CN103492419B

CN103492419B - 可中和狂犬病病毒的结合分子

Info

Publication number: CN103492419B
Application number: CN201280013315.9A
Authority: CN
Inventors: 张宸在; 金昄谦; 洪慧真; 金星贤
Original assignee: Match Imec Inter Uni Micro Electr
Current assignee: Match Imec Inter Uni Micro Electr
Priority date: 2011-03-18
Filing date: 2012-03-16
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2032-03-16
Also published as: KR20120107050A; WO2012128508A3; KR101388680B1; WO2012128508A2; CN103492419A

Abstract

本发明涉及一种可中和狂犬病病毒的结合分子。更详细地说，本发明的结合分子对源自如狗、牛、猫鼬、蝙蝠、臭鼬及狼等个体的狂犬病病毒具有进行中和的能力，因此可有效用于治疗感染源自广泛动物的狂犬病病毒的患者。

Description

可中和狂犬病病毒的结合分子

技术领域

本发明涉及一种可中和狂犬病病毒的结合分子。

背景技术

狂犬病(rabies)属于病毒性人兽共患感染病，除了主要对野生及宠养动物构成影响外，还对包括人类的哺乳类构成影响，成为急性脑疾病的原因。狂犬病为一旦发生则几近导致死亡的致命疾病，与艾滋病一并被认为是致死率最高的疾病。上述狂犬病在全世界范围内得到传播，每年有千万以上的人被感染后而接受治疗，并且每年死亡人数为40,000至70,000。

狂犬病通过唾液和血来传染，主要是被感染狂犬病的狗或猫等咬伤时发病。并且，臭鼬、蝙蝠等大部分的哺乳类也有可能感染狂犬病。

狂犬病病毒(rabiesvirus)通过身体的神经组织到达脑神经组织后，表现出实际发病症状。虽然人体的脑部存在血脑屏障(bloodbrainbarrier)以屏蔽外部物质，使得病毒等无法渗透，但狂犬病病毒会通过RVG(rabiesvirusglycoprotein，狂犬病病毒糖蛋白)蛋白质，穿透血液内壁而感染脑部的中枢神经系统(centralnervoussystem)。

初期，除了与感冒类似的症状以外，被咬的部位会感到瘙痒或发热。随着狂犬病的病情发展，表现出不安感、恐水症(吞入水等液体时肌肉引起痉挛并感到严重的痛症而怕水的症状)、对风的恐惧(风会使感觉器官过度敏感)、兴奋、麻痹、精神失常等神经异常症状。并且，还会引起对阳光的过敏反应。在观察到这种症状的2-7天后，全身的神经或肌肉发生麻痹而导致昏迷状态，并因呼吸障碍而死亡。

在感染狂犬病后，可立即通过局部伤口保护及被动(抗狂犬病免疫球蛋白：以下称为“抗狂犬病抗体(anti-rabiesantibody)”)及主动(疫苗)的免疫化给药进行治疗及预防。

当前开发出的抗狂犬病抗体有人源狂犬病免疫球蛋白(humanderivedrabiesimmunoglobulin：以下称为“HRIG”)及马源狂犬病免疫球蛋白(equinederivedrabilesimmunoglobulin：以下称为“ERIG”)。在HRIG的情况下，较难实现顺畅的供给且价格昂贵。并且，由于是源自人体的血液，被HIV等感染的危险性高，并由于是多克隆抗体(polyclonalantibody)而效果不高。在ERIG的情况下，由于是源自马，治疗效率低于HRIG，因此要以高于HRIG的用量向患者给药。尽管ERIG相比于HRIG价格低廉，但其供给也不顺畅，且由于是源自与人体不同的个体的抗体，可能会引发过敏症(anaphyaxis)。为了克服上述缺点，在被感染后的预防中，限制使用可中和狂犬病病毒的单克隆抗体(monoclonalantibody)。虽然开发出了狂犬病-病毒中和的小鼠单克隆抗体(SchumacherCL等,J.Clin.Invest.Vol.84,p.971-975,1989)，但由于其短的血清半衰期、用以诱发人体效应物功能的能力缺失及在人体中诱发对小鼠抗体所不希望的HAMA(humananti-mouseantibody，人抗鼠抗体)反应，因此对感染狂犬病的人类患者直接给药受到限制。

因此，为了进行狂犬病的治疗，亟待开发出非源自血液而稳定性高，通过培养合成且可实现大规模量产供给，且能够获得均匀品质的单克隆抗体。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于提供一种与狂犬病病毒结合而具有中和能力的结合分子。

