JP2003199594A - Ｃｄ１８に対するヒト化抗体 - Google Patents

Ｃｄ１８に対するヒト化抗体

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Abstract

(57)【要約】 【課題】抗体がヒトＣＤl8抗原に結合し得るように、特
定の抗ヒトＣＤl8抗体由来のＣＤＲの十分なアミノ酸配
列が提示されているヒト化抗体を提供すること。 【解決手段】抗体がヒトＣＤ-18 抗原に結合し得るに十
分な、特定の抗ヒトＣＤl8抗体由来のＣＤＲのアミノ酸
配列を具備するヒト化抗体。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、ＣＤl8抗原に結
合する抗体、そのような抗体の調製およびこの抗体を含
有する医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】抗体は、典型的には、ジスルフィド結合
および２つの軽鎖で互いに連結した２つの重鎖を有して
いる。各々の重鎖は、多くの定常ドメインが後に続く可
変ドメインをその一端に有している。各々の軽鎖は、そ
の一端に可変ドメインを、他端に定常ドメインを有して
いる。軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並ん
でいる。軽鎖定常ドメインは、重鎖の第１定常ドメイン
と並んでいる。軽鎖および重鎖中の定常ドメインは、抗
体の抗原への結合には直接は関わらない。
【０００３】軽鎖および重鎖の各対の可変ドメインは、
抗原結合部位を形成する。軽鎖および重鎖のドメインは
同様の一般構造を有しており、各ドメインは、配列が比
較的保全され、３つの相補性決定部位（ＣＤＲ）によっ
て連結された、４つ領域からなるフレームワークを有し
ている。この４つのフレームワーク領域は、βシート構
造を大きく取り入れ、ＣＤＲはこのβシート構造に連結
し、時にはその一部を形成するループを形成する。ＣＤ
Ｒは、フレームワーク領域によって非常に接近した状態
に保持され、他のドメインからのＣＤＲと共に、抗原結
合部位の形成に寄与する。抗体のＣＤＲおよびフレーム
ワーク領域は公知文献（例えば、非特許文献１参照）を
参照することにより決定することができる。
【０００４】抗体の可変ドメインのフレームワークより
も、ＣＤＲが異なる種から誘導される改変抗体（altere
d antibody）の調製が報告されている（例えば、特許文
献１参照）。このＣＤＲは、ラットもしくはマウスモノ
クローナル抗体から誘導することができる。改変抗体の
可変ドメインおよび定常ドメインのフレームワークは、
ヒト抗体から誘導することができる。ヒトに投与された
場合、そのようなヒト化抗体が引き出す免疫応答は、ヒ
トによって高められたラットもしくはマウス抗体に対す
る免疫応答と比較して無視し得るものである。ヒト化 C
AMPATH-l抗体が報告されている（Campath は、ウェルカ
ム企業グループの登録商標である）（例えば、特許文献
２参照）。
【０００５】
【非特許文献１】Kabat et al., "Sequences of protei
ns of immunologicalinterest（疫学的に重要なタンパ
ク質の配列），US Dept. ofHealth and Human Service
s, US Government Printing Office（米国健康社会福祉
省、米国政府印刷局）1987年
【特許文献１】欧州特許出願公開第０２３９４００号明
細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第０３２８４０４号明
細書
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、抗体
がヒトＣＤl8抗原に結合し得るように、下に示す各ＣＤ
Ｒの十分なアミノ酸配列が提示されているヒト化抗体を
提供することにある。
【０００７】また、本発明の目的は、抗体がヒトＣＤ-l
8 抗原に結合し得るように、上に示す各ＣＤＲの十分な
アミノ酸配列が提示されているヒト化抗体をコードする
ＤＮＡ分子を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、〔１〕
抗体がヒトＣＤ-18 抗原に結合し得るに十分な、下記
の各ＣＤＲのアミノ酸配列を具備するヒト化抗体、 〔２〕 軽鎖の可変ドメインフレームワークがタンパク
ＲＥＩの可変ドメインフレームワークであるか、もしく
はそれと実質的に相同である前記〔１〕記載の抗体、
〔３〕 重鎖の可変ドメインフレームワークがタンパク
ＮＥＷＭの可変ドメインフレームワークであるか、もし
くはそれと実質的に相同である前記〔１〕または〔２〕
記載の抗体、〔４〕 ＣＤＲが、前記〔１〕において特
定される軽鎖ＣＤＲ1 ないし3 および重鎖ＣＤＲ1 ない
し3 である前記〔１〕〜〔３〕いずれか記載の抗体、
〔５〕 前記〔１〕〜〔４〕いずれかに記載されるヒト
化抗体の調製方法であって、(i) ヒト化抗体の軽鎖をコ
ードする第１発現ベクターおよびヒト化抗体の重鎖をコ
ードする第２発現ベクター；または (ii) ヒト化抗体の
軽鎖および重鎖の両方をコードする単一の発現ベクタ
ー；のいずれかを用いてホストを形質転換し、該ホスト
を各鎖が発現する条件下に維持し、並びに発現した鎖の
集合体により産生されるヒト化抗体を単離することを具
備する方法、〔６〕 抗体がヒトＣＤ-18 抗原に結合し
得るに十分な、下記の各ＣＤＲのアミノ酸配列を具備す
るヒト化抗体をコードするＤＮＡ分子、 〔７〕 軽鎖の可変ドメインフレームワークがタンパク
ＲＥＩの可変ドメインフレームワークであるか、もしく
はそれと実質的に相同である前記〔６〕記載のＤＮＡ分
子、〔８〕 重鎖の可変ドメインフレームワークがタン
パクＮＥＷＭの可変ドメインフレームワークであるか、
もしくはそれと実質的に相同である前記〔６〕または
〔７〕記載のＤＮＡ分子、
〔９〕 ＣＤＲが、前記
〔６〕において特定される軽鎖ＣＤＲ1 ないし3 および
重鎖ＣＤＲ1 ないし3 である前記〔６〕〜〔８〕いずれ
か記載の抗体、〔１０〕 発現ベクターの形態にある前
記〔６〕〜
〔９〕いずれか記載のＤＮＡ分子、〔１１〕
前記〔１０〕記載の発現ベクターで形質転換されたホ
スト、〔１２〕 薬剤学的に許容し得る担体もしくは希
釈剤および、活性成分として、前記〔１〕〜〔４〕いず
れかに定義されるヒト化抗体を包含する医薬組成物、並
びに〔１３〕 軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含んで
なるヒト化抗体またはそのフラグメントであって、ヒト
ＣＤ１８抗原に特異性を有し、標識されており、該軽鎖
可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ1 、ＣＤＲ2 および
ＣＤＲ3 ）および該重鎖可変領域の相補性決定領域（Ｃ
ＤＲ1 、ＣＤＲ2 およびＣＤＲ3 ）が、以下のアミノ酸
配列： を有するものであるか、または前記ＣＤＲのアミノ酸配
列が前記アミノ酸配列に実質的に相同なものである、ヒ
ト化抗体またはそのフラグメント、に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】この抗体は、好ましくは、天然抗
体またはそれらのフラグメントの構造を有している。し
たがって、この抗体は、完全抗体、（Fab'）2 フラグメ
ント、Fab フラグメント、軽鎖ダイマーまたは重鎖ダイ
マーを含んでいてもよい。この抗体は、ＩｇＧl 、Ｉｇ
Ｇ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のようなＩｇＧ；また
はＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤであればよい。
【００１０】この抗体の重鎖の定常ドメインは、それに
応じて選択することができる。軽鎖定常ドメインは、κ
またはλ定常ドメインであってもよい。
【００１１】この抗体は、WO 86/01533 に記述されるタ
イプのキメラ抗体であってもよい。WO 86/01533 による
キメラ抗体は、抗原結合部位および非免疫グロブリン部
位を含む。抗原結合部位は、抗体軽鎖可変ドメインおよ
び／または重鎖可変ドメインである。典型的には、この
キメラ抗体は、軽鎖および重鎖可変ドメインの両者を含
む。非免疫グロブリン部位は、抗原結合部位のＣ末端に
融合している。この非免疫グロブリン部位は、典型的に
は非免疫グロブリンタンパクであり、酵素領域、公知の
結合特異性を有するタンパクから誘導された領域、タン
