JP4819285B2 - 狂犬病ウイルス特異的ヒトモノクローナル中和抗体及び核酸及び関連する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０００年５月１６日に出願された米国仮出願番号第６０／２０４，５１８号に基づき３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、分子生物学及び免疫学の分野に関するものであり、より詳細には、ヒトモノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体の核酸及びアミノ酸配列に関するものである。
【０００３】
発明の背景
狂犬病は、Rhabdoviridae（ラブドウイルス）科、Lyssavirus（リッサウイルス）属の一員である狂犬病ウイルスでの中枢神経系の感染によって引き起こされる急性の神経疾患である。その古さ及びその疾患の恐ろしい性質のために歴史的に重要な狂犬病ウイルスは、多様な野生生物種におけるリザーバが広範であることから、ヒト及び動物（家畜）感染の重大な驚異であり続ける。世界の多くの地域にわたり、狂犬病ウイルスの別個の異型が特定の陸生生物種において固有であり、それらの間で共通していることは比較的稀である。英国、オーストラリア、日本及び多数の島々を含む幾つかの島々には陸生の狂犬病が存在しないが、狂犬病及びコウモリに関連する狂犬病関連ウイルスが近年英国及びオーストラリアで確認された。
【０００４】
狂犬病ウイルスは、特徴として、弾丸型の、平均で７５×１８０ナノメートルの、エンベロープのある粒子である。ビリオンは、一本鎖ネガティブセンスＲＮＡゲノム及び５種類の構造タンパク質（核タンパク質（Ｎ）分子、リンタンパク質（ＮＳ）、ポリメラーゼ（Ｌ）、マトリクスタンパク質（Ｍ）及びウイルス性糖タンパク質（Ｇ））で構成される。
【０００５】
Ｎ及びＧタンパク質は、双方とも、多様な狂犬病ウイルス株の血清型の特徴付けを可能とする抗原決定基を担持する。Ｎ決定基は、異なるウイルス隔離集団間で高度に保存されており、そのため、特異的な抗体を用いる狂犬病ウイルス感染の免疫組織学的検出のための非常に有用なターゲットである。一方、Ｇタンパク質上に担持された抗原決定基は、本質的に狂犬病ウイルス株間で変化する。不活性化されたウイルスを用いてのワクチン接種によって生産されたウイルス中和抗体は、Ｇを標的とする。Ｔ細胞がＧ、Ｎ及びＮＳに応答し、実験的条件下でウイルスに対する免疫応答に参与することは明らかであるが、狂犬病ウイルスに対する免疫性の評価は、概して血清学、特に、ウイルス中和抗体に限定される。
【０００６】
ヒト狂犬病が未だに一般的な世界の地域においては、イヌが、ヒトに感染するウイルスの主要なリザーバである。イヌ科の狂犬病はワクチン接種によって大幅に排除されたが、キツネ、コヨーテ、スカンク、アライグマ、コウモリ及び他の種々雑多な動物がこのウイルスの異型を宿す。多くの地域で、ウイルスの野生生物リザーバは拡大し続ける。更に、狂犬病ウイルスは、あるリザーバ種からヒト又は他の末端段階宿主に、通常は狂犬病とは関係の無い動物、例えば、ネコ、ウサギ等によって伝染され得る。
【０００７】
一度臨床的症状が現れたらほぼ必ず致命的な狂犬病は、感染された個体を能動的及び受動的な免疫法の組み合わせで迅速に処置することによって防ぐことができる。受動免疫法は、狂犬病免疫個体（ヒト狂犬病−免疫グロブリン；ＨＲＩＧ）又は超免疫化ウマ（ウマ（equine）狂犬病−免疫グロブリン；ＥＲＩＧ）のプールされた血清から得られたプレフォームド（予備形成）狂犬病ウイルス中和抗体の投与から成る。どちらのタイプの試薬も、異なる狂犬病ウイルス隔離集団に対して変化する抗原特異性（従って有効性）を含む、ある種のリスクを受容者（レシピエント）に与える。
【０００８】
ＨＲＩＧは、プールされたヒト血清から調製される。従って、ＨＲＩＧ調製物は、既知の又は未知のヒト病原体で汚染される可能性がある。一方、異質抗原の調製物として、ＥＲＩＧは厳しいアナフィラキシー反応と結び付けられてきた。狂犬病ウイルスに対して特異的なマウスモノクローナルが、暴露後（post-exposure）予防における使用のために検討されてきたが、ＥＲＩＧ等はヒトにとって抗原的に異質である。結果として、これは、ヒト組織からのそれらの急激な掃除、並びにアナフィラキシー反応を引き起こす可能性をもたらす。
【０００９】
より良い試薬を提供するために、ヒトモノクローナル抗体を、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）−形質転換・狂犬病ウイルス特異的ヒトＢ細胞と、マウス−ヒトヘテロ（異種）ハイブリッドドナーとの融合によって作製した。これらの細胞からの、抗体重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）をコードするｃＤＮＡクローンは、その抗体が異種の発現系内で発現されるように構成される。これらの構成物は、規定された特異性を有する狂犬病ウイルス中和ヒト抗体が、制御された系において生産され、懸念される有害な汚染物から精製されることを許す。本発明は、これらのモノクローナル狂犬病ウイルス中和ヒト抗体、それらの重鎖及び軽鎖の核酸配列及びコードされたタンパク質のアミノ酸配列に関するものである。又、本発明によれば、狂犬病ウイルスに暴露した個体の、治療的に有効な暴露後予防処置としての、そのモノクローナル抗体の使用方法が提供される。
【００１０】
発明の概要
本発明の目的は、重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をコードする重鎖及び軽鎖核酸配列を有する核酸分子を分離することである。この重鎖及び軽鎖アミノ酸配列は、狂犬病ウイルスタンパク質に特異的に結合するモノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体のものである。
【００１１】
本発明の一実施態様によると、モノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体をコードする分離された核酸分子は、重鎖（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１（配列番号１））及び軽鎖（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２（配列番号２））のｃＤＮＡ配列から誘導される。
【００１２】
本発明の目的は、異種発現系内で発現され、有害な汚染物から精製される抗体重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡクローン中にコードされる分離されたヒトモノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体を提供することである。本発明の一実施態様によると、この分離されたヒトモノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３（配列番号３）及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４（配列番号４）のものである。
【００１３】
本発明は、キメラ免疫グロブリン軽鎖をコードする融合遺伝子を提供する。そのキメラ軽鎖は、ヘテロ（異種）ハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする第１のＤＮＡ配列；及びヒト軽鎖定常領域をコードする第２のＤＮＡ配列を含んでいる。本発明の更なる目的は、この融合遺伝子を発現するための発現ベクターを提供することである。本発明の更なる目的は、この発現ベクターのための宿主細胞を提供することである。
【００１４】
本発明は、キメラ免疫グロブリン重鎖をコードする融合遺伝子を提供する。そのキメラ重鎖は、ヘテロハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする第１のＤＮＡ配列；及びヒト重鎖定常領域をコードする第２のＤＮＡ配列を含んでいる。本発明の更なる目的は、この融合遺伝子を発現するための発現ベクターを提供することである。本発明の更なる目的は、この発現ベクターのための宿主細胞を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、キメラ免疫グロブリン軽鎖をコードする融合遺伝子及びキメラ免疫グロブリン重鎖をコードする融合遺伝子から誘導される、分離されたモノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体を提供することである。
【００１６】
本発明の目的は、狂犬病ウイルスに暴露した個体を処置する方法であって、該個体に治療的に有効な量の、異種発現系内で発現され、有害な汚染物から精製される抗体重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡクローン中にコードされるヒトモノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体を投与し、それによって狂犬病ウイルスの中枢神経系への伝染を妨げることによる前記方法を提供することである。
【００１７】
発明の説明
本発明は、種々の狂犬病ウイルス株の糖タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体又は種々のモノクローナル抗体の混合物での暴露後処置は、狂犬病ウイルスを侵入部位において中和し、そのウイルスが中枢神経系（ＣＮＳ）に広がるのを防ぐことができる。従って、狂犬病ウイルスへの経皮又は粘膜暴露に対して、狂犬病特異的モノクローナル抗体が、咬まれた場所内に注入され、並びに全身に投与される。ウイルスの複製はほとんどニューロン細胞だけに制限されるので、ＣＮＳ内へ侵入する以前に本発明のモノクローナル抗体によってウイルスの中和及び掃除をすることは、効果的な暴露後予防法である。
【００１８】
細胞
ハイブリダイゼーションに用いられたヒトＢ細胞は、一次狂犬病ワクチン接種の第３投与後７〜２１日の間の５人のドナー及びブースターワクチンの投与後１０〜２１日の５人の狂犬病免疫ドナーの末梢血から得た。全ての事例において、使用したワクチンはラビバック（Rabivac）（商標）ヒト二倍体細胞ワクチン（ウイルス株：ピットマン・ムーア（Pitman Moore）１５０３−３Ｍ、ベーリングレック、マールブルク、ドイツ連邦共和国）であった。全てのドナーは、ＨＩＶ及びＢ型肝炎についての試験において陰性であった。ハイブリドーマ融合パートナーとして用いられたマウス−ヒトハイブリッド異種骨髄腫（ヘテロミエローマ）ＳＨＭ−Ｄ３３細胞（テング（Teng, N. N.）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7308, 1983）及びＥＢＶ源として用いられたＢ９５−８エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）−形質転換マーモセット白血球（ヘンダーソン（Henderson）ら、J. Exp. Med. Vol. 76, p. 152, 1977）は、ＡＴＣＣ（ロックビル、メリーランド州））から得た。
【００１９】
狂犬病ウイルス
抗体調製物の、種々の狂犬病ウイルス株を中和する能力を評価するために、多数の抗原的に異なる固定（馴養）・実験室株、並びに２種類の代表的な街上狂犬病ウイルスを用いた。イブリン−ロキトニキ−アベルセス（ＥＲＡ）、対抗ウイルス標準、マウス脳順応（ＣＶＳ−２４）又は細胞培養順応（ＣＶＳ−１１）、及びピットマン−ムーア（ＰＭ）の各固定株は、トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティ・ウイルスコレクション（Thomas Jefferson University virus collection）から得た。アメリカ合衆国における近年の狂犬病事例のほとんどに関連する銀髪コウモリ狂犬病ウイルス（silver-haired bat rabies virus：ＳＨＢＲＶ）、及びイヌ狂犬病ウイルスの一員であるコヨーテ街上狂犬病ウイルス／メキシコイヌ狂犬病ウイルス（ＣＯＳＲＶ）は、既述されているようにして得た（モリモトら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 93, p. 5653, 1996）。ウイルス精製、及び糖タンパク質（Ｇ）並びに核タンパク質（Ｎ）の調製については、既に他の文献に記載されている（ディーツショールド（Dietzschold）ら、世界 保健機関、ジュネーブ、ｐ．１７５、１９９６）。
