JPH07504808A

JPH07504808A - Ｃｄｒをグラフトしたヒト化キメラｔ細胞抗体

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Publication number: JPH07504808A
Application number: JP5509972A
Authority: JP
Inventors: ワルドマン、ハーマン; ウオルシュ、ルイス; クローエ、ジェームズ・スコット; ルイス、アラン・ピーター
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-12-06
Filing date: 1992-12-04
Publication date: 1995-06-01
Anticipated expiration: 2017-10-28
Also published as: ATE234923T1; ES2194011T3; DK0667902T3; US5502167A; JP3339637B2; EP0667902A1; GB9125979D0; DE69232968D1; DE69232968T2; EP0667902B1; WO1993011237A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＤＲをグラフトしたヒト化キメラＴ細胞抗体本発明は、ヒトＣＤ２を導入されたトランスジエニ・ツクマウス（ｍｏｕｃｅ　ｔｒｓｎｓｇｅｎｉｃ　ｆｏｒ　ｈｕ＋＋ｕ　ＣＤ２）由来の休止Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞に結合し、該Ｔ細胞の増殖を阻害し、また該Ｔ細胞を溶解するヒト化抗体に関する。また、このような抗体の製造および該抗体を含有する薬剤組成物に関する。

抗体は、典型的には、ジスルフィド結合によって連結された二つの重鎮と、二つの軽鎖とを具備している。夫々の軽鎖は、ジスルフィド結合によって重鎮に結合している。夫々の重鎮の一端には、可変ドメインおよびこれに続く多くの定常ドメインを有している。夫々の軽鎖は、一端に可変ドメインを有し、他端に定常ドメインを有している。この軽鎖の可変ドメインは、重鎮の可変ドメインと整合するように並べられている。軽鎖の定常ドメインは、重鎮の最初の定常ドメインと整合するように並べられている。軽鎖および重鎮の定常ドメインは、該抗体の抗原に対する結合には直接関与しない。

軽鎖および重鎮の夫々の対における可変ドメインは、抗原結合部位を形成する。

軽鎖および重鎮上の該ドメインは同一の一般構造を有しており、夫々のドメインは、四つのフレームワーク領域（配列は比較的保存されている）と、これらを連結する三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）とを具備している。

この四つのフレームワーク領域は大略βシートコンホメーションをとっており、ＣＤＲは該βシート構造を連結するルーブ（場合によってはβシート構造の一部ら）を形成している。

これらＣＤＲは、フレームワーク領域によって他のＣＤＨに極めて近接した状態で保持されており、抗原結合部位の形成に寄与している。抗体のＣＤＲおよびフレームワーク領域は、Ｆｓｂｉｔ　ｃｌ　！＋、　（ｒ免疫学的に興味あるプロモータの配列」；υＳ　Ｄｅｐｌ、ｏｌ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｂｕｎａｎ　Ｓｅ＋ｖｉｃｅ＋、υＳ　Ｇｏｖｅ「ｎｍｅｎｔ　Ｐｒｉｎｌｉｎｇ　０ｆｆｉｃｅ、１９６７）によって決定され得る。

変異抗体（該抗体可変ドメインのＣＤＲがフレームワークとは異なった種に由来する）の製造が、Ｅ　Ｐ　−Ａ　−０２３９４００に開示されている。該ＣＤＲは、ラット・モノクローナル抗体またはマウス・モノクローナル抗体から誘導れ得る。この変異抗体における可変ドメインのフレームワーク及び定常ドメインは、ヒト抗体から誘導され得る。このようなヒト化抗体は、ラット抗体またはマウス抗体に対してヒトが示す免疫応答に比較すると、ヒトに投与されたときに殆ど無視し得る免疫応答しか誘起しない。ヒト化ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体（Ｃｘｍｐａｔｈはウェルカム瞭ファウンデーション社の商標である）が、Ｅ　Ｐ　−Ａ　 −０３２８４０４に開示されている。

ヒトＴ細胞は免疫応答の調節に重要な役割を果たす。従って、抗Ｔ細胞抗体は、イン・ビボ投与されたときに免疫抑制剤となり得る。その結果として、このような抗体は、例えば移植／宿生障害、移植拒絶反応、並びにリューマチ性関節炎の治療に有用であり得る。

抗Ｔ細胞抗体である非ヒト・モノクローナル抗体が作製されている。しかし、非ヒト・モノクローナル抗体はヒト補体を特１と良好に固定せず、ヒト患者に注射されたときに免疫原となる。Ｗｏ　８９１０９６２２には、ヒト定常ドメイン及びマウス可変ドメインで構成されたキメラ抗体が提案されている。しかし、顕著な免疫原性の問題は未解決のままである。

本発明の一つの側面に従えば、ヒト化抗体であって、そのＣＤＨのアミノ酸配列が、ヒトＣＤ２を導入されたトランスジェニックマウス由来の体止Ｔｍ胞および活性化Ｔｉ胞に結合し、該Ｔ細胞の増殖を阻害し、且つ該細胞を溶解するような特異性を有するモノクローナル抗体のＣＤＲ配列に由来し、また夫々のＣＤＲのアミノ酸配列が充分に保存されていている結果、上記と同じ特異性が与えられているヒト化抗体が提供される。

本発明の別の側面に従えば、ヒト化抗体であって、該抗体がヒトＴ細胞抗原に結合できるように、夫々のＣＤＨの下記アミノ酸配列が充分に与えられるヒト化抗体が提供される。

軽鎖：ＣＤＲ１（配列ＩＤ番号３および４）ＣＤＲ２（配列ＩＤ番号５および６）ＣＤＲ３（配列ＩＤ番号７および８）軽鎖：ＣＤＲ１（配列ＩＤ番号１１および１２）ＣＤＲ２（配列ＩＤ番号１３および１４）ＣＤＲ３（配列ＩＤ番号１５および１６）該抗体は、好ましくは天然抗体またはそのフラグメントの構造を有する。従って、該抗体は完全抗体、（Ｆａｂ″）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、軽鎖二量体または重鎮二量体であり得る。該抗体はＩｇＧ１．１ｇＧ２、Ｉ　ｇＧ３もしくは１ｇＧ４のようなＩｇＧ、またはＩｇＭＳＩｇＡ。

ＩｇＥもしくはＩｇＤであり得る。抗体重鎮の定常ドメインは適宜選択される。

軽鎖定常ドメインは、カッパ定常ドメイン又はラムダ定常ドメインであり得る。

該抗体は、ＷＯ８６１０１５３３に開示されたタイプのキメラ抗体であり得る。

Ｗｏ　８６１０１５３３に従うキメラ抗体は、抗原結合領域および非免疫グロブリン領域を具備している。この抗原結合領域は、抗体の軽鎖可変ドメインおよび／または重鎖可変ドメインである。典型的には、該キメラ抗体は軽鎖可変ドメイン及び重鎮可変ドメインを具備している。前記の非免疫グロブリン領域は、この抗原結合領域のＣ末端に融合される。この非免疫グロブリン領域は、典型的には非免疫グロブリンタンパクであり、酵素領域、公知の結合特異性を有するタンパク由来の領域、タンパク毒素由来の領域、または遺伝子によって発現される何れかのタンパクに由来する領域であり得る。この非免疫グロブリン領域は糖鎖領域であってもよい。該キメラ抗体の二つの領域は、開裂可能なリンカ−配列を介して連結され得る。

軽鎖ＣＤＲ１〜３（配列ＩＤ番号３〜８）および重鎖ＣＤＲ１〜３（配列ＩＤ番号１１〜１６）は、抗ヒトＴ細胞抗体ＹＴＨ６５５ｆ５）６のＣＤＲである。このＹＴＨ６５５（５：１６はラットＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体であり、ヒトＣＤ２を導入されたトランスジェニックマウス由来の休止Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞に結合し、該Ｔ細胞の増殖を阻害し、該Ｔｍ胞を溶解する。ヒト化ＹＴＨ６５５抗体の特異性は、ヒトＣＤ２を導入されたトランスジェニックマウス由来の休止Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞に結合し、該Ｔ細胞の増殖を阻害し、且っ該Ｔ細胞を溶解する能力によって決定され得る。

ヒト化抗体のＣＤＲは、適切には上記の軽鎖ＣＤＲ１〜３および重鎖ＣＤＲ１〜３である。しかし、これらＣＤＨのアミノ酸配列は変更され得る。各ＣＤＨのアミノ酸配列は、アミノ酸の置換、挿入および／または削除によって最大４０％まで（例えば３０％まで、２０％まで若しくは１０％まで）変更され得る。

従って、夫々のＣＤＨには、アミノ酸の置換、挿入および／または削除が一つ又は二つ含まれ得る。軽鎖ＣＤＲ３または重鎖ＣＥＲ３には、アミノ酸の置換、挿入および／または削除が三つまで存在し得る。軽鎖ＣＤＲＩには、アミノ酸の置換、挿入および／または削除が四つまで存在し得る。重鎮ＣＤＲ２には、アミノ酸の置換、挿入および／または削除が六つまで存在し得る。好ましくは、各ＣＥＲのアミノ酸配列・　は、抗Ｔ細胞抗体ＹＴＨ６５５（５）６における各ＣＤＲのアミノ酸配列に対して実質的な相同性を有している。

