CN103342751B - 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的抗体中和剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异结合并中和灵长类GM-CSF的人单克隆抗体或其片段。

Description

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的抗体中和剂
本发明涉及抗体及其片段，其能中和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的活性。本发明进一步涉及包含该抗体及其片段的药物组合物以及该抗体及其片段用于制备治疗各种病症的药物的用途。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，最初被描述成粒细胞和巨噬细胞前体细胞的体外生长和分化的有效刺激物，它是约23kDa的糖蛋白，带有4个α螺旋束结构，其能结合由属于1类细胞因子受体家族的亚基构成的异二聚化的受体。它刺激诸如巨噬细胞、嗜中性白细胞、粒细胞、嗜曙红细胞和提呈抗原的树突状细胞成熟，增加它们在抗感染方面的功能能力。在小鼠中的基因消除实验，即静默或敲除感兴趣的基因(本文中的GM-CSF)的实验，显示GM-CSF对于维持一些巨噬细胞群(如涉及清除肺中表面活性剂和应答某些种类的感染或免疫应答的那些)的功能活性来说是必需的。
尽管GM-CSF对嗜中性白细胞、嗜曙红细胞、巨噬细胞、以及较次要的红细胞类和巨核细胞的先祖细胞在体外有有效的刺激活性，而用基因敲除小鼠得到的体内结果提示GM-CSF的主要生理作用是维持或刺激成熟的巨噬细胞和粒细胞的功能活性并刺激向免疫系统进行抗原提呈。后一作用通过直接对树突状细胞和巨噬细胞的产生起作用而达成，也通过增加II类主要组织相容性复合物和Fc受体在巨噬细胞和树突状细胞上的表达而达成。
GM-CSF刺激嗜中性白细胞、嗜曙红细胞、和单核细胞-巨噬细胞的功能活性。这些包括增强趋化活性，增加细胞粘附分子的表达和增加与表面的粘附性，和增加吞噬活性以及抑制和延缓这些细胞的凋亡。嗜中性白细胞代表了抗入侵防御的第一线。通过包括GM-CSF的原炎性刺激物能延缓嗜中性白细胞程序性死亡，确保在正确的时间和位置使炎症消退。GM-CSF也能刺激这些细胞的能力来介导抗体依赖性细胞细胞毒性，并杀死在细胞内的微生物，并对这些细胞起“引发’’效果以增强它们对接下来的氧化爆发(oxidativeburst)(超氧化物阴离子的产生)刺激的应答、脱粒并释放抗微生物剂、并具有化学趋化作用。另外，GM-CSF刺激次级细胞因子和介质从这些细胞释放，包括从嗜中性白细胞中释放IL-1、G-CSF、M-CSF、和白细胞三烯，以及从巨噬细胞中释放IL-1、TNF、IL-6，G-CSF、M-CSF、和前列腺素。
从以上清楚可知，GM-CSF在活化和维持对抗感染所必需的细胞群中起关键的作用。可是，在某些情况下，活化这些细胞群是不合需要的。例如，当未出现病原体的时候，活化以上细胞系在许多情况下导致急性和/或慢性炎症病情，在极端情况下可危及生命。相似地，过表达GM-CSF可导致过量免疫活化，造成炎症。在这种情况下，需要中和GM-CSF的活性，从而消除或至少减轻这些炎症病症的症状。
这种中和活性的例子存在于现有技术中。例如发现了，中和抗GM-CSF抗体能在外周血样品中增加嗜曙红细胞凋亡率(Kankaanranta等(2000)JournalofAllergyandClinicalImmunology106，77-83)。由于增加嗜曙红细胞存活与哮喘相关，因而预计增加嗜曙红细胞凋亡能减轻哮喘症状。
在慢性炎性疾病中，如哮喘、类风湿性关节炎、和多发性硬化，GM-CSF的水平会局部增加并在某些情况下全身性增加，而且与这些疾病中的炎症过程相关。
因此，本发明的目的是改进对以前技术已知的增加了的和/或不希望的GM-CSF活性进行中和的模式。
因此，本发明的一个方面涉及人单克隆抗体或其片段，其特异结合并中和灵长类GM-CSF。
本文中所用的术语“特异结合”或相关表述，如“特异的结合”、“特异地结合”、“特异结合物”等，指人单克隆抗体或其片段区分出灵长类GM-CSF和任何数量的其他不同于灵长类GM-CSF的潜在抗原的能力如此之高，从多种作为潜在结合配偶体的不同抗原的汇聚物中，仅结合或仅显著结合灵长类GM-CSF。在本发明的范围内，“显著”结合灵长类GM-CSF，是指在从作为潜在结合配偶体的同样可接触的多种不同抗原的汇聚物中，比任何其他不同于灵长类GM-CSF的抗原高至少10倍、优选50倍、最优选100倍或更高频率(在动力学意义上)地结合灵长类GM-CSF的时候。这些动力学测量可在Biacore设备上进行。
本文中所用的“中和”、“中和剂”、“中和”和其语法上相关的变体指部分或完全减弱GM-CSF的一种或多种生物学效应。该GM-CSF的一种或多种生物学效应的部分或完全减弱可由修饰、阻断和/或消除GM-CSF介导的信号传导而造成，如例如在细胞内信号传递、细胞增殖或释放可溶性物质、上或下调细胞内基因活化所显示的，例如导致除了GM-CSF之外的配体的表面受体表达的那些。所属领域技术人员能理解的是，存在多种模式来确定试剂(例如所论及的抗体或其片段)是否能被划分为中和剂。例如，这一般可通过如下标准体外测试来实现：在第一个增殖实验中，其增殖程度已知取决于GM-CSF活性的细胞系，和一系列含各种浓度的GM-CSF一起孵育，孵育后测定细胞系的增殖程度。通过这种测量，确定出能使细胞半最大增殖程度的GM-CSF浓度。然后进行第二个增殖实验，其在每一系列样品中利用第一个增殖实验中所用的相同数量的细胞、以上确定的GM-CSF浓度、以及此次使用各种浓度的怀疑是GM-CSF中和剂的抗体或其片段。再测量细胞增殖以确定足以导致半最大生长抑制的抗体或其片段的浓度。如果得到的生长抑制相对于抗体(或其片段)浓度的图是S形的，使得随着抗体(或其片段)浓度增加而降低细胞增殖，则在一定程度上导致抗体依赖性生长抑制，即以某种程度中和了GM-CSF活性。在这种情况下，抗体或其片段可被认为是本发明范围内的“中和剂”。其增殖程度已知取决于GM-CSF活性的细胞系的一个例子是TF-1细胞系，其如Kitamura，T.等(1989).JCellPhysiol140，323-34所述。