【００２０】
ヒトＰＢＬのＥＢＶ−トランスフォーメーション（形質転換）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を全血からフィコール−パケ（Ficoll-Paque）（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）での密度遠心分離によって、他の文献に詳しく記載されているようにして（プレバンスキ（Plebanski）ら、Immunology Vol. 75, p. 86, 1992）分離した。そして、Ｔ細胞を、モノクローナル抗ＣＤ２抗体コート磁性ビーズ（ダイナル・インコーポレイテッド（Dynal Inc.）、レイクサクセス、ニューヨーク州）及び磁性粒子濃縮器（ダイナル（Dynal））を用いた負の選択によって涸渇させた。ＣＤ−２陰性細胞（主としてＢ細胞）を集め、既に記述されているようにして（スワミネイサン（Swaminathan）、１９９２）不死化した。手短に説明すれば、Ｂ９５−８細胞［１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ギブコ（Gibco））補充ＲＰＭＩ1640（ギブコ・ＢＲＬ・ライフ・テクノロジーズ（Gibco BRL Life Technologies）、グランドアイランド、ニューヨーク州）中で集密状態に培養されたもの］を、ドライアイス上での凍結融解によって溶菌させて、細胞内ＥＢＶを放出させた。ＥＢＶを含む上清を、１０００ＲＰＭ（回転／分）、１０分間の回転、及び０．４５μｍのフィルターを通した濾過により浄化した。ウイルスを、４℃での８０００ＲＰＭ（回転／分）、２時間の遠心分離によって濃縮した。７×１０6個のＢ細胞（１ｍｌのＢ９５−８培地中に懸濁）を、２５ｍｌのＢ９５−８細胞から調製したウイルスと共に、３７℃で２時間インキュベートした。感染の後、その細胞を培地で２度洗浄し、９６ウェル平底マイクロタイタープレート（ヌンク（Nunc）、フィッシャー・サイエンティフィック（Fisher Scientific）、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）中に１×１０4細胞／ウェルの濃度で蒔き、５％ＣＯ2及び９５％空気の加湿雰囲気中で３７℃にて培養した。
【００２１】
マウス−ヒトヘテロハイブリッドの樹立
ＥＢＶ−形質転換細胞系を約４週間培養した後、上清を採集し、ＥＬＩＳＡにて狂犬病ウイルス特異的抗体の存在について試験した。陽性のウェルを先ず１ｍｌ、次いで２ｍｌの培養（４８及び２４ウェルプレート、ヌンク（Nunc））に移し、その後その上清を他の文献に詳しく記述されているようにして（フーパー（Hooper）、ASM Press, WA p. 755, 1997）急速蛍光合焦阻害試験（rapid fluorescent focus inhibition test：ＲＦＦＩＴ）にて狂犬病ウイルス中和抗体について検定（アッセイ）した。中和抗体を生産する細胞系を、次のようにしてＳＨＭ−Ｄ３３細胞（ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ１６６８）とハイブリダイズさせた。ＳＨＭ−Ｄ３３及びＥＢＶ−形質転換細胞の等数（それぞれ約５×１０6個）を、滅菌ポリスチレン丸底試験管（ファルコン（Falcon）、フィッシャーサイエンティフィック（Fisher Scientific））内に一緒に入れ、１０００ＲＰＭ（回転／分）で１０分間遠心分離した。細胞を無血清培地で２度洗浄し、細胞ペレットを１００μｌの培地中に再懸濁した。
【００２２】
試験管を３７℃の水浴中で１分間温め、次いで０．５ｍｌの温かい（３７℃）５０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ポリエチレングリコール（シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Co.）、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号：Ｐ−７１８１）を、４５秒間にわたり試験管を穏やかに振とうしながら滴下して加えた。その後、無血清培地を３０秒にわたり３ｍｌゆっくりと加え、次いで３０秒にわたり９ｍｌ加えることによって、融合反応を停止させた。この試験管を室温にて８分間静置させ、次いで２分間３７℃の水浴中でインキュベートした。その後、細胞を５００ｇで３分間遠心分離し、１０％ＦＢＳ並びに０．０４μＭアミノプテリン（ギブコ（Gibco））及び１０μＭウワバイン（シグマ（Sigma））を含有するイスコフ改変ダルベッコ（Iscove's modification of Dulbecco's：ＩＭＤＭ；ギブコ（Gibco））培地３０ｍｌに、細胞ペレットを穏やかに再懸濁させ、ハイブリダイズされていなかった細胞から選択した。細胞懸濁液を９６ウェル平底マイクロタイタープレート中に、１×１０4細胞／ウェルの濃度にて蒔き、上述と同様にしてインキュベートした。
【００２３】
ヘテロハイブリッド細胞のコロニーが樹立された際に（約６週間の培養）、ＥＬＩＳＡ及びＲＦＦＩＴにて、上清を、狂犬病ウイルス特異的抗体の生産について試験した。抗体生産細胞を、マイクロタイタープレート中での限界希釈によって、少なくとも３回クローン化した。細胞を、９６ウェル丸底プレート中に、２倍希釈にて、４細胞／ウェルから始めて滴定した。平均０．２５細胞若しくはそれ以下の細胞を含むウェルからの細胞を、上清の採集及び更なる分析のために増やした。
【００２４】
ＥＬＩＳＡでの狂犬病ウイルス特異的抗体の分析
抗体特異性及びイソタイプを、固相ＥＬＩＳＡにて評価した。プレート（ポリソーブ（PolySorb）（商標）、ヌンク（Nunc））を、加湿チャンバー中で室温にて一晩中、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に希釈した５・ｇ／ｍｌ狂犬病ＥＲＡウイルス、糖タンパク質若しくは核タンパク質でコートした。次いで、このプレートを、上清サンプルの添加に先立ち、ＰＢＳ中５％粉乳でブロックし、０．０５％トゥイーン20（Ｔｗｅｅｎ20）（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）含有ＰＢＳにて洗浄した。
【００２５】
室温での２時間のインキュベーションに続いて、このプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄して未結合一次抗体を除去し、種々のヒト重鎖イソタイプに対し特異的な、種々の酵素結合若しくはビオチン化二次抗を、１時間室温にて加えた。適当な基質（リン酸−クエン酸緩衝液中３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、又は０．１Ｍグリシン緩衝液中ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）、シグマ（Sigma））の添加による、又はアビジン−アルカリ性ホスフェート（室温（ＲＴ）にて３０分）及びＰＮＰＰ基質の添加後の、媒質中の可溶性最終生成物の生産によって二次抗体を検出した。ペルオキシダーゼ−ＴＭＢ反応を２Ｍ Ｈ2ＳＯ4の添加によって停止させた。吸光度値を、マイクロプレート分光光度計（バイオテク（Biotek）、ウィヌースキ、バーモント州）にて、ＴＭＢ生産物について４５０ｎｍ、又ＰＮＰＰ反応について４０５ｎｍで読んだ。
【００２６】
ＲＦＦＩＴ
各形質転換細胞系からの上清サンプルを、既に記述されているようにして（フーパー（Hooper）、ASM Press, WA p. 755, 1997）急速蛍光合焦阻害試験（ＲＦＦＩＴ）の変形を用いて、狂犬病ウイルス中和抗体の存在について検定した。上清サンプル（５０μｌ）を、９６ウェル平底プレート（ヌンク（Nunc））中で希釈した。インジケーター（指示）細胞の８０〜９０％感染を引き起こすことが既知である狂犬病ウイルス希釈物の３０μｌを、各試験サンプルに加え、そのプレートを３７℃で１時間インキュベートした。陰性媒質及び陽性狂犬病免疫血清の対照（コントロール）サンプルを各検定においてインキュベートした。インキュベーションの後、１．８×１０6細胞／ｍｌ濃度の新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞３０μｌを各ウェルに加え、この培養を一晩中３７℃でインキュベートした。次いで、このプレートを氷冷ＰＢＳで一度洗浄し、氷冷９０％アセトンで２０分間、−２０℃で固定化させた。固定化の後、アセトンを除去し、このプレートを空気乾燥させた。感染されたＢＨＫ細胞を検出するために、４０μｌのＦＩＴＣ抗狂犬病核タンパク質モノクローナルグロブリン（セントコル（Centocor）、マルヴァーン、ペンシルバニア州）を各ウェルに４５分間３７℃にて加えた。次いで、このプレートを蒸留水で３度洗浄し、蛍光顕微鏡下で検査した。
【００２７】
アフィニティークロマトグラフィーによる抗体の精製
ＩｇＧ１抗体を、プロテインＡカラム（ｒプロテインＡセファロース（rProtein A Sepharose）（商標）ファストフロー（Fast Flow）、アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech））を用いて精製した。手短に説明すれば、上清を０．４５μｍメンブランを通して濾過することによって浄化し、ｐＨを１Ｎ ＮａＯＨで８．０に調整した。上清を、カラムに約１００ｃｍ／時の線形流速にて通した。ＰＢＳ（ｐＨ８）で洗浄した後、抗体を０．１Ｍクエン酸溶液を用いてカラムから溶出させ、その後ＰＢＳで透析した。
【００２８】
ＩｇＧ３抗体を、プロテインＧカラム（プロテインＧセファロース（Protein G Sepharose）（商標）ファストフロー（Fast Flow）、アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech））を用いて精製した。ＩｇＧ３を含有する上清を、０．４５μｍメンブランを通して濾過することによって浄化し、ｐＨを１Ｎ ＮａＯＨで７．０に調整した。上清を、カラムに約１１ｃｍ／時の線形流速にて通した。ＰＢＳで洗浄した後、抗体を０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）を用いてカラムから溶出させ、その後ＰＢＳで透析した。
【００２９】
ＩｇＭ抗体を、マンナン結合タンパク質及び既に記述されている技術（ネベンス（Nevens）ら、J. Chromatogr, Vol. 597, p. 247, 1992）を改変したものを用いて精製した。手短に説明すれば、ＩｇＭを含有する上清をＥＤＴＡ処理し、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ８．０とし、濾過して、４℃に冷却した。マンナン結合タンパク質−アガロース（シグマ（Sigma））を、カラム中で４℃にて、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3／０．５Ｍ ＮａＣｌから成る結合緩衝液（ｐＨ８．３）で洗浄し、その後上清を加え、カラム上で１５分間、４℃にてインキュベートした。その後、このカラムを数容量の結合緩衝液で洗浄し、室温（ＲＴ）に１時間移した。ＩｇＭを、結合緩衝液で室温（ＲＴ）にてカラムから溶出させ、ＰＢＳで透析した。
【００３０】