并且，本发明的另一目的在于提供一种在所述结合分子上结合有一个以上的标签的免疫交联物。

并且，本发明的另一目的在于提供一种用以编码所述结合分子的多聚核苷酸。

并且，本发明的另一目的在于提供一种插入有用以编码所述结合分子的多聚核苷酸的表达载体。

并且，本发明的另一目的在于提供一种被所述表达载体转化的细胞株。

并且，本发明的另一目的在于提供一种含有所述结合分子的组合物。

并且，本发明的另一目的在于提供一种含有所述结合分子的试剂盒。

并且，本发明的另一目的在于提供一种利用所述结合分子的狂犬病诊断方法。

并且，本发明的另一目的在于提供一种利用所述结合分子的狂犬病治疗及预防方法。

并且，本发明的另一目的在于提供一种通过培养所述细胞株来制备所述结合分子的方法。

并且，本发明的另一目的在于提供一种利用所述结合分子的狂犬病病毒检测方法。

技术方案

为了达到上述目的，本发明提供了一种与狂犬病病毒结合而具有中和能力的结合分子。

并且，本发明提供了一种在所述结合分子上结合有一个以上的标签的免疫交联物。

并且，本发明提供了一种用以编码所述结合分子的多聚核苷酸。

并且，本发明提供了一种插入有用以编码所述结合分子的多聚核苷酸的表达载体。

并且，本发明提供了一种通过将所述表达载体转化到宿主细胞中用以制备本发明的结合分子的细胞株。

并且，本发明提供了一种追加含有所述结合分子及药剂学上可允许的赋形剂的药学组合物。

并且，本发明提供了一种追加含有所述结合分子及药剂学上可允许的赋形剂的狂犬病治疗及预防用组合物。

并且，本发明提供了一种含有所述结合分子的狂犬病诊断用试剂盒。

并且，本发明提供了一种含有所述结合分子的狂犬病治疗及预防用试剂盒。

并且，本发明提供了一种利用所述结合分子的狂犬病诊断方法。

并且，本发明提供了一种包括将所述结合分子按有效量向对象给药的步骤的狂犬病治疗及预防方法。

并且，本发明的另一目的在于提供一种通过培养所述细胞株来制备本发明的结合分子的方法。

有益效果

本发明的可中和狂犬病病毒的结合分子，已确认为以多种狂犬病病毒为对象具有中和能力，因此有助于以感染狂犬病病毒的患者为对象的狂犬病治疗及预防。

附图说明

图1示出含有本发明嵌合抗体的重链和轻链基因的表达载体。

图2示出利用中国的狗狂犬病病毒(Rv342)的体内(invivo)动物实验结果。

具体实施方式

以下，对本发明中使用的词语进行如下定义。

本发明中使用的“结合分子”的用语指的是含有嵌合体、人源化或人源单克隆抗体等单克隆抗体的完整(intact)的免疫球蛋白(immunoglobulin)，或是与抗原结合的免疫球蛋白，例如是包括为了与狂犬病病毒或病毒外部的G蛋白(Glycoprotein，糖蛋白)或其片段结合而与完整的免疫球蛋白竞争的免疫球蛋白片段的可变性区域。不管结构如何，抗原-结合片段均与被完整的免疫球蛋白识别的相同的抗原进行结合。抗原-结合片段可包括含有如下氨基酸序列的肽或多肽：含有结合分子氨基酸序列的2个以上的连续(contiguous)氨基酸残基、20个以上的连续氨基酸残基、25个以上的连续氨基酸残基、30个以上的连续氨基酸残基、35个以上的连续氨基酸残基、40个以上的连续氨基酸残基、50个以上的连续氨基酸残基、60个以上的连续氨基酸残基、70个以上的连续氨基酸残基、80个以上的连续氨基酸残基、90个以上的连续氨基酸残基、100个以上的连续氨基酸残基、125个以上的连续氨基酸残基、150个以上的连续氨基酸残基、175个以上的连续氨基酸残基、200个以上的连续氨基酸残基或250个以上的连续氨基酸残基。

抗原-结合片段特别是包括Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fv、dAb、Fd、互补决定区(complementarity-determiningregion；CDR)片段、单链抗体(scFv)、2价(bivalent)单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、含有可充分与为多肽的特定抗原结合的免疫球蛋白的一个以上的片段的多肽等。上述片段可通过合成或完整的免疫球蛋白的酶或化学分解而制备，或是可基于重组DNA技术以遗传工程学进行制备。制备方法为本领域的技术人员所公知。

本发明中使用的“药剂学上可允许的赋形剂”的用语指的是与药物、制剂或结合分子等活性分子组合的惰性物质，用以制备可允许的或方便的给药形态。药剂学上可允许的赋形剂为非毒性的，或者为了其所意图的用途，赋形剂的毒性在所使用的用量及浓度下对受用者来说是可允许的。赋形剂可与包括药物、制剂或结合分子的剂型的其它成分共存。

本发明中使用的“治疗学上有用的量”的用语指的是在感染狂犬病病毒之前或之后对预防或治疗有效的本发明的结合分子的量。

以下，对本发明进行详细的说明。

本发明的发明人从美国疾病控制中心(CenterforDiseaseControl：以下称为“CDC”)接收被验证为对广泛的狂犬病病毒表现出中和能力的杂交瘤细胞，并以此作为对象，获得了小鼠单克隆抗体的重链及轻链的可变区域序列。之后，在IgG1主链(backbone)上连接上述重链及轻链的可变区域而制备嵌合抗体。之后，对如上制备的嵌合抗体进行体内(invivo)及体外(invitro)试验，以多种狂犬病病毒为对象进行了中和能力试验，据此确认了本发明的单克隆抗体可有助于治疗被源自广泛个体的狂犬病病毒感染的患者。

由此，本发明提供了一种与狂犬病病毒结合而具有中和能力的结合分子。

在本发明中，其特征在于，上述结合分子包括可变区域，该可变区域具有含被记载为序列号27的多肽的CDR1区域、含被记载为序列号28的多肽的CDR2区域及含被记载为序列号29的多肽的CDR3区域。