パク毒から誘導された領域または、まさに遺伝子によっ
て発現したタンパクから誘導された領域であってもよ
い。非免疫グロブリン部位は、炭水化物（carbon hydra
te）領域であってもよい。このキメラ抗体の２つの部位
は、開裂可能なリンカー配列を介して結合していてもよ
い。
【００１２】配列番号３ないし８および配列番号11ない
し16の軽鎖ＣＤＲｌないし３および重鎖ＣＤＲｌないし
３は、それぞれ、ＣＤ18抗体であるＹＦＣ51.1.1ラット
抗体のＣＤＲである。ヒトＣＤl8抗原に対するヒト化抗
体の特異性は、下記の通り、フローサイトメトリー、単
球付着および／またはＴ細胞拡散アッセイによって測定
することができる。
【００１３】単球（ＭＮＣ）付着 ＭＮＣを、抗体（20μｌ）の存在下および非存在下にお
いて、ホルボールジエステルＰＤＢｕ（10-9Ｍ）で５分
間処理する。次いで、これらの細胞をウシ大動脈内皮細
胞（ＢＡＥＣ）単層に移し、95％空気、５％ＣＯ2 の加
湿雰囲気において37℃で30分間インキュベートする。リ
ン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄することに
より、非付着細胞を除去する。次に、付着細胞を、50μ
ｌの0.5％へキサデシルトリメチルアンモニウムブロマ
イドを用いてその場で溶解させる。各ウェルに0.4 ｍＭ
過酸化水素を含有するジアニシジン・ジハイドロクロラ
イド（0.63ｍＭ）を添加して（250 μｌ）さらに10分間
インキュベートする。その後、吸光度の増加として記録
される単球特異的ミエロペルオキシダーゼの存在を利用
して酵素活性を評価する。試料の450 ｎｍでの光学密度
はマルチウェルプレートリーダー（Anthosシリーズ、La
b Teckinstruments ）を用いて記録することができる。
その後、処理試料と未処理試料との間で比較を行なうこ
とができる（Bathら， J. Immunol. Meth.，118, 59-6
5, (1989)）。
【００１４】フローサイトメトリー Gladwin らの方法（Biochem. Biophys. Acta., 1052, 1
66-172, (1990)）に従って、抗体を用いたラット、ウサ
ギ、モルモットおよびヒト単球の表面標識を行なう。簡
単に述べると、細胞懸濁液（５×106 ）の一部ｌｍｌを
適切な抗体と共にインキュベートし、単分散させ、溶融
氷上で30間インキュベートする。これらの細胞をＰＢＳ
中で２回洗浄し、ウサギ抗ラットF （ab’）2 ＦＩＴＣ
結合体の１：200 希釈液と共に溶融氷上でさらに30分間
インキュベートする。最後に、これらの細胞をＰＢＳ中
で３回洗浄し、0.1 ％パラホルムアルデヒド中に固定す
る。表面標識の分析は、標準コンピューター、電子工学
および光学を用いるエピクス・エリート（Epics Elite
）フローサイトメトリー（Coulter cytometry, Hialh
ea, FL ）を用いることにより行なうことができる。こ
のエリートは、l5ｍＷ488ｎｍアルゴンレーザー（Cyoni
cs モデル2201、San Jose、CA）で構成されている。単
球およびリンパ球群を、前方角ライトスキャター（forw
ard angle light scatter ）およびサイドスキャターで
分離する。２×104 単球についての緑色蛍光データをビ
ット−マップ・ゲート制御（bit-map gating）によって
集め、3回のログ・スケールについて集める。同様の方
法で、２×104 好中球についての緑色蛍光データを集め
る。各試料について、一次ｍＡｂの存在下における平均
蛍光強度を、ウサギ抗ラットF （ab’) 2 ＦＩＴＣフラ
グメントのみと共にインキュベートした細胞と比較し、
細胞標識の割合を決定する。試料は３重に標識すること
が可能であり、１回の別々の機会に繰り返し実験を行な
うことができる。
【００１５】Ｔ細胞拡散アッセイ フィコール・パックによる密度勾配分離を用いて脱フィ
ブリン化血液からヒト単核球を調製する。リンパ球（２
×105 細胞）を、平底96ウェルマイクロタイタープレー
ト（Nunclon, Roskild，Denmark ）の各ウェル内で、10
％自己血清、 2ｍＭグルタミンおよびlOO ｉＵペニシリ
ン／lOO μｇ・ｍｌ-1ストレプトマイシンを補ったＲＰ
ＭＩl640において培養する。異なる濃度のモノクローナ
ル抗体の存在もしくは非存在下における、培地単独、ま
たは抗原（Tetanus Toxoid、３μｇ・ｍｌ-1）もしくは
マイトジェン（ＰＨＡ、１μｇ・ｍｌ-1）を伴う３回培
養を行なう。細胞を、95％空気、５％ＣＯ2 の加湿雰囲
気中において、37℃で５日間培養する。次いで、ウェル
に１μＣｉ［メチル 3Ｈ］チミジン（２Ｃｉ・ｍｍｏｌ
-1、Amersham）を規則的に供給し、18時間後に回収して
Ｂカウンター（LKB，Betaplate ，Sweden）を用いる液
体シンチレーションにより放射活性を計測する。結果
は、平均＋／−ＳＥＭとして表わされる。
【００１６】ヒト化抗体のＣＤＲは、上述の軽鎖ＣＤＲ
ｌないしおよび重鎖ＣＤＲｌないし３であることが適当
である。しかしながら、これらのＣＤＲのアミノ酸配列
は変化してもよい。各ＣＤＲのアミノ酸配列は、アミノ
酸置換、挿入および／または欠損により40％まで、例え
ば30％まで、20％まで、あるいは10％まで、変化させる
ことができる。
【００１７】したがって、各ＣＤＲは１もしくは２のア
ミノ酸置換、挿入および／または欠損を含む。軽鎖ＣＤ
Ｒにおいては、３つまでのアミノ酸置換、挿入および／
または欠損があってもよい。軽鎖ＣＤＲｌもしくは重鎖
ＣＤＲ３においては、４つまでのアミノ酸置換、挿入お
よび／または欠損が存在してもよい。重鎖ＣＤＲ２にお
いては、６つまでのアミノ酸置換、挿入および／または
欠損が存在してもよい。好ましくは、各ＣＤＲのアミノ
酸配列は、ＹＦＣ 51.1.1 の各ＣＤＲのそれと実質的に
相同である。
【００１８】抗体のフレームワークおよび定常ドメイン
は、ヒトフレームワークおよびヒト定常ドメインであ
る。好ましくは、抗体重鎖の可変部位のフレームワーク
は、ヒトタンパクＮＥＷＭの対応フレームワーク（Saul
ら，L. Biol. Chem. 25, 585-597,（1987））と実質的
に相同である。フレームワークに係る相同性は、ＮＥＷ
Ｍに関して一般に80％以上、例えば90％以上あるいは95
％以上である。多くのアミノ酸置換、挿入および／また
は欠損が存在し得る。結合を保存するためになされるこ
ともあるフレームワーク変化の候補には、アミノ酸残基
27、30、48、66、67、71、91、93および94の変化が含ま
れる。
【００１９】抗体軽鎖の可変部位のフレームワークは、
典型的には、タンパクＲＥＩの可変ドメインフレームワ
ーク（Epp ら，Eur. J. Biochem. 45, 513-524, （197
4））と実質的に相同である。フレームワークに係る相
同性は、ＲＥＩに関して一般に80％以上、例えば90％以
上、あるいは95％以上である。多くのアミノ酸置換、挿
入および／または欠損が、例えば Kabatらのナンバリン
グによるアミノ酸残基71に、あってもよい。
【００２０】この発明に従い、ヒト化抗体の軽鎖をコー
ドする第１の発現ベクターおよび重鎖をコードする第２
の発現ベクターで形質転換されたホストを、各鎖が発現
するような条件下に維持し、それにより発現した鎖の集
合体により産生されるヒト化抗体を単離することを具備
する方法によって、ヒト化抗体が調製される。
【００２１】第１および第２の発現ベクターは、同一の
ベクターであってもよい。この発明は、さらに、 -ヒト化抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ配
列； ‐前記ＤＮＡ配列を組み込む発現ベクター；および ‐前記発現ベクターで形質転換されたホスト を提供する。
【００２２】抗体の各鎖は、ＣＤＲ置換により調製する
こともできる。ヒト抗体の軽鎖もしくは重鎖の可変部位
のＣＤＲは、得られた抗体がＣＤl8抗原と結合し得るに
十分な、ラット抗ヒトＣＤl8抗体ＹＦＣ51.1.1の各ＣＤ
Ｒのアミノ酸配列によって置換される。ヒト抗体鎖の超
可変部位をコードするＤＮＡのＣＤＲコード領域は、所
望のＣＤＲをコードするＤＮＡによって置換される。適
当であるならば、この改変ＤＮＡを、抗体鎖の定常ドメ
インをコードするＤＮＡに連結させる。このＤＮＡを発
現ベクターにクローニングする。この発現ベクターを、
抗体鎖が発現するような条件下で培養される適合ホスト
細胞に導入する。その後、この方法で共に発現する相補
