JP3339637B2 - Ｃｄｒをグラフトしたヒト化キメラｔ細胞抗体 - Google Patents

Ｃｄｒをグラフトしたヒト化キメラｔ細胞抗体

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトCD2を導入されたトランスジェニック
マウス（mouce transgenic for human CD2）由来の休止
Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞に結合し、該Ｔ細胞の増殖を
阻害し、また該Ｔ細胞を溶解するヒト化抗体に関する。
また、このような抗体の製造および該抗体を含有する薬
剤組成物に関する。
抗体は、典型的には、ジスルフィド結合によって連結
された二つの重鎖と、二つの軽鎖とを具備している。夫
々の軽鎖は、ジスルフィド結合によって重鎖に結合して
いる。夫々の重鎖の一端には、可変ドメインおよびこれ
に続く多くの定常ドメインを有している。夫々の軽鎖
は、一端に可変ドメインを有し、他端に定常ドメインを
有している。この軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ド
メインと整合するように並べられている。軽鎖の定常ド
メインは、重鎖の最初の定常ドメインと整合するように
並べられている。軽鎖および重鎖の定常ドメインは、該
抗体の抗原に対する結合には直接関与しない。
軽鎖および重鎖の夫々の対における可変ドメインは、
抗原結合部位を形成する。軽鎖および重鎖の該ドメイン
は同一の一般構造を有しており、夫々のドメインは、四
つのフレームワーク領域（配列は比較的保存されてい
る）と、これらを連結する三つの相補性決定領域（CD
R）とを具備している。この四つのフレームワーク領域
は大略βシートコンホメーションをとっており、CDRは
該βシート構造を連結するループ（場合によってはβシ
ート構造の一部も）を形成している。これらCDRは、フ
レームワーク領域によって他のCDRに極めて近接した状
態で保持されており、抗原結合部位の形成に寄与してい
る。抗体のCDRおよびフレームワーク領域は、Kabat et
al.（「免疫学的に興味あるプロモータの配列」;US Dep
t.of Health and Human Services,US Government Print
ing Office,1967）によって決定され得る。
変異抗体（該抗体可変ドメインのCDRがフレームワー
クとは異なった種に由来する）の製造が、EP−Ａ−0239
400に開示されている。該CDRは、ラット・モノクローナ
ル抗体またはマウス・モノクローナル抗体から誘導れ得
る。この変異抗体における可変ドメインのフレームワー
ク及び定常ドメインは、ヒト抗体から誘導され得る。こ
のようなヒト化抗体は、ラット抗体またはマウス抗体に
対してヒトが示す免疫応答に比較すると、ヒトに投与さ
れたときに殆ど無視し得る免疫応答しか誘起しない。ヒ
ト化CAMPATH−１抗体（Campathはウエルカム・ファウン
デーション社の商標である）が、EP−Ａ−0328404に開
示されている。
ヒトＴ細胞は免疫応答の調節に重要な役割を果たす。
従って、抗Ｔ細胞抗体は、イン・ビボ投与されたときに
免疫抑制剤となり得る。その結果として、このような抗
体は、例えば移植／宿主障害、移植拒絶反応、並びにリ
ューマチ性関節炎の治療に有用であり得る。
抗Ｔ細胞抗体である非ヒト・モノルローナル抗体が作
製されている。しかし、非ヒト・モノクローナル抗体は
ヒト補体を特に良好に固定せず、ヒト患者に注射された
ときに免疫原となる。WO 89/09622には、ヒト定常ドメ
イン及びマウス可変ドメインで構成されたキメラ抗体が
提案されている。しかし、顕著な免疫原性の問題は未解
決のままである。
本発明の一つの側面に従えば、ヒト化抗体であって、
そのCDRのアミノ酸配列が、ヒトCD2を導入されたトラン
スジェニックマウス由来の休止Ｔ細胞および活性化Ｔ細
胞に結合し、該Ｔ細胞の増殖を阻害し、且つ該細胞を溶
解するような特異性を有するモノクローナル抗体のCDR
配列に由来し、また夫々のCDRのアミノ酸配列が充分に
保存されていている結果、上記と同じ特異性が与えられ
ているヒト化抗体が提供される。
本発明の別の側面に従えば、ヒト化抗体であって、該
抗体がヒトＴ細胞抗原に結合できるように、夫々のCDR
の下記アミノ酸配列が充分に与えられるヒト化抗体が提
供される。
軽鎖:CDR1（配列ID番号３および４） CDR2（配列ID番号５および６） CDR3（配列ID番号７および８） 重鎖:CDR1（配列ID番号11および12） CDR2（配列ID番号13および14） CDR3（配列ID番号15および16） 該抗体は、好ましくは天然抗体またはそのフラグメン
トの構造を有する。従って、該抗体は完全抗体、（Fa
b′）２フラグメント、Fabフラグメント、軽鎖二量体ま
たは重鎖二量体であり得る。該抗体はIgG1、IgG2、IgG3
もしくはIgG4のようなIgG、またはIgM、IgA、IgEもしく
はIgDであり得る。抗体重鎖の定常ドメインは適宜選択
される。軽鎖定常ドメインは、カッパ定常ドメイン又は
ラムダ定常ドメインであり得る。
該抗体は、WO 86/01533に開示されたタイプのキメラ
抗体であり得る。WO 86/01533に従うキメラ抗体は、抗
原結合領域および非免疫グロブリン領域を具備してい
る。この抗原結合領域は、抗体の軽鎖可変ドメインおよ
び／または重鎖可変ドメインである。典型的には、該キ
メラ抗体は軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを具
備している。前記の非免疫グロブリン領域は、この抗原
結合領域のＣ末端に融合される。この非免疫グロブリン
領域は、典型的には非免疫グロブリンタンパクであり、
酵素領域、公知の結合特異性を有するタンパク由来の領
域、タンパク毒素由来の領域、または遺伝子によって発
現される何れかのタンパクに由来する領域であり得る。
この非免疫グロブリン領域は糖鎖領域であってもよい。
該キメラ抗体の二つの領域は、開裂可能なリンカー配列
を介して連結され得る。
軽鎖CDR1〜３（配列ID番号３〜８）および重鎖CDR1〜
３（配列ID番号11〜16）は、抗ヒトＴ細胞抗体YTH655
（５）６のCDRである。このYTH655（５）６はラットIgG
2bモノクローナル抗体であり、ヒトCD2を導入されたト
ランスジェニックマウス由来の休止Ｔ細胞および活性化
Ｔ細胞に結合し、該Ｔ細胞の増殖を阻害し、該Ｔ細胞を
溶解する。ヒト化YTH655抗体の特異性は、ヒトCD2を導
入されたトランスジェニックマウス由来の休止Ｔ細胞お
よび活性化Ｔ細胞に結合し、該Ｔ細胞の増殖を阻害し、
