RU2272809C2 - Специфичные в отношении вируса бешенства нейтрализующие моноклональные антитела человека и нуклеиновые кислоты и связанные с ними способы - Google Patents
Специфичные в отношении вируса бешенства нейтрализующие моноклональные антитела человека и нуклеиновые кислоты и связанные с ними способы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2272809C2 RU2272809C2 RU2002133470/13A RU2002133470A RU2272809C2 RU 2272809 C2 RU2272809 C2 RU 2272809C2 RU 2002133470/13 A RU2002133470/13 A RU 2002133470/13A RU 2002133470 A RU2002133470 A RU 2002133470A RU 2272809 C2 RU2272809 C2 RU 2272809C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- rabies virus
- seq
- amino acid
- cells
- Prior art date
Links
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 title claims abstract description 63
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 39
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 22
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 20
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 18
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 18
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 16
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 16
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 4
- 241000266847 Mephitidae Species 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 3
- 241000282470 Canis latrans Species 0.000 description 3
- 241000288673 Chiroptera Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241001416166 Mephitis mephitis Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 241001147414 Eptesicus fuscus Species 0.000 description 2
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 2
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 2
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 2
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 2
- 241001125036 Lasionycteris noctivagans Species 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241000282330 Procyon lotor Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000596212 Vulpes lagopus Species 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- AWKYSZSJPJUFQS-UHFFFAOYSA-N 3,7-dihydropurine-2,6-dione;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 AWKYSZSJPJUFQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-L 4-nitrophenyl phosphate(2-) Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LPMXVESGRSUGHW-UHFFFAOYSA-N Acolongiflorosid K Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1CC2(O)CCC3C4(O)CCC(C=5COC(=O)C=5)C4(C)CC(O)C3C2(CO)C(O)C1 LPMXVESGRSUGHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001404203 Aeorestes cinereus Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 101001008255 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1D-8 Proteins 0.000 description 1
- 101001047628 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2-29 Proteins 0.000 description 1
- 101001008321 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2D-26 Proteins 0.000 description 1
- 101001047619 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3-20 Proteins 0.000 description 1
- 101001008263 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3D-15 Proteins 0.000 description 1
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N IMP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102100022964 Immunoglobulin kappa variable 3-20 Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000711828 Lyssavirus Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 1
- 102000009112 Mannose-Binding Lectin Human genes 0.000 description 1
- 108010087870 Mannose-Binding Lectin Proteins 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000514943 Myotis grisescens Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- LPMXVESGRSUGHW-GHYGWZAOSA-N Ouabain Natural products O([C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O1)[C@H]1C[C@@H](O)[C@@]2(CO)[C@@](O)(C1)CC[C@H]1[C@]3(O)[C@@](C)([C@H](C4=CC(=O)OC4)CC3)C[C@@H](O)[C@H]21 LPMXVESGRSUGHW-GHYGWZAOSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000282335 Procyon Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101900083372 Rabies virus Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101900236200 Rabies virus Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000711931 Rhabdoviridae Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 244000166550 Strophanthus gratus Species 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000555295 Urocyon cinereoargenteus Species 0.000 description 1
- 108010027570 Xanthine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000012143 dye reagent concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 101150106093 gpt gene Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229940099472 immunoglobulin a Drugs 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- LUEWUZLMQUOBSB-GFVSVBBRSA-N mannan Chemical class O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H](O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]3O)CO)[C@@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-GFVSVBBRSA-N 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- LPMXVESGRSUGHW-HBYQJFLCSA-N ouabain Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C[C@@]2(O)CC[C@H]3[C@@]4(O)CC[C@H](C=5COC(=O)C=5)[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@@H]3[C@@]2(CO)[C@H](O)C1 LPMXVESGRSUGHW-HBYQJFLCSA-N 0.000 description 1
- 229960003343 ouabain Drugs 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000002064 post-exposure prophylaxis Effects 0.000 description 1
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 229940036105 rabies immunoglobulin Drugs 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. В изобретении описывается антитело и его фрагменты, нейтрализующие вирус бешенства, и способ лечения субъекта, подвергшегося воздействию вируса бешенства с использованием указанного антитела и его фрагмента. Раскрыты варианты выделенных нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, несущих соответственно легкую и тяжелую цепь антитела. Описан экспрессирующий вектор, несущий по меньшей мере одну из указанных нуклеиновых кислот. Использование изобретения повышает длительность выживания субъектов после воздействия на них вируса бешенства и может найти применение в соответствующей профилактической терапии таких субъектов. 6 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.
Description
Область изобретения
Изобретение относится к областям молекулярной биологии и иммунологии, и, более конкретно, к последовательностям нуклеиновой кислоты и аминокислотным последовательностям специфичных в отношении вируса бешенства нейтрализующих моноклональных антител человека.
Предпосылки изобретения
Бешенство представляет собой острое неврологическое заболевание, вызванное инфицированием центральной нервной системы вирусом бешенства, членом рода Lyssavirus семейства Rhabdoviridae. Имея большое историческое значение вследствие своей древности и устрашающей природы вызываемого заболевания, вирус бешенства продолжает являться важной опасной инфекцией человека и ветеринарной инфекцией по причине наличия обширных резервуаров в разных видах диких животных. По большей части земного шара различные варианты вируса бешенства являются эндемичными для конкретных видов наземных животных, при этом между ними относительно мало общего. Хотя на некоторых островах, включая Объединенное Королевство, Австралию, Японию и многие другие острова, нет наземного бешенства, в UK и Австралии недавно обнаружили вирусы бешенства и вирусы, подобные вирусам бешенства, ассоциированные с летучими мышами.
Вирус бешенства обычно представляет собой пулевидную частицу, покрытую оболочкой, в среднем 75 на 180 нанометров. Вирион состоит из однонитевой антисмысловой геномной РНК и пяти структурных белкоз: нуклеопротеиновых молекул (N), фосфопротеина (NS), полимеразы (L), матриксного белка (К) и вирусного гликспротеина (G).
Белки N и G несут антигенные детерминанты, которые обеспечивают характеристику серотипов различных штаммов вируса бешенства. N-детерминанты являются высококонсервативными среди различных вирусных изолятов и поэтому широко используются как мишени для иммунохимической детекции инфекции вирусом бешенства с применением специфических антител. С другой стороны, антигенные детерминанты, находящиеся на белке G существенно варьируют среди штаммов вируса бешенства. Вируснейтрализующие антитела, полученные путем иммунизации инактивированным вирусом, направлены против G. Хотя ясно, что Т-клеточные реакции на G, N и NS участвуют в иммунном ответе на вирус в экспериментальных условиях, оценка иммунитета против вируса бешенства в основном ограничена серологией, особенно что касается вируснейтрализующих антител.
В тех областях земного шара, где еще обычным является бешенство человека, основным резервуаром вирусов, инфицирующих человека, является собака. Там, где собачье бешенство в значительной степени элиминировано вакцинацией, варианты вируса переносят лисы, койоты, скунсы, еноты, летучие мыши и различные другие млекопитающие. Во многих областях резервуары вируса в дикой природе продолжают расширяться. Более того, вирус бешенства может переноситься от резервуарных видов человеку или другим конечным хозяевам животными, в норме не ассоциированными с бешенством, такими как кошки, кролики, и т.д.