当該抗体のフレームワーク及び定常ドメインは、ヒトφフレームワーク及びヒト定常ドメインである。好ましくは、抗体重鎮における可変ドメインのフレームワークは、ヒト・タンパクＫＯＬの対応するフレームワーク（ＳｃｂＩｇｉｄｌ　ｇｌ　ｇｌ、。

Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅ＋’＋　１．　Ｐｈ７ｓｉｏ１．　Ｃｌｕｍ、、３６４＋７１３−７４７．　１９８３）　に対して実質的な相同性を有している。フレムワークに関するＫＯＬとの相同性は、一般に８０％以上（例えば９０％以上または９５％以上）である。アミノ酸の置換、挿入および／または削除が数多く存在し得る。例えば、フレームワーク４の第七残基は適切にはＴｈｒ又はＬｅｕ、好ましくはＬｅｕである。Ｋｓｂｔｌ　ｒｊ　＊１．．１９８７によれば、この残基はＫＯＬの残基１０９である。結合を修復するために成され得る他のフレームワーク変更には、アミノ酸残基２７，３０，４８．６６゜６７．７１．９１．９３及び９４が含まれる。アミノ酸のナンバリングはＫｔｂｓｌ　ｒｌ　ａｌ、　に従う。

抗体軽鎖における可変ドメインのフレームワークは、典型的には、タンパクＨ５ＩＧＫＶＩＩの可変ドメイン−フレームワーク（ＥＭＢＬデータベース：　Ｋｌｏｂｅｃｋ、　Ｂ、Ｇ、、　ＥＭＢＬ　ｄａｌｘ　ｌ１ｂｒｘｒｙ　ｓｕｂ＋ａｉ…ｄ　７１ｈ　Ａｐｔｉｌ、１９８６）に対して実質的な相同性を有している。この配列には４５２位にフレームシフトが存在する。読取り枠（ｒｓｉｄｉＢ　ｆｒｉｍｅ）を修正するために、塩基４５２（Ｔ）の削除がなされた。フレームワークに関するＨ５ＩＧＫＶＩ＋との相同性は、一般に８０％以上（例えば９０％以上または９５％以上）である。例えば、Ｋｘｂｘｌ　ｒｊ　！ｌ、のナンノくリングに従ったアミノ酸残基７１におけるように、アミノ酸の置換、挿入および／または削除が数多く存在し得る。

ヒト化抗体は、本発明に従う方法によって製造される。この方法は、ヒト化抗体の軽鎖をコードする第一発現ベクター並びにヒト化抗体の重鎮をコードする第二発現ベクターで形質転換された宿主を、夫々の鎖が発現される条件下で維持することと、こうして発現された鎖の組み立てによって形成されたヒト化抗体を単離することとを具備する。

第一および第二の発現ベクターは同じベクターであり得る。

更に、本発明は次のものを提供する。

・ヒト化抗体の軽鎖または重鎮をコードする配列を有するＤＮＡ。

・前記ＤＮＡ配列を組み込んだ発現ベクター。

・前記発現ベクターで形質転換された宿主。

抗体の夫々の鎖は、ＣＤＲ置換によって製造され得る。得られた抗体が休止Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞に結合できるように、ヒト抗体の軽鎖または重鎮における可変ドメインのＣＤＲが、ＹＴＨ６５５の夫々のＣＤＨの充分なアミノ酸配列によって置換される。ヒト抗体鎖の超可変領域をコードするＤＮＡのＣＤＲコード領域が、望ましいＣＤＲをコードするＤＮＡによって置き換えられる。適切な場合には、この変異ＤＮＡは抗体鎖の定常ドメインをコードするＤＮＡに連結される。該ＤＮＡは発現ベクター中にクローン化される。この発現ベクターは適合する宿主細胞中に導入され、該細胞は抗体鎖が発現されるような条件下で培養される。この方法で同時発現された相補的な抗体鎖は、次いで組み立てられ、ヒト化抗体が形成され得る。

モノクローナル抗体をヒト化するための四つの一般的ステップが存在する。即ち、（１）出発抗体の軽鎖および重鎮における可変ドメインのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を決定すること。

（２）ヒト化抗体を設計すること、即ち、ヒト化プロセスの際に何れの抗体フレームワークを使用するかを決定するこ（３）現実のヒト化方法論／技術（４）トランスフェクション及びヒト化抗体の発現。

抗体をヒト化するためには、抗体の重鎮および軽鎖における可変領域のみが必要であることが知られている。定常ドメインの配列は、再構成ストラテジーに寄与しないので関係がない。抗体の可変ドメインにおけるアミノ酸配列を決定する最も単純な方法は、重鎮および軽鎖の可変ドメインをコードするクローン化されたｃＤＮＡから決定することである。

与えられた抗体の重鎮および軽鎖における可変ドメインのｃＤＮＡをクローニングするためには、二つの一般的な方法がある。即ち、（１）従来のｃＤＮＡライブラリーを介する方法、または（２）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介する方法である。これらの方法は、両者共に広く知られている。

該ｃＤＮＡのヌクレオチド配列が与えられれば、この情報を、抗体可変ドメインの推定アミノ酸配列に翻訳することは簡単なことである。本発明の例において、ゲラ菌類ＹＴＨ’６５５抗体のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は、配列ＩＤ番号１および２（軽鎖）、並びに配列ＩＤ番号９および１０（重鎮）に示されている。

くステップ２〉：ヒト化抗体の設計ヒト化に際して何れのヒト抗体配列を使用するかを決定する場合、考慮すべき幾つかの因子が存在する。軽鎖および重鎮のヒト化は相互に独立して考慮されるが、夫々についての論拠は基本的に同様である。

この選別プロセスは次の論理に基づいている。即ち、与えられた抗体の抗原特異性および抗原親和性は、主に可変ドメインにおけるＣＤＨのアミノ酸配列によって決定される。可変ドメインのフレームワーク残基による直接の寄与は、極めて小さいか、或いは全くない。フレームワーク領域の主要な機能は、複数のＣＤＲを、抗体を認識するための適切な空間的配向（ｏｒｉｓｎｌｘ目ｏｎ）で保持することである。従って、ヒト可変トメイアのフレームワークがゲラ歯頚の可変ドメイン（ゲラ歯頚ＣＤＨの起源）に対して高度の相同性を有しているならば、ゲラ歯頚のＣＤＲをヒト可変ドメインのフレームワーク中に置換することが、その正しい空間的配向を最も保持し易いように思える。従って、ヒト可変ドメインは、ゲラ歯頚の可変ドメインに対して高度の相同性を有するように、好ましく選択されなければならない。

適切なヒト抗体の可変ドメイン配列は、次のようにして選択される。

１、コンピュータ・プログラムを用いることにより、ゲラ歯頚抗体の可変ドメインに対して最も相同性の高いヒト抗体の可変ドメイン配列について、全ての入手可能なタンパク（およびＤＮＡ）のデータベースを調査する。適切なプログラムの出力は、ゲラ菌類抗体に対して最も相同性の高い配列、各配列に対する相同性パーセント、およびゲソ歯頚配列に対する各配列の整列に関するリストである。

これは、重鎮および軽鎖の両方の可変ドメイン配列について独立に行なわれる。

ヒト免疫グロブリンの配列のみが含まれているとすれば、上記の分析はもっと容易に達成される。

２、ヒト抗体における可変ドメインの配列を列記し、相同性を比較する。最初に、ＣＤＨの長さく変化が著しい重鎮のＣＤＲ３を除く）を比較する。ヒ）・の重鎖、並びにカッパ軽鎖およびラムダ軽鎖をサブグループに分割する；重鎖は３つのサブグループ、カッパ鎖は４つのサブグループ、ラムダ鎖は６つのサブグループである。ＣＤＨの寸法は、各サブグループ内では同様であるが、サブグループ間では変化する。ゲラ菌類抗体のＣＤＲを、相同性の一次近似として、ヒト・サブグループの一つに適合させることが通常は可能である。次いで、同様の長さのＣＤＲを有する抗体が、アミノ酸配列の相同性について比較される。この比較は、特にＣＤＲ内において行なわれるが、周囲のフレームワーク領域においても行なわれる。最も相同性の高いヒト可変ドメインが、ヒト化のためのフレームワークとして選ばれる。

Ｅ　Ｐ　−Ａ　−０２３９４００に従い、所望のＣＤＲをヒト・フレームワークにグラフトすることによって、抗体はヒト化され得る。従って、所望の再構成された抗体をコードするＤＮＡ配列は、そのＣＤＲを再構成しようとするヒトＤＮＡを用いて開始することにより作製され得る。所望のＣＤＲを含むゲラ歯顎の可変ドメインにおけるアミノ酸配列が、選択されたヒト抗体の可変ドメイン配列と比較される。ヒト可変領域にゲラ歯顎ＣＤＲを組み込むために、ゲラ歯顎の対応残基に変える必要があるヒト可変ドメイン残基がマークされる。また、ヒト配列中の置換すべき残基、該配列に追加すべき残基または該配列から削除すべき残基も存在し得る。