并且，在本发明中，其特征在于，上述结合分子包括可变区域，该可变区域具有含被记载为序列号30的多肽的CDR1区域、含被记载为序列号31的多肽的CDR2区域及含被记载为序列号32的多肽的CDR3区域。

并且，在本发明中，其特征在于，上述结合分子包括：重链可变区域，该重链可变区域具有含被记载为序列号27的多肽的CDR1区域、含被记载为序列号28的多肽的CDR2区域及含被记载为序列号29的多肽的CDR3区域；以及轻链可变区域，该轻链可变区域具有含被记载为序列号30的多肽的CDR1区域、含被记载为序列号31的多肽的CDR2区域及含被记载为序列号32的多肽的CDR3区域。本发明其特征在于，上述结合分子为Fab片段、Fv片段、双特异抗体(diabody)、嵌合抗体、人源化抗体或人源抗体。

并且，在本发明中，其特征在于，上述结合分子包括含被记载为序列号35的多肽序列的可变区域。

并且，在本发明中，其特征在于，上述结合分子包括含被记载为序列号36的多肽序列的可变区域。

并且，在本发明中，其特征在于，上述结合分子包括：含被记载为序列号35的多肽序列的重链可变区域，及含被记载为序列号36的多肽序列的轻链可变区域。本发明的特征在于，上述结合分子为Fab片段、Fv片段、双特异抗体(diabody)、嵌合抗体、人源化抗体或人源抗体。

并且，在本发明中，其特征在于，上述结合分子包括重链，该重链具有：含被记载为序列号35的多肽序列的可变区域，及含被记载为序列号37的多肽序列的恒定区域。

并且，在本发明中，其特征在于，上述结合分子包括轻链，该轻链具有：含被记载为序列号36的多肽序列的可变区域，及含被记载为序列号38的多肽序列的恒定区域。

并且，在本发明中，其特征在于，上述结合分子包括：重链，该重链具有含被记载为序列号35的多肽序列的可变区域及含被记载为序列号37的多肽序列的恒定区域；以及轻链，该轻链具有含被记载为序列号36的多肽序列的可变区域及含被记载为序列号38的多肽序列的恒定区域。

在本发明中，可变区域的CDR按照由卡巴特(Kabat)等设计的系统，以通常的方法决定(参照文献[Kabat等,《感兴趣的免疫球蛋白的蛋白序列(第五版)(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(5^th))》,国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth),贝塞斯达,马里兰州(1991)])。虽然本发明中使用了Kabat方法决定使用的CDR，但是除此之外，含有按照国际免疫遗传学数据库(InternationalImMunoGeneTicsdatabase；IMGT)方法、Chothia方法、AbM方法等其它方法决定的CDR的结合分子也将包含于本发明。

本发明的特征在于上述结合分子为抗体。

并且，本发明的特征在于，上述狂犬病病毒来源于选自由狗、牛、猫鼬、蝙蝠、臭鼬及狼所组成的组中的一种。

并且，本发明提供了一种在上述结合分子上结合有一个以上的标签的免疫交联物。

并且，本发明提供了一种用以编码上述结合分子的核酸分子。

本发明的核酸分子包括本领域技术人员所公知的能够翻译为本发明提供的抗体的氨基酸序列的多聚核苷酸序列的所有核酸分子。因此，通过ORF(openreadingframe，开放阅读框)可制备出多种多聚核苷酸序列，其也将全部包含于本发明的核酸分子中。

并且，本发明提供了一种插入有用以编码上述结合分子的核酸分子的表达载体。

作为上述表达载体，优选地可利用由作为Celltrion公司独有的表达载体MarEx载体(参照韩国专利申请10-2006-0020723)及商业上广泛使用的pCDNA载体、F、R1、RP1、Col、pBR322、ToL、Ti载体；粘粒(cosmid)；λ(lambda)、λ形(lambdoid)、M13、Mu、p1P22、Qμ、T-偶数(even)、T2、T3、T7等噬菌体；选自由植物病毒所组成的组中的一种的表达载体，但是本发明并非限定于此。对于本领域的技术人员来说公知的是为表达载体的所有表达载体均可使用在本发明中。在选择表达载体时，将根据目标宿主细胞的性质而定。在向宿主细胞导入载体时，可通过磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡萄聚糖调节转染、脂质体转染或电穿孔法进行，但是本发明并非限定于此，本领域的技术人员可选择适用于所使用的表达载体及宿主细胞的导入方法。优选地，载体含有一个以上的筛选标记，但是本发明并非限定于此，可利用未含有筛选标记的载体并根据制备物的制备与否而进行筛选。对筛选标记的选择将根据目标宿主细胞而进行筛选，由于其利用是对本领域技术人员所公知的方法，本发明对此并不进行限定。

为了容易地对本发明的核酸分子进行纯化，可将标签序列插入表达载体上并进行融合。作为上述标签包括六聚组氨酸标签、血球凝集素标签、myc标签或flag标签。但是本发明并非限定于此，对于本领域技术人员所公知的能够用以容易地进行纯化的标签均可用于本发明。