Будучи почти неизбежно фатальным, как только возникают клинические симптомы, бешенство может предотвращаться срочным лечением инфицированного субъекта комбинацией пассивной и активной иммунизации. Пассивная иммунизация включает введение предварительно образованных антител, нейтрализующих вирус бешенства, полученных из объединенной сыворотки субъектов, иммунных к бешенству (иммунный к бешенству глобулин человека; HRIG) или гипериммунных лошадей (иммунный к бешенству глобулин лошади; ERIG). Оба типа реагентов несут реципиентам некоторые опасности, включая вариабельную антигенную специфичность, и, таким образом, действенность в отношении различных вирусных изолятов.
HRIG получают из объединенных сывороток человека, поэтому имеется возможность, что препараты HRIG могут контаминироваться известными и неизвестными болезнетворными микроорганизмами человека. С другой стороны, будучи препаратом чужеродного антигена, ERIG связан с тяжелыми анафилактическими реакциями. Мышиные моноклональные антитела против вируса бешенства предложены к использованию при профилактике после воздействия, но, как и ERIG, являются антигенно чужеродными для человека. Это может приводить к их быстрому выведению из организма человека, а также к их способности вызвать анафилактическую реакцию.
Для представления лучшего реагента были получены моноклональные антитела человека путем слияния трансформированных вирусом Эпштейна-Барра (EBV), специфичных в отношении вируса бешенства В-клеток человека с гетерогибридными донорами мышь-человек. Клоны кДНК, кодирующие тяжелые и легкие цепи антител из данных клеток, конструировали таким образом, что данные антитела экспрессировались в гетерологических экспрессирующих системах. Данные конструкции обеспечивали продукцию нейтрализующих вирус бешенства антител человека определенной специфичности в контролируемой системе, очищенной от возможных вредных примесей. Настоящее изобретение относится к данным моноклональным, нейтрализующим вурус бешенства антителам человека, последовательностям нуклеиновой кислоты их тяжелых и легких цепей и аминокислотным последовательностям кодируемых белков. Настоящее изобретение также относится к способам применения данных моноклональных антител в качестве терапевтически эффективного профилактического лечения субъектов, подвергшихся воздействию вируса бешенства, после данного воздействия.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является выделение молекул нуклеиновой кислоты, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи и легкой цепи, кодирующую аминокислотную последовательность тяжелой цепи и легкой цепи. Аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи принадлежат моноклональному, нейтрализующему вирус бешенства антителу, которое специфично связывается с белком вируса бешенства.
В одном из осуществлений настоящего изобретения данные выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют моноклональное, нейтрализующее вирус бешенства антитело, происходят из последовательностей кДНК тяжелой цепи SEQ ID NO: 1 и легкой цепи SEQ ID NO: 2.
Целью настоящего изобретения является предоставление выделенного моноклонального, нейтрализующего вирус бешенства антитела, которое кодируется клонами кДНК, кодирующими тяжелую и легкую цепь антитела, которые экспрессируются в гетерологических экспрессирующих системах и очищаются от вредных примесей. В одном из осуществлений настоящего изобретения аминокислотная последовательность выделенного моноклонального, нейтрализующего вирус бешенства антитела человека совпадает с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно.
Настоящее изобретение относится к гену слияния, кодирующему химерную легкую цепь иммуноглобулина. Химерная легкая цепь содержит первую последовательность ДНК, кодирующую вариабельный регион легкой цепи иммуноглобулина моноклонального, нейтрализующего вирус бешенства антитела, продуцируемого клеточной линией гетерогибридомы; и вторую последовательность ДНК, кодирующую константный регион легкой цепи человека. Дальнейшей целью настоящего изобретения является предоставление экспрессирующего вектора для экспрессии данного гена слияния. Дальнейшей целью является предоставление клетки-хозяина для данного экспрессирующего вектора.
Настоящее изобретение относится к гену слияния, кодирующему химерную тяжелую цепь иммуноглобулина. Химерная тяжелая цепь содержит первую последовательность ДНК, кодирующую зариабельный регион тяжелой цепи иммуноглобулина моноклонального, нейтрализующего вирус бешенства антитела, продуцируемого клеточной линией гетерогибридомы; и вторую последовательность ДНК, кодирующую константный регион тяжелой цепи человека. Дальнейшей целью настоящего изобретения является предоставление экспрессирующего вектора для экспрессии данного гена слияния. Дальнейшей целью является предоставление клетки-хозяина для данного экспрессирующего вектора.
Другой целью настоящего изобретения является предоставление выделенного моноклонального, нейтрализующего вирус бешенства антитела, происходящего из гена слияния, кодирующего химерную легкую цепь иммуноглобулина, и гена слияния, кодирующего химерную тяжелую цепь иммуноглобулина.
Целью настоящего изобретения является предоставление способа лечения субъекта, подвергшегося воздействию вируса бешенства, путем введения субъекту терапевтически эффективного количества моноклонального, нейтрализующего вирус бешенства антитела человека, которое кодируется клонами кДНК, кодирующими тяжелую и легкую цепь антитела, которые экспрессируются в гетерологических экспрессирующих системах и очищаются от вредных примесей, предотвращая таким образом распространение вируса бешенства в центральную нервную систему.
Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, которые специфично связываются с гликопротеином различных штаммов вируса бешенства. Лечение после воздействия вируса моноклональным антителом или смесью различных моноклональных антител нейтрализует вирус бешенства в месте проникновения и предотвращает распространение вируса в центральную нервную систему (ЦНС). Таким образом, в случаях чрезкожного пути воздействия вируса бешенства или его воздействия на слизистые, специфичные в отношении бешенства моноклональные антитела применяют на месте укуса, а также вводят системно. Поскольку репликация вируса происходит почти исключительно в нейронах, нейтрализация и выведение вируса моноклональными антителами по настоящему изобретению перед проникновением в ЦНС является эффективной профилактикой после воздействия вируса.
Клетки
В-клетки человека, использованные для гибридизации, получали из периферической крови 5 доноров в период между 7 и 21 сутками после третьей дозы первичной вакцинации от бешенства и 5 иммунных к бешенству доноров через 10-21 сутки после введения стимулирующей вакцины. Во всех случаях применяемой вакциной являлась вакцина диплоидных клеток человека Rabivac™ (вирусный штамм Pitman Moore 1503-3M, Behringwerke, Марбург, ФРГ). Все доноры являлись негативными при тестировании на ВИЧ и гепатит В. Клетки гибридной гетеромиеломы мышь-человек SHM-D33, задействованные в качестве гибридомных партнеров слияния (Teng, N.N. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7308, 1983) и лейкоциты мармозетки В95-8, трансформированные вирусом Эпштейна-Барра (EBV), применяемым в качестве источника EBV (Henderson et al., J. Exp. Med. Vol.76, p.152, 1977), были получены из АТСС (Rockvilie, Мэриленд).