ヒト可変ドメインを突然変異化して所望の残基を含ませるために用いることができるオリゴヌクレオチドが合成される。

これらオリゴヌクレオチドは、何れが都合のよい大きさとすることができる。通常は、入手可能な特定の合成機で合成可能な長さにおいてのみ制限される。オリゴヌクレオチドに指令されたイン・ビトロでの突然変異誘発法は、広く知られている。

或いは、Ｗｏ　９２１０７０７５の組換ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を用いてヒト化を達成してもよい。この方法論を用いると、ヒト抗体のフレームワーク領域の間のＣＤＲがスプライスされる。

一般に、英国特許出願ｍ９０２２０１１．２号の技術は、二つのヒト中フレームワーク領域（ＡＢおよびＣＤ）並びにその間のＣＤＲ（ドナーＣＤＲによって置換されるべきもの）を具備したテンプレートを用いて行なわれる。プライマーＡおよびプライマーＢはフレームワーク領域ＡＢを増幅するために用いられ、プライマーＣおよびプライマーＤはフレームワーク領域ＣＤを増幅するために用いられる。しかし、プライマーＢおよびプライマーＣの夫々の５゛末端には、ドナーＣＤＲ配列の全部または少なくとも一部に対応した追加の配列が含まれている。

プライマーＢおよびプライマーＣは、ＰＣＲが行なわれ１尋る条件下において、これらの５′末端が相互にアニールされるに充分な長さで重なる。従って、増幅された領域ＡＢおよびＣＤは、オーバーラツプおよび伸長による遺伝子スプライシングを受け、単一の反応でヒト化された生成物が製造される。

抗体を再構成するための突然変異誘発反応に続いて、変異誘発されたＤＮＡは、軽鎖または重鎮の定常ドメインをコードする適切なりＮＡに連結され、発現ベクター中にクローン化され、宿主細胞（好ましくは哺乳類細胞）中にトランスフェクトされ得る。これらのステップは、常法に従って行なうことができる。従って、再構成抗体は下記（ａ）〜（ｄ）を具備したプロセスによって製造され得る；（ａ）Ｉｇの重鎮または軽鎖の少なくとも可変ドメインをコードするＤＮＡ配列に操作可能に連結された適切なプロモータを含み、該可変ドメインがヒト抗体由来のフレームワーク領域および本発明のヒト化抗体に要求されるＣＤＲを具備する、第一の複製可能な発現ベクターを調製すること。

（ｂ）相捕的１ｇの軽鎖および重鎮の少なくとも可変ドメインを夫々コードするＤＮＡ配列に操作可能に連結された適切なプロモータを含む、第二の１々製可能な発現ベクターを調製すること。

（Ｃ）細胞ラインを、上記で調製された第一のベクターまたは両方のベクターで形質転換すること。

（ｄ）前記形質転換された細胞ラインを培養し、前記変異抗体を製造すること。

好ましくは、ステップ（ａ）におけるＤＮＡ配列は、ヒト抗体鎖の該可変ドメインと、該定常ドメイン又は夫々の定常ドメインとの両方をコードする。このヒト化抗体は回収され、精製され得る。変異抗体を産生ずるように形質転換される細胞ラインは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞ライン、または不死化された哺乳類細胞ライン（中でもミエローマ、ハイブリドーマ、トリオーマ（＋ｒｉｏｍ１）またはクヮドローマ（ｑｕｘｄｔｏｍａ）細胞ラインのようなリンパ起源のものが有利）であり得る。この細胞ラインはまた、ウィルス（例えばエプスタインバー・ウィルス）での形質転換により不死化されたＢ細胞のような、正常なリンパ球であってもよい。最も好ましくは、この不死化された細胞ラインはミエローマ細胞ライン又はその誘導体である。

ヒト化抗体の製造に用いられる細胞ラインは好ましくは哺乳類細胞ラインであるが、その代わりに、他の何れかの適切な細胞ライン、例えばバクテリア細胞ライン又は酵母細胞ラインを用いてもよい。単一の抗体鎖については、Ｅ、　Ｃｏ１１由来のバクテリア株を用い得ることが予想される。得られた抗体は機能をチェックされる。もし機能が喪失していれば、スチップ（２）に戻って抗体のフレームワークを変更する必要がある。

発現された本発明の全抗体、その二量体、個々の軽鎖および重鎮、または他の免疫グロブリン形は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等のような当該技術における標準的な手法（一般には、５ｃｏｐ２ｓ、　Ｒ，、Ｐｒｏｌｅｉｎ　ＰｕｔＨｉｃ＊ｔｉｏｎ、５ｐｒｉｏＨｔｔ−Ｖ！ｔ１１Ｈ，Ｎ、Ｙ、　（１９８２）を参照のこと）に従って精製することができる。薬剤としての用途に使用するためには、少なくとも約９０％〜９５％の均一性をもった実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８％〜９９％以上の均一性をもったものが最も好ましい。部分的に又は所望の均一さにまで精製されたら、ヒト化抗体は治療的に用いられ、或いは免疫蛍光染色等の試験操作の開発および実施に用いられ得る（一般には、ｌｓａ＋ｕｎｏｌｏｇｉｃｔｉＭ！ｔｈｏｄｓ、　Ｖｏｌ、　Ｉ　ｕｄ　ＩＩ、Ｌｅｒｋｏｙｉｌｓ　ｕｄ　Ｐａｒｍｉｓ、ｓｄｓ、、＾ｃｘｄｓｍｉｃ　Ｐｒｔｓｓ、Ｎｏｖ　Ｙｏｒｋ、Ｎ、Ｙ、　（１９７９ｉａｄ　１９８１）を参照のこと）。

ヒトＴ細胞抗原特異性の抗体の典型的な用途は、Ｔ細胞に媒介された疾病状態の治療にある。一般に、疾病に関連する細胞がＴ細胞抗原を有するものであると同定された場合は、該Ｔ細胞抗原に結合できるヒト化抗体が適切である。例えば、治療に適した典型的な疾病状態には、心臓、肺、腎臓、肝臓等の臓器移植を受けた患者における移植／宿主病および移植拒絶が含まれる。他の疾病には自己免疫疾患、例えばＩ型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、全身性紅斑性狼瘉および重症筋無力症が含まれる。

本発明のヒト様抗体はまた、他の抗体と組み合わせて、特に、疾病の原因細胞表面の他のマーカーと反応するヒトモノクローナル抗体と組み合わせて使用され得る。適切なＴ細胞マーカーには、例えば、第１回国際白血球分化ワークショップにより命名された、所謂［分化群（Ｃ１ｕｓｌ＊ｒ＠ｏ［Ｄｉ（ｆｔｔｃ＋＋１ｉｘｊｉｏｎ）　Ｊに分類されたものが含まれる（Ｌｓｕｋｏｃｙｌ！Ｔ７ｐｉｎｇ、Ｂｅｒｎｓｒｄ、ｅｆ　！＋、、Ｅｄｓ、、Ｓｐｒｉｏｇｅｒ−ＶＣｒｌｓｇ、　Ｎ、Ｙ、　（１９８４１）。

この抗体はまた、化学療法剤または免疫抑制剤と関連して別途投与される組成物としても使用され得る。典型的には、この薬剤には、シクロスポリンＡまたはプリン類縁体（例えばメントレキセート、６−メルカプトプリン等）が含まれるが、それ以外にも、当業者に周知の多くの薬剤（例えばシクロホスファミド、プレドニゾン等）もまた用いられ得る。

本発明の抗体は免疫毒素の一部を形成する。免疫毒素は二つの成分によって特徴づけられ、イン−ビトロまたはインｅビボにおいて、選択された細胞を死滅させるために特に有用である。一つの成分は細胞毒素剤であり、通常、これを付着しまたは吸収した細胞は死に至る。「デリバリ−担体」として知られる第二の成分は、毒素剤を特定の細胞タイプ、例えば悪性腫瘍を構成する細胞へ運ぶための手段を提供する。この二つの成分は、普通は、種々の周知の化学的手法の何れかによって一緒に結合される。例えば、細胞得剤が蛋白であり、第二成分が完全な免疫グロブリンであるとき、この結合はへテロニ官能架橋剤（例えば５ＰＤＰ、カルボジイミド、グルタルアルデヒド等）によって行なわれ得る。当該技術において種々の免疫毒素が周知であり、例えば「モノクローナル抗体／毒素複合体：魔法の弾丸を０指してＪ　（Ｔｈｏｒｐｅｅｌ　＊ｌ、。

Ｍｏｌ１ｏｃｌｏｕｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｃｌ１ｎｉＣｘｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　Ａｃｘｄｅｍｉｃ１’ｒｔｓｓ、　ｐｐ、１６８−１９０　（１９８２））中に見出すことができる。

免疫毒素としての用途に適した種々の細胞毒剤がある。細胞毒剤には、放射性核種（例えばヨウ素−１３１、イツトリウム−９０、レニウム−１８８及びビスマス−２１２）　；多くの化学療法剤（例えばビンデシン、メソトレキセート、アドリアマイシン及びシスプラチン）；細胞毒タンパク（例えばポークライード抗ウィルスタンパク、シュードモナスエキソトキシンＡ１リシン、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖等のようなりボゾーム阻害タンパク、或いはホスホリパーゼ酵素（例えばホスホリパーゼＣ）のような細胞表面で活性なタンパク）が含まれる。

