CZ20004164A3 - Protilátky proti CD23, jejich dertiváty a jejich terapeutické použití - Google Patents

Abstract

Řešení popisuje protilátky, které se váží na molekulu CD23 (FCeRII) typ II, zvláště pak změněné protilátky, které zahrnují protilátky, jež se vážou na molekulu CD23 (FCeRII) typ II, charakterizovanou afmitní konstantou, jejíž hodnotaje rovna nebo větší než 1 x 109 Ka Mol'1, přípravu takových protilátek, farmaceutických prostředků, které obsahují uvedené protilátky a jejich použití při terapii, zvláště při terapii autoimunitního a zánětlivého onemocnění.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká protilátek, které se váži na molekulu CD23 (FCeRII) typ II, jejich zvláště upravené formy, přípravy takových protilátek, farmaceutických kompozic, které obsahují uvedené protilátky a jejich použití při terapii.

Dosavadní stav techniky

CD23 (FCERII) je molekula typu II a patří do rodiny Clektinů. Tato rodina také zahrnuje receptor pro lymfocyty (MEL-14) a molekulu 1 adheze endoteliálních leukocytů (ELAM1). Je to receptor vhodný pro IgE s nízkou afinitou. V případě člověka řada krvetvorných typů buněk exprimuje na svém povrchu molekuly CD23. Tyto buňky zahrnují folikulární dendritické buňky, B buňky, T buňky a makrofágy. Molekuly CD23 se také nacházejí v rozpustných formách v biologických tekutinách. Rozpustné molekuly CD23 (sCD23) vznikají proteolytickým štěpením transmembránových receptorů. Molekula CD23 vykazuje pleiotropní aktivity, které zahrnují zprostředkování adheze buněk, regulaci IgE a uvolnění histaminu, záchranu B buněk před apoptózou a regulaci růstu myeloidních buněk. Tyto funkční aktivity probíhají prostřednictvím navázání specifických ligandů buněk spojených s CD23 nebo sCD23, později působí způsobem podobným jako cytkiny (popisuje se v publikaci Conrad, D.H., Annu Rev. Immunol. 8, 623-645 (1990), Delespesse, G. et al., Adv. Immunol. 49, 149-191 (1991), Bonnefoy, J.Y., et al., Curr. Opin. Immunol. 5, 944-47 (1993)) .

V řadě zánětlivých buněk se sledovala zvýšená exprese CD23. Molekuly CD23 se také nacházejí v synoviálních biopsiích získaných od pacientů s chronickou synovitidou a také sCD23 se zde nachází v koncentracích, které přesahují normální rozsah séra a synoviálních tekutin pacientů s revmatoidní artritidou (popisuje se v publikaci Bansal, A.S., Oliver, W. Marsh, M.N.,

B.

Immunology 79, 285-289

Pumphrey, R.S., and Wilson, P.

(1993), Hellen, E. A., Rowlands, D.C., Hansel, T.T., Kitas, G. D., and Crocker, J. J., Clin. Pathol. 44, 293-296 (1991), Chomarat, P., Brioloay, J., Banchereau, J., and Miossec, P., Arthritis Rheum. 86, 234-242 (1993), Baansal, A., et al., Clin. Exp. Immunol. 89, 452-455 (1992), Rezonzew, R., and

Newkirk, M.N., Clin. Immunol. Immunopathol., 71, 156-163 (1994)). Množství sérového sCD23 u pacientů s revmatoidní artritidou se vztahuje ke statutu onemocnění a koreluje se sérovým revmatoidním faktorem (popisuje se

Bansal, A.S. et al., Clin. Exp. Rheumatol., (1994). Pro-zánětlivé cytokiny jsou zvláště v publikaci 12, 281-285 důležité u revmatoidní artritidy a ústřední roli mají v případě TNF-a a

IL-lb při poškození artritických v publikaci Brennan, F.M., Chantry, D.

kloubů (popisuje se , Jackson, A., Maini,

R. , and Feldman, Μ. , Lancet 2, 244-247 (1989), Brennan, F.M.,

Maini, R.M., and Feldman Μ. , (1992)) .

J. Rheumatol 31, 293-298

Protilátky v typickém případě obsahují dva těžké řetězce, které jsou spolu spojené disulfidickými vazbami a dva lehké řetězce. Každý lehký řetězec je spojen s určitým těžkým řetězcem disulfidickou vazbou. Každý těžký řetězec má na jednom konci variabilní oblast, po které následuje určitý počet konstantních oblastí. Každý lehký řetězec obsahuje na jednom konci variabilní oblast a na druhém konci konstantní oblast. Variabilní oblast lehkého řetězce je spojena s variabilní oblastí těžkého řetězce. Konstantní oblast lehkého řetězce je spojena s první konstantní oblastí těžkého řetězce. Konstantní oblasti lehkých a těžkých řetězců se přímo nepodílejí na navázání protilátek na antigen.

I i

Variabilní oblasti každého páru lehkého a těžkého řetězce tvoří vazebné místo pro antigen. Oblasti lehkého a těžkého řetězce vykazují stejnou obecnou strukturu a každá oblast obsahuje kostru čtyř oblastí, jejíž sekvence jsou relativně konzervativní a jsou spojeny třemi oblastmi, které určují komplementaritu (CDR). Čtyři oblasti kostry tvoří uspořádání beta-listu a CDR tvoří smyčky, které jsou spojeny a v některých případech tvoří část struktury beta-listu. CDR . se nacházejí v blízkosti základních oblastí a spolu s CDR, které pocházejí z jiné oblasti, se podílejí na vytvoření vazebného místa pro antigen. CDR a oblasti kostry protilátek se mohou stanovit na základě publikace Kabat et al., „Sequences of proteins of immunological interest US Dept. of

Health and Human Services, US Government Printing Office,

1987).

Příprava upravených protilátek, jejichž variabilní oblast protilátek hlodavců se kombinuje s konstantní oblastí lidských protilátek je dobře známa v oboru (popisuje se v publikaci Oi and Morrison (1986) Biotechniques 4, 214-212). Protilátky vhodné pro člověka, ve kterých se CDR získaly ze zdroje odlišného od zdroje kostry variabilních oblastí protilátek, se popisuje v publikaci EP-A-0239400. CDR se mohou získat z monoklonálních protilátek hlodavců nebo primátů. Základní kostra variabilních oblastí a konstantních oblastí protilátek se obvykle získá z lidských protilátek. Takové upravené protilátky by neměly vyvolat tak velkou imunitní odezvu, když ' se aplikují člověku ve srovnání s imunitní odezvou u člověka, která vzniká proti celým cizorodým protilátkám, jako jsou protilátky získané z hlodavců.

Myší monoklonální protilátky vznikly proti receptorů CD23 *

(FCsRII) (PCT/EP/95/04109) . Takové monoklonální protilátky nejsou však ideální pro použití při léčbě lidí, protože jsou i

··· · · ·· ··· · · potencionálně imunogenní, když se aplikují člověku injekcí a mohou být lytické. Dále běžně dostupné protilátky, které se vážou na receptor CD23 rozeznávají odlišné epitopy, které se exprimují na receptorů CD23. Specifita navázání na epitop může hrát podstatnou část účinnosti protilátek pro určitý účel. Výběr protilátek s vysokou afinitou v případě cílového receptorů může být terapeuticky výhodný, protože požadovaná dávka bude nižší než v případě monoklonálních protilátek, které vykazují nižší afinitu v případě stejného receptorů.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje upravené protilátky, které obsahují podstatnou aminokyselinovou sekvenci každého CDR, která je uvedena dále v textu. Uvedené protilátky jsou schopny vázat molekulu CD23 (FCsRII) typ II, který se exprimuje na povrchu krvetvorných buněk:

lehký řetězec

RSSKSLLY KDGKTYLN	CDRL1	(SEQ	ID	NO:	3)
LMSTRAS......	CDRL2	(SEQ	ID	NO:	5)
QQLVEYPFT	CDRL3	(SEQ	ID	NO:	7)

těžký řetězec

GYWMS....	CDRH1	(SEQ	ID	NO:	9)
EIRLKSDNYATHYAESVKG	CDRH2	(SEQ	ID	NO:	11)
FID......	CDRH3	(SEQ	ID	NO:	13)

Vynález dále popisuje protilátky, které se váží na stejný epitop jako protilátky, které mají CDR popsaný shora v textu. Testy kompetitivní inhibice se použily pro mapování epitopů na antigenů, jako je molekula CD23. Kompetitivní analýza FACS zahrnuje použití buněk, které exprimují molekulu jako cíl. Testované protilátky se značí jedním fluorochromem a sekundární protilátky, které se vážou na stejný antigen, se i

v značí druhým odlišně barveným fluorochromem. Jestliže jsou přítomny oba fluorochromy, pak protilátky nevykazují vzájemnou kompetitivní inhibici a proto se domníváme, že rozeznávají na cílové molekule odlišné epitopy. Mapování epitopu je možné také provést za použití přímých testů navázání peptidové knihovny, kde se exprimují peptidové sekvence z cílového antigenu a testují se za použití protilátek značených fluorochromem, jak se uvádí shora v testu. Při studiích mapování epitopu se ukázalo, že použitím protilátek je možné definovat nový epitop na molekule CD23. Vynález proto popisuje protilátky, které kompetitivně inhibují navázání protilátek, které mají sekvence CDR uvedené shora v textu, na molekulu CD23 (FCsRII) typ II exprimovaných na krvetvorných buňkách.

Perferovanými protilátkami podle vynálezu jsou upravené protilátky. Mohou to být chimérické protilátky, které obsahují dostatečnou část variabilních sekvencí těžkého a lehkého řetězce myších protilátek Cil uvedených na obrázku č. 1 a 2 (SEQ ID NO: 1 a 2 a SEQ ID NO: 46, 47, 50 a 51), které jsou schopné vázat se na molekulu CD23 a lidskou konstantní oblast. Protilátky mohou být chimérické protilátky typu, který se popisuje v publikaci WO 86/01533 a které obsahují oblast vázající antigen a oblast, která nepochází z imunoglobulinu. Oblast vázající antigen je variabilní oblast lehkého řetězce protilátek a/nebo variabilní oblast těžkého řetězce.

V typickém případě chimérické protilátky obsahují variabilní oblasti lehkého i těžkého řetězce. Oblast, která nepochází z imunoglobulinu se fúzuje s C-koncem oblasti vázající antigen. Oblast, která nepochází z imunoglobulinu je v typickém případě neimunoglobulinový protein a může to být oblast enzymu získaná z proteinu, který vykazuje známou vazebnou specifitu, nebo z proteinového toxinu nebo z libovolného proteinu exprimovaného genem.

V neimunoglobulinové oblasti se může nacházet sacharidová ·· ·· * · · ·· • * · · · · 9 9

9999 9 9 9 99

9999 99 99 999 99 999 oblast. Dvě oblasti chimérických protilátek se mohou spojit přes štěpitelnou linkerovou sekvenci. Upravené protilátky mohou také být bispecifické protilátky.

Upravené protilátky mohou být humanizované protilátky, ve kterých dostatečná část jedné nebo více aminokyselinových sekvencí každé CDR (a jestliže jsou nutné zbytky kostry) jsou přítomny na kostře lidských protilátek tak, že je schopna vázat molekulu CD23.

Je vhodné, aby CDR protilátek podle vynálezu byly CDR LI a L3 lehkého řetězce a CDR Hl a 3 těžkého řetězce, jak se uvádí shora v textu. Aminokysekinové sekvence těchto CDR se však mohou změnit. Aminokyselinová sekvence každého CDR se může změnit substitucí, začleněním a/nebo delecí aminokyselin.

Každé CDR může proto zahrnovat substituce, inzerce a/nebo delece jedné nebo dvou aminokyselin. V lehkém řetězci CDRL3 nebo v těžkém řetězci CDRH3 mohou existovat substituce, inzerce a/nebo delece až tří aminokyselin. V lehkém řetězci CDRL1 se mohou vyskytovat až čtyři substituce, inzerce a/nebo delece aminokyselin. V těžkém řetězci CDRH2 může být přítomno až šest substitucí, inzercí a/nebo delecí aminokyselin. Upřednostňuje se, aby aminokyselinová sekvence každého CDR byla v podstatě homologní se sekvencí každého CDR, jak se uvádí shora v textu.

Upřednostňuje se, aby stupeň shody sekvence byl alespoň 50 %. Více se upřednostňuje, aby stupeň shody sekvence byl alespoň 75 %. Nejvíce se upřednostňuje, aby stupeň shody sekvence byl alespoň 95 %.

Je výhodné, že není nutné, aby stupeň shody sekvencí byl vysoký, protože různé aminokyseliny se mohou často substituovat jinými aminokyselinami, které mají podobné vlastnosti, aniž se podstatně mění nebo negativně ovlivňují • 44 4 4 44 9 4 9

4494 4 9 4 49 jisté vlastnosti proteinu. Tyto změny se často nazývají „konzervativní změny aminokyselin. Tak aminokyseliny glycin, valin, leucin nebo izoleucin se mohou často vzájemně substituovat. Jiné aminokyseliny, které je možné často substituovat zahrnují: fenylalanin, tyrosin a tryptofan (aminokyseliny, které mají aromatické boční řetězce), lyzin, arginin a histidin (aminokyseliny, které mají bazický postranní řetězec), aspartát a glutamát (aminokyseliny, které mají kyselý postranní řetězec), asparagin a glutamin (aminokyseliny, které mají amidový postranní řetězec) a cystein a methionin (aminokyseliny, které mají postranní řetězec obsahující síru). Tak termín „derivát může také zahrnovat variantu aminokyselinové sekvence, která obsahuje jednu nebo více „konzervativních změn vztažených k uvedené sekvenci.

Kostru a konstantní oblasti protilátek tvoří přednostně kostra a konstantní oblasti lidských protilátek. Upřednostňuje se, aby kostra variabilní oblasti těžkého řetězce protilátek byla v podstatě homologní s odpovídající kostrou lidského proteinu KOL (popisuje se v publikaci Schmidt et al., HoppeSeyler's Z. Physiol. Chem., 364 713-747, 1983). Homologie s ohledem na kostru je v obecném případě 80 % nebo více s ohledem na KOL. Je to například 90 % nebo více nebo 95 % nebo více. Dále je vhodné, aby sedmý zbytek kostry 4 v KOL byl Thr nebo Leu, přičemž se upřednostňuje Leu. Tento zbytek je zbytek 109 (popisuje se v publikaci Kabat et al., „Sequences of proteins of immunological interest US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987). Existuje zde řada substitucí, inzercí a/nebo delecí aminokyselin. Například je možné změnit jeden nebo více zbytků v polohách 49, 66, 76, 77 a 94, aby se získal ekvivalentní zbytek v myších protilátkách. Jinými kandidáty změn na kostře, které se mohou provést, aby se obnovilo navázání, jsou aminokyselinové zbytky 27, 30, 48, 67, 71, 91 a 93.

Aminokyseliny se čísluji způsobem, který se popisuje v publikaci Kabat et al., „Sequences of proteins of immunological interest US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987).

Kostra variabilní oblasti lehkého řetězce protilátek je v typickém případě podstatně homologní s variabilní oblastí kostry proteinu HSIGKVII (databáze EMBL: Klobeck, H. G., knihovna dat podaná 7.4.1986). Existuje zde posun této sekvence do polohy 452. Aby se rektifikoval čtecí rámec, provedla se delece báze 452(T).

Homologie s ohledem na kostru je v obecném případě 80 % nebo více s ohledem na vybranou sekvenci. Preferuje se homologie 90 % nebo více nebo 95 % nebo více. Řada substitucí, inzercí a/nebo delecí aminokyselin se může vyskytovat v aminokyselinovém zbytku 64, ale také nebo místo zbytku 71 podle číslování, které se popisuje v publikaci Kabat et al., „Sequences of proteins of immunological interest US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987).

Vynález dále popisuje protilátky, které obsahují variabilní sekvence těžkého a lehkého řetězce uvedené na obrázku č. 3 a 4 (SEQ ID NO: 17 a 18).