Вирусы бешенства
Для оценки способности препаратов антител нейтрализовать различные вирусные штаммы бешенства использовали некоторое количество фиксированных лабораторных штаммов с различной антигенностью, а также два представительных уличных вируса бешенства. Фиксированные штаммы Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA), вирусный стандарт для введения, адаптированный для мозга мыши (CVS-24) или для клеточной культуры (CVS-11), и Pitman-Moore (PM) были получены из вирусной коллекции Университета Томаса Джефферсона. Вирус бешенства летучей мыши серой ночницы (SHBRV), ассоциированный с большей частью последних случаев бешенства в Соединенных Штатах Америки, и уличный вирус бешенства койота/мексиканский вирус собачьего бешенства (COSRV), являющийся членом семейства вирусов собачьего бешенства, были получены как описано (Morimoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.93, p.5653, 1996). Очистка вируса и получение гликопротеина (G) и нуклеопротеина (N) были описаны в других источниках (Dietzschold et al, World Health Organization, Geneva, p.175, 1996).
Трансформация EBV человеческих PBL
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из цельной крови центрифугированием в градиенте плотности на Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, Нью-Джерси), как подробно описано в других источниках (Plebanski et al., Immunology Vol.75, p.86, 1992). Затем удаляли Т-клетки путем негативной селекции с использованием покрытых моноклональными антителами против CD2 магнитных гранул (Dynal Inc, Lake Success, Нью-Йорк) и концентратора магнитных частиц (Dynal). СD2-негативные клетки, преимущественно В-клетки, собирали и иммортализовали, как описано ранее (Swaminathan, 1992). В кратком изложении, клетки В95-8, культивированные до слияния в RPMI1640 (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, Нью-Йорк), дополненной 10% фетальной сыворотки теленка (FBS; Gibco), лизировали путем замораживания-оттаивания на сухом льду для высвобождения внутриклеточного EBV. Надосадочную жидкость, содержащую EBV, осветляли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин и путем фильтрации через фильтр с порами 0,45 мкм. Вирус концентрировали центрифугированием при 8000 об/мин в течение 2 ч при 4°С 7·106 В-клеток (ресуспендированных в 1 мл культуральной среды В95-8) инкубировали при 37°С в течение 2 ч с вирусом, полученным из 25 мл клеток В95-8. После инфекции клетки дважды отмывали культуральной средой, помещали в 96-луночный плоскодонный планшет для микротитрования (Nunc, Fisher Scientific, Pittsburgh, Пенсильвания) в концентрации 1·104 клеток/лунку и культивировали при 37°С в увлажненной атмосфере из 5% CO2 и 95% воздуха.
Образование гетерогибридов мышь-человек
После того, как трансформированные EBV клетки культивировали примерно в течение 4 недель, надосадочную жидкость собирали и тестировали на предмет наличия антител, специфичных в отношении вируса бешенства посредством ELISA. Позитивные лунки переносили вначале в культуры объемом 1 мл, а затем в культуры объемом 2 мл (48- и 24-луночные планшеты, Nunc), и затем анализировали надосадочную жидкость посредством теста быстрого ингибирования фокусов флуоресценции (RFFIT) на предмет антител, нейтрализующих вирус бешенства, как подробно описано в других источниках (Hooper, ASM Press, WA p.755, 1997). Клеточные линии, продуцирующие нейтрализующие антитела, подвергали гибридизации с клетками SHM-D33 (инвентарный номер АТСС CRL1668) следующим образом. Равные количества SHM-D33 и клеток, трансформированных EBV (примерно 5·106 каждых) совместно добавляли в стерильную полистирольную круглодонную пробирку (Falcon, Fisher Scientific) и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин. Клетки дважды отмывали бессывороточной средой и ресуспендировали клеточный осадок в 100 мкл среды.
Пробирки нагревали на водяной бане с температурой 37°С в течение 1 мин, и затем в течение 45-секундного периода добавляли по каплям 0,5 мл теплого (37°С) 50% (мас./об.) полиэтиленгликоля (Sigma Chemical Co., Сент-Луис, Миссури, кат. №Р-7181) при осторожном встряхивании пробирки. Затем реакцию слияния останавливали медленным добавлением 3 мл бессывороточной среды в течение 30 сек, с последующим добавлением 9 мл в течение 30 сек. Пробирки выдерживали при комнатной температуре в течение 8 мин и затем инкубировали в течение 2 мин на водяной бане с температурой 37°С. Затем клетки центрифугировали при 500 г в течение 3 мин и осторожно ресуспендировали клеточный сгусток в 30 мкл среды Dulbecco (IMDM; Gibco), в модификации Iscove, содержащей 10% FBS, а также 0,04 мкМ аминоптерина (Gibco) и 10 мкМ уабаина (Sigma) для селекции против негибридизовавшихся клеток. Суспензии клеток помещали в 96-луночные плоскодонные планшеты для микротитрования в концентрации 1·104 клеток на лунку и инкубировали, как описано для клеточных линий.
Когда колонии гетерогибридных клеток стали сформированными (примерно 6 недель культивирования), надосадочные жидкости тестировали на продукцию антител, специфичных в отношении вируса бешенства путем ELISA и RFFIT. Продуцирующие антитела клетки клонировали как минимум три раза путем лимитирующего разведения в планшетах для микротитрования. Клетки титровали в 96-луночных круглодонных планшетах в 2-кратных разведениях, начиная от 4 клеток на лунку. Клеткам из лунок, содержащих в среднем 0,25 клеток или менее, давали возможность пролиферировать для сбора надосадочной жидкости и дальнейшего анализа.
Анализ антител, специфичных в отношении вируса бешенства, посредством ELISA
Специфичность и изотип антител оценивали путем твердофазного ELISA. Планшеты (PolySorb™, Nunc) при комнатной температуре, в увлажненной камере в течение ночи покрывали 5 мкг/мл вирусом бешенства ERA, гликопротеином или нуклеопротеином, разведенных в фосфатно-солевом буфере (PBS). Затем планшеты блокировали 5% порошковым молоком в PES и отмывали в PBS, содержащем 0,05% Tween20 (PBS-Tween) перед добавлением образцов надосадочной жидкости.
После инкубации при комнатной температуре в течение 2 ч планшеты промывали PBS-Tween для удаления несвязавшегося первичного антитела и добавляли различные конъюгированные с ферментом или биотинилированные вторичные антитела, специфичные в отношении различных изотипов тяжелых цепей человека, с инкубацией в течение 1 ч при комнатной температуре. Вторичное антитело детектировали или по продукции в среде растворимого конечного продукта после добавления подходящего субстрата (3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) в фосфатно-цитратном буфере или п-нитрофенилфосфат (PNPP) в 0,1М глициновом буфере, Sigma) или после добавления авидинащелочной фосфатазы (30 мин при КТ) и субстрата PNPP. Реакцию пероксидаза-ТМВ останавливали добавлением 2М H2SO4. Значения поглощения считывали на спектрофотометре для микропланшетов (Biotek, Winooski, Вермонт) при 450 нм для продукта ТМВ и при 405 нм для реакции PNPP.
