JP4263951B2 - イヌ化抗体の作成方法および使用 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規のイヌ化抗体製剤を開発するための組換えＤＮＡ技術およびモノクローナル抗体技術の組合せ、より詳細には、例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）を中和し、しかもイヌにおいて非免疫原性の免疫グロブリンの産生ならびそれらの生体内での使用に関係する。本発明はまた、より詳細には、イヌパルボウイルスに対するイヌ化モノクローナル抗体、これらの抗体をコードするポリヌクレオチド配列、これらの抗体を作製するための方法、これらの抗体の抗原結合部位を融合タンパク質として利用する方法、活性成分としてこれらの抗体を含む薬学的組成物に関係する。
【０００２】
【従来の技術】
【非特許文献１】
Kohlerら、Nature 256: 495-497(1976)
【非特許文献２】
Jonesら、Nature 321:522-525(1986)
【非特許文献３】
Reichmannら、Nature 332:323-327(1988)
【非特許文献４】
Verhoeyenら、Science 239:1534-1536(1988)
【非特許文献５】
Patalら、Immunogenetics 41:282-286(1995)
【非特許文献６】
Tangら、Veterinary Immunology & Immunopathology 80:259-270(2001)
【特許文献１】
特許第2811089号公報
【特許文献２】
特許第2811096号公報
【特許文献３】
特許第2837240号公報
【０００３】
イヌは以前からペットとして人間に飼育されていたが、近年では、従来の盲導犬などの社会的な役割のほか、精神的な伴侶としての価値が特に重視されている。その結果、イヌの社会的な地位が向上し、イヌの疾病とくに伝染病に関するより確実な知識が必要となり、その診断、治療、予防のための方法が求められている。
【０００４】
イヌの感染症は現在ではワクチンにより予防されるが、適切なワクチン接種がされなかった場合やペットショップ等でのストレスの問題から感染症に罹患することも多い。とくにウイルス感染症に対しては対処療法しかなく、場合によっては致死的である。
【０００５】
たとえば、ＣＰＶ感染症は、イヌに見られる激しい嘔吐、出血性下痢、および脱水、白血球減少を主徴とした急性の疾患である。本病は３〜１２週齢の幼犬に見られる心筋炎型と離乳後あらゆる年齢層に見られる腸炎型とに大別される。前者は、外見上健康な幼犬が突然虚脱し、呼吸困難を起こすなど経過が急で、死亡率が高く、治癒後も後遺症が残る。後者は激しい嘔吐・出血性下痢および顕著な脱水・白血球減少を主徴とし、死に至るものが多く、軽微な場合には不顕性のまま推移することもある。
【０００６】
ＣＰＶ感染には移行抗体が感染防御に有効であることや、抗体による治療が有効であることが実験的にも知られている。しかし、現実には治療方法として対処療法としての輸液の点滴注射やネコインターフェロン投与、二次感染防止のための抗生物質投与が一般的に行われているが、その効果は低い。
【０００７】
また、この他にもイヌには多くの感染症、ジステンパー 、パラインフルエンザ 、犬伝染性気管支炎、 コロナウイルス感染症 、アデノウイルス感染症などがあり、それらに対してもワクチンが存在するが、治療法は対処療法しかない。
【０００８】
ウイルス感染症は中和抗体による血清療法が有効であり、治療効果が期待される。しかし、イヌを用いた抗血清販売の事業化は動物愛護からも社会的に受け入れられるものではなく、現実性がない。
【０００９】
特定の抗原を標的とする抗体を作製するためには、通常、Kohler及びMilsteinの見いだした方法(非特許文献１-)が用いられる。すなわち、マウスを抗原で免疫し、免疫マウス由来の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させ、標的抗原に特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製する。現在、上記のイヌウイルスに対してはウイルスを抗原としてモノクローナル抗体が作製されている。そのようなモノクローナル抗体を治療に用いることができるが、モノクローナル抗体はマウス起源のものであり、したがってイヌにおいてはそれら自身が抗原性を持つ。そのようなモノクローナル抗体をイヌに繰り返し投与した場合には、イヌの免疫システムはマウスモノクローナル抗体に対する応答を開始し、それを無効にしてしまう。
【００１０】
抗体は、典型的には、ジスルフィド結合によって互いに連結する２本の重鎖と、各重鎖のＮ-末端に結合する軽鎖とを含む。各重鎖は、そのＮ-末端に可変領域ドメインを、それに続いて他端に定常領域ドメインを有する。また、各軽鎖もＮ-末端の可変領域ドメインとそれに続く定常領域ドメインを有する。軽鎖及び重鎖各対の可変領域ドメインは、抗原結合部位を形成する。軽鎖及び重鎖上の可変領域ドメインは同じ一般構造を有し、各ドメインは、配列が比較的保存されている４つの領域からなるフレームワークとこれに接続する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有している。４つのフレームワーク領域はβ-シート構造をとり、ＣＤＲはこのβ-シート構造体に接続するループを形成する。これらのＣＤＲはフレームワーク領域によって非常に接近した状態に保たれ、抗原結合部位の形成に寄与している。
【００１１】
マウスモノクローナル抗体のＣＤＲをヒトのフレームワークに移植し、該当するマウスモノクローナル抗体の結合能力を有し、かつ、ヒトに抗原性を示さないヒト化抗体を作製することが、Winter及び彼の共同研究者によって提唱されている(例えば、非特許文献２-、非特許文献３-及び非特許文献４-を参照のこと)。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
このように人間の医療分野では遺伝子工学的手法を用いてヒト化した抗体が実用化されている。一方、イヌの場合はイヌの軽鎖の定常領域の塩基配列(特許文献１、特許文献２)、イヌの重鎖の遺伝子(特許文献３、非特許文献５-、非特許文献６-)が報告されているが、それらからイヌ化抗体を作製する技術は完成されていない。
【００１３】
本発明は、イヌ化抗体を開発するための基本となる遺伝子断片およびＣＤＲ移植技術を提供する。本技術により作製されたイヌ化抗体を生産するための方法、抗原結合ドメインを融合タンパク質として利用する方法、活性成分としてこれらの抗体を含む薬学的組成物を提供することが本発明に含まれる。
【００１４】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号２に示すイヌ免疫グロブリンκ遺伝子可変領域ドメインを有するアミノ酸配列、配列番号４に示すイヌ免疫グロブリンλ遺伝子可変領域ドメインを有するアミノ酸配列、および配列番号６、８、１０、１２に示すイヌ免疫グロブリンγ鎖遺伝子可変領域ドメインを有するアミノ酸配列をもとにイヌパルボウイルスに対する中和モノクローナル抗体のＣＤＲを移植して作成される、配列番号１７、１９に示す可変領域を持つことを特徴とするイヌ化抗体遺伝子。
（２）（１）に記載されたイヌ化抗体遺伝子の可変ドメインを、イヌで抗原性を示さない他のタンパク質遺伝子と融合してなることを特徴とする融合タンパク質遺伝子。
（３）（２）に記載された融合タンパク質遺伝子のうち、特に特異性がイヌパルボウイルスに対するものであることを特徴とする融合タンパク質遺伝子。
（４）（１）ないし（３）のいずれか１項に記載された遺伝子を真核細胞で発現することを特徴とする発現ベクター。
（５）（１）ないし（３）のいずれか１項に記載された遺伝子を真核細胞で発現することを特徴とするウイルスベクター。
（６）（４）または（５）に記載されたベクターを真核細胞に導入してイヌ化抗体タンパク質を生産することを特徴とするイヌ化抗体タンパク質の製造方法。
（７）配列番号２に示すイヌ免疫グロブリンκ遺伝子可変領域ドメインを有するアミノ酸配列、配列番号４に示すイヌ免疫グロブリンλ遺伝子可変領域ドメインを有するアミノ酸配列、および配列番号６、８、１０、１２に示すイヌ免疫グロブリンγ鎖遺伝子可変領域ドメインを有するアミノ酸配列をもとにイヌパルボウイルスに対する中和モノクローナル抗体のＣＤＲを移植して作成される、配列番号１７、１９に示す可変領域を持つイヌ化抗体遺伝子によってコードされる、配列番号１８、２０に示すアミノ酸配列である可変領域を持つことを特徴とするイヌ化抗体タンパク質。
【００１５】
抗体遺伝子は、公知の技術を使用することによって本発明の開示に基づいて調製され得る。すなわち、イヌの脾臓等から抽出したｍＲＮＡをテンプレートとして使用し、配列番号１３および１４に示すプライマーを用いてイヌ免疫グロブリンの軽鎖の可変領域ドメインの塩基配列を単離した。そのようなＰＣＲ（polymerase Chain Reaction）増幅（5'race）については市販のキットが利用可能である。さらに、同様に、既知の情報（Tangら、前出）に基づき設計したプライマーを用いてイヌ免疫グロブリンの重鎖ｃＤＮＡ全体をクローニングした。一方、イヌパルボウイルスに対する中和モノクローナル抗体のｃＤＮＡを単離した。これらの抗体を使用して、イヌ化されたイヌパルボウイルスに対する中和モノクローナル抗体の免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子を構築し得る。また、この方法で任意のモノクローナル抗体をイヌ化しうる。
【００１６】
まず、モノクローナル抗体の可変領域の配列を突き止める必要がある。そのようなＤＮＡ配列決定のため、可変ドメイン配列は、一般的に周知の技術によって各々のｍＲＮＡから合成される重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡから決定することができる。その後、種々の方法（たとえば、Kabatら、U.S.Department of Health and Human Services (1983)、Chotiaら、Nature 342:877-883(1989)、Martinら、Proceedings of National Academy of Science in USA 86:9268-9272(1989)、MacCallumら、Journal of Molecular Biology 262:732-745(1996)）を参照して、超可変領域を決定することができる。また、一方で、ＣＤＲはＸ線結晶学又は分子モデリング技術を用いる構造解析により決定することができる。次いで、フレームワーク領域に由来する特定の選択残基と共に、ＣＤＲに対応する全てのアミノ酸残基を含む複合ＣＤＲを構築することができる。次に、得られた複合ＣＤＲを“抗原結合部位”として転移させることができる。マウス抗体のＣＤＲをヒト抗体に移植する方法については、たとえば、特許第２８２８３４０号公報、特開平１１-４６９４号公報、特開平１１-２４３９５５号公報などを参照できる。
【００１７】
このとき、設計されたアミノ酸配列を、遺伝子断片に付加、欠失または置換の技術は公知である。典型的な技法には、部位指向性変異誘発及びＰＣＲが含まれる。
【００１８】
抗体を「ヒト化」することは、以上に述べたほど効率の良いプロセスではない。たとえば、適合性のヒトのフレームワーク領域を、１０００を超えるヒトの重鎖および軽鎖のアミノ配列から、それぞれを選択しなければならない。このように作製された、マウス抗体と同じＣＤＲを有するヒト化抗体でも、しばしば、もとのマウス抗体と同じ効力を有さない。「ヒト化」抗体は、ＣＤＲ以外にいくらかマウスのアミノ酸残基を加えてマウス抗体に匹敵する立体構造を保証するフレームワークモチーフを有する必要がある。
【００１９】
このような状況の下、イヌ抗体の立体構造の情報やイヌの可変領域遺伝子の十分な情報もなく、我々はイヌ化抗体の作出に成功した。
【００２０】
もっとも、イヌ重鎖、軽鎖可変領域の遺伝子の情報が多いほどイヌ化が容易になる。したがって、我々は十分な可変領域遺伝子の情報を解析するために利用可能なプライマーおよびその方法をも提供する。
【００２１】
前記のように生成されるイヌ化抗体の可変領域の遺伝子は、相当する免疫グロブリン定常領域の遺伝子に連結し、イヌ化抗体遺伝子が完成する。イヌ化抗体遺伝子を用いて、例えば、昆虫細胞、ＣＨＯもしくはミエローマ細胞、酵母等で、それぞれに対応する発現用プラスミドもしくはベクターウイルスに結合し、リン酸カルシウム処理、リポフェクション又はエレクトロポレーション法等により細胞内に導入して、イヌ化抗体タンパク質を発現することができる。
【００２２】
なお、以上の操作は、Sambrookら（Sambrookら、Molecular Cloning.3rd Edition Cold Spring Harbor Press (2001)）等の既知の遺伝子操作技術・細胞工学技術にしたがって行うことができる。
【００２３】
発現した組換えイヌ化抗体タンパク質は、当該分野の標準的手順により精製され得る。この手順としては、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などが挙げられる（一般的には、参考として、本明細書において援用される、Scopesら、Protein Purification、Springer-Verlag、N.Y.(1982)を参照のこと）。イヌにおいて薬として使用するためには９５％以上の純度が望ましい。イヌ化抗体を含む薬学的組成物は、一般的に非経口経路（すなわち、皮下的に、筋肉内におよび静脈内に）で投与される。
【００２４】
ところで、定常ドメインは抗原に抗体を結合するのに直接は関係しないが、エフェクター機能を示す。その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは異なったクラスに分けられる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという免疫グロブリンの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかは、例えばヒトにおいてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４；ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のようなサブクラス（アイソタイプ）に更に分割される。
【００２５】