并且，本发明提供了一种通过将上述表达载体转化到宿主细胞中用以制备本发明的结合分子的细胞株。

在本发明中，上述细胞株可包括哺乳动物、植物、昆虫、菌类或细胞性起源的细胞，但是本发明并非限定于此。作为上述哺乳动物细胞，优选地选自由CHO细胞、F2N细胞、CSO细胞、BHK细胞、黑色素瘤细胞(Bowesmelanomacell)、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、HEK293细胞及HEK293T细胞所组成的组中的任一种作为宿主细胞使用，但是本发明并非限定于此，对于本领域的技术人员所公知的可作为哺乳动物宿主细胞使用的细胞均可利用。

并且，本发明提供了一种追加含有上述结合分子及药剂学上可允许的赋形剂的药学组合物。

本发明的组合物除了具有狂犬病病毒中和能力的结合分子以外，还可包括药剂学上可允许的赋形剂。药剂学上可允许的赋形剂已由本领域技术人员所公知。

并且，本发明提供了一种追加含有上述结合分子及药剂学上可允许的赋形剂的狂犬病治疗及预防用组合物。

本发明的组合物除了本发明的具有狂犬病病毒中和能力的结合分子以外，还可包括药剂学上可允许的赋形剂。药剂学上可允许的赋形剂已由本领域的技术人员所公知。

并且，本发明的预防及治疗用组合物可包括至少5种其它狂犬病治疗剂，并且，可包括多个种类的单克隆抗体，并据此可表现出对中和活性的提升作用。

同时，本发明的预防及治疗用组合物可追加包括至少一种其它治疗剂或诊断剂。作为上述治疗剂包括抗病毒药剂，但是本发明并非限定于此。作为这种药剂，可以是抗体、小分子、有机或无机化合物、酶、多聚核苷酸序列、抗病毒性肽等。

本发明的预防及治疗用组合物在制备及储存条件下保持无菌且稳定，其在传递时或传递之前，可以粉末形态存在于药剂学上可允许的赋形剂中以进行重组。在用于制备杀菌性注射溶液的杀菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥及冷冻干燥，用以从活性构成成分的粉末及其预杀菌-过滤的溶液中制备追加的所需构成成分。本发明的组合物可以是溶液状态，也可以是适当的药剂学上可允许的赋形剂在传递之前或传递时被添加及/或混合以提供单位给药量的注射剂型。优选地，本发明中使用的药剂学上可允许的赋形剂适合于高药物浓度，可保持适当的流动性，并可根据需要而延迟吸收。

对于本发明的预防及治疗用组合物给药的最佳路径选择，将受到包括组合物内活性分子的物理-化学特性、临床状况的紧急性及活性分子的血浆(plasma)浓度与所需治疗用效果的关系等多个因素的影响。例如，本发明的单克隆抗体可与用以防止得到调节的释放剂型迅速释放的传递体(carrier)一同制备，该传递体包括植入物及微型胶囊化传递系统。本发明中可使用乙烯醋酸乙烯酯、多价无水物、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯及聚乳酸等生物降解性、生物相容性聚合物。并且，单克隆抗体可被用以防止抗体惰性化的物质或化合物涂敷或一同给药。例如，单克隆抗体可与适当的传递体-脂质体或稀释剂一同给药。

本发明的预防及治疗用组合物的给药方法可分为经口及非经口，优选的给药路径为静脉注射，但是本发明并非限定于此。

作为上述经口形态，可制剂化为锭剂、片剂、药用滴剂、水性或油性悬浮剂、散剂或分散颗粒剂、乳剂、硬性胶囊剂、软性明胶胶囊剂、糖浆剂或酏剂、丸剂、糖衣锭、液剂、胶剂或浆剂。该些剂型中包括含有惰性稀释剂、颗粒化或崩解剂、结合剂、光泽剂、保存剂、着色剂、风味剂或甜味剂、植物油或矿物油、湿润剂及增粘剂的药剂学上的赋形剂，但是本发明并非限定于此。

上述非经口形态可以是水性或非水性等张性杀菌非毒性注射或注入溶液或悬浮液的形态。溶液或悬浮液中可包括在使用给药量及浓度下对水溶体无毒性的1,3-丁二醇、林格式溶液、汉克斯平衡盐(Hank’s)溶液、等张性氯化钠溶液等药剂、油、脂肪酸、局部麻醉剂、保存剂、缓冲液、粘度或溶解度增加剂、水溶性抗氧化剂、油溶性抗氧化剂及金属螯合剂。

并且，本发明提供了一种包括如下步骤的含有上述结合分子的狂犬病诊断用试剂盒：1)本发明的具有狂犬病病毒中和能力的结合分子；以及2)容器。

并且，本发明提供了一种包括如下步骤的含有上述结合分子的狂犬病治疗及预防用试剂盒：1)本发明的具有狂犬病病毒中和能力的结合分子；以及2)容器。

并且，本发明提供了一种包括如下步骤的利用上述结合分子的狂犬病诊断方法：1)将对象的样品与本发明的具有狂犬病病毒中和能力的结合分子接触；以及2)对上述步骤1)的结果进行分析，并判断与否感染狂犬病。

并且，本发明提供了一种包括具有如下步骤的将上述结合分子以有效量给予对象的狂犬病治疗及预防方法：向被确认为感染狂犬病的对象，以治疗学上有效的量给予具有狂犬病病毒中和能力的结合分子。