RFFIT
Образцы надосадочной жидкости для каждой трансформированной клеточной линии анализировали на предмет наличия антител, нейтрализующих вирус бешенства с использованием разновидности теста быстрого ингибирования фокусов флуоресценции (RFFIT), как описано ранее (Hooper, ASM Press, WA p.755, 1997). Образцы надосадочной жидкости (50 мкл) подвергали разделению в 96-луночных плоскодонных планшетах (Nunc). 30 мкл разведения вируса бешенства, о котором известно, что оно вызывает 80-90% инфицирования индикаторных клеток, добавляли в каждый тестируемый образец, и инкубировали планшеты при 37°С в течение 1 ч. Контрольные образцы, отрицательные со средой и положительные с сывороткой, иммунной к бешенству, включали в каждый анализ. После инкубации 30 мкл клеток почки детеныша хомячка (ВНК) в концентрации 1,8×106 клеток/мл добавляли в каждую лунку, и инкубировали культуры в течение ночи при 37°С. Затем планшеты единожды отмывали ледяным PBS и фиксировали ледяным 90% ацетоном в течение 20 мин при 20°С. После фиксации ацетон удаляли, и планшеты сушили на воздухе. Для детекции инфицированных клеток ВНК к каждой лунке добавляли 40 мкл FITC-моноклонального глобулина против нуклеопротеина вируса бешенства (Centocor, Malvern, Пенсильвания) и инкубировали в течение 45 мин при 37°С. Затем планшеты трижды отмывали дистиллированной водой и исследовали под флуоресцентным микроскопом.
Очистка антител путем аффинной хроматографии
Антитело IgG1 очищали с использованием колонки с белком А (Protein A Sepharose™ Fast Flow, Amersham Pharmacia Biotech). В кратком изложении, надосадочные жидкости осветляли фильтрацией через мембрану с порами 0,45 мкм и доводили рН до 8,0 1н NaOH. Надосадочную жидкость пропускали через колонку с линейной скоростью потока, примерно равной 100 см/час. После промывки в PBS (pH 8) антитело элюировали с колонки с использованием 0,1М раствора лимонной кислоты, и затем диализовали против PBS.
Антитело IgG3 очищали с использованием колонки с белком G (Protein G Sepharose™ Fast Flow, Amersham Pharmacia Biotech). Надосадочную жидкость, содержащую IgG3, осветляли фильтрацией через мембрану с порами 0,45 мкм и доводили pH до 7,0 1н NaOH. Надосадочную жидкость пропускали через колонку с линейной скоростью потока, примерно равной 11 см/час. После промызки PBS антитело элюировали с колонки с использованием 0,1М глицинового буфера (pH 3,0), и затем диализовали против PBS.
Антитело IgM очищали с использованием маннансвязываюшего белка и модификации ранее описанного способа (Nevens et al., J. Chromatogr, vol.597, p.247, 1992). В кратком изложении, надосадочную жидкость, содержащую IgM, обрабатывали EDTA, доводили pH до 8,0 1М NaOH, фильтровали и охлаждали до 4°С. Агарозу с маннансвязывающим белком (Sigma) промывали в колонке при 4°С связывающим буфером, состоящим из 0,1 М NaHCO3/0,5 М NaCl, pH 8,3, и затем добавляли надосадочную жидкость и инкубировали на колонке в течение 15 мин при 4°С. Затем колонку отмывали несколькими объемами связывающего буфера и доводили до RT в течение 1 ч. IgM элюировали из колонки связывающим буфером при RT и диализовали против PBS.
Концентрации белка в диализованных препаратах антител определяли с использованием анализа по детекции белка (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Калифорния) следующим образом. 100 мкл образца добавляли к 5 мл разведения 1/5 концентрата красящего реагента и инкубировали при RT в течение 10 минут. Отрицательный контроль PBS и различные белковые стандарты бычьего сывороточного альбумина (BSA) включали в каждый анализ. После инкубации образцы считывали в спектрофотометре при 595 нм. Концентрации белка в тестируемых образцах вычисляли по сравнению с поглощением стандартов BSA. Чистоту препаратов антител оценивали путем электрофореза в 12,5% полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях (SDS-PAGE). Очищенные антитела характеризовались на SDS-PAGE двумя основными полосами, соответствующими тяжелым и легким цепям иммуноглобулина.
Получение, выделение и определение последовательности клонов кДНК Общую РНК выделяли из клеток гибридомы JA с использованием RNAzol В (Biotecx Laboratories, Houston). Реакции обратной транскрипции проводили при 42°С в течение 1 ч с обратной транскриптазой вируса миелобластоза птиц (Promega) и олиго(dT)-праймера. Часть продуктов обратной транскрипции подвергали амплификации полимеразной цепной реакцией (PCR) с использованием специфичных праймеров тяжелых цепей: праймер IgG-HF1 (5'-ACCATGGAGTTTGGGCTGAG-3' (SEQ ID NO: 5), старт-кодон подчеркнут, инвентарный номер Y14737), и праймер IgG-HR2 (5'-ACTCATTTACCCGGGGACAG-3' (SEQ ID NO: 6), стоп-кодон подчеркнут, инвентарный номер Y14737) или специфичных праймеров легких цепей: праймер IgG-LF5 (5'-AGCATGGAAGCCCCAGCTCA-3' (SEQ ID NO: 7), старт-кодон подчеркнут, инвентарный номер М63438), и праймер IgG-LR2 (5'-CTCTAACACTCTCCCCTGTTG-3' (SEQ ID NO: 8), стоп-кодон подчеркнут, инвентарный номер М63438). Амплификацию проводили в 35 циклов денатурации при 94°С в течение 60 секунд, с отжигом при 50°С в течение 60 секунд, и полимеризацией при 72°С в течение 90 секунд с ДНК-полимеразой Taq (Promeca). Продукты PCR (1,4 тыс.осн. для тяжелой цепи, 0,7 тыс.осн. для легкой цепи) очищали и определяли последовательность с использованием набора для циклического определения последовательности AmpliTaq (Perkin-Elmer) со специфическими праймерами. Продукты PCR клонировали в клонирующий вектор ТА, pCR2.1 (Invitrogen). Определяли последовательность клонированных кДНК тяжелой цепи и легкой цепи с использованием набора для циклического определения последовательности AmpliTaq (Perkin-Elmer) со специфическими праймерами.
Последовательности, кодирующие моноклональные антитела, нейтрализующие вирус бешенства
кДНК моноклональных антител и комплементарные ей последовательности представляют собой нуклеиновые кислоты моноклональных антител, описанные по настоящему изобретению. В описанном здесь конкретном осуществлении последовательность кДНК моноклонального антитела предоставлена для тяжелой цепи (SEQ ID NO: 1) и легкой цепи (SEQ ID NO: 2) моноклонального антитела из клона JA, будучи, таким образом, лишенной каких-либо интронов.
Данное изобретение также относится к однонитевым олигонуклеотидам для применения в качестве праймеров в PCR, в которой амплифицируется фрагмент, содержащий последовательность моноклонального антитела, относящийся, например, к вариабельному или гипервариабельному региону моноклонального антитела. Олигонуклеотид характеризуется последовательностью подлежащей гибридизации части, по крайней мере, по длине, равной 8 нуклеотидам, гена моноклонального антитела, а другой нуклеотид характеризуется последовательностью, обратно комплементарной нижележащей последовательности (в положении «даунстрим») той же цепи гена моноклонального антитела, так что каждый нуклеотид служит праймером для синтеза в направлении навстречу другому. Олигонуклеотиды по длине предпочтительно попадают в интервал 10-35 нуклеотидов.
Настоящее изобретение относится к полноразмерным последовательностям кДНК тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела клона гетерогибридомы JA (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, соответственно), и к кодируемым полипептидам аминокислот №1-474 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 3) и аминокислот №1-234 легкой цепи (SEQ ID NO: 4).