抗体鎖を組み立ててヒト化抗体を形成することもでき
る。
【００２３】この発明は、ラット抗体ＹＦＣ51.1.1から
直接もしくは間接的に誘導されるＣＤＲを有するヒト化
抗体の生成に言及しつつここに記載される。しかしなが
ら、ここに記載される技術は、他のヒト化抗ＣＤl8抗体
の誘導に等しく用いることができる。さらなる側面によ
ると、この発明は、ヒト化（ＣＤＲグラフト化）抗ＣＤ
l8抗体を提供する。
【００２４】モノクローナル抗体のヒト化には４つの一
般工程がある。すなわち、 (1)開始抗体軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチ
ドおよび推定アミノ酸配列の決定； (2)ヒト化抗体の設計、すなわち、ヒト化プロセスにお
いてどの抗体フレーム ワーク領域を用いるかの決定； (3)実際のヒト化方法論／技術；および (4)ヒト化抗体の形質導入および発現 がある。
【００２５】工程１：抗体軽鎖および重鎖可変ドメイン
のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列の決定 抗体をヒト化するためには、抗体重鎖および軽鎖可変ド
メインのアミノ酸配列のみが知られていることが必要で
ある。定常領域の配列は、これらが再造形戦略に寄与し
ないため、不適当である。抗体可変ドメインアミノ酸配
列を決定する最も簡単な方法は、重鎖および軽鎖可変ド
メインをコードするクローン化ｃＤＮＡからのものであ
る。
【００２６】所定の抗体重鎖および軽鎖可変ドメインｃ
ＤＮＡをクローニングする一般的な方法には、(1) 通常
のｃＤＮＡライブラリーによるもの、または (2)ポリメ
ラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）によるも
の、の２通りがある。これらの両方法は、広く知られて
いる。ｃＤＮＡのヌクレオチド配列が与えられると、こ
の情報を抗体可変ドメインの推定アミノ酸配列に翻訳す
ることは簡単なことである。この例において、齧菌類Ｙ
ＦＣ51.1.1の軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列および
推定アミノ酸配列が配列番号l および２並びに配列番号
９および10に示されている。
【００２７】工程２：ヒト化抗体の設計 ヒト化においてどのヒト抗体配列を用いるかを決定する
にあたり、幾つかの要素が考慮される。軽鎖および重鎖
のヒト化は互いに独立している考えられているが、いず
れについても論理は基本的に類似している。
【００２８】この選択プロセスは、以下の原理に基づい
ている：所定の抗体の特異性および親和性は、主とし
て、可変部位ＣＤＲのアミノ酸配列によって決定され
る。可変ドメインフレームワーク残基の直接の寄与は、
ほとんどないか、もしくは全くない。フレームワーク領
域の主な機能は、ＣＤＲを、抗原を認識するためのそれ
らの適切な空間内方位に保持することにある。このた
め、齧歯類ＣＤＲをヒト可変ドメインフレームワークに
置換することは、ヒト可変ドメインフレームワークが、
それらが起源とする齧歯類可変ドメインと高度に相同で
ある場合には、ほとんど、それらの正しい空間内方位を
保有する結果となるであろう。したがって、ヒト可変ド
メインは、好ましくは、齧歯類可変ドメイン（複数）と
高い相同性を有するべきである。適当なヒト抗体可変ド
メイン配列は、以下の通りに選択することができる：
【００２９】1 ．コンピュータ・プログラムを用いて、
全ての利用可能なタンパク（およびＤＮＡ）データベー
スを、齧歯類抗体可変ドメインに最も相同なヒト抗体可
変ドメイン配列について検索する。適切なプログラムの
出力は、齧歯類抗体に最も相同な配列、各配列に対する
％相同性、齧歯類配列に対する各配列の位置合わせ（a1
ignment ）のリストである。これは、重鎖および軽鎖可
変ドメイン配列の両者について別々に行なう。上記分析
は、ヒト免疫グロブリン配列のみが含まれるのであれ
ば、より容易に達成される。
【００３０】２．ヒト抗体可変ドメイン配列を列挙し、
相同性を比較する。この比較は、非常に変化しやすいＣ
ＤＲ３を除いて、最初にＣＤＲの長さについて行なう。
ヒト重鎖およびκおよびλ軽鎖は、サブグループ（重鎖
３サブグループ、重鎖４サブグループ、重鎖６サブグル
ープ）に分割される。各サブグループ内のＣＤＲサイズ
は類似しているが、サブグループ間では変化する。通
常、齧歯類抗体ＣＤＲを、相同性の第１近似としてヒト
サブグループの1 つと対にすることが可能である。次
に、類似する長さのＣＤＲを有する抗体を、アミノ酸配
列相同性について比較する。これは、特にＣＤＲ内につ
いて行なわれるが、周囲のフレームワーク領域において
も行なう。最も相同なヒト可変ドメインをヒト化のため
のフレームワークとして選択する。
【００３１】工程３：実際のヒト化方法論／技術 抗体は、EP-A-0239400に従って、ヒトフレームワークに
所望のＣＤＲをグラフト化することによりヒト化でき
る。したがって、所望の再造形抗体をコードするＤＮＡ
配列は、再造形することを望むＣＤＲを含むヒトＤＮＡ
から始めて調製することができる。所望のＣＤＲを含む
齧歯類可変ドメインアミノ酸配列を、選択したヒト抗体
可変ドメイン配列のものと比較する。齧歯類の対応残基
に変更してヒト可変部位に齧歯類ＣＤＲを組み込むため
に必要なヒト可変ドメイン中の残基に印をつける。ヒト
配列の置換、追加、削除を必要とする残基もまたあり得
る。
【００３２】ヒト可変ドメインフレームワークを所望の
残基を有するように変異させるために用いることができ
るオリゴヌクレオチドを合成する。それらのオリゴヌク
レオチドは、都合のよいいかなるサイズであってもよ
い。実施する人間は、通常、その人が利用可能な特定の
合成機の能力によってのみ、長さに制限を受ける。オリ
ゴヌクレオチド指向（Oligonucleotide-directed）イン
・ビトロ変異の方法は良く知られている。
【００３３】代わりに、WO 92/07075 の組換えポリメラ
ーゼ・ チェイン・リアクション（ＰＣＲ）方法論を用い
てヒト化を達成することができる。この方法論を用い
て、ヒト抗体のフレームワーク領域間にＣＤＲをスプラ
イスすることができる。
【００３４】一般に、W0 92/07075 の技術は、２つのフ
レームワーク領域、ＡＢおよびＣＤ、並びにそれらの間
の、ドナーＣＤＲによって置換されるＣＤＲを含むテン
プレートを用いて行なうことができる。プライマーＡお
よびＢはフレームワーク領域ＡＢの増幅に用いられ、プ
ライマーＣおよびＤはフレームワーク領域ＣＤの増幅に
用いられる。しかしながら、プライマーＢおよびＣは、
各々それらの5'末端に、ドナーＣＤＲの全てもしくは少
なくとも一部に対応するさらなる配列をも有している。
プライマーＢおよびＣは、ＰＣＲが実行可能な条件下
で、互いにそれらの5'末端のアニーリングを行なうに十
分な長さで重複している。これにより、増幅された領域
ＡＢおよびＣＤは、重複伸長による遺伝子スプライシン
グを受けて、単一反応でヒト化生成物を生成することが
できる。
【００３５】工程４：再造形抗体の形質導入および発現 抗体を再造形するための変異反応に続いて、変異ＤＮＡ
を軽鎖および重鎖定常部位をコードする適当なＤＮＡに
連結し、発現ベクターにクローニングしてホスト細胞、
好ましくは哺乳類細胞に形質導入することができる。こ
れらの工程は、ルーチン様式で行なうことができる。し
たがって、再造形抗体は、（a) 少なくともＩｇ重鎖も
しくは軽鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡ配列に作
働し得るように連結された適切なプロモーターを含む、
第１の複製可能な発現ベクターであって、前記可変ドメ
インがヒト抗体からのフレームワーク領域およびこの発
明のヒト化抗体に必要なＣＤＲを含む発現ベクターを調
製し、（b) 少なくとも相補Ｉｇ軽鎖もしくは重鎖の各
々の可変ドメインをコードするＤＮＡ配列に作動し得る
ように連結された適切なプロモーターを含む、第２の複
製可能な発現ベクターを調製し、（c) 第１のベクタ
ー、または調製されたベクターの両者を用いて細胞系を
形質転換し、および（d) 前記形質転換細胞系を培養し
て前記改変抗体を生成させる、ことを具備する。
【００３６】好ましくは、工程（a)におけるＤＮＡ配列
は、ヒト抗体鎖の両可変ドメインおよび特定の、もしく
は各定常ドメインをコードする。このヒト化抗体は、適
切な組換え発現系であればどのようなものを用いても調
製することができる。改変抗体を生成させるために形質