如所属领域普通技术人员所理解的，细胞增殖的程度不是确立中和能力的唯一参数。例如，测定其分泌水平依赖于GM-CSF的信号传递分子(如细胞因子)的水平，可用于鉴定可疑的GM-CSF中和剂。
可用于确定所论及的抗体或其片段是否是灵长类GM-CSF活性的中和剂的细胞系的其他例子包括AML-193(Lange，B.等(1987).Blood70，192-9)；GF-D8(Rambaldi，A.等(1993).Blood81，1376-83)；GM/SO(Oez，S.等(1990).ExperimentalHematology18，1108-11)；MO7E(Avanzi，G.C.等(1990).JournalofCellularPhysiology145，458-64)；TALL-103(Valtieri，M.等(1987).JournalofInmunology138，4042-50)；UT-7(Komatsu，N.等(1991).CancerResearch51，341-8)。
本发明所述的人抗体或其片段是单克隆的。本文中所用的术语“单克隆的”应被理解为具有其现有技术中所述的典型含义，即产生于产抗体的细胞(如B细胞)的单克隆中、并识别所结合抗原上的单个表位的抗体(或其相应片段)。尤其难于制备单克隆的人抗体。与用永生化的细胞系融合鼠B细胞相反，融合人B细胞和永生化的细胞系是不可行的。因此，本发明的人单克隆抗体是克服抗体技术领域中现存的公认的技术障碍的结果。抗体的单克隆性质使其尤其适于用作治疗剂，这是因为该抗体将作为单一、均一的分子种类而存在，其可以被很好地表征并重复制备并纯化。这些因素产生的产物，其生物活性可被高精度地预测出，如果要使该分子被管理部门批准可以向人给药治疗，则这是非常重要的。
尤其重要的是，本发明所述的单克隆抗体(或相应片段)是人抗体(或相应片段)。为了使抗体试剂能向人给药治疗，很有利的是，该抗体是人源的。在向人患者给药后，人抗体或其片段将最可能不引发患者免疫系统的强免疫原性应答，即不会被识别为“外来的”非人蛋白。这指不产生宿主(即患者)抗体来抗该治疗性抗体，否则宿主抗体就会阻断治疗性抗体的活性和/或加速患者身体清除治疗性抗体，由此阻止其发挥其所希望的治疗效应)。
本文中所用的术语“人”抗体应被理解为指本发明的抗体或其片段，其包含包含于人生殖系抗体群内的一种或多种氨基酸序列。因此为了在本文中定义，抗体、或其片段可被认为是人的，如果它由这种一种或多种人生殖系氨基酸序列组成，即如果所论及的抗体或其片段的一种或多种氨基酸序列与表达的一种或多种人生殖系氨基酸序列一致。抗体或其片段也可以看成是人的，如果它由如下序列组成：所述序列与其最接近的人生殖系序列的差别不超过由于体高变所带来的差别。另外，许多非人哺乳动物(例如啮齿动物，如小鼠和大鼠)抗体包含VHCDR3氨基酸序列，其预计也存在于表达的人抗体群中。预计存在于表达的人群(repertoire)中的人或非人源的一个或多个任何这种序列也可被认为是符合本发明目的的“人”的。
根据本发明的一个具体实施方式，灵长类GM-CSF是人(Homosapiens)GM-CSF或非人灵长类GM-CSF。非人灵长类GM-CSF的尤其优选的变体包括长臂猿(nomascusconcolor，也被称为西方黑纹长臂猿)GM-CSF和猕猴科猴子的GM-CSF，例如恒河猴(Macacamulatta)GM-CSF和食蟹猴(Macacafascicularis)GM-CSF。根据本发明的具体实施方式，人单克隆抗体或其片段在人和至少一种上述猴物种之间显示出交叉反应性。这对于要向人受试者给药治疗的抗体分子是尤其有益的，这是因为该抗体通常将在行政审批前必须经历大量试验，其中某些早期试验涉及非人动物物种。为了进行这些测试，一般希望用与人遗传上高度相似的非人物种，这是因为由此获得的结果一般将高度预示出将相同分子向人给药时所预期的相应结果。可是，这种基于动物试验的预测能力至少部分取决于分子的相似性，当由于物种交叉反应性而可将相同的治疗分子向人和动物模型给药时，其预测能力是非常高的。如本发明的具体实施方式中，当抗体分子与人和另一种很相关的物种中的相同抗原交叉反应时，可以使用该相同抗体分子在人中以及在该很相关的物种中、例如在一种上述猴物种中进行试验。这增加了测试本身的效率以及这些试验在该抗体在人(从治疗角度最终兴趣所在的物种)行为方面的预测能力。
根据本发明的另一个具体实施方式，人单克隆抗体可以是IgG抗体。现有公知的是，IgG不仅包含负责具有高度区别性的抗原识别和结合的可变抗体区，而且包含通常在内源产生的抗体上出现的重和轻抗体多肽链的恒定区，在某些情况下，甚至在一个或多个位点上带有碳水化合物修饰。这样的糖基化一般是IgG型的标志，而且部分这些恒定区组成了完整抗体的所谓Fc区，已知其能在体内引发出各种效应器功能。另外，Fc区介导IgG与Fc受体的结合，由此延长体内半衰期并辅助IgG向Fc受体增加的地方——发炎的组织归巢。有益的是，IgG抗体是IgGl抗体或IgG4抗体，这些形式是优选的，这是因为它们的体内活性机制被特别好地理解并表征了。对于IgGl抗体，尤其是这样子的。