并且，本发明提供了一种包括如下步骤的用以制备与狂犬病病毒结合而具有中和能力的结合分子的方法：1)培养上述细胞株；以及2)回收表达的结合分子。

并且，本发明提供了一种包括如下步骤的用以检测狂犬病病毒的方法：1)将对象的样品与本发明的具有狂犬病病毒中和能力的结合分子接触；以及2)测定上述结合分子是否与对象样品特异性结合。

对象的样品包括取自于(潜在性)感染对象的血液、血清、组织或其它生物学物质，但也可以是不限定于此的生物学样本。(潜在性)感染对象可以是人体对象，但也可以是疑似狂犬病病毒的传递体的动物。对象样品可以预先进行制备，以更加适合于检测方法。优选地，在结合分子与狂犬病病毒或对象样品中存在的其抗原性成分之间允许形成免疫学复合体的条件下，将本发明的结合分子或免疫球蛋白与对象样品接触。形成表现出对象样品内存在狂犬病病毒的免疫学复合体，通过适当的手段进行检测并测定。作为这些方法有放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光法、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)、生物分子相互作用分析(BIACORE)、免疫印迹分析等免疫分析，但是本发明并非限定于此。

以下，按照实施例对本发明进行详细说明。以下实施例仅是为了更加具体地说明本发明，而本发明并非限定于此。

<实施例>

实施例1：杂交瘤(hybridoma)细胞筛选

依据美国疾病控制中心(CenterforDiseaseControl：以下称为“CDC”)中保管的关于杂交瘤细胞的以前实验及记录，筛选出约10余种杂交瘤细胞后，通过RFFIT(RapidFluorescentFocusInhibitionTest，快速荧光灶抑制试验)(Smith,J.S.等,日内瓦：世界卫生组织,pp.181-191,1996；以及疾病预防和控制中心,Morb.Mortal.WeeklyRep.49(RR-1),1-21,1999)方法测定各克隆培养基的抗原结合片段(Fab)滴度(titer)，并将其结果记载在表1中。结果是，筛选一定水平以上(0.7IU/ml)的克隆，克隆的名称如下：#62-62-5、#62-62-6、#2-21-8、#2-21-14及#2-21-23。

表1

[表1]

克隆滴度检测结果

样本ID	同种型(Isotype)	滴度(Titer)
			62-111-1	IgG2a	0.03
62-105-06	待定	0.03
			62-62-5	IgG2a	0.7
62-80-6	IgG2b	0.7
			2-21-20	IgG2a	0.1
62-28-5	IgG2a	0.03
			62-114-6	IgG3	0.03
2-21-23	IgG2a	83
			2-21-8	IgG2a	150
2-21-14	IgG2a	17.8
			62-139-2	IgG1	0.03
2-21-17	待定	0.03

从其中筛选出的杂交瘤细胞进行纯化以获得单克隆抗体后，进行了与滴度相关的实验RFFIT。

表2

[表2]

利用纯化的克隆的RFFIT结果

抗体名(抗体浓度)	滴度	IU/ml	IU/mg
				2-21-8(3.5mg/mL)	13500	158.82	45.4
62-80-6(3.58mg/mL)	60	0.71	0.2
				2-21-23(4.9mg/mL)	7500	88.24	18.0
2-21-14(1.9mg/mL)	1900	22.35	11.7

以表2的4个克隆为对象，进行了对美国CDC中保管的全世界狂犬病病毒的RFFIT。美国CDC中保有全世界约50余种狂犬病病毒，病毒列表如下表3所示。

表3

[表3]

美国CDC保有的狂犬病病毒列表

No.	狂犬病病毒种类	起源
			1	CVS-11	-
2	猫鼬RSA	猫鼬，南非
			3	CASK	臭鼬，美国加利福尼亚
4	狗Tun	狗，突尼斯
			5	狗gab	狗，加蓬
6	TXFX	灰狐，得克萨斯
			7	狗泰国	狗，泰国
8	狗索诺拉(Dong son)	狗，墨西哥
			9	Phi 002	人/狗，菲律宾
10	DR MX	蝙蝠，墨西哥
			11	DR巴西	蝙蝠，巴西
12	phi狗	人/狗，菲律宾

13	WA蝙蝠	蝙蝠，美国华盛顿
			14	3860蝙蝠	蝙蝠，美国加利福尼亚
15	狗Arg	狗，阿根廷
			16	TX SK	臭鼬，美国得克萨斯
17	RAC	浣熊，美国佐治亚
			18	中国2005	狗，中国
19	Rv342中国	牛/狗，中国
			20	TX郊狼	郊狼，美国得克萨斯
21	rv61	人(不包括狗)，英国(不包括印度)
			22	AL蝙蝠	蝙蝠，美国加利福尼亚
23	LC NY	蝙蝠，美国纽约
			24	蝙蝠Ef	蝙蝠，美国宾夕法尼亚
25	C1434	蝙蝠，美国阿拉巴马
			26	ABV(SM 4476)	澳大利亚蝙蝠病毒
27	Wu ABLV	澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒
			28	AZ蝙蝠	蝙蝠，亚利桑那
29	VA 399	蝙蝠，美国弗吉尼亚
			30	TN 410	蝙蝠，美国田纳西
31	TN 132	蝙蝠，美国田纳西
			32	SK 4384	臭鼬，美国得克萨斯
33	AK FX	北极狐，美国阿拉斯加
			34	857r	浣熊狗，俄罗斯，远东
35	I-148	狗，印度
			36	猫鼬PR	猫鼬，波多黎各
37	灰(Gray)FX-AZ	灰狐，美国亚利桑那
			38	NC SK	臭鼬，美国威斯康星
39	323R	狗/郊狼，美国得克萨斯
			40	RVHN	人(不包括狼)，俄罗斯，北极
41	MI1625	蝙蝠,田纳西，美国
			42	I-151	狗，印度
43	TN-269	蝙蝠，美国田纳西
			44	斯里兰卡	牛，斯里兰卡
45	鼠耳蝠(Myotis)	蝙蝠，美国华盛顿