且つ該Ｔ細胞を溶解する能力によって決定され得る。
ヒト化抗体のCDRは、適切には上記の軽鎖CDR1〜３お
よび重鎖CDR1〜３である。しかし、これらCDRのアミノ
酸配列は変更され得る。各CDRのアミノ酸配列は、アミ
ノ酸の置換、挿入および／または削除によって最大40％
まで（例えば30％まで、20％まで若しくは10％まで）変
更され得る。
従って、夫々のCDRには、アミノ酸の置換、挿入およ
び／または削除が一つ又は二つ含まれ得る。軽鎖CDR3ま
たは主鎖CER3には、アミノ酸の置換、挿入および／また
は削除が三つまで存在し得る。軽鎖CDR1には、アミノ酸
の置換、挿入および／または削除が四つまで存在し得
る。主鎖CDR2には、アミノ酸の置換、挿入および／また
は削除が六つまで存在し得る。好ましくは、各CERのア
ミノ酸配列は、抗Ｔ細胞抗体YTH655（５）６における各
CDRのアミノ酸配列に対して実質的な相同性を有してい
る。
当該抗体のフレームワーク及び定常ドメインは、ヒト
・フレームワーク及びヒト定常ドメインである。好まし
くは、抗体重鎖における可変ドメインのフレームワーク
は、ヒト・タンパクKOLの対応するフレームワーク（Sch
midt et al.,Hoppe−Seyler's Z.Physiol.Chem.,364:71
3−747,1983）に対して実質的な相同性を有している。
フレムワークに関するKOLとの相同性は、一般に80％以
上（例えば90％以上または95％以上）である。アミノ酸
の置換、挿入および／または削除が数多く存在し得る。
例えば、フレームワーク４の第七残基は適切にはThr又
はLeu、好ましくはLeuである。Kabat et al.,1987によ
れば、この残基はKOLの残基109である。結合を修復する
ために成され得る他のフレームワーク変更には、アミノ
酸残基27,30,48,66,67,71,91,93及び94が含まれる。ア
ミノ酸のナンバリングはKabat et al.に従う。
抗体軽鎖における可変ドメインのフレームワークは、
典型的には、タンパクHSIGKVIIの可変ドメイン・フレー
ムワーク（EMBLデータベース:Klobeck,H.G.,EMBL data
library submitted 7th April,1986）に対して実質的な
相同性を有している。この配列には452位にフレームシ
フトが存在する。読取り枠（reading frame）を修正す
るために、塩基452（Ｔ）の削除がなされた。フレーム
ワークに関するHSIGKVIIとの相同性は、一般に80％以上
（例えば90％以上または95％以上）である。例えば、Ka
bat et al.のナンバリングに従ったアミノ酸残基71にお
けるように、アミノ酸の置換、挿入および／または削除
が数多く存在し得る。
ヒト化抗体は、本発明に従う方法によって製造され
る。この方法は、ヒト化抗体の軽鎖をコードする第一発
現ベクター並びにヒト化抗体の重鎖をコードする第二発
現ベクターで形質転換された宿主を、夫々の鎖が発現さ
れる条件下で維持することと、こうして発現された鎖の
組み立てによって形成されたヒト化抗体を単離すること
とを具備する。
第一および第二の発現ベクターは同じベクターであり
得る。更に、本発明は次のものを提供する。
・ヒト化抗体の軽鎖または重鎖をコードする配列を有す
るDNA。
・前記DNA配列を組み込んだ発現ベクター。
・前記発現ベクターで形質転換された宿主。
抗体の夫々の鎖は、CDR置換によって製造され得る。
得られた抗体が休止Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞に結合で
きるように、ヒト抗体の軽鎖または重鎖における可変ド
メインのCDRが、YTH655の夫々のCDRの充分なアミノ酸配
列によって置換される。ヒト抗体鎖の超可変領域をコー
ドするDNAのCDRコード領域が、望ましいCDRをコードす
るDNAによって置き換えられる。適切な場合には、この
変異DNAは抗体鎖の定常ドメインをコードするDNAに連結
される。該DNAは発現ベクター中にクローン化される。
この発現ベクターは適合する宿主細胞中に導入され、該
細胞は抗体鎖が発現されるような条件下で培養される。
この方法で同時発現された相補的な抗体鎖は、次いで組
み立てられ、ヒト化抗体が形成され得る。
モノクローナル抗体をヒト化するための四つの一般的
ステップが存在する。即ち、 （１）出発抗体の軽鎖および重鎖における可変ドメイン
のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を決定する
こと。
（２）ヒト化抗体を設計すること、即ち、ヒト化プロセ
スの際に何れの抗体フレームワークを使用するかを決定
すること。
（３）現実のヒト化方法論／技術 （４）トランスフェクション及びヒト化抗体の発現。
＜ステップ１＞： 抗体の軽鎖および重鎖における可変ドメインのヌクレオ
チド配列および推定アミノ酸配列の決定 抗体をヒト化するためには、抗体の重鎖および軽鎖に
おける可変領域のみが必要であることが知られている。
定常ドメインの配列は、再構成ストラテジーに寄与しな
いので関係がない。抗体の可変ドメインにおけるアミノ
酸配列を決定する最も単純な方法は、重鎖および軽鎖の
可変ドメインをコードするクローン化されたcDNAから決
定することである。
与えられた抗体の重鎖および軽鎖における可変ドメイ
ンのcDNAをクローニングするためには、二つの一般的な
方法がある。即ち、（１）従来のcDNAライブラリーを介
する方法、または（２）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
を介する方法である。これらの方法は、両者共に広く知
られている。該cDNAのヌクレオチド配列が与えられれ
ば、この情報を、抗体可変ドメインの推定アミノ酸配列
に翻訳することは簡単なことである。本発明の例におい
て、YTH655（５）６のヌクレオチド配列および推定アミ
ノ酸配列は、配列ID番号１および２（軽鎖）、並びに配
列ID番号９および10（重鎖）に示されている。
＜ステップ２＞： ヒト化抗体の設計 ヒト化に際して何れのヒト抗体配列を使用するかを決
定する場合、考慮すべき幾つかの因子が存在する。軽鎖
および重鎖のヒト化は相互に独立して考慮されるが、夫
々についての論拠は基本的に同様である。
この選別プロセスは次の論理に基づいている。即ち、
与えられた抗体の抗原特異性および抗原親和性は、主に
可変ドメインにおけるCDRのアミノ酸配列によって決定
される。可変ドメインのフレームワーク残基による直接
の寄与は、極めて小さいか、或いは全くない。フレーム
ワーク領域の主要な機能は、複数のCDRを、抗体を認識
するための適切な空間的配向（orientation）で保持す