抗体タンパク質はこれらの機能ドメインが比較的独立しているため、たとえば抗原に対する結合能力は可変ドメイン断片（例えばF(ab')2）で保持される。そこで、他の用途に応じて、可変ドメイン断片を他のポリペプチドへの融合することが可能である。特に抗原性を持たないようにイヌ由来の機能性タンパク質に融合し、抗体としての特異性を持ち、抗体以外のエフェクター機能を持たせる改変は有効で安全な治療薬を開発する有効な方法である。融合させる技術についてはすでに1984年に特許第２８６５６４５号公報や特許第２７１４７８６号公報として出願され、その後も多くの改良がなされている。それらの具体的方法については、単行本（KontermannとDubel編集、Antibody Engineering、Springer Lab Manual）に詳しい。感染症への応用は、たとえば、特定の細胞に発現する受容体に結合し、その細胞を増殖させたり、活性化させたり、遊走させることであり、その作用により、たとえば感染部位の免疫担当細胞を有効利用して早期の感染防御を成立させたり、異物処理を促進させたり、炎症を制御する。
【００２６】
さらに、先に述べた発現ベクターのうち、真核細胞で発現するベクターはＤＮＡのまま、筋肉内に注射すると発現させることができる。このときに、塩基性リポソームなど、市販のキャリア物質を用いて発現や導入を安定化することができる。金コロイド粒子にＤＮＡを吸着させ、皮内の細胞に効率良くＤＮＡを導入する装置もまた市販されている。また、アデノウイルスやアデノ随伴ウイルスなどのゲノムにプロモータと一緒に挿入し、感染させることでも体内で発現させることができる。これらＤＮＡを導入する方法を用いてイヌ化抗体タンパク質、イヌ化された可変ドメインをもつ融合タンパク質を発現させ、治療する遺伝子治療技術については周知のことであり、タンパク質性薬剤と比べて取り扱いが簡便である。すでに確立しているこの方法については総説（日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、株式会社エヌ・ティー・エス）を参照できる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１ 抗ＣＰＶマウスモノクローナル抗体の作製
（１）ウイルス抗原の精製
ＣＰＶ、Ｃｐ４９株をＣＲＦＫ細胞に接種し増殖させ、その培養上清にＰＥＧ６０００と塩化ナトリウムを加えることによりウイルスを沈殿回収した。ＴＥ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再浮遊させ、塩化セシウムを用いた密度勾配遠心法にてウイルス抗原を精製した。
【００２８】
（２）免疫
Ｂａｌｂ／ｃマウス（１４週齢、メス）にウイルス抗原１００μｇを3週間隔で3回免疫した。1回目は抗原をフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ、ヤトロン社）と混ぜて、2回目以降はフロイント不完全アジュバントと混ぜて、皮下に接種した。3回目免疫後3週目に同抗原２０μｇを腹腔に接種し、3日後に脾臓を摘出した。
【００２９】
（３）ハイブリドーマの作製およびスクリーニング
免疫マウスから摘出した脾臓より脾細胞を回収し、脾細胞４×１０8とマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１細胞４×１０7とを、常法通り融合させることによりハイブリドーマを作製した。精製ウイルス抗原を用いたＥＬＩＳＡおよびウイルス感染ＣＲＦＫ細胞を用いた間接蛍光抗体法により抗ＣＰＶ抗体を産生しているハイブリドーマをスクリーニングし、限界希釈法にてハイブリドーマのクローニングを行った。
【００３０】
抗ＣＰＶ抗体を産生しているハイブリドーマ6クローンを得た。これらのクローンが産生する6種類の抗ＣＰＶ抗体をそれぞれ、ＣＰ１ａ、ＣＰ２ａ、ＣＰ３ａ、ＣＰ４ａ、ＣＰ５ａ、ＣＰ６ａと名付けた。アイソタイプおよびサブクラスはそれぞれ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１、ＩｇＡであった。
【００３１】
（４）モノクローナル抗体の選定
得られたハイブリドーマクローンを１０7細胞／マウスで腹腔に接種することにより抗体を腹水中に分泌生産し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（アマシャム・ファルマシア社）で添付のプロトコールに従い、腹水中の抗体を精製した。各モノクローナル抗体につきＣＰＶ-Ｃｐ４９株に対するウイルス中和活性および豚赤血球凝集抑制活性の有無を調べ、さらに、精製ウイルス抗原を用いたＥＬＩＳＡおよびラテックス凝集反応によりウイルス抗原との結合性を調べた。以上の試験結果の総合判定で、イヌ化抗体作製に供するモノクローナル抗体の選定を行った。その結果、サブクラスがＩｇＧ１であり、ＣＰＶ-Ｃｐ４９株に対する強い結合性を有すると考えられたＣＰ３ａを、以下で作製するイヌ化抗体の候補とした。
【００３２】
実施例２：ＣＰ３ａ抗体の可変領域のｃＤＮＡクローニング
ＣＰ３ａを生産するハイブリドーマからＩＳＯＧＥＮ（ＤＯＪＩＮＤＯ社製）を用いて、添付のプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した。
【００３３】
逆転写用プライマーは下記のようにデータベースより引用したマウスκおよびγ両鎖の定常領域の５'領域に設定した。
【００３４】
κ鎖逆転写用プライマー（配列番号２５）
Ｃκ１ :5'-CAGATGTTAACTGCTCACTG-3'
( Gene Bank Accession No. V00810:nucleotide No.472-453)
γ鎖逆転写用プライマー（配列番号２６）
ＣγＨ-２:5'-AGTTTGGGCAGCAGATCCA-3'
( Gene Bank Accession No. BC003435:nucleotide No.523-498)
【００３５】
２．５μｇのＲＮＡを鋳型として、１０μＭのＣκ１もしくはＣγＨ-２プライマーを１μｌ使用した。まず、ＤＥＰＣ処理した蒸留水で全量１５．５μｌにして７０℃で１０分間加熱した後、氷上で急冷した。次に１０ｍＭのｄＮＴＰを１μｌ、添付されていた緩衝液を２．５μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴを２．５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2を２．５μｌ、逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社） １μｌ（２００Ｕ）を加えてよく混合し、４２℃で５５分間、７０℃で１５分間反応させた。
【００３６】
次に、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製５'ＲＡＣＥ ＫＩＴを用いてプロトコールに従い、ｍＲＮＡの５'末端領域から可変領域全体をクローニングした。すなわち、逆転写したｃＤＮＡにオリゴｄＣを付加し、さらに、アダプターを付加し、それに相補的なプライマーをＰＣＲに用いた。
【００３７】
アダプタプライマー(配列番号２７)
：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGGG-3'
【００３８】
一方、増幅用に用いた３'側プライマーは逆転写用プライマーの上流領域に下記のように設定した。
【００３９】
κ鎖増幅用プライマー（配列番号２８）
Ｃκ２:5'-GATGGTGGGAAGATGGATAC-3'
( Gene Bank Accession No. V00810:nucleotide No.452-433)
γ鎖増幅用プライマー(配列番号２９)
ＣγＨ-１:5'-ACAGACAGATGGGGGTGTCG-3'
( Gene Bank Accession No. BC003435:nucleotide No.493-474)
【００４０】
このようにして得られたκ鎖、γ鎖の可変領域のＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（インビトロージェン社）を用い、添付のプロトコールに従い、ｐＧＥＭ-Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｒｒｐｍｅｇａ社）にライゲーションした。ライゲ-ション反応液を用いてコンピテント化した大腸菌ＸＬ１-Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）の形質転換反応を行い、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で作製したアガロースプレートで形質転換体の選択を行った。３７℃にて一晩培養し、プレートに生育したコロニーのうちプラスミドベクタ-に重鎖遺伝子ｃＤＮＡの挿入が確認された４個のコロニーのみ１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌで一晩培養した。ＱＩＡｐｒｅｐ（Ｒ） ｓｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて添付のプロトコール通り操作し、プラスミドＤＮＡを抽出・精製した。
【００４１】
得られたｃＤＮＡクロ-ンはＡＢＩ社製のＡＢＩ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔｓを用いたジデオキシシークエンス法により、添付のプロトコールにしたがって反応を行い、ＡＢＩ社製シークエンサ３７３Ａで解析して決定した。
【００４２】
塩基配列の解析の結果、得られたＣＰ３ａモノクローナル抗体γ鎖、κ鎖の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号２１、２２および２３、２４に示した。
【００４３】
実施例３：イヌ免疫グロブリンγ鎖遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
（１）ＲＮＡの調製
実験用ビーグル犬より脾臓を摘出して、ハサミで細かく切り、２０ｍｌのＧＴＣ溶液（４Ｍグアニジンチオシアネート、２５ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％ Ｎ-ラウロイル サルコシン酸、０．１Ｍ ２-メルカプトエタノール）中でさらに細かく切断し、組織片を溶解させた。１８ゲージの注射針で４回ストロークしてゲノムＤＮＡを切断した後、４ｍｌずつに分注し、-８０℃で凍結保存した。凍結チュ-ブのうち１本を解凍し、溶解液に２Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を４００μｌ、ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネイト）で処理した蒸留水で飽和したフェノールを４ｍｌ、クロロホルム／イソアミルアルコール（４９：１）を８００μｌ、それぞれ加える毎に軽く混和しながら順番に加えた。溶液を１０秒間激しく撹拌し、３０分間氷上に静置した後、４℃で３０００ｒｐｍ、３０分間遠心した。遠心分離後、上清を回収し、上清５００μｌに２-プロパノールを５００μｌ加えてよく混和し、-２０℃で２時間冷却した後、４℃で１４０００ｒｐｍ、３０分間遠心した。上清を捨て、沈殿を４００μｌの７０％エタノールで洗浄した後、乾燥して４０μｌのＤＥＰＣ処理した蒸留水に溶解した。抽出したＲＮＡを吸光度により定量した。
【００４４】
（２） ｃＤＮＡ合成
イヌ免疫グロブリンγ鎖遺伝子ｃＤＮＡをクローニングするため、既に報告されている塩基配列（Ｔａｎｇら、既出）を基にプライマ-としてＩＧ-Ｆ、ＩＧ-Ｒオリゴヌクレオチドを合成した。下記にそれぞれの塩基配列を示す。
【００４５】
ＩＧ-Ｆ(配列番号３０):5'-AGTGCTCAGGACACMACACA-3'
ＩＧ-Ｒ(配列番号３１):5'-TCATTTACCCGGAGAATGGG-3'
【００４６】
逆転写反応（ＲＴ）は実施例３（１）で調製したＲＮＡ ２μｇを鋳型として１０μＭのＩＧ-Ｒプライマーを１μｌ使用した。まず、ＤＥＰＣ処理した蒸留水で全量１５．５μｌにして７０℃で１０分間加熱した後、氷上で急冷した。次に１０ｍＭのｄＮＴＰを１μｌ、添付されていた緩衝液を２．５μｌ、０．１ＭＤＴＴを２．５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2を２．５μｌ、逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社） １μｌ（２００Ｕ）を加えてよく混合し、４２℃で５５分間、７０℃で１５分間反応させた。
【００４７】
（３） ＰＣＲによるイヌ免疫グロブリンγ鎖ｃＤＮＡの増幅
ＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅は、逆転写反応液１μｌを鋳型としてＩＧ-ＦプライマーおよびＩＧ-Ｒプライマーを最終濃度各０．４μＭで使用した。ＴＡＫＡＲＡ社製のＬＡ-Ｔａｑポリメラーゼ（２．５Ｕ）を用いて９８℃１５秒、５５℃３０秒、７４℃２分を１サイクルとして３０サイクルのＰＣＲを行い、イヌ免疫グロブリンγ鎖ｃＤＮＡを増幅した。反応終了後、エタノ-ル沈殿を行い、ペレットを１０μｌの滅菌蒸留水に溶解した後、１％アガロースゲルで電気泳動を行い、臭化エチジウムにて染色後、紫外線照射下で約１４５０ｂｐのバンドを確認した。
【００４８】
（４） ＰＣＲ産物のクローニング
イヌ免疫グロブリンγ鎖ｃＤＮＡのバンド部分をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１、Ｉｎｃ．）を用いて添付のプロトコールに従ってアガロ-スゲルより切り出した。切り出したＤＮＡ断片をＴＡＫＡＲＡ社製のｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２を用い、１５℃で一晩反応させることによりＰｒｏｍｅｇａ社製のｐＧＥＭ-Ｔ Ｅａｓｙ ベクター１μｌ（５０ｎｇ）にライゲーションした。ライゲ-ション反応液を用いてコンピテント化した大腸菌ＸＬ１-Ｂｌｕｅの形質転換反応を行い、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で作製したアガロースプレートで形質転換体の選択を行った。３７℃にて一晩培養し、プレートに生育したコロニーのうちプラスミドベクタ-にイヌ免疫グロブリンγ鎖ｃＤＮＡの挿入を確認した。確認されたうち４個のコロニーのみ１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌで一晩培養した。ＱＩＡｐｒｅｐ（Ｒ） ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて添付のプロトコール通り操作し、プラスミドＤＮＡを抽出・精製した。
【００４９】
（５） 塩基配列の決定
得られたイヌ免疫グロブリンγ鎖ｃＤＮＡクロ-ンはＡＢＩ社製のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（Ｒ） ＢｉｇＤｙｅTM Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔｓを用いたジデオキシシークエンス法によりシークエンサー（ＡＢＩ社：Ａ３１０）を用いて挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