其结果，对于表3中记载的狂犬病病毒，将各克隆的RFFIT结果值记载于以下的表4中。数值越高，表示越高的中和效能。

表4

[表4]

美国CDC中执行的RFFIT结果

(SRIG：标准狂犬病免疫球蛋白)

(xxx：未进行)

其中，2-21-23克隆在整体上表现出高效能且传送给Celltrion公司，利用上述2-21-23克隆的可变区域和人类抗体的恒定区域制备了单克隆抗体。

实施例2：对于杂交瘤细胞分泌的嵌合抗体的cDNA确定

实施例2-1：细胞培养

从美国CDC入库了杂交瘤细胞#2-21-8、2-21-14、2-21-23和62-80-6，将上述细胞在添加有5％胎牛血清(FBS；Sigma，12003C)的IMDM培养基(英俊公司(Invitrogen)12440-053)中进行培养。在培养期间，利用支原体聚合酶链反应ELISA试剂盒(支原体PCRELISAkit)(罗氏公司(Roche)，11663925910)检查了是否有支原体污染，并确认培养液中没有支原体。

实施例2-2：杂交瘤细胞分泌的小鼠抗体的重链和轻链可变区域的DNA确定

在培养中的杂交瘤#2-21-23中，使用RNeasyplus小量(mini)试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，74134)分离出总RNA。将分离出的1μg总RNA作为模板(template)，使用SMARTerPCRcDNA合成试剂盒(Clontech，634925)同时进行逆转录(reversetranscription)反应和5’及3’-cDNA末端快速扩增的聚合酶链式反应(5'和3'RACEPCR；cDNA末端快速扩增的聚合酶链式反应)，从而在5’和3’末端合成了具有特定序列的cDNA文库(cDNAlibrary)。cDNA文库合成反应条件如下。首先，将1μg的总RNA与3'SMARTCDS引物IIA(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)N-1N-3':序列号1)进行混合后，进行72℃下3分钟及42℃下2分钟的反应。之后，添加SMARTerIIA寡核苷酸(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTA-3':序列号2)和逆转录酶进行混合，进行42℃下60分钟、70℃下10分钟的逆转录反应，从而合成出在5’末端和3’末端具有特定序列的第一链cDNA(firststrandcDNA)。将第一链cDNA作为模板，利用5’PCR引物IIA(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3':序列号3)在95℃下进行1分钟热变性后，通过以在95℃下15秒、65℃下30秒及68℃下30秒的条件反复进行30次的聚合酶链式反应，最终合成及扩增了在5’和3’末端具有特定序列的cDNA文库。

为了在合成的cDNA文库中扩增对于杂交瘤细胞分泌的小鼠(mouse)抗体的可变区域特异性的cDNA，利用Advantage2PCR试剂盒(Clontec,639207)进行了聚合酶链式反应。所使用的上游引物(senseprimer)为前面使用的SMARTerPCRcDNA合成试剂盒中包含的引物，其为与cDNA的5’末端的特定序列一致的5’PCR引物IIA(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3':序列号3)。在重链的情况下，作为下游引物使用了以对IgG2a的重链恒定区域特异性的序列为对象的序列(5'-GCCAGTGGATAGAGCGATG-3':序列号4)，在轻链的情况下，以对k链或λ链的恒定区域特异性的序列为对象，分别使用了序列5'-GTGGGAAGATGGAGACAGTTG-3'(序列号5)和5'-GGACAGTCAGTTTGG-3'(序列号6)。利用这些引物，在95℃下进行1分钟热变性后，通过以在95℃下30秒、68℃下1分钟的条件反复进行30次的聚合酶链式反应，获得了包含有对于杂交瘤细胞#2-21-23所表达的抗体的可变区域总的cDNA片段。将包含有重链和轻链各个可变区域的总的cDNA片段克隆于TOPOTA克隆试剂盒(Invitrogen,K4500)中的TA载体后，对碱基序列进行分析。进行碱基序列分析的结果是，在重链的情况下，获得了具有一个氨基酸不同的三种IgG2a伽玛链(gammachain)的可变区域DNA序列。在此情况下，判断为是因为在对可变区域的cDNA片段的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)过程中发生突变(mutation)，从而获得了三种重链可变区域而不是一种。此外，在轻链的情况下，获得了对于一个κ链(kappachain)的可变区域的DNA序列。