ることである。従って、ヒト可変ドメインのフレームワ
ークがゲッ歯類の可変ドメイン（ゲッ歯類CDRの起源）
に対して高度の相同性を有しているならば、ゲッ歯類の
CDRをヒト可変ドメインのフレームワーク中に置換する
ことが、その正しい空間的配向を最も保持し易いように
思える。従って、ヒト可変ドメインは、YTH655の可変ド
メインに対して高度の相同性を有するように、好ましく
選択されなければならない。
適切なヒト抗体の可変ドメイン配列は、次のようにし
て選択される。
1.コンピュータ・プログラムを用いることにより、YTH6
55抗体の可変ドメインに対して最も相同性の高いヒト抗
体の可変ドメイン配列について、全ての入手可能なタン
パク（およびDNA）のデータベースを調査する。適切な
プログラムの出力は、YTH655抗体に対して最も相同性の
高い配列、各配列に対する相同性パーセント、およびゲ
ッ歯類配列に対する各配列の整列に関するリストであ
る。これは、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメイン配列
について独立に行なわれる。ヒト免疫グロブリンの配列
のみが含まれているとすれば、上記の分析はもっと容易
に達成される。
2.ヒト抗体における可変ドメインの配列を列記し、相同
性を比較する。最初に、CDRの長さ（変化が著しい重鎖
のCDR3を除く）を比較する。ヒトの重鎖、並びにカッパ
軽鎖およびラムダ軽鎖をサブグループに分割する；重鎖
は３つのサブグルーブ、カッパ鎖は４つのサブグルー
プ、ラムダ鎖は６つのサブグループである。CDRの寸法
は、各サブグループ内では同様であるが、サブグループ
間では変化する。YTH655抗体のCDRを、相同性の一次近
似として、ヒト・サブグループの一つに適合させること
が通常は可能である。次いで、同様の長さのCDRを有す
る抗体が、アミノ酸配列の相同性について比較される。
この比較は、特にCDR内において行なわれるが、周囲の
フレームワーク領域においても行なわれる。最も相同性
の高いヒト可変ドメインが、ヒト化のためのフレームワ
ークとして選ばれる。
＜ステップ３＞： 現実のヒト化方法論／技術 EP−Ａ−0239400に従い、所望のCDRをヒト・フレーム
ワークにグラフトすることによって、抗体はヒト化され
得る。従って、所望の再構成された抗体をコードするDN
A配列は、そのCDRを再構成しようとするヒトDNAを用い
て開始することにより作製され得る。所望のCDRを含む
ゲッ歯類の可変ドメインにおけるアルミ酸配列が、選択
されたヒト抗体の可変ドメイン配列と比較される。ヒト
可変領域にゲッ歯類CDRを組み込むために、ゲッ歯類の
対応残基に変える必要があるヒト可変ドメイン残基がマ
ークされる。また、ヒト配列中の置換すべき残基、該配
列に追加すべき残基または該配列から削除すべき残基も
存在し得る。
ヒト可変ドメインを突然変異化して所望の残基を含ま
せるために用いることができるオリゴヌクレオチドが合
成される。これらオリゴヌクレオチドは、何れか都合の
よい大きさとすることができる。通常は、入手可能な特
定の合成機で合成可能な長さにおいてのみ制限される。
オリゴヌクレオチドに指令されたイン・ビトロでの突然
変異誘発法は、広く知られている。
或いは、WO 92/07075の組換ポリメラーゼ連鎖反応法
（PCR）を用いてヒト化を達成してもよい。この方法論
を用いると、ヒト抗体のフレームワーク領域の間のCDR
がスプライスされる。
一般に、英国特許出願第9022011.2号の技術は、二つ
のヒト・フレームワーク領域（ABおよびCD）並びにその
間のCDR（ドナーCDRによって置換されるべきもの）を具
備したテンプレートを用いて行なわれる。プライマーＡ
およびプライマーＢはフレームワーク領域ABを増幅する
ために用いられ、プライマーＣおよびプライマーＤはフ
レームワーク領域CDを増幅するために用いられる。しか
し、プライマーＢおよびプライマーＣの夫々の５′末端
には、ドナーCDR配列の全部または少なくとも一部に対
応した追加の配列が含まれている。プライマーＢおよび
プライマーＣは、PCRが行なわれ得る条件下において、
これらの５′末端が相互にアニールされるに充分な長さ
で重なる。従って、増幅された領域ABおよびCDは、オー
バーラップおよび伸長による遺伝子スプライシングを受
け、単一の反応でヒト化された生成物が製造される。
＜ステップ４＞： トランスフェクションおよび再構成抗体の発現 抗体を再構成するための突然変異誘発反応に続いて、
変異誘発されたDNAは、軽鎖または重鎖の定常ドメイン
をコードする適切なDNAに連結され、発現ベクター中に
クローン化され、宿主細胞（好ましくは哺乳類細胞）中
にトランスフェクトされ得る。これらのステップは、常
法に従って行なうことができる。従って、再構成抗体は
下記（ａ）〜（ｄ）を具備したプロセスによって製造さ
れ得る： （ａ）Igの重鎖または軽鎖の少なくとも可変ドメインを
コードするDNA配列に操作可能に連結された適切なプロ
モータを含み、該可変ドメインがヒト抗体由来のフレー
ムワーク領域および本発明のヒト化抗体に要求されるCD
Rを具備する。第一の複製可能な発現ベクターを調製す
ること。
（ｂ）相補的Igの軽鎖および重鎖の少なくとも可変ドメ
インを夫々コードするDNA配列に操作可能に連結された
適切なプロモータを含む、第二の複製可能な発現ベクタ
ーを調製すること。
（ｃ）細胞ラインを、上記で調製された第一のベクター
または両方のベクターで形質転換すること。
（ｄ）前記形質転換された細胞ラインを培養し、前記変
異抗体を製造すること。
好ましくは、ステップ（ａ）におけるDNA配列は、ヒ
ト抗体鎖の該可変ドメインと、該定常ドメイン又は夫々
の定常ドメインとの両方をコードする。このヒト化抗体
は回収され、精製され得る。変異抗体を産生するように
形質転換される細胞ラインは、チャイニーズハムスター
卵巣（CHO）細胞ライン、または不死化された哺乳類細
胞ライン（中でもミエローマ、ハイブリドーマ、トリオ
ーマ（trioma）またはクワドローマ（quadroma）細胞ラ
インのようなリンパ起源のものが有利）であり得る。こ
の細胞ラインはまた、ウイルス（例えばエプスタインバ
ー・ウイルス）での形質転換により不死化されたＢ細胞
のような、正常なリンパ球であってもよい。最も好まし
くは、この不死化された細胞ラインはミエローマ細胞ラ
イン又はその誘導体である。
ヒト化抗体の製造に用いられる細胞ラインは好ましく
は哺乳類細胞ラインであるが、その代わりに、他の何れ
かの適切な細胞ライン、例えばバクテリア細胞ライン又
は酵母細胞ラインを用いてもよい。単一の抗体鎖につい
ては、E.Coli由来のバクテリア株を用い得ることが予想
される。得られた抗体は機能をチェックされる。もし機