一般的には、［キメラ毒素Ｊ　（Ｏｌｓｎｓｓ　ｎｏｄ　Ｐｈ１ｌ、　Ｐｈｘｒｍａｃ。

Ｔｈａｔ、、　２５；３３５−３８１　（１９８２））並びに「癌の検出および治療のためのモノクロ−ナル抗体Ｊ　（！ｄｓ、　Ｂｘｌｄｗｉｎ　ｘｎｄ　Ｂａ７ｅｒｓ、　ｐｐ、１５９−１７９．２２４−２６６、＾ｃｘｄｓｍｉｃ　Ｐｕ５ｓ　（１９８５）　）を参照されたい。

免疫毒素のデリバリ−成分は、本発明によるヒト化抗体である。完全な免疫グロブリン又はＦａｂのようなその結合性フラグメントが好ましく用いられる。典型的には、免疫毒素における抗体は、ヒトＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＧアイソタイプであろうが、所望に応じて他の哺乳類定常ドメインが利用され得る。

本発明は更に、薬剤的に許容され得るキャリアまたは稀釈剤と、活性成分としての本発明によるヒト化抗体とを含有する薬剤組成物を提供する。この組成物は、本発明に従う免疫毒素を含有してもよい。本発明のヒト化抗体、免疫毒素およびその薬剤組成物は、非経腸的投与（即ち皮下投与、筋肉的投与または静脈内投与）に特に有用である。

非経腸的投与のための組成物は共通して、許容可能なキャリア（好ましくは水性キャリア）中に溶解された抗体の溶液またはそのカクテルからなっている。種々の水性キャリア（例えば水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．４％グリシン等）を使用することができる。これら溶液は滅菌されており、また一般には粒子物質を含まない。これら組成物は、従来周知の滅菌技術によって滅菌され得る。該組成物は、生理学的条件に近似させるために必要とされる、ｐＨ調節および緩衝剤、毒性調節剤等のような薬剤的に許容可能な任意成分、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含有してもよい。これら処方中の抗体濃度は、例えば、約０．５重量％未満から、通常は約１重量％以上、最大で１５重量％または２０重量％までと広範に変化させることができ、選択された投与方法に従い、主に液体容量、粘度等に基づいて選択される。

筋肉注射のための典型的な薬剤組成物は、１ｍｌの滅菌緩衝水および５０ｍｇの抗体を含有するように調製することができる。静脈注射のための典型的な薬剤組成物は、２５０　ｍ　ｌの滅菌リンゲル溶液および１５０ｍ　ｇの抗体を含有するように調製することができる。非経腸的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者にとっては公知もしくは明らかであり、例えばＲｃａｉａｇｌｏｎ’ｓ　Ｐｈｘｒａ＋ｚｃｅｕｌｉｃｘｌ　５ｃｉｕｃｃ。

１５１ｈ　ｅｄ、、Ｍｕｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃ０ＩｌｌＩ＋１１１７．　Ｅａ＋ｌｏｏ、　Ｐｅｎ＋ｕｙｌｙｓｎｉＡ　（１９８０１の中により詳細に説明されている。

本発明の抗体は凍結乾燥して貯蔵し７、使用に先立って、適切なキャリア中で再生することができる。この技術は、従来の免疫グロブリンについて有効であることが示されている。

適切な凍結乾燥および再生技術は何れも用いることができる。

当業者は、凍結乾燥および再生によって種々の程度での抗体活性の喪失がもたらされ（例えば、従来の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも活性喪失が大きくなる傾向がある）、使用レベルを調節して補償しなければなければならないことを理解するであろう。

本発明のヒト様抗体を含有する組成物またはそのカクテルは、予防および／または治療のために投与され得る。治療的適用において、組成物は、既に疾病に履患している患者に対し、該疾病およびその合併症を治癒し、または少なくとも部分的に抑制もしくは緩和するために充分な墓で投与される。

これを達成するのに充分な墓は、「治療的有効投与量」と定義される。この用途のための有効量は、感染の重篤度および患者自身における免疫系の一般状態に依存するが、一般的には１回の投与墓当たりの抗体量は約１〜約２００ｍ　ｇであり、より普通には患者当たり５〜２５ｍｇの投与量が用いられる。

本発明の物質は一般に、深刻な疾病状態、即ち生命が脅かされ若しくは生命が脅かされる可能性のある状態に用いられることに留意しなければならない。このような症例においては、外因性物質を最小限とし、また「外来物質」拒絶の可能性を低減する（これは本発明のヒト様抗体によって達成される）という観点から、実質的に過剰量のこれら抗体を投与することが可能であり、また主治医はそれを望ましいと思うかも知れない。

予防的適用において、本発明の抗体を含有する組成物またはそのカクテルは、患者の抵抗力を高めるために、未だ疾病自体にない患者に投与される。このような投与量は「予防的有効投与量」と定義される。この用途においても、精密な量は患者の健康状態および免疫の一般的１ノベルに依存するが、一般的には１回の投与量当たりの抗体量は０．１〜２５ｍｇの範囲であり、特に患者当たり０．５〜２．５ｍｇの投与量が用いられる。好ましい予防的用途は、腎臓移植拒絶の防止である。

当該組成物の一回投与または多回数投与は、主治医が選択した投与量レベルおよびパターンで行なわれる。何れにしても、薬剤処方は、患者を効果的に治療するために充分な墓の本発明の抗体を与えなければならない。

本発明のヒト様抗体は更に、イン・ビトロにおける広範な有用性を有し得る。例を挙げると、典型的な抗体は、Ｔ細胞をタイピングするため、特異的ＹＴＨ６５５抗原を有する細胞または該受容体のフラグメントを単離するため、並びにワクチンの製造等のために利用することができる。

診断目的において、当該抗体はラベルされてもよく、或いはラベルされなくてもよい。ラベルされない抗体は、該ヒトか抗体と反応するラベルされた他の抗体（第二抗体）、例えばヒト免疫グロブリンの定常領域に特異的なラベルされた抗体と組み合わせて用いることができる。或いは、該抗体を直接ラベルすることもできる。放射性核種、蛍光体、酵素、酵素基質、酵素共因子、酵素阻害剤、リガンド（特にハブテン）等のような広範なラベルが使用され得る。多種類の免疫検定が利用可能であり、これら免疫検定は当業者に周知である。

細胞活性に対する保護、または細胞活性もしくは選択された抗原の存在の検出において、本発明の抗体と共に使用するためのキットも提供される。即ち、本発明のヒト化抗体は、単独または所望の細胞タイプに特異的な追加の抗体と共に、通常は容器内の凍結乾燥された形態で提供されてもよい。抗体は、ラベルまたは毒素に結合されても結合されなくてもよい。また、該抗体は緩衝液（例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液等）、安定剤、殺菌剤、不活性タンパク（例えば血清アルブミン）等の、および使用説明書のセットと共にキットに含められる。これらは、活性抗体の量を基準にして、一般的には約５重量％未満、通常は全量で少なくとも約ｏ、ｏｏｉ重量％で存在せしめる。しばしば、活性成分を稀釈するための不活性な増墓剤または賦形剤を含めるのが望ましく、その場合、賦形剤は全組成物の約１〜９９重量％で存在せしめ得る。当該キメラ抗体に結合できる第二抗体を試験または検定に用いる場合、通常はこれを別の瓶に収容する。

この第二抗体は典型的にはラベルに結合され、上記の抗体処方と同様にして処方される。

図　１　＝ＭＲ１４細胞に対するヒト化ＹＴＨ６５５の結合ヒト化ＹＴＨ６５５（ＨＵＭＣＤ２）の活性が、ＭＦ１４と称する活性化Ｔ細胞ラインを用いたＦＡＣ３によって試験された。ヒトＩｇＧ１の定常ドメインおよびＹＴＨ６５５の可変ドメインを含むキメラ￥ＴＨ６５５（ＣＨＩＭＣＤ２）が、対照として用いられた。細胞は先ず、キメラＹＴＨ６５５またはヒト化ＹＴＨ６５５と共にインキュベートされた。洗浄の後、細胞は商業的に入手可能な抗ヒトＦＩＴＣと共にインキュベートされ〜次いでＦ　Ａ　ＣＳ　（Ｉｌｕｏｒｓｓｃｅｎｃｅ　ｇｃｊｉｖａｌ！ｄ　ｃｔｌｌ　５ｏｒｆｅｒ）によって分析された。図は、ヒト化ＹＴＨ６５５の結合性がキメラＹＴＨ６５５の結合性と等価であること、並びにヒト化ＹＴＨ６５５の結合が力価測定され得ることを示している。

従って、ヒト化モノクローナル抗体の抗原特異性は維持されていた。

以下の実施例は、本発明を例示するものである。

ＹＴＨ６５５抗体Ｈ鎖のクローニングと配列決定ＹＴＨ６５５抗体のＶＨ領領域コードするｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法（Ｏｒｌｕｄｉ　ｃｌ　ａｔ。