【００５０】
クロ-ニングした４個のイヌ抗体γ鎖ｃＤＮＡ、２、Ｃ、ＥおよびＦの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号５から１２に示す。
【００５１】
得られたアミノ酸配列のデータを、既に報告されているイヌ抗体γ鎖遺伝子のアミノ酸配列（Ｔａｎｇら、既出）と定常ドメインのみ比較したところ、約９８％の相同性が認められた。また、ヒト、マウスのγ鎖と相同性を比較したところ、６０〜７０％の相同性が示された。今回得られた４種類のイヌγ鎖のアミノ酸配列を既報のイヌγ鎖Ａ〜Ｄ、ヒトγ鎖、マウスγ鎖と比較し、相同性の値を表１にまとめ、それらのアミノ配列を並記した図を図１に示した。
【００５２】
【表１】
【００５３】
実施例４：イヌ免疫グロブリン軽鎖 (κ鎖およびλ鎖) 遺伝子の可変領域ｃＤＮＡのクローニング
イヌ抗体軽鎖遺伝子定常ドメインの５'上流側に隣接する可変ドメインｃＤＮＡをクローニングするため、既に報告されているイヌ抗体軽鎖(κ鎖およびλ鎖)遺伝子の定常ドメインの塩基配列(特許第２８１１０８９号公報、特許第２８１１０９６号公報)を基にκ鎖合成用プライマーとして配列番号９の、またλ鎖合成用プライマーとして配列番号１１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、５'ＲＡＣＥ法を行った。
【００５４】
すなわち、ＲＮＡを鋳型とし、ＣａＩｇｋ-Ｒ２プライマー（κ鎖）またはＣａＩｇＬ-Ｒ２プライマー（λ鎖）を使用して、実施例３（２）と同様に逆転写反応を行った。次に、５'ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ （ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）を使用して、添付のプロトコールに従いｃＤＮＡの分画、ｃＤＮＡへのｄＣ ｔａｉｌの付加およびＰＣＲによる増幅を行った。なお、ＰＣＲはＣａＩｇＫ-Ｒ２プライマー（κ鎖）またはＣａＩｇＬ-Ｒ２プライマー（λ鎖）およびキットに付属のＡｂｒｉｄｇｅｄ Ａｎｃｈｏｒ プライマ-を使用して、実施例３（３）と同様の条件で行った。その後、ＰＣＲで増幅したｃＤＮＡ断片を実施例３（４）と同様にクロ-ニングし、得られたクロ-ンは実施例３（５）と同様の方法で塩基配列を決定した。クロ-ニングしたイヌ免疫グロブリンκ鎖、λ鎖遺伝子可変領域ｃＤＮＡの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号１、２、３、４に示した。
【００５５】
得られた塩基配列のデータを、ヒト、マウスのγ鎖と相同性を比較したところ、６０〜８０％の相同性が示された。今回得られたイヌκ、λ鎖のアミノ酸配列を既報のヒト、マウスのκ鎖、γ鎖と比較し、相同性の値を表２にまとめ、それらのアミノ配列を並記した図を図２，３に示した。
【００５６】
【表２】
【００５７】
実施例５：ＣＤＲ移植によるイヌ化抗体重鎖ｃＤＮＡの合成
（１） ＰＣＲ法によるイヌ化抗体重鎖可変領域ｃＤＮＡの合成
実施例２で得られたマウスのＣＰ３ａ可変領域のｃＤＮＡ塩基配列、および実施例３で得られたイヌ免疫グロブリンγ鎖遺伝子の可変領域ｃＤＮＡの塩基配列よりＣｏｎｔａｃｔ法(ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６２，７３２-７４５，１９９６)に従ってＣＤＲを推定した。推定に基いて、ＣＰ３ａのＣＤＲをイヌ抗体のＣＤＲと交換した抗ＣＰＶイヌ化抗体重鎖遺伝子の可変領域ｃＤＮＡを設計した。イヌ化抗体重鎖遺伝子の可変ドメインｃＤＮＡをＰＣＲで合成するため、各断片がお互いに４０ｂｐ重複するような4つのオリゴＤＮＡ断片（Ｈｅａｖｙ１〜４）を作製した。下記にその塩基配列を示す。また、重鎖の可変ドメイン全体を増幅し、定常ドメインと連結させる、またはトランスファーベクターに組み込むことを考慮して特定の制限酵素サイトを付加したプライマー、Ｈ-ＶＦおよびＨ-ＶＲオリゴヌクレオチドを設計した。Ｈ-ＶＦおよびＨ-ＶＲの塩基配列を配列番号１５、１６に示す。
【００５８】
Ｈｅａｖｙ１(配列番号３２):
5'-CGGGATCCCGATGGAGTCTGTGCTCTGCTGGGTTTTCCTTGTCTCTATTTTAAAAGGTGTCCAGGGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACCTGGTGAAGCCTGGGGGGTCCTTGAGACTGTCCTGTGTGGCCTCT-3'
Ｈｅａｖｙ２（配列番号３３）:
5'-GTTAGTTCGACCGTCGGTAGGAAAAATCTCTCCAATCCACTGCAGCCCCTTCCCTGGAGACTGACGGACCCAGTGCATCCAGTAGCCGGTGAAGGTGAATCCAGAGGCCACACAGGACAGTCTCAAGGACCCCCCAGGCTTC-3'
Ｈｅａｖｙ３（配列番号３４）:
5'-GTGGATTGGAGAGATTTTTCCTACCGACGGTCGAACTAACTACGCAGACGCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTT-3'
Ｈｅａｖｙ４（配列番号３５）:
5'-AACCGAGGGGGCCGTGGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCCAGTAAGCAAACCCCTCCCCACCATACTTTTTTCTTGTACAGTAATAAACAGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGGCTGTTCATCTGCAGA-3'
【００５９】
ＤＮＡの合成過程を図４に模式的に図示するとともに、各ＰＣＲ産物のアガロース電気泳動パターンを示した。初めに上記のＨｅａｖｙ１とＨｅａｖｙ２とを混合（各１００μＭ、反応液Ａとする）またはＨｅａｖｙ３とＨｅａｖｙ４とを混合(各１００μM、反応液Ｂとする)し、ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ-Ｔａｑポリメラーゼ（２．５Ｕ）を使用して全量５０μｌにて、９４℃４５秒、５５℃１分、７２℃２分を１サイクルとしたＰＣＲを２５サイクル行った。反応終了後Ａ、Ｂ各反応液に等量のクロロホルム・イソアミルアルコール（２４：１）を加えて撹拌した後、室温で１００００ｒｐｍ、５分間遠心して上清を回収した。次にＡ、Ｂ各反応液の上清を５μｌづつ混合し、同様のＰＣＲ反応を行った。反応終了後、上記と同様に回収した上清１μｌおよびプライマーＨ-ＶＦとＨ-ＶＲを用い (最終濃度各１μＭ)、ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ-Ｔａｑポリメラーゼ（２．５Ｕ）を使用して全量５０μｌで全長を合成するためのＰＣＲを９８℃１５秒、５５℃３０秒、７４℃２分を１サイクルとして２５サイクル行った。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで電気泳動し、約４５０ｂｐのバンドを確認した。
【００６０】
（２） イヌ化抗体重鎖遺伝子、定常ドメインｃＤＮＡのクローニング
実施例３（５）で得られた塩基配列を元にイヌ抗体重鎖遺伝子の定常領域ｃＤＮＡを増幅し、可変領域ｃＤＮＡに連結させる、またはトランスファーベクターに組み込むことを考慮して特定の制限酵素サイトを付加した下記のプライマーＨ-ＣＦ、Ｈ-ＣＲオリゴヌクレオチドを合成した。
【００６１】
Ｈ-ＣＦ（配列番号３６）
:5'-GGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCACGGCCCCCTCGGTT-3'
Ｈ-ＣＲ（配列番号３７）
:5'-GCGGATCCTCATTTACCCGGAGAATGGG-3'
【００６２】
実施例３（４）で得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ-Ｔａｑポリメラーゼ（２．５Ｕ）とプライマーＨＣ-ＦおよびＨ-ＣＲ（最終濃度各０．４μＭ）を使用して全量５０μｌにて９４℃４５秒、５５℃１分、７２℃２分を１サイクルとしたＰＣＲを２５サイクル行った。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで電気泳動し、約１０００ｂｐのバンドを確認した。
【００６３】
（３） イヌ化抗体γ鎖遺伝子の全長ｃＤＮＡの作製
実施例４（１）で得られたイヌ化抗体重鎖遺伝子の可変領域ｃＤＮＡと実施例４（２）で得られた定常領域ｃＤＮＡを混合し、ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ-Ｔａｑポリメラーゼ（２．５Ｕ）を使用して、９４℃４５秒、５５℃１分、７２℃２分を１サイクルとしたＰＣＲを２５サイクル行った。ＰＣＲの反応液を１００倍に希釈して鋳型とし、プライマーＨ-ＶＦおよびＨ-ＣＲ(最終濃度各０．４μＭ)を用いて、同じ反応条件でイヌ化抗体重鎖遺伝子ｃＤＮＡの全長を合成するためのＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで電気泳動し、約１４５０ｂｐのバンドを確認した。増幅したＤＮＡ断片はＰｒｏｍｅｇａ社製のＴ４リガーゼを使用し、ｐＧＥＭ-Ｔ Ｅａｓｙ ベクターに実施例３（４）と同様にクロ-ニングした。得られたクロ-ンは実施例３（５）と同様の方法で塩基配列を決定した。なお、クロ-ニングしたイヌ化抗体重鎖遺伝子ｃＤＮＡに１塩基の変異が認められた(２６２番目の塩基がＡからＧに置換していた)ため、次項に示す方法で修復した。
【００６４】
（４） イヌ化γ鎖ｃＤＮＡ遺伝子の塩基置換の修復
変異が認められた箇所を修復するため下記のプライマーを設計し、ＰＣＲを行った。
【００６５】
Ｈ-１３-ＸｈｏＩ（配列番号３８）:5'-CGATTCACCATCTCGAGAGACAACG-3'
Ｈ-１４-ＸｈｏＩ（配列番号３９）:5'-CGTTGTCTCTCGAGATGGTGAATCG-3'
【００６６】
プライマーＨ-１３-ＸｈｏＩおよびベクタ-に相補的なＳＰ６プライマ-(最終濃度各０．３μＭ)を用いてｃＤＮＡの前半部分を、また、プライマーＨ-１４-ＸｈｏＩおよびベクタ-に相補的なＴ７プライマー(最終濃度各０．３μＭ)を用いてｃＤＮＡの後半部分を増幅した。実施例５（３）で得られたプラスミドクローンを鋳型とし、ＴＯＹＯＢＯ社製の ＫＯＤ-ＰＬＵＳ（１Ｕ）を使用したＰＣＲを９４℃１５秒、５８℃３０秒、６８℃５０秒を１サイクルとして３０サイクル行った。前半部分、後半部分の各ＰＣＲ産物をエタノール沈殿後、スピンカラム（Ｃｅｎｔｒｉ-Ｓｅｐ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で精製し、前半部分のＰＣＲ産物は制限酵素ＸｈｏＩ、ＳｐｈI（Ｒｏｃｈｅ社）で、また、後半部分のＰＣＲ産物は制限酵素ＸｈｏＩ（Ｒｏｃｈｅ社）、ＳａｃＩ（ＴＡＫＡＲＡ社）で消化した。制限酵素処理した各ＰＣＲ産物は実施例３（４）と同様にして、あらかじめＳｐｈI、ＳａｃＩで消化しておいたｐＧＥＭ-Ｔ Ｅａｓｙベクターにライゲーションし、クロ-ニングした。ただし、コンピテント化した大腸菌はＪＭ１０９（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いた。また、得られたプラスミドクロ-ンを実施例３（５）と同様の方法で塩基配列の確認をしたところ、目的の塩基配列を有するイヌ化重鎖遺伝子ｃＤＮＡの全長がクロ-ニングされていた。イヌ化重鎖遺伝子、可変ドメインｃＤＮＡの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号１７、１８に示す。以上の構築過程を模式的に図６に示した。以降、このイヌ化重鎖遺伝子ｃＤＮＡの全長がクロ-ニングされたプラスミドをｐＣＩｇγと呼ぶ。
【００６７】
実施例６ ＣＤＲ移植によるイヌ化抗体κ鎖ｃＤＮＡの合成
（１） イヌ化抗体κ鎖可変領域ｃＤＮＡの合成
実施例４で得られたイヌ抗体κ鎖遺伝子の可変領域ｃＤＮＡ塩基配列より、実施例５（１）と同様にマウスのＣＰ３ａ遺伝子のκ鎖可変ドメインのＣＤＲをイヌ抗体κ鎖のＣＤＲと交換した抗ＣＰＶイヌ化抗体κ鎖遺伝子の可変領域ｃＤＮＡを設計し、下記のオリゴヌクレオチド断片（Ｋａｐｐａ１〜４）およびプライマーｋ-ＶＦおよびｋ-ＶＲオリゴヌクレオチドを使用してイヌ化抗体κ鎖可変領域ｃＤＮＡを合成した。合成の過程を模式的に図５に示した。１％アガロースゲル電気泳動により、最終ＰＣＲ産物に約４２０ｂｐのバンドを確認した。
【００６８】
Kappa1（配列番号４０）:
5'-GGAAGATCTTCATGAGGTTCCCTTCTCAGCTCCTGGGGCTGCTGATGCTCTGGATCCCAGGATCCAGTGGGGATATGTGCATGACACAGACCCCACTGTCCCTGTCCGTCAGCCCTGGAGAGACTGCCTCCATCT-3'
Kappa2（配列番号４１）:
5'-ATTTTTGCATTATAGACCAGGAGCTGTGGAGACTGGCCTGGCTTCTGTCGATACCATAGTAAATAACTGTAGAGGCTCTGACTGGCCTTGCAGGAGATGGAGGCAGTCTCTCCAGGGCTGACGGACAGGGACAG-3'
Kappa3（配列番号４２）:
5'-CAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAATCTTAGCAACTGGCGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGCGGGTCAGGGACAGATTTCACCCTGAGAATCAGCACAGTGGAGGCTGACGATACTGGA-3'
Kappa4（配列番号４３）:
5'-GCCAGCTGGCTGGGCATCATTCCGTTTGAGCTCCACCTTGGTTCCTGCTCCGAACGTGTACGGAGTAGCATAATGATGTTGGCAGTAATAAACTCCAGTATCGTCAGCCTCCACTGTGCTGATTCTCAGGGTG-3'
【００６９】
Ｋ-ＶＦ（配列番号４４）:5'-GGAAGATCTTCATGAGGTTCCCTTCTCAGCT-3'
Ｋ-ＶＲ（配列番号４５）:5'-GACAGCTGGCTGGGCATCAT-3'
【００７０】
（２） ＰＣＲ産物のクローニング
Ｐｒｏｍｅｇａ社製のＴ４リガーゼを使用し、ｐＧＥＭ-Ｔ Ｅａｓｙベクターに実施例６（１）で得られたＤＮＡ断片をそれぞれ実施例３（４）と同様にクロ-ニングした。得られたクロ-ンは実施例３（５）と同様の方法で塩基配列を決定し、実施例６（１）で設計した配列と同一であることを確認した。
【００７１】
（３） イヌ抗体κ鎖遺伝子の定常領域ｃＤＮＡのクローニング
イヌ免疫グロブリンκ鎖遺伝子、定常ドメインｃＤＮＡをクローニングするため既に報告されているイヌ免疫グロブリンκ鎖遺伝子の定常領域の塩基配列(特許２８１１０８９)を基にプライマ-ＣａＩｇｋ-Ｆ、ＣａＩｇｋ-Ｒオリゴヌクレオチドを合成した。下記にその配列を示す。