能が喪失していれば、ステップ（２）に戻って抗体のフ
レームワークを変更する必要がある。
発現された本発明の全抗体、その二量体、個々の軽鎖
および重鎖、または他の免疫グロブリン形は、硫酸アン
モニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマト
グラフィー、ゲル電気泳動等のような当該技術における
標準的な手法（一般には、Scopes,R.,Protein Purifica
tion,Springer−Verlag,N.Y.（1982）を参照のこと）に
従って精製することができる。薬剤としての用途に使用
するためには、少なくとも約90％〜95％の均一性をもっ
た実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、98％〜99
％以上の均一性をもったものが最も好ましい。部分的に
又は所望の均一さにまで精製されたら、ヒト化抗体は治
療的に用いられ、或いは免疫蛍光染色等の試験操作の開
発および実施に用いられ得る（一般には、Immunologica
l Methods,Vol.I and II,Lefkovits and Pernis,eds.,A
cademic Press,New York,N.Y.（1979 and 1981）を参照
のこと）。
ヒトＴ細胞抗原特異性の抗体の典型的な用途は、Ｔ細
胞に媒介された疾病状態の治療にある。一般に、疾病に
関連する細胞がＴ細胞抗原を有するものであると同定さ
れた場合は、該Ｔ細胞抗原に結合できるヒト化抗体が適
切である。例えば、治療に適した典型的な疾病状態に
は、心臓、肺、腎臓、肝臓等の臓器移植を受けた患者に
おける移植／宿主病および移植拒絶が含まれる。他の疾
病には自己免疫疾患、例えばＩ型糖尿病、多発性硬化
症、リウマチ性関節炎、全身性紅班性狼瘡および重症筋
無力症が含まれる。
本発明のヒト様抗体はまた、他の抗体と組み合わせ
て、特に、疾病の原因細胞表面の他のマーカーと反応す
るヒトモノクローナル抗体と組み合わせて使用され得
る。適切なＴ細胞マーカーには、例えば、第１回国際白
血球分化ワークショップにより命名された、所謂「分化
群（Clusters of Differentiation）」に分類されたも
のが含まれる（Leukocyte Typing,Bernard,et al.,Ed
s.,Springer−Verlag,N.Y.（1984））。
この抗体はまた、化学療法剤または免疫抑制剤と関連
して別途投与される組成物としても使用され得る。典型
的には、この薬剤には、シクロスポリンＡまたはプリン
類縁体（例えばメソトレキセート、６−メルカプトプリ
ン等）が含まれるが、それ以外にも、当業者に周知の多
くの薬剤（例えばシクロホスファミド、プレドニゾン
等）もまた用いられ得る。
本発明の抗体は免疫毒素の一部を形成する。免疫毒素
は二つの成分によって特徴づけられ、イン・ビトロまた
はイン・ビボにおいて、選択された細胞を死滅させるた
めに特に有用である。一つの成分は細胞毒素剤であり、
通常、これを付着しまたは吸収した細胞は死に至る。
「デリバリー担体」として知られる第二の成分は、毒素
剤を特定の細胞タイプ、例えば悪性腫瘍を構成する細胞
へ運ぶための手段を提供する。この二つの成分は、普通
は、種々の周知の化学的手法の何れかによって一緒に結
合される。例えば、細胞得剤が蛋白であり、第二成分が
完全な免疫グロブリンであるとき、この結合はヘテロ二
官能架橋剤（例えばSPDP、カルボジイミド、グルタルア
ルデヒド等）によって行なわれ得る。当該技術において
種々の免疫毒素が周知であり、例えば「モノクローナル
抗体／毒素複合体：魔法の弾丸を目指して」（Thorpe e
t al.,Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine,A
cademic Press,pp.168−190（1982））中に見出すこと
ができる。
免疫毒素としての用途に適した種々の細胞毒剤があ
る。細胞毒剤には、放射性核種（例えばヨウ素−131、
イットリウム−90、レニウム−188及びビスマス−21
2）；多くの化学療法剤（例えばビンデシン、メソトレ
キセート、アドリアマイシン及びシスプラチン）；細胞
毒タンパク（例えばポークウィード抗ウイルスタンパ
ク、シュードモナスエキソトキシンＡ、リシン、ジフテ
リア毒素、リシンＡ鎖等のようなリボゾーム阻害タンパ
ク、或いはホスホリパーゼ酵素（例えばホスホリパーゼ
Ｃ）のような細胞表面で活性なタンパク）が含まれる。
一般的には、「キメラ毒素」（Olsnes and Phil,Pharma
c.Ther.,25:335−381（1982））並びに「癌の検出およ
び治療のためのモノクローナル抗体」（eds.Baldwin an
d bayers,pp.159−179,224−266,Academic Press（198
5））を参照されたい。
免疫毒素のデリバリー成分は、本発明によるヒト化抗
体である。完全な免疫グロブリン又はFabのようなその
結合性フラグメントが好ましく用いられる。典型的に
は、免疫毒素における抗体は、ヒトIgA、IgMまたはIgG
アイソタイプであろうが、所望に応じて他の哺乳類定常
ドメインが利用され得る。
本発明は更に、薬剤的に許容され得るキャリアまたは
稀釈剤と、活性成分としての本発明によるヒト化抗体と
を含有する薬剤組成物を提供する。この組成物は、本発
明に従う免疫毒素を含有してもよい。本発明のヒト化抗
体、免疫毒素およびその薬剤組成物は、非経腸的投与
（即ち皮下投与、筋肉内投与または静脈内投与）に特に
有用である。
非経腸的投与のための組成物は共通して、許容可能な
キャリア（好ましくは水性キャリア）中に溶解された抗
体の溶液またはそのカクテルからなっている。種々の水
性キャリア（例えば水、緩衝水、0.4％生理食塩水、0.4
％グリシン等）を使用することができる。これら溶液は
滅菌されており、また一般には粒子物質を含まない。こ
れら組成物は、従来周知の滅菌技術によって滅菌され得
る。該組成物は、生理学的条件に近似させるために必要
とされる、pH調節および緩衝剤、毒性調節剤等のような
薬剤的に許容可能な任意成分、例えば酢酸ナトリウム、
塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸
ナトリウム等を含有してもよい。これら処方中の抗体濃
度は、例えば、約0.5重量％未満から、通常は約１重量
％以上、最大で15重量％または20重量％までと広範に変
化させることができ、選択された投与方法に従い、主に
液体容量、粘度等に基づいて選択される。
筋肉注射のための典型的な薬剤組成物は、1mlの滅菌
緩衝水および50mgの抗体を含有するように調製すること
ができる。精製注射のための典型的な薬剤組成物は、25