Protilátky přednostně vykazují strukturu přirozených protilátek nebo jeho fragment. Protilátky proto mohou obsahovat celé protilátky, fragment (Fab')₂, fragment Fab, dimer lehkého řetězce nebo dimer těžkého řetězce. Protilátky mohou být IgG, jako je IgGl, IgG2, IgG3 nebo IgG4 nebo IgM, IgA, IgE nebo IgD nebo jejich upravená varianta. Konstantní oblast těžkého řetězce protilátek se může vybrat podobným způsobem. Konstantní oblast lehkého řetězce může být oblast kappa nebo lambda.

I • · ·· ·· · tt • 99 · « · · ··· •··· ·· · · · • · · · · · · · « «

Q ···«····

D ···· ·♦ «· ··· ·· «

Konstantní oblast se vybrala podle požadované funkčnosti.

V normálním případě IgGl bude demonstrovat lytickou schopnost prostřednictvím navázání na komplement a bude zprostředkovávat ADCC (buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátkách). Jestliže jsou nutné necytotoxické blokační protilátky, preferují se IgG4. Protilátky IgG4 mohou demonstrovat nestabilitu při produkci a proto se více preferuje úprava v obecném případě více stabilních IgGl. Naznačené úpravy se popisují v publikaci EP0307434, které jsou v polohách 235 a 237. Vynález dále popisuje lytickou nebo nelytickou formu protilátek podle vynálezu.

Každý řetězec protilátek je možné připravit náhradou CDR.

CDR variabilní oblasti lehkého a těžkého řetězce lidských protilátek se nahradí dostatečnou částí aminokyselinové sekvence každého CDR anti-CD23 protilátek, kdy výsledné protilátky jsou schopny se vázat na molekulu CD23. Oblasti DNA kódující CDR, které kódují hypervariabílní oblast řetězce lidských protilátek, se nahradily DNA kódující požadovaný CDR. Jestliže je to vhodné, tato změněná DNA se váže na DNA kódující konstantní oblast protilátkového řetězce. DNA se klonovala do expresivního vektoru. Expresívní vektor se zavedl do kompatibilní hostitelské buňky, která se kultivovala za takových podmínek, aby se exprimoval řetěz protilátek. Řetězce komplementárních protilátek, které se společně exprimují tímto způsobem mohou pak tvořit humanizované protilátky.

Humanizace monoklonálních protilátek zahrnuje čtyři kroky. Jsou to:

1) stanovení nukleotidová a předpokládané aminokyselinové sekvence počátečních variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce protilátek,

2) navržení humanizovaných protilátek, to znamená rozhodnout, která oblast kostry protilátek se použije během procesu humanizace, tftf * tftf • tftftf • tftf tftftftf tftf

3) metoda/technika skutečné humanizace

4) transfekce a exprese humanizovaných protilátek.

Vynález popisuje sekvenci DNA, která kóduje řetězec protilátek obsahující jednu nebo více sekvencí podle:

páry	baží	CDRLl	číslo	70	až	117,	zobrazeno	na	obrázku	č.	3
(SEQ	ID NO	: 4)
páry	baží	CDRL2	číslo	163	až	183,	zobrazeno	na	obrázku	č.	3
(SEQ	ID NO	: 6)
páry	baží	CDRL3	číslo	280	až	306,	zobrazeno	na	obrázku	č.	3
(SEQ	ID NO	: 8)
páry	baží	CDRH1	číslo	91	až	105,	zobrazeno	na	obrázku	č.	4
(SEQ	ID NO	: 10)
páry	baží	CDRH2	číslo	148	až	204,	zobrazeno	na	obrázku	č.	4
(SEQ	ID NO	: 12)
páry	baží	CDRH3	číslo	301	až	309,	zobrazeno	na	obrázku	č.	4
(SEQ	ID NO	: 14)

nebo sekvence DNA kódující řetězec protilátek, který obsahuje jednu nebo obě sekvence podle obrázku č. 3 nebo 4 (SEQ ID NO: 17 nebo 18 a SEQ ID NO: 48 a 49) .

Krok 1: stanovení nukleotidové a předpovězené aminokyselinové sekvence variabilních oblastí lehkého a těžkého řetězce protilátek.

Aby se mohly protilátky humanizovat, je nutné znát aminokyselinovou sekvenci variabilních oblastí těžkého nebo lehkého řetězce protilátek. Sekvence konstantních oblastí je irelevantní, protože nepřispívá ke strategii obnovení. Nejednoduší metoda stanovení aminokyselinové sekvence variabilní oblasti protilátek pochází z klonované cDNA kódující variabilní oblast těžkého a lehkého řetězce.

• 0

00« • 00 0 0

0·0 000 ·· 000 00 000

Existují dvě obecné metody klonování cDNA variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce: 1) prostřednictvím konveční knihovny cDNA nebo 2) prostřednictvím polymerázové řetězcové reakce (PCR). Obě tyto metody jsou známy v širokém rozsahu. Jestliže je dána nukleotidová sekvence cDNA, je to jednoduchý způsob jak přeložit tuto informaci do předpovězené aminokyselinové sekvence variabilních oblastí

V tomto případě nukleotidová sekvence a aminokyselinová sekvence řetězce protilátek Cil hlodavců jsou zobrazeny na obrázku č. 1 a 2 (SEQ ID NO: 1 (těžký řetězec) a 2 (lehký řetězec) a SEQ ID NO: 45 a 47).

protilátek. předpovězená

Krok 2: Navrhování humanizovaných protilátek

Existuje několik faktorů, které se zvažují při rozhodování, kterou sekvenci použít v případě humanizace. Humanizace lehkého a těžkého řetězce se zvažuje nezávisle na sobě, ale uvažování je v zásadě podobné.

Tento způsob výběru je založen na následující úvaze: daná antigenní specifita a afinita je primárně určena aminokyselinovou sekvencí variabilní oblasti CDR. Základní zbytky variabilní oblasti přispívají pouze málo nebo vůbec. Primární funkce základních oblastí je udržovat CDR v jeho správné prostorové orientaci, aby rozeznal antigen. Pak substituce CDR hlodavců do variabilní oblasti kostry lidských protilátek je vysoce homologní s variabilní oblastí hlodavců, ze které pochází. Přednostně je možné vybrat lidskou variabilní oblast, protože je vysoce homologická s variabilními oblastmi hlodavců.

Vhodná sekvence variabilní oblasti lidských protilátek se může vybrat následujícím způsobem:

1. Za použití počítačového programu se zkoumají všechny dostupné databáze proteinů (a DNA), aby se zjistily

9 9 • 9

999 sekvence variabilních oblastí lidských protilátek, které jsou nejvíce homologické s variabilními oblastmi protilátek hlodavců. Výstup vhodného programu je seznam sekvencí, které jsou nejvíce homologické s protilátkami hlodavců, procento homologie s každou sekvencí a uspořádání každé sekvence se sekvencí hlodavce. To se provádí nezávisle na obou sekvencích variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce. Shora popsaná analýza se provede jednodušeji, jestliže jsou zahrnuty pouze sekvence lidského imunoglobulinu.

2. Seznam sekvencí variabilních oblastí lidských protilátek a porovnání za účelem zjištění homologie. Nejdříve se provede porovnání délky CDR mimo CDR3 těžkého řetězce, který je docela variabilní. Lidské těžké řetězce a lehké řetězce kappa a lambda se rozdělily do podskupin: podskupina 3 těžkého řetězce, podskupina 4 řetězce kappa, podskupina 6 řetězce lambda. Velikosti CDR v každé podskupině jsou podobné, ale ve skupinách se liší. Jako první přiblížení stupně homologie je obvykle možné srovnat do párů protilátky CDR hlodavců s jednou z lidských podskupin. Protilátky nesoucí CDR podobné délky se pak porovnaly, aby se zjistila sekvenční homologie aminokyselin, zvláště pak v CDR, ale také v okolních oblastech kostry protilátek. Lidská variabilní oblast, která je nejvíce homologní, se vybrala jako kostra v případě humanizace.

Krok 3: současné humanizační metody/techniky

Protilátky je možné humanizovat zavedením štěpu do požadované CDR do kostry lidských protilátek podle EP-A0239400. Sekvence DNA kódující požadované protilátky se může proto připravit tak, že začíná lidskou DNA, jejíž CDR má být přeformována. Aminokyselinová sekvence variabilní oblasti « · hlodavců obsahující požadovanou CDR se porovnává s vybranou sekvencí variabilní oblasti lidských protilátek. Zbytky v lidské variabilní oblasti jsou označeny tak, že je je nutné označit, když mají být vyměněny za odpovídající zbytek u hlodavců, aby vznikla lidská variabilní oblast, která obsahuje CDR hlodavců. Zde se také musí vyskytovat zbytky, které je třeba substituovat, přidat nebo deletovat z lidské sekvence.

Syntetizovaly se oligonukleotidy, které se mohou použít při mutagenezi kostry lidské variabilní oblasti, aby obsahovaly požadované zbytky. Tyto oligonukleotidy se mohou vyskytovat v libovolné vhodné velikosti. Velikost použitých oligonukleotidů limitují pouze schopnosti určitého syntetizeru, který je dostupný. Způsob mutageneze in vitro řízené oligonukleotidem je dobře znám v oboru.

V jiném případě je možné humanizace dosáhnout za použití rekombinantní polymerázové řetězcové reakce (PCR), která se popisuje v publikaci WO 92/07075. Za použití této metody se může CDR upravit sestřihem mezi oblastmi kostry lidských protilátek.

V obecném případě je možné provést techniku WO 92/07075 za použití templátu, který obsahuje dvě oblasti kostry lidských protilátek, AB a CD a mezi nimi je CDR, která se nahradí donorovou CDR. Primery A a B se používají při amplifikaci oblasti kostry AB a primerů C a D, které se používají při amplifikaci oblasti CD kostry. Primery B a C také obsahují na svém 5'konci další sekvenci odpovídající všem nebo částem donorové sekvence CDR. Primery B a C překrývají délku dostatečně, aby došlo k navázání na jejich 5'konce za podmínek, které umožňují, aby proběhla PCR. Tak amplifikované oblasti AB a CD prodělaly úpravu genu sestřihem extenzí přesahu za vzniku humanizovaného produktu v jediné reakci.

• ·

00 • * · • «··

0 0 0

0 0 «000 0·

Krok 4: Transfekce a exprese upravených protilátek

Po reakcích, které tvoří mutace, aby vznikly upravené protilátky, se může mutagenizovaná DNA navázat na vhodnou DNA kódující konstantní oblast lehkého nebo těžkého řetězce klonovaného do expresivního vektoru a transfekovaných do hostitelských buněk, přičemž se upřednostňují savčí buňky. Tyto kroky mohou probíhat rutinním způsobem. Upravené protilátky se mohou připravit způsobem, který zahrnuje:

a) přípravu prvního replikovatelného expresivního vektoru, který zahrnuje vhodný promotor operativně spojený se sekvencí DNA, která kóduje alespoň jednu variabilní oblast těžkého nebo lehkého řetězce Ig, variabilní oblast obsahující oblasti kostry, které pocházejí z lidských protilátek a CDR požadovanou pro humanizaci protilátek podle vynálezu,

b) přípravu druhého replikovatelného expresivního vektoru, který zahrnuje vhodný promotor operativně spojený se sekvencí DNA, která kóduje alespoň variabilní oblast komplementárního Ig lehkého nebo těžkého řetězce,

c) transformace buněčné linie prvním nebo oběma připravenými vektory a

d) kultivace uvedené transformované buněčné linie za vzniku uvedených upravených protilátek.

Upřednostňuje se, aby sekvence DNA v kroku a) kódovala variabilní oblast a/nebo každou konstantní oblast řetězce lidských protilátek. Humanizované protilátky se mohou získat a čistit. Buněčná linie, která se transformuje, aby došlo k produkci upravených protilátek může být linie buněk vaječníků čínských křečků (CHO) nebo imortalizovaná buněčná linie savců. Je výhodné, aby tato buněčná linie byla mízního původu, jako je buněčná linie myelomu, hybridomů, triomu nebo kvadromu. Buněčná linie může také obsahovat normální lymfoidní buňky, jako jsou B buňky, které neodumírají po transformaci virem, jako je virus Epstein-Barrové. Nejvýhodnější je, aby neodumírající buněčnou linií byla linie buněk myelomu nebo její deriváty. Expresívní systém první volby je expresívní systém glutaminsyntetázy, který se popisuje v publikaci WO 87/04462.

Ačkoli buněčná linie používaná k produkci humanizovaných protilátek je přednostně savčí buněčná linie, může se také použít libovolná jiná vhodná buněčná linie, jako je bakteriální buněčná linie nebo kvasinková buněčná linie. V případě řetězců jediné protilátky se předpokládá, že se mohou, použít bakteriální kmeny odvozené od E. coli. U získaných protilátek se kontroluje jejich funkčnost. Jestliže protilátky ztratí svoji funkcí je nezbytné se vrátit ke kroku (2) a změnit kostru protilátek.

Vynález poskytuje expresívní vektor obsahující DNA kódující a adaptovanou pro expresi protilátek podle vynálezu a hostitelské buňky transformované uvedenými expresivními vektory.

Po expresi se celé protilátky, jejich dimery, jednotlivé lehké a těžké řetězce nebo jejich imunigiobulinové formy podle vynálezu mohou čistit podle standardních postupů, které jsou dobře známy v oboru. Tyto postupy zahrnují srážení síranem amonným, afinitní kolony, kolonovou chromatografii, gelovou elektroforézu a podobně (popisuje se v publikaci Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)) . Pro farmaceutické využití se preferují v podstatě čisté imunoglobuliny, které vykazují 90 až 95 % homogenitu. Více se preferují imunoglubuliny, které vykazují 98 až 99 % homogenitu nebo vyšší. Jestliže se čištěním protilátek dosáhne částečné nebo požadované čistoty, protilátky se pak mohou použít v terapii nebo při vývoji nebo provádění testů, při imunofluorescenčním barvení a podobně (popisuje se v publikaci i

·· «« ·· φ • * · · · φ · , • ··♦ · · · , «····· Φ · , ·····> 4

Φ · · Φ · · φ* ΦΦΦ

Immunological methods, Vols. I a II, Lefkovits and Pernis, eds., Academie Press, New York, Ν. Y. (1979 a 1981)).

Protilátky mohou fungovat blokováním interakcí mezi molekulami CD23 vázanýma na membráně a ligandem, který se na ně váže. Pro studium takového blokačního účinku se použijí in vitro testy, jako jsou radio-imunitní testy. Protilátky pak mohou fungovat tak, že se naváží na rozpuštěný CD23. Je známo, že CD23 navázaný na membráně podléhá štěpení, čímž se uvolní z povrchu buňky za vzniku řady rozpustných fragmentů. Tyto fragmenty působí jako cytokiny a hrají důležitou úlohu při tvorbě IgE. Při nemoci proto vzniká nadměrné množství rozpustného CD23. Navázáním těchto fragmentů na protilátky podle vynálezu může interferovat se schopností rozpuštěného CD23 zprostředkovat své účinky. Věří se, že protilátky podle vynálezu brání produkci CD23 tím, že štěpí receptor vázaný na membránu. Vynález proto popisuje použití anti-CD23 protilátek při výrobě léčiva pro zablokování tvorby rozpustného CD23.

Schopnost libovolných protilátek zprostředkovat svůj účinek se vztahuje k jejich afinitě na cílový antigen. Protilátky podle vynálezu vykazují velmi vysokou afinitu pro receptor CD23. Afinitní konstanta takových protilátek je přednostně vyšší než lxlO⁹ Ka/mol a více se preferuje vyšší než lxlO¹⁰ Ka/mol. Vynález proto poskytuje protilátky schopné navázat receptor CD23 nebo rozpustná CD23 caharakterizovaný afinitní konstantou rovnou nebo vyšší než lxlO⁹ Ka/mol.