【００７２】
ＣａＩｇｋ-Ｆ（配列番号４６）:5'-AATGATGCCCAGCCAGCCGT-3'
ＣａＩｇｋ-Ｒ（配列番号４７）:5'-TTAGTCCACTCTCTGACACT-3'
【００７３】
まず、実施例３（１）で調製したＲＮＡの２μｇ分を鋳型とし、実施例４と同様にプライマーＣａＩｇｋ-Ｆ、ＣａＩｇｋ-Ｒを用いて、イヌ免疫グロブリンκ鎖遺伝子の定常領域ｃＤＮＡをクロ-ニングした。クロ-ニングした定常領域ｃＤＮＡを再び増幅し、可変領域ｃＤＮＡに連結させる、またはトランスファーベクターに組み込むことを考慮して特定の制限酵素サイトを付加した下記のプライマーＦｕＫＣ-Ｆ、Ｋ-ＣＲオリゴヌクレオチドを合成した。
【００７４】
ＦｕＫＣ-Ｆ（配列番号４８）:5'-AACCAAGGTGGAGCTCAAACGGAATGATGCCCAGCCAGCCGTC-3'
Ｋ-ＣＲ（配列番号４９）:5'-GGAAGATCTTTAGTCCACTCTCTGACACT-3'
【００７５】
次に、得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、ＬＡ-Ｔａｑポリメラーゼ（２．５Ｕ）と最終濃度各０．４μＭのプライマーＦｕＫＣ-ＦおよびＫ-ＣＲを使用して全量５０μｌにて９４℃３０秒、５８℃１分、７２℃２分を１サイクルとしたＰＣＲを２５サイクル行った。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで電気泳動し、約４００ｂｐのバンドを確認した。得られたＤＮＡ断片を実施例３（４）と同様にクロ-ニングし、得られたクロ-ンは実施例３（５）と同様の方法で塩基配列を決定し、目的の塩基配列を有することを確認した。
【００７６】
（４） イヌ化抗体κ鎖遺伝子の全長ｃＤＮＡの構築
実施例６（２）で得られたイヌ化抗体κ鎖可変領域ｃＤＮＡをクロ-ニングしたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ(Ｒｏｃｈｅ社)、ＳａｃＩ(ＴＡＫＡＲＡ社)で消化し、実施例６（３）で得られたイヌ免疫グロブリンκ鎖定常領域ｃＤＮＡをクロ-ニングしたプラスミドを制限酵素ＰｓｔＩ、ＳａｃＩで消化した。各ＤＮＡ断片は実施例３（４）と同様に、あらかじめＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩで消化したｐＧＥＭ-３Ｚｆ（＋）ベクター(ＡＢＩ社)とライゲーションし、クロ-ニングした。また、得られたプラスミドを実施例３（５）と同様の方法で塩基配列の確認をしたところ、目的の塩基配列を有するイヌ化κ鎖遺伝子ｃＤＮＡの全長がクロ-ニングされていた。イヌ化抗体κ鎖遺伝子ｃＤＮＡ全体の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号１９、２０に示す。また、構築過程を模式的に図６に示した。以降このプラスミドをｐＣＩｇκと呼ぶ。
【００７７】
実施例７： 抗イヌ免疫グロブリンウサギ抗血清の作製
（１） イヌ免疫グロブリンの精製
イヌの血清よりＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ ＦＦ １ｍｌカラム（Ａｍａｓｈａｍ社）を使用してイヌ免疫グロブリンを精製した。すなわち、イヌより採取した血清２ｍｌに等量の２×Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））を加えて撹拌した後、グラスフィルタ-（東洋濾紙社）にてろ過した。前処理した血清４ｍｌを５ｍｌの１×Ｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））で平衡化したカラムに通し、イヌ免疫グロブリンをカラムに結合させた。１０ｍｌの１×Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒでカラムを洗浄した後、２ｍｌのＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０））でイヌ免疫グロブリンを溶出した。溶出液に６００μｌの１Ｍ トリス-塩酸（ｐＨ９．０）を加えて中和し、免疫用抗原とした。
【００７８】
（２）免疫
免疫用抗原０．４ｍｌに等量のＦＣＡ（ヤトロン社）を混合し、２週間間隔で２羽のウサギに合計５回免疫した。５回目の免疫後、さらに２週間後にウサギより血液を採取し、血清を分離して抗イヌ免疫グロブリンウサギ抗血清を得た。
【００７９】
（３）ウエスタンブロッティング法による抗血清の検査
抗原に対する反応性はウエスタンブロッティング法により確認した。すなわち、免疫用抗原をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離後、ＰＶＤＦ膜(ミリポア社)へと転写し、その後、５％スキムミルクを含むＰＢＳで室温にて１時間ブロッキングを行った。上記で得られた抗イヌ免疫グロブリンウサギ抗血清は５％スキムミルクを含むＰＢＳで希釈し、ブロッキング処理した膜と室温で１時間反応させた後、ＰＢＳで１５分間の洗浄を２回行った。洗浄後、膜は５％スキムミルクを含むＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体(ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ)と室温で１時間反応させ、ＰＢＳで５分間の洗浄を３回行った。膜上のバンドの検出は３，３'-ジアミノベンジジン四塩酸塩１０ｍｇ（Ｓｉｇｍａ社製）を２０ｍｌのＰＢＳに溶解して３０％過酸化水素水を３２μｌを加えた溶液に浸して行った。イヌ免疫グロブリンの重鎖と軽鎖に相当する２本のバンドが確認された。
【００８０】
実施例８：組換えバキュロウイルスの作製
（１）バキュロウイルストランスファーベクターの構築
バキュロウイルストランスファーベクターとしてはｐＡｃＵＷ５１(ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社)を用いた。このベクターには２つのプロモーター領域（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎおよびＰ１０）があり、それぞれのプロモ-タ-の下流に接続された遺伝子を同時に発現させる。なお、ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎプロモーターの下流にはイヌ化抗体γ鎖ｃＤＮＡを、Ｐ１０プロモーターの下流にはイヌ化抗体κ鎖ｃＤＮＡを組み込んだ。
【００８１】
実施例６（４）で得られたｐＣＩｇγを制限酵素ＢａｍＨＩ(Ｒｏｃｈｅ社)で消化し、アガロース電気泳動後、切り出されたγ鎖ｃＤＮＡ部分を実施例４（４）と同様にしてアガロ-スゲルより回収し、あらかじめ制限酵素ＢａｍＨＩで消化したｐＡｃＵＷ５１とライゲ-ションし、クロ-ニングした。ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎプロモーターに対してｃＤＮＡが順方向に挿入されたクローンを選択し、プラスミドＤＮＡの抽出・精製を行った。得られたプラスミドは制限酵素ＢｇｌＩＩ(Ｒｏｃｈｅ社)で消化した後、実施例７（４）で得られたｐＣＩｇκをＢｇｌＩＩで消化して切り出されるイヌ化抗体κ鎖ｃＤＮＡ部分を上記と同様にして組み込んだ。Ｐ１０プロモーターに対してイヌ化抗体κ鎖ｃＤＮＡが順方向に挿入された３個のクローンを選択した。以上の構築過程を模式的に図７に示した。以降、このイヌ化抗体遺伝子のγ鎖、κ鎖両ｃＤＮＡを組み込んだトランスファーベクターをｐＣＩｇ-ＣＰＶ(クロ-ン１〜３)と呼ぶ。
【００８２】
（２） トランスフェクション
バキュロウイルスの宿主細胞としては昆虫細胞であるＳｆ２１ＡＥ細胞を用いた。Ｓｆ２１ＡＥ細胞は１０％牛胎児血清(ＦＢＳ)、０．２６％ ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｓｅ ｂｒｏｔｈ（ＤＩＦＣＯ社製）、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＧｒａｃｅ'ｓ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）で培養した。トランスファーベクターｐＣＩｇ-ＣＰＶと制限酵素により切断したバキュロウイルスゲノムＤＮＡとを宿主細胞であるＳｆ２１ＡＥ細胞へ同時にトランスフェクションすると、組換えが起こってｐＣＩｇ-ＣＰＶが組み込まれた遺伝子をもつ組換えバキュロウイルスが得られる。ゲノムが切断されたままのウイルスは増殖することができないため、この方法では相同組換えによりゲノムがつながった組換えウイルスが選択的に増殖する。
【００８３】
制限酵素Ｂｓｕ３６Ｉで切断したバキュロウイルスゲノムＤＮＡ、ＢａｃＰＡＫ６（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を２０ｎｇと実施例８（１）で得られた３クローンのｐＣＩｇ-ＣＰＶ各１μｇとを混合し、滅菌蒸留水で総量を８μｌとした。このＤＮＡ溶液と２倍希釈したリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）８μｌを混合し、１５分間室温にて静置した。あらかじめ１×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように６穴プレートに播種しておいたＳｆ２１ＡＥ細胞を無血清Ｇｒａｃｅ'ｓ培地で洗浄し、同じ培地を１ｍｌ加えた後、前記のＤＮＡ-リポフェクチン溶液を添加した。２７℃で一晩培養した後、１ｍｌの血清入り培地を加え、さらに２７℃で培養を続けた。
【００８４】
(３) プラッククローニング
培養上清に出現したウイルスより組換えウイルスをプラック法によりクローニングした。トランスフェクションから３日後、培養上清を培地で１０2、１０3、１０4倍希釈し、１×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように６穴プレートに播種しておいたＳｆ２１ＡＥ細胞にこのウイルス希釈液２００μｌを加えて１時間感染させた。ウイルス希釈液を除き、４５℃で保温しておいた１％のＳｅａ ｐｌａｑｕｅアガロース(ＦＭＣ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社)を含む培地を加えた後、３０分室温で静置して固めた。その上から培地を１ｍｌ加え、２７℃で３日間培養し、プラックが形成されていることを確認した後、０．０１％のニュートラルレッドを含むＰＢＳを滴下した。一晩２７℃で培養し、細胞の死滅により色の抜けているプラックを確認して印を付けた。印を付けたプラックをパスツールピペットで抜き取り、５００μｌの培地に懸濁し、さらに超音波処理をしてアガロースを破壊した。遠心でアガロースを沈殿させ、上清を１０2、１０3、１０4倍希釈して次のプラッククローニングに用いた。同じ行程をさらに２回繰り返し、計３回のプラッククローニングを行って各クローンにつき３つの組換えバキュロウイルスを得た。
【００８５】
(４) イヌ化抗体タンパク質の昆虫細胞での発現
組換えバキュロウイルス感染培養上清を用いて、組換えウイルスをＳｆ２１ＡＥ細胞に感染させ、３日後に感染細胞と培養上清を回収した。回収した感染細胞はＰＢＳで洗浄した後−３０℃に保存した。
【００８６】
感染細胞および培養上清中の発現タンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより解析したところ、組換えバキュロウイルス感染細胞の方にはイヌ化抗体γ鎖およびκ鎖遺伝子のアミノ酸配列から予想される分子量である約５２ｋＤと約３２ｋＤの位置にバンドが検出された。結果を図８に示した。また、感染細胞および培養上清中の発現タンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分離後、実施例６（３）と同様にして抗イヌ免疫グロブリンウサギ抗血清を用いたウェスタンブロッティング法で解析したところ、上記と同じ位置に２本の特異的なバンドが検出された。結果を図９に示した。これにより、イヌ化抗体γ鎖およびκ鎖が昆虫細胞内でタンパク質として発現したことが示された。
【００８７】
【発明の効果】
本発明は、抗体をイヌ化するための遺伝子素材およびアミノ酸配列情報を得るための方法を提供し、それらを組み合わせることにより、イヌに投与した場合に低抗原性である抗体応用医薬品を開発するための技術を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】イヌγ鎖クローン２のアミノ酸配列とイヌγ鎖Ａ、Ｂ、ヒトγ１〜４鎖、マウスγ鎖と整列させた。*はイヌγ鎖クローン２と同じアミノ酸であることを示す。
【図２】イヌκ鎖クローンのアミノ酸配列とヒト、マウス、ネコのκ鎖と整列させた。*はイヌκ鎖クローン２と同じアミノ酸であることを示す。
【図３】イヌλ鎖クローンのアミノ酸配列とヒト、マウス、ミンクのλ鎖と整列させた。*はイヌλ鎖クローン２と同じアミノ酸であることを示す。
【図４】イヌ化抗体重鎖可変領域のｃＤＮＡの合成過程を模式的に示した。また、ＰＣＲ産物1〜４をアガロース電気泳動した泳動パターンを示した。
【図５】イヌ化抗体κ鎖可変領域のｃＤＮＡの合成過程を模式的に示した。また、ＰＣＲ産物４をアガロース電気泳動した泳動パターンを示した。
【図６】イヌ化抗体γ鎖およびκ鎖ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＣＩｇκおよびｐＣＩｇγの構築過程を模式的に示した。
【図７】イヌ化抗体γ鎖およびκ鎖ｃＤＮＡを有するバキュロウイルストランスファープラスミドｐＣＩｇ-ＣＰＶの構築過程を模式的に示した。
【図８】組換えバキュロウイルスをＳｆ２１ＡＥ細胞に感染させ、その培養上清および細胞分画をＳＤＳ-ＰＡＧＥで解析した結果を示した。矢印は発現タンパク質を示している。
【図９】図８の電気泳動を抗イヌ免疫グロブリン抗血清を用いてウエスタンブロッティングにより解析した結果を示した。矢印は発現タンパク質を示している。
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規のイヌ化抗体製剤を開発するための組換えＤＮＡ技術およびモノクローナル抗体技術の組合せ、より詳細には、例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）を中和し、しかもイヌにおいて非免疫原性の免疫グロブリンの産生ならびそれらの生体内での使用に関係する。本発明はまた、より詳細には、イヌパルボウイルスに対するイヌ化モノクローナル抗体、これらの抗体をコードするポリヌクレオチド配列、これらの抗体を作製するための方法、これらの抗体の抗原結合部位を融合タンパク質として利用する方法、活性成分としてこれらの抗体を含む薬学的組成物に関係する。
【０００２】
【従来の技術】
【非特許文献１】
Kohlerら、Nature 256: 495-497(1976)
【非特許文献２】