転換される細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞系または、有利にリンパ組織を起源とする、
ミエローマ、ハイブリドーマ、トリオーマもしくはクア
ドローマ細胞系のような不死化哺乳動物細胞系であって
もよい。この細胞系には、エプシュタイン・バールウイ
ルス（Epstein-Barr virus）のようなウイルスを用いた
形質転換によって不死化される、Ｂ細胞のような正常リ
ンパ球も含まれる。最も好ましくは、不死化細胞系はミ
エローマ細胞系もしくはそれらの派生体である。
【００３７】この発明による抗体の発現に用いられるＣ
ＨＯ細胞は、ジハイドロフォレートリダクターゼ（ｄｈ
ｆｒ）を欠失し、それ故成長のためにチミジンおよびハ
イポキサンチンに依存するものであればよい（Urlaub
ら，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 4216-4220
（1980））。親ｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞系は、抗体およ
び、ｄｈｆｒ陽性フェノタイプのＣＨＯ細胞形質転換体
の選別を可能にするｄｈｆｒをコードするＤＮＡが形質
導入されている。選別は、このコロニーをチミジンおよ
びハイポキサンチンを欠く培地で培養することにより行
なう。これらの欠失は、非形質転換細胞の成長を妨げ、
形質転換細胞がフォレート経路を再び拾い上げて選別シ
ステムを迂回することを妨げる。これらの形質転換体
は、通常、形質導入された興味対象のＤＮＡおよびｄｈ
ｆｒをコードするＤＮＡを一緒に組み込んだことによる
効果により、低レベルの興味対象ＤＮＡを発現する。抗
体をコードするＤＮＡの発現レベルは、メトトレキセー
ト（ＭＴＸ）を用いて増幅することにより増加させるこ
とができる。この薬剤は酵素ｄｈｆｒの直接阻害剤であ
り、これらの条件下で生存するに十分なまでそれらのｄ
ｈｆｒ遺伝子のコピー数を増幅する耐性コロニーの単離
を可能にする。ｄｈｆｒをコードするＤＮＡ配列および
抗体をコードするＤＮＡ配列は元の形質転換体では密接
に連結しているので、通常、共存増幅（concomitant am
plification ）が起こり、それ故に所望の抗体の発現が
増幅する。
【００３８】ＣＨＯもしくはミエローマ細胞と一緒に用
いる他の好ましい発現系は、WO 87/04462に記載される
グルタミン・シンセターゼ（ＧＳ）増幅系である。この
系は、酵素ＧＳをコードするＤＮＡおよび所望の抗体を
コードするＤＮＡを用いた細胞の形質導入を含む。次い
で、グルタミン非含有培地中で成長し、それ故ＧＳをコ
ードするＤＮＡが組み込まれたことが推測できる細胞を
選択する。次に、これらの選択されたクローンに対し、
メチオニン・スルフォキシミン（Ｍｓｘ）を用いる酵素
ＧＳの阻害を行なう。これらの細胞は、生き残るため
に、抗体をコードするＤＮＡの共存増幅を伴ってＧＳを
コードするＤＮＡを増幅する。
【００３９】ヒト化抗体を産生するために用いられる細
胞系は、好ましくは、哺乳動物細胞系ではあるが、代わ
りに、細菌細胞系もしくは酵母細胞系のような他の適切
な細胞系も用いることができる。特に、E. coli 由来細
菌株が使用可能であることは考慮される。得られた抗体
は、その機能性について照合する。機能性が失われてい
る場合には、工程 (2)に戻り、抗体のフレームワークを
変える必要がある。
【００４０】一旦発現した後は、この発明の抗体全体、
それらのダイマー、個々の軽鎖および重鎖、または他の
免疫グロブリン形態を取り出し、硫酸アンモニウム沈
殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィ
ー、ゲル電気泳動等を含む当分野の標準的な手順で精製
することができる（一般的には、Scopes，R., Protein
Purification，Springer-Verlag, N. Y.（1982）を参
照）。医薬上の使用には、少なくとも約90ないし95％の
等質性を有する実質的に純粋な免疫グロブリンが好まし
く、98ないし99％以上の等質性を有していることが最も
好ましい。望みのままに、部分的であれ、等質にまでで
あれ、一旦精製されると、治療に用い、あるいはアッセ
イ手順の開発及び実施、免疫蛍光染色等に用いることが
できる（一般的には．Immunological Methods, Iおよび
II巻， Lefkovits and Pernis編，Academic Press，Ne
w York, N. Y.（1979および1981）を参照）。
【００４１】ヒト化ＣＤl8抗体は、例えば、白血球介在
状況の治療に用いることができる。ヒト化ＣＤl8抗体
は、典型的には、敗血症または他の感染性もしくは非感
染性外傷における白血球の肺および他の器官への流入の
阻止にその用途を見出す。したがって、ヒト化ＣＤl8抗
体は、内毒性ショックもしくは成人呼吸困難症候群の患
者における白血球の肺および他の器官への侵入の阻止に
用いることができる。この抗体は、血栓崩壊治療後の端
息もしくは白血球介在レパーフュージョン（reperfusio
n ）損傷の治療、敗血症または他の感染性もしくは非感
染性外傷に起因する炎症を有する患者の肺および他の器
官における炎症の治療、抗感染症剤を投与されている患
者の炎症の除去もしくは軽減、あるいは化学療法におけ
る患者への治療薬の投与の補助に用いることができる
（EP-A-0346078）。
【００４２】この発明のヒト化抗体は、他の抗体、特に
疾患に応答し得る細胞上の他のマーカーとの反応性を有
するヒトモノクローナル抗体と組み合わせて用いること
もできる。例えば、適当なＴ細胞マーカーには、第１回
国際白血球分化ワークショップ，Leukocyte Typing，Be
rnard ら編，Springer-Verlag ，N. Y. （l984）によっ
て命名された、いわゆる“分化の集団（Clusters of Di
fferentiation ）”にグループ分けされるものが含まれ
る。
【００４３】この抗体はまた、化学療法剤もしくは免疫
抑制剤と連動して与えられる、分離投与組成物（separa
tely administered composition ）として用いることも
できる。典型的には、これらの薬剤にはシクロスポリン
Ａもしくはプリン・アナローグ（例えば、メトトレキセ
ート、６−メルカルプトプリン等）が含まれるが、さら
に当業者に公知の多くの薬剤（例えば、シクロホスファ
ミド、プレドニソン等）を利用することもできる。
【００４４】この発明の抗体は、免疫毒素の一部を形成
してもよい。免疫毒素は、２つの成分で特徴付けられ、
イン・ビトロもしくはイン・ビボにおいて選ばれた細胞
を殺すのに特に有用である。“移送坦体（delivery veh
icle）”として知られる第２の成分は、毒性作用物質を
特定の細胞タイプ、例えばカルシノーマを含む細胞に移
送する手段を提供する。２つの成分は、通常、種々の公
知化学手段により互いに化学的に結合している。例え
ば、細胞毒性作用物質がタンパクであり、第２成分が完
全免疫グロブリンである場合には、結合はへテロ二官能
性架橋剤、例えば、ＳＰＤＰ、カルボジイミド、グルタ
ルアルデヒド等によるものであればよい。種々の免疫毒
性の製造は、当分野では公知であり、例えば“モノクロ
ーナル抗体−毒素結合体：魔法の弾丸を目指して”，Th
orpeら，Monoclonal Antibodies inClinical Medicin
e，Academic Press，pp.168-190（1982）に見出すこと
ができる。
【００４５】種々の細胞毒性作用物質が免疫毒素中での
使用に適している。細胞毒性作用物質には、ヨウ素-13
1、イットリウム-90 、レニウム-188、およびビスマス-
212のような放射核；ビンデシン（vindesine ）、メト
トレキセート、アドリアマイシン、およびシスプラチン
のような多数の化学療法剤；およびアメリカヤマゴボウ
抗菌タンパク、シュードモナス外毒素Ａ、リシン、ジフ
テリア毒素、リシンＡ鎖等のリボソーム阻害タンパク、
もしくはホスホリパーゼ酵素（例えば、ホスホリパーゼ
Ｃ）のように細胞表面で活性な作用物質のような細胞毒
性タンパクが含まれうる。一般には、“キメラ毒素”，
OlsnesおよびPhil, Pharmac. Ther., 25,335-381（198
2）、および“癌検出および治療のためのモノクローナ
ル抗体”，Baldwin およびByers 編，pp.159-179, 224-
266, Academic Press （1985) 参照。
【００４６】免疫毒素の移送成分は、この発明によるヒ
ト化抗体である。完全免疫グロブリンまたはそれらの結