0mlの滅菌リンゲル溶液および150mgの抗体を含有するよ
うに調製することができる。非経腸的に投与可能な組成
物を調製するための実際の方法は、当業者にとっては公
知もしくは明らかであり、例えばRemington's Pharmaci
utical Science,15th ed.,Mack Publisheng Company,Ea
ston,Pennsylvania（1980）の中により詳細に説明され
ている。
本発明の抗体は凍結乾燥して貯蔵し、使用に先立っ
て、適切なキャリア中で再生することができる。この技
術は、従来の免疫グロブリンについて有効であることが
示されている。適切な凍結乾燥および再生技術は何れも
用いることができる。当業者は、凍結乾燥および再生に
よって種々の程度での抗体活性の喪失がもたらされ（例
えば、従来の免疫グロブリンでは、IgM抗体はIgG抗体よ
りも活性喪失が大きくなる傾向がある）、使用レベルを
調節して補償しなければなければならないことを理解す
るであろう。
本発明のヒト様抗体を含有する組成物またはそのカク
テルは、予防および／または治療のために投与され得
る。治療的適用において、組成物は、既に疾病に履患し
ている患者に対し、該疾病およびその合併症を治癒し、
または少なくとも部分的に抑制もしくは緩和するために
充分な量で投与される。これを達成するのに充分な量
は、「治療的有効投与量」と定義される。この用途のた
めの有効量は、感染の重篤度および患者自身における免
疫系の一般状態に依存するが、一般的には１回の投与量
当たりの抗体量は約１〜約200mgであり、より普通には
患者当たり５〜25mgの投与量が用いられる。本発明の物
質は一般に、深刻な疾病状態、即ち生命が脅かされ若し
くは生命が脅かされる可能性のある状態に用いられるこ
とに留意しなければならない。このような症例において
は、外因性物質を最小限とし、また「外来物質」拒絶の
可能性を低減する（これは本発明のヒト様抗体によって
達成される）という観点から、実質的に過剰量のこれら
抗体を投与することが可能であり、また主治医はそれを
望ましいと思うかも知れない。
予防的適用において、本発明の抗体を含有する組成物
またはそのカクテルは、患者の抵抗力を高めるために、
未だ疾病自体にない患者に投与される。このような投与
量は「予防的有効投与量」と定義される。この用途にお
いても、精密な量は患者の健康状態および免疫の一般的
レベルに依存するが、一般的には１回の投与量当たりの
抗体量は0.1〜25mgの範囲であり、特に患者当たり0.5〜
2.5mgの投与量が用いられる。好ましい予防的用途は、
腎臓移植拒絶の防止である。
当該組成物の一回投与または多回数投与は、主治医が
選択した投与量レベルおよびパターンで行なわれる。何
れにしても、薬剤処方は、患者を効果的に治療するため
に充分な量の本発明の抗体を与えなければならない。
本発明のヒト様抗体は更に、イン・ビトロにおける広
範な有用性を有し得る。例を挙げると、典型的な抗体
は、Ｔ細胞をタイピングするため、特異的YTH655抗原を
有する細胞または該受容体のフラグメントを単離するた
め、並びにワクチンの製造等のために利用することがで
きる。
診断目的において、当該抗体はラベルされてもよく、
或いはラベルされなくてもよい。ラベルされない抗体
は、該ヒトか抗体と反応するラベルされた他の抗体（第
二抗体）、例えばヒト免疫グロブリンの定常領域に特定
的なラベルされた抗体と組み合わせて用いることができ
る。或いは、該抗体を直接ラベルすることもできる。放
射性核種、蛍光体、酵素、酵素基質、酵素共因子、酵素
阻害剤、リガンド（特にハプテン）等のような広範なラ
ベルが使用され得る。多種類の免疫検定が利用可能であ
り、これら免疫検定は当業者に周知である。
細胞活性に対する保護、または細胞活性もしくは選択
された抗原の存在の検出において、本発明の抗体と共に
使用するためのキットも提供される。即ち、本発明のヒ
ト化抗体は、単独または所望の細胞タイプに特異的な追
加の抗体と共に、通常は容器内の凍結乾燥された形態で
提供されてもよい。抗体は、ラベルまたは毒素に結合さ
れても結合されなくてもよい。また、該抗体は緩衝液
（例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液
等）、安定剤、殺菌剤、不活性タンパク（例えば血清ア
ルブミン）等の、および使用説明書のセットと共にキッ
トに含められる。これらは、活性抗体の量を基準にし
て、一般的には約５重量％未満、通常は全量で少なくと
も約0.001重量％で存在せしめる。しばしば、活性成分
を稀釈するための不活性な増量剤または賦形剤を含める
のが望ましく、その場合、賦形剤は全組成物の約１〜99
重量％で存在せしめ得る。当該キメラ抗体に結合できる
第二抗体を試験または検定に用いる場合、通常はこれを
別の瓶に収容する。この第二抗体は典型的にはラベルに
結合され、上記の抗体処方と同様にして処方される。
図 1: MR14細胞に対するヒト化YTH655の結合 ヒト化YTH655（HUMCD2）の活性が、MF14と称する活性
化Ｔ細胞ラインを用いたFACSによって試験された。ヒト
IgG1の定常ドメインおよびYTH655の可変ドメインを含む
キメラYTH655（CHIMCD2）が、対照として用いられた。
細胞は先ず、キメラYTH655またはヒト化YTH655と共にイ
ンキュベートされた。洗浄の後、細胞は商業的に入手可
能な抗ヒトFITCと共にインキュベートされ、次いでFACS
（fluorescence activated cell sorter）によって分析
された。図は、ヒト化YTH655の結合性がキメラYTH655の
結合性と等価であること、並びにヒト化YTH655の結合が
力価測定され得ることを示している。従って、ヒト化モ
ノクローナル抗体の抗原特異性は維持されていた。
以下の実施例は、本発明を例示するものである。
YTH655抗体Ｈ鎖のクローニングと配列決定 YTH655抗体のVH領域をコードするcDNAを、ポリメラー
ゼ連鎖反応（PCR）に基づく方法（Orlandi et al.,PNAS
USA,86:3833−3837,1989）をいくらか変更した方法を
用いて単離した。全RNAが、グアニジンチオシアネート
法（Chirgwin et al.,Biochemistry,18:5294,1979）に
よってハイブリドーマ細胞から単離された。また、ポリ
（Ａ）+RNAは、全RNAをポリＵセファロース4Bカラム（P
harmacia,Milton Keynes,U.K.）に通し、溶出させるこ
とにより単離された。第一鎖を合成するために、５μｇ
のポリ（Ａ）+RNAを、250μＭの各dNTP、10mMのジチオ