Jonesら、Nature 321:522-525(1986)
【非特許文献３】
Reichmannら、Nature 332:323-327(1988)
【非特許文献４】
Verhoeyenら、Science 239:1534-1536(1988)
【非特許文献５】
Patalら、Immunogenetics 41:282-286(1995)
【非特許文献６】
Tangら、Veterinary Immunology & Immunopathology 80:259-270(2001)
【特許文献１】
特許第2811089号公報
【特許文献２】
特許第2811096号公報
【特許文献３】
特許第2837240号公報
【０００３】
イヌは以前からペットとして人間に飼育されていたが、近年では、従来の盲導犬などの社会的な役割のほか、精神的な伴侶としての価値が特に重視されている。その結果、イヌの社会的な地位が向上し、イヌの疾病とくに伝染病に関するより確実な知識が必要となり、その診断、治療、予防のための方法が求められている。
【０００４】
イヌの感染症は現在ではワクチンにより予防されるが、適切なワクチン接種がされなかった場合やペットショップ等でのストレスの問題から感染症に罹患することも多い。とくにウイルス感染症に対しては対処療法しかなく、場合によっては致死的である。
【０００５】
たとえば、ＣＰＶ感染症は、イヌに見られる激しい嘔吐、出血性下痢、および脱水、白血球減少を主徴とした急性の疾患である。本病は３〜１２週齢の幼犬に見られる心筋炎型と離乳後あらゆる年齢層に見られる腸炎型とに大別される。前者は、外見上健康な幼犬が突然虚脱し、呼吸困難を起こすなど経過が急で、死亡率が高く、治癒後も後遺症が残る。後者は激しい嘔吐・出血性下痢および顕著な脱水・白血球減少を主徴とし、死に至るものが多く、軽微な場合には不顕性のまま推移することもある。
【０００６】
ＣＰＶ感染には移行抗体が感染防御に有効であることや、抗体による治療が有効であることが実験的にも知られている。しかし、現実には治療方法として対処療法としての輸液の点滴注射やネコインターフェロン投与、二次感染防止のための抗生物質投与が一般的に行われているが、その効果は低い。
【０００７】
また、この他にもイヌには多くの感染症、ジステンパー 、パラインフルエンザ 、犬伝染性気管支炎、 コロナウイルス感染症 、アデノウイルス感染症などがあり、それらに対してもワクチンが存在するが、治療法は対処療法しかない。
【０００８】
ウイルス感染症は中和抗体による血清療法が有効であり、治療効果が期待される。しかし、イヌを用いた抗血清販売の事業化は動物愛護からも社会的に受け入れられるものではなく、現実性がない。
【０００９】
特定の抗原を標的とする抗体を作製するためには、通常、Kohler及びMilsteinの見いだした方法(非特許文献１-)が用いられる。すなわち、マウスを抗原で免疫し、免疫マウス由来の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させ、標的抗原に特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製する。現在、上記のイヌウイルスに対してはウイルスを抗原としてモノクローナル抗体が作製されている。そのようなモノクローナル抗体を治療に用いることができるが、モノクローナル抗体はマウス起源のものであり、したがってイヌにおいてはそれら自身が抗原性を持つ。そのようなモノクローナル抗体をイヌに繰り返し投与した場合には、イヌの免疫システムはマウスモノクローナル抗体に対する応答を開始し、それを無効にしてしまう。
【００１０】
抗体は、典型的には、ジスルフィド結合によって互いに連結する２本の重鎖と、各重鎖のＮ-末端に結合する軽鎖とを含む。各重鎖は、そのＮ-末端に可変領域ドメインを、それに続いて他端に定常領域ドメインを有する。また、各軽鎖もＮ-末端の可変領域ドメインとそれに続く定常領域ドメインを有する。軽鎖及び重鎖各対の可変領域ドメインは、抗原結合部位を形成する。軽鎖及び重鎖上の可変領域ドメインは同じ一般構造を有し、各ドメインは、配列が比較的保存されている４つの領域からなるフレームワークとこれに接続する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有している。４つのフレームワーク領域はβ-シート構造をとり、ＣＤＲはこのβ-シート構造体に接続するループを形成する。これらのＣＤＲはフレームワーク領域によって非常に接近した状態に保たれ、抗原結合部位の形成に寄与している。
【００１１】
マウスモノクローナル抗体のＣＤＲをヒトのフレームワークに移植し、該当するマウスモノクローナル抗体の結合能力を有し、かつ、ヒトに抗原性を示さないヒト化抗体を作製することが、Winter及び彼の共同研究者によって提唱されている(例えば、非特許文献２-、非特許文献３-及び非特許文献４-を参照のこと)。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
このように人間の医療分野では遺伝子工学的手法を用いてヒト化した抗体が実用化されている。一方、イヌの場合はイヌの軽鎖の定常領域の塩基配列(特許文献１、特許文献２)、イヌの重鎖の遺伝子(特許文献３、非特許文献５-、非特許文献６-)が報告されているが、それらからイヌ化抗体を作製する技術は完成されていない。
【００１３】
本発明は、イヌ化抗体を開発するための基本となる遺伝子断片およびＣＤＲ移植技術を提供する。本技術により作製されたイヌ化抗体を生産するための方法、抗原結合ドメインを融合タンパク質として利用する方法、活性成分としてこれらの抗体を含む薬学的組成物を提供することが本発明に含まれる。
【００１４】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号２に示すイヌ免疫グロブリンκ遺伝子可変領域ドメインを有するアミノ酸配列、配列番号４に示すイヌ免疫グロブリンλ遺伝子可変領域ドメインを有するアミノ酸配列、および配列番号６、８、１０、１２に示すイヌ免疫グロブリンγ鎖遺伝子可変領域ドメインを有するアミノ酸配列をもとにイヌパルボウイルスに対する中和モノクローナル抗体のＣＤＲを移植して作成される、配列番号１７、１９に示す可変領域を持つことを特徴とするイヌ化抗体遺伝子。
（２）（１）に記載されたイヌ化抗体遺伝子の可変ドメインを、イヌで抗原性を示さない他のタンパク質遺伝子と融合してなることを特徴とする融合タンパク質遺伝子。
（３）（２）に記載された融合タンパク質遺伝子のうち、特に特異性がイヌパルボウイルスに対するものであることを特徴とする融合タンパク質遺伝子。
（４）（１）ないし（３）のいずれか１項に記載された遺伝子を真核細胞で発現することを特徴とする発現ベクター。
（５）（１）ないし（３）のいずれか１項に記載された遺伝子を真核細胞で発現することを特徴とするウイルスベクター。
（６）（４）または（５）に記載されたベクターを真核細胞に導入してイヌ化抗体タンパク質を生産することを特徴とするイヌ化抗体タンパク質の製造方法。
（７）配列番号２に示すイヌ免疫グロブリンκ遺伝子可変領域ドメインを有するアミノ酸配列、配列番号４に示すイヌ免疫グロブリンλ遺伝子可変領域ドメインを有するアミノ酸配列、および配列番号６、８、１０、１２に示すイヌ免疫グロブリンγ鎖遺伝子可変領域ドメインを有するアミノ酸配列をもとにイヌパルボウイルスに対する中和モノクローナル抗体のＣＤＲを移植して作成される、配列番号１７、１９に示す可変領域を持つイヌ化抗体遺伝子によってコードされる、配列番号１８、２０に示すアミノ酸配列である可変領域を持つことを特徴とするイヌ化抗体タンパク質。
【００１５】
抗体遺伝子は、公知の技術を使用することによって本発明の開示に基づいて調製され得る。すなわち、イヌの脾臓等から抽出したｍＲＮＡをテンプレートとして使用し、配列番号１３および１４に示すプライマーを用いてイヌ免疫グロブリンの軽鎖の可変領域ドメインの塩基配列を単離した。そのようなＰＣＲ（polymerase Chain Reaction）増幅（5'race）については市販のキットが利用可能である。さらに、同様に、既知の情報（Tangら、前出）に基づき設計したプライマーを用いてイヌ免疫グロブリンの重鎖ｃＤＮＡ全体をクローニングした。一方、イヌパルボウイルスに対する中和モノクローナル抗体のｃＤＮＡを単離した。これらの抗体を使用して、イヌ化されたイヌパルボウイルスに対する中和モノクローナル抗体の免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子を構築し得る。また、この方法で任意のモノクローナル抗体をイヌ化しうる。
【００１６】
まず、モノクローナル抗体の可変領域の配列を突き止める必要がある。そのようなＤＮＡ配列決定のため、可変ドメイン配列は、一般的に周知の技術によって各々のｍＲＮＡから合成される重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡから決定することができる。その後、種々の方法（たとえば、Kabatら、U.S.Department of Health and Human Services (1983)、Chotiaら、Nature 342:877-883(1989)、Martinら、Proceedings of National Academy of Science in USA 86:9268-9272(1989)、MacCallumら、Journal of Molecular Biology 262:732-745(1996)）を参照して、超可変領域を決定することができる。また、一方で、ＣＤＲはＸ線結晶学又は分子モデリング技術を用いる構造解析により決定することができる。次いで、フレームワーク領域に由来する特定の選択残基と共に、ＣＤＲに対応する全てのアミノ酸残基を含む複合ＣＤＲを構築することができる。次に、得られた複合ＣＤＲを“抗原結合部位”として転移させることができる。マウス抗体のＣＤＲをヒト抗体に移植する方法については、たとえば、特許第２８２８３４０号公報、特開平１１-４６９４号公報、特開平１１-２４３９５５号公報などを参照できる。
【００１７】
このとき、設計されたアミノ酸配列を、遺伝子断片に付加、欠失または置換の技術は公知である。典型的な技法には、部位指向性変異誘発及びＰＣＲが含まれる。
【００１８】
抗体を「ヒト化」することは、以上に述べたほど効率の良いプロセスではない。たとえば、適合性のヒトのフレームワーク領域を、１０００を超えるヒトの重鎖および軽鎖のアミノ配列から、それぞれを選択しなければならない。このように作製された、マウス抗体と同じＣＤＲを有するヒト化抗体でも、しばしば、もとのマウス抗体と同じ効力を有さない。「ヒト化」抗体は、ＣＤＲ以外にいくらかマウスのアミノ酸残基を加えてマウス抗体に匹敵する立体構造を保証するフレームワークモチーフを有する必要がある。
【００１９】
このような状況の下、イヌ抗体の立体構造の情報やイヌの可変領域遺伝子の十分な情報もなく、我々はイヌ化抗体の作出に成功した。
【００２０】
もっとも、イヌ重鎖、軽鎖可変領域の遺伝子の情報が多いほどイヌ化が容易になる。したがって、我々は十分な可変領域遺伝子の情報を解析するために利用可能なプライマーおよびその方法をも提供する。
【００２１】
前記のように生成されるイヌ化抗体の可変領域の遺伝子は、相当する免疫グロブリン定常領域の遺伝子に連結し、イヌ化抗体遺伝子が完成する。イヌ化抗体遺伝子を用いて、例えば、昆虫細胞、ＣＨＯもしくはミエローマ細胞、酵母等で、それぞれに対応する発現用プラスミドもしくはベクターウイルスに結合し、リン酸カルシウム処理、リポフェクション又はエレクトロポレーション法等により細胞内に導入して、イヌ化抗体タンパク質を発現することができる。
【００２２】
なお、以上の操作は、Sambrookら（Sambrookら、Molecular Cloning.3rd Edition Cold Spring Harbor Press (2001)）等の既知の遺伝子操作技術・細胞工学技術にしたがって行うことができる。
【００２３】
発現した組換えイヌ化抗体タンパク質は、当該分野の標準的手順により精製され得る。この手順としては、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などが挙げられる（一般的には、参考として、本明細書において援用される、Scopesら、Protein Purification、Springer-Verlag、N.Y.(1982)を参照のこと）。イヌにおいて薬として使用するためには９５％以上の純度が望ましい。イヌ化抗体を含む薬学的組成物は、一般的に非経口経路（すなわち、皮下的に、筋肉内におよび静脈内に）で投与される。
【００２４】
ところで、定常ドメインは抗原に抗体を結合するのに直接は関係しないが、エフェクター機能を示す。その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは異なったクラスに分けられる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという免疫グロブリンの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかは、例えばヒトにおいてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４；ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のようなサブクラス（アイソタイプ）に更に分割される。
【００２５】
抗体タンパク質はこれらの機能ドメインが比較的独立しているため、たとえば抗原に対する結合能力は可変ドメイン断片（例えばF(ab')2）で保持される。そこで、他の用途に応じて、可変ドメイン断片を他のポリペプチドへの融合することが可能である。特に抗原性を持たないようにイヌ由来の機能性タンパク質に融合し、抗体としての特異性を持ち、抗体以外のエフェクター機能を持たせる改変は有効で安全な治療薬を開発する有効な方法である。融合させる技術についてはすでに1984年に特許第２８６５６４５号公報や特許第２７１４７８６号公報として出願され、その後も多くの改良がなされている。それらの具体的方法については、単行本（KontermannとDubel編集、Antibody Engineering、Springer Lab Manual）に詳しい。感染症への応用は、たとえば、特定の細胞に発現する受容体に結合し、その細胞を増殖させたり、活性化させたり、遊走させることであり、その作用により、たとえば感染部位の免疫担当細胞を有効利用して早期の感染防御を成立させたり、異物処理を促進させたり、炎症を制御する。
【００２６】