合フラグメント、例えばＦａｂが好ましく用いられる。
典型的には、免疫毒素中の抗体は、ヒトＩｇＡ，ＩｇＭ
もしくはＩｇＧイソタイプのものであるが、所望により
他の哺乳動物定常部位を利用することもできる。
【００４７】この発明は、さらに、薬剤学上許容し得る
坦体もしくは希釈剤および、活性成分として、この発明
によるヒト化抗体を含有する医薬組成物を提供する。こ
の組成物は、この発明による免疫毒素を含有していても
よい。この発明のヒト化抗体、免疫毒素およびそれらの
医薬組成物は、非経口投与、すなわち皮下、筋肉内もし
くは静脈内投与に特に有用である。
【００４８】非経口投与用の組成物は、通常、抗体もし
くはそれらのカクテルを許容しうる担体、好ましくは水
性担体中に溶解した溶液を含む。種々の水性担体、例え
ば、水、緩衝水、0.4 ％生理食塩水、0.3 ％グリシン等
を用いることができる。これらの溶液は無菌であり、一
般に特別な物質は含んでいない。これらの組成物は、通
常の公知滅菌技術により滅菌される。これらの組成物
は、生理学的条件を近づけるために、ｐＨ調節および緩
衝剤、毒性調節剤等の薬剤学的に許容しうる補助物質、
例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を所望により含
むことができる。これらの処方における抗体の濃度は大
きく変化しうる。例えば、約0.5 重量％未満、通常は少
なくとも約１重量％から15もしくは20重量％もの間であ
り、選ばれた特定の投与方式に従い、主に流体容積、粘
度等に基づいて選択される。
【００４９】このため、筋肉内注射用の典型的な医薬組
成物は、無菌緩衝水１ｍｌおよび抗体50ｍｇを含むよう
に調製することができる。静脈注射用の典型的な組成物
は、無菌リンゲル溶液250 ｍｌおよび抗体150 ｍｇを含
むように調製することができる。非経口投与可能な組成
物の実際の調製方法は、当業者には公知もしくは明らか
であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Scienc
e，15版, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylv
ania （1980）により詳細に記載されている。
【００５０】この発明の抗体は、保存のために凍結乾燥
し、使用の前に適切な担体中でもどすことができる。こ
の技術は、通常の免疫グロブリンで有効であることが示
されている。あらゆる適切な凍結乾燥並びに再構成技術
を用いることができる。凍結乾燥および再構成が抗体活
性損失の程度を変化させ（例えば、通常の免疫グロブリ
ンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも活性損失が大き
い傾向にある）、使用レベルを調節して補償しなければ
ならないことがあり得ることは当業者には認識されるで
あろう。
【００５１】このヒト様抗体もしくはそれらのカクテル
を含有する組成物は、予防および／または治療処置のた
めに投与することができる。治療目的の適用において
は、組成物は、すでに疾患に罹患した患者に、治療に十
分であるか、あるいは少なくともその疾患および余病の
進行を止め、もしくは緩和させる量が投与される。これ
を達成するに適した量は、“治療上の有効投与単位量”
と定義される。この用途に有効な量は、感染の重篤性お
よび患者自身の免疫系の一般状態に依存するが、一般
に、投与単位量当り抗体約１ないし約200 ｍｇの範囲を
とり、より一般的には患者当り５ないし25ｍｇの投与量
が用いられている。この発明の物質は、一般に、疾患が
重篤な状態、すなわち生命が脅かされているか、もしく
は潜在的に生命が脅かされている状況で用いられること
は心に留めておくべきである。そのような場合には、こ
の発明のヒト様抗体によって達成される外部発生物質の
最小化および“外来物質”拒絶の恐れをより少なくする
という観点から、治療医師によってこの抗体の実質的な
過剰量を投与することが可能であり、望ましいものと感
じられる。
【００５２】予防目的の適用においては、この抗体もし
くはそれらのカクテルを含有する組成物は、患者の抵抗
力を増強させるために、まだ疾患状態にはない患者に投
与される。そのような量は、“予防上の有効投与単位
量”と定義される。この用途においては、正確な量は同
様に患者の健康状態および免疫の一般レベルに依存する
が、一般に、単位投与量当り0.1 ないし25ｍｇの範囲を
とり、特に患者当り0.5ないし2.5 ｍｇである。好まし
い予防用途は、腎臓移植拒絶の予防に対するものであ
る。
【００５３】この組成物は、治療医師によって選択され
た投与量レベルおよびパターンで、単一もしくは複数投
与することができる。いずれにしても、この医薬処方
は、この発明の抗体を、患者を効果的に治療するに十分
な量提供するべきである。
【００５４】この発明のヒト様抗体は、イン・ビトロに
おいて、非常に多様な用途をさらに見出すことができ
る。例として、例示抗体は、Ｔ細胞タイピング、特異Ｃ
Ｄl8抗原保有細胞もしくは受容体のフラグメントの単
離、ワクチン調製等に用いることができる。
【００５５】診断の目的には、この抗体は標識されてい
ても、されていなくてもよい。未標識抗体は、ヒト化抗
体と反応する他の標識抗体（二次抗体）、例えばヒト免
疫グロブリン定常部位に特異的な抗体、と組み合わせて
用いることができる。代わりに、この抗体を直接標識す
ることができる。非常に多様な標識、例えば、放射核、
蛍石、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素阻害
剤、リガンド（特にハプテン）等を用いることができ
る。多くのタイプのイムノアッセイを利用することがで
き、それらは当業者に公知である。
【００５６】キットもまた、細胞活性もしくは選択され
た抗原の存在に対する防御またはその検出に使用するた
めに、この主題の抗体を具備することができる。したが
って、この発明のヒト化抗体は、通常、容器内に凍結乾
燥された形で、単独に、もしくは所望の細胞タイプにた
いする特異性を有するさらなる抗体と一緒に供給され
る。標識もしくは毒素と結合していてもいなくてもよい
これらの抗体は、トリス、リン酸塩、炭酸塩のような緩
衝剤、安定化剤、殺生物剤、不活性タンパク、例えば血
清アルブミン等と共にキットに含まれる。一般に、これ
らの物質は活性抗体の量に対して約５重量％未満存在
し、通常、抗体濃度に対して総量で少なくとも約 0.001
重量％存在する。しばしば、活性成分を希釈するため
に、不活性エクステンダー（extender）または賦形剤を
含むことが望ましく、賦形剤は組成物全体の約１ないし
99重員％存在し得る。アッセイにおいて、キメラ抗体に
結合し得る二次抗体が用いられる場合には、これは通常
別のバイアル中に収容される。二次抗体は、典型的には
標識と結合しており、上述の抗体処方と同様の様式で処
方されている。このキットは、一般に、一揃いの使用説
明書も含んでいる。
【００５７】以下の例はこの発明を説明する。
【００５８】例 ＹＦＣ51.1.1ラット抗ヒトＣＤ18重鎖および軽鎖のクロ
ーニング並びに配列決定 2.5 ×lO7 ＹＦＣ51.1.1発現細胞から、Chomczynski お
よびSacchiの方法（Anal. Biochem., 162, 156-159, (1
987)) に従い、l ×107 細胞当り1 ｍｌの抽出溶液を用
いて、全ＲＮＡを単離した。得られたＲＮＡペレット
を、分光光度計の測定で 4μｇ／μｌの濃度となるよう
にジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処理蒸留水50
μｌに再溶解する。製造者のプロトコルを用い、75μｇ
の全量ＲＮＡからｍＲＮＡを抽出するために、ダイナビ
ーズ・オリゴ（ｄＴ）25（Dynal ）を用いた。ｃＤＮＡ
合成用のスーパースクリプト（SUPERSCRlPT ）・プラス
ミド・ システムおよびプラスミド・クローニング・キッ
ト（ＢＲＬ）を用い、製造者が推奨する方法に従って、
単離したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。得られたｃ
ＤＮＡ／ｐＳＰＯＲＴ−ｌライゲーションを用いて、Es
cherichia coli マックス・エフィシエンシ（MAX EFFI
CIENCY）ＤＨ５αコンペテント・セルズ（ＢＲＬ）を形
質転換した。Buluwelaらの方法（Nucleic Acids Res.,
17, 452,（1989））に従い、約5000コロニーを Hybond-
N ナイロンフィルター（Amersham）上にのせて溶菌し、