スレイトール、50mMのトリスHCl（42℃でpH8.2）、10mM
・MgCl2、100mM・KCl、10ピコモルのVHドメインに対し
て特異的なプライマーVH1FOR［５′−ｄ（TGA GGA GAC
GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G］、およびジエチ
ルピロカルボネート（DEPC）処理した蒸留水と合体し、
24μｌとした。これを70℃で10分間加熱し、その後42℃
で10分間加熱した後、23単位のスーパーRT（AMV逆転写
酵素;Anglia Biotec,colchester,UK）を加えた。これを
42℃で１時間反応させた。
引き続くPCR増幅において、50μｌのPCR増幅反応液
は、５μｌの第一鎖合成反応液（未精製）、500μＭの
核dNTP、67mMのトリスHCl（25℃でpH8.8）、17mM・NH4S
O4、10mM・MgCl2、20μg/mlのゼラチン、５単位のTAQ・
DNAポリメラーゼ（Koch−Light,Haverhill,U.K.）、25
ピコモルのプライマーVH1FORと、25ピコモルの混合プラ
イマーVH1BACK［５′−ｄ（AGG T（CG）（CA）Ａ（GA）
CTGC AG（GC）AGT C（TA）G G］からなっていた。反応
液をミネラルオイル層で覆った後、Techne・PHC−１プ
ログラマブルサイクリックリアクターを用いて、95℃で
1.5分間（変性）、50℃で３分間（アニーリング）およ
び72℃３分間（伸長）のサイクルで30サイクル反応させ
た。最後のサイクルには、10分間の伸長時間を含めた。
サンプルを−20℃で凍結し、ミネラル油（−20℃で粘
性の液体）を吸引で除去した。水相を解凍し、２％アガ
ロースで電気泳動した後に、350bpのPCR生成物を精製し
た。このPCR生成物を、Pst I及びBstE IIの二つで切断
した。当初、これをベクターM13VH・PCR1（Orlandi et
al.,1989）のPst I及びBstE II制限部位にクローニング
した。しかし、作成したクローンの配列をジデオキシチ
ェーンターミネーション法（Sanger et al.,PNAS USA 7
4:5463−5467,（1977））で調べたところ、YTH655VH遺
伝子は、CDR2とCDR3の間のフレームワーク領域に位置し
た内部Pst I制限部位を含むことがわかった。代りのク
ローニング方法として、該PCR生成物をPst Iのみで消化
し、M13mp18（Yanisch−Perron et al.,Gene 33,103−1
19,1985）のPst I部位にクローニングした。続いて、M1
3mp18からPst Iフラグメントを単離し、これをM13VHPCR
1（VHPst I−BstE IIフラグメントを含む）のPst I部位
にクローニングすることにより、完全なVH遺伝子を再構
築した。Pst Iフラグメントの正確な配置（orientatio
n）は、ジデオキシ配列分析によって決定された。最後
に、YTH655VH遺伝子が内部Pst I部位を一つだけ含むこ
と（即ち、段階的ローニング方法の結果としてDNAがま
ったく失われていないこと）を確かめるために、該部位
を含む60bpフラグメントがクローニングされ、配列が決
定された。この60bpのフラグメントは、VH・PCR生成物
をXnm I−Bg1 IIIで２重切断し、次いで13mp19のHinc I
I−BamH I部位にクローニングすることによって生じ
た。
独立のPCR増幅で得たランダムなVH・PCR生成物のヌク
レオチド配列分析、並びに独立のRNA分離によって、単
一のVHドメインcDNAがが明らかになった。cDNAの配列と
推定アミノ酸配列については後述する。VH領域をコード
する他のクローンは見つからなかったので、この配列
は、YTH655抗体遺伝子に由来するものと思われる。
YTH655抗体のＬ鎖のクローニングと配列決定 ハイブリドーマ細胞からの全RNAが、グアニジンチオ
シアネート法（Chirguwin et al.,Biochemistry,18,529
4,1979）によって単離された。全RNAからmRNAを抽出す
るために、ダイナビーズオリゴ（dT）25（Dynal社）
が、製造業者のプロトコルに従って用いられた。
cDNA合成用スーパースクリプトプラスミドシステム及
びプラスミドクローニングのためのキット（BRL社）を
用い、製造業者の推薦する方法に従って、単離したmRNA
からcDNAを合成し、これをプラスミドpSPORT−１にクロ
ーニングした。その結果得られたcDNA/pSPORT−１ライ
ゲーション生成物により、大腸菌Max Efficiency DH5α
Competent Cells（BRL社）が形質転換された。約5,000
コロニーがハイボンドナイロンフィルター（Amersham）
上に載置され、Buluwela et al（Nucleic Acids Res.1
7,452,1989）の方法に従って溶解し、変性して固定し
た。フィルターを55℃で30分間、0.2×SSC,0.1％SDS中
のプロテナーゼＫ（50μg/ml）で処理し、過剰の残渣を
ティッシュで除去した。
短縮Ｌ鎖に関するM13ファージ上清が、フィルターを
スクリーニングするプローブを作製するために用いられ
た。このM13ファージ上清は、M13のリバースプライマー
及びユニバーサルプライマー、並びに２μｌの32αＰ−
ATPを用いることにより、PCR反応にかけられた。フィル
ターは、ChurchとGilbertの方法（PNAS,81,1991−1995,
1982）に従い、ハイブリッド形成溶液中において、25μ
ｌの放射活性プローブを用いてスクリーニングされた。
略30の潜在的陽性のコロニーが検出された。陽性クロー
ンから、Del Salらの方法（Nucleic Acids Research 1
6,9878,1988）を用いて、プラスミドDNAが調製された。
このDNAを、Not IおよびSal Iで制限分解した後、既述
の32P−M13ファージ上清プローブを用いたサザンブロッ
トにより分析した。４つの陽性クローンの配列が、T7、
T3、及びフレームワーク４プライマーを使って、ジデオ
キシチェーンターミネーション法（Sanger et al.,PNA
S,USA,74,5463−5467,1977）に従って決定された。３つ
のクローンは短縮型YTH655抗体Ｌ鎖であり、１つのクロ
ーンは完全な長さのYTH655抗体Ｌ鎖であった。完全な長
さのクローンは、ジデオキシチェーンターミネーション
法を用いて配列が完全に決定された。
キメラ抗体の設計 前述のステップ２で説明した選別方法を用いることに
より、KOL重鎖（Kabat et al.,1987）のヒト可変領域フ
レームワークと、HSIGKV II軽鎖（EMBLデータベース;19