透析された抗体調製物のタンパク質濃度を、タンパク質検出検定（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を用いて次のようにして決定した。１００μｌのサンプルを、染色試薬濃縮液の１／５希釈５ｍｌに加え、室温にて１０分間インキュベートした。陰性ＰＢＳコントロール及び種々のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質標準を、各検定においてインキュベートした。インキュベーションの後、サンプルを分光光度計にて５９５ｎｍで読んだ。試験サンプルのタンパク質濃度を、ＢＳＡ標準の吸光度と対照させて計算した。全ての抗体調製物の純度を、還元条件下での１２．５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって評価した。精製された抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、分離された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に対応する２本の主要なバンドを示した。
【００３１】
ｃＤＮＡクローンの生成、分離及び配列決定（シーケンシング）
全ＲＮＡをＪＡハイブリドーマ細胞から、ＲＮＡｚｏｌＢ（バイオテクス・ラボラトリーズ（Biotecx Laboratories）、ヒューストン）を用いて分離した。逆転写酵素反応を、鳥類骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（プロメガ（Promega））及びオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて４２℃で１時間行った。逆転写酵素生成物の一部を、重鎖特異的プライマー［ＩｇＧ−ＨＦ１プライマー（５’−ＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：５（配列番号５））、出発コドン（開始コドン）：下線部、寄託番号：Ｙ１４７３７）、及びＩｇＧ−ＨＲ２プライマー（５’−ＡＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：６（配列番号６））、停止コドン（終止コドン）：下線部、寄託番号：Ｙ１４７３７）］又は軽鎖特異的プライマー［ＩｇＧ−ＬＦ５プライマー（５’−ＡＧＣＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：７（配列番号７））、出発コドン：下線部、寄託番号：Ｍ６３４３８）、及びＩｇＧ−ＬＲ２プライマー（５’−ＣＴＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：８（配列番号８））、停止コドン：下線部、寄託番号：Ｍ６３４３８）］を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に供した。変性を９４℃で６０秒、アニーリングを５０℃で６０秒、及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ（Promega））を用いた重合を７２℃で９０秒の、３５サイクルで増幅を行った。ＰＣＲ生成物（重鎖は１．４ｋｂ、軽鎖は７ｋｂ）を精製し、ＡｍｐｌｉＴａｑサイクルシーケンシングキット（AmpliTaq cycle sequencing kit）（パーキンエルマー（Perkin-Elmer））を特定のプライマーと共に用いることによって配列決定した。ＰＣＲ生成物を、ＴＡクローニングベクター、ｐＣＲ２．１（インビトロジェン（Invitrogen））内にクローン化した。クローン化された重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡを、ＡｍｐｌｉＴａｑサイクルシーケンシングキット（パーキンエルマー（Perkin-Elmer））を特定のプライマーと共に用いることによって配列決定した。
【００３２】
モノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体コード配列
モノクローナル抗体ｃＤＮＡ、及びそれに相補的な配列は、本発明によって提供されるモノクローナル抗体核酸である。本明細書における特定の実施態様では、モノクローナル抗体ｃＤＮＡ配列は、クローンＪＡからのモノクローナル抗体の重鎖（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１（配列番号１））及び軽鎖（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２（配列番号２））に対して提供され、従って如何なるイントロンをも欠いている。
【００３３】
本発明はまた、モノクローナル抗体配列を含有するフラグメント、例えば、モノクローナル抗体の可変若しくは超可変領域を増幅するＰＣＲにおいてプライマーとして使用するための一本鎖オリゴヌクレオチドをも提供する。このオリゴヌクレオチドは、モノクローナル抗体遺伝子のハイブリダイズ可能な部分、少なくとも８ヌクレオチドの配列を有し、他のオリゴヌクレオチドはこのモノクローナル抗体遺伝子と同一鎖中の下流配列の逆相補配列を有し、これによって各オリゴヌクレオチドは、他方に向かう方向の合成を引き起こす。これらのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、長さが１０〜３５ヌクレオチドの範囲内にある。
【００３４】
本発明は、ヘテロハイブリドーマクローンＪＡのモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖に対する全長ｃＤＮＡ配列（それぞれＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１（配列番号１）及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２（配列番号２））、及び重鎖に対する１〜４７４番アミノ酸（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３（配列番号３））及び軽鎖に対する１〜２３４番アミノ酸（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４（配列番号４））のコードされたポリペプチドを提供する。
【００３５】
本明細書に開示される特定の実施態様では、本発明は、ヘテロハイブリドーマクローンＪＡからのモノクローナル抗体の核酸配列に関する。本発明の好ましい、非制限的な態様では、ヘテロハイブリドーマクローンＪＡがモノクローナル抗体ｃＤＮＡ源である。
【００３６】
モノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体の機能上の均等物
本発明はまた、本明細書中に記載される抗体の機能上の均等物（同等物）をも含む。機能上の均等物は、抗体の結合特性に匹敵する結合特性を有し、例えば、キメラ化された、単一鎖抗体、並びにそのフラグメントを含む。そのような機能上の均等物を産生する方法は、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／２１３１９、欧州特許出願番号第２３９，４００；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０９６２２；欧州特許出願３３８，７４５；及び欧州特許出願ＥＰ３３２，４２４に記載されている。
【００３７】
機能上の均等物は、本発明の抗体の可変若しくは超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。「実質的に同一」のアミノ酸配列は、ここでは、ピアースン（Pearson）及びリップマン（Lipman）、Proc. Natl. Inst. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448, 1988に従うＦＡＳＴＡ検索法によって決定した場合に、他のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％相同の配列として定義する。キメラ化された抗体は、実質的に若しくは専らヒト抗体定常領域から誘導される定常領域、及び実質的に若しくは専ら各安定なヘテロハイブリドーマからのモノクローナル抗体可変領域の配列から誘導される可変領域を有する（シャンピオン（Champion, J. M.）ら、Journal of Immunological Methods, 235 81-90, 2000）。
【００３８】
単一鎖抗体又はＦｖフラグメントは、連結リンカー有り若しくは無しで軽鎖の可変領域に連結された抗体重鎖の可変領域から成るポリペプチドである。従って、Ｆｖは完全な抗体の結合部位を含む。
【００３９】
機能上の均等物は更に、完全抗体のそれと同一又は実質的に同一の結合特性を有する抗体フラグメントを含む。このようなフラグメントは、一方又は両方のＦａｂフラグメント、又はＦ（ａｂ’）2フラグメントを含んでいてよい。抗体フラグメントは、完全抗体の６個の補体決定領域（complement determining region）を全て含んでいることが好ましいが、このような領域を全てよりも少なく含んでいるフラグメント、例えば、３個、４個又は５個の補体決定領域を含むフラグメントであってもまた機能する。機能上の均等物は、ＩｇＧ免疫グロブリンクラス及びそのサブクラスの一員であるが、次の免疫グロブリンクラスのいずれかであるか又はいずれかを組み合わせてもよい：ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ、及びそのサブクラス。種々のサブクラス、例えば、ＩｇＧサブクラスの重鎖は、異なるエフェクタ作用を担い、そのため、所望の重鎖定常領域を選択することによって、所望のエフェクタ作用を有するキメラ抗体が生産される。好ましい定常領域は、γ１（ＩｇＧ１）、γ３（ＩｇＧ３）及びγ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域は、κ又はλタイプのものであってよい。
【００４０】
本発明の免疫グロブリンは、一価、二価又は多価であってよい。一価免疫グロブリンは、ジスルフィド架橋を介してキメラ軽鎖と結合したキメラ重鎖で形成される二量体（ＨＬ）である。二価免疫グロブリンは、少なくとも１個のジスルフィド架橋を介して結合した２つの二量体で形成される四量体（Ｈ2Ｌ2）である。
【００４１】
標準的組み替えＤＮＡ技術
標準的組み替えＤＮＡ技術は、サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング（Molecular Cloning）」、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）（１９８７）及びアウスベル（Ausubel）ら（編）「分子生物学における最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ／ウィリー−インターサイエンス（Green Publishing Associates/Wiley-Interscience）、ニューヨーク（１９９０）に記載されている。
【００４２】
手短に説明すれば、所望のＤＮＡ、例えば、抗体又は抗体均等物を発現する核酸分子を含む適当な細胞源を選択する。全ＲＮＡを、適当な細胞源から標準的な手順によって調製する。この全ＲＮＡをｃＤＮＡ合成を導くために使用する。ＲＮＡを分離するための及びｃＤＮＡを合成するための標準的な方法は、例えば上述のような分子生物学の標準的なマニュアルに提供されている。
【００４３】
ｃＤＮＡは、既知の方法によって増幅することができる。例えば、ｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（サイキ（Saiki）ら、Science, 239, 487, 1988又はマリス（Mullis）ら、米国特許第４，６８３，１９５を参照）による増幅のためのテンプレートとして使用することができる。ＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、増幅されるべき既知の配列から導かれる。オリゴヌクレオチドは、斯界にて知られた方法によって合成される。好適な方法は、カルサス（Caruthers）によってScience 230, 281-285, 1985に記載されたものを含む。
【００４４】
上流及び下流のオリゴヌクレオチドの混合物がＰＣＲ増幅において使用される。条件は、各特定のプライマー対に対して、標準的な手順に従って最適化される。ＰＣＲ生成物は、例えば、電気泳動によってｃＤＮＡが各プライマー間の配列に対応する正しいサイズを有するかについて分析される。