さらに、先に述べた発現ベクターのうち、真核細胞で発現するベクターはＤＮＡのまま、筋肉内に注射すると発現させることができる。このときに、塩基性リポソームなど、市販のキャリア物質を用いて発現や導入を安定化することができる。金コロイド粒子にＤＮＡを吸着させ、皮内の細胞に効率良くＤＮＡを導入する装置もまた市販されている。また、アデノウイルスやアデノ随伴ウイルスなどのゲノムにプロモータと一緒に挿入し、感染させることでも体内で発現させることができる。これらＤＮＡを導入する方法を用いてイヌ化抗体タンパク質、イヌ化された可変ドメインをもつ融合タンパク質を発現させ、治療する遺伝子治療技術については周知のことであり、タンパク質性薬剤と比べて取り扱いが簡便である。すでに確立しているこの方法については総説（日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、株式会社エヌ・ティー・エス）を参照できる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１ 抗ＣＰＶマウスモノクローナル抗体の作製
（１）ウイルス抗原の精製
ＣＰＶ、Ｃｐ４９株をＣＲＦＫ細胞に接種し増殖させ、その培養上清にＰＥＧ６０００と塩化ナトリウムを加えることによりウイルスを沈殿回収した。ＴＥ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再浮遊させ、塩化セシウムを用いた密度勾配遠心法にてウイルス抗原を精製した。
【００２８】
（２）免疫
Ｂａｌｂ／ｃマウス（１４週齢、メス）にウイルス抗原１００μｇを3週間隔で3回免疫した。1回目は抗原をフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ、ヤトロン社）と混ぜて、2回目以降はフロイント不完全アジュバントと混ぜて、皮下に接種した。3回目免疫後3週目に同抗原２０μｇを腹腔に接種し、3日後に脾臓を摘出した。
【００２９】
（３）ハイブリドーマの作製およびスクリーニング
免疫マウスから摘出した脾臓より脾細胞を回収し、脾細胞４×１０8とマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１細胞４×１０7とを、常法通り融合させることによりハイブリドーマを作製した。精製ウイルス抗原を用いたＥＬＩＳＡおよびウイルス感染ＣＲＦＫ細胞を用いた間接蛍光抗体法により抗ＣＰＶ抗体を産生しているハイブリドーマをスクリーニングし、限界希釈法にてハイブリドーマのクローニングを行った。
【００３０】
抗ＣＰＶ抗体を産生しているハイブリドーマ6クローンを得た。これらのクローンが産生する6種類の抗ＣＰＶ抗体をそれぞれ、ＣＰ１ａ、ＣＰ２ａ、ＣＰ３ａ、ＣＰ４ａ、ＣＰ５ａ、ＣＰ６ａと名付けた。アイソタイプおよびサブクラスはそれぞれ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１、ＩｇＡであった。
【００３１】
（４）モノクローナル抗体の選定
得られたハイブリドーマクローンを１０7細胞／マウスで腹腔に接種することにより抗体を腹水中に分泌生産し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（アマシャム・ファルマシア社）で添付のプロトコールに従い、腹水中の抗体を精製した。各モノクローナル抗体につきＣＰＶ-Ｃｐ４９株に対するウイルス中和活性および豚赤血球凝集抑制活性の有無を調べ、さらに、精製ウイルス抗原を用いたＥＬＩＳＡおよびラテックス凝集反応によりウイルス抗原との結合性を調べた。以上の試験結果の総合判定で、イヌ化抗体作製に供するモノクローナル抗体の選定を行った。その結果、サブクラスがＩｇＧ１であり、ＣＰＶ-Ｃｐ４９株に対する強い結合性を有すると考えられたＣＰ３ａを、以下で作製するイヌ化抗体の候補とした。
【００３２】
実施例２：ＣＰ３ａ抗体の可変領域のｃＤＮＡクローニング
ＣＰ３ａを生産するハイブリドーマからＩＳＯＧＥＮ（ＤＯＪＩＮＤＯ社製）を用いて、添付のプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した。
【００３３】
逆転写用プライマーは下記のようにデータベースより引用したマウスκおよびγ両鎖の定常領域の５'領域に設定した。
【００３４】
κ鎖逆転写用プライマー（配列番号２５）
Ｃκ１ :5'-CAGATGTTAACTGCTCACTG-3'
( Gene Bank Accession No. V00810:nucleotide No.472-453)
γ鎖逆転写用プライマー（配列番号２６）
ＣγＨ-２:5'-AGTTTGGGCAGCAGATCCA-3'
( Gene Bank Accession No. BC003435:nucleotide No.523-498)
【００３５】
２．５μｇのＲＮＡを鋳型として、１０μＭのＣκ１もしくはＣγＨ-２プライマーを１μｌ使用した。まず、ＤＥＰＣ処理した蒸留水で全量１５．５μｌにして７０℃で１０分間加熱した後、氷上で急冷した。次に１０ｍＭのｄＮＴＰを１μｌ、添付されていた緩衝液を２．５μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴを２．５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2を２．５μｌ、逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社） １μｌ（２００Ｕ）を加えてよく混合し、４２℃で５５分間、７０℃で１５分間反応させた。
【００３６】
次に、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製５'ＲＡＣＥ ＫＩＴを用いてプロトコールに従い、ｍＲＮＡの５'末端領域から可変領域全体をクローニングした。すなわち、逆転写したｃＤＮＡにオリゴｄＣを付加し、さらに、アダプターを付加し、それに相補的なプライマーをＰＣＲに用いた。
【００３７】
アダプタプライマー(配列番号２７)
：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGGG-3'
【００３８】
一方、増幅用に用いた３'側プライマーは逆転写用プライマーの上流領域に下記のように設定した。
【００３９】
κ鎖増幅用プライマー（配列番号２８）
Ｃκ２:5'-GATGGTGGGAAGATGGATAC-3'
( Gene Bank Accession No. V00810:nucleotide No.452-433)
γ鎖増幅用プライマー(配列番号２９)
ＣγＨ-１:5'-ACAGACAGATGGGGGTGTCG-3'
( Gene Bank Accession No. BC003435:nucleotide No.493-474)
【００４０】
このようにして得られたκ鎖、γ鎖の可変領域のＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（インビトロージェン社）を用い、添付のプロトコールに従い、ｐＧＥＭ-Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｒｒｐｍｅｇａ社）にライゲーションした。ライゲ-ション反応液を用いてコンピテント化した大腸菌ＸＬ１-Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）の形質転換反応を行い、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で作製したアガロースプレートで形質転換体の選択を行った。３７℃にて一晩培養し、プレートに生育したコロニーのうちプラスミドベクタ-に重鎖遺伝子ｃＤＮＡの挿入が確認された４個のコロニーのみ１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌで一晩培養した。ＱＩＡｐｒｅｐ（Ｒ） ｓｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて添付のプロトコール通り操作し、プラスミドＤＮＡを抽出・精製した。
【００４１】
得られたｃＤＮＡクロ-ンはＡＢＩ社製のＡＢＩ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔｓを用いたジデオキシシークエンス法により、添付のプロトコールにしたがって反応を行い、ＡＢＩ社製シークエンサ３７３Ａで解析して決定した。
【００４２】
塩基配列の解析の結果、得られたＣＰ３ａモノクローナル抗体γ鎖、κ鎖の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号２１、２２および２３、２４に示した。
【００４３】
実施例３：イヌ免疫グロブリンγ鎖遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
（１）ＲＮＡの調製
実験用ビーグル犬より脾臓を摘出して、ハサミで細かく切り、２０ｍｌのＧＴＣ溶液（４Ｍグアニジンチオシアネート、２５ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％ Ｎ-ラウロイル サルコシン酸、０．１Ｍ ２-メルカプトエタノール）中でさらに細かく切断し、組織片を溶解させた。１８ゲージの注射針で４回ストロークしてゲノムＤＮＡを切断した後、４ｍｌずつに分注し、-８０℃で凍結保存した。凍結チュ-ブのうち１本を解凍し、溶解液に２Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を４００μｌ、ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネイト）で処理した蒸留水で飽和したフェノールを４ｍｌ、クロロホルム／イソアミルアルコール（４９：１）を８００μｌ、それぞれ加える毎に軽く混和しながら順番に加えた。溶液を１０秒間激しく撹拌し、３０分間氷上に静置した後、４℃で３０００ｒｐｍ、３０分間遠心した。遠心分離後、上清を回収し、上清５００μｌに２-プロパノールを５００μｌ加えてよく混和し、-２０℃で２時間冷却した後、４℃で１４０００ｒｐｍ、３０分間遠心した。上清を捨て、沈殿を４００μｌの７０％エタノールで洗浄した後、乾燥して４０μｌのＤＥＰＣ処理した蒸留水に溶解した。抽出したＲＮＡを吸光度により定量した。
【００４４】
（２） ｃＤＮＡ合成
イヌ免疫グロブリンγ鎖遺伝子ｃＤＮＡをクローニングするため、既に報告されている塩基配列（Ｔａｎｇら、既出）を基にプライマ-としてＩＧ-Ｆ、ＩＧ-Ｒオリゴヌクレオチドを合成した。下記にそれぞれの塩基配列を示す。
【００４５】
ＩＧ-Ｆ(配列番号３０):5'-AGTGCTCAGGACACMACACA-3'
ＩＧ-Ｒ(配列番号３１):5'-TCATTTACCCGGAGAATGGG-3'
【００４６】
逆転写反応（ＲＴ）は実施例３（１）で調製したＲＮＡ ２μｇを鋳型として１０μＭのＩＧ-Ｒプライマーを１μｌ使用した。まず、ＤＥＰＣ処理した蒸留水で全量１５．５μｌにして７０℃で１０分間加熱した後、氷上で急冷した。次に１０ｍＭのｄＮＴＰを１μｌ、添付されていた緩衝液を２．５μｌ、０．１ＭＤＴＴを２．５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2を２．５μｌ、逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社） １μｌ（２００Ｕ）を加えてよく混合し、４２℃で５５分間、７０℃で１５分間反応させた。
【００４７】
（３） ＰＣＲによるイヌ免疫グロブリンγ鎖ｃＤＮＡの増幅
ＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅は、逆転写反応液１μｌを鋳型としてＩＧ-ＦプライマーおよびＩＧ-Ｒプライマーを最終濃度各０．４μＭで使用した。ＴＡＫＡＲＡ社製のＬＡ-Ｔａｑポリメラーゼ（２．５Ｕ）を用いて９８℃１５秒、５５℃３０秒、７４℃２分を１サイクルとして３０サイクルのＰＣＲを行い、イヌ免疫グロブリンγ鎖ｃＤＮＡを増幅した。反応終了後、エタノ-ル沈殿を行い、ペレットを１０μｌの滅菌蒸留水に溶解した後、１％アガロースゲルで電気泳動を行い、臭化エチジウムにて染色後、紫外線照射下で約１４５０ｂｐのバンドを確認した。
【００４８】
（４） ＰＣＲ産物のクローニング
イヌ免疫グロブリンγ鎖ｃＤＮＡのバンド部分をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１、Ｉｎｃ．）を用いて添付のプロトコールに従ってアガロ-スゲルより切り出した。切り出したＤＮＡ断片をＴＡＫＡＲＡ社製のｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２を用い、１５℃で一晩反応させることによりＰｒｏｍｅｇａ社製のｐＧＥＭ-Ｔ Ｅａｓｙ ベクター１μｌ（５０ｎｇ）にライゲーションした。ライゲ-ション反応液を用いてコンピテント化した大腸菌ＸＬ１-Ｂｌｕｅの形質転換反応を行い、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で作製したアガロースプレートで形質転換体の選択を行った。３７℃にて一晩培養し、プレートに生育したコロニーのうちプラスミドベクタ-にイヌ免疫グロブリンγ鎖ｃＤＮＡの挿入を確認した。確認されたうち４個のコロニーのみ１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌで一晩培養した。ＱＩＡｐｒｅｐ（Ｒ） ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて添付のプロトコール通り操作し、プラスミドＤＮＡを抽出・精製した。
【００４９】
（５） 塩基配列の決定
得られたイヌ免疫グロブリンγ鎖ｃＤＮＡクロ-ンはＡＢＩ社製のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（Ｒ） ＢｉｇＤｙｅTM Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔｓを用いたジデオキシシークエンス法によりシークエンサー（ＡＢＩ社：Ａ３１０）を用いて挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
【００５０】
クロ-ニングした４個のイヌ抗体γ鎖ｃＤＮＡ、２、Ｃ、ＥおよびＦの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号５から１２に示す。
【００５１】
得られたアミノ酸配列のデータを、既に報告されているイヌ抗体γ鎖遺伝子のアミノ酸配列（Ｔａｎｇら、既出）と定常ドメインのみ比較したところ、約９８％の相同性が認められた。また、ヒト、マウスのγ鎖と相同性を比較したところ、６０〜７０％の相同性が示された。今回得られた４種類のイヌγ鎖のアミノ酸配列を既報のイヌγ鎖Ａ〜Ｄ、ヒトγ鎖、マウスγ鎖と比較し、相同性の値を表１にまとめ、それらのアミノ配列を並記した図を図１に示した。
【００５２】
【表１】
実施例４：イヌ免疫グロブリン軽鎖 (κ鎖およびλ鎖) 遺伝子の可変領域ｃＤＮＡのクローニング