Protilátky, které se váží na receptor CD23 se mohou použít in vivo při léčbě nebo profylaxi zánětlivého nebo autoimunitního onemocnění. To je velmi podstatné, protože řada těchto onemocnění navzdory dlouhotrvajícímu výzkumu je velmi těžké nebo zcela nemožné účinně léčit. To je zvláště případ artritidy, která často ovlivňuje lidi ve středním věku a může • β • · • · β

• 44 ·· ·4 • 4 4 • · ·· • · • 4 ···· 44 • 4 • 4 • 4 • 4 jim bránit v práci. Účinná léčba artritidy je dlouhotrvající úkol pro mnoho výzkumných skupin.

Protilátky podle vynálezu se mohou použít při léčbě nebo profylaxi vážného onemocnění, které zahrnuje artritidu, lupus erythematosus, Hashimotovu tyreoiditidu, roztroušenou sklerózu, cukrovku, uveitidu, dermatitidu, lupénku, kopřivku, nefrotický syndrom, glomerulonefritidu, zánětlivé onemocnění střev, ulcerativní kolitidu, Krohnovu nemoc, Sjogrenův syndrom, alergii, astma, více specificky alergické nebo intrinsické astma, akutní astmatická exacerbaci, rinitidu, exém, GVH, COPD, inzulitidu, bronchitidu (zvláště chronickou bronchitidu) nebo cukrovku (zvláště cukrovku typu I).

Vynález popisuje použití protilátek podle vynálezu při výrobě léčiva pro léčbu jediné nebo více poruch. Vynález dále popisuje způsob léčby jedné nebo více shora uvedených poruch, které zahrnují aplikaci terapeuticky účinné dávky protilátek podle vynálezu.

Protilátky podle vynálezu se mohou použít při studování interakcí mezi CD23 a různými ligandami, například mezi CD23 a CD21, mezi CD23 a CDllb, mezi CD23 a CDU, mezi CD23 a proteinem endoteliálních buněk s molekulovou hmotností 80 000 až 75 000 nebo mezi CD23 a proteinem s molekulovou hmotností 115 000 ( který, jak se věří je příbuzný s endoteliálním proteinem s molekulovou hmotností 80 000 až 85 000) . Věří se, že jedna nebo více shora uvedených interakcí se vyskytuje in vivo. Zvláště se preferují protilátky nebo jiná vazebná činidla, která jsou schopna blokovat tyto interakce. Věří se, že tato činidla jsou zvláště vhodná pro snížení nebo zvýšení zánětlivého účinku sprostředkovaného cytokiny. Mohou se použít proti maligním nádorům B buněk, jako jsou chronická lymfocytární leukémie a leukémie vlasových buněk.

·· ·· • · · • ··· • 9 · » · · ··<· ·· ·· ·· t * · • · • · · • ·

• · ··

Alternativní mechanizmus působení anti-CD23 terapie se může podílet na blokování IgE imunitní odezvy.

Protilátky podle vynálezu je také možné použít při léčbě a profylaxi alergického onemocnění, které zahrnují onemocnění, které nejsou způsobeny IgE. Mohou se použít při léčbě a profylaxi Crohnovy nemoci.

Protilátky podle vynálezu se mohou použít samotné nebo v kombinaci s imunosupresivními činidly, jako jsou steroidy, cyklosporin nebo protilátky, jako jsou anti-lymfocytární protilátky nebo více se upřednostňují činidla vyvolávající toleranci, anti-autoimunitní nebo proti-zánětlivá činidla, jako jsou činidla inhibující CD4+T buňky, například anti-CD4 protilátky (upřednostňují se blokační činidla nebo protilátky, které nejsou deplekační) , anti-CD8 protilátky, TNF antagonista například anti-TNF protilátky nebo TNF inhibitor, například rozpustný TNF receptor nebo činidla, jako je NSAID.

Vhodné dávky sloučeniny podle vynálezu budou kolísat v závislosti na faktorech, jako je léčené onemocnění nebo poruchy, způsob aplikace a věk a hmotnost jednotlivce, který se léčí. Aniž dojde k omezení určitou dávkou, věří se, že na příklad v případě parenterální aplikace se denní dávka pohybuje v rozmezí 0,01 až 20 mg/kg protilátek podle vynálezu (obvykle je přítomna část farmaceutické kompozice) a tato dávka je vhodná pro léčbu typické dospělé osoby. Vhodnější je, že se dávka může pohybovat v rozmezí 0,1 až 5 mg/kg, jako je rozmezí 0,1 až 2 mg/kg. Jednotková vhodná dávka je 1 až 400 mg.

Protilátky se mohou také použít, jako odděleně aplikovatelné sloučeniny ve spojení s chemoterapeutickými nebo imunosupresivními činidly. V typickém případě činidla budou zahrnovat cyklosporin A nebo purínový analog (například methotrexát, 6-merkaptopurin nebo podobně). Může se také

použít řada dalších činidel (například cyklofosfamid, prednison, atd.), které jsou dobře známy v oboru.

Jestliže je nutné lyžovat buňky, na které se protilátky vážou, pak protilátky podle vynálezu mohou tvořit část imunotoxinu. Imunotoxiny se charakterizují dvěmi komponenty a jsou zvláště použitelné při zabíjení vybraných buněk in vitro a in vivo. Jednou složkou je cytotoxické činidlo, které je obvykle pro buňky fatální v případě, že se na ně váže nebo absorbuje. Druhá složka, která je známa jako „nástroj pro zavádění poskytuje způsob zavedení toxického činidla do určitého typu buněk, jako jsou buňky, které jsou obsaženy v karcinomu. Dvě složky jsou běžně chemicky vázané dohromady libovolným dobře známým chemickým postupem. Například v případě, kdy cytotoxickým činidlem je protein a druhou složkou je intaktní imunoglobulin, vazba je provedena způsobem heterobifunkčních příčních vazeb, například SPDP, karbodiimid, glutaraldehyd a podobně. Produkce různých imunotoxinu je dobře známa v oboru a může se popisovat například v publikaci „Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magie Bullet, Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academie Press, pp. 168-190 (1982).

Různá cytotoxické činidla jsou vhodná pro použití jako imunocytotoxiny. Cytotoxické činidla mohou zahrnovat radionukleotidy, jako je jodin-131, ytrium-90, rhenium-188 a vizmut-212, řadu chemoterapeutických léků, jako je vindesin, methotrexát, adriamycin a cisplantin a cytotoxické proteiny, jako jsou ribozomální inhibiční proteiny podobné antivirovému proteinu, exotoxinu A bakterií Pseudomonas, ricinu, toxinu difterie, řetězce A ricinu atd. nebo činidla aktivní na povrchu buňky, jako jsou fosfolipázové enzymy (například fosfolipáza C) (popisuje se v publikaci „Chimaeric Toxins, Olsnes and Phil, Pharmac. Ther., 25: 335-381 (1982) a „Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, eds.

Baldwin and Byers, pp. 159-179, 224-266, Academie Press (1985).

Zaváděná složka imunotoxinu je protilátka podle vynálezu. Přednostně se používají neporušené imunoglobuliny nebo jejich vazebné fragmenty, jako je Fab. V typickém případě protilátky v imunotoxinech jsou isotypy lidských IgA, IgM nebo IgG, ale je-li to nutné mohou se využít i jiné konstantní oblasti.

Vynález dále popisuje farmaceutickou kompozici, která obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo a jako aktivní složku protilátku podle vynálezu. Sloučenina může obsahovat imunotoxin podle vynálezu. Protilátky, imunotoxin a jejich farmaceutické sloučeniny podle vynálezu je možné zvláště použít při parenterální aplikaci, to znamená podkožně, do svalu nebo intravenózně.

Kompozice vhodné pro parenterální aplikaci mohou běžně obsahovat roztok protilátek nebo jejich koktejl rozpuštěný v přijatelném nosiči, upřednostňuje se vodný nosič. Může se použít řada vodných nosičů, jako je například voda, pufrovaná voda, 0,4 % fyziologický roztok, 0,3 % glycinu a podobně. Tyto roztoky jsou sterilní a v obecném případě neobsahují určité látky. Tyto kompozice se mohou sterilizovat běžnými sterilizačními postupy, které jsou dobře známy v oboru. Prostředky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné auxiliární látky, vyžadují-li to fyziologické podmínky, jako jsou činidla pro úpravu pH a činidla sloužící jako pufry, činidla upravující toxicitu a podobně. Je to například acetát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, laktát sodný atd.. Koncentrace protilátek v případě těchto formulací se může kolísat v širokém rozmezí. Rozmezí může být méně než 0,5 %, obvykle alespoň 1 % až 15 nebo 20 % (hmotn.) . Koncentrace se vybere na základě objemů kapalin, viskozity, atd., v souladu s určitým modem vybrané aplikace.

i • · • · • · ··

Typická farmaceutická kompozice v případě injekce do svalu se může připravit tak, že obsahuje až 1 ml sterilní pufrované vody a 50 mg protilátek. Typická kompozice v případě nitrožilní infúze se může připravit tak, že obsahuje 250 ml sterilního Ringerova roztoku a 150 mg protilátek. Aktuální metody vhodné pro přípravu aplikovatelných sloučenin jsou dobře známy v oboru a popisují se například v publikaci Remington's Pharmaceutical Science, 15 th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980).

Protilátky podle vynálezu se mohou lyofilizovat za účelem uložení a před použitím se rekonstituovaly ve vhodném nosiči. Ukázalo se, že tato metoda je účinná s běžnými imunitními globuliny. Může se použít libovolný lyofilizační postup a postup rekonstituce. Je vhodné, aby lyofilizace a rekonstituce vedla k různému stupni ztráty aktivity protilátek (například běžné imunitní globuliny, protilátky IgM mají tendence mít vyšší ztráty aktivity ve srovnání s protilátkami IgG).

Jediné a opakované aplikace kompozic se mohou provést dávkou a paternem, který vybral lékař. Farmaceutické přípravky mohou poskytovat množství protilátek podle vynálezu, které je účinné pro léčbu pacienta.

Protilátky podle vynálezu mohou dále nacházet široké uplatnění in vitro. Protilátky se mohou použít při typování T buněk, při izolaci buněk, které nesou specifický antigen CD23 nebo fragmenty receptorů, při přípravě vakciny nebo podobně.

Pro diagnostické účely se protilátky mohou buď značit a nebo se neznačí. Neznačené protilátky se mohou použít v kombinaci s jinými značenými protilátkami (sekundární protilátky), které reagují s humanizovanými protilátkami, jako jsou protilátky specifické pro konstantní oblasti lidského imunoglobulinu. V jiném případě protilátky se mohou značit

i	·· 0 0 0 · · ·· • ·0 ···· 0 0 0 0000 00 0 00
22	0000 00 00 000 00 0
přímo. Může se použít	široké	rozmezí	značek, jako jsou
radionukleotidy, fluor,	enzymy,	enzymové	substráty, enzymové
kofaktory, enzymové inhibitory,	ligandy	(zvláště hapteny)

atd.. Je dostupná řada imunologických testů, které jsou známy v oboru přímo.

Sady se mohou také použít s protilátkami při ochraně proti aktivitě buněk nebo při její detekci nebo detekci přítomnosti vybraného antigenu. Protilátky podle vynálezu se mohou připravovat obvykle v lyofilizované formě v nádobce, buď samotné nebo spolu s dalšími protilátkami, které jsou specifické pro požadovaný typ buňky. Protilátky, které jsou spojeny se značkou nebo toxinem nebo nejsou spojeny jsou zahrnuty v sadách s pufrem, jako je Tris, fosforečnan, uhličitan atd., stabilizátorem, biocidy, inertními proteiny, například sérovým albuminem nebo podobně a návodem pro použití. V obecném případě tento materiál bude přítomen v množství menším než 5 % (hmotn.) vztaženo na množství aktivních protilátek a obvykle je přítomné v celkovém množství alespoň 0,001 % (hmotn.) vztaženo ke koncentraci protilátek. Často je nutné zahrnout inertní plnidlo nebo ekcipient, aby se naředily aktivní složky. Ekcipient může tvořit 1 až 99 % (hmotn.) celkového prostředku. V případě, že sekundární protilátky jsou schopny se vázat na chimérické protilátky, které se používají v testu, jsou pak přítomny v oddělené lahvičce. Sekundární protilátky jsou v typickém případě spojeny se značkou a tvoří analogickým způsobem s protilátkami prostředky, které se popisují shora v textu.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 je zobrazena aminokyselinová a nukleotidová sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce Cil myši.

• · · ···· · · · 0 · · · 0 · · 0 0

Na obrázku č.	2 je	zobrazena	aminokyselinová	a
nukleotidová sekvence	variabilní oblasti	lehkého řetězce	Cil
myši.
Na obrázku č.	3 je	zobrazena	aminokyselinová	a
nukleotidová sekvence	variabilní oblasti těžkého řetězce
humanizovaných protilátek proti	CD23.
Na obrázku č.	4 je	zobrazena	aminokyselinová	a

nukleotidová sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce protilátek proti CD23.

Na obrázku č. 5 je znázorněno poloviční maximální navázání chimérické CD23 IgGlm.

Na obrázku č. 6 je znázorněno poloviční maximální navázání humanizovaných CD23 IgGlm.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Klonování a sekvenování myších anti-CD23 monoklonálních protilátek Cil.

Obecné postupy:

Není-li uvedeno jinak používají se následující standardní postupy a podmínky. Bylo-li to možné používaly se protokoly doporučené výrobcem. Restrikční štěpení a jiné postupy molekulární biologie se uskutečnily v podstatě stejně, jak se popisuje v publikaci Maniatis et al., Molecular Cloning- a laboratory manual 2^nd edition, Cold Spring Harbour Press).

PCR se uskutečnilo za použití programovatelného termálního cyklovače (Trio, Biometra). V typickém případě reakce o objemu 100 μΐ obsahovala 2,5 jednotek polymerázy AmpliTaq (PerkinElmer-Cetus, Beaconsfield, UK) v pufru, který se získal od výrobce, 250 μΜ každého z dATP, dCTP, dGTP a dTTP, amplifikační primery v koncentraci 1 μΜ a templátovou DNA. Není-li uvedeno jinak použily se následující specifikace cyklu:

• · ·· ·· · ·· » · · ·*·· · · · • · · · · · · · · krok 0: teplota 95 °C po dobu 5 minut krok 1: teplota 95 °C po dobu 1 minuty krok 2: teplota 50 °C po dobu 1 minuty, skok na krok 3 při teplotě 0,4 °C/vteřinu krok 3: teplota 72 °C po dobu 1 minuty, zpět na krok 1, opakovat smyčku 30 krát krok 4: teplota 72 °C po dobu 5 minut

Sekvenování DNA se uskutečnilo za použití metody dideoxyterminace za použití buď systému Sequenase v2 · (USB, Cambridge, UK) nebo systém terminace fluorescenčním barvivém (ABI).

Čištění DNA na gelu se provedlo oddělením reakce na agarózovém gelu s nízkou teplotou tání (NuSieve GTG, FMC, Rockland, ME) . Vybrané fragmenty se vyřízly pod UV zářením a DNA se získala za použití preparačního kitu Wizard PCR (Promega, Southampton, UK).

Číslování aminokyselinových zbytků v řetězcích protilátek se provádí podle schématu publikovaném v publikaci Kabat et al., Sequences of proteins of immonological interest, US Dept of Health and Human Services, US Govt Printing Office, 1991).

Příprava cDNA z hybridomu Cil

Pro extrakci RNA se použila kultivovaná kultura buněk Cil. Kultura obsahující 1,3 χ 10⁷ buněk se centrifugovala a buněčný pelet a supernatant se získaly pro analýzu. V supernatantu se testovala přítomnost myšího imunoglobulinu v různých izotypech za použití imunologické metody (kit ISO1, Sigma , Poole, UK) a zjistilo se, že monoklonální Cil jsou izotyp IgGl.

Mediátorová RNA se izolovala z peletu buněk sekvenční aplikací kitu pro izolaci celkové RNA (Stratagene, Cambridge, UK) (za vzniku celkové RNA) a pak kitu „mRNA Purification i

(Dynal, Oslo, Norway). Části mRNA a celkové RNA se pak převedly na jednořetězcovou cDNA za použití „Superscript Preamplification Systém (BRL, Paisley, Scotland, UK). Alikvoty Výsledné cDNA se použily pro PCR, která je navržena tak, aby se odděleně amplifikovaly variabilní oblasti těžký a lehký řetězec imunoglobulinu Cil.