、　ＰＮＡＳ　ｔｌｓＡ、　８６：３８３３−３８３７．１９８９　）をいくらか変更した方法を用いて単離した。全ＲＮＡが、グアニジンチオシアネート法（ＣｈｉＢｖｉｎ　ｔ（！１．．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ７．１８：５２９４．１９７９　）によってハイブリドーマ細胞から単離された。また、ポリ（Ａ）　 ”　ＲＮＡは、全ＲＮＡをポリＵセファｏ−ス４Ｂカラム（Ｐｈａｒｌｕｃｉ畠、　Ｍｉ　１＋００　Ｋｅ７ｕｓ、　Ｕ、　Ｋ、　）に通し、溶出させることにより単離された。第−鎖を合成するために、５μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭのジチオスレイトール、５０ｍＭのトリスＨＣＩ（４２℃でｐＨ８，２）、１０ｍＭ争ＭｇＣｌ２．１００ｍＭＩＩＫＣ１，１０ピコモルのＶ、ドメインに対して特異的なプライマーＶＨ，ＦＯＲ［５’　− ｄ　（ＴＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＣＧＧＴ　ＧＡＣＣＧＴ　ＧＧＴ　ＣＣＣＴＴＧ　ＧＣＣＣＣＡ　Ｇｌ、およびジエチルピロカルボネート（Ｄ　Ｅ　Ｐ　Ｃ）処理した蒸留水と合体し、２４μｌとした。これを７０℃で１０分間加熱し、その後４２℃で１０分間加熱した後、２３単位のスーパーＲＴ　（ＡＭＶ逆転写酵素；　Ａｎｇｌｉａ　Ｂｉｏｌｅｃ、　Ｃｏ１ｃｈ＊ｓｔｕ、υＫ）を加えた。これを４２℃で１時間反応させた。

引き続（ＰＣＲ増幅において、５０μｌのＰＣＲ増幅反応液は、５μｌの第−鎖合成反応液（未精製）、５００μＭの各ｄＮＴＰ、６７ｍＭのトリスＨＣＩ　（２５℃でｐＨ８，８）、１７ｍＭ＊ＮＨｎ　ＳＯ４，１０ｍＭａＭｇＣ１２，２０μｇ　／　ｍｌのゼラチン、５単位のＴＡＱ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｃｈ −Ｌｉｇｈｔ、　Ｉｌ＊ｖｅｒｈｉｌｌ、　Ｕ、　Ｋ、　）　、２５ピコモルのプライマーＶＨ，ＦＯＲと、２５ピコモルノ混合プライ７−ＶＨ，ＢＡ　ＣＫ　［５’　−ｄ　（ＡＧＧ　Ｔ　（ＣＧ＞　（Ｃ＾）　ＡｆＧＡ）ＣＴＧＣＡＧ（ＧＣ）八ＧＴＣ（ＴＡＮＧＧ］からなっていた。反応液をミネラルオイル層で覆った後、Ｔｅｃｈｎｅ−ＰＨＣ−１プログラマブルサイクリツクリアクターを用いて、９５℃で１．５分間（変性）、５０℃で３分間（アニーリング）および７２℃３分間（伸長）のサイクルで３０サイクル反応させた。最後のサイクルには、１０分間の伸長時間を含めた。

サンプルを一２０℃で凍結し、ミネラル油（−２０℃で粘性の液体）を吸引で除去した。水相を解凍し、２％アガロースで電気泳動した後に、３５０ｂｐのＰＣＲ生成物を精製した。このＰＣＲ生成物を、ＰｓｔＩ及びＢｓｔＥｌｌの二つで切断した。当初、これをベクターＭ１３ＶＨ−ＰＣＲＩ（Ｏｒｌｘｎｄｉ　ｅＩｘｉｌ、１９８９）のＰｓｔＩ及びＢｓｔＥＩＩ制限部位にクローニングした。

しかし、作成したクローンの配列をジデオキシチェーンターミネーション法（ＳｘＢ！ｔ　ｔｔ　ｓｌ、。

ＰＮＡＳ　ｔｌｓＡ　７４：５４６３−５４６７、　（１９７７））で調べたところ、ＹＴＩＩ　６５５Ｖｌｌ遺伝子は、ＣＤＲ２とＣＤＲ３の間のフレームワーク領域に位置した内部Ｐｓｔｌ制限部位を含むことがわかった。代りのクローニング方法として、該ＰＣＲ生成物をＰｓｔｌのみで消化し、Ｍｌ　３ｍｐ　１８　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｕｒｏｎ　！ｆ　ｘｌ、、Ｇｅｎｅ３３、１０３−１１９．１９８５）のＰｓｔ１部位にクローニングした。続いて、Ｍ１３ｍｐ１８からＰｓｔｌフラグメントを単離し、これをＭ１３ＶＨＰＣＲ１（ＶＨＰｓｔＩ −ＢｓｔＥＩＩフラグメントを含む）のＰｓｔＩ部位にクローニングすることにより、完全なＶＨ遺伝子を再構築した。Ｐｓｔｌフラグメントの正確な配置（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）は、ジデオキシ配列分析によって決定された。最後に、ＹＴＩＩ　６５５　Ｖｌｌ遺伝子が内部Ｐｓｔ１部位を一つだけ含むこと（即ち、段階的ローニング方法の結果としてＤＮＡがまったく失われていないこと）を確かめるために、該部位を含む６０ｂｐフラグメントがクローニングされ、配列が決定された。この６０ｂｐのフラグメントは、ＶＨ−ＰＣＲ生成物をＸｍｎｌ −ＢｇｌｌＩで２重切断し、次いでＭ１３ｍｐ１９のＨｉｎｃｌＩ−ＢａｍＨ１部位にクローニングすることによって生じた。

独立のＰＣＲ増幅で得たランダムなＶＨ−ＰＣＲ生成物のヌクレオチド配列分析、並びに独立のＲＮＡ分離によって、単一のＶＨドメインｃＤＮＡがが明らかになった。ｃＤＮＡの配列と推定アミノ酸配列については後述する。ＶＨ領領域コードする他のクローンは見つからなかったので、この配列は、ＹＴＨ６５５抗体遺伝子に由来するものと思われる。

ＹＴＨ６５５抗体のＬ鎖のクローニングと配列決定ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡが、グアニジンチオシアネート法（Ｃｈｉｒｇｕｗｉｎ　ｅｔ　！ｌ、、　ＢｉｏｃｈＣｍｉｓｌｒ７．１８．５２９４．１９７９）によって単離された。全ＲＮＡからｍＲＮＡを抽出するために、ダイナビーズオリゴ（ｄＴ）ｘ、（Ｄｙｎａ　１社）が、製造業者のプロトコルに従って用いられた。

ｃＤＮＡ合成用スーパースクリプトプラスミドシステム及びプラスミドクローニングのためのキット（ＢＲＬ社）を用い、製造業者の推薦する方法に従って、単離したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これをプラスミドｐｓＰＯＲＴ−１にクローニングした。その結果得られたｃＤＮＡ／ｐｓＰＯＲＴ−１ライゲーシヨン生成物により、大腸菌Ｍ！Ｉ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃ７ＤＨ５ａ　Ｃｏｍｐｓｔｃｎｌ　Ｃｃｌｌ＠（ＢＲＬ社）が形質転換された。約５．０００コロニーがハイボンドナイロンフィルター（Ａｍ＊ｒｓｈｊｍ）上に載置され、Ｂｕｌｕｗｒｌ！ｅｌ　！ｌ　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　ｂｓ、　１７，４５２．１９８９）の方法・に従って溶解し、変性して固定した。フィルターを５５℃で３０分間、０．２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中のプロテナーゼＫ（５０μｇ　／　ｍｌ　）で処理し、過剰の残渣をティッシュで除去した。

短縮し鎖に関するＭ１３ファージ上清が、フィルターをスクリーニングするプローブを作製するために用いられた。このＭ１Ｂファージ上清は、Ｍｉ３のリバースプライマー及びユニバーサルブライマー、並びに２μｌの３２αＰ−ＡＴＰを用いることにより、ＰＣＲ反応にかけられた。フィルターは、ＣｈｕｒｃｈとＧ１１ｂｅ目の方法（ＰＮＡＳ、　８１．１９９１−１９９５．１９８２）に従い、ハイブリッド形成溶液中において、２５μｌの放射活性プローブを用いてスクリーニングされた。略３０の潜在的陽性のコロニーが検出された。陽性クローンから、Ｄｅｌ　Ｓｉｌ　らの方法（Ｎｕｃｌｒｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｓａｔｃｈ　１６．９８７８．１９８８　）を用いて、プラスミドＤＮＡが調製された。このＤＮＡを、Ｎｏｔｌおよび５ａｌＩで制限分解した後、既述の”Ｐ−Ｍ１３ファージ上清プローブを用いたサザンプロットにより分析した。４つの陽性クローンの配列が、Ｔ７、Ｔ３、及びフレームワーク４プライマーを使って、ジデオキシチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒｅｌ　ａｔｌ、　ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、　７４．５４６３−５４６７、１９７７）に従って決定された。３つのクローンは短縮型ＹＴＨ６５５抗体り鎖であり、１つのクローンは完全な長さのＹＴＨ６５５抗体り鎖であった。完全な長さのクローンは、ジデオキシチェーンターミネーション法を用いて配列が完全に決定された。