イヌ抗体軽鎖遺伝子定常ドメインの５'上流側に隣接する可変ドメインｃＤＮＡをクローニングするため、既に報告されているイヌ抗体軽鎖(κ鎖およびλ鎖)遺伝子の定常ドメインの塩基配列(特許第２８１１０８９号公報、特許第２８１１０９６号公報)を基にκ鎖合成用プライマーとして配列番号９の、またλ鎖合成用プライマーとして配列番号１１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、５'ＲＡＣＥ法を行った。
【００５４】
すなわち、ＲＮＡを鋳型とし、ＣａＩｇｋ-Ｒ２プライマー（κ鎖）またはＣａＩｇＬ-Ｒ２プライマー（λ鎖）を使用して、実施例３（２）と同様に逆転写反応を行った。次に、５'ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ （ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）を使用して、添付のプロトコールに従いｃＤＮＡの分画、ｃＤＮＡへのｄＣ ｔａｉｌの付加およびＰＣＲによる増幅を行った。なお、ＰＣＲはＣａＩｇＫ-Ｒ２プライマー（κ鎖）またはＣａＩｇＬ-Ｒ２プライマー（λ鎖）およびキットに付属のＡｂｒｉｄｇｅｄ Ａｎｃｈｏｒ プライマ-を使用して、実施例３（３）と同様の条件で行った。その後、ＰＣＲで増幅したｃＤＮＡ断片を実施例３（４）と同様にクロ-ニングし、得られたクロ-ンは実施例３（５）と同様の方法で塩基配列を決定した。クロ-ニングしたイヌ免疫グロブリンκ鎖、λ鎖遺伝子可変領域ｃＤＮＡの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号１、２、３、４に示した。
【００５５】
得られた塩基配列のデータを、ヒト、マウスのγ鎖と相同性を比較したところ、６０〜８０％の相同性が示された。今回得られたイヌκ、λ鎖のアミノ酸配列を既報のヒト、マウスのκ鎖、γ鎖と比較し、相同性の値を表２にまとめ、それらのアミノ配列を並記した図を図２，３に示した。
【００５６】
【表２】
実施例５：ＣＤＲ移植によるイヌ化抗体重鎖ｃＤＮＡの合成
（１） ＰＣＲ法によるイヌ化抗体重鎖可変領域ｃＤＮＡの合成
実施例２で得られたマウスのＣＰ３ａ可変領域のｃＤＮＡ塩基配列、および実施例３で得られたイヌ免疫グロブリンγ鎖遺伝子の可変領域ｃＤＮＡの塩基配列よりＣｏｎｔａｃｔ法(ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６２，７３２-７４５，１９９６)に従ってＣＤＲを推定した。推定に基いて、ＣＰ３ａのＣＤＲをイヌ抗体のＣＤＲと交換した抗ＣＰＶイヌ化抗体重鎖遺伝子の可変領域ｃＤＮＡを設計した。イヌ化抗体重鎖遺伝子の可変ドメインｃＤＮＡをＰＣＲで合成するため、各断片がお互いに４０ｂｐ重複するような4つのオリゴＤＮＡ断片（Ｈｅａｖｙ１〜４）を作製した。下記にその塩基配列を示す。また、重鎖の可変ドメイン全体を増幅し、定常ドメインと連結させる、またはトランスファーベクターに組み込むことを考慮して特定の制限酵素サイトを付加したプライマー、Ｈ-ＶＦおよびＨ-ＶＲオリゴヌクレオチドを設計した。Ｈ-ＶＦおよびＨ-ＶＲの塩基配列を配列番号１５、１６に示す。
【００５８】
Ｈｅａｖｙ１(配列番号３２):
5'-CGGGATCCCGATGGAGTCTGTGCTCTGCTGGGTTTTCCTTGTCTCTATTTTAAAAGGTGTCCAGGGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACCTGGTGAAGCCTGGGGGGTCCTTGAGACTGTCCTGTGTGGCCTCT-3'
Ｈｅａｖｙ２（配列番号３３）:
5'-GTTAGTTCGACCGTCGGTAGGAAAAATCTCTCCAATCCACTGCAGCCCCTTCCCTGGAGACTGACGGACCCAGTGCATCCAGTAGCCGGTGAAGGTGAATCCAGAGGCCACACAGGACAGTCTCAAGGACCCCCCAGGCTTC-3'
Ｈｅａｖｙ３（配列番号３４）:
5'-GTGGATTGGAGAGATTTTTCCTACCGACGGTCGAACTAACTACGCAGACGCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTT-3'
Ｈｅａｖｙ４（配列番号３５）:
5'-AACCGAGGGGGCCGTGGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCCAGTAAGCAAACCCCTCCCCACCATACTTTTTTCTTGTACAGTAATAAACAGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGGCTGTTCATCTGCAGA-3'
【００５９】
ＤＮＡの合成過程を図４に模式的に図示するとともに、各ＰＣＲ産物のアガロース電気泳動パターンを示した。初めに上記のＨｅａｖｙ１とＨｅａｖｙ２とを混合（各１００μＭ、反応液Ａとする）またはＨｅａｖｙ３とＨｅａｖｙ４とを混合(各１００μM、反応液Ｂとする)し、ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ-Ｔａｑポリメラーゼ（２．５Ｕ）を使用して全量５０μｌにて、９４℃４５秒、５５℃１分、７２℃２分を１サイクルとしたＰＣＲを２５サイクル行った。反応終了後Ａ、Ｂ各反応液に等量のクロロホルム・イソアミルアルコール（２４：１）を加えて撹拌した後、室温で１００００ｒｐｍ、５分間遠心して上清を回収した。次にＡ、Ｂ各反応液の上清を５μｌづつ混合し、同様のＰＣＲ反応を行った。反応終了後、上記と同様に回収した上清１μｌおよびプライマーＨ-ＶＦとＨ-ＶＲを用い (最終濃度各１μＭ)、ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ-Ｔａｑポリメラーゼ（２．５Ｕ）を使用して全量５０μｌで全長を合成するためのＰＣＲを９８℃１５秒、５５℃３０秒、７４℃２分を１サイクルとして２５サイクル行った。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで電気泳動し、約４５０ｂｐのバンドを確認した。
【００６０】
（２） イヌ化抗体重鎖遺伝子、定常ドメインｃＤＮＡのクローニング
実施例３（５）で得られた塩基配列を元にイヌ抗体重鎖遺伝子の定常領域ｃＤＮＡを増幅し、可変領域ｃＤＮＡに連結させる、またはトランスファーベクターに組み込むことを考慮して特定の制限酵素サイトを付加した下記のプライマーＨ-ＣＦ、Ｈ-ＣＲオリゴヌクレオチドを合成した。
【００６１】
Ｈ-ＣＦ（配列番号３６）
:5'-GGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCACGGCCCCCTCGGTT-3'
Ｈ-ＣＲ（配列番号３７）
:5'-GCGGATCCTCATTTACCCGGAGAATGGG-3'
【００６２】
実施例３（４）で得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ-Ｔａｑポリメラーゼ（２．５Ｕ）とプライマーＨＣ-ＦおよびＨ-ＣＲ（最終濃度各０．４μＭ）を使用して全量５０μｌにて９４℃４５秒、５５℃１分、７２℃２分を１サイクルとしたＰＣＲを２５サイクル行った。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで電気泳動し、約１０００ｂｐのバンドを確認した。
【００６３】
（３） イヌ化抗体γ鎖遺伝子の全長ｃＤＮＡの作製
実施例４（１）で得られたイヌ化抗体重鎖遺伝子の可変領域ｃＤＮＡと実施例４（２）で得られた定常領域ｃＤＮＡを混合し、ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ-Ｔａｑポリメラーゼ（２．５Ｕ）を使用して、９４℃４５秒、５５℃１分、７２℃２分を１サイクルとしたＰＣＲを２５サイクル行った。ＰＣＲの反応液を１００倍に希釈して鋳型とし、プライマーＨ-ＶＦおよびＨ-ＣＲ(最終濃度各０．４μＭ)を用いて、同じ反応条件でイヌ化抗体重鎖遺伝子ｃＤＮＡの全長を合成するためのＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで電気泳動し、約１４５０ｂｐのバンドを確認した。増幅したＤＮＡ断片はＰｒｏｍｅｇａ社製のＴ４リガーゼを使用し、ｐＧＥＭ-Ｔ Ｅａｓｙ ベクターに実施例３（４）と同様にクロ-ニングした。得られたクロ-ンは実施例３（５）と同様の方法で塩基配列を決定した。なお、クロ-ニングしたイヌ化抗体重鎖遺伝子ｃＤＮＡに１塩基の変異が認められた(２６２番目の塩基がＡからＧに置換していた)ため、次項に示す方法で修復した。
【００６４】
（４） イヌ化γ鎖ｃＤＮＡ遺伝子の塩基置換の修復
変異が認められた箇所を修復するため下記のプライマーを設計し、ＰＣＲを行った。
【００６５】
Ｈ-１３-ＸｈｏＩ（配列番号３８）:5'-CGATTCACCATCTCGAGAGACAACG-3'
Ｈ-１４-ＸｈｏＩ（配列番号３９）:5'-CGTTGTCTCTCGAGATGGTGAATCG-3'
【００６６】
プライマーＨ-１３-ＸｈｏＩおよびベクタ-に相補的なＳＰ６プライマ-(最終濃度各０．３μＭ)を用いてｃＤＮＡの前半部分を、また、プライマーＨ-１４-ＸｈｏＩおよびベクタ-に相補的なＴ７プライマー(最終濃度各０．３μＭ)を用いてｃＤＮＡの後半部分を増幅した。実施例５（３）で得られたプラスミドクローンを鋳型とし、ＴＯＹＯＢＯ社製の ＫＯＤ-ＰＬＵＳ（１Ｕ）を使用したＰＣＲを９４℃１５秒、５８℃３０秒、６８℃５０秒を１サイクルとして３０サイクル行った。前半部分、後半部分の各ＰＣＲ産物をエタノール沈殿後、スピンカラム（Ｃｅｎｔｒｉ-Ｓｅｐ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で精製し、前半部分のＰＣＲ産物は制限酵素ＸｈｏＩ、ＳｐｈI（Ｒｏｃｈｅ社）で、また、後半部分のＰＣＲ産物は制限酵素ＸｈｏＩ（Ｒｏｃｈｅ社）、ＳａｃＩ（ＴＡＫＡＲＡ社）で消化した。制限酵素処理した各ＰＣＲ産物は実施例３（４）と同様にして、あらかじめＳｐｈI、ＳａｃＩで消化しておいたｐＧＥＭ-Ｔ Ｅａｓｙベクターにライゲーションし、クロ-ニングした。ただし、コンピテント化した大腸菌はＪＭ１０９（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いた。また、得られたプラスミドクロ-ンを実施例３（５）と同様の方法で塩基配列の確認をしたところ、目的の塩基配列を有するイヌ化重鎖遺伝子ｃＤＮＡの全長がクロ-ニングされていた。イヌ化重鎖遺伝子、可変ドメインｃＤＮＡの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号１７、１８に示す。以上の構築過程を模式的に図６に示した。以降、このイヌ化重鎖遺伝子ｃＤＮＡの全長がクロ-ニングされたプラスミドをｐＣＩｇγと呼ぶ。
【００６７】
実施例６ ＣＤＲ移植によるイヌ化抗体κ鎖ｃＤＮＡの合成
（１） イヌ化抗体κ鎖可変領域ｃＤＮＡの合成
実施例４で得られたイヌ抗体κ鎖遺伝子の可変領域ｃＤＮＡ塩基配列より、実施例５（１）と同様にマウスのＣＰ３ａ遺伝子のκ鎖可変ドメインのＣＤＲをイヌ抗体κ鎖のＣＤＲと交換した抗ＣＰＶイヌ化抗体κ鎖遺伝子の可変領域ｃＤＮＡを設計し、下記のオリゴヌクレオチド断片（Ｋａｐｐａ１〜４）およびプライマーｋ-ＶＦおよびｋ-ＶＲオリゴヌクレオチドを使用してイヌ化抗体κ鎖可変領域ｃＤＮＡを合成した。合成の過程を模式的に図５に示した。１％アガロースゲル電気泳動により、最終ＰＣＲ産物に約４２０ｂｐのバンドを確認した。
【００６８】
Kappa1（配列番号４０）:
5'-GGAAGATCTTCATGAGGTTCCCTTCTCAGCTCCTGGGGCTGCTGATGCTCTGGATCCCAGGATCCAGTGGGGATATGTGCATGACACAGACCCCACTGTCCCTGTCCGTCAGCCCTGGAGAGACTGCCTCCATCT-3'
Kappa2（配列番号４１）:
5'-ATTTTTGCATTATAGACCAGGAGCTGTGGAGACTGGCCTGGCTTCTGTCGATACCATAGTAAATAACTGTAGAGGCTCTGACTGGCCTTGCAGGAGATGGAGGCAGTCTCTCCAGGGCTGACGGACAGGGACAG-3'
Kappa3（配列番号４２）:
5'-CAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAATCTTAGCAACTGGCGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGCGGGTCAGGGACAGATTTCACCCTGAGAATCAGCACAGTGGAGGCTGACGATACTGGA-3'
Kappa4（配列番号４３）:
5'-GCCAGCTGGCTGGGCATCATTCCGTTTGAGCTCCACCTTGGTTCCTGCTCCGAACGTGTACGGAGTAGCATAATGATGTTGGCAGTAATAAACTCCAGTATCGTCAGCCTCCACTGTGCTGATTCTCAGGGTG-3'
【００６９】
Ｋ-ＶＦ（配列番号４４）:5'-GGAAGATCTTCATGAGGTTCCCTTCTCAGCT-3'
Ｋ-ＶＲ（配列番号４５）:5'-GACAGCTGGCTGGGCATCAT-3'
【００７０】
（２） ＰＣＲ産物のクローニング
Ｐｒｏｍｅｇａ社製のＴ４リガーゼを使用し、ｐＧＥＭ-Ｔ Ｅａｓｙベクターに実施例６（１）で得られたＤＮＡ断片をそれぞれ実施例３（４）と同様にクロ-ニングした。得られたクロ-ンは実施例３（５）と同様の方法で塩基配列を決定し、実施例６（１）で設計した配列と同一であることを確認した。
【００７１】
（３） イヌ抗体κ鎖遺伝子の定常領域ｃＤＮＡのクローニング
イヌ免疫グロブリンκ鎖遺伝子、定常ドメインｃＤＮＡをクローニングするため既に報告されているイヌ免疫グロブリンκ鎖遺伝子の定常領域の塩基配列(特許２８１１０８９)を基にプライマ-ＣａＩｇｋ-Ｆ、ＣａＩｇｋ-Ｒオリゴヌクレオチドを合成した。下記にその配列を示す。
【００７２】
ＣａＩｇｋ-Ｆ（配列番号４６）:5'-AATGATGCCCAGCCAGCCGT-3'
ＣａＩｇｋ-Ｒ（配列番号４７）:5'-TTAGTCCACTCTCTGACACT-3'
【００７３】
まず、実施例３（１）で調製したＲＮＡの２μｇ分を鋳型とし、実施例４と同様にプライマーＣａＩｇｋ-Ｆ、ＣａＩｇｋ-Ｒを用いて、イヌ免疫グロブリンκ鎖遺伝子の定常領域ｃＤＮＡをクロ-ニングした。クロ-ニングした定常領域ｃＤＮＡを再び増幅し、可変領域ｃＤＮＡに連結させる、またはトランスファーベクターに組み込むことを考慮して特定の制限酵素サイトを付加した下記のプライマーＦｕＫＣ-Ｆ、Ｋ-ＣＲオリゴヌクレオチドを合成した。
【００７４】
ＦｕＫＣ-Ｆ（配列番号４８）:5'-AACCAAGGTGGAGCTCAAACGGAATGATGCCCAGCCAGCCGTC-3'
Ｋ-ＣＲ（配列番号４９）:5'-GGAAGATCTTTAGTCCACTCTCTGACACT-3'
【００７５】