В описанном здесь конкретном осуществлении изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты моноклонального антитела из клона гетерогибридомы JA. В предпочтительном, но не ограничивающем аспекте изобретения клон гетерогибридомы JA является источником кДНК моноклонального антитела.
Функциональные эквиваленты моноклональных антител, нейтрализующих вирус бешенства
Данное изобретение также включает функциональные эквиваленты антител, представленных в данном описании. Функциональные эквиваленты обладают характеристиками связывания, сравнимыми с таковыми для антител, и включают, например, химерные или одноцепочечные антитела, а также их фрагменты. Способы продукции таких функциональных эквивалентов описаны в заявке РСТ WO 93/21319, в Европейской патентной заявке №239400; в заявке РСТ WO 89/09622; Европейской патентной заявке 338745; и Европейской патентной заявке ЕР 332424.
Функциональные эквиваленты включают полипептиды с аминокислотными последовательностями, по существу теми же самыми, что аминокислотные последовательности вариабельных или гипервариабельных регионов антител по настоящему изобретению. «По существу те же самые» аминокислотные последовательности определены здесь как последовательность по крайней мере с 70%-ной, предпочтительно, по крайней мере с 80%-ной, и, более предпочтительно, по крайней мере с 90%-ной гомологией в отношении другой аминокислотной последовательности, что определяется по поиску способом FASTA согласно Pearson and Lipman, Proc. Natl. Inst. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448, 1988. Химерные антитела содержат константные регионы, происходящие в основном или исключительно из константных регионов человеческого антитела, и вариабельных регионов, происходящие в основном или исключительно из последовательности вариабельного региона моноклонального антитела из любой стабильной гетерогибридомы (Champion, J. M., et al., Journal of Immunological Methods, 235 81-90, 2000).
Одноцепочечные антитела или Fv-фрагменты представляют собой полипептиды, состоящие из вариабельного региона тяжелой цепи антитела, связанного с вариабельным регионом легкой цепи, при наличии или в отсутствие соединяющего линкера. Таким образом, Fv включает участок, комбинирующий целое антитело.
Функциональные эквиваленты, кроме того, включают фрагменты антител, которые обладают теми же или, по существу, теми же характеристиками связывания, как таковые для целого антитела. Такие фрагменты могут содержать один или несколько Fab-фрагментов F(ab').sub.2-фрагмента. Предпочтительно, фрагменты антитела содержат все шесть определяющих комплементарность регионов целого антитела, хотя фрагменты, содержащие меньшее максимального количество таких регионов, такое как три, четыре или пять определяющих комплементарность региона, также являются функциональными. Функциональные эквиваленты являются членами класса иммуноглобулинов IgG и его подклассов, но могут представлять собой или сочетать любые из следующих классов иммуноглобулинов: IgM, IgA, IgD или IgE, и их подклассов. Тяжелые цепи разных подклассов, таких как подклассы IgG, ответственны за различные эффекторные функции, и, таким образом, за счет выбора требуемого константного региона тяжелой цепи продуцируют химерные антитела с требуемой эффекторной функцией. Предпочтительными константными регионами являются гамма-1 (IgG1), гамма-3 (IgG3) и гамма-4 (IgG4). Константный регион легкой. цепи может быть типа каппа или лямбда.
Иммуноглобулины по настоящему изобретению могут быть моновалентными, дивалентными или поливалентными. Моновалентные иммуноглобулины представляют собой димеры (HL), образованные химерной тяжелой цепью, ассоциированной через дисульфидные мостики с химерной легкой цепью. Дивалентные иммуноглобулины представляет собой тетрамеры (H.sub.2 L.sub.2), образованные двумя димесами, ассоциированными по крайней мере через один дисульфидный мостик.
Стандартные способы рекомбинантной ДНК
Стандартные способы рекомбинантной ДНК описаны в Sambrook et al., "Molecular Cloning", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) и Ausubel et al. (Eds) "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates/Wiley-Interscience, New York (1990).
В кратком изложении, выбирают подходящим источником клеток, содержащих молекулы нуклеиновой кислоты, которые экспрессируют требуемую ДНК, такую как относящуюся к антителу или эквиваленту антитела. Общую РНК получают путем стандартных процедур из подходящего источника. Общую РНК применяют для непосредственного синтеза кДНК. Стандартные способы выделения РНК и синтеза кДНК описаны в стандартных руководствах по молекулярной биологии, таких как, например, те, что описаны выше.
кДНК может быть амплифицирована известными способами. Например, кДНК может использоваться в качестве матрицы для амплификации путем полимеразной цепной реакции (PCR); см. Saiki et al., Science, 239, 487, 1988 или Mullis et al., патент США №683195. Последовательности олигонуклеотидных праймеров для амплификации путем PCR происходят из известных, подлежащих амплификации последовательностей. Данные олигонуклеотиды синтезируют способами, известными в данной области. Подходящие способы включают те, что описаны Caruthers в Science 230, 281-285, 1985.
Смесь вышележащих и нижележащих (в положениях «апстрим» и «даунстрим») олигонуклеотидов применяют при амплификации путем PCR. Условия оптимизируют для каждой конкретной пары праймеров по стандартным процедурам. Продукт PCR анализируют, например, путем электрофореза, на предмет кДНК, характеризующейся правильным размером, соответствующим последовательности между праймерами.
Альтернативно, кодирующий регион может амплифицироваться в двух или более перекрывающихся фрагментах. Перекрывающиеся фрагменты конструируют с включением сайтов рестрикции, позволяющих объединение фрагментов в интактную кДНК.
Для выделения целых кодирующих белок регионов тяжелых и легких цепей каждого моноклонального антитела из каждой клеточной линии гетерогибридомы вышележащий олигонуклеотидный праймер для PCR, например, комплементарен последовательности на 5'-конце, включая старт-кодон ATG и по крайней мере 5-10 нуклеотидов левее старт-кодона. Нижележащий олигонуклеотидный праймер для PCR комплементарен последовательности на 3'-конце требуемой последовательности ДНК. Требуемая последовательность кДНК кодирует целую часть тяжелой и легкой цепей каждого моноклонального антитела, включая стоп-кодон.
Подлежащая амплификации кДНК, такая как та, что кодирует антитела или эквиваленты антител, также может реплицироваться в состав широкого спектра клонирующих векторов в широком спектре клеток-хозяев. Клетка-хозяин может являться прокариотической или эукариотической.
Вектор, в который встраивается кДНК моноклонального антитела, может включать сегменты хромосомных, нехромоссмных и синтетических последовательностей ДНК. Некоторые подходящие прокариотические клонирующие векторы включают в качестве неограничивающих примеров плазмиды из Е.coli, такие как colEl, pCRl, pBR322, pMB9, pUC, pKSM и RP4. Прокариотические векторы также включают в качестве неограничивающих примеров производные ДНК фагов, таких как М13, и другие нитевидные фаги с однонитевой ДНК.
Вектор, содержащий подлежащую экспрессии кДНК моноклонального антитела, трансфицируется в подходящую клетку-хозяина, как описано ниже. Клетку-хозяина выдерживают в подходящей культуральной среде, и подвергают воздействию условий, в которых клетки и вектор реплицируются.