【００４５】
別法では、コード領域は、２つ若しくはそれ以上のオーバーラップフラグメント中で増幅され得る。オーバーラップフラグメントは、このフラグメントからの無傷ｃＤＮＡの組み立て（アッセンブリー）を許す制限酵素認識部位を含むように設計される。
【００４６】
各ヘテロハイブリドーマ細胞系からの各モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖に対する全タンパク質コード領域を分離するために、例えば、上流ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、ＡＴＧ出発コドン及びこの出発コドンの上流の少なくとも５〜１０ヌクレオチドを含む５’末端の配列に対し相補的である。下流ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、所望のＤＮＡ配列の３’末端の配列に対し相補的である。所望のｃＤＮＡ配列は、停止コドンを含む、各モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の全部をコードする。
【００４７】
増幅されるべきｃＤＮＡ、例えば、抗体又は抗体均等物をコードするｃＤＮＡは、多種多様な宿主細胞中の多種多様なクローニングベクター中で複製させることができる。宿主細胞は、原核性又は真核性であってよい。
【００４８】
モノクローナル抗体ｃＤＮＡがその中に挿入（スプライス）されるベクターは、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列のセグメントを含み得る。いくつかの適当な原核性クローニングベクターは、限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）からのプラスミド、例えば、ｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ｐＵＣ、ｐＫＳＭ及びＲＰ４等を含む。原核性ベクターはまた、限定されるものではないが、ファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３及び他の繊維状一本鎖ＤＮＡファージ等の誘導体を含む。
【００４９】
発現されるべきモノクローナル抗体ｃＤＮＡを含むベクターは、後述のように、適当な宿主細胞中にトランスフェクトされる。宿主細胞は、適当な培地中に維持され、この細胞及びベクターが複製する条件下に置かれる。
【００５０】
キメラ抗体
一般的に、キメラ抗体は、キメラ免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖コンポーネントのそれぞれに対して、少なくとも、好ましくは糖タンパク質を中和するヒト狂犬病特異的ヒト可変領域（例えば、接合セグメント（joining segment）で機能的に再配列される可変領域）の機能部位をコードする第１のＤＮＡセグメントであって、ヒト定常領域の少なくとも一部をコードする第２のＤＮＡセグメントに連結されたものを含む融合遺伝子を調製することによって生産される。各融合遺伝子は、発現ベクター中で組み立てられるか又は発現ベクター中に挿入される。次いで、その遺伝子産物を発現する能力のある受容細胞は、その遺伝子でトランスフェクトされる。トランスフェクトされた受容細胞は、組み込まれた遺伝子の発現を許す条件下で培養され、発現された免疫グロブリン又は免疫グロブリン鎖が回収される。
【００５１】
免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、モノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体を生産するリンパ球（リンパ系細胞）から得られる。例えば、狂犬病糖タンパク質に対抗するモノクローナル抗体を生産するヘテロハイブリドーマ細胞系は、本発明のキメラ抗体の免疫グロブリン可変領域源を提供する。定常領域は、標準的なクローニング技術によってヒト抗体生産細胞から得られる。別法では、２クラスの軽鎖及び５クラスの重鎖を表す遺伝子がクローン化されているので、ヒト由来の定常領域は、これらのクローンから容易に得られる。キメラ抗体の結合フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）2及びＦａｂフラグメントは、先端を切った形のキメラ重鎖遺伝子を設計することによって調製される。例えば、Ｆ（ａｂ’）2重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨ1ドメイン及びヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むだろう。別法として、このようなフラグメントは、キメラ免疫グロブリンの酵素開裂によって得ることができる。一例を挙げれば、パパイン又はペプシン開裂によって、それぞれＦａｂ又はＦ（ａｂ’）2フラグメントを生成することができる。
【００５２】
好ましくは、キメラ重鎖及び軽鎖、又はそれらの部分をコードする融合遺伝子は、受容細胞を同時トランスフェクト（cotransfect）するために用い得る２つの異なる発現ベクター中で組み立てられる。各ベクターは、２つの選択可能な遺伝子（一方は細菌性システム（系）内での選択ため、他方は真核性システム内での選択のためのもの）を含み、各ベクターは異なる遺伝子対を有する。これらのベクターは、細菌性システム内での融合遺伝子の生産及び増幅、及びその後の真核細胞の同時トランスフェクション及び同時トランスフェクトされた細胞の選択を可能とする。細菌性システムに対する選択可能な遺伝子の例としては、限定されるものではないが、アンピシリン耐性を与える遺伝子及びクロラムフェニコール耐性を与える遺伝子が含まれる。限定されるものではないが、真核性のトランスフェクタント（トランスフェクトされた細胞）の選択のための次の２つの選択可能遺伝子が好ましい：（ｉ）キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（転移酵素）遺伝子（ｇｐｔ）、及び（ｉｉ）Ｔｎ５（ｎｅｏと指定）からのホスホトランスフェラーゼ遺伝子。ｇｐｔでの選択は、この遺伝子によってコードされる酵素の、プリンヌクレオチド合成のための基質としてキサンチンを用い得る能力に基づく。類似の内因性酵素にはその能力はない。イノシン一リン酸のキサンチン一リン酸への交換をブロックする、キサンチン及びマイコフェノール酸を含む培地中では、ｇｐｔ遺伝子を発現する細胞のみが生き残ることができる。ｎｅｏの生成物は、抗生物質Ｇ４１８及びそのクラスの他の抗生物質によって引き起こされる真核細胞中でのタンパク質合成の阻害をブロックする。これら２つの選択手順は、同時に又は順次に使用することができ、２つの異なるＤＮＡベクター上で真核細胞内に導入される免疫グロブリン鎖遺伝子の発現を選択することができる。
【００５３】
発現系
遺伝子コードの本来の縮重のため、実質的に同一又は機能上均等な重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が、本発明の範囲内にある。本発明に従って使用することのできる変更されたＤＮＡ配列は、結果的に同一又は機能上均等な遺伝子産物をコードする配列を与える、異なるヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換を含む。遺伝子産物それ自体が、結果として沈黙の変化（silent change）をもたらし、従って機能上均等なモノクローナル抗体を生産する、重鎖又は軽鎖配列内でのアミノ酸残基の欠失、付加又は置換を含んでいてよい。
【００５４】
本発明によれば、モノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体の重鎖及び軽鎖、フラグメント若しくはその類似物をコードするヌクレオチド配列が、適当な発現ベクター内に挿入される。挿入されたタンパク質コード配列の転写及び翻訳のために必要な要素を含むこのベクターは、それゆえ、モノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体の形成のための重鎖及び軽鎖免疫グロブリンの発現を導く組み替えＤＮＡ分子を生成する。
【００５５】
好ましい受容細胞系は骨髄腫細胞である。骨髄腫細胞は、トランスフェクトされた免疫グロブリン遺伝子によってコードされる免疫グロブリンを合成、組み立て及び分泌することができる。更に、これらは免疫グロブリンのグリコシル化のための機構を有する。特に好ましい受容細胞は、免疫グロブリンを生産しない骨髄腫細胞系、例えば、Ｓｐ２／０である。これらの細胞系は、トランスフェクトされた免疫グロブリン遺伝子によってコードされる免疫グロブリンのみを生産する。骨髄腫細胞は、培養中で成長させるか、又は分泌された免疫グロブリンを腹水から得ることができるマウスの腹膜中で成長させることができる。他のリンパ球（リンパ系細胞）、例えば、Ｂリンパ球又はハイブリドーマ細胞を、好適な受容細胞として用い得る。
【００５６】
リンパ球（リンパ系細胞）を免疫グロブリンコード遺伝子を含むベクターでトランスフェクトするためには、いくつかの方法がある。リンパ球（リンパ系細胞）内にＤＮＡを導入する好ましい一方法は、エレクトロポレーション（電気穿孔法）によるものである。この方法では、受容細胞は、組み込まれるべきＤＮＡの存在下で電気パルスを受けさせられる。ＤＮＡを導入する他の一方法は、プロトプラスト（原形質）融合法によるものである。この方法では、免疫グロブリン遺伝子を含む組み替えプラスミドを宿す細菌から細胞壁を取り除くためにリゾチームを用いる。生成したスフェロプラストは、ポリエチレングリコールで骨髄腫細胞と融合される。プロトプラスト融合の後、トランスフェクタントが選択され、分離される。多くの細胞タイプ内にＤＮＡを導入するために用い得る他の一技術は、リン酸カルシウム沈降法である。
【００５７】
免疫グロブリン遺伝子はまた、非リンパ球（非リンパ系細胞）、例えば、細菌又は酵母中で発現され得る。細菌中で発現される場合、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖は、封入体の部分となる。従って、その鎖は、分離され、精製され、そして機能的免疫グロブリン分子へと組み立てられる必要がある。シグナル配列を含む融合タンパク質としてのＥ．ｃｏｌｉからの分泌を含む、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現のためのその他の方策が利用可能である（例えば、プラックトゥーン（Pluckthun, A.）ら、 BioTechnology 9: 545-551, 1991；スケラ（Skerra, A.）ら、BioTechnology 9:273-278, 1991を参照）。
【００５８】
【配列表】
関連出願の相互参照
本出願は、２０００年５月１６日に出願された米国仮出願番号第６０／２０４，５１８号に基づき３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、分子生物学及び免疫学の分野に関するものであり、より詳細には、ヒトモノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体の核酸及びアミノ酸配列に関するものである。
【０００３】
発明の背景
狂犬病は、Rhabdoviridae（ラブドウイルス）科、Lyssavirus（リッサウイルス）属の一員である狂犬病ウイルスでの中枢神経系の感染によって引き起こされる急性の神経疾患である。その古さ及びその疾患の恐ろしい性質のために歴史的に重要な狂犬病ウイルスは、多様な野生生物種におけるリザーバが広範であることから、ヒト及び動物（家畜）感染の重大な驚異であり続ける。世界の多くの地域にわたり、狂犬病ウイルスの別個の異型が特定の陸生生物種において固有であり、それらの間で共通していることは比較的稀である。英国、オーストラリア、日本及び多数の島々を含む幾つかの島々には陸生の狂犬病が存在しないが、狂犬病及びコウモリに関連する狂犬病関連ウイルスが近年英国及びオーストラリアで確認された。
【０００４】