次に、得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、ＬＡ-Ｔａｑポリメラーゼ（２．５Ｕ）と最終濃度各０．４μＭのプライマーＦｕＫＣ-ＦおよびＫ-ＣＲを使用して全量５０μｌにて９４℃３０秒、５８℃１分、７２℃２分を１サイクルとしたＰＣＲを２５サイクル行った。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで電気泳動し、約４００ｂｐのバンドを確認した。得られたＤＮＡ断片を実施例３（４）と同様にクロ-ニングし、得られたクロ-ンは実施例３（５）と同様の方法で塩基配列を決定し、目的の塩基配列を有することを確認した。
【００７６】
（４） イヌ化抗体κ鎖遺伝子の全長ｃＤＮＡの構築
実施例６（２）で得られたイヌ化抗体κ鎖可変領域ｃＤＮＡをクロ-ニングしたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ(Ｒｏｃｈｅ社)、ＳａｃＩ(ＴＡＫＡＲＡ社)で消化し、実施例６（３）で得られたイヌ免疫グロブリンκ鎖定常領域ｃＤＮＡをクロ-ニングしたプラスミドを制限酵素ＰｓｔＩ、ＳａｃＩで消化した。各ＤＮＡ断片は実施例３（４）と同様に、あらかじめＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩで消化したｐＧＥＭ-３Ｚｆ（＋）ベクター(ＡＢＩ社)とライゲーションし、クロ-ニングした。また、得られたプラスミドを実施例３（５）と同様の方法で塩基配列の確認をしたところ、目的の塩基配列を有するイヌ化κ鎖遺伝子ｃＤＮＡの全長がクロ-ニングされていた。イヌ化抗体κ鎖遺伝子ｃＤＮＡ全体の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号１９、２０に示す。また、構築過程を模式的に図６に示した。以降このプラスミドをｐＣＩｇκと呼ぶ。
【００７７】
実施例７： 抗イヌ免疫グロブリンウサギ抗血清の作製
（１） イヌ免疫グロブリンの精製
イヌの血清よりＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ ＦＦ １ｍｌカラム（Ａｍａｓｈａｍ社）を使用してイヌ免疫グロブリンを精製した。すなわち、イヌより採取した血清２ｍｌに等量の２×Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））を加えて撹拌した後、グラスフィルタ-（東洋濾紙社）にてろ過した。前処理した血清４ｍｌを５ｍｌの１×Ｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））で平衡化したカラムに通し、イヌ免疫グロブリンをカラムに結合させた。１０ｍｌの１×Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒでカラムを洗浄した後、２ｍｌのＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０））でイヌ免疫グロブリンを溶出した。溶出液に６００μｌの１Ｍ トリス-塩酸（ｐＨ９．０）を加えて中和し、免疫用抗原とした。
【００７８】
（２）免疫
免疫用抗原０．４ｍｌに等量のＦＣＡ（ヤトロン社）を混合し、２週間間隔で２羽のウサギに合計５回免疫した。５回目の免疫後、さらに２週間後にウサギより血液を採取し、血清を分離して抗イヌ免疫グロブリンウサギ抗血清を得た。
【００７９】
（３）ウエスタンブロッティング法による抗血清の検査
抗原に対する反応性はウエスタンブロッティング法により確認した。すなわち、免疫用抗原をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離後、ＰＶＤＦ膜(ミリポア社)へと転写し、その後、５％スキムミルクを含むＰＢＳで室温にて１時間ブロッキングを行った。上記で得られた抗イヌ免疫グロブリンウサギ抗血清は５％スキムミルクを含むＰＢＳで希釈し、ブロッキング処理した膜と室温で１時間反応させた後、ＰＢＳで１５分間の洗浄を２回行った。洗浄後、膜は５％スキムミルクを含むＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体(ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ)と室温で１時間反応させ、ＰＢＳで５分間の洗浄を３回行った。膜上のバンドの検出は３，３'-ジアミノベンジジン四塩酸塩１０ｍｇ（Ｓｉｇｍａ社製）を２０ｍｌのＰＢＳに溶解して３０％過酸化水素水を３２μｌを加えた溶液に浸して行った。イヌ免疫グロブリンの重鎖と軽鎖に相当する２本のバンドが確認された。
【００８０】
実施例８：組換えバキュロウイルスの作製
（１）バキュロウイルストランスファーベクターの構築
バキュロウイルストランスファーベクターとしてはｐＡｃＵＷ５１(ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社)を用いた。このベクターには２つのプロモーター領域（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎおよびＰ１０）があり、それぞれのプロモ-タ-の下流に接続された遺伝子を同時に発現させる。なお、ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎプロモーターの下流にはイヌ化抗体γ鎖ｃＤＮＡを、Ｐ１０プロモーターの下流にはイヌ化抗体κ鎖ｃＤＮＡを組み込んだ。
【００８１】
実施例６（４）で得られたｐＣＩｇγを制限酵素ＢａｍＨＩ(Ｒｏｃｈｅ社)で消化し、アガロース電気泳動後、切り出されたγ鎖ｃＤＮＡ部分を実施例４（４）と同様にしてアガロ-スゲルより回収し、あらかじめ制限酵素ＢａｍＨＩで消化したｐＡｃＵＷ５１とライゲ-ションし、クロ-ニングした。ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎプロモーターに対してｃＤＮＡが順方向に挿入されたクローンを選択し、プラスミドＤＮＡの抽出・精製を行った。得られたプラスミドは制限酵素ＢｇｌＩＩ(Ｒｏｃｈｅ社)で消化した後、実施例７（４）で得られたｐＣＩｇκをＢｇｌＩＩで消化して切り出されるイヌ化抗体κ鎖ｃＤＮＡ部分を上記と同様にして組み込んだ。Ｐ１０プロモーターに対してイヌ化抗体κ鎖ｃＤＮＡが順方向に挿入された３個のクローンを選択した。以上の構築過程を模式的に図７に示した。以降、このイヌ化抗体遺伝子のγ鎖、κ鎖両ｃＤＮＡを組み込んだトランスファーベクターをｐＣＩｇ-ＣＰＶ(クロ-ン１〜３)と呼ぶ。
【００８２】
（２） トランスフェクション
バキュロウイルスの宿主細胞としては昆虫細胞であるＳｆ２１ＡＥ細胞を用いた。Ｓｆ２１ＡＥ細胞は１０％牛胎児血清(ＦＢＳ)、０．２６％ ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｓｅ ｂｒｏｔｈ（ＤＩＦＣＯ社製）、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＧｒａｃｅ'ｓ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）で培養した。トランスファーベクターｐＣＩｇ-ＣＰＶと制限酵素により切断したバキュロウイルスゲノムＤＮＡとを宿主細胞であるＳｆ２１ＡＥ細胞へ同時にトランスフェクションすると、組換えが起こってｐＣＩｇ-ＣＰＶが組み込まれた遺伝子をもつ組換えバキュロウイルスが得られる。ゲノムが切断されたままのウイルスは増殖することができないため、この方法では相同組換えによりゲノムがつながった組換えウイルスが選択的に増殖する。
【００８３】
制限酵素Ｂｓｕ３６Ｉで切断したバキュロウイルスゲノムＤＮＡ、ＢａｃＰＡＫ６（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を２０ｎｇと実施例８（１）で得られた３クローンのｐＣＩｇ-ＣＰＶ各１μｇとを混合し、滅菌蒸留水で総量を８μｌとした。このＤＮＡ溶液と２倍希釈したリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）８μｌを混合し、１５分間室温にて静置した。あらかじめ１×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように６穴プレートに播種しておいたＳｆ２１ＡＥ細胞を無血清Ｇｒａｃｅ'ｓ培地で洗浄し、同じ培地を１ｍｌ加えた後、前記のＤＮＡ-リポフェクチン溶液を添加した。２７℃で一晩培養した後、１ｍｌの血清入り培地を加え、さらに２７℃で培養を続けた。
【００８４】
(３) プラッククローニング
培養上清に出現したウイルスより組換えウイルスをプラック法によりクローニングした。トランスフェクションから３日後、培養上清を培地で１０2、１０3、１０4倍希釈し、１×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように６穴プレートに播種しておいたＳｆ２１ＡＥ細胞にこのウイルス希釈液２００μｌを加えて１時間感染させた。ウイルス希釈液を除き、４５℃で保温しておいた１％のＳｅａ ｐｌａｑｕｅアガロース(ＦＭＣ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社)を含む培地を加えた後、３０分室温で静置して固めた。その上から培地を１ｍｌ加え、２７℃で３日間培養し、プラックが形成されていることを確認した後、０．０１％のニュートラルレッドを含むＰＢＳを滴下した。一晩２７℃で培養し、細胞の死滅により色の抜けているプラックを確認して印を付けた。印を付けたプラックをパスツールピペットで抜き取り、５００μｌの培地に懸濁し、さらに超音波処理をしてアガロースを破壊した。遠心でアガロースを沈殿させ、上清を１０2、１０3、１０4倍希釈して次のプラッククローニングに用いた。同じ行程をさらに２回繰り返し、計３回のプラッククローニングを行って各クローンにつき３つの組換えバキュロウイルスを得た。
【００８５】
(４) イヌ化抗体タンパク質の昆虫細胞での発現
組換えバキュロウイルス感染培養上清を用いて、組換えウイルスをＳｆ２１ＡＥ細胞に感染させ、３日後に感染細胞と培養上清を回収した。回収した感染細胞はＰＢＳで洗浄した後−３０℃に保存した。
【００８６】
感染細胞および培養上清中の発現タンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより解析したところ、組換えバキュロウイルス感染細胞の方にはイヌ化抗体γ鎖およびκ鎖遺伝子のアミノ酸配列から予想される分子量である約５２ｋＤと約３２ｋＤの位置にバンドが検出された。結果を図８に示した。また、感染細胞および培養上清中の発現タンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分離後、実施例６（３）と同様にして抗イヌ免疫グロブリンウサギ抗血清を用いたウェスタンブロッティング法で解析したところ、上記と同じ位置に２本の特異的なバンドが検出された。結果を図９に示した。これにより、イヌ化抗体γ鎖およびκ鎖が昆虫細胞内でタンパク質として発現したことが示された。
【００８７】
【発明の効果】
本発明は、抗体をイヌ化するための遺伝子素材およびアミノ酸配列情報を得るための方法を提供し、それらを組み合わせることにより、イヌに投与した場合に低抗原性である抗体応用医薬品を開発するための技術を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】イヌγ鎖クローン２のアミノ酸配列とイヌγ鎖Ａ、Ｂ、ヒトγ１〜４鎖、マウスγ鎖と整列させた。*はイヌγ鎖クローン２と同じアミノ酸であることを示す。
【図２】イヌκ鎖クローンのアミノ酸配列とヒト、マウス、ネコのκ鎖と整列させた。*はイヌκ鎖クローン２と同じアミノ酸であることを示す。
【図３】イヌλ鎖クローンのアミノ酸配列とヒト、マウス、ミンクのλ鎖と整列させた。*はイヌλ鎖クローン２と同じアミノ酸であることを示す。
【図４】イヌ化抗体重鎖可変領域のｃＤＮＡの合成過程を模式的に示した。また、ＰＣＲ産物1〜４をアガロース電気泳動した泳動パターンを示した。
【図５】イヌ化抗体κ鎖可変領域のｃＤＮＡの合成過程を模式的に示した。また、ＰＣＲ産物４をアガロース電気泳動した泳動パターンを示した。
【図６】イヌ化抗体γ鎖およびκ鎖ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＣＩｇκおよびｐＣＩｇγの構築過程を模式的に示した。
【図７】イヌ化抗体γ鎖およびκ鎖ｃＤＮＡを有するバキュロウイルストランスファープラスミドｐＣＩｇ-ＣＰＶの構築過程を模式的に示した。
【図８】組換えバキュロウイルスをＳｆ２１ＡＥ細胞に感染させ、その培養上清および細胞分画をＳＤＳ-ＰＡＧＥで解析した結果を示した。矢印は発現タンパク質を示している。
【図９】図８の電気泳動を抗イヌ免疫グロブリン抗血清を用いてウエスタンブロッティングにより解析した結果を示した。矢印は発現タンパク質を示している。
【配列表】
Claims (7)
- 配列番号２に示すイヌ免疫グロブリンκ遺伝子可変領域ドメインを有するアミノ酸配列、
配列番号４に示すイヌ免疫グロブリンλ遺伝子可変領域ドメインを有するアミノ酸配列、
および配列番号６、８、１０、１２に示すイヌ免疫グロブリンγ鎖遺伝子可変領域ドメインを有するアミノ酸配列をもとにイヌパルボウイルスに対する中和モノクローナル抗体のＣＤＲを移植して作成される、配列番号１７、１９に示す可変領域を持つことを特徴とするイヌ化抗体遺伝子。 - 請求項１に記載されたイヌ化抗体遺伝子の可変ドメインを、イヌで抗原性を示さない他のタンパク質遺伝子と融合してなることを特徴とする融合タンパク質遺伝子。
- 請求項２に記載された融合タンパク質遺伝子のうち、特に特異性がイヌパルボウイルスに対するものであることを特徴とする融合タンパク質遺伝子。
- 請求項１ないし３のいずれか１項に記載された遺伝子を真核細胞で発現することを特徴とする発現ベクター。
- 請求項１ないし３のいずれか１項に記載された遺伝子を真核細胞で発現することを特徴とするウイルスベクター。
- 請求項４または５に記載されたベクターを真核細胞に導入してイヌ化抗体タンパク質を生産することを特徴とするイヌ化抗体タンパク質の製造方法。
- 配列番号２に示すイヌ免疫グロブリンκ遺伝子可変領域ドメインを有するアミノ酸配列、
配列番号４に示すイヌ免疫グロブリンλ遺伝子可変領域ドメインを有するアミノ酸配列、
および配列番号６、８、１０、１２に示すイヌ免疫グロブリンγ鎖遺伝子可変領域ドメインを有するアミノ酸配列をもとにイヌパルボウイルスに対する中和モノクローナル抗体のＣＤＲを移植して作成される、配列番号１７、１９に示す可変領域を持つイヌ化抗体遺伝子によってコードされる、配列番号１８、２０に示すアミノ酸配列である可変領域を持つことを特徴とするイヌ化抗体タンパク質。
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