変性させて固定した。このフィルターを、0.2 ×ＳＳ
Ｃ、0.1 ％ＳＤＳ中において、55℃で、プロテイナーゼ
Ｋ（50μｇ／ｍｌ）を用いて30分間処理し、過剰の残骸
をティッシュで除去した。
【００５９】(i）重鎖 ラットγ‐ＣＨ１定常部位（塩基 496-515）のタンパク
に相補的な、配列番号17に示すオリゴヌクレオチドの末
端を漂識し、標準プロトコルに従うＹＦＣ51.1.1重鎖に
ついてのフィルターのスクリーニングに用いた。約50の
潜在的な陽性コロニーが検出され、さらに分析するため
に20個を選択した。Del Sal らの方法（Nucleic Acids
Res., 16, 9878, （1988) ）を用いてプラスミドＤＮＡ
が調製され、20のうちの12が期待通りのサイズを有する
ラット免疫グロブリン重鎖ｃＤＮＡのインサートを有し
ていた。クローンｐ51Ｈ．6 を選択し、シークエンス・
キット（ＵＳＢ）のプロトコルにより、ジデオキシ鎖末
端法（Sangerら，Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74 ，
5463-5467,（l977））に従い、プラスミド・プライミン
グにより可変部位の配列を両方向決定した。可変部位の
配列を配列番号９および10に示す。
【００６０】（ii）軽鎖 非放射性ＤＮＡ標識および検出キット（Boehringer Man
nheim ）を用い、製造者のプロトコルに従って、ラット
ミエローマＹ３−Ａｇ1.2.3 軽鎖のクローン（Crowe
ら，Nucleic Acids Res., 17, 7992, （1989））をジゴ
キシゲニン−ll−ｄＵＴＰで標識し、ＹＦＣ51.1.1軽鎖
についてのフィルターのスクリーニングに用いた。約40
の潜在的な陽性コロニーが検出され、さらに分析するた
めに24個を選択した。上述と同様にプラスミドＤＮＡを
調製した。Ｙ３−Ａｇ1.2.3 およびＹＦＣ51.1.1軽鎖の
両方が単離された（Ｙ３細胞系はハイブリドーマ融合パ
ターン）が、それらは異なる制限パターンを有すること
により分別可能であった。ＹＦＣ51.1.1軽鎖を有する１
つのクローンｐ51Ｌ. ４を選択し、重鎖についての記述
と同様に配列を決定した。可変部位の配列を配列番号１
および２に示す。
【００６１】ヒト化抗体の設計 上記工程（２）に記述した選別手順を用いて、ヒト化プ
ロセスに用いるＮＥＷＭ重鎖およびＲＥＩ軽鎖のヒト可
変ドメイン・フレームワーク（Kabat ら，1987）を選択
した。
【００６２】ヒト化重鎖および軽鎖遺伝子の構築 LewisおよびCrowe の方法（Gene，101, 297-302（199
1））に従い、ヒト化重鎖および軽鎖を構築した。
【００６３】（i) 軽鎖 軽鎖オリゴヌクレオチドプライマー ＡL ：配列番号l8 ＢL ：配列番号l9 ＣL ：配列番号20 ＤL ：配列番号21 ＥL ：配列番号22 ＦL ：配列番号23 ＧL ：配列番号24 ＨL ：配列番号25
【００６４】ＰＣＲ反応（Saiki ら，Science 239, 487
-491（1988））を、プログラム可能な加熱ブロック（Hy
baid）内で、20回の温度サイクル（94℃で1 分、50℃で
２分および72℃で３分）および続く72℃での最終10分工
程を用いて行なった。製造者が推奨する通り、各プライ
マー１μｇ、特定量のテンプレート、およびＴａｑポリ
メラーゼ（Perkin Elmer Cetus） 2.5ユニットを反応緩
衝液と共に最終容積100 μｌで用いた。
【００６５】ＰＣＲの開始テンプレートはＣＡＭＰＡＴ
Ｈ-lH 軽鎖（ＲＥｌ フレームワーク上のヒト化ＣＡＭ
ＰＡＴＨ-l；PageおよびSydenham，Biotechnology, 9,
64-68 (1991))である。プライマー対ＡL およびＢL 、
ＣL およびＤL 、ＥL およびＦL 、並びにＧL およびＨ
L をそれぞれを用いて、反応当りテンプレート10ｎｇ
で、４通りの初期ＰＣＲ反応を行なった。これらのＰＣ
Ｒ反応の生成物、フラグメントＡＢL 、ＣＤL 、ＥＦL
およびＧＨL の各々を、Prep-A-Gene （Bio-Rad）を用
いて、製造者が推奨するプロトコルに従って精製した。
各精製生成物の1／４を用いて、フラグメントＡＢL と
ＣＤL 、およびＥＦL とＧＨL とを結合させ、プライマ
ーＡL およびＤL 、並びにＥL およびＨL をそれぞれ用
いる組換えＰＣＲ反応を行なった。これらの反応の生成
物、フラグメントＡＤL およびＥＨ L を上述の通りに精
製し、各々のl ／４をプライマーＡL およびＨL を用い
る組換えＰＣＲ反応において結合した。最終ヒト化軽鎖
組換えＰＣＲ生成物ＡＨL を、プライマーＡL およびＨ
L のHind III部位を利用し、Crowe ら，Nucleic Acids
Res., 19, 184,（1991）の方法に従って、ｐＵＣ-l8
（ＢＲＬ）のHindIII 部位にクローニングした。ジデオ
キシ鎖末端法によりプラスミド単離体の配列を決定し、
正しい配列のクローンを選択した。
【００６６】（ii）重鎖 重鎖オリゴヌクレオチドプライマー： ＡH ：配列番号26 ＢH ：配列番号27 ＣH ：配列番号28 ＤH ：配列番号29 ＥH ：配列番号30 ＦH ：配列番号31 ＧH ：配列番号32 ＨH ：配列番号33
【００６７】ＰＣＲの開始テンプレートはＣＡＭＰＡＴ
Ｈ‐ 1Ｈ重鎖である。上述と同様ではあるがオリゴヌク
レオチドプライマーＡH ないしＨH を用いて、組換えＰ
ＣＲ法により齧歯類ＣＤＲをテンプレートにグラフト化
した。最終ＰＣＲ、すなわち、フラグメントＡＤH およ
びＥＨH とプライマーＡH およびＨH は、生成物の収率
は高くはない。そこで、（フラグメントＡＤH およびＥ
ＦH から）フラグメントAFH を生成し、フラグメントＥ
ＨH と共にプライマーＡH およびＨH を用いるＰＣＲに
用いた。オリゴヌクレオチドＡH およびＨH は、ヒト化
可変部位の初期クローニングを可能ならしめるために、
それぞれHindIII およびEcoRl 部位を有するように設計
し、それに続く、選択された適切な定常部位を用いる可
変部位のクローニングを容易にするために、オリゴヌク
レオチドＧH のＮＥＷＭフレームワーク４（ＦＲ４）領
域にSpeI部位を導入した。SpeI部位は、ヒト化重鎖テン
プレートの109 位（Kabat ら，1987によるナンバリン
グ）のロイシン残基を変えることがないように選択し
た。６つのヒト重鎖Ｊ−ミニ遺伝子のうちの４つは、こ
の位置にロイシンを有している（Kabat ら，1987）。こ
のため、一般に、操作したSpel部位の使用は適当であ
る。
【００６８】ヒト化重鎖可変部位組換えＰＣＲ生成物を
Hindlll ／EcoRI 切断ｐＵＣ−l8（ＢＲＬ）にクローニ
ングし、正しい配列を有するプラスミド単離体を選択し
た。ＣＡＭＰＡＴＨ‐l Ｈ重鎖のＦＲ４およびγl 定常
部位を、オリゴヌクレオチドプライマーＸH （配列番号
34）およびＹH （配列番号35）を用いてｐＵＣ−l8（Ｂ
ＲＬ）にＰＣＲクローニングした。プライマーＸH は
SpeIおよびHindII1 部位を有し、ＹH はEcoR1 部位を有
する。HindII1 およびEcoRl 部位をＰＣＲ生成物のｐＵ
Ｃ‐18へのクローニングに用い、正しい配列を有するプ
ラスミド単離体を選択した。続いて、操作したＦＲ４Sp
eI部位を用いて、ヒト化可変部位およびγl 定常部位か
ら完全重鎖を再構成した。
【００６９】ＣＯＳ細胞における一過性発現 ヒト化重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡをベクター
ｐＥＥ6 ．ｈＣＭＶおよびｐＥＥ12にそれぞれクローニ
ングした。 Stephens ＆ Cockett，Nucleic Acids Re
s., 17, 7110（1989）； Bebbington ら，Biotechnolog
y, 10, 169（1992）；およびBebbingtonおよびHentsche
l ，Glover編 ＤＮＡクローニング第 III巻，Academic
Press（1987）を参照。ベクターｐＥＥl2は、ｐＢＲ 3
22をベースとし、h-CMV- MEIプロモーターおよびＳＶ40
早期（early ）領域プロモーターの制御の下のハムスタ
ー・グルタミン・シンセターゼ（ＧＳ）ｃＤＮＡを有す
るベクターである。ベクターｐＥＥl2は、ＳＶ40プロモ
ーター転写によりh-CMV-MEIプロモーターと同じ方向に
誘導されたＧＳｃＤＮＡ発現カセットを有するｐＥＥ6
（EP-A-0338841参照）に対応する。ベクターｐＥＥ6 、
