白转印于硝酸纤维素膜上，转印结束后，取出硝酸纤维素膜，作好标记，放入平皿中，用PBST，含5％脱脂奶粉，室温封闭过夜，将硝酸纤维素膜转移到封闭液稀释的杂交瘤上清中，室温作用2小时之后，用PBS洗膜3次，每次10分钟。再分别将膜转移入用封闭液1∶100倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体中，室温作用2小时后，再用PBS洗3遍，每次10分钟，DAB进行显色；

免疫印迹结果表明此株单克隆抗体均能与狂犬病CTN株病毒反应，其中2C5株还能与融合表达的狂犬病糖蛋白GST-RVG反应，而与GST载体菌蛋白不反应，表明此单克隆抗体针对的是狂犬病糖蛋白的。

单克隆抗体腹水的ELISA效价测定灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒以5μg/mL的浓度包被ELISA板，100μL/孔，腹水以PBS倍比稀释，做间接ELISA反应，以P/N≥2.1为阳性判定标准。

3、权利要求1所述的单克隆抗体在检测狂犬病病毒抗原中的应用。

4、根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述检测狂犬病病毒抗原方法包括间接酶联免疫吸附检测法、Dot-ELISA、免疫组织化学检测法或试纸条检测法。

5、权利要求1所述的单克隆抗体在制备狂犬病病毒检测试剂盒中的应用。

6、含有权利要求1所述的单克隆抗体的检测狂犬病病毒的试剂盒。

7、分泌权利要求1所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞，是保藏号为CGMCC No.3014的抗狂犬病病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C5。

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