Химерные антитела
В основном химерные антитела продуцируют путем получения для каждого компонента легкой и тяжелой цепи химерного иммуноглобулина гена слияния, включающего первый сегмент ДНК, который кодирует по крайней мере функциональную часть специфичного к вирусу бешенства, предпочтительно к гликопротеину, нейтрализующего вариабельного региона человека (например, функционально перестроенного вариабельного региона с соединяющим сегментом), связанную со вторым сегментом ДНК, кодирующим по крайней мере часть человеческого константного региона. Каждый ген слияния встроен или включен в экспрессирующий вектор. Затем данными генами трансфицируют клетки-реципиенты, способные экспрессировать генные продукты. Трансфицированные клетки-реципиенты культивируют в условиях, которые дают возможность для экспрессии включенных генов, и получают экспрессированные иммуноглобулины или иммуноглобулиновые цепи.
Гены, кодирующие вариабельный регион тяжелых и легких цепей иммуноглобулина получают из лимфоидных клеток, которые продуцируют моноклональные антитела, нейтрализующие вирус бешенства. Например, клеточные линии гетерогибридомы, продуцирующие моноклональные антитела против гликопротеина вируса бешенства, представляют источник иммуноглобулинового вариабельного региона для настоящих химерных антител. Константные регионы получают из антителопродуцирующих клеток человека стандартными способами клонирования. Альтернативно, поскольку гены, представляющие два класса легких цепей и пять классов тяжелых цепей, были клонированы, константные регионы человеческого происхождения легко доступны из данных клонов. Химерные связывающие фрагменты антитела, такие как F(ab').sub.2 и Fab-фрагменты, получают путем конструирования гена химерной тяжелой цепи в укороченной форме. Например, химерный ген, кодирующий часть тяжелой цепи F(ab').sub.2 включает последовательности ДНК, кодирующие СН.sub.1-домен и шарнирный регион тяжелой цепи. Альтернативно, такие фрагменты могут быть получены ферментным расщеплением химерного иммуноглобулина. Например, расщепление папаином или пепсином может приводить к образованию Fab- или F(ab').sub.2-фрагментов соответственно.
Предпочтительно, гены слияния, кодирующие тяжелую и легкую химерные цепи или их части, встроены в два разных экспрессируащих вектора, которые могут использоваться для совместной трансфекции клеток-реципиентов. Каждый вектор содержит два подлежащих селекции гена, один для селекции в бактериальной системе и один для селекции в эукариотической системе, причем каждый вектор имеет отличную от другого пару генов. Данные векторы дают возможность для продукции и амплификации генов слияния в бактериальных системах, и последующей совместной трансфекции эукариотических клеток и селекции совместно трансфицированных клеток. Неограничизающие примеры генов, подлежащих селекции в бактериальных системах, включают гены, обеспечивающие резистентность к ампициллину, и ген, обеспечивающий резистентность к хлорамфениколу. Предпочтительные два подлежащих селекции гена для селекции эукариотических трансфицированных клеток приведены в качестве неограничивающих примеров: (i) ген ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (gpt) и (ii) ген фосфотрансферазы из Тn5 (обозначенный neo). Селекция gpt основана на способности фермента, кодируемого данным геном, использовать ксантин в качестве субстрата для синтеза пуриновых нуклеотидов; аналогичный эндогенный фермент этого не может. В среде, содержащей ксантин и микофеноловую кислоту, которая блокирует преобразование инозин-монофосфата в ксантин-монофосфат, могут выживать только клетки, экспрессирующие ген gpt. Продукт neo блокирует ингибирование синтеза белка в эукариотических клетках, вызванное антибиотиком G418 и другими антибиотиками его класса. Две процедуры селекции могут применяться одновременно или последовательно для селекции на экспрессию генов цепей иммуноглобулина, введенных в эукариотическую клетку в двух разных векторах ДНК.
Экспрессирующие системы
Вследствие присущей генетическому коду вырожденности другие последовательности ДНК, кодирующие по существу те же или функционально эквивалентные аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей, находятся в объеме настоящего изобретения. Измененные последовательности ДНК, которые могут использоваться по изобретению, включают делеции, дополнения и замены различных нуклеотидных остатков, приводящих к образованию последовательности, которая кодирует тот же или функционально эквивалентный генный продукт. Данный продукт сам может содержать делеции дополнения и замены различных аминокислотных остатков в последовательности легкой или тяжелой цепи, которые приведут к молчащим изменениям, с продукцией таким образом функционально эквивалентного моноклонального антитела.
По настоящему изобретению нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую и легкую цепи моноклонального, нейтрализующего вирус бешенства антитела, его фрагмент или аналог, встраивают в. подходящий экспрессирующий вектор. Данный вектор содержит элементы, необходимые для транскрипции и трансляции встроенной последовательности, кодирующей белок, так что генерируются рекомбинантные молекулы ДНК, которые направляют экспрессию легкой и тяжелой иммуноглобулиновых цепей для образования моноклонального, нейтрализующего вирус бешенства антитела.
Предпочтительной реципиентной клеточной линией является линия клеток миеломы. Клетки миеломы могут синтезировать, конструировать и секретировать иммуноглобулины, кодируемые трансфицированными генами иммуноглобулина. Кроме того, они обладают механизмом гликозилирования иммуноглобулина. Особенно предпочтительной клеткой-реципиентом является клеточная линия миеломы, которая не продуцирует иммуноглобулин, такая как Sp2/0. Данные клеточные линии продуцируют только иммуноглобулин, кодируемый трансфицированными генами иммуноглобулина. Клетки миеломы могут выращиваться в культуре или в брюшной полости мышей, где секретируемый иммуноглобулин может быть получен из асцитной жидкости. В качестве подходящих клеток-реципиентов могут служить другие лимфоидные клетки, такие как В-лимфоциты или клетки гибридомы.
Существует несколько способов трансфекции лимфоидных клеток векторами, содержащими гены, кодирующие иммуноглобулин. Предпочтительным путем введения ДНК в лимфоидные клетки является введение путем электропорации. По данной процедуре клетки-реципиенты подвергаются воздействию электрического импульса в присутствии ДНК, подлежащей включению. Другим путем введения ДНК является слияние с протопластом. По данному способу лизоцим применяется для снятия клеточной стенки с бактерий, несущих рекомбинантную плазмиду, содержащую иммуноглобулиновый ген. Полученные в результате сферопласты сливаются с клетками миеломы посредством полиэтиленгликоля. После слияния с протопластом трансфицированные клетки отбирают и выделяют. Другой способ, который может использоваться для введения ДНК в клетки многих типов, представляет собой преципитацию фосфатом кальция.
Иммуноглобулиновые гены также могут экспрессироваться в нелимфоидных клетках, таких как бактерии или дрожжи. При экспрессии в бактериях тяжелые цепи и легкие цепи иммуноглобулина становятся частью телец включения. Таким образом, данные цепи должны быть выделены и очищены, а затем смонтированы в функциональные иммуноглобулиновые молекулы. Доступны другие стратегии для экспрессии в Е.coli (см., например, Pluckthun, A., BioTechnology 9: 545-551, 1991; Skerra, A. et al., BioTechnology 9: 273-278, 1991), включая секрецию из Е.coli в виде белков слияния, включающих сигнальную последовательность.