ｈＣＭＶおよびｐＥＥl2を形質導入した細胞は、ＧＳｃ
ＤＮＡの存在により、グルタミン非含有培地において成
長可能である。選択はｐＥＥl2プラスミドに対してのみ
行なわれるが、効果的な発現は、両プラスミドの共組込
み（co-integration）に依存する。
【００７０】トランスフェクタム試薬（Transfectam re
agent ）（Promega, Southampton,U.K.）を用い、製造
者が推奨する条件下で、組換えプラスミド（各５μｇ）
を５×105 ＣＯＳ-1細胞に形質導入した。ストックＣＯ
Ｓ-1細胞（source ECACC, Porton Down ，U.K.）は、10
％仔ウシ血清（APP, Dudley U.K.）を補ったＤＭＥＭ培
地（Flow，lrvine，U.K.）中に維持した。ＣＯＳ細胞形
質導入は、ＤＭＥＭ培地（Flow, Irvine，U.K.）中で行
なった。形質導入の４日後のＣＯＳ-1細胞からの成長培
地のアッセイを、捕獲抗体としてポリクローナル抗ヒト
ＩｇＧ（Sigma，Poole ，U.K.）を固相した可撓性マイ
クロタイタープレート（Falcon，Beclon-Dickinson，Pl
ymouth，U.K.）を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡアッセ
イにより行なった。アッセイ試料を加え、抗ヒトＩｇＧ
γ鎖−特異的パーオキシダーゼ結合体（Seralab, Cra
wley Down, U.K. ）および基質としてのオルソフェニレ
ンジミン−ＨＣｌ（Sigma, Poole U.K．）を用いて検出
を行なった。
【００７１】Gladwin ら，Biochem. Biophs. Acta., lO
52, 166-l72 (1990 ）の方法に従い、消耗したＣＯＳ細
胞上清をＦＡＣＳ分析のためのＭＦ-l4 （Ｔ細胞クロー
ン）の表面標識に用いることにより、ＣＯＳ細胞におい
てヒト化抗体が一時的に発現したことが示された。簡潔
に述べると、細胞懸濁液（105 ）の一部lOO μｌを、適
当な抗体（消耗したＣＯＳ細胞上清）と共に、溶融氷上
で30分間インキュベートした。これらの細胞をＰＢＳで
２回洗浄し、適当な二次抗体と共にさらに30分間インキ
ュベートした（下記参照）。細胞を再び洗浄し、溶融氷
上で、抗ラットＩｇ−ＦＩＴＣもしくは抗ヒトＩｇ‐Ｆ
ＩＴＣ結合体を添加した。最後に、細胞をＰＢＳで２回
洗浄し、 0.1％パラホルムアルデヒドで固定した。表面
標識の分析は、標準コンピュータ、電子工学および光学
を用いるBecton-Dickenson FACScan を用いて行なっ
た。
【００７２】ＣＯＳ細胞上清中のヒト化抗体は、ラット
ＹＦＣ51.1.1の結合の阻害の他に、ＭＦ−ｌ4 細胞と結
合することが示された。このヒト化抗体が、ラットモノ
クローナル抗体の結合をブロックすることによりＣＤl8
に対する結合性を保持することが示されたので、安定な
ＮＳＯ形質導入体を作製した。
【００７３】ＮＳＯ細胞における安定発現 ＮＳＯ細胞における安定な形質導入を生じさせるシング
ル発現ベクターは、pEEl2-軽鎖プラスミドのBamHI の中
のpEE6から完全重鎖発現カセットをクローニングして生
成させた。すなわち、配列をコードする重鎖及び軽鎖の
両方は、同じベクターから同じ方向に転写された。形質
導入のためのプラスミド40μｇを、細菌性プラスミド配
列の中に認識配列を有するSalI制限酵素による消化によ
って直線化した。直線化されたＤＮＡをエタノールを用
いて溶液から沈殿させ、70％エタノール中で洗浄し、乾
燥して滅菌水に再び懸濁させた。
【００７４】ＮＳＯ細胞（ヒト骨髄腫（mycloma ）細胞
系；Jarvis，Methods in Enzymology, 73B, 3 （198
1）；source ECACC ，Porton Down ，U.K.参照）の指
数関数的な増殖は、非選択的DMEM培地（すなわち、グル
タミン及び硝酸鉄がなく、ピルビン酸ナトリウムllO mg
／1 （GIBCO/BRL ，Paisley, U.K. ）を用い、 1×非必
須アミノ酸（Flow，Irvine，U.K.）２mM グルタミン
（GlBCO)および10％子ウシ胎児血清（APP, Dudley, U.
K. ）が補填されている）中で続けられた。ＮＳＯ細胞
を遠心分離し、洗浄し、且つ、ＤＮＡを添加した後に、
細胞が １０7 細胞／mlの濃度になるように冷ＰＢＳ中
に再懸濁した。直線化されたプラスミドＤＮＡ（40μ
ｇ）を、エレクトロポーレーションキュベット中の１０
7 細胞に氷上で添加した。細胞およびＤＮＡを泡立たな
いように穏やかに混合し、混合物を氷上に５分間放置し
た。キュベットの外側を拭いて乾燥し、1500V, 3ｍＦの
二連続パルスを、Gene Pulser （BlO-Rad ）を用いて加
えた。このキュベットを、５分間、氷に戻した。
【００７５】形質移入した細胞を、非選択的培地50μｌ
中に３×105 、7.5 ×104 および 1.5×104 細胞／ｍｌ
の濃度で、96ウエルプレートに移し、37℃で24時間イン
キュベートした。次に、選択的培地（すなわち、グルタ
ミン及び硝酸鉄がなく、ピルビン酸ナトリウム100 ｍｇ
／1 （GlBCO /BRL，Pais1ey, U.K. ）を用い、グルタミ
ン酸（60ｍｇ／l ）、アスパラギン（60ｍｇ／ｍｌ；Si
gma ，Poole ，U.K.）、 l×非必須アミノ酸、アデノシ
ン，シチジン，グアノシンおよびウリジン各 7ｍｇ／ｍ
ｌ、チミジン 2.4ｍｇ／l （Sigma, Poole，U.K.）並び
に10％未溶解子ウシ血清（APP, Dudley ，U.K.）が補填
されている）lOO μｌを、結合および形質導入されたプ
ラスミドを有する、選択されたクローンに添加した。こ
のプレートを培養器に戻し、実質のある細胞の死が起こ
り、分離している生き残ったコロニーが現れるまで放置
した。一旦、グルタミン依存性形質導入体が認められた
ら、単一のコロニーを有するウエルを選択し、使用した
組織培養懸濁液を集めて、ヒトＩｇＧ分泌をアッセイし
た。
【００７６】次に、ＩｇＧ分泌について陽性である単一
のコロニーを有するウエルを、選択的培地を使用した培
養に発展させた。細胞を、96ウエルプレートの中に、培
地100 μｌ中104 細胞／ウェルで分布させ、一晩インキ
ュベートした。L-メチオニンスルホキシイミン（ＭＳ
Ｘ）の濃縮物を含有する選択的培地100 μｌを添加し
た。ＭＳＸは、ベクターの分泌を増幅させる毒性グルタ
ミン類似物である。各々の96- ウエルプレートは、 200
μＭ〜12.5μＭの範囲内で異なるＭＳＸの最終濃度を有
する。個々のコロニーを、ＭＳＸ耐性を起こしたＭＳＸ
最高濃度で、各々の依存性形質導入体から分離した。コ
ロニーを発展させ、抗体分泌速度（μｇ／10 6 細胞／
日）を、増幅されていない場合の速度と比較した。１〜
３μｇ／106 細胞／日でヒト化抗体を発現するクローン
を得た。
【００７７】ヒト化抗体を、使用した組織細胞懸濁液か
ら、スーパーロース プロテイン-Gカラム（ファルマシ
ア）上のアフィニティークロマトグラフィーで精製し、
Ｔ細胞増殖アッセイおよびClq 結合研究に使用した。
【００７８】Ｔ細胞増殖 末梢性ヒト単核細胞を、リンホプレプ（Lymphoprep）(N
ycomed，Oslo，Norway）を用いて脱線維素ヒト全身血液
から分離し、製造業者のプロトコールを続けた。３倍培
養液を、中間クローン（10％自己血清、2mM グルタミン
およびlOO ＩＵ／ｍｌペニシリン、100 μｇ／ｍｌスト
レプトマイシンを補充したRPMI 1640 ）、または、培地
および抗原（Tetanus toxoid，５μｇ／ml）若しくは培
地およびマイトジェン（PHA,５μg ／ｍｌ）と共に、YF
C 51.1.1またはヒト化抗体の存在下或いは存在なしで、
96ウエル平底マイクロタイタープレート（Nunclon ，Ro
skild ，Denmark ）の中に供給した。細胞を、37℃、95
％空気、５％ＣＯ2 の加湿雰囲気で５日間培養した。次
に、ウエルを、1 μＣｉ［メチル 3H ］チミジン（２Ｃ
ｉ／mmol，Amersham）でパルスを送り、４時間後集め、
βカウンター（LKB,Betaplate，Sweden）を使用した液
体シンチレーションにより、放射能計数をした。
【００７９】ラットYFC51.1.1 モノクローナル抗体およ
びヒト化抗体の両方は、抗原特異的Ｔ細胞反応を強く阻
害したが、増殖を誘発したＰＨＡについて僅かな効果を
有した。しかしながら、抗体（50μｇ／ｍｌ）の高いレ
ベルおよびＰＨＡ（25μｇ／ｍｌ）の低いレベルでは、