Klonování a sekvenování variabilní oblasti těžkého řetězce Cil

Těžký řetězec se klonoval různými variacemi metody podle Bendinga a Jonese (Bio/Technology 9: 88-89), kde se pro PCR amplifikaci celé variabilní oblasti používá 12 „forward primerů, které jsou specifické pro oblast signálního peptidu těžkého řetězce a 1 reverzní prímer specifický pro konstantní oblast myšího yl. Spíše než přidat 12 forward primerů do jedné reakce, je lepší provést 12 oddělených reakcí PCR. Kdy v každé reakci se použije jeden z forward primerů v kombinaci s reverzním primerem yl. Tyto reakce se provedly při teplotě hybridiazece 42,5 °C (krok 2 popsaný ve schématu uvedeném shora v textu).

Vzorky každé reakce se analyzovaly na agarózovém gelu a pruh vykazující očekávanou velikost se objevil pouze při reakci, která užívala forward primer MHVll. Na základě uvedeného výsledku se provedly dvě PCR za použití MVH11 a reverzního primerů yl a cDNA, která se odvodila z mRNA a z celkové RNA. Při dvou nezávislých reakcí PCR, které mají sloužit jako zdroj materiálu pro klonování, se použily běžné přístroje, které jsou dobře známy v oboru a zabraňují vzniku chyb v sekvenci, jenž vznikají chybným začleněním nukleotidů Tag polymerázou.

Výsledné fragmenty PCR se pak štěpily restrikčními enzymy Xmal a Sáli, čistily se na gelu a klonovaly se do pUCl8. Inzerty z počtu klonů z každé PCR se sekvenovaly a zjistilo se, že jsou shodné. To naznačuje, že sekvence neobsahuje chyby, které vznikly způsobem PCR. Upíná sekvence variabilní oblasti je uvedena na obrázku č. 1 (SEQ ID NO: 1) a je zcela spárována těžkým řetězcem skupiny IIC podle Kabata.

Klonování a sekvenování variabilní oblasti lehkého řetězce Cil

Variabilní oblast lehkého řetězce Cil se klonovala podobným způsobem. Zahrnuje sadu 11 forward primerů, které jsou specifické pro oblast signálního peptidu, a 1 reverzní primér specifický pro myší konstantní oblast κ (Bending and Jones, (Bio/Technology 9: 88-89). Navíc, jak se dříve stanovilo, tento primér neamplifikuje dostatečně účinně všechny myší lehké řetězce kappa, použily jsme jiný primér, který zde nazíváme MKV12 (sekvence

5'ACTAGTCGACATGAAGTTTCCTTCTCAACTTCTGCTC3') (SEQ ID NO: 41). Jak se uvádí shora v textu v každé oddělené reakci PCR se nachází jeden forward primér a reverzní primér konstantní oblasti kappa. Tyto reakce proběhly a analyzovaly se elektroforézou na agarózovém gelu.

Tři produkty vzniklé při uvedených reakcích měly očekávanou velikost. Tyto produkty se odděleně štěpily restrikčními enzymy Sall a Xmal, čistily se a klonovaly se do pUCl8, přičemž vznikly klony označené VKI, VKJ a VKK. Tyto klony se částečně sekvenovaly za účelem stanovení jejich identity. Zjistilo se, že částečná sekvence klonu VKI je shodná se známou sekvencí, lehký řetězec získaný z myelomu MOPC21, který vykazuje posun v rámci CDR3 (Genbank M35669) a také se odstranil VKI. Také se zjistilo, že částečná sekvence klonu VKK zahrnující CDR3 je shodná s produktivně upraveným lehkým řetězcem MOPC21 (genbank J00560, J00552). To samotné nebrání tomu, aby se klon VKK upravil na lehký řetězec Cíl, přičemž oba lehké řetězce mohou sdílet CDR3 v embryonální konfiguraci. Je dáno, že myelomový předchůdce hybridomu je ·· ♦» » · · • ··* derivát M0PC21 a tak se identifikovala jiná sekvence příbuzná MOPC21 (klon VKI). Uvažuje se, že klon VKK je správný.

Uvažuje se, že klon VKJ s velkou pravděpodobností reprezentuje opravdovou variabilní oblast lehkého řetězce Cil, stejně jako částečná sekvence nebyla shodná s libovolnou sekvencí v genové bance. Klon VKJ se zcela sekvenoval a zjistilo se, že jde o plně funkční sekvenci lehkého řetězce, neobsahuje posun v rámci, s největší pravděpodobností používá geny VK167 nebo VK24, a je umístěna jako netypická sekvence skupiny II podle Kabata. Úplná sekvence klonu VKJ se zobrazila na obrázku č. 2 (SEQ ID NO: 2) . Dále se provedla druhá nezávislá PCR za použití páru primerů, která produkuje produkt, který se klonoval a sekvenoval, aby se předešlo možnosti, že sekvence VKJ zahrnuje chyby PCR. Klony z této druhé amplifikace měly sekvenci shodnou s původním klonem VKJ.

Definitvní důkaz, že VKJ obsahoval variabilní oblast lehkého řetězce Cil se získal prostřednictvím konstrukce chimérických protilátek za použití VK a VH, které se popisují shora v textu. Ukázalo se, že protilátky váží CD23.

Návrh chimérových protilátek

Aby se ověřilo, že se klonovaly a sekvenovaly správné variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce, zkonstruovaly se chimerové anti-CD23. Variabilní oblast těžkého řetězce se amplifikovala za použití klonů z knihovny cDNA. Forward primer obsahoval 5'klonovací místo (Hind III), 5'nepřekládanou sekvenci zahrnující funkční Kozákův signál, spolu s prvními šesti kodony myší variabilní těžké oblasti. Reverzní primer zavádí restrikční místo Spe I do rámce 4, aby se fúzoval s lidskou konstantní oblastí gamma I. Za použití těchto primerů vznikl produkt obsahující 430 párů baží.

anti-CD23 chimérické PCR oligonukleotidy těžkého řetězce:

·· tf· tftf ♦ tftf • tftf tftftftf tftftf tf tftftf tftftf tftf

5'gAT gAA gCT TTA CAg TTA CTC AgC ACA	Cag gAC CTC ACC ATg gAT
TTT ggg Ctg ATT 3' SEQ ID NO	: 19
5'gAT ggA CTA gTg TCC CTT ggC CCC A 3'	SEQ ID NO: 20
Zkonstruovaly se primery pro	amplifikaci variabilní
oblasti anti-CD23 lehkého řetězce	za účelem připravit

chimérický lehký řetězec. Tyto primery obsahují 5'klonovací místo (Hind III), 5' nepřekládanou sekvenci zahrnující signál podle Kozaca, spolu s prvními šesti kodony myšího variabilního lehkého řetězce. Reverzní primer obsahoval restrikční místo BsiW 1 a antikodony vhodné pro určité aminokyseliny.

Reduntantní kódy jsou standardní: Y = T nebo C, Κ = T nebo G, V = A, G nebo C. Produkt obsahoval 420 párů baží.

anti-CD23 chimérické PCR oligonukleotidy lehkého řetězce:

5'gAT gAA gCT TTA CAg TTA CTC AgC ACA CAg gAC CTC ACC ATg Agg TTC TCT gTT CAg SEQ ID NO: 21

5'gAT gCg TAC gTY TKA TYT CCA VCT TKG T 3' SEQ	ID NO: 22	(a
SEQ ID NO: 42	až 45 a 52 a 53)
T R Κ I E	L Κ T
R	V
Produkty	těžkého řetězce	se	čistily,	štěpily	se
restrikčními	enzymy Hind III a	Spe	I, pak se	klonovaly	do

vektoru pUC štěpeného restrikčními enzymy Hind III a Spe I, který obsahuje konstantní oblast lidského gamma I. Používaná lidská konstantní oblast byla těžký řetězec IgGl popsaný v publikaci Reichmann L et al., (1988) Nátuře 322, 323-327,

Page, M. J. and Sydenham, M. A. (1991) Biotechnology 9, 64-68 a Crowe J. S. et al., Clinical Exp. Immunol. (1992) 87-105.

» ♦· • ·

9·9

Variabilní a konstantní oblast se získala z vektoru pUC restrikčním enzymem Hind III a EcoRI, pak se klonovala do restrikčního místa Hind III - EcoR 1 expresívního vektoru pEE6, který se získal od firmy Celtech (Stephens and Cockett and Nucl. Acids, Res. (1989) 17, 7110).

Když se sekvenoval chimérický těžký řetězec chybělo 100 párů baží 5'sekvence. Po testování sekvence myšího variabilního řetězce se objevilo vnitřní restrikční místo Hind

III. Aby vznikla variabilní sekvence úplného těžkého řetězce vytvořená v produktech PCR, produkt PCR se štěpil restrikčním enzymem Hind III a malý fragment obsahující 100 párů baží se klonoval do pEE6 tráveného enzymem Hind III, který obsahuje těžký řetězec chimérických protilátek anti-CD23.

PCR produkty lehkého řetězce se čistily, pak se štěpily restričními enzymy Hind III a BsiW 1. Pak se ligovaly do vektoru pUC, který obsahuje konstantní oblast lidského kappa. Použití konstantní oblasti lidského kappa se popisuje v publikaci Reichmann L et al., (1988) Nátuře 322, 323-327.

Variabilní a konstantní oblast se odstranila z vektoru pUC restrikčním enzymem Hind III a Eco RI. Tento fragment se klonoval do restrikčního místa Hind III - EcoR 1 expresívního vektoru pEEl2, který se získal od firmy Celltech (Bebbington and Hentschel, In DNA Cloning Vol. 3, Chapter 8 IRL Press 1987) .

Chimérický těžký řetězec se izoloval jako kazeta Bgl II Sal I a začlenil se do restrikčního místa BamHI - Sal I plazmidu lehkého řetězce pEE12 tak, že geny lehkého a těžkého řetězce byly na stejném plazmidu.

Konečná exprese plazmidu, která obsahuje chimerový CD23 se dočasně exprimovala v buňkách COS (buňky ledvin šedé opice). Transfektam (Promega) se rekonstituoval v koncentraci 1 mg/ml podle doporučeného protokolu výrobce. V den před transfekcí se t

» · · • · • ··· do prohlubně vneslo 5 x 10⁵ buněk a připravilo se tak šest ploten (Costar) při celkovém objemu 2,5 ml média. Jako médium se použilo Dulbeccovo upravené Eagle Médium (Gibco/BRL) a 10 % dialyzované fetální telecí sérum (Hyclone). Plotny se inkubovaly přes noc při teplotě 37 °C. Pro každou prohlubeň na plotnách se 6 prohlubněmi se připravila směs, kdy 20 gl transfektamu se přidalo do 0,5 ml média bez séra ve sterilním polystyrénovém kontejneru, pak se směs rychle promíchala na vortexu. V případě každé prohlubně, kde mělo dojít ke transfekci se do 0,5 ml roztoku transfektamu v médiu bez séra přidaly 4 gg plazmidové DNA. Pak se prohlubně zamíchaly a nechaly se stát při teplotě místnosti po dobu 10 minut. Zatím se připravily buňky pro transfekci. Z buněk, které se transfekují, se odstranilo kultivační médium, pak se buňky v každé prohlubni opatrně promyly 1 nebo 2 krát 5 ml předem ohřátého kultivačního média bez séra. Pak se přidalo do každé prohlubně 0,5 ml kultivačního média bez séra. Dříve připravený roztok 0,5 ml DNA/transfektam se přidal do každé prohlubně a pak se buňky nechaly růst. Plotny se jemně míchaly, pak se vrátily do inkubátoru na další čtyři hodiny. Do transfekčního roztoku se přidaly dva mililitry úplného média (obsahující 1,5 násobek koncentrace normálního séra). Plotny se vrátily do inkubátoru na dobu tří dnů. Z ploten se shromáždilo kultivační médium a testovala se aktivita protilátek.

V testu ELISA se chimérické protilátky vázaly na sCD23. V případě testu ELISA, který slouží pro stanovení navázání SCD23, se plotny EIA/RIA (Costar) potáhly 100 gl na jednu prohlubeň sCD23 v koncentraci 2 gg/ml v roztoku 35 mM NahCO₃, 15 mM Na₂CO₃, pH 9,3 přes noc při teplotě 4 °C. Plotny se promyly třikrát 150 mM NaCl, 50 mM baží Trizma, 0,1 % (objem) Tween-20, pH 7,4 (TBS/Tween) a blokovaly se po dobu 1 až 2 hodin pří teplotě 22 °C 2% bovinním sérovým albuminem ·· * · · · • 4 4 4 • 4·4 4 · v TBS/Tween v množství 100 μΐ na prohlubeň a promyly se třikrát směsi TBS/Tween.

Ředění supernatantů z myších hybridomů Cil se přidalo v množství 100 μΙ/prohlubeň do jedné části plotny s 96 prohlubněmi a do další části plotny s 96 prohlubněmi se přidala ředění chimérických protilátek anti-CD23 exprimovaných v supernatantech buněk COS. Myší protilátky Cil se detekovaly konjugátem anti-myší IgG (celá molekula) - peroxidáza, který pochází z koz a je možné ho získat od firmy Sigma A4416. Konjugát se ředil v poměru 1:1000 v PBS/BSA (bovinní sérový albumin) (1%). Chimérické protilátky anti-CD23 se detekovaly za použití konjugátu protilátek proti lehkému řetězci lidského kappa (vázaného a volného) s peroxidázou (Sigma A-7164), který se ředí v poměru 1:5 000 v PBS/BSA (1 %). Chimérické anti-CD23 se v testu ELISA váží na sCD23.

Chimérické protilátky proti CD23 se také váží na membránu CD23, jak se stanovilo pomocí FACS. Tato data ukázala, že správné variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce Cil se klonovaly a sekvenovaly. Tyto myší sekvence se pak použily k vývoji humanizovaných protilátek proti CD23.

Konstrukce genů humanizovaného těžkého a lehkého řetězce

Humanizované těžké a lehké řetězce se zkonstruovaly podle následující metody, která se popisuje v publikaci Lewis and Crowe (Gene 101, 297-302, 1991).

(i) lehký řetězec

Sekvence variabilní oblasti kostry myších protilátek se porovnaly se sekvencemi kostry lidských protilátek v databázi

GenBank. Homologie kostry lidského lehkého řetězce se porovnala z homologií sekvence variabilní kostry lehkého řetězce myších anti-lidských anti-CD23 protilátek. Kostra

4 4 4 ·

444 4« 444 vykazující největší homologii se vybrala jako templát pro extenzi pomocí PCR.

Lokus: HSIGKVII 490 bp mRNA

Definice: Lidská upravená DNA pro vedoucí peptid imunoglobinu kappa a variabilní oblast Zdroj: Homo sapiens

Autor: Klobeck, H.G. et al., Contribution of human V kappa II germ-line genes to light Chain diversity, nátuře, 309, 73-76,

1984.

Testovala se každá aminokyselina, která se liší ve stejné » poloze od kostry myších a lidských protilátek. Lidská aminokyselina zůstala, jestliže navázání antigenu není ovlivněno, protože lidské zbytky jsou méně imunogenní než myší zbytky. Označení specifických zbytků, které ovlivňují navázání je hypotetické a je založeno na datech získaných z jiných )» interakcí protilátka-antigen. Z publikovaných dat se ukázalo, že zbytky 71, 91 a 94 v kostře těžkého řetězce interagují s navázáním antigenu (Tramontano, A., Chothia, C., and A.M. Lesk, J. Mol. Biol., 215, 175-182, 1990, Kettleborough, C.A., Saldanha, J. , Heath, V. J., Morrison, C. J. and M.M. Bending, Protein Eng, 4, 773-783, 1991) . Tyto zbytky mohou být proto stejné v humanizované kostře jako v myší kostře. Každá změna aminokyseliny se zvažuje z hlediska velikosti, hydrofobicity, hydrofility a náboje. Jestliže lidská aminokyselina je podobná s myší aminokyselinou v těchto charakteristikách, pak se v tomto místě použije lidská aminokyselina.