Дополнительный Пример
Вирус-нейтрализующее действие моноклонального антитела, состоящего из тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3 и легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, было проверено против изолята вируса бешенства с использованием быстрого флуоресцентного теста (RFFIT) и отражено в Таблице 1. Активность испытуемого антитела была сравнена с нейтрализующей активностью коммерчески доступного препарата иммуноглобулина человека против бешенства (HRIG) (Imogam-rabies®, Pasteur Merieux Connaught).
Нейтрализующее действие препарата антитела была определена в четырех повторностях с двукратным шагом титрования, используя клетки нейробластомы мыши в качестве основы для роста вируса. Антитела были разбавлены до концентрации 0,02 Ед/0,1 мл раствора. Приблизительно 50-100 TCID50 каждого вируса, из числа указанных в Таблице 1, культивировали с антителом в течение 90 минут при 37°С. Затем была добавлена аликвота из 200 мкл суспензии клеток нейробластомы мыши (50000 клеток/мл) и далее проводили культивирование в течение 40 часов при 37°С. После фиксации ацетоном инфицированные вирусом клетки визуализировались окрашиванием при помощи антирабического реактива, меченого изотиоцианатом флуоресцеина. Положительная оценка базировалась на результате, соответствующем полной нейтрализации вируса. Результаты приведены в Таблице 1 ("+" нейтрализация; "0" - нет нейтрализации).
Моноклональное антитело на основе SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 4 нейтрализовало каждый испытуемый вариант вируса бешенства. Моноклональное антитело нейтрализовало даже штамм вируса бешенства, полученный от летучей мыши (Lasionycteris noctivagans), который был устойчив к действию коммерческого препарата.
Таблица 1 Нейтрализация вируса бешенства под действием HRIG и моноклоналыюго антитела с SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:4 |
||
Изолят вируса бешенства (источник образца) | HRIG | Mab |
(1) Енот (Procyon lotor), восточная область США | + | - |
(2) Скунс (Mephitis mephitis), северная и центральная области США | + | - |
(3) Скунс (М.mephitis), южная и центральная области США | + | - |
(4) Скунс (М.mephitis),Калифорния, США | + | - |
(5) Серая лисица (Urocyon cinereoargenteus), Техас, США. | + | - |
(6) Серая летучая мышь (Lasiurus cinereus) | 0 | - |
(7) Летучая мышь кожан бурый (Eptesicus fuscus), Нью Йорк, США | + | - |
(8) Летучая мышь кожан бурый (E.fuscus), Вашингтон, США | + | - |
(9) Летучая мышь вечерник серебристый (Lasionycteris noctivagans), США | + | - |
(10) Собака, граница США-Мексика | + | - |
(11)Собака, Таиланд | + | - |
(12) Собака, Филиппины | + | - |
(13) Арктическая лисица (Alopex lagopus), Аляска, США | + | - |
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР
Эксперимент in vivo, по оценке эффективности нейтрализации вируса моноклональным антителом, состоящим из тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3 и легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, был проведен с использованием выделенного вируса бешенства техасского койота. В качестве чувствительной модели использовали сирийских хомячков. Группе из шести испытуемых животных и группе из десяти контрольных животных вводили в правую икроножную мышцу (gastrocnemius) 50 мкл гомогената слюнной железы койота, инфицированного (в естественных условиях) вирусом бешенства, в разведении 1:1000. Через 24 часа хомячкам вводили 50 мкл моноклонального антитела с концентрацией 0,68 мг/мл, что эквивалентно приблизительно 0,24 ME противорабической активности.
Результаты эксперимента показали, что имеется достоверное различие в длительности выживания для двух групп (р=0.0075). Различие определено по критерию Манна-Уитни.
Для наглядности результаты представлены графически. Прямоугольники отражают результаты выживания в диапазоне 25-75 персентилей. Медиана (50 персентилей) в группе, получившей антитело, выделена в виде линии внутри прямоугольника. Интервальные отметки показывают разброс данных как максимальный и минимальный результат внутри группы.
Claims (14)
1. Антитело, которое нейтрализует вирус бешенства, включающее полипептид тяжелой цепи, имеющий по меньшей мере 80%-ную гомологию по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, и полипептид легкой цепи, имеющий по меньшей мере 80%-ную гомологию по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4.
2. Антитело по п.1, включающее полипептид тяжелой цепи, имеющий по меньшей мере 90%-ную гомологию по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, и полипептид легкой цепи, имеющий по меньшей мере 90%-ную гомологию по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4.
3. Антитело по п.1 или 2, которое представляет собой антитело человека.
4. Антитело по п.1 или 2, которое представляет собой антитело IgG1.
5. Антитело по п.2, включающее полипептид тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, и полипептид легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.
6. Фрагмент антитела, охарактеризованного в любом из пп.1-5, нейтрализующий вирус бешенства, где указанный фрагмент выбран из группы, состоящей из Fv фрагментов, Fab фрагментов и F(ab')2 фрагментов.
7. Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, где полипептид содержит тяжелую цепь антитела, нейтрализующего вирус бешенства.
8. Нуклеиновая кислота по п.7, включающая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.
9. Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, где полипептид содержит легкую цепь антитела, нейтрализующего вирус бешенства.
10. Нуклеиновая кислота по п.9, включающая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.
11. Экспрессирующий вектор, включающий по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту по любому из пп.7-10.
12. Вектор по п.11, включенный в клетку-хозяин.
13. Способ лечения субъекта, подвергшегося воздействию вируса бешенства, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела по любому из пп.1-5 или фрагмента по п.6.