80％阻害まで得られた。
【００８０】補体結合 ヒト単核細胞（上記調製）を、ＰＨＡ5 μｇ／ｍｌを用
いて刺激し、37℃で２日間インキュベートした。細胞を
ＰＢＳで洗浄し、ＰＨＡを除去した。次に、細胞を、テ
スト抗体10μｇ／μｌと共に氷上で２０分間インキュベ
ートし、氷冷ＰＢＳで細胞を洗浄し、水冷ヒト血清と共
に２０分間インキュベートした。水冷ＰＢＳで洗浄し、
ヒト血清を分離した。次いで、細胞を、フルオロセイン
化（Fluoreceinated）ポリクローナルヒツジ抗ヒトClq
と共に、２０分間インキュベートした。結合していない
抗−Clq を、ＰＢＳで細胞を洗浄して除去し、細胞を、
Becton-Dickenson FACScan で分析した。YFC51.1.1
は、ヒトClq と弱く結台していることが認められ、ヒト
化抗体との結合は検出されなかった。抗-CD l8抗体の可
能性のある治療的使用は、CD18陽性細胞の枯渇よりも、
白血球のCDl8- 仲介粘着の一過性阻害に頼っている。従
って、ヒト抗体が ＣＤl8陽性細胞の上へヒト補体を固
定できないことは、インビボで、抗体が補体を使用し尽
くさないがブロッキング抗体として機能し得るので、好
都合である。
【００８１】ＦＡＣＳ分析 CDl8陽性Ｔ細胞クローン（MFl4）を、ラット抗体と比較
したヒト化抗体の結合の測定に使用した。細胞をラット
またはヒト化抗体を氷上で３０分間インキュベートし
た。結合していない抗体を洗浄して除去し、２番目の抗
体を添加（すなわち、ラット抗体をヒト化抗体と共に予
備インキュベートした細胞に添加した。逆もまた同様で
ある。氷上で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄
して結合していない抗体を除去し、 FITC-標識抗ヒト抗
体または抗ラット抗体を添加した。結合していない標識
を洗浄により除去し、細胞をBecton-Dickenson FACSca
n で分析した。YFC51.1.1 lOμｇ／ｍｌを用いたMFl4細
胞の予備インキュベーションは、ヒト化抗体O.1 μｇ／
ｍｌの結合を完全にブロックした。相反する実験では、
ヒト化抗体10μｇ／ｍｌを用いた予備インキュベーショ
ンは、YFC51.1.1 0.1μｇ／ｍｌの結合を完全にブロッ
クした。第１の抗体 1.0およびO.1 μｇ／ｍｌを使用し
た場合の両方とも、ブロッキングの滴定に至った。
【００８２】
【発明の効果】本発明により、抗体がヒトＣＤl8抗原に
結合し得るように、特定の抗ヒトＣＤl8抗体由来のＣＤ
Ｒの十分なアミノ酸配列が提示されているヒト化抗体が
提供される。また、抗体がヒトＣＤ-l8 抗原に結合し得
るように、特定の抗ヒトＣＤl8抗体由来のＣＤＲの十分
なアミノ酸配列が提示されているヒト化抗体をコードす
るＤＮＡ分子が提供される。
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【００９２】
【００９３】
【００９４】
【００９５】
【００９６】
【００９７】
【００９８】
【００９９】
【０１００】
【０１０１】
【０１０２】
【０１０３】
【０１０４】
【０１０５】
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１５年２月１４日（２００３．２．１
４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ (72)発明者 ワルドマン、ハーマン イギリス国、シービー２・１キューピー、 ケンブリッジシャー、ケンブリッジ、テニ スコート・ロード（番地なし）、デパート メント・オブ・パソロジー、ザ・ユニバー シティー・オブ・ケンブリッジ内 (72)発明者 シムス、マーチン イギリス国、ビーアール３・３ビーエス、 ケント、ベッケンハム、ラングレイ・コー ト（番地なし）、ザ・ウエルカム・ファウ ンデーション・リミテッド内 (72)発明者 クロー、スコット イギリス国、ビーアール３・３ビーエス、 ケント、ベッケンハム、ラングレイ・コー ト（番地なし）、ザ・ウエルカム・ファウ ンデーション・リミテッド内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA44 CA04 CA05 CA06 CA09 CA11 DA02 EA04 GA03 GA11 GA18 HA03 HA08 HA14 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 CE12 DA01 4B065 AA90X AA91X AA93X AA93Y AB01 AB05 AB06 AC14 BA02 BA08 BA24 CA25 CA44 4C085 AA14 BB11 CC23 EE01 GG04 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 EA20 FA72 FA74 GA26

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 抗体がヒトＣＤ-18 抗原に結合し得るに
    十分な、下記の各ＣＤＲのアミノ酸配列を具備するヒト
    化抗体。
  2. 【請求項２】 軽鎖の可変ドメインフレームワークがタ
    ンパクＲＥＩの可変ドメインフレームワークであるか、
    もしくはそれと実質的に相同である請求項１記載の抗
    体。
  3. 【請求項３】 重鎖の可変ドメインフレームワークがタ
    ンパクＮＥＷＭの可変ドメインフレームワークである
    か、もしくはそれと実質的に相同である請求項１または
    ２記載の抗体。
  4. 【請求項４】 ＣＤＲが、請求項１において特定される
    軽鎖ＣＤＲ1 ないし3 および重鎖ＣＤＲ1 ないし3 であ
    る請求項１〜３いずれか記載の抗体。
  5. 【請求項５】 請求項１〜４いずれかに記載されるヒト
    化抗体の調製方法であって、(i) ヒト化抗体の軽鎖をコ
    ードする第１発現ベクターおよびヒト化抗体の重鎖をコ
    ードする第２発現ベクター；または (ii) ヒト化抗体の
    軽鎖および重鎖の両方をコードする単一の発現ベクタ
    ー；のいずれかを用いてホストを形質転換し、該ホスト
    を各鎖が発現する条件下に維持し、並びに発現した鎖の
    集合体により産生されるヒト化抗体を単離することを具
    備する方法。
  6. 【請求項６】 抗体がヒトＣＤ-18 抗原に結合し得るに
    十分な、下記の各ＣＤＲのアミノ酸配列を具備するヒト
    化抗体をコードするＤＮＡ分子。
  7. 【請求項７】 軽鎖の可変ドメインフレームワークがタ
    ンパクＲＥＩの可変ドメインフレームワークであるか、
    もしくはそれと実質的に相同である請求項６記載のＤＮ
    Ａ分子。
  8. 【請求項８】 重鎖の可変ドメインフレームワークがタ
    ンパクＮＥＷＭの可変ドメインフレームワークである
    か、もしくはそれと実質的に相同である請求項６または
    ７記載のＤＮＡ分子。
  9. 【請求項９】 ＣＤＲが、請求項６において特定される
    軽鎖ＣＤＲ1 ないし3 および重鎖ＣＤＲ1 ないし3 であ
    る請求項６〜８いずれか記載の抗体。
  10. 【請求項１０】 発現ベクターの形態にある請求項６〜
    ９いずれか記載のＤＮＡ分子。
  11. 【請求項１１】 請求項１０記載の発現ベクターで形質
    転換されたホスト。
  12. 【請求項１２】 薬剤学的に許容し得る担体もしくは希
    釈剤および、活性成分として、請求項１〜４いずれかに
    定義されるヒト化抗体を包含する医薬組成物。
  13. 【請求項１３】 軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含ん
    でなるヒト化抗体またはそのフラグメントであって、ヒ
    トＣＤ１８抗原に特異性を有し、標識されており、該軽
    鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ1 、ＣＤＲ2 およ
    びＣＤＲ3 ）および該重鎖可変領域の相補性決定領域
    （ＣＤＲ1 、ＣＤＲ2 およびＣＤＲ3 ）が、以下のアミ
    ノ酸配列： を有するものであるか、または前記ＣＤＲのアミノ酸配
    列が前記アミノ酸配列に実質的に相同なものである、ヒ
    ト化抗体またはそのフラグメント。
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