キメラ抗体の設計前述のステップ２で説明した選別方法を用いることにより、ＫＯＬ重鎖（Ｋａｂｘｌ　ｅｌ　ａｌ、、１９８７　）　（７）ヒト可変領域フレームワークと、Ｈ３ＩＧＫＶＩＩ軽鎖（ＥＭＢＬデータベース；１９８６年４月７日に提出されたＫｌｏｂ！ｃｋ、　Ｈ，Ｇ、Ｅ　Ｍ　Ｂ　Ｌデータライブラリー）がヒト化プロセスのために選ばれた。

ヒト化したＨ鎖とＬ鎖遺伝子の構造ヒト化したＨ鎖とＬ鎖は、次のＬｅｖｉｓ　とＣ＋ｏｖｅ　（Ｇｓｎｅ　１０１、２９７−３０２．１９９１　）の方法にしたがって構築された。

（ｉ）　Ｌ鎖り鎖オリゴヌクレオチドブライマーＡＬ　：配列ＩＤ番号１７；ＢＬ　：配列ＩＤ番号１８：ＣＬ　：配列ＩＤ番号１９：ＤＬ　：配列ＩＤ番号２０：Ｅｌ　：配列ＩＤ番号２１：ＦＬ　：配列ＩＤ番号２２：Ｇ、、：配列ＩＤ番号２３：Ｈし：配列ＩＤ番号２４：ＰＣＲ反応（Ｓａｉｋｉ　ｔｔ　ｘ！、、５ｃｉｅ＋＋ｃｅ　２３９．４８７− ４９１，１９８８　）が、プログラム可能なヒーティングブロック（Ｈ７ｂｓｉｄ）中において、温度サイクル（９４℃で１分３０秒、５０℃で２分、７２℃で３分）を２０サイクル繰り返した後、最後に７２℃で１０分保持することにより行われた。製造業者が推奨するように、８００ｎｇの各プライマー、特定量の鋳型、および２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（ＰｅＩｋｉｎ　Ｅｌｍｃｔ　Ｃｅ１ｕｓ）を、反応緩衝液と共に１００μｌの最終容量とした。

このＰＣＨのための最初の鋳型は、先にヒト化されたＨｕｍＤＸＣ２Ｌ鎖であった。これは、［ｌ５ＩＧ）：Ｖｌｌフレームワークを有するヒト・カッパＬ鎖であり、続いて部位指向性突然変異をを受けて、ＣＤＲＬｌ、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３をラット抗ジゴキシンモノクローナル抗体（ＤＸ４８）のＣＤＲＬｌ、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３に置き換えられたものである。

最初に、４つの一次ＰＣＲ反応が行なわれた。夫々の反応は、１０ｎＨの鋳型と各プライマー対、即ちＡＬとＢ、とのプライマー対、ＣＬとＤＬとのプライマー対、ＥＬとＦ、とのプライマー対またはＧＬとＨＬとのプライマー対とを使って行なわれた。これらＰＣＲ反応の生成物、即ち、夫々のフラグメントＡＢＬＳＣＤＬＳＥＦＬおよびＧＨＬは、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇ　ｅ　ｎ　ｅ　（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて、生産者が推奨するプロトコルに従って精製された。各精製物の１／４を使って、フラグメントＡＢＬとＣＤＬ、並びにフラグメントＥＦＬとＧＨ，を夫々結合した。この夫々について、プライマーＡＬ及びＤＬ％またはプライマーＥＬ及びＨＬを用いた組換えＰＣＲ反応を行った。これらの反応生成物、即ちフラグメントＡＤＬおよびフラグメントＥ　ＨＬを上記のように精製し、これら夫々の生成物の１／４を、プライマーＡＬおよびＨＬを用いた組換えＰＣＲ反応において結合させた。最終的なヒト化り鎖組換えＰＣＲ生成物（即ちＡＨＬ）は、Ｃ＋ｏｖｔ　ｅｌ　ｓｌ。

、＋９９１の方法に従って、プライマーＡＬおよびＨｔにおけるＨｉｎｄｌｌ１部位を利用して、プラスミドｐＵＣ−１８（ＢＲＬ）のＨｉｎｄ１１１部位にクローニングされた。ジデオキシチェーン末端法を用いることにより、単離したプラスミドの配列を決定し、正しい配列のクローンを選択した。

（ｉ　ｆ）Ｈ鎖Ｈ鎖オリゴヌクレオチドブライマーＡ！Ｉ　；配列ＩＤ番号２５；ＢＩＩ＋＝配列ＩＤ番号２６；ＣＭ：配列ＩＤ番号２７：Ｄ、Ｉ　：配列ＩＤ番号２８：ＥＢ　：配列ＩＤ番号２９：ＦＨ：配列ＩＤ番号３０；ＧＩＩ　：配列ＩＤ番号３１：Ｈ！ｌ　：配列ｒＤ番号３２：ＰＣＨのためのの最初の鋳型は、ヒト化抗ＣＤ４重鎖（ＫＯＬフレームワーク上にある。Ｗｏ　９２１０５２７４；Ｇｏｒｍａｎ　ｅｌ　ａｌ、。

ＰＩｏｃ、　Ｎａ１ｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８．１９７１）で、ゲノムＤＮＡからＣＤＮＡに転換されたものである。上記の組換えＰＣＲ法に従って、この鋳型にゲラ歯頚のＣＤＲがグラフトされた。ただし、このＰＣＲ法では、オリゴヌクレオチドブライマーＡｎ〜Ｈ，ｇａ用いられた。オリゴヌクレオチドＡｌｌおよびＨ，Ｉは、ヒト化可変領域の最初のクローニングを可能にするために、夫々ＨｉｎｄｌｌｌおよびＥｃｏＲＩ部位で設計された。

また、その後の選択された適切な定常領域を有する可変領域のクローニングを容易にするために、５ｐｅＩ部位が、オリゴヌクレオチドＧ、のＫ　ＯＬフレームワーク４　（ＦＨ４）領域に導入された。この５ｐｅ１部位は、ヒト化抗ＣＤ４・Ｈ鎖鋳型の１０９番目（ナンバリングはＫａｂｘｌ　！＋　１１．．１９８７による）のスレオニン残基（ＫＯＬではプロリン）をロイシン残基（６つのヒトＨ鎖Ｊ遺伝子断片のうち４つがこの位置にロイシンを有する；Ｋａｂｘｌ　ｅｔ　！＋１．＋９８７）にかえた。ヒト化Ｈ鎖の可変領域組換えＰＣＲ生成物は、ＨＬ　ｎ　ｄ　ｌｌＩ／Ｅ　ｃｏＲＩで切断したｐ　Ｕ　Ｃ−１８（Ｂ　ＲＬ　）中にクローニングされ、正しい配列をもった単離プラスミドが選択された。ヒト化抗ＣＤ４重鎖のＦＨ４およびＣ１定常領域が、オリゴヌクレオチドブライマーＸ、（配列ＩＤ番号３３）およびＹＩＩ（配列ＩＤ番号３４）を用いて、ｐＵＣ１８（ＢＲＬ　）中にＰＣＲクローニングされた。プライマーＸＩＩは５ｐｅ１部位およびＨｉｎｄｌ１１部位を含み、ＹｌｌはＥｃｏＲ１部位を含んでいる。ＨｉｎｄｌｌｌおよびＥｃｏＲＩ部位を用いて、ＰＣＲ生成物がｐＵＣ−１８中にクローニングされ、正しい配列をもった単離プラスミドが選択された。続いて、設計したＦＢ４・Ｓｐｅ　１部位を用いることにより、ヒト化可変領域クローンおよびγ１定常領域クローンから、完全なＨ鎖が再構築された。

ヒト化ＹＴＨ６５５のＨ鎖とＬ鎖は、ヒトサイトメガロウィルスプロモーターに支配された真核生物発現ベクター中にクローニングされ、ＣＯ８細胞内において、ＩｇＧφＥＬＩＳＡの測定では２００ｎｇ／ｍｌのレベルで一時的に発現された。

ヒト化ＹＴＨ６５５のＨ鎖およびＬ鎖を発現する安定な細胞ラインは、ＮＳＯ細胞に、ＣＯ３細胞のトランスフェクションに使ったのと同じ真核細胞発現ベクターをトランスフェクトすることによって作製された。ＹＴＨ６５５、並びにヒトＩｇＧ１定常領域およびＹＴＨ６５５の可変領域を含むキメラＹＴＨ６５５は、活性Ｔ細胞ラインであるＭＦ１４に結合することがＦＡＣ５ＡＣ５分析て示された。ＦＡＣ５（Ｗ！ｉｒ　Ｄ、Ｍ、１９８５　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｏ＋ｕｌａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ７　Ｍｏｌ　１　ａｎｄ　２４１ｈＥｄ−Ｂｌｘｃｋｖｓｌｌ　５ｃｉｓｎｆｉｌｉｃ　Ｐｕｂｌｉｅｘｌｉｏｎ、０ｘｌｏｒｄ　）でＩＩ定したとき、ＭＦ１４細胞に結合するヒト化ＹＴＨ６５５［４μｇ／＠ｇ］は、ラットＹＴＨ６５５［４μｇ／ｍｇ］およびキメラＹＴＨ６５５［４μｇ／ｎｇ］の結合と等価であった。従って、ヒト化モノクローナル抗体の抗原特異性は保持されていた。ＦＡＣ３分析によって、ヒト化ＹＴＨ６５５のＭＦ１４細胞への結合は濃度依存性であることが示された。