’ Při porovnání variabilní aminokyselinové sekvence kostry myšího lehkého řetězce a variabilní sekvence lidského lehkého řetězce, která vykazuje největší homologii, se zjistilo 13 rozdílů. Nezachoval se žádný z myších zbytků. Vytvořila se variabilní sekvence humanizovaného lehkého řetězce a program

GCG se použil pro identifikaci tichých míst v případě ···· ·· ·· ··· ·· · následujících enzymů: AccI, Hael, Nhel, PvuII, Xbal, Xhol, Xmal.

V nukleotidové sekvenci se provedly změny tak, aby byly zahrnuty uvedená místa restrikčních enzymů, aniž dojde ke změně aminokyselinové sekvence. Přítomnost uvedených míst umožňuje snažší štěpení a spojení fragmentů PCR klonů.

Humanizovaný variabilní lehký řetězec se vytvořil vnesením CDR myšího lehkého řetězce do existujícího templátu (například HSIGKVII, popisuje se v publikaci Klobek, H. G. et al., Nátuře (1984) 309, 73-76), který obsahuje vybranou sekvenci kostry lidského lehkého řetězce za použití sestřihu přesahu pomocí PCR (popisuje se v publikaci Crowe J. S. et al., Clinical Exp. Immunol. (1992) 87-105. Připravily se plazmidy kódující variabilní sekvence humanizovaného lehkého řetězce:

sekvence podle Kozaca pro transkripci a signální sekvence (MGWSCIILFLVATATGVHS-SEQ ID NO: 15) se zahrnula do templátové sekvence lehkého řetězce. Na 5'konec produktu PCR vhodného pro klonování se přidalo restrikční místo Hind III a na jeho 3'konec se přidalo restrikční místo Bswi I. Oligonukleotidy vhodné pro PCR extenzi jsou:

Al : 3'	SEQ	ID	NO:	23.	5' gAT CAA gCT TCT	CTA	CAg	TTA	CTg	AgC	ACA
Bl: gAg	SEQ ACT	ID CTT	NO: ACT	24. CgA	5' AAT CAA gTA TgT gCg ACA ggA gAT ggA	CTT ggC	CCC 3'	ATC	CTT	ATA	CAg
CL: ggg	SEQ AAg	ID ACA	NO: TAC	25. TTg	5' CgC TCg AgT AAg AAT Tgg TAC CTg CAg	AgT AAg	CTC 3'	CTg	TAT	AAg	gAT
Dl: gAg	SEQ CTg	ID 3'	NO:	26.	5' TgA TgC CCg ggT	ggA	CAT	CAA	ATA	gAT	Cag
El: gAC	SEQ Agg	ID 3'	NO:	27.	5' TTg Atg TCC ACC	Cgg	gCA	TCA	ggg	gTC	CCT

·· ·· ·» · φφ * · φ φ · ·· · · · φ φφφ φφφ φ φ

F_l: SEQ ID NO: 28. 5' AgC CAC CTg Acg TTT gAT CTC CAC CTT ggT CCC TTg gCC gAA CgT gAA Tgg ATA CTC TAC CAg CTg TTg ACA gTA ATA AAC CCC 3'

Reakce PCR (popisuje se v publikaci Saiki et al., Science 239, 487-491, 1988) se provedly v programovatelném zahřívaném bloku (Perkin Elmer, GeneAmp 9600) za použití 25 cyklů při cyklizaci teplot (94 °C po dobu 1 minuty, 50 °C po dobu 2 minut, 72 °C po dobu 3 minut) , pak následuje konečný 5 minutový krok při teplotě 72 °C. V konečném reakčním objemu 50 μΐ jsou obsaženy primery (každý v koncentraci 40 μΜ) , specifikované množství templátu a 2,5 jednotek Taq polymerázy (Perkin Elmer Cetus) a reakční pufr podle doporučení výrobce.

Provedly se tři primární reakce PCR, kdy se při každé reakci použilo 10 ng templátu, páry primerů A_L s B_L, C_L s D_L, E_L s F_l. Produkty uvedených reakcí, což jsou fragmenty AB_L, CD_L a EF_l se čistily za použití sady „Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen Ltd., Surrey, UK, produkt #28104) podle protokolu doporučeného výrobcem. Fragmenty AB_L a CD_L se kombinovaly za použití jedné desetiny každého čištěného produktu a provedla se rekombinanční reakce PCR s primery A_L a D_L. Produkt této reakce, což je fragment AD_L, se čistil jako shora v textu. Jedna destina produktu se kombinovala v rekombinantní reakci PCR s jednou desetinou čištěného EF_L za použití primerů A_L a F_l. Konečný produkt rekombinační PCR humanizovaného lehkého řetězce AF_L se ligoval do pCR™ II, který pochází ze sady „TA Cloning Kit (Invitrogen BV, Leek, The Netherlands, produkt #K2000~01), přičemž se postupuje podle protokolu doporučeného výrobcem. Plazmidové izoláty se sekvenovaly za použití fluorescenčního sekvenátoru ABI.

(ii) Těžký řetězec ·· ·» • · * · · · • · 9 · · · • · 9 9 9 9

9999 99 99 999

Identifikovala se sekvence kostry lidských protilátek, která vykazuje největší homologii se sekvencí kostry myších protilátek, vhodná pro těžký řetězec. Sekvence vykazující nej vyšší homologii v databázi v případě těžkého řetězce je:

Lokus: HUMSIGVS 423 BP MRNA

Definice: mRNA řetězce lidského Ig mu oblast 5' konce V3b-D-J4 Zdroj: cDNA k mRNA Homo sapiens

Autoři: Sanz, I et al., VH sequence of human autoantibody. Evidence That autoantibodies can be unmutated copies of germline genes. J. Immuno. 142, 883-887, 1989.

Při porovnání variabilní aminokyselinové sekvence kostry myšího těžkého řetězce a variabilní sekvence lidského těžkého řetězce, která vykazuje největší homologii, se zjistilo 17 rozdílů. V pěti pozicích 49, 66, 76, 77 a 94 se zachovala myší aminokyselina. Ve všech dalších polohách se při humanizaci kostry těžkého řetězce použily lidské aminokyseliny.

Vytvořil se soubor variabilní sekvence humanizovaného těžkého řetězce a program GCG se použil pro identifikací tichých míst v případě následujících enzymů: EaglI, Nhel, Xbal, Xhol, Xmal.

V nukleotidové sekvenci se provedly změny tak, aby byly zahrnuty uvedená místa restrikčních enzymů, aniž dojde ke změně aminokyselinové sekvence. Přítomnost uvedených míst umožňuje snažší štěpení a spojení fragmentů PCR klonů.

Na 5'konec sekvence variabilní oblasti humanizovaného těžkého řetězce se přidalo restrikční místo Hind III vhodné pro klonování, sekvence podle Kozaka vhodná pro iniciaci transkripce a myší signální sekvence (MAWWTLLFLMAAAQSAQA -SEQ ID NO: 16) pro účely vylučování proteinu. Na 3'konec sekvence se přidalo restrikční místo Spěl, které je vhodné pro klonování.

i

··	<··	··	•
• »	•	• ·	··	t	9	99
	• ··	*	«	•	•	9
•	• ·	•	9	•	•	•
····	98	«·	·· ·	··	99

Variabilní kostra humanizovaného těžkého řetězce, který obsahuje myší CDR se připravila pomocí PCR za použití dlouhých překrývajících se oligonukleotidů. Syntetizovalo se osm oligonukleotidů, které tvoří přibližně 60 párů baží s přesahem 15 párů baží. Tyto oligonukleotidy jsou následující:

AH: ACC	SEQ TTg	ID CTA	NO: TTC	29. CTg	5'ACA CgA AgC TTC ACC ATg gCg gCC gCC CAA 3'	Atg	gCT	Tgg gTg	Tgg
BH:	SEQ	ID	NO:	30.	5' CTT TAC CAA gCC TCC	CCC	AgA	CTC	CAC	Cag
CTg	CAC	CTC	TgC	TTg	ggC ACT TTg ggC ggC CgC	CAT	3'
CH:	SEQ	ID	NO:	31.	5' TTg gTA AAg CCC ggg	ggg	TCC	CTT	AgA	CTC
TCC	TgT	gCA	gCT	AgC	ggA TTC ACT TTC AgT 3'
DH:	SEQ	ID	NO:	32.	5'CCC CTT CCC Tgg AgC	CTg	gCg	gAC	CCA	ggA
CAT	CCA	gTA	gCC	gAA	AgT gAA TCC gCT 3'
EH:	SEQ	ID	NO:	33.	5' ggg AAg ggg CTC gAg	Tgg	gTT	gCT	gAA	ATT
AgA	TTg	AAA	TCT	gAT	AAT TAT gCA ACA CAT 3'
FH:	SEQ	ID	NO:	34.	5' ATC ATC TCT TgA gAT	ggT	gAA	TTT	CCC	CTT
CAC	AgA	CTC	CgC	ATA	ATg TgT TgC ATA ATT 3'
GH:	SEQ	ID	NO:	35.	5' ATC TCA AgA gAT gAT	TCA	AAA	TCT	AgA	CTg
TAT	CTg	CAA	ATg	AAC	AgC CTg AAA ACC gAg gAC	ACA	3'
HH:	SEQ	ID	NO:	36.	5'ggT gAC TAg TgT TCC	CTg	gCC	CCA	gTC	TAT
gAA	ATC	TgT	ACA	gTA	ATA CAC ggC TgT gTC CTC	ggT	TTT	3'

Myší CDR se vneslo do templátu za použití rekombinační

PCR. PCR se provedla za použití programovatelného termálního cyklovače (Trio, Biometra). Reakce o objemu 50 μΐ obsahovala

2,5 jednotek polymerázy AmpliTaq (Perkin-Elmer-Cetus,

Beaconsfield, UK) v pufru, který poskytl výrobce. Tento pufr zaručuje preferované pH a intovou sílu vhodné pro amplifikací (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KC1 a 1,5 mM MgCl2) , 200 μΜ každého dATP, dCTP, dGTP a dTTP a amplifikační primery v koncentraci 1 μς/μΐ. Vzorky se zahřály na teplotu 94 °C po dobu 2 minut v zahřívacím bloku, centrifugovaly se po dobu 30 vteřin při 16 000 x G. Vzorky se umístily na led po dobu 1 minuty, pak se přidala Taq polymeráza a kapka minerálního oleje. Vzorky se míchaly na vortexu, pak se 30 vteřin centrifugovaly při 16 000 x G. Vzorky se pak umístily do programovatelného termálního cyklovače a proběhla reakce za následujících podmínek:

«

Krok 1: teplota 94 °C po dobu 1 minuty

Krok 2: teplota 50 °C po dobu 2 minut, skok na krok 3 při teplotě 0,4 °C/vteřinu _k krok 3: teplota 72 °C po dobu 3 minut, zpět na krok 1, opakovat smyčku 25 krát

Provedlo se sedm primárních reakcí PCR, kdy se při každé reakci použilo 1 μg/μl každého primeru za použití kombinací primerů Ah s Bh, Ch s Dh, Eh s Fh, Gh a Hh, Ah Bh Ch a Dh Eh Fh Gh a H_h, A_h B_h C_h D_h E_h F_h G_h a H_h. Alikvóty o objemu 1 μΐ primárních produktů PCR se kombinovaly s primery (1 μς/μΐ) a vystavily se stejným podmínkám reakce PCR, které se popisují pro primární reakce PCR, při kterých vzniká variabilní oblast těžkého řetězce v plné délce. Primární fragmenty PCR AF_H a EH_h, fragment AH_h, fragmenty AB_H, CD_H, a EF_H a GH_h, fragmenty AB_H, CD_h, EF_h, GH_h a AH_h se kombinovaly s primery A_H a H_h. Všechny reakce PCR produkovaly fragmenty celé délky. PCR produkt variabilní oblasti humanizovaného těžkého řetězce z reakcí AB_H, ς GH_h a AH_h se NA Wizard PCR Preps (Promega) podle protokolu, který doporučuje výrobce. Čištěné produkty se štěpily restrikčním enzymem Hind III a Spěl a pak se klonovaly do vektoru pUC, který obsahuje mutovanou konstantní oblast IgGl (popisuje dále v textu).

Konstrukce humanizovaných protilátek

PCR produkty variabilní oblasti humanizovaného těžkého řetězce se štěpily restrikčními enzymy Hind III a Spe I a pak se klonovaly do vektoru pUC, který obsahuje mutovanou konstantní oblast IgGl (popisuje se dále v textu). Variabilní oblast klonů se sekvenovala. Sekvence je uvedena na obrázku č. 3 a 4 (SEQ ID NO: 17 a 18). Vybral se klon obsahující správnou variabilní aminokyselinovou sekvenci humanizovaného těžkého řetězce. Tento klon má jednu skrytou změnu nukleotidu z modelové variabilní sekvence humanizovaného těžkého řetězce.

V případě konstantní oblasti humanizovaného těžkého řetězce se použily IgGl s mutacemi, aby se eliminovalo navázání Clq a Fc. Tyto mutace jsou založeny na následujících dvou publikacích: Duncan, A. R. and Winter, G. Localization of the Clq binding site on antibodies by surface scanning. Nátuře 332, 738-740, 1988 a Duncan, A. R. , Woolf, J. M., Partridge,

L. J., Burton, D. R. and Winter, G. Localisation of the binding for human FcRl on IgG. Nátuře 332, 563-564, 1988.

Mutace zbytků se popisuje v publikaci Kabat, A., Wu, T.T., Perry, Η. M., Gottesman, K.S. and C. Foeller, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Volume 1, page 680.

Změny provedené v IgGl za vzniku izotypu, který není > cytotoxický jsou následující: 248 Leu(Ctg) na Ala(gCg) a 250

Gly (ggA) na Ala(gCA).

_M Tyto mutace se připravily místně řízenou mutagenezí lidského IgGl následujícím způsobem:

' Konstantní oblasti oligonukleotidů PCR používané ke vzniku

IgGl s mutacemi byly následující:

SEQ ID NO: 37: A_c gCT CCT TTT AAg CTT Tgg ggT CAA ggC TCA CTA gTC ACA gTC TCC

SEQ

ID

NO:

38:

Bc

TgA

Cgg

TgC

CCC

CgC

gAg

TTC

Agg

SEQ

ID

NO:

39:

Cc

CCT

gAA

CTC

gCg

ggg

gCA

CCg

TCA

SEQ

ID

NO:

40:

Dc

AAg

CTT

CCg

TCg

AAT

TCA

TTT

ACC Cgg AgA CAg

Oligonukleotid A_c obsahuje restrikční místo Hind/Spe. Oligonukleotidy B_c a C_c obsahuje mutace v polohách 248 a 250. Oligonukleotid D_c obsahuje restrikční místo EcoRI. Oligonukleotidy A_c a B_c se použily pro vytvoření fragmentu AB za použití podmínek PCR, které se specifikují sekco obecné metodologie. Jako templát se použila klonovaná konstantní oblast lidského IgGl (reichmann, L., Clark, Μ. , Waldmann, H., and Winter, G., (1988) Reshaping human antibodies fpr therapy,· Nátuře 322, 323- 327). Oligonukleotidy C_c a D_c se použily k vytvoření fragmentu CD za použití stejných podmínek PCR a templátu jako v případě AB. Fragmenty PCR AB a CD se čistily za použití čistícího systému určeného pro DNA Wizard PCR Preps (Promega) . PCR fragmenty AB (5,0 μΐ) a CD_c (5,0 μί) se kombinovaly s oligonukleotidy A_c a D_c za vzniku fragmentu AD_C, který obsahuje konstantní oblast IgGl s mutacemi. Fragment AD_C se čistil za použití čistícího systému určeného pro DNA Wizard PCR Preps (Promega), štěpily se restrikčními enzymy Hindlll a EcorI, pak se ligovaly do plazmidu pEE6 štěpeného restrikčními enzymy Hind III a EcoRI, který obsahuje variabilní oblast humanizovaného anti-CD23 těžkého řetězce.