86年４月７日に提出されたKlobeck,H.G.EMBLデータライ
ブラリー）がヒト化プロセスのために選ばれた。
ヒト化したＨ鎖とＬ鎖遺伝子の構造 ヒト化したＨ鎖とＬ鎖は、次のLewisとCrowe（Gene 1
01,297−302,1991）の方法にしたがって構築された。
（ｉ）Ｌ鎖 Ｌ鎖オリゴヌクレオチドプライマー AL:配列ID番号17: BL:配列ID番号18: CL:配列ID番号19: DL:配列ID番号20: EL:配列ID番号21: FL:配列ID番号22: GL:配列ID番号23: HL:配列ID番号24: PCR反応（Saiki et al.,Science 239,487−491,198
8）が、プログラム可能なヒーティングブロック（Hybai
d）中において、温度サイクル（94℃で１分30秒、50℃
で２分、72℃で３分）を20サイクル繰り返した後、最後
に72℃で10分保持することにより行われた。製造業者が
推奨するように、800ngの各プライマー、特定量の鋳
型、および2.5単位のTaqポリメラーゼ（Perkin Elmer C
etus）を、反応緩衝液と共に100μｌの最終容量とし
た。
このPCRのための最小の鋳型は、先にヒト化されたHum
DXC2 L鎖であった。これは、HSIGKV IIフレームワーク
を有するヒト・カッパＬ鎖であり、続いて部位指向性突
然変異を受けて、CDRL1、CDRL2およびCDRL3をラット抗
ジゴキシンモノクローナル抗体（DX48）のCDRL1、CDRL2
およびCDRL3に置き換えられたものである。
最初に、４つの一次PCR反応が行なわれた。夫々の反
応は、10ngの鋳型と各プライマー対、即ちALとBLとのプ
ライマー対、CLとDLとのプライマー対、ELとFLとのプラ
イマー対またはGLとHLとのプライマー対とを使って行な
われた。これらPCR反応の生成物、即ち、夫々のフラグ
メントABL、CDL、EFLおよびGHLは、Prep−Ａ−Gene（BI
ORAD）を用いて、生産者が推奨するプロトコルに従って
精製された。各精製物の1/4を使って、フラグメントABL
とCDL、並びにフラグメントEFLとGHLを夫々結合した。
この夫々について、プライマーAL及びDL、またはプライ
マーEL及びHLを用いた組換えPCR反応を行った。これら
の反応生成物、即ちフラグメントADLおよびフラグメン
トEHLを上記のように精製し、これら夫々の生成物の1/4
を、プライマーALおよびHLを用いた組換えPCR反応にお
いて結合された。最終的なヒト化Ｌ鎖組換えPCR生成物
（即ちAHL）は、Crowe et al.,1991の方法に従って、プ
ライマーALおよびHLにおけるHind III部位を利用して、
プラスミドpUC−18（BRL）のHind III部位にクローニン
グさせた。ジデオキシチェーン末端法を用いることによ
り、単離したプラスミドの配列を決定し、正しい配列の
クローンを選択した。
（ii）Ｈ鎖 Ｈ鎖オリゴヌクレオチドプライマー AH:配列ID番号25: BH:配列ID番号26: CH:配列ID番号27: DH:配列ID番号28: EH:配列ID番号29: FH:配列ID番号30: GH:配列ID番号31: HH:配列ID番号32: PCRのためのの最初の鋳型は、ヒト化抗CD4重鎖（KON
フレームワーク上にある。WO 92/05274;Gorman et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,1971）で、ゲノムDNAからc
DNAに転換されたものである。上記の組換えPCR法に従っ
て、この鋳型にゲッ歯類のCDRがグラフトされた。ただ
し、このPCR法では、オリゴヌクレオチドプライマーAH
〜HHga用いられた。オリゴヌクレオチドAHおよびHHは、
ヒト化可変領域の最初のクローニングを可能にするため
に、夫々Hind IIIおよびEcoR I部位で設計された。ま
た、その後の選択された適切な定常領域を有する可変領
域のクローニングを容易にするために、Spe I部位が、
オリゴヌクレオチドGHのKOLフレームワーク４（FR4）領
域に導入された。このSpe I部位は、ヒト化抗CD4・Ｈ鎖
鋳型の109番目（ナンバリングはKabat et al.,1987によ
る）のスレオニン残基（KOLではプロリン）をロイシン
残基（６つのヒトＨ鎖Ｊ遺伝子断片のうち４つがこの位
置にロイシンを有する;Kabat et al.,1987）にかえた。
ヒト化Ｈ鎖の可変領域組換えPCR生成物は、Hind III/Ec
oR Iで切断したpUC−18（BRL）中にクローニングされ、
正しい配列をもった単離プラスミドが選択された。ヒト
化抗CD4重鎖のFR4およびc1定常領域が、オリゴヌクレオ
チドプライマーXH（配列ID番号33）およびYH（配列ID番
号34）を用いて、pUC−18（BRL）中にPCRクローニング
された。プライマーXHはSpe I部位およびHind III部位
を含み、YHはEcoR I部位を含んでいる。Hind IIIおよび
EcoR I部位を用いて、PCR生成物がpUC−18中にクローニ
ングされ、正しい配列をもった単離プラスミドが選択さ
れた。続いて、設計したFR4・Spe1部位を用いることに
より、ヒト化可変領域クローンおよびγ１定常領域クロ
ーンから、完全なＨ鎖が再構築された。
ヒト化YTH655のＨ鎖とＬ鎖は、ヒトサイトメガロウイ
ルスプロモーターに支配された真核生物発現ベクター中
にクローニングされ、COS細胞内において、IgG・ELISA
の測定では200ng/mlのレベルで一時的に発現された。ヒ
ト化YTH655のＨ鎖およびＬ鎖を発現する安定な細胞ライ
ンは、NSO細胞に、COS細胞のトランスフェクションに使
ったのと同じ真核細胞発現ベクターをトランスフェクト
することによって作製された。YTH655、並びにヒトIgG1
定常領域およびYTH655の可変領域を含むキメラYTH655
は、活性Ｔ細胞ラインであるMF14に結合することがFACS
分析によって示された。FACS（Weir D.M.1985 Handbook
of Experimental Immunology Vol 1 and 2 4th Ed−Bl
ackwell Scientific Publication,Oxford）で測定した
とき、MF14細胞に結合するヒト化YTH655［４μg/mg］
は、ラットYTH655［４μg/mg］およびキメラYTH655［４
μg/mg］の結合と等価であった。従って、ヒト化モノク
ローナル抗体の抗原特異性は保持されていた。FACS分析
によって、ヒト化YTH655のMF14細胞への結合は濃度依存
性であることが示された。