狂犬病ウイルスは、特徴として、弾丸型の、平均で７５×１８０ナノメートルの、エンベロープのある粒子である。ビリオンは、一本鎖ネガティブセンスＲＮＡゲノム及び５種類の構造タンパク質（核タンパク質（Ｎ）分子、リンタンパク質（ＮＳ）、ポリメラーゼ（Ｌ）、マトリクスタンパク質（Ｍ）及びウイルス性糖タンパク質（Ｇ））で構成される。
【０００５】
Ｎ及びＧタンパク質は、双方とも、多様な狂犬病ウイルス株の血清型の特徴付けを可能とする抗原決定基を担持する。Ｎ決定基は、異なるウイルス隔離集団間で高度に保存されており、そのため、特異的な抗体を用いる狂犬病ウイルス感染の免疫組織学的検出のための非常に有用なターゲットである。一方、Ｇタンパク質上に担持された抗原決定基は、本質的に狂犬病ウイルス株間で変化する。不活性化されたウイルスを用いてのワクチン接種によって生産されたウイルス中和抗体は、Ｇを標的とする。Ｔ細胞がＧ、Ｎ及びＮＳに応答し、実験的条件下でウイルスに対する免疫応答に参与することは明らかであるが、狂犬病ウイルスに対する免疫性の評価は、概して血清学、特に、ウイルス中和抗体に限定される。
【０００６】
ヒト狂犬病が未だに一般的な世界の地域においては、イヌが、ヒトに感染するウイルスの主要なリザーバである。イヌ科の狂犬病はワクチン接種によって大幅に排除されたが、キツネ、コヨーテ、スカンク、アライグマ、コウモリ及び他の種々雑多な動物がこのウイルスの異型を宿す。多くの地域で、ウイルスの野生生物リザーバは拡大し続ける。更に、狂犬病ウイルスは、あるリザーバ種からヒト又は他の末端段階宿主に、通常は狂犬病とは関係の無い動物、例えば、ネコ、ウサギ等によって伝染され得る。
【０００７】
一度臨床的症状が現れたらほぼ必ず致命的な狂犬病は、感染された個体を能動的及び受動的な免疫法の組み合わせで迅速に処置することによって防ぐことができる。受動免疫法は、狂犬病免疫個体（ヒト狂犬病−免疫グロブリン；ＨＲＩＧ）又は超免疫化ウマ（ウマ（equine）狂犬病−免疫グロブリン；ＥＲＩＧ）のプールされた血清から得られたプレフォームド（予備形成）狂犬病ウイルス中和抗体の投与から成る。どちらのタイプの試薬も、異なる狂犬病ウイルス隔離集団に対して変化する抗原特異性（従って有効性）を含む、ある種のリスクを受容者（レシピエント）に与える。
【０００８】
ＨＲＩＧは、プールされたヒト血清から調製される。従って、ＨＲＩＧ調製物は、既知の又は未知のヒト病原体で汚染される可能性がある。一方、異質抗原の調製物として、ＥＲＩＧは厳しいアナフィラキシー反応と結び付けられてきた。狂犬病ウイルスに対して特異的なマウスモノクローナルが、暴露後（post-exposure）予防における使用のために検討されてきたが、ＥＲＩＧ等はヒトにとって抗原的に異質である。結果として、これは、ヒト組織からのそれらの急激な掃除、並びにアナフィラキシー反応を引き起こす可能性をもたらす。
【０００９】
より良い試薬を提供するために、ヒトモノクローナル抗体を、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）−形質転換・狂犬病ウイルス特異的ヒトＢ細胞と、マウス−ヒトヘテロ（異種）ハイブリッドドナーとの融合によって作製した。これらの細胞からの、抗体重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）をコードするｃＤＮＡクローンは、その抗体が異種の発現系内で発現されるように構成される。これらの構成物は、規定された特異性を有する狂犬病ウイルス中和ヒト抗体が、制御された系において生産され、懸念される有害な汚染物から精製されることを許す。本発明は、これらのモノクローナル狂犬病ウイルス中和ヒト抗体、それらの重鎖及び軽鎖の核酸配列及びコードされたタンパク質のアミノ酸配列に関するものである。又、本発明によれば、狂犬病ウイルスに暴露した個体の、治療的に有効な暴露後予防処置としての、そのモノクローナル抗体の使用方法が提供される。
【００１０】
発明の概要
本発明の目的は、重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をコードする重鎖及び軽鎖核酸配列を有する核酸分子を分離することである。この重鎖及び軽鎖アミノ酸配列は、狂犬病ウイルスタンパク質に特異的に結合するモノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体のものである。
【００１１】
本発明の一実施態様によると、モノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体をコードする分離された核酸分子は、重鎖（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１（配列番号１））及び軽鎖（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２（配列番号２））のｃＤＮＡ配列から誘導される。
【００１２】
本発明の目的は、異種発現系内で発現され、有害な汚染物から精製される抗体重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡクローン中にコードされる分離されたヒトモノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体を提供することである。本発明の一実施態様によると、この分離されたヒトモノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３（配列番号３）及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４（配列番号４）のものである。
【００１３】
本発明は、キメラ免疫グロブリン軽鎖をコードする融合遺伝子を提供する。そのキメラ軽鎖は、ヘテロ（異種）ハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする第１のＤＮＡ配列；及びヒト軽鎖定常領域をコードする第２のＤＮＡ配列を含んでいる。本発明の更なる目的は、この融合遺伝子を発現するための発現ベクターを提供することである。本発明の更なる目的は、この発現ベクターのための宿主細胞を提供することである。
【００１４】
本発明は、キメラ免疫グロブリン重鎖をコードする融合遺伝子を提供する。そのキメラ重鎖は、ヘテロハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする第１のＤＮＡ配列；及びヒト重鎖定常領域をコードする第２のＤＮＡ配列を含んでいる。本発明の更なる目的は、この融合遺伝子を発現するための発現ベクターを提供することである。本発明の更なる目的は、この発現ベクターのための宿主細胞を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、キメラ免疫グロブリン軽鎖をコードする融合遺伝子及びキメラ免疫グロブリン重鎖をコードする融合遺伝子から誘導される、分離されたモノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体を提供することである。
【００１６】
本発明の目的は、狂犬病ウイルスに暴露した個体を処置する方法であって、該個体に治療的に有効な量の、異種発現系内で発現され、有害な汚染物から精製される抗体重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡクローン中にコードされるヒトモノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体を投与し、それによって狂犬病ウイルスの中枢神経系への伝染を妨げることによる前記方法を提供することである。
【００１７】
発明の説明
本発明は、種々の狂犬病ウイルス株の糖タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体又は種々のモノクローナル抗体の混合物での暴露後処置は、狂犬病ウイルスを侵入部位において中和し、そのウイルスが中枢神経系（ＣＮＳ）に広がるのを防ぐことができる。従って、狂犬病ウイルスへの経皮又は粘膜暴露に対して、狂犬病特異的モノクローナル抗体が、咬まれた場所内に注入され、並びに全身に投与される。ウイルスの複製はほとんどニューロン細胞だけに制限されるので、ＣＮＳ内へ侵入する以前に本発明のモノクローナル抗体によってウイルスの中和及び掃除をすることは、効果的な暴露後予防法である。
【００１８】
細胞
ハイブリダイゼーションに用いられたヒトＢ細胞は、一次狂犬病ワクチン接種の第３投与後７〜２１日の間の５人のドナー及びブースターワクチンの投与後１０〜２１日の５人の狂犬病免疫ドナーの末梢血から得た。全ての事例において、使用したワクチンはラビバック（Rabivac）（商標）ヒト二倍体細胞ワクチン（ウイルス株：ピットマン・ムーア（Pitman Moore）１５０３−３Ｍ、ベーリングレック、マールブルク、ドイツ連邦共和国）であった。全てのドナーは、ＨＩＶ及びＢ型肝炎についての試験において陰性であった。ハイブリドーマ融合パートナーとして用いられたマウス−ヒトハイブリッド異種骨髄腫（ヘテロミエローマ）ＳＨＭ−Ｄ３３細胞（テング（Teng, N. N.）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7308, 1983）及びＥＢＶ源として用いられたＢ９５−８エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）−形質転換マーモセット白血球（ヘンダーソン（Henderson）ら、J. Exp. Med. Vol. 76, p. 152, 1977）は、ＡＴＣＣ（ロックビル、メリーランド州））から得た。
【００１９】
狂犬病ウイルス
抗体調製物の、種々の狂犬病ウイルス株を中和する能力を評価するために、多数の抗原的に異なる固定（馴養）・実験室株、並びに２種類の代表的な街上狂犬病ウイルスを用いた。イブリン−ロキトニキ−アベルセス（ＥＲＡ）、対抗ウイルス標準、マウス脳順応（ＣＶＳ−２４）又は細胞培養順応（ＣＶＳ−１１）、及びピットマン−ムーア（ＰＭ）の各固定株は、トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティ・ウイルスコレクション（Thomas Jefferson University virus collection）から得た。アメリカ合衆国における近年の狂犬病事例のほとんどに関連する銀髪コウモリ狂犬病ウイルス（silver-haired bat rabies virus：ＳＨＢＲＶ）、及びイヌ狂犬病ウイルスの一員であるコヨーテ街上狂犬病ウイルス／メキシコイヌ狂犬病ウイルス（ＣＯＳＲＶ）は、既述されているようにして得た（モリモトら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 93, p. 5653, 1996）。ウイルス精製、及び糖タンパク質（Ｇ）並びに核タンパク質（Ｎ）の調製については、既に他の文献に記載されている（ディーツショールド（Dietzschold）ら、世界 保健機関、ジュネーブ、ｐ．１７５、１９９６）。
【００２０】
ヒトＰＢＬのＥＢＶ−トランスフォーメーション（形質転換）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を全血からフィコール−パケ（Ficoll-Paque）（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）での密度遠心分離によって、他の文献に詳しく記載されているようにして（プレバンスキ（Plebanski）ら、Immunology Vol. 75, p. 86, 1992）分離した。そして、Ｔ細胞を、モノクローナル抗ＣＤ２抗体コート磁性ビーズ（ダイナル・インコーポレイテッド（Dynal Inc.）、レイクサクセス、ニューヨーク州）及び磁性粒子濃縮器（ダイナル（Dynal））を用いた負の選択によって涸渇させた。ＣＤ−２陰性細胞（主としてＢ細胞）を集め、既に記述されているようにして（スワミネイサン（Swaminathan）、１９９２）不死化した。手短に説明すれば、Ｂ９５−８細胞［１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ギブコ（Gibco））補充ＲＰＭＩ1640（ギブコ・ＢＲＬ・ライフ・テクノロジーズ（Gibco BRL Life Technologies）、グランドアイランド、ニューヨーク州）中で集密状態に培養されたもの］を、ドライアイス上での凍結融解によって溶菌させて、細胞内ＥＢＶを放出させた。ＥＢＶを含む上清を、１０００ＲＰＭ（回転／分）、１０分間の回転、及び０．４５μｍのフィルターを通した濾過により浄化した。ウイルスを、４℃での８０００ＲＰＭ（回転／分）、２時間の遠心分離によって濃縮した。７×１０6個のＢ細胞（１ｍｌのＢ９５−８培地中に懸濁）を、２５ｍｌのＢ９５−８細胞から調製したウイルスと共に、３７℃で２時間インキュベートした。感染の後、その細胞を培地で２度洗浄し、９６ウェル平底マイクロタイタープレート（ヌンク（Nunc）、フィッシャー・サイエンティフィック（Fisher Scientific）、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）中に１×１０4細胞／ウェルの濃度で蒔き、５％ＣＯ2及び９５％空気の加湿雰囲気中で３７℃にて培養した。