Konstantní oblast se sekvenovala, aby se potvrdily mutace. Fragment obsahující tyto mutace se přenesl do expresivního plazmidu pEE6, který obsahuje variabilní oblast humanizovaného anti-CD23 těžkého řetězce.

PCR produkty lehkého řetězce se štěpily restričními enzymy Hind III a BsiW 1, pak se klonovaly do expresívního plazidu pEE12, který obsahuje konstantní oblast lehkého řetězce • · · · lidského kappa, jak se popisuje shora v textu. Klony se sekvenovaly za použití fluorescenčního sekvenátoru ABI a vybral se klon obsahující správnou aminokyselinovou sekvenci pro variabilní oblast humanizovaného lehkého řetězce.

Fragment BglII-SalI obsahující humanizovaný těžký řetězec anti-CD23 z plazmidů pEE6 se ligoval do místa BamHI-SalI plazmidů pEEl2, který obsahuje humanizovaný lehký řetězec anti-CD23 za vzniku jednoho plazmidů, který obsahuje humanizovaný těžký a lehký řetězec anti-CD23. Variabilní a konstantní oblast humanizovaného těžkého a lehkého řetězce obsažené v konečném plazmidů se sekvenovaly.

Dočasná exprese humanizovaných protilátek

Plazmid s humanizovanými anti-CD23 se transfekoval do buněk COS a dočasně se exprimoval za použití stejného protokolu, jak se popisuje v případě chimérických protilátek shora v textu. Expresívní plazmid s humanizovanými anti-CD23 se transfekoval do buněk COS a dočasně se exprimoval, jak se popisuje v případě dočasné exprese chimérických anti-CD23.

Koncentrace chimérických a humanizovaných anti-CD23 protilátek nutných pro poloviční maximální navázání na CD23 se testoval za použití testu ELISA s sCD23, který se popisuje shora v textu. Absorbance při vlnové délce 405 nm se vynesla do grafu proti rozmezí koncentrací protilátek za vzniku sigmoidální křivky. Absorbance se odečítala za použití zařízení pro odečítání ploten „Molecular Devices (Menlo Park, Calif., USA) a softwaru Softmax (Molecular Device Corp.), aby se stanovila křivka nejlépe vyhovující log-logit algoritmu, parametry rovnice a korelační koeficient. Křivka se popisuje v publikaci Data Analysis and Quality Control of Assays: A Practical Primer, R P Channing Rogers in Practical Immuno Assay, editor Wilfrid R. Butt, publikuje Marcel Dekker, lne. New York 1984. Algoritmus odpovídající log-logit rovnici byl • · • · založený na metodě Levenberg-Marquardt. Tato metoda se popisuje v publikaci Numericical Principles in C: The Art of Science computing, William H. Press, Brían P. Flannery, Saul A. Teukolski and William T. Vetterling, publikováno Cambridge University Press, New York, 1988. Hodnoty pro proměnnou x vyjádřené v ng/ml se vypočítaly pro následující rovnici:

x= cx fa-yl 1/b [y-d] kdy y + d-c 2 a kde symbol d je hodnota y odpovídající asymptotě při vysokých hodnotách osy x, symbol a je hodnota y odpovídající asymptotě při nízkých hodnotách osy x, symbol c je hodnota x odpovídající středu mezi a a d, symbol b popisuje jak rychle křivka vykonává tranzici od asymptot ve středu křivky. V typickém případě nabývá hodnoty

1.

Poloviční maximální navázání sCD23 chimérickými anti-CD23 je 16,28 ng/ml (zobrazeno na obrázku č. 5). Konstanta pro poloviční maximální navázání humanizovaných anti-CD23 je 15,03 ng/ml (zobrazeno na obrázku č. 6) . Tato data ukazují, že humanizované anti-CD23 mají ekvivalentní navázání s chimérickými anti-CD23, které mají kompletní myší Cil variabilní oblast.

Stabilní exprese

Za použití amplifikačního systému genu glutaminové syntetázy získaného od firmy Celtech se vybraly stabilní buněčné linie exprimující humanizované anti-CD23. Pracuje se podle základního systému, který je popsaný v publikaci

Bebbington et al., 1992, Biotechnology 10, 169-175. Tento systém popisuje přípravu stabilních buněčných linií zavedením linearizovaných expresívních vektorů, které obsahují cDNA kódující glutaminovou syntetázu křečků, kterou řídí časný promotor SV40 a sestřih SV40 a polyadenylační signál a cDNA těžkého a lehkého řetězce protilátek, do buněk savců elektroporací. Transfekované buňky se pak vybraly na základě jejich schopnosti růstu v kultivačním médiu bez glutaminu. Buňky NSO (buňky B myšího myelomu, které nevylučují imunoglobin) se použily při přípravě humanizovaných anti-CD23. Stabilní buněčné linie se kultivovaly v Iscově upraveném Dulbeccově kultivačním médiu (Sigma) s 2 mM glutaminem (GIBCO/BRL) a 10 % fetálním telecím sérem (Hyclone) (NonSelect médium). Buněčné linie anti-CD23 se připravily následujícím způsobem. Expresívní plazmid obsahující humanizované anti-CD23 (40 μρ) se linearizoval FsPl (New England Biolabs), srážel se etanolem a resuspendoval se ve sterilní vodě o objemu 50 μΐ. Stanovil se počet exponenciálně rostoucích buněk NSO. Buňky (10⁷) se centrifugovaly a promyly se ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanem (PBS). Buňky se resuspendovaly v 950 μΐ sterilního PBS. DNA se přidala do elektroporačních kyvet (0,4 mm, Bio-Rad), které se uchovávaly na ledu. Kyvety se umístily do elektroporátoru BioRad a proběhlo zavedení dvěma konzekutivními pulzy při napětí 1 500 voltů a 3 μΕ. Kyveta se odstranila a umístila se na led. Buňky se naředily na koncentraci 10 , 10 , 10 buněk v mililitru neselekčního kultivačního média a nanesly se na plotny s 96 prohlubněmi (Costar) v množství 50 μΐ na jednu prohlubeň. Příští den se do každé prohlubně přidalo 150 μΐ Iscovova Dulbeccova upraveného média (Sigma) s 60 μρ/ml kyseliny glutamové (Sigma), 60 μρ/ml asparaginu (Sigma), 7 μρ/ml každého aenosinu (Sigma) , guanosinu (Sigma) , cytidinu (Sigma), uridinu (Sigma)a thymidinu (Sigma) a 10 fetálního • · ·· telecího séra (Hyclone) (selekční médium). Plotny se vrátily do inkubátoru s teplotou 37 °C a nechaly se kultivovat až se projevilo podstatné odumírání buněk a zůstalo pár živých kolonií.

Kolonie se přenesly z konfluentních ploten s 96 prohlubněmi do jedné prohlubně na plotně, která obsahuje 24 prohlubní. Po několika dnech se konfluentní kultura použila při inokulaci kultivační lahve o objemu 25 cm². K použitému kultivačnímu médiu se přidalo čerstvé selekční médium. Kultury se udržovaly v koncentraci 10⁵ až 10⁶ buněk/ml. Stanovila se rychlost specifické produkce (SPR) 144 klonů, aby se porovnala produkce protilátek u každého klonu tak, že se vybral klon s nejvyšší produkcí jako produkční linie. SPR se stanovilo tak, že se vzalo 10⁶ buněk konfluentní lahve, buňky se promyly PBS a pak se buňky přidaly do 10 ml čerstvého média a kultivovaly se po dobu 24 hodin při teplotě 37 °C. Produkce protilátek se hodnotila testem ELISA.

U klonů se nejprve testovala produkce lidského IgG za použití testu ELISA. Plotny EIA/RIA (Costar) se potáhly 100 μΐ kozího anti-lidského IgG v koncentraci 5 μρ/ml (Jackson Immunoresearch Labs #109-001-003) v 35 mM NaHCCh, 15 mM Na2CC>3, pH 9,3 a nechaly se stát přes noc při teplotě 4 °C. Plotny se třikrát promyly 150 mM NaCl, 50 mM baží Trizma, 0,1 % (objem) Tween-20, pH 7,4 (TBS/Tween) , blokovaly se po dobu 1 až 2 hodin při teplotě 22 °C se 100 μΐ na jednu prohlubeň 2% bovinního albuminového séra v TBS/Tween a třikrát se promyly TBS/Tween. Do prohlubní se přidalo 100 μί kontrolního standardu Campath-1H IgGl (popisuje se v publikaci Page, M. J. and Sydenham, M. A. (1991) Biotechnology 9, 64-68) (1 000 ng/ml až ng/ml) v kontrolním médiu nebo ve supernatantech vzorků ve třech sadách. Plotny se nechaly inkubovat přes noc po dobu 4°C. Plotny se promyly pětkrát TBS/Tween a přidalo se 100 μί ředění ··· ·· ·

1: 5000 kozího anti-lidského konjugátu alkalické fosfatázy (Jackson Immunoresearch Labs #109-055-088) a inkubovaly se po dobu 2 hodin při teplotě 22 °C nebo přes noc při teplotě 4 °C. Plotny se promyly pětkrát TBS/Tween a přidalo se 100 μΐ 3 mM pNPP v substrátovém pufru (Sigma 104-0) a plotny se odečítaly při vlnové délce 405 nm na odečítacím zařízení pro mikrotitrační destičky (Molecular Devices) za použití 20 minutového kinetického programu. Standardní křivky a koncentrace IgG ve vzorku se vypočítalo a hodnoty přímo zpracoval program. SPR se vyjadřuje v pg/10⁶ buněk /24 hodin. SPR 144 klonů se pohybovala v rozmezí 14 až 0 Hg/10⁶ buněk/24 hodin. Klony exprimující alespoň 5 μg/10⁶ buněk/24 hodin se testovaly pro navázání sCD23 za použití už popsaného testu ELISA. Chimérické CD23 se v těchto testech použily jako standardy.

Lyže komplementu a testy ADCC

Humanizované anti-CD23 značené FITC se použily k potvrzení exprese povrchových CD23 na buňkách RPMI 8866 průtokovou cytometrií. Stejná buňka se obarvila FITC značenými humanizovanými anti-Cdw52 protilátkami (hCD52) a zjistilo se, že nevykazují expresi CD₅₂. Naopak buňky Wein 133 vykazují expresi hCD52, ale nevykazují expresi anti-CD23.

Buňky RPMI 8866 se obarvily europiumdiethylentriaminopentaacetátem (Eu/DTPA) zatímco buňky Wein 133 se značily samariumdiethylentriaminopentaacetátem (Sm/DTPA) podle metod, které se popisují v publikaci Blomberg, K, 1993, J. Immunol. Methods. 168, 267, Patel et al., 1995, J. Immunol. Methods, 184, 29). Směs 1:1 značených buněk Wein 133 a buněk RPMI 8866 se pak lyžovala buď hCD52 nebo anti-CD23 v přítomnosti NHS, jako zdroje komplementu. Aktivace komplementu prostřednictvím klasické dráhy pomocí hCD52 způsobuje uvolnění Sm/DTPA. V přítomnosti anti-CD23 se

neuvolnilo žádné Sm/DTPA. Data potvrzují, že pouze hCD52 a nikoli anti-CD23 vyvolávají lyži buněk Wein 133. Data dále potvrzují, že dráha komplementu se může aktivovat, aby došlo k lyži buněk. Jak se předpokládalo, pomocí hCD52 se neuvolnilo z buněk RPMI 8866 žádné Eu/DTPA. Ačkoli buňky RPMI 8866 exprimují CD23, pomocí anti-CD23 se neuvolnilo žádné Eu/DTPA, což ukazuje, že protilátky nejsou schopny aktivovat komplement.

Lyže směsi značených buněk Wein 133 a RPMI 8866 v poměru 1: 1 pomocí buněčnou toxicitou závislou na protilátkách (ADCC) se provedla buď anti-CD23 nebo hCD52 v přítomnosti periferních krevních jednojaderných buněk (PBMC). Uvolnění Sm/DTPA pomocí hCD52 a nikololiv anti-CD23 potvrdilo, že pouze anti-CD23 nejsou schopny zprostředkovat ADCC lyži buněk Wein 133. To nebylo překvapující, protože buňky Wein 133 neexprimují CD23. Ani protilátky nezpůsobují uvolnění Eu/DTPA. To naznačuje, že ačkoli exprese CD23 se potvrdila u buněk RPMI 8866 průtokovou cytometrií, v souvislosti s anti-CD23 se nedetekovala žádná lyže buněk zprostředkovaná ADCC.

Kinetická analýza

Rychlost asociace, disociace a disociační rychlostní konstanta pro navázání humanizovaných anti-CD23 na antigen CD23 se hodnotila biosenzorem Baicore. Čištěný rekombinantní CD23 se imobilizoval na povrchu senzoru CM5. Karboxylové skupiny na povrchu dextranu se aktivovaly l-ethyl-3(3dimethylaminopropyl)karbimidem (EDCO/N-hydroxysukcimimid (NHS). Po aktivaci prošly rekombinantní CD23 přes povrch, aby iniciovaly imobilizaci. Pak se přidal ethanolamin, aby se deaktivovaly zbylé aktivní skupiny. Humanizované anti-CD23 ředěné v pufru HBS prošly přes povrch senzoru. Navázání antiCD23 na imobilizovaný CD23 se monitorovalo v reálném čase, aby se odhadla rychlost asociace (M^sec^-1) . Také se monitorovala • tf ·· • · · • ··· tftftf · tftf

disociace CD23 a anti-CD23 komplexu v pufru, aby se odhadla rychlost disociace (sec'¹) . Disociační konstanta (nM) se vypočítala s disociační a asociační rychlostí. V případě 6-ti vsádek anti-CD23 data ukazují asociační rychlost v rozmezí 1,5 až 1,85 x 10 ⁶ M“¹sec'¹ a disociační rychlost 1 až 2 x 10^-5 sec' ¹. Zjistilo se, že disociační konstanta v případě protilátek anti-CD23 je v rozmezí 8 až 12 pM. Stanovilo se, že afinitní konstanta je přibližně 9 x 1O¹⁰ Ka mol^-1.