配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人 （Ａ）名称：ウエルカム・ファウンデーション・リ
ミテッド （Ｂ）通り：ユニオンハウス，ユーストンロード16
0 （Ｃ）市 ：ロンドン （Ｅ）国 ：英国 （Ｆ）郵便番号（ZIP）:NW1 2BP （Ａ）氏名：ワルドマン，ヘルマン （Ｂ）通り：ケンブリッジ大学，病理学部，免疫科 （Ｃ）市 ：テニスコートロード，ケンブリッジ （Ｄ）州 ：ケンブリッジシア （Ｅ）国 ：英国 （Ｆ）郵便番号（ZIP）:CB2 1QP （Ａ）氏名：ウオルシュ，ルイス （Ｂ）通り：ケンブリッジ大学，病理学部，免疫科 （Ｃ）市 ：テニスコートロード，ケンブリッジ （Ｄ）州 ：ケンブリッジシア （Ｅ）国 ：英国 （Ｆ）郵便番号（ZIP）:CB2 1QP （ii）発明の名称：抗体 （iii）配列の数:34 （iv）コンピュータ読取り可能な形態 （Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM・PCコンパチブル （Ｃ）オペレーティング・システム： PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア： PatentIn Release ＃1.0,Version ＃1.25（E
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (73)特許権者 999999999 ワルドマン、ハーマン イギリス国、シービー２・１キューピ ー、ケンブリッジ、テニス・コート・ロ ード（番地無し），イムノロジー・ディ ビジョン、デパートメント・オブ・パソ ロジー、ケンブリッジ・ユニバーシティ ー (73)特許権者 999999999 ウオルシュ、ルイス イギリス国、シービー２・１キューピ ー、ケンブリッジ、テニス・コート・ロ ード（番地無し），イムノロジー・ディ ビジョン、デパートメント・オブ・パソ ロジー、ケンブリッジ・ユニバーシティ ー (72)発明者 ワルドマン、ハーマン イギリス国、シービー２・１キューピ ー、ケンブリッジ、テニス・コート・ロ ード（番地無し），イムノロジー・ディ ビジョン、デパートメント・オブ・パソ ロジー、ケンブリッジ・ユニバーシティ ー (72)発明者 ウオルシュ、ルイス イギリス国、シービー２・１キューピ ー、ケンブリッジ、テニス・コート・ロ ード（番地無し），イムノロジー・ディ ビジョン、デパートメント・オブ・パソ ロジー、ケンブリッジ・ユニバーシティ ー (72)発明者 クローエ、ジェームズ・スコット イギリス国、ビーアール３・３ビーエ ス、ケント、ベッケンハム、ラングレ イ・コート（番地無し）、ウエルカム・ リサーチ・ラボラトリーズ (72)発明者 ルイス、アラン・ピーター イギリス国、ビーアール３・３ビーエ ス、ケント、ベッケンハム、ラングレ イ・コート（番地無し）、ウエルカム・ リサーチ・ラボラトリーズ (56)参考文献 国際公開91／9968（ＷＯ，Ａ１) Ｎａｔｕｒｅ，1987年10月29日，Ｖｏ ｌ．329，ｐ．842−846 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ. 21，Ｎｏ．11，ｐ．2717−2725 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 C12P 21/08 C07K 16/18 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒト化抗体であって、該抗体がヒトＴ細胞
    抗原に結合できるように、夫々CDRの下記アミノ酸配列
    が充分に与えられているヒト化抗体。 軽鎖:CDR1（配列ID番号３および４） CDR2（配列ID番号５および６） CDR3（配列ID番号７および８） 重鎖:CDR1（配列ID番号11および12） CDR2（配列ID番号13および14） CDR3（配列ID番号15および16）
  2. 【請求項２】請求項１に記載の抗体であって、前記CDR
    のアミノ酸配列が、ヒトCD2を導入されたトランスジェ
    ニックマウス由来の休止Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞に結
    合し、該Ｔ細胞の増殖を阻害し、且つ該細胞を溶解する
    ような特異性を有するモノクローナル抗体のCDR配列に
    由来するヒト化抗体。
  3. 【請求項３】請求項２に記載のヒト化抗体であって、前
    記モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体また
    はラットモノクローナル抗体であるヒト化抗体。
  4. 【請求項４】請求項１〜３の何れか１項に記載の抗体で
    あって、軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域が、タ
    ンパクHSIGKV11における可変ドメインのフレームワーク
    領域に対する実質的に相同性を有する抗体。
  5. 【請求項５】請求項１〜４の何れか１項に記載の抗体で
    あって、重鎖可変ドメインのフレームワーク領域が、タ
    ンパクKOLにおける可変ドメインのフレームワーク領域
    に対する実質的相同性を有する抗体。
  6. 【請求項６】請求項１〜５の何れか１項に記載の抗体で
    あって、前記CDRが、請求項３で特定した軽鎖のCDR1〜
    ３及び重鎖のCDR1〜３である抗体。
  7. 【請求項７】請求項１〜６の何れか１項に定義したヒト
    化抗体を製造する方法であって、前記ヒト化抗体の軽鎖
    をコードする第一の発現ベクターおよび前記ヒト化抗体
    の重鎖をコードする第二の発現ベクターで形質転換され
    た宿主を、夫々の鎖が発現される条件下で維持すること
    と、こうして発現された鎖の組み立てにより形成された
    前記ヒト化抗体を単離することとを具備した方法。
  8. 【請求項８】請求項７に記載の方法であって、前記第一
    の発現ベクターおよび前記第二の発現ベクターが同じベ
    クターである方法。
  9. 【請求項９】請求項１〜６の何れか１項に定義したヒト
    化抗体の軽鎖または重鎖をコードするDNA配列。
  10. 【請求項１０】請求項９に記載のDNA配列を組み込んだ
    発現ベクター。
  11. 【請求項１１】請求項10に記載の発現ベクターで形質転
    換された宿主。
  12. 【請求項１２】細胞毒剤に結合された請求項１〜６の何
    れか１項に記載のヒト化抗体を具備する免疫毒剤。
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