实施例2-3：编码嵌合抗体的重链和轻链cDNA的制备

利用重叠聚合酶链式反应(overlappingPCR)，将小鼠抗体链的可变区域DNA序列连接在人类(humantype)抗体的恒定区域，制备了嵌合抗体。首先，为了进行重叠聚合酶链式反应，利用表5中记载的引物，在95℃下进行5分钟热变性后，以在95℃下1分钟、57℃下1分钟、72℃下1分钟的条件反复进行35次，获得了对于小鼠的轻链(κ链)和重链(伽玛链)可变区域的聚合酶链式反应产物和对于人类的轻链(κ链)和重链(伽玛链)恒定区域的聚合酶链式反应产物。之后，将可变区域和恒定区域的聚合酶链式反应产物作为模板，利用HCF1和HCR2引物，按照与前面提及的相同的条件进行PCR，获得了可变区域和恒定区域连接的重链。在轻链的情况下，利用LCF1和LCR2引物，也以相同的方式进行聚合酶链式反应，获得了可变区域和恒定区域连接的轻链。将最终获得的各重链和轻链分别克隆于PCR2.1TA克隆载体中。在克隆后，通过碱基序列分析，确认了在重叠聚合酶链式反应过程中没有发生突变。

表5

[表5]

引物信息

实施例2-4：嵌合抗体表达载体的制备

对于获得的包含重链和轻链的PCR2.1TA克隆载体，通过限制酶NheI和PmeI进行处理以获得重链基因和轻链基因后，将获得的重链基因和轻链基因分别插入已经经相同的限制酶处理的pCT145载体和pCT147载体中。pCT145载体及pCT147载体是分别用以克隆抗体的重链和轻链而制备的Celltrion公司独有的载体。之后，为了制备出同时包含重链转录单位(启动子-重链基因-多聚腺苷酸(poly(A)))和轻链转录单位(启动子-轻链基因-多聚腺苷酸)的表达载体，对包含重链基因的pCT145载体进行限制酶PacI和AscI处理以获得重链转录单位，然后对包含轻链基因的pCT147载体进行相同的限制酶进行处理以插入重链转录单位。之后，利用限制酶筛选同时包含重链转录单位和轻链转录单位的载体，并命名为pCT188(参照图1)。筛选出的载体利用Endofree质粒大量(plasmidmaxi)试剂盒(QIAGEN，德国，12362)进行提取。利用一部分提取的DNA，经碱基序列分析最终确认了抗体的碱基序列。被确认的序列如下表6所示。

表6

[表6]

小鼠单克隆抗体序列信息

实施例3：基于瞬时转导方法的嵌合抗体的制备

为了细胞内的瞬时转导，使用了为阳离子聚合物(cationicpolymer)的FreeStyle^TMMax(Invitrogen，16447-100)，并按照制造商的使用说明书进行转导。在转导前一天，将在EX-CELL293无血清培养基(Sigma，14571C：以下记载为“EX-CELL293培养基”)中生长的F2N细胞进行离心分离，并将培养基替换为FreeStyle293无血清培养基(Gibco，12338)，以每毫升中0.8×10⁶个细胞的浓度，向两个250ml振荡烧瓶(shakerflask)分别接种了50ml(总共100ml)。转导当天，在将包含嵌合抗体基因的125μg的pCT178DNA和125μl的FreeStyle^TMMax试剂，分别利用OptiPROSFMII(Invitrogen，12309)培养基稀释为2ml体积(volume)后，轻轻地进行混合。随后立即将被稀释的FreeStyle^TMMax试剂混合于稀释有DNA的溶液中，然后在常温下反应17分钟。在常温下反应17分钟的期间，测定要在转导中使用的被接种的F2N细胞的个数，利用该FreeStyle293培养基进行稀释，以使细胞浓度达到1.0×10⁶个。17分钟后，通过将DNA和FreeStyle^TMMax试剂混合溶液处理F2N细胞以进行转导。转导第二天，将同量的EX-CELL293培养基添加于被转导的细胞并培养7天，从而制备了单克隆抗体。

实施例4：嵌合单克隆抗体的效能确认

实施例4-1：体外实验

从实施例3中制备的单克隆抗体中获得三个嵌合形态的候补单克隆抗体，将其如下表7所示稀释为适当的浓度，并与转换为嵌合单克隆抗体之前的原有的小鼠抗体2-21-23一同以代表性的狂犬病病毒为对象进行中和能力实验，该实验通过RFFIT进行。并将其结果记载于表8中。

表7

[表7]

实验中使用的2-21-23的小鼠抗体和嵌合形态单克隆抗体的浓度

表8

转换为嵌合形态的单克隆抗体的RFFIT的结果

通过该结果，筛选出表现高效能的嵌合抗体#72-21-23。

下表9为在决定是嵌合抗体#72-21-23后，正式利用表8中未进行的病毒与SRIG进行比较的实验结果。

表9

[表9]

狂犬病病毒种类	SRIG(实际滴度)	2-21-23嵌合抗体#7(9ug/mL)滴度(IU/mg)
			狗ARG	250	1300(1155.6)
857r(27)	210	1400(1481.5)
			AK狐	210	1200(1269.8)
WA蝙蝠	250	1300(1155.6)
			rv61	170	1400(1830.1)
AL蝙蝠	170	1200(1568.6)
			蝙蝠Ef	170	1300(1699.3)
C1434	170	1400(1830.1)
			Gray FX-AZ	180	340(419.8)
NC SK	180	230(284.0)
			323R	230	1400(1352.7)
I-151	145	1400(2145.6)
			TN 269	145	60(15/20孔中1:5)(1.8)
鼠耳蝠	145	1000(1532.6)