【００２１】
マウス−ヒトヘテロハイブリッドの樹立
ＥＢＶ−形質転換細胞系を約４週間培養した後、上清を採集し、ＥＬＩＳＡにて狂犬病ウイルス特異的抗体の存在について試験した。陽性のウェルを先ず１ｍｌ、次いで２ｍｌの培養（４８及び２４ウェルプレート、ヌンク（Nunc））に移し、その後その上清を他の文献に詳しく記述されているようにして（フーパー（Hooper）、ASM Press, WA p. 755, 1997）急速蛍光合焦阻害試験（rapid fluorescent focus inhibition test：ＲＦＦＩＴ）にて狂犬病ウイルス中和抗体について検定（アッセイ）した。中和抗体を生産する細胞系を、次のようにしてＳＨＭ−Ｄ３３細胞（ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ１６６８）とハイブリダイズさせた。ＳＨＭ−Ｄ３３及びＥＢＶ−形質転換細胞の等数（それぞれ約５×１０6個）を、滅菌ポリスチレン丸底試験管（ファルコン（Falcon）、フィッシャーサイエンティフィック（Fisher Scientific））内に一緒に入れ、１０００ＲＰＭ（回転／分）で１０分間遠心分離した。細胞を無血清培地で２度洗浄し、細胞ペレットを１００μｌの培地中に再懸濁した。
【００２２】
試験管を３７℃の水浴中で１分間温め、次いで０．５ｍｌの温かい（３７℃）５０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ポリエチレングリコール（シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Co.）、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号：Ｐ−７１８１）を、４５秒間にわたり試験管を穏やかに振とうしながら滴下して加えた。その後、無血清培地を３０秒にわたり３ｍｌゆっくりと加え、次いで３０秒にわたり９ｍｌ加えることによって、融合反応を停止させた。この試験管を室温にて８分間静置させ、次いで２分間３７℃の水浴中でインキュベートした。その後、細胞を５００ｇで３分間遠心分離し、１０％ＦＢＳ並びに０．０４μＭアミノプテリン（ギブコ（Gibco））及び１０μＭウワバイン（シグマ（Sigma））を含有するイスコフ改変ダルベッコ（Iscove's modification of Dulbecco's：ＩＭＤＭ；ギブコ（Gibco））培地３０ｍｌに、細胞ペレットを穏やかに再懸濁させ、ハイブリダイズされていなかった細胞から選択した。細胞懸濁液を９６ウェル平底マイクロタイタープレート中に、１×１０4細胞／ウェルの濃度にて蒔き、上述と同様にしてインキュベートした。
【００２３】
ヘテロハイブリッド細胞のコロニーが樹立された際に（約６週間の培養）、ＥＬＩＳＡ及びＲＦＦＩＴにて、上清を、狂犬病ウイルス特異的抗体の生産について試験した。抗体生産細胞を、マイクロタイタープレート中での限界希釈によって、少なくとも３回クローン化した。細胞を、９６ウェル丸底プレート中に、２倍希釈にて、４細胞／ウェルから始めて滴定した。平均０．２５細胞若しくはそれ以下の細胞を含むウェルからの細胞を、上清の採集及び更なる分析のために増やした。
【００２４】
ＥＬＩＳＡでの狂犬病ウイルス特異的抗体の分析
抗体特異性及びイソタイプを、固相ＥＬＩＳＡにて評価した。プレート（ポリソーブ（PolySorb）（商標）、ヌンク（Nunc））を、加湿チャンバー中で室温にて一晩中、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に希釈した５・ｇ／ｍｌ狂犬病ＥＲＡウイルス、糖タンパク質若しくは核タンパク質でコートした。次いで、このプレートを、上清サンプルの添加に先立ち、ＰＢＳ中５％粉乳でブロックし、０．０５％トゥイーン20（Ｔｗｅｅｎ20）（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）含有ＰＢＳにて洗浄した。
【００２５】
室温での２時間のインキュベーションに続いて、このプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄して未結合一次抗体を除去し、種々のヒト重鎖イソタイプに対し特異的な、種々の酵素結合若しくはビオチン化二次抗を、１時間室温にて加えた。適当な基質（リン酸−クエン酸緩衝液中３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、又は０．１Ｍグリシン緩衝液中ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）、シグマ（Sigma））の添加による、又はアビジン−アルカリ性ホスフェート（室温（ＲＴ）にて３０分）及びＰＮＰＰ基質の添加後の、媒質中の可溶性最終生成物の生産によって二次抗体を検出した。ペルオキシダーゼ−ＴＭＢ反応を２Ｍ Ｈ2ＳＯ4の添加によって停止させた。吸光度値を、マイクロプレート分光光度計（バイオテク（Biotek）、ウィヌースキ、バーモント州）にて、ＴＭＢ生産物について４５０ｎｍ、又ＰＮＰＰ反応について４０５ｎｍで読んだ。
【００２６】
ＲＦＦＩＴ
各形質転換細胞系からの上清サンプルを、既に記述されているようにして（フーパー（Hooper）、ASM Press, WA p. 755, 1997）急速蛍光合焦阻害試験（ＲＦＦＩＴ）の変形を用いて、狂犬病ウイルス中和抗体の存在について検定した。上清サンプル（５０μｌ）を、９６ウェル平底プレート（ヌンク（Nunc））中で希釈した。インジケーター（指示）細胞の８０〜９０％感染を引き起こすことが既知である狂犬病ウイルス希釈物の３０μｌを、各試験サンプルに加え、そのプレートを３７℃で１時間インキュベートした。陰性媒質及び陽性狂犬病免疫血清の対照（コントロール）サンプルを各検定においてインキュベートした。インキュベーションの後、１．８×１０6細胞／ｍｌ濃度の新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞３０μｌを各ウェルに加え、この培養を一晩中３７℃でインキュベートした。次いで、このプレートを氷冷ＰＢＳで一度洗浄し、氷冷９０％アセトンで２０分間、−２０℃で固定化させた。固定化の後、アセトンを除去し、このプレートを空気乾燥させた。感染されたＢＨＫ細胞を検出するために、４０μｌのＦＩＴＣ抗狂犬病核タンパク質モノクローナルグロブリン（セントコル（Centocor）、マルヴァーン、ペンシルバニア州）を各ウェルに４５分間３７℃にて加えた。次いで、このプレートを蒸留水で３度洗浄し、蛍光顕微鏡下で検査した。
【００２７】
アフィニティークロマトグラフィーによる抗体の精製
ＩｇＧ１抗体を、プロテインＡカラム（ｒプロテインＡセファロース（rProtein A Sepharose）（商標）ファストフロー（Fast Flow）、アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech））を用いて精製した。手短に説明すれば、上清を０．４５μｍメンブランを通して濾過することによって浄化し、ｐＨを１Ｎ ＮａＯＨで８．０に調整した。上清を、カラムに約１００ｃｍ／時の線形流速にて通した。ＰＢＳ（ｐＨ８）で洗浄した後、抗体を０．１Ｍクエン酸溶液を用いてカラムから溶出させ、その後ＰＢＳで透析した。
【００２８】
ＩｇＧ３抗体を、プロテインＧカラム（プロテインＧセファロース（Protein G Sepharose）（商標）ファストフロー（Fast Flow）、アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech））を用いて精製した。ＩｇＧ３を含有する上清を、０．４５μｍメンブランを通して濾過することによって浄化し、ｐＨを１Ｎ ＮａＯＨで７．０に調整した。上清を、カラムに約１１ｃｍ／時の線形流速にて通した。ＰＢＳで洗浄した後、抗体を０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）を用いてカラムから溶出させ、その後ＰＢＳで透析した。
【００２９】
ＩｇＭ抗体を、マンナン結合タンパク質及び既に記述されている技術（ネベンス（Nevens）ら、J. Chromatogr, Vol. 597, p. 247, 1992）を改変したものを用いて精製した。手短に説明すれば、ＩｇＭを含有する上清をＥＤＴＡ処理し、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ８．０とし、濾過して、４℃に冷却した。マンナン結合タンパク質−アガロース（シグマ（Sigma））を、カラム中で４℃にて、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3／０．５Ｍ ＮａＣｌから成る結合緩衝液（ｐＨ８．３）で洗浄し、その後上清を加え、カラム上で１５分間、４℃にてインキュベートした。その後、このカラムを数容量の結合緩衝液で洗浄し、室温（ＲＴ）に１時間移した。ＩｇＭを、結合緩衝液で室温（ＲＴ）にてカラムから溶出させ、ＰＢＳで透析した。
【００３０】
透析された抗体調製物のタンパク質濃度を、タンパク質検出検定（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を用いて次のようにして決定した。１００μｌのサンプルを、染色試薬濃縮液の１／５希釈５ｍｌに加え、室温にて１０分間インキュベートした。陰性ＰＢＳコントロール及び種々のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質標準を、各検定においてインキュベートした。インキュベーションの後、サンプルを分光光度計にて５９５ｎｍで読んだ。試験サンプルのタンパク質濃度を、ＢＳＡ標準の吸光度と対照させて計算した。全ての抗体調製物の純度を、還元条件下での１２．５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって評価した。精製された抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、分離された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に対応する２本の主要なバンドを示した。
【００３１】
ｃＤＮＡクローンの生成、分離及び配列決定（シーケンシング）