根据本发明的另一个具体实施方式，人单克隆抗体的片段可以是scFv、单结构域抗体、Fv、VHH抗体、双抗体、串联的双抗体、Fab、Fab’或F(ab)2。这些形式通常可被分成两个亚型，即由单多肽链组成的那些，和包含至少2条多肽链的那些。前一亚型的成员包括scFv(包含一个VH区和一个VL区，它们通过多肽接头连接成单多肽链)；单结构域抗体(包含单个抗体可变区)，如VHH抗体(包含单VH区)。后一亚型的成员包括Fv(包含一个VH区和一个VL区，形成分开的多肽链，它们非共价地相互连接)；双抗体(包含2条非共价连接的多肽链，其中每一条包含2个抗体可变区-通常每条多肽链有一个VH和一个VL-这两条多肽链以头对尾构型排列而形成二价抗体分子)；串联的双抗体(双特异性单链Fv抗体，其包含具有两种不同特异性的4个共价相连的免疫球蛋白可变VH和VL区，形成上述双抗体两倍大的同二聚体)；Fab(作为一条多肽链包含完整的抗体轻链，其自身包含了VL区和完整的轻链恒定区，而且作为另一条多肽链，包含一部分抗体重链，其包含完整的VH区和部分重链恒定区，所述2条多肽链通过链内二硫键而在分子间相连)；Fab’(如同以上Fab，除了进一步还原了包含在抗体重链上的二硫键)；和F(ab)2(包含2个Fab’分子，每个Fab’分子与另一个Fab’分子通过链内二硫键相连)。一般而言，上文所述类型的抗体片段给设计，例如需要在特定紧急情况下临时治疗给药的抗体的药物动力学性质带来了很大的柔性。例如，可期望减小给药的抗体大小，从而在治疗已知很少有血管分布的组织(例如，关节)时增加组织穿透程度。在某些情况下，也可期望增加治疗性抗体被清除出身体的速率，所述速率一般通过减少给药的抗体大小来加速。
根据本发明的另一个具体实施方式，所述人单克隆抗体或其片段可以呈现为单价单特异性的；多价单特异性的，尤其是二价单特异性的；或多价多特异性的，尤其是二价双特异性的形式。一般而言，多价单特异性的，尤其是二价单特异性的抗体，如上文所述的完整人IgG，可给它带来治疗优势，即亲合(avidity)效应——即相同抗体与相同抗原(本文中的灵长类GM-CSF)的多个分子结合——可增强该抗体起到的中和作用。本发明的抗体片段的几种单价单特异性形式如上所述(例如，scFv、Fv、VHH或单结构域抗体)。多价多特异性的，尤其是二价双特异性形式的本发明的人单克隆抗灵长类GM-CSF抗体，可包括完整的IgG，其中一个结合臂结合灵长类GM-CSF，而其另一个结合臂结合不同于灵长类GM-CSF的另一抗原。其他多价多特异性的，尤其是二价双特异性形式，优选为人单链双特异性抗体，即重组人抗体构建体，其包含2个上述scFv实体，通过现有通常已知的小的插入性多肽间隔区连成一个连续的多肽链(例如参见WO99/54440，其涉及抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体)。在本文中，双特异性单链抗体的范围内所涵盖的双特异性单链抗体的一个scFv部分将特异结合如上所提及的灵长类GM-CSF，而该双特异性单链抗体的另一个scFv部分将结合另一个确定具有治疗利益的抗原。
根据另一个具体实施方式，人单克隆抗体或其片段可以是衍生化的，例如用有机聚合物，例如用一个或多个聚乙二醇(“PEG”)和/或聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)分子。现有已知的是，这种衍生化有益于调节抗体或其片段的药效学性质。尤其优选的是衍生为PEG-马来酰亚胺的PEG分子，其能以位点特异性方式通过半胱氨酸的巯基来与抗体或其片段缀合。在这些中，尤其优选的是20kD和/或40kD的PEG-马来酰亚胺，其可以是分支或直链的形式。尤其有益的是增加较小的人抗灵长类GM-CSF抗体片段(如scFv片段)的有效分子量，其通过将后者与一个或多个PEG分子(尤其是PEG-马来酰亚胺)偶联而获得。
根据本发明的另一个具体实施方式，人单克隆抗体或其片段特异结合人或非人灵长类GM-CSF的表位，尤其是不连续表位，所述GM-CSF包含氨基酸第23-27位(RRLLN)和/或氨基酸第65-77位(GLR/QGSLTKLKGPL)。
上述氨基酸序列第65-77位中的第67位的可变性反映出了作为一方面的人和长臂猿GM-CSF(其中第67位是R)与作为另一方面的猕猴科猴子(例如猕猴和恒河猴)(其中第67位是Q)之间在灵长动物GM-CSF的这部分中的异质性。
本文中所用的人和非人灵长类GM-CSF的编号指成熟的GM-CSF的，即不带有其17个氨基酸信号序列的GM-CSF(上述人和非人灵长类物种的成熟的GM-CSF的总长度都是127个氨基酸)。人GM-CSF和长臂猿GM-CSF的序列如下：
APARSPSPSTQPWEHVNAIQEA LSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE
某些猕猴科成员(例如恒河猴和食蟹猴)的GM-CSF序列如下：
APARSPSPGTQPWEHVNAIQEA LSRDTAAEMNKTVEVVSEMFDLQEPSCLQTRLELYKQTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFQSFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE
上述本发明的人单克隆抗体(或其片段)所结合的最小表位(更好是不连续表位)在以上GM-CSF序列中用粗体字表示。本文中所用的术语“不连续表位”应被理解为是给定多肽链(本文中的成熟的人和非人灵长类GM-CSF)中至少2个不相邻的氨基酸序列区段(stretch)，其与同时并特异地(如上所定义)与抗体结合。根据该定义，该同时的特异结合可以是针对线形的GM-CSF多肽的。在本文中，可以设想成熟的GM-CSF多肽形成了延伸的环，在环的一个区域中以上面粗体字所指示的2个序列排成排，例如或多或少互相平行和彼此接近。在该状态下，它们特异并同时与本发明的抗体片段结合。根据该定义，以上所示的成熟GM-CSF的2个序列段的同时特异结合也可以采取抗体与构象表位结合的形式。在本文中，成熟的GM-CSF已经形成了其通常在体内所形成的三级构象(Sun，H.W.，J.Bernhagen，等(1996).ProcNatlAcadSciUSA93，5191-6)。在该三级构象中，成熟的GM-CSF多肽链以如下方式折叠：使以上所示的2条序列区段处于空间相邻的位置，例如在成熟、折叠的GM-CSF的特定区域的外表面，在此它们根据周围的多肽序列背景下的其三维构象来被识别。