配列表（１）一般情報ｆｉ）出願人（Ａ）名称：ウェルカム・ファウンデーション・リミテッド（Ｂ）通り：ユニオンハウス、ユーストンロード１６０（Ｃ）市　：ロンドンｆＥ１国　：英国（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：ＮＷｌ　２ＢＰ（Ａ）　氏名：ワルドマン、ヘルマンＣＢ）通りニケンブリッジ大学、病理学部、免疫科（Ｃ１市：テニスコートロード、ケンブリッジｆＤ）州　：ケンブリッジシア（Ｅ）国　：英国（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：ＣＢ２　１ＱＰ（Ａ）氏名：ウオルシュ、ルイス（Ｂ）通り：ケンブリッジ大学、病理学部、免疫科（Ｃ）市　：テニスコートロード、ケンブリッジＣＤ）州　：ケンブリッジシアｆＥ）国　：英国（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：ＣＢ２　１ＱＰ（１、発明の名称：抗体ｆｉｉｉ）配列の数二３４（ｉｖ）　コンピュータ読取り可能な形態（Ａ）媒体タイプ；フロッピーディスク（Ｂ）コンビニ　９’：ＩＢＭ−ＰＣ，コンパチブル（Ｃ）オペレーティング会システム：ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）　ソフトウェア：Ｐａ１ｃｎ！Ｉｎ　Ｒ＜１ｔａｓｃ　ｇｌ、０．　Ｖｕｓｉｏｎ　札２５　（ＥＰＣ）（ｖｌ）先の出願データ（Ａ）出願番号：　ＧＢ　９１２５９７９．６（Ｂ）出願日：　１９９１年１２月６日（２）配列ＩＤ番号１の情報ｆｉ）配列の特徴（Ａ）長さ＝３３０塩基対ＦＢ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉｘｌ特徴（Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５（Ｂ）位置＝　１・・・３３０（ｘｉ）配列の記載；配列ＩＤ番号ＩＡＡＴ　ＧにＡ　ＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＴＧ　ＣＡＴ　ＴにＧ　丁ＡＣＣＴＧ　ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＣＣＡ　ＧにＣＣＡＩＩ；　ＴＣＴ　１４P！＋ＡＣＡ　ＣＡＴ　ＴＴＴ　ＣＣＧ　ＴＡＣＡＣに　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＣＣＴ　（Ｃ：Ｇ　ＡＣＣＡＡＧ　Ｃ丁ＧＧλＡ　３３０（２）配列ＩＤ番号２の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１１０アミノ酸（Ｂ）型　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー；直鎖状（ｉｉ）分子の種類：タンパク（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号２（２）配列ＩＤ番号３の情報ｆｉ）配列の特徴（Ａ）長さ；４８塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（ｐ）トポロジー：直鎖状（ｉ　０分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉり特徴（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤ５（Ｂ）位置：　１・・・４８（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号３（２）配列ＩＤ番号４の情報（ｉｌ配列の特徴（Ａ）長さ：１６アミノ酸（Ｂ）型　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：タンパク（ｘｉｌ配列の記載：配列ＩＤ番号キ（２）配列ＩＤ番号５の情報（ｉ）配列の特徴ＦＡ）長さ：２１塩基対ｆＢ）型　；核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉ　！＞特徴（人）特徴を表す記号：ＣＤ５（Ｂ）位置：　１・・・２１（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号５（２）配列ＩＤ番号６の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ＝７アミノ酸ｆＢＪ型　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：タンパク（ｘｌ）配列の記載；配列ＩＤ番号６（２）配列ＩＤ番号７の情報（」）配列の特徴（＾）長さ：２７塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉｘ）特徴（Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５（Ｂ）位置：　ｌ・・・２７（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号７（２）配列ＩＤ番号８の情報（ｉｌ配列の特徴ｆＡ）長さ：９アミノ酸（Ｂ）型　；アミノ酸（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｉ　ｉ）分子の種類：タンパク（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号８（２）配列ＩＤ番号９の情報（１）配列の特徴（Ａ）長さ：２９７塩基対（ＢＪ型　：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）分子の種類：ｃＤＮＡ（１１）特徴（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤ５（Ｂ）位置：　ｌ・・・２９７（ｘＩ）配列の記載：配列ＩＤ番号９ｃｃＡ　ＣＣＴ　ＴＴに　ＣＯＧ　ＡＡＡ　ＣＣＴ　Ｇ（：、Ｇ　にＣＴ　ＴＣＴ　ＣＴに　ＡＡＡ　ＣＴＣＴＣＴ　ＴにＴ　にＴＡ　（１GＣＣム８ＴＣＧ　ＧにＡ　ＴＴＣＡＣＴ　ＴＴＣＡにＴ　ＧＡＣＴＡＣＴＧＧ　ＡＴ（、ＡＧＣＴにＧ　ＧＴＴ　ＣＧＣＣＡＧ、ＡＣＴ　９６ＣＣＴ　にＧＡ　ＡＡＧ　ＡＣＣＡＴＣＧＡＧ　ＴＧＧ　ＡＴＴ　ＧＧＡ　ＣＡＴ　ＡＴＴ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＧＡＴ　ＧＧＣＡＧＴ　１４S ＴＡＣＡＣＡ　ＡＡＣＴＡＴ　ＧＣＡ　ＣＣＡ　ＴＣＣＣＴＡ　ＡＡＧ　ＡＡＴ　ＣＧＡ　丁τＣＡＣＡ　ＡＴＣＴＣＣＡＧＡ　１９２ＧＡＣＡＡＴ　（：ＣＣＡＡＧ　Ａ、ＧＣＡＣＣＣＴＧ　ＴＡ、ＣＣＴに　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＡＧＣＩａＡＴ　ＧＴＧ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　２vＯにＡＧ　ＧＡＧ　ＡＣＡ　ＧＣＣＡＣＴ　ＴＡＴ　ＴＡＣＴにＴ　ＡＣＴ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＣＴＡ　ＣＡＡ　ＣＧＧ　ＡＧＴ　丁ＡＣ２εW ＴＧＧ　ＧＧＣＣＡＡ　２９７Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｃ１ｎ（２）配列ＩＤ番号１０の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：９９アミノ酸（Ｂ）型　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状ｉｉ　ｉ）分子の種類：タンパク（１１）配列の記載：配列ＩＤ番号１０Ｇｌｙ　Ｃ１１１１Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　にｌｙ　ＡＬａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ａｌ■ ｌ　５　１０　１５Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｎｅｔ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　ＴｈｒＰｒｏ　ＧＬｙ　Ｌｙｉ　Ｔｈｒ　Ｍｅｃ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　にｌ：／　ｆｉ、ｓｐ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　TｅｒＴｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　ＡＬａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｐｈ＠　丁ｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　ＡｒｇＡｓｐ　Ａｓｉ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｍｅｃ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　ＶａＬ　Ａｒｇ　５ｉｒＧｌｕ　Ａｓｐ　丁ｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　（：Ｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｔｙ■ Ｔｒｐ　［：１ｙ　Ｇ１ｒ＋（２）配列ＩＤ番号１１の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ＝１５塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉ　ｘ）特徴（Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５（Ｂ）位置＝　１・・・１５（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号１１（２）配列ＩＤ番号１２の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ＝５アミノ酸（Ｂ）型　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）分子の種類：タンパク（ｘｌ）配列の記載：配列ＩＤ番号１２（２）配列ＩＤ番号１３の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ＝５１塩基対！Ｂｌ型　：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（ｐ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（１ｘ）特徴（Ａ）特徴を表す記号；　ＣＤ５（Ｂ）位置；　ｌ・・・５１（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号１３（２）配列ＩＤ番号１４の情報（ｉ）配列の特徴（Ａｌ　長さ：１７アミノ酸（Ｂ）型　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）分子の種類：タンパク（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号１４（２）配列ＩＤ番号１５の情報（ｉ）配列の特徴（＾）長さ：１８塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５（Ｂ）位置：　ｌ・・・１８（Ｘｌ）配列の記載；配列ＩＤ番号１５ＧＡＧ　にＴＡ　ＣＡＡ　ＣＣＧ　ＡＣＴ　ＴＡＣ１８（２）配列ＩＤ番号１６の情報（１）配列の特徴（＾）長さ＝６アミノ酸（Ｂ）型　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー；直鎖状（ｉ　ｉ）分子の種類：タンパク（ｘｌ）配列の記載：配列ＩＤ番号１６（２）配列ＩＤ番号１７の情報（ｉ）配列の特徴（＾）長さ：３０塩基対ＣＢ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ１分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉｉｉｌ　ハイポセティカル配列二Ｎ。

（ｉｉ）アンチセンス二Ｎ０（ｘｉ）配列の記載二配列ＩＤ番号１７ＧＡＴＣＡＡＧ；ＣＴＴ　ＣＴＣＴＡＣＡＧＴＴ　ＡＣＴＩ：ＡＣＣＡＣＡ　３０（２）配列ＩＤ番号１８の情報（ｉＪ配列の特徴（Ａ）長さ＝４７塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー；直鎖状（１１）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセティヵル配列二Ｎ。