全ＲＮＡをＪＡハイブリドーマ細胞から、ＲＮＡｚｏｌＢ（バイオテクス・ラボラトリーズ（Biotecx Laboratories）、ヒューストン）を用いて分離した。逆転写酵素反応を、鳥類骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（プロメガ（Promega））及びオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて４２℃で１時間行った。逆転写酵素生成物の一部を、重鎖特異的プライマー［ＩｇＧ−ＨＦ１プライマー（５’−ＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：５（配列番号５））、出発コドン（開始コドン）：下線部、寄託番号：Ｙ１４７３７）、及びＩｇＧ−ＨＲ２プライマー（５’−ＡＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：６（配列番号６））、停止コドン（終止コドン）：下線部、寄託番号：Ｙ１４７３７）］又は軽鎖特異的プライマー［ＩｇＧ−ＬＦ５プライマー（５’−ＡＧＣＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：７（配列番号７））、出発コドン：下線部、寄託番号：Ｍ６３４３８）、及びＩｇＧ−ＬＲ２プライマー（５’−ＣＴＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：８（配列番号８））、停止コドン：下線部、寄託番号：Ｍ６３４３８）］を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に供した。変性を９４℃で６０秒、アニーリングを５０℃で６０秒、及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ（Promega））を用いた重合を７２℃で９０秒の、３５サイクルで増幅を行った。ＰＣＲ生成物（重鎖は１．４ｋｂ、軽鎖は７ｋｂ）を精製し、ＡｍｐｌｉＴａｑサイクルシーケンシングキット（AmpliTaq cycle sequencing kit）（パーキンエルマー（Perkin-Elmer））を特定のプライマーと共に用いることによって配列決定した。ＰＣＲ生成物を、ＴＡクローニングベクター、ｐＣＲ２．１（インビトロジェン（Invitrogen））内にクローン化した。クローン化された重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡを、ＡｍｐｌｉＴａｑサイクルシーケンシングキット（パーキンエルマー（Perkin-Elmer））を特定のプライマーと共に用いることによって配列決定した。
【００３２】
モノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体コード配列
モノクローナル抗体ｃＤＮＡ、及びそれに相補的な配列は、本発明によって提供されるモノクローナル抗体核酸である。本明細書における特定の実施態様では、モノクローナル抗体ｃＤＮＡ配列は、クローンＪＡからのモノクローナル抗体の重鎖（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１（配列番号１））及び軽鎖（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２（配列番号２））に対して提供され、従って如何なるイントロンをも欠いている。
【００３３】
本発明はまた、モノクローナル抗体配列を含有するフラグメント、例えば、モノクローナル抗体の可変若しくは超可変領域を増幅するＰＣＲにおいてプライマーとして使用するための一本鎖オリゴヌクレオチドをも提供する。このオリゴヌクレオチドは、モノクローナル抗体遺伝子のハイブリダイズ可能な部分、少なくとも８ヌクレオチドの配列を有し、他のオリゴヌクレオチドはこのモノクローナル抗体遺伝子と同一鎖中の下流配列の逆相補配列を有し、これによって各オリゴヌクレオチドは、他方に向かう方向の合成を引き起こす。これらのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、長さが１０〜３５ヌクレオチドの範囲内にある。
【００３４】
本発明は、ヘテロハイブリドーマクローンＪＡのモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖に対する全長ｃＤＮＡ配列（それぞれＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１（配列番号１）及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２（配列番号２））、及び重鎖に対する１〜４７４番アミノ酸（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３（配列番号３））及び軽鎖に対する１〜２３４番アミノ酸（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４（配列番号４））のコードされたポリペプチドを提供する。
【００３５】
本明細書に開示される特定の実施態様では、本発明は、ヘテロハイブリドーマクローンＪＡからのモノクローナル抗体の核酸配列に関する。本発明の好ましい、非制限的な態様では、ヘテロハイブリドーマクローンＪＡがモノクローナル抗体ｃＤＮＡ源である。
【００３６】
モノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体の機能上の均等物
本発明はまた、本明細書中に記載される抗体の機能上の均等物（同等物）をも含む。機能上の均等物は、抗体の結合特性に匹敵する結合特性を有し、例えば、キメラ化された、単一鎖抗体、並びにそのフラグメントを含む。そのような機能上の均等物を産生する方法は、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／２１３１９、欧州特許出願番号第２３９，４００；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０９６２２；欧州特許出願３３８，７４５；及び欧州特許出願ＥＰ３３２，４２４に記載されている。
【００３７】
機能上の均等物は、本発明の抗体の可変若しくは超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。「実質的に同一」のアミノ酸配列は、ここでは、ピアースン（Pearson）及びリップマン（Lipman）、Proc. Natl. Inst. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448, 1988に従うＦＡＳＴＡ検索法によって決定した場合に、他のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％相同の配列として定義する。キメラ化された抗体は、実質的に若しくは専らヒト抗体定常領域から誘導される定常領域、及び実質的に若しくは専ら各安定なヘテロハイブリドーマからのモノクローナル抗体可変領域の配列から誘導される可変領域を有する（シャンピオン（Champion, J. M.）ら、Journal of Immunological Methods, 235 81-90, 2000）。
【００３８】
単一鎖抗体又はＦｖフラグメントは、連結リンカー有り若しくは無しで軽鎖の可変領域に連結された抗体重鎖の可変領域から成るポリペプチドである。従って、Ｆｖは完全な抗体の結合部位を含む。
【００３９】
機能上の均等物は更に、完全抗体のそれと同一又は実質的に同一の結合特性を有する抗体フラグメントを含む。このようなフラグメントは、一方又は両方のＦａｂフラグメント、又はＦ（ａｂ’）2フラグメントを含んでいてよい。抗体フラグメントは、完全抗体の６個の補体決定領域（complement determining region）を全て含んでいることが好ましいが、このような領域を全てよりも少なく含んでいるフラグメント、例えば、３個、４個又は５個の補体決定領域を含むフラグメントであってもまた機能する。機能上の均等物は、ＩｇＧ免疫グロブリンクラス及びそのサブクラスの一員であるが、次の免疫グロブリンクラスのいずれかであるか又はいずれかを組み合わせてもよい：ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ、及びそのサブクラス。種々のサブクラス、例えば、ＩｇＧサブクラスの重鎖は、異なるエフェクタ作用を担い、そのため、所望の重鎖定常領域を選択することによって、所望のエフェクタ作用を有するキメラ抗体が生産される。好ましい定常領域は、γ１（ＩｇＧ１）、γ３（ＩｇＧ３）及びγ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域は、κ又はλタイプのものであってよい。
【００４０】
本発明の免疫グロブリンは、一価、二価又は多価であってよい。一価免疫グロブリンは、ジスルフィド架橋を介してキメラ軽鎖と結合したキメラ重鎖で形成される二量体（ＨＬ）である。二価免疫グロブリンは、少なくとも１個のジスルフィド架橋を介して結合した２つの二量体で形成される四量体（Ｈ2Ｌ2）である。
【００４１】
標準的組み替えＤＮＡ技術
標準的組み替えＤＮＡ技術は、サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング（Molecular Cloning）」、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）（１９８７）及びアウスベル（Ausubel）ら（編）「分子生物学における最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ／ウィリー−インターサイエンス（Green Publishing Associates/Wiley-Interscience）、ニューヨーク（１９９０）に記載されている。
【００４２】
手短に説明すれば、所望のＤＮＡ、例えば、抗体又は抗体均等物を発現する核酸分子を含む適当な細胞源を選択する。全ＲＮＡを、適当な細胞源から標準的な手順によって調製する。この全ＲＮＡをｃＤＮＡ合成を導くために使用する。ＲＮＡを分離するための及びｃＤＮＡを合成するための標準的な方法は、例えば上述のような分子生物学の標準的なマニュアルに提供されている。
【００４３】
ｃＤＮＡは、既知の方法によって増幅することができる。例えば、ｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（サイキ（Saiki）ら、Science, 239, 487, 1988又はマリス（Mullis）ら、米国特許第４，６８３，１９５を参照）による増幅のためのテンプレートとして使用することができる。ＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、増幅されるべき既知の配列から導かれる。オリゴヌクレオチドは、斯界にて知られた方法によって合成される。好適な方法は、カルサス（Caruthers）によってScience 230, 281-285, 1985に記載されたものを含む。
【００４４】
上流及び下流のオリゴヌクレオチドの混合物がＰＣＲ増幅において使用される。条件は、各特定のプライマー対に対して、標準的な手順に従って最適化される。ＰＣＲ生成物は、例えば、電気泳動によってｃＤＮＡが各プライマー間の配列に対応する正しいサイズを有するかについて分析される。
【００４５】
別法では、コード領域は、２つ若しくはそれ以上のオーバーラップフラグメント中で増幅され得る。オーバーラップフラグメントは、このフラグメントからの無傷ｃＤＮＡの組み立て（アッセンブリー）を許す制限酵素認識部位を含むように設計される。
【００４６】
各ヘテロハイブリドーマ細胞系からの各モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖に対する全タンパク質コード領域を分離するために、例えば、上流ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、ＡＴＧ出発コドン及びこの出発コドンの上流の少なくとも５〜１０ヌクレオチドを含む５’末端の配列に対し相補的である。下流ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、所望のＤＮＡ配列の３’末端の配列に対し相補的である。所望のｃＤＮＡ配列は、停止コドンを含む、各モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の全部をコードする。
【００４７】
増幅されるべきｃＤＮＡ、例えば、抗体又は抗体均等物をコードするｃＤＮＡは、多種多様な宿主細胞中の多種多様なクローニングベクター中で複製させることができる。宿主細胞は、原核性又は真核性であってよい。
【００４８】