14. Способ по п.13, в котором антитело или фрагмент применяют в месте укуса субъекта или вводят системно.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US20451800P | 2000-05-16 | 2000-05-16 | |
US60/204,518 | 2000-05-16 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2002133470A RU2002133470A (ru) | 2004-06-10 |
RU2272809C2 true RU2272809C2 (ru) | 2006-03-27 |
Family
ID=22758233
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2002133470/13A RU2272809C2 (ru) | 2000-05-16 | 2001-05-04 | Специфичные в отношении вируса бешенства нейтрализующие моноклональные антитела человека и нуклеиновые кислоты и связанные с ними способы |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6890532B2 (ru) |
EP (1) | EP1282703B1 (ru) |
JP (1) | JP4819285B2 (ru) |
AT (1) | ATE411387T1 (ru) |
CA (1) | CA2419148C (ru) |
DE (1) | DE60136174D1 (ru) |
IL (1) | IL152825A (ru) |
RU (1) | RU2272809C2 (ru) |
WO (1) | WO2001088132A2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2533802C1 (ru) * | 2013-08-30 | 2014-11-20 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Тримеризованное однодоменное антитело, специфически связывающееся с гликопротеином g вируса бешенства, нейтрализующее вирус бешенства |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040013672A1 (en) * | 2000-05-16 | 2004-01-22 | Thomas Jefferson University | Recombinant antibodies, and compositions and methods for making and using the same |
US20020115143A1 (en) * | 2000-08-24 | 2002-08-22 | Bernhard Dietzschold | Rhabdovirus-based vectors to express high levels of functional human antibodies |
AU2002332600B2 (en) * | 2001-08-21 | 2007-03-22 | Thomas Jefferson University | Recombinant antibodies, and compositions and methods for making and using the same |
US7084257B2 (en) | 2001-10-05 | 2006-08-01 | Amgen Inc. | Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity |
USRE47770E1 (en) | 2002-07-18 | 2019-12-17 | Merus N.V. | Recombinant production of mixtures of antibodies |
DK2314629T4 (da) | 2002-07-18 | 2023-02-06 | Merus Nv | Rekombinant produktion af blandinger af antistoffer |
AU2004242614B2 (en) | 2003-05-30 | 2011-09-22 | Merus N.V. | Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs |
US20100069614A1 (en) | 2008-06-27 | 2010-03-18 | Merus B.V. | Antibody producing non-human mammals |
ES2646560T3 (es) | 2004-01-20 | 2017-12-14 | Merus N.V. | Mezclas de proteínas de unión |
CN101133158B (zh) * | 2005-02-02 | 2012-12-05 | 马萨诸塞州大学 | 人抗狂犬病抗体及其用途 |
JP2008263964A (ja) * | 2007-03-29 | 2008-11-06 | Yamaguchi Univ | コウモリ由来細胞株 |
JP2010085126A (ja) * | 2008-09-29 | 2010-04-15 | Adtec Kk | 狂犬病ウイルス中和抗体価判定具および狂犬病ウイルス中和抗体価の測定方法 |
WO2012128508A2 (ko) * | 2011-03-18 | 2012-09-27 | (주)셀트리온 | 광견병 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자 |
CN114163530A (zh) | 2012-04-20 | 2022-03-11 | 美勒斯公司 | 用于产生免疫球蛋白样分子的方法和手段 |
WO2019227039A1 (en) * | 2018-05-24 | 2019-11-28 | Lankenau Institute For Medical Research | Compositions comprising antibodies to rabies virus and the uses thereof |
CN111166877A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-05-19 | 西安回天血液制品有限责任公司 | 一种狂犬病人免疫球蛋白的制备方法 |
CN114958774B (zh) * | 2022-05-08 | 2023-10-27 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 抗狂犬病病毒单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
IL89489A0 (en) | 1988-03-09 | 1989-09-10 | Hybritech Inc | Chimeric antibodies directed against human carcinoembryonic antigen |
WO1989009789A1 (en) | 1988-04-07 | 1989-10-19 | Farmitalia Carlo Erba S.R.L. | Human monoclonal antibodies against rabies virus |
WO1989009622A1 (en) | 1988-04-15 | 1989-10-19 | Protein Design Labs, Inc. | Il-2 receptor-specific chimeric antibodies |
WO1989009825A1 (en) | 1988-04-16 | 1989-10-19 | Celltech Limited | Method for producing recombinant dna proteins |
AU4025193A (en) | 1992-04-08 | 1993-11-18 | Cetus Oncology Corporation | Humanized C-erbB-2 specific antibodies |
-
2001
- 2001-05-04 AT AT01933020T patent/ATE411387T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-05-04 RU RU2002133470/13A patent/RU2272809C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-05-04 DE DE60136174T patent/DE60136174D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-04 IL IL152825A patent/IL152825A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-05-04 EP EP01933020A patent/EP1282703B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-04 WO PCT/US2001/014468 patent/WO2001088132A2/en active Search and Examination
- 2001-05-04 JP JP2001584514A patent/JP4819285B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-05-04 CA CA2419148A patent/CA2419148C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-05-04 US US09/848,832 patent/US6890532B2/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
CHEUNG et al., A recombinant human Fab expressed in Escherichia coli neutralizes rabies virus, Journal of virology, Nov.1992, стр.6714-6720. PATERSON et al., Variation in IgG1 heavy chain allotype does not con-tribute to differences in biological activity of two human anti-Rhesus (D) monoclonal antibodies, Immunotechnology, 1998, Jun, 4 (1): стр.37-47. http://ww../query.fcgi&cmd=Retrieve&db=Protein&list_uids=11275302&do pt=GenPep, Submitted 17.05.1999 Masataka Takekoshi. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2533802C1 (ru) * | 2013-08-30 | 2014-11-20 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Тримеризованное однодоменное антитело, специфически связывающееся с гликопротеином g вируса бешенства, нейтрализующее вирус бешенства |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2001088132A2 (en) | 2001-11-22 |
DE60136174D1 (de) | 2008-11-27 |
US20030165507A1 (en) | 2003-09-04 |
CA2419148A1 (en) | 2001-11-22 |
JP2004528803A (ja) | 2004-09-24 |
IL152825A0 (en) | 2003-06-24 |
CA2419148C (en) | 2011-07-12 |
EP1282703A2 (en) | 2003-02-12 |
WO2001088132A3 (en) | 2002-07-18 |
ATE411387T1 (de) | 2008-10-15 |
US6890532B2 (en) | 2005-05-10 |
IL152825A (en) | 2009-07-20 |
EP1282703B1 (en) | 2008-10-15 |
JP4819285B2 (ja) | 2011-11-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2272809C2 (ru) | Специфичные в отношении вируса бешенства нейтрализующие моноклональные антитела человека и нуклеиновые кислоты и связанные с ними способы | |
EP0690132B1 (en) | Anti-hiv monoclonal antibody | |
CA2091335A1 (en) | Antibodies for treatment and prevention of infection in animals and man | |
CN113354729B (zh) | 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用 | |
RU2292353C2 (ru) | Рекомбинантные антитела и композиции, а также способы их создания и использования | |
RU2764740C1 (ru) | Биспецифическое антитело против вируса бешенства и его применение | |
EP1597280A2 (en) | Monoclonal antibody production by ebv transformation of b cells | |
JPH08500979A (ja) | ヒトにおいて病原体による感染に対する受動免疫を付与するための新規の抗体 | |
CN107226861A (zh) | 人源抗h7n9禽流感病毒中和性抗体1f7l及其应用 | |
RU2613421C2 (ru) | Высокоаффинные антитела человека к белку gb цитомегаловирусу (cmv) человека | |
AU2002332600A1 (en) | Recombinant antibodies, and compositions and methods for making and using the same | |
CN113354730B (zh) | 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用 | |
Hamilton et al. | A humanized antibody against human cytomegalovirus (CMV) gpUL75 (gH) for prophylaxis or treatment of CMV infections | |
Cheung et al. | A recombinant human Fab expressed in Escherichia coli neutralizes rabies virus | |
WO1994028933A1 (en) | Bispecific human monoclonal antibodies specific for human immunodeficiency virus | |
US7071319B2 (en) | Recombinant antibodies, and compositions and methods for making and using the same | |
WO2016010160A1 (ja) | 抗インフルエンザウイルス抗体及びその利用 | |
JP4263951B2 (ja) | イヌ化抗体の作成方法および使用 | |
RU2793967C1 (ru) | Однодоменное антитело ламы Н5 и его производное H5-Fc, специфически связывающие RBD-домен S-белка вируса SARS-CoV-2, обладающие вируснейтрализующей активностью | |
RU2769223C1 (ru) | Средство и способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного антитела и гуманизированного моноклонального антитела | |
RU2765731C1 (ru) | Гуманизированное моноклональное антитело, специфически связывающиеся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, средство и способ для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 | |
US20020115143A1 (en) | Rhabdovirus-based vectors to express high levels of functional human antibodies | |
JPH06506947A (ja) | 抗ウィルスハイブリッド抗体 | |
JP2023106636A (ja) | ヒト抗破傷風毒素抗体 | |
CN116143910A (zh) | 靶向SARS-CoV-2刺突蛋白的纳米抗体及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190505 |