在优选的具体实施方式中，以上(不连续)表位还包含氨基酸第28-31位(LSRD)，其在以上人和非人灵长类GM-CSF序列中以斜体表示。在尤其优选的具体实施方式中，以上(不连续)表位中的任一个还包含氨基酸第32-33位(TA)和/或氨基酸第21-22位(EA)，其中每个区段分别是以上人和非人灵长类GM-CSF序列中下划了线的。
根据本发明的另一个具体实施方式，人单克隆抗体或其片段在其重链可变区中包含CDR3，所述CDR3包含选自由SEQIDNO：1-13或56之任一所列的那些所组成的组的氨基酸序列。优选的是人单克隆抗体或其片段，其包含如SEQIDNO：14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQIDNO：15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQIDNO：1所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQIDNO：14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQIDNO：15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQIDNO：2所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQIDNO：14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQIDNO：15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQIDNO：3所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQIDNO：14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQIDNO：15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQIDNO：4所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQIDNO：14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQIDNO：15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQIDNO：5所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQIDNO：14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQIDNO：15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQIDNO：6所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQIDNO：14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQIDNO：15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQIDNO：7所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQIDNO：14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQIDNO：15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQIDNO：8所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQIDNO：14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQIDNO：15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQIDNO：9所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQIDNO：14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQIDNO：15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQIDNO：10所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQIDNO：14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQIDNO：15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQIDNO：11所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQIDNO：14所示的重链可变区CDRI序列、如SEQIDNO：15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQIDNO：12所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQIDNO：14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQIDNO：15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQIDNO：13所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQIDNO：14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQIDNO：15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQIDNO：56所示的重链可变区CDR3序列。