（ｉｔ）アンチセンス：　ＹＥＳ（Ｘｌ）配列の記載：配列ＩＤ番号１８ＣＣＡＴＴＡＣＴＣＴ　ｃＴＡＣＣＡｃＣＣＴ　ＣＴＣＡＣＴＴＧｆｉ、ＣＣＣ；ＡＣＡＧにＡＧＡ　ＴＧＧＡＧＣ；Ｃ４７（２）配列ＩＤ番号１９の情報（１）配列の特徴（Ａ）長さ＝４７塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセティヵル配列二Ｎ。

（ｉｉ）アンチセンス二Ｎ。

（用配列の記載：配列ＩＤ番号１９ＴＧＧＴＡＣＡＣＡに　ＴＡＡＴ（：ＧＡＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＴにＣＡＴＴにＧ；ＴＡＣＣＴ　ＧＣＡＧＡＡＧ　４７（２）配列ＩＤ番号２０の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ＝３６塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセティカル配列二Ｎ０（ｌマ）アンチセンス：　ＹＥＳ（１１）配列の記載；配列ＩＤ番号２０ＡＧＡＪＪＡＴＣＴ；　ＴＴＧＧＡＡＡＣＣＣ（：ＡＴＡＧＡＴＣＡＧ　ＧＡＧＣＴＧ　”（２）配列ＩＤ番号２１の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ＝３６塩基対ｆｉｌ型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列＝ＮＯ（１ｖ）アンチセンス＋Ｎ０（ｘｌ）配列の記載：配列ＩＤ番号２１Ｃ（：ＧにＴＴ丁ＣＣＡ　ＡＣＡＧＡ丁ＴＴＴＣＴＧ（：ＧＣＴＣＣＣＴ　ＧＡＣＡＧＣ３６（２）配列ＩＤ番号２２の情報（１）配列の特徴（Ａ）長さ：４２塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセティカル配列＝ＮＯ（１マ）アンチセンス：　ＹＥＳ（２）配列ＩＤ番号２３の情報ｆｉ）配列の特徴（＾）長さ：４２塩基対ｆＢ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数；−末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：　ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列二Ｎ０（ｉ　ｖ）アンチセンス二Ｎ０（ｒｉ）配列の記載；配列ＩＤ番号２３丁ＴＡＣＡＡＡＧＴＡ　ＣＡＣＡＴＴＴＴＣＣＧＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡ　ＣＣ４２（２）配列ＩＤ番号２４の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：３０塩基対（Ｂｌ型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本練（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉｉｉｌ　ハイポセティカル配列＝ＮＯ（１ｖ）アンチセンス：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号２４Ｃ＾丁ＣＡＡＧＣＴＴ　ＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴ　ＣＣＣＣＴ（：ＴＴＩＩ；Ａ（２）配列ＩＤ番号２５の情報（１）配列の特徴（Ａ）長さ：３１塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本練（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列＝ＮＯ（ｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ（ｘｉｌ配列の記載：配列ＩＤ番号２５τにＧＧＡＴＣＩＩＩ：ＡＴ　ＣＡＡＣＣＴＴτＡＣＡにＴ丁−ＣＴＧＡＧ；　Ｃ（２）配列ＩＤ番号２６の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：３０塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本練（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティカル配列：Ｎ０（ｉｉ）アンチセンス：　ＹＥＳ（Ｉｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号２６３０　ＧＣ丁ＣＡτＣＣＡＧ　ＴＡＧＴＣＡＣＴＧＡ　ＡにＡＴＧＡＡＴＣＣ（２）配列ＩＤ番号２７の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ；３０塩基対ＣＢ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本練（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティカル配列二Ｎ０（１ｖ）　アンチセンス＝ＮＯ（２）配列ＩＤ番号３２の情報（ｉｔ配列の特徴（Ａｌ長さ＝３６塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本練（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ【）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティカル配列二Ｎ０（ｉマ）アンチセンス：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載；配列ＩＤ番号３２（２）配列ＩＤ番号３３の情報（ｉｌ配列の特徴（＾）長さ：４８塩基対（Ｂｌ型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本練（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセティカル配列二Ｎ０（１マ）アンチセンス二Ｎ０（２）配列ＩＤ番号３４の情報（１）配列の特徴（＾）長さ＝３３塩基対ＣＢ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本練（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセティカル配列＝ＮＯ（１マ）アンチセンス：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号３４ＡＡＣＣτ丁ＣＣＧＴ　ＣＧＡＡ丁τＣＡＴ丁　丁ＡＣＣＣＧＣ，−，にＡ　ＣＡ、Ｇ　３３【図（］国＠講査報告１工、。　、、　ＰＣＴ／ＧＢ　９２１０２２５１フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　、庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／１０１５１０９　ＺＮＡ／／（Ｃｌ３Ｆ　２１１０８Ｃ１２Ｒ１：９１）（７１）出願人　ウオルシュ、ルイスイギリス国、シービー２・１キユーピー、ケンブリッジ、テニス・コート・ロード（番地無し）、イムノロジー・ディビジョン、デパートメント・オブ・パソロジー、ケンブリッジ・ユニバージティー（７２）発明者　ワルドマン、バーマンイギリス国、シーピー２・１キユーピー、ケンブリッジ、テニス・コート・ロード（番地無し）、イムノロジー・ディビジョン、デパートメント・オブ・バソロジー、ケンブリッジ・ユニバージティーＩ（７２）発明者　ウオルシュ、ルイスイギリス国、シービー２・１キユーピー、ケンブリッジ、テニス・コート・ロード（番地無し）、イムノロジー・ディビジョン、デパートメント・オブ・バソロジー、ケンブリッジ・ユニバージティー（７２）発明者　クローエ、ジェームズ・スコツトイギリス国、ピーアール３・３ビーニス、ケント、ペラケンハム、ラングレイ・コート（番地無い、ウェルカム・リサーチ・ラボラトリーズ（７２）発明者　ルイス、アラン・ピータ−イギリス国、ピーアール３・３ビーニス、ケント、ベラケンハム、ラングレイ・コート（番地無し）、ウェルカム・リサーチ・ラボラトリーズ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト化抗体であって、そのＣＤＲのアミノ酸配列が、ヒトＣＤ２を導入されたトランスジェニックマウス由来の休止Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞に結合し、該Ｔ細胞の増殖を阻害し、且つ該細胞を溶解するような特異性を有するモノクローナル抗体のＣＤＲ配列に由来し、また夫々のＣＤＲのアミノ酸配列が充分に保存されていて、上記と同じ特異性が与えられているヒト化抗体。２．請求項１に記載のヒト化抗体であつて、前記モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体またはラットモノクローナル抗体であるヒト化抗体。３．ヒト化抗体であって、該抗体がヒトＴ細胞抗原に結合できるように、夫々のＣＤＲの下記アミノ酸配列が充分に与えられているヒト化抗体が提供される。軽鎖：ＣＤＲ１（配列１Ｄ番号３および４）ＣＤＲ２（配列１Ｄ番号５および６）ＣＤＲ３（配列１Ｄ番号７および８）軽鎖：ＣＤＲ１（配列１Ｄ番号１１および１２）ＣＤＲ２（配列１Ｄ番号１３および１４）ＣＤＲ３（配列１Ｄ番号１５および１６）４．請求項１〜３の何れか１項に記載の抗体であって、軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域が、タンパクＨＳｌＧＫＶｌｌにおける可変ドメインのフレームワーク領域に対する実質的相同性を有する抗体。５．請求項１〜４の何れか１項に記載の抗体であって、重鎖可変ドメインのフレームワーク領域が、タンパクＫＯＬにおける可変ドメインのフレームワーク領域に対する実質的相同性を有する抗体。６．請求項１〜５の何れか１項に記載の抗体であつて、前記ＣＤＲが、請求項３で特定した軽鎖のＣＤＲ１〜３および重鎖のＣＤＲ１〜３である抗体。７．請求項１〜６の何れか１項に定義したヒト化抗体を製造する方法であって、前記ヒト化抗体の軽鎖をコードする第一の発現ベクターおよび前記ヒト化抗体の重鎖をコードする第二の発現ベクターで形質転換された宿主を、夫々の鎖が発現される条件下で維持することと、こうして発現された鎖の組み立てにより形成された前記ヒト化抗体を単離することとを具備した方法。８．請求項７に記載の方法であって、前記第一の発現ベクターおよび前記第二の発現ベクターが同じベクターである方法。９．請求項１〜６の何れか１項に定義したヒト化抗体の軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡ配列。１０．請求項９に記載のＤＮＡ配列を組み込んだ発現ベクター。１１．請求項１０に記載の発現ベクターで形質転換された宿主。１２．細胞毒剤に結合された請求項１〜６の何れか１項に記載のヒト化抗体を具備する免疫毒素。１３．薬剤的に許容され得るキャリアまたは稀釈剤と、請求項１〜６の何れか１項に記載のヒト化抗体とを含有する薬剤組成物。１４．請求項１３に記載の組成物であって、前記ヒト化抗体が細胞毒剤に結合された免疫毒素を含有する組成物。