♦ · ii ii

11 11 ♦ ··♦ 1 1

111 1

119 11

1111 11 11

19 1

11

111 11 1

Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 415 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: CDS
	(B)	Pozice: 3 ..413
	(D)	Jiné informace: Mus musculus
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
get tta cag tta	ctc agc aca cag gac ctc acc atg gat ttt ggg

Ala Leu Gin Leu Leu Ser Thr Gin Asp Leu Thr Met Asp Phe Gly 1 5 10 15

ctg Leu ctt Leu

att Ile gag Glu

ttt ttt Phe Phe gag tet

att Ile 20 gga Gly

gtt ctt tta Val Leu Leu

aaa ggg gtc cag agt gaa gtg

aag Lys aaa Lys

Lys Gly Val Gin 25

Ser Glu

Val 30 atg Met

gga Gly

tcc Ser 45

gga ggc Gly Gly

ttg Leu

gtg Val 40

caa cct

gga Gly

Glu

Ser 35

Gin

Pro

ctc

tcc

tgt

gta

gcc

tet

gga

ttt

act

ttc

agt

ggc

tac

tgg

atg

tet

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Gly

Tyr

Trp

Met

Ser

50

55

60

tgg

gtc

ege

cag

tet

cca

gag

aag

ggg

ctt

gag

tgg

gtt

get

gaa

att

Trp

Val

Arg

Gin

Ser

Pro

Glu

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Glu

Ile

143

191

239 • tt tt· » · · tttttttt »··· tttt aga ttg aaa tet gat aat tat gca aca cat tat gcg gag tet gtg aaa

Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser Val Lys

85 ^{90 95}

287 ggg aag ttc acc atc tca aga gat gat tcc aaa agt cgt ctc tac ctg Gly Lys Phe Thr Xle Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg Leu Tyr Leu

100 -^-85 l’E0

335 caa atg aac age tta aga gct gaa gac agt gga gtt tat tac tgt aca Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Thr

115 120 125

383 gat ttc ata gac tgg ggc caa ggg aca cta gt

Asp Phe Ile Asp Trp Gly Gin Gly Thr Leu

130 135 (2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

415

	(A)	DÉLKA: 437 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: CDS
	(B)	Pozice: 3 ..437
	(D)	Jiné informace: Mus musculus

(Xi)

Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

aa gct tta cag tta ctc age aca cag gac ctc acc atg agg ttc tet Ala Leu Gin Leu Leu Ser Thr Gin Asp Leu Thr Met. Arg Phe Ser

49

• •

9 9

• · • 9 9 9 9 9 99

♦ · · « • · · • » · * • · · ♦ ·· ··

* · • · ···

9 9 9 9 9

gtt

cag

ttt

ctg

ggg

gtg

ctt

atg

ttc

tgg

atc

tet

gga

gtc

agt

ggg

95

Val

Gin

Phe

Leu

Gly

Val

Leu

Met

Phe

Trp

Ile

Ser

Gly

Val

Ser

Gly

20

25

30

gat

att

gtg

ata

acc

cag

gat

gaa

ctc

tcc

aat

cct

gtc

act

tet

gga

143

Asp

Ile

Val

Ile

Thr

Gin

Asp

Glu

Leu

Ser

Asn

Pro

Val

Thr

Ser

Gly

35

40

45

gaa

tca

gtt

tcc

atc

tcc

tgc

agg

tet

agt

aag

agt

ctc

ctg

tat

aag

191

-

Glu

Ser

Val

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Lys

Ser

Leu

Leu

Tyr

Lys

50

55

60

gat

ggg

aag

aca

tac

ttg

aat

tgg

ttt

ctg

cag

aga

cca

gga

caa

tet

239

Asp

Gly

Lys

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Phe

Leu

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ser

65

70

75

•

cct

cag

ctc

ctg

atg

tat

ttg

atg

tcc

acc

cgt

gca

tca

gga

gtc

tca

287

Pro

Gin

Leu

Leu

Met

Tyr

Leu

Met

Ser

Thr

Arg

Ala

Ser

Gly

Val

Ser

80

85

90

95

.gac

cgg

ttt

agt

ggc

agt

ggg

tca

ggc

aca

gat

ttc

acc

ctg

gaa

atc

335

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Glu

Ile

100

105

110

agt

aga

gtg

aag

gct

gag

gat

gtg

ggt

gtg

tat

tac

tgt

caa

caa

ctt

383

Ser

Arg

Val

Lys

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Leu

115

120

125

gta

gag

tat

cca

ttc

acg

ttc

ggc

tcg

ggg

aca

aag

ttg

gaa

ata

aaa

431

Val

Glu

Tyr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Ser

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

(

130

135

140

437 cgt acg

Arg Thr

145

99 99 9 ·9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 • tftftf 99 9 99

9 9 9 9 · · tf· · • 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 tftftf tftf · (2) Informace o SEQ ID NO: 3:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 16 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 15 10 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 48 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	i DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: CDS
	(B)	Pozice: 1 ..48
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO:

cgc tcg agt aag agt ctc ctg tat aag gat ggg aag aca tac ttg aat 48 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn

10 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein ·· φφ φ φ φ φφ • · · φ φ · · · φ · φφφφ φφ φ φφ φφφφ φφ φφ ··· φφ φφφ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser 1 ⁵ (2) Informace o SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (C) Pozice: 3 ..413 (D) Jiné informace: Mus musculus (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

ttg atg tcc acc cgg gca tca

Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser 1 5 (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 9 aminokysel
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii]	i DRUH	MOLEKULY: protein
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč:
	(B)	Pozice:

(D) Jiné informace: Mus musculus (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

Gin Gin Leu Val Glu Tyr Pro Phe Thr 1 5 i

00 00 0 00 000 0000 00

0000 00 0 · · (2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..27 (D) Jiné informace: Mus musculus (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

caa cag ctg gta gag tat cca ttc acg

Gin Gin Leu Val Glu Tyr Pro Phe Thr 1 5 (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 5 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii;	i DRUH	MOLEKULY: protein
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: Mus musculus

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

Gly Tyr Trp Met Ser 1 5 (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 párů baží ·· ·» • · · • 9 ·· ··

9 ···· ·* (Β) TYP: nukleová kyselina (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..15 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

ggc tac tgg atg tcc Gly Tyr Trp Met Ser

5 (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 19 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	i DRUH	MOLEKULY: protein
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: Mus musculus

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser 15 10 15

Val Lys Gly (2) Informace o SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

w		(A)	DÉLKA: 57 párů bázi
		(B)	TYP: nukleová kyselina
		(C)	DRUH ŘETĚZCE:
*		(D)	TOPOLOGIE:
	(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA

(ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS

··	«·		··	*		··
« ·	•	•	•	• ·	«	•
•	• ·«	•	•	•	•	•
*	• ·	• ·	•	»	« ·	9
•
···«	··			• ··		99

(xi) (B) Pozice: 1 ..57 Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

tat gca	aca	cat	tat	gcg	gag	tet	48
Tyr Ala	Thr	His	Tyr	Ala	Glu	Ser
10					15

gtg aag ggg Val Lys Gly (2) Informace o SEQ ID NO: 15:

(i)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: popis umělé syntetická sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

sekvence

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein

44	44	44	4		»4
• ·	•	• ·	• 4	•		4 9
•	···	• 4	•	•		4
•	• 4	4 ·	•	•		•
4444	• 4	44	«4·		4«	4

(ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: popis umělé sekvence:

syntetická sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gin Ser 1 5 10 15

Ala Gin Ala

2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 348 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: DNA

(ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: variabilní oblast lehkého řetězce humanizovaných protilátek anti-CD23 (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..348

	(xi)	Popis	sekvence:	SEQ	ID	NO:	17 :
gat	att gtg	atg act	cag tet cca	ctc	tcc	ctg	CCC	gtc acc	cct	gga	48
Asp	Ile Val	Met Thr	Gin Ser Pro	Leu	Ser	Leu	Pro	Val Thr	Pro	Gly
1		5			10				15

	56	····	• ·	• ·	• · ·
gag ccg gcc tcc	atc tcc tgt cgc tcg agt aag	agt ctc ctg	tat	aag	96
Glu Pro Ala Ser	Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys	Ser Leu Leu	Tyr	Lys
20	25	30
gat ggg aag aca	tac ttg aat tgg tac ctg cag	aag cca ggg	cag	tet	144
Asp Gly Lys Thr	Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gin	Lys Pro Gly	Gin	Ser
35	40	45
cca cag ctc ctg	atc tat ttg atg tcc acc cgg	gca tca ggg	gtc	cct	192
Pro Gin Leu Leu	Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg	Ala Ser Gly	Val	Pro
50	55	60
gac agg ttc agt	ggc agt gga tca ggc aca gat	ttt aca ctg	aaa	atc	240
Asp Arg Phe Ser	Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp	Phe Thr Leu	Lys	Ile
65	70 75			80
ago aga gtg gag	gct gag gat gtt ggg gtt tat	tac tgt caa	cag	ctg	288
Ser Arg Val Glu	Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr	Tyr Cys Gin	Gin	Leu
	85 90		95
gta gag tat cca	ttc acg ttc ggc caa ggg acc	aag gtg gag	atc	aaa	336
Val Glu Tyr Pro	Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr	Lys Val Glu	Ile	Lys
100	105	110
cgt acg gtg gct					348
Arg Thr Val Ala

115 (2) Informace o SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 1 335párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	i DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: umělá se

(ix) ZNAKY (D) Jiné informace: variabilní oblast těžkého řetězce humanizovaných protilátek anti-CD23 (ix) ZNAKY:

• ··· (A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..1 335

(xi)

Popis

sekvence:

SEQ

ID

NO:

18:

gag

gtg

cag

ctg

gtg

gag

tet

ggg

gga

ggc

ttg

gta

aag

ccc

ggg

ggg

48

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly Gly

Gly

Leu

Val

Lys

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

tcc

ctt

aga

ctc

tcc

tgt

gca

gct

age

gga

ttc

act

ttc

agt

ggc

tac

96

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Gly

Tyr

20

25

30

tgg

atg

tcc

tgg

gtc

ege

cag

gct

cca

ggg

aag

ggg

ctc

gag

tgg

gtt

144

Trp

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

gct

gaa

att

aga

ttg

aaa

tet

gat

aat

tat

gca

aca

cat

tat

gcg

gag

192

Ala

Glu

Ile

Arg

Leu

Lys

Ser

Asp

Asn

Tyr

Ala

Thr

His

Tyr

Ala

Glu

50

55

60

tet

gtg

aag

ggg

aaa

ttc

acc

atc

tca

aga

gat

gat

tca

aaa

tet

aga

240

Ser

Val

Lys

Gly

Lys

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

Lys

Ser

Arg

65

70

75

80

ctg

tat

ctg

caa

atg

aac

age

ctg

aaa

acc

gag

gac

aca

gcc

gtg

tat

288

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Lys

Thr

Glu

Asp.

Thr

Ala

Val

Tyr

85

90

95

tac

tgt

aca

gat

ttc

ata

gac

tgg

ggc

cag

gga

aca

cta

gtc

acc

gtc

336

Tyr

Cys

Thr

Asp

Phe

Ile

Asp

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

100

105

110

tcc

tca

gcc

tcc

acc

aag

ggc

cca

tcg

gtc

ttc

ccc

ctg

gca

ccc

tcc

384

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

115

120

125

tcc aag age

acc Thr

tet ggg ggc

aca gcg gcc ctg ggc tgc

ctg Leu

gtc Val

aag Lys

432

Ser

Lys 130

Ser

Ser

Gly

Gly 135

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly 140

Cys

gac

tac

ttc

ccc

gaa

ccg

gtg

acg

gtg

tcg

tgg

aac

tea

ggc

gcc

ctg

480

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

145

150

155

160

acc

age

ggc

gtg

cac

acc

ttc

ccg

get

gtc

cta

cag

tcc

tea

gga

ctc

528

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

-

165

170

175

tac

tec

ctc

age

age

gtg

gtg

acc

gtg

ccc

tcc

age

age

ttg

ggc

acc

576

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

180

185

190

cag

acc

tac

atc

tgc

aac

gtg

aat

cac

aag

ccc

age

aac

acc

aag

gtg

624

Glh

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

195

200

2OS

gac

aag

aaa

gtg

gag

ccc

aaa

tet

tgt

gac

aaa

act

cac

aca

tgc

cca

672

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

210

215

220

ccg

tgc

cca

gca

cct

gaa

ctc

gcg

ggg

gca

ccg

tea

gtc

ttc

ctc

ttc

720

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Ala

Gly

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

225

230

235

240

ccc

cca

aaa

ccc

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

gtc

768

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

245

250

255

aca

tgc

gtg

gtg

gtg

gac

gtg

age

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

ttc'

816

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

260

265

270 » · · • · • · ··

aac tgg

tac gtg Tyr Val 275

gac Asp

ggc gtg Gly Val

gag gtg cat aat

gcc Ala

aag Lys 285

aca Thr

aag Lys

ccg Pro

864

Asn

Trp

Glu Val 280

His

Asn

cgg

gag

gag

cag

tac

aac

agc

acg

tac

cgt

gtg

gtc

agc

gtc

ctc

acc

912

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

290

295

300

gtc

ctg

cac

cag

gac

tgg

ctg

aat

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

gtc

960

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

305

310

315

320

tcc

aac

aaa

gcc

ctc

cca

gcc

CCC

atc

gag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

gcc

1008

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

325

330

335

aaa

ggg

cag

CCC

ega.

gaa

cca

cag

gtg

tac

acc

ctg

CCC

cca

tcc

cgg

1056

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

340

345

350

gat

gag

ctg

acc

aag

aac

cag

gtc

agc

ctg

acc

tgc

ctg

gtc

aaa

ggc

1104

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

355

360

365

ttc

tat

CCC

agc

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

agc

aat

ggg

cag

ccg

1152

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

370

375

380

gag

aac

aac

tac

aag

acc

acg

cct

CCC

gtg

ctg

gac

tcc

gac

ggc

tcc

1200

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

385

390

395

400

ttc

ttc

ctc

tac

agc

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

agc

agg

tgg

cag

cag’’

1248

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

405 410

415 ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac 1296

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 ^{425 430} tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa tga 1335

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 ⁴⁴θ (2) Informace o SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 57 párů	baží
	(B)	TYP: nukleová	kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii:	1 DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:	umělá sekvence
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:	oligonukleotid
(xi)	Popis sekvence: SEQ	ID NO: 19:

gatgaagctt tacagttact cagcacacag gacctcacca tggattttgg getgatt

2) Informace o	SEQ ID NO: 20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 25 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
(ii) DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix) ZNAKY:
(D)	Jiné informace: umělá sekvence
(ix) ZNAKY:
(D)	Jiné informace: oligonukleotid
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:

• · · 0 0 0 0 ··· • · · · 0 0 · 00

61
	0000 00	00 000 00
gatggactag tgtcccttgg cccca		' 25
(2) Informace o SEQ ID NO: 21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 57 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: umělá sekvence
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: oligonukleotid

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

gatgaagctt tacagttact cagcacacag gacctcacca tgaggttctc tgttcag 57 (2) Informace o SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 28 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: umělá sekvence
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: oligonukleotid

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:

gatgcgtacg tytkatytcc avcttkgt 28 (2) Informace o SEQ ID NO: 23:

• · • · · · (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 30 párů	baží
	(B)	TYP: nukleová	kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:	umělá sekvence
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:	oligonukleotid
(xi)	Popi	s sekvence: SEQ	ID NO: 23:

gatcaagctt ctctacagtt actgagcaca (2) Informace o SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 63 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: DNA

(ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:

aatcaagtat gtottccoat ccttatacag gagactctta ctcgagcg.c agg.gatgga 60 63 ggc (2) Informace o SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

• · · *

	(A)	DÉLKA: 63 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: umělá sekvence
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: oligonukleotid

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:

cgctcgagta agagtctcct gtataaggat gggaagacat acttgaattg gtacctgcag 60 (2) Informace o SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 36 párů	baží
	(B)	TYP: nukleová	kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:	umělá sekvence
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:	oligonukleotid
(Xi)	Popis sekvence: SEQ	ID NO: 26:

tgatgcccgg gtggacatca aatagatcag gagctg (2) Informace o SEQ ID NO: 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 párů baží • 9

(B)	TYP: nukleová kyselina DRUH ŘETĚZCE: TOPOLOGIE:
	(C) (D)
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: umělá sekvence
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: oligonukleotid

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 27:

ttgatgtcca cccgggcatc aggggtccct gacagg (2) Informace o SEQ ID NO: 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 84 párů	baží
	(B)	TYP: nukleová	kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:	umělá sekvence
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:	oligonukleotid
(xi)	Popis sekvence: SEQ	ID NO: 28:

agccacctga cgtttgatct ccaccttggt cccttggccg aacgtgaatg gatactctác 60 cagctgttga cagtaataaa cccc (2) Informace o SEQ ID NO: 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 60 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina

9 99 -99 · · · • · 9 9 9 9· 9 9 9 • 999 999 9 9

9 9 · · 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 999 99 9 (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 29:

acacgaagct tcaccatggc ttgggtgtgg accttgctat tcctgatggc ggccgcccaa 60 (2) Informace o SEQ ID NO: 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 66 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: DNA

(ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 30 ctttaccaag cctcccccag actccaccag ctgcacctct gcttgggcac tttgggcggc 60 cgccat (2) Informace o SEQ ID NO: 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 60 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 31:

ttggtaaagc ccggggggtc ccttagactc tcctgtgcag ctagcggatt cactttcagt 60 (2) Informace o SEQ ID NO: 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 60 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: umělá sekvence
(ix)	ZNAKY:

(D) Jiné informace: oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3λ:

ccccttccct ggagcctggc ggacccagga catccagtag ccactgaaag tgaátccgct 60 (2) Informace o SEQ ID NO: 34:

•	(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 60 párů baží
		(B)	TYP: nukleová kyselina
		(C)	DRUH ŘETĚZCE:
		(D)	TOPOLOGIE:
	(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA

(ix) ZNAKY:

·· ·· • · · • ···

(D) Jiné informace: umělá sekvence (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 34:

999· 99

99 9 9 atcatctctt gagatggtga atttcccctt cacagactcc goataatgtg ttgcataatt 60 (2) Informace o SEQ ID NO: 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 66 párů bázi
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: DNA

(ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 35:

atctcaagag atgattca.a atctagactg tatctgoaaa tgaaoagcct gaaaaccg.g gacaca (2) Informace o SEQ ID NO: 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 69 párů	bázi
(B)	TYP: nukleová	kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: DNA

(ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence φ· ·· ·· · ·· • · · · · * · · • ··· 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 8 9 9 9 9 9

9999 99 99 999 99 · (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 36:

ggtgactagt gttccctggc cccagtctat gaaatctgta cagtaataca cggctgtgtc 60 ctcggtttt (2) Informace o SEQ ID NO: 37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 48 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DN7\
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: umělá sekvence
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: oligonukleotid

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 37:

gctgctcctt ttaagctttg gggtcaaggc tcactagtca cagtctcc

Informace o	SEQ ID NO: 38:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 24 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
(ii) DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix) ZNAKY:
(D)	Jiné informace: umělá sekvence
(ix) ZNAKY:
(D)	Jiné informace: oligonukleotid

*· • 4 4 • 4 44

4 ·

•444 44 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 38:

tgacggtgcc cccgcgagtt cagg (2) Informace o SEQ ID NO: 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 24 párů	baží
	(B)	TYP: nukleová	kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:	umělá sekvence
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:	oligonukleotid
(xi)	Popis sekvence: SEQ	ID NO: 39:
cctgaactcg cgggggcacc gtca

(2) Informace o	SEQ ID NO: 40:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 33 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
(ii) DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix) ZNAKY:
(D)	Jiné informace: umělá sekvence
(ix) ZNAKY:
(D)	Jiné informace: oligonukleotid
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 40:

·· »· ·· · ·· ··· · · · · * · · • ··· · · ♦ · · ······ ···· • · · · · · · · ···· ·· ·· ··· ·· · aagcttccgt cgaattcatt tacCcggaga cag (2) Informace o SEQ ID NO: 41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 37 párů	bázi
	(B)	TYP: nukleová	kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:	umělá sekvence
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:	primer
(xi)	Popis sekvence: SEQ	ID NO: 41:
actagtcgac	: atgaagtttc cttctcaact tctgctc

(2) Informace o SEQ ID NO: 42:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) (B)	DÉLKA: 8 aminokyselin TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: umělá sekvence
(ix)	ZNAKY:
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 42:

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr

	71	*··· · · · · · · ·»»· ·* ·· ·«· ·· ·♦
Informace o	SEQ ID NO: 43:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 8 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: umělá sekvence
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: syntetická	sekvence

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 43:

Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr (2) Informace o SEQ ID NO: 44:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 8 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: umělá sekvence
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: syntetická sekvence

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 44:

Thr Lys Leu Glu Ile Arg Arg Thr 1 ·· ·· • · · • ··· ··»» ·· (2) Informace o SEQ ID NO: 45:

(i)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 8 párů	baží
(B)	TYP: nukleová	kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: DNA

(ii) (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: syntetická sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 45:

Thr Lys Val Glu Ile Arg Arg Thr 1 5 (2) Informace o SEQ ID NO: 46:

(i)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 415 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 46:

actagtgtcc cttggcccca gtctatgaaa tctgtacagt aataaactcc gctcttaagc tgttcatttg caggtagaga cgacttttgg aatcatctct aacttccctt tcacagactc cgcataatgt gttgcataat tatcagattt tcagcaaccc actcaagccc cttctctgga gactggcgga cccaagacat ctgaaagtaa atccagaggc tacacaggag agtttcatgg atcctccagg cctcctccag actcctcaag cttcacttca ctctggaccc cttttaaaag aaaatcagcc caaaatccat ggtgaggtcc tgtgtgctga gtaactgtaa actgtcttca 60 tgagatggtg 120 caatctaatt 180 ccagtagcca 240 ttgcaccaag 300 aacaataaaa 360 agctt 415 «0 ·· « ·9

0 0 » 0 ♦ · 0 · · • 000 · · · · ·

3

000« 00 00 000 00 9 (2) Informace o SEQ ID NO: 47:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 437 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: DNA

(ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 47:

cgtacgtttt atttccaact ttgtccccga gccgaacgtg aatggatact ctacaagttg 60 ttgacagtaa tacacaccca catcctcagc cttcactcta ctgatttcca gggtgaaatc 120 tgtgcctgac ccactgccac taaaccggtc tgagactcct gatgcacggg tggacatcaa 180 atacatcagg agctgaggag attgtcctgg tctctgcaga aaccaattca agtatgtctt 240 cccatcctta tacaggagac tcttactaga cctgcaggag atggaaactg attctccaga 300 agtgacagga ttggagagtt catcctgggt tatcacaata tccccactga ctccagagat 360 ccagaacata agcaccccca gaaactgaac agagaacctc atggtgaggt cctgtgtgct 420 gagtaactgt aaagctt 437 (2) Informace o SEQ ID NO: 48:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 348 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: DNA

(ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: variabilní oblast lehkého řetězce humanizovaných protilátek anti-CD23 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 48:

V •tf t

♦ ··· • · * • · * ·· tf tf · tftf • tftf • tf tf tf • tf • tftftf tftf • tftf • tf tftftf • · tftf agccaccgta cgtttgatct ccaccttggt cccttggccg aacgtgaatg gatactctac 60 cagctgttga cagiaataaa ccccaacatc ctcagcctcc actctgctga ttttcagtgt 120 aaaatctgtg cctgatccac tgccactgaa cctgtcággg acccctgatg cccgggtgga 180 catcaaatag atcaggagct gtggagactg ccctggcttc tgcaggtacc aattcaagtá 240 tgtcttccca tccttataca ggagactctt actcgagcga caggagatgg aggccggctc 300 tccaggggfcg acgggcaggg agagtggaga ctgagtcatc acaatatc 348 (2) Informace o SEQ ID NO: 49:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 1 335 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace: umělá sekvence
(ix)	ZNAKY:

(D) Jiné informace: variabilní oblast těžkého řetězce humanizovaných protilátek anti-CD23 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 49:

tcatttaccc ggagacaggg agaggctctt catcacggag catgagaaga cgttcccctg gctgtagagg aagaaggagc cgtcggagtc ctccggctgc ccattgctct cccactccac caggcaggtc aggctgacct ggttcttggt cacctgtggt tctcggggct gccctttggc gagggctttg ttggagacct tgcacttgta gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtgggcat gtgtgagttt tgtcacaaga gttgctgggc ttgtgattca cgttgcagat cacggtcacc acgctgctga gggagtagag gtgcacgccg ctggtcaggg cgcctgagtt gtccttgacc aggcagccca gggccgctgt cagggggaag accgatgggc ccttggtgga ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcatg 60 ctgccacctg ctcttgtcca cggtgagctt 120 cagcacggga ggcgtggtct tgtagttgtt 180 ggcgatgtcg ctgggataga agcctttgac 240 cagctcatcc cgggatgggg gcagggtgta 300 tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360 ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420 gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480 gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540 ctcaggggtc cgggagatca tgagggtgtc 600 cggtgccccc gcgagttcag gtgctgggca 660 tttgggctcc actttcttgt ccaccttggt 720 gtaggtctgg gtgcccaagc tgctggaggg 7.80 tcctgaggac tgtaggacag ccgggaaggt 840 ccacgacacc gtcaccggtt cggggaagta 900 gcccccagag gtgctcttgg aggagggtgc 960 ggctgaggag acggtgacta gtgttccctg 1020

gccccagtct atgaaatctg tacagtaata cacggctgtg tcctcggttt tcaggctgtt 1080 catttgcaga tacagtctag attttgaatc atctcttgag atggtgaatt tccccttcac 1140 agactccgca taatgtgttg cataattatc agatttcaat ctaatttcag caacccactc 1200 gagccccttc cctggagcct ggcggaccca ggacatccag tagccactga aagtgaatcc 1260 gctagctgca caggagagtc taagggaccc cccgggcttt accaagcctc ccccagactc 1320

1335 caccagctgc acctc (2)' Informace o SEQ ID NO: 50:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 137 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 50:

»

Ala 1 Ile

Leu Gin Phe Phe

Leu Ile 20

Leu Ser Thr Gin Asp Leu

Thr Met

Asp Glu

Phe Gly 15

Leu Leu

5 Val Leu

Leu

Lys

Gly 25

10 Val

Gin

Ser

Val 30

Lys

Glu

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

Gly

Ser

Met

Lys

Leu

•

35

40

45

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Gly

Tyr

Trp

Met

Ser

Trp

50

55

60

Val

Arg

Gin

Ser

Pro

Glu

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Glu

Ile

Arg

65

70

75

80

«

Leu

Lys

Ser

Asp

Asn

Tyr

Ala

Thr

His

Tyr

Ala

Glu

Ser

Val

Lys

Gly

85

90

95

Lys

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

Lys

Ser

Arg

Leu

Tyr

Leu

Gin

100 105 110

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Thr Asp 115 120 125

Phe Ile Asp Trp Gly Gin Gly Thr Leu
130	135
(2) Informace o SEQ ID NO: 51:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A) DÉLKA: 145 aminokyselin
	(B) TYP: aminokyselina
	(C) DRUH ŘETĚZCE:
	(D) TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH MOLEKULY: protein
(ix)	ZNAKY:

(D) Jiné informace: Mus musculus (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 51:

Ala Leu Gin Leu Leu

Ser

Thr Gin Asp Leu Thr Met Arg 10

Phe

Ser 15

Val

1

5

Gin

Phe

Leu

Gly

Val

Leu

Met

Phe

Trp

Ile

Ser

Gly

Val

Ser

Gly

Asp

20

25

30

Ile

Val

Ile

Thr

Gin

Asp

Glu

Leu

Ser

Asn

Pro

Val

Thr

Ser

Gly

Glu

35

40

45

Pro

Gin

Leu

Leu

Ile

Tyr

Leu

Met

Ser

Thr

Arg

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Leu

85

90

95

Val

Glu

Tyr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

Arg Thr Val Ala

115

2) Informace o SEQ ID NO: 53:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 444 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
ÍX)	ZNAKY:

(D) Jiné informace: umělá sekvence (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: popis umělé sekvence: variabilní oblast těžkého řetězce humanizovaných protilátek anti-CD23

(xi)

Popis Leu Val 5

sekvence:

SEQ Gly

ID Gly 10

NO: Leu

53:

Pro Gly Gly 15

Glu Val 1

Gin

Glu Ser

Gly

Val

Lys

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Gly

Tyr

20

25

30

Trp

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Glu

Ile

Arg

Leu

Lys

Ser

Asp

Asn

Tyr

Ala

Thr

His

Tyr

Ala

Glu

50

55

60

Ser

Val

Lys

Gly

Lys

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

Lys

Ser

Arg

65

70

75

80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr. Ala Val Tyr 85 90 95

Tyr Cys Thr Asp Phe Ile Asp Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 115 120 125

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 130 135 140

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

145 150 155 léO

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 180 185 190

Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 195 200 205

Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His GÍu Asp Pro Glu Val Lys Phe 260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Protilátky, které obsahují dostatečnou část aminokyselinové sekvence každé CDR uvedené dále v textu tak, že protilátky jsou schopny se vázat molekulu CD23 (FCeRII) typ II exprimovanou na krvetvorných buňkách:

   RSSKSLLY KDGKTYLN CDRL1(SEQ ID NO: 3) LMSTRAS CDRL2(SEQ ID NO: 5) QQLVEYPFT CDRL3(SEQ ID NO: 7) GYWMS CDRH1(SEQ ID NO: 9) EIRLKSDNYATHYAESVKG CDRH2(SEQ ID NO: 11) FID...... CDRH3(SEQ ID NO: 13)
2. 2. Protilátky, které se váží na molekulu CD23 (FCsRII) typ II exprimovanou na krvetvorných buňkách nebo na rozpustný CD23 charakterizovaný afinitní konstantou, jejíž hodnota je rovna nebo vyšší než lxlO⁹ Ka Mol^-1.
3. 3. Protilátky, které kompetitivně inhibují navázání protilátek, jenž mají sekvence CDR uvedené v nároku 1, na molekulu CD23 (FCsRII) typ II exprimovanou na krvetvorných buňkách.

   4 . Protilátky podle libovolného z nároků 1 až 3, které jsou «» 5. změněné protilátky. Protilátky podle nároku 4, které j sou humanizované l 6. protilátky. Protilátky podle libovolného z nároků 1 až 5, kde kostra těžkého řetězce zahrnuje aminokyselinové zbytky z myších protilátek v libovolné z poloh 49, 66, 76, 77 a 94. 7. Protilátky podle libovolného z nároků 1 až 6, kde kostra

   lehkého řetězce zahrnuje aminokyselinové zbytky myších protilátek v poloze 64.
4. 8. Protilátky obsahující jednu nebo více aminokyselinových sekvencí podle SEQ ID NO: 1 a 2.
5. 9. Protilátky obsahující jednu nebo dvě aminokyselinové sekvence podle SEQ ID NO: 17 a 18.
6. 10. Protilátky podle libovolného z nároků, kde konstantní oblast obsahuje Ala v poloze 235 a Ala v poloze 237 podle systému číslování podle Kabata.
7. 11. Protilátky podle libovolného z nároků 1 až 11, které jsou vhodné pro použití při terapii lidí.
8. 12. Použití protilátek podle libovolného z nároků 1 až 10 při výrobě léčiva vhodného pro léčbu poruch vybraných ze skupiny zahrnující artritidu, lupus erythematosus, Hashimotovu tyreoiditidu, roztroušenou sklerózu, cukrovku, uveitidu, dermatitidu, lupénku, kopřivku, nefrotický syndrom, glomerulonefritidu, zánětlivé onemocnění střev, ulcerativní kolitidu, Krohnovu nemoc, Sjogrenův syndrom, alergii, alergické astma, intrinsické astma, akutní astmatická exacerbaci, rinitidu, exém, GVH, COPD, inzulitidu, bronchitidu (zvláště chronická bronchitida) nebo cukrovku (zvláště cukrovku typu I), maligní nádory Bbuněk.
9. 13. Použití protilátek, které se vážou na molekulu CD23 (FCsRII) typ II exprimovanou na krvetvorných buňkách při výrobě léčiva vhodného pro blokování tvorby rozpustného CD23.

   protilátkou je 10.
10. 14. Použití protilátek podle nároku 13, kde protilátka podle libovolného z nároků 1 až
11. 15. Sekvence DNA kódující řetězec protilátek, jednu nebo více sekvencí podle :

    CDRL1 čísla párů baží 70 až 117 z obrázku č. 3 4)

    CDRL2 čísla párů baží 163 až 183 z obrázku č. 3

    který obsahuj e (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:

    6)

    CDRL3 8) čísla párů baží 280 až 306 z obrázku č. 3 (SEQ ID NO: CDRH1 čísla párů baží 91 až 105 z obrázku č. 4 (SEQ ID NO: 10) CDRH2 čísla párů baží 148 až 204 z obrázku č. 4 (SEQ ID NO: 12) CDRH3 čísla párů baží 301 až 309 z obrázku č. 4 (SEQ ID NO: 14) 16. Sekvence DNA kódující řetězec protilátek, který obsahuj e

    jednu nebo více sekvencí, které kódují sekvence podle SEQ ID NO: 1 a 2.
12. 17. Sekvence DNA kódující řetězec protilátek, který obsahuje jednu nebo dvě sekvence podle SEQ ID NO: 17 a 18.
13. 18. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje protilátky, které se definují v libovolném z nároků 1 až 10, a farmaceuticky přijatelný ekcipient.
14. 19. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje protilátky, které se definují v libovolném z nároků 1 až 10 v kombinaci s imunomodulačním nebo protizánětlivým činidlem a farmaceuticky přijatelným ekcipientem.