モノクローナル抗体ｃＤＮＡがその中に挿入（スプライス）されるベクターは、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列のセグメントを含み得る。いくつかの適当な原核性クローニングベクターは、限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）からのプラスミド、例えば、ｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ｐＵＣ、ｐＫＳＭ及びＲＰ４等を含む。原核性ベクターはまた、限定されるものではないが、ファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３及び他の繊維状一本鎖ＤＮＡファージ等の誘導体を含む。
【００４９】
発現されるべきモノクローナル抗体ｃＤＮＡを含むベクターは、後述のように、適当な宿主細胞中にトランスフェクトされる。宿主細胞は、適当な培地中に維持され、この細胞及びベクターが複製する条件下に置かれる。
【００５０】
キメラ抗体
一般的に、キメラ抗体は、キメラ免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖コンポーネントのそれぞれに対して、少なくとも、好ましくは糖タンパク質を中和するヒト狂犬病特異的ヒト可変領域（例えば、接合セグメント（joining segment）で機能的に再配列される可変領域）の機能部位をコードする第１のＤＮＡセグメントであって、ヒト定常領域の少なくとも一部をコードする第２のＤＮＡセグメントに連結されたものを含む融合遺伝子を調製することによって生産される。各融合遺伝子は、発現ベクター中で組み立てられるか又は発現ベクター中に挿入される。次いで、その遺伝子産物を発現する能力のある受容細胞は、その遺伝子でトランスフェクトされる。トランスフェクトされた受容細胞は、組み込まれた遺伝子の発現を許す条件下で培養され、発現された免疫グロブリン又は免疫グロブリン鎖が回収される。
【００５１】
免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、モノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体を生産するリンパ球（リンパ系細胞）から得られる。例えば、狂犬病糖タンパク質に対抗するモノクローナル抗体を生産するヘテロハイブリドーマ細胞系は、本発明のキメラ抗体の免疫グロブリン可変領域源を提供する。定常領域は、標準的なクローニング技術によってヒト抗体生産細胞から得られる。別法では、２クラスの軽鎖及び５クラスの重鎖を表す遺伝子がクローン化されているので、ヒト由来の定常領域は、これらのクローンから容易に得られる。キメラ抗体の結合フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）2及びＦａｂフラグメントは、先端を切った形のキメラ重鎖遺伝子を設計することによって調製される。例えば、Ｆ（ａｂ’）2重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨ1ドメイン及びヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むだろう。別法として、このようなフラグメントは、キメラ免疫グロブリンの酵素開裂によって得ることができる。一例を挙げれば、パパイン又はペプシン開裂によって、それぞれＦａｂ又はＦ（ａｂ’）2フラグメントを生成することができる。
【００５２】
好ましくは、キメラ重鎖及び軽鎖、又はそれらの部分をコードする融合遺伝子は、受容細胞を同時トランスフェクト（cotransfect）するために用い得る２つの異なる発現ベクター中で組み立てられる。各ベクターは、２つの選択可能な遺伝子（一方は細菌性システム（系）内での選択ため、他方は真核性システム内での選択のためのもの）を含み、各ベクターは異なる遺伝子対を有する。これらのベクターは、細菌性システム内での融合遺伝子の生産及び増幅、及びその後の真核細胞の同時トランスフェクション及び同時トランスフェクトされた細胞の選択を可能とする。細菌性システムに対する選択可能な遺伝子の例としては、限定されるものではないが、アンピシリン耐性を与える遺伝子及びクロラムフェニコール耐性を与える遺伝子が含まれる。限定されるものではないが、真核性のトランスフェクタント（トランスフェクトされた細胞）の選択のための次の２つの選択可能遺伝子が好ましい：（ｉ）キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（転移酵素）遺伝子（ｇｐｔ）、及び（ｉｉ）Ｔｎ５（ｎｅｏと指定）からのホスホトランスフェラーゼ遺伝子。ｇｐｔでの選択は、この遺伝子によってコードされる酵素の、プリンヌクレオチド合成のための基質としてキサンチンを用い得る能力に基づく。類似の内因性酵素にはその能力はない。イノシン一リン酸のキサンチン一リン酸への交換をブロックする、キサンチン及びマイコフェノール酸を含む培地中では、ｇｐｔ遺伝子を発現する細胞のみが生き残ることができる。ｎｅｏの生成物は、抗生物質Ｇ４１８及びそのクラスの他の抗生物質によって引き起こされる真核細胞中でのタンパク質合成の阻害をブロックする。これら２つの選択手順は、同時に又は順次に使用することができ、２つの異なるＤＮＡベクター上で真核細胞内に導入される免疫グロブリン鎖遺伝子の発現を選択することができる。
【００５３】
発現系
遺伝子コードの本来の縮重のため、実質的に同一又は機能上均等な重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が、本発明の範囲内にある。本発明に従って使用することのできる変更されたＤＮＡ配列は、結果的に同一又は機能上均等な遺伝子産物をコードする配列を与える、異なるヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換を含む。遺伝子産物それ自体が、結果として沈黙の変化（silent change）をもたらし、従って機能上均等なモノクローナル抗体を生産する、重鎖又は軽鎖配列内でのアミノ酸残基の欠失、付加又は置換を含んでいてよい。
【００５４】
本発明によれば、モノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体の重鎖及び軽鎖、フラグメント若しくはその類似物をコードするヌクレオチド配列が、適当な発現ベクター内に挿入される。挿入されたタンパク質コード配列の転写及び翻訳のために必要な要素を含むこのベクターは、それゆえ、モノクローナル狂犬病ウイルス中和抗体の形成のための重鎖及び軽鎖免疫グロブリンの発現を導く組み替えＤＮＡ分子を生成する。
【００５５】
好ましい受容細胞系は骨髄腫細胞である。骨髄腫細胞は、トランスフェクトされた免疫グロブリン遺伝子によってコードされる免疫グロブリンを合成、組み立て及び分泌することができる。更に、これらは免疫グロブリンのグリコシル化のための機構を有する。特に好ましい受容細胞は、免疫グロブリンを生産しない骨髄腫細胞系、例えば、Ｓｐ２／０である。これらの細胞系は、トランスフェクトされた免疫グロブリン遺伝子によってコードされる免疫グロブリンのみを生産する。骨髄腫細胞は、培養中で成長させるか、又は分泌された免疫グロブリンを腹水から得ることができるマウスの腹膜中で成長させることができる。他のリンパ球（リンパ系細胞）、例えば、Ｂリンパ球又はハイブリドーマ細胞を、好適な受容細胞として用い得る。
【００５６】
リンパ球（リンパ系細胞）を免疫グロブリンコード遺伝子を含むベクターでトランスフェクトするためには、いくつかの方法がある。リンパ球（リンパ系細胞）内にＤＮＡを導入する好ましい一方法は、エレクトロポレーション（電気穿孔法）によるものである。この方法では、受容細胞は、組み込まれるべきＤＮＡの存在下で電気パルスを受けさせられる。ＤＮＡを導入する他の一方法は、プロトプラスト（原形質）融合法によるものである。この方法では、免疫グロブリン遺伝子を含む組み替えプラスミドを宿す細菌から細胞壁を取り除くためにリゾチームを用いる。生成したスフェロプラストは、ポリエチレングリコールで骨髄腫細胞と融合される。プロトプラスト融合の後、トランスフェクタントが選択され、分離される。多くの細胞タイプ内にＤＮＡを導入するために用い得る他の一技術は、リン酸カルシウム沈降法である。
【００５７】
免疫グロブリン遺伝子はまた、非リンパ球（非リンパ系細胞）、例えば、細菌又は酵母中で発現され得る。細菌中で発現される場合、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖は、封入体の部分となる。従って、その鎖は、分離され、精製され、そして機能的免疫グロブリン分子へと組み立てられる必要がある。シグナル配列を含む融合タンパク質としてのＥ．ｃｏｌｉからの分泌を含む、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現のためのその他の方策が利用可能である（例えば、プラックトゥーン（Pluckthun, A.）ら、 BioTechnology 9: 545-551, 1991；スケラ（Skerra, A.）ら、BioTechnology 9:273-278, 1991を参照）。
【００５８】
【配列表】
Claims (10)
- 抗体重鎖及び抗体軽鎖から成る抗体をコードする分離された核酸であって、配列番号３のアミノ酸配列を有する抗体重鎖をコードする第１の核酸セグメントと、配列番号４のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖をコードする第２の核酸セグメントと、を有する分離された核酸。
- 前記第１の核酸セグメントは配列番号１のヌクレオチド配列を有し、前記第２の核酸セグメントは配列番号２のヌクレオチド配列を有する請求項１に記載の分離された核酸。
- 請求項１又は２に記載の核酸を有する発現ベクター。
- 請求項３に記載の発現ベクターで形質転換され、前記発現ベクターによってコードされたポリペプチドを発現するようになっている宿主細胞。
- 狂犬病ウイルス中和抗体の製造方法であって、請求項４に記載の宿主細胞を培養することを含む製造方法。
- 配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチドと、配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドと、を有する抗体。
- （ａ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有する抗体重鎖ポリペプチドの可変領域をコードする第１のＤＮＡ配列と、（ｉｉ）ヒト重鎖定常領域をコードする第２のＤＮＡ配列と、を有する融合遺伝子によってコードされる免疫グロブリン重鎖と、
（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖ポリペプチドの可変領域をコードする第１のＤＮＡ配列と、（ｉｉ）ヒト軽鎖定常領域をコードする第２のＤＮＡ配列と、を有する融合遺伝子によってコードされる免疫グロブリン軽鎖と、
を有する抗体。 - 配列番号３のアミノ酸配列を有する抗体重鎖ポリペプチドと配列番号４のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖ポリペプチドとを有する抗体のフラグメントを含む抗体フラグメントであって、前記抗体の６個の補体決定領域を含み、狂犬病ウイルス中和活性を有する抗体フラグメント。
- 配列番号３のアミノ酸配列を有する抗体重鎖ポリペプチドと配列番号４のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖ポリペプチドとを有する抗体のフラグメントを含む抗体フラグメントであって、狂犬病ウイルス中和活性を有し、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント及びＦ（ａｂ’）2フラグメントから成る群から選択される抗体フラグメント。
- 狂犬病ウイルスに曝露した個体を処置するための、請求項６若しくは７に記載の抗体又は請求項８若しくは９に記載の抗体フラグメント。
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