实施例4-2：体内动物实验

为了检测从上述实施例中筛选的2-21-23嵌合抗体#7在体内中是否具有对狂犬病病毒的治疗效果，进行了如下所述利用叙利亚仓鼠(Syrianhamster)的动物实验。在本动物实验中，使用了中国狗狂犬病病毒Rv342。

动物实验组总共分为4组，其分别为：(1)仅注入Rv342病毒的组，(2)注入Rv342病毒和疫苗(人二倍体赛诺菲-巴斯德(HumandiploidSanofiPasteur))的组，(3)注入Rv342病毒和2-21-23嵌合抗体#7的组，和(4)注入Rv342病毒和2-21-23嵌合抗体#7及疫苗(HumandiploidSanofiPasteur)的组。Rv342病毒根据50/ml的MICLD进行1/100稀释并肌肉注射50μl，疫苗以每1ml中约2.5IU以上的疫苗病毒株注射了50ul(0、3、7、14天)，0.6mg/mL的嵌合抗体#7注射了50ul。疫苗和嵌合抗体#7在注射Rv342病毒24小时后分别进行了注射。

实验结果如表10及图2所示。在注入病毒和2-21-23嵌合抗体#7的情况下(组3)，实验动物截止到观察期间的第45天均生存下来，而在仅注入病毒(组1)或注入病毒和疫苗的情况下(组2)均死亡。并且，在注入病毒和2-21-23嵌合抗体#7及疫苗的情况下(组4)，也表现出90％以上的生存率。

表10

[表10]

体内动物实验结果

*观察期间：病毒感染后45天

以上参照例示性的实施方式对本发明进行了说明，但是本发明所属技术领域的技术人员在不超出本发明的范围内，可对其实施多种变化，并可将其要素替换成均等物。因此，本发明并非限定于作为为了实施本发明而设计出的最优方式所示出的特定实施方式，而是应当被解释为包括属于所附的权利要求书中所述范围的所有实施方式。

Claims

1.一种与狂犬病病毒结合而具有中和能力的结合分子，其特征在于，按照卡巴特方法，所述结合分子包括：重链可变区域，该重链可变区域具有由序列号27所示的多肽组成的CDR1区域、由序列号28所示的多肽组成的CDR2区域及由序列号29所示的多肽组成的CDR3区域；以及，轻链可变区域，该轻链可变区域具有由序列号30所示的多肽组成的CDR1区域、由序列号31所示的多肽组成的CDR2区域及由序列号32所示的多肽组成的CDR3区域。

2.一种与狂犬病病毒结合而具有中和能力的结合分子，其特征在于，所述结合分子包括：由序列号35所示的多肽序列组成的重链可变区域，及由序列号36所示的多肽序列组成的轻链可变区域。

3.一种与狂犬病病毒结合而具有中和能力的结合分子，其特征在于，所述结合分子包括：重链，该重链具有由序列号35所示的多肽序列组成的可变区域及由序列号37所示的多肽序列组成的恒定区域；以及，轻链，该轻链具有由序列号36所示的多肽序列组成的可变区域及由序列号38所示的多肽序列组成的恒定区域。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子为抗体。

5.根据权利要求1或2所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子为Fab片段、Fv片段、双特异抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人源抗体。

6.根据权利要求1～3中任一项所述的结合分子，其特征在于，所述狂犬病病毒来源于选自由狗、牛、猫鼬、蝙蝠、臭鼬及狼所组成的组中的任一种。

7.一种在权利要求1～3中任一项所述的结合分子上追加结合有一个以上的标签的免疫交联物。

8.一种用以编码权利要求1～3中任一项所述的结合分子的核酸分子。

9.一种插入有权利要求8所述的核酸分子的表达载体。

10.一种细胞株，用于通过将权利要求9所述的表达载体转化到宿主细胞从而制备能够与狂犬病病毒结合而具有中和能力的结合分子。

11.根据权利要求10所述的细胞株，其特征在于，所述宿主细胞为选自由CHO细胞、F2N细胞、CSO细胞、BHK细胞、黑色素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、HEK293细胞及HEK293T细胞所组成的组中的任一种。

12.一种药学组合物，所述药物组合物包括权利要求1～3中任一项所述的结合分子及追加的药剂学上可允许的赋形剂。

13.一种狂犬病治疗及预防用组合物，所述狂犬病治疗及预防用组合物包括权利要求1～3中任一项所述的结合分子及追加的药剂学上可允许的赋形剂。

14.一种狂犬病诊断用试剂盒，其特征在于，包括：

1)权利要求1～3中任一项所述的结合分子；以及

2)容器。

15.一种狂犬病治疗及预防用试剂盒，其特征在于，包括：

1)权利要求1～3中任一项所述的结合分子；以及

2)容器。

16.一种用以制备与狂犬病病毒结合而具有中和能力的结合分子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)培养权利要求10所述的细胞株；以及

2)回收被表达的结合分子。