更优选的是，CDR1、CDR2和CDR3序列的以上14个组合之任一存在于人单克隆抗体或其片段中，该人单克隆抗体或其片段进一步在其轻链可变区中包含含SEQIDNO：16所示氨基酸序列的CDR1、含SEQIDNO：17所示氨基酸序列的CDR2、和含SEQIDNO：18所示氨基酸序列的CDR3。
根据另一个具体实施方式，本发明的人单克隆抗体或其片段在其轻链可变区中包含如SEQIDNO.19所示的氨基酸序列。优选的是人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：20所示氨基酸序列的；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：21所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：22所示氨基酸序列的；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：23所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：24所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：25所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：26所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：27所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：28所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：29所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：30所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：31所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：32所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：33所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：52所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：53所示氨基酸序列。
根据另一个具体实施方式，本发明的人单克隆抗体或其片段在其轻链可变区中包含如SEQIDNO.54所示的氨基酸序列。优选的是人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：20所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：21所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：22所示氨基酸序列的；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：23所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：24所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：25所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：26所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：27所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：28所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：29所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：30所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：31所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：32所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：33所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：52所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：53所示氨基酸序列。
根据另一个具体实施方式，本发明的人单克隆抗体或其片段在其轻链可变区中包含如SEQIDNO.55所示的氨基酸序列。优选的是人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：20所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：21所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：22所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：23所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：24所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：25所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：26所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：27所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：28所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：29所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：30所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：31.所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：32所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：33所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：52所示氨基酸序列；或人单克隆抗体或其片段，轻链可变区包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重链可变区包含如SEQIDNO：53所示氨基酸序列。
优选的具体实施方式提供了人单克隆抗体或其片段，在其轻链可变区中包含含如SEQIDNO.16所示氨基酸序列的CDR1区、具有如SEQIDNO.17所示氨基酸序列的CDR2区和具有如SEQIDNO.18所示氨基酸序列的CDR3，并在其重链可变区中包含含如SEQIDNO.14所示氨基酸序列的CDR1区、具有如SEQIDNO.15所示氨基酸序列的CDR2区和具有如SEQIDNO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或56之任一所示氨基酸序列的CDR3。
在另一优选的具体实施方式中，人单克隆抗体在其轻链中包含如SEQIDNO：34所示的氨基酸序列并在其重链中包含如SEQIDNO：35所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQIDNO：34所示的氨基酸序列并在其重链中包含如SEQIDNO：36所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQIDNO：34所示的氨基酸序列并在其重链中包含如SEQIDNO：37所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQIDNO：34所示的氨基酸序列并在其重链中包含如SEQIDNO：38所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQIDNO：34所示的氨基酸序列并在其重链中包含如SEQIDNO：39所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQIDNO：34所示的氨基酸序列并在其重链中包含如SEQIDNO：40所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQIDNO：34所示的氨基酸序列并在其重链中包含如SEQIDNO：41所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQIDNO：34所示的氨基酸序列并在其重链中包含如SEQIDNO：42所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQIDNO：34所示的氨基酸序列并在其重链中包含如SEQIDNO：43所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQIDNO：34所示的氨基酸序列并在其重链中包含如SEQIDNO：44所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQIDNO：34所示的氨基酸序列并在其重链中包含如SEQIDNO：45所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQIDNO：34所示的氨基酸序列并在其重链中包含如SEQIDNO：46所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQIDNO：34所示的氨基酸序列并在其重链中包含如SEQIDNO：47所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQIDNO：34所示的氨基酸序列并在其重链中包含如SEQIDNO：48所示的氨基酸序列。
以上优选的具体实施方式提供了人单克隆抗体分子和/或其片段，其尤其益于作为灵长类(尤其是人)的GM-CSF活性的中和剂。这些尤其优选的具体实施方式所述的人单克隆抗体或其片段由于几个原因而很有益。
首先，它们高度特异地识别灵长类GM-CSF，也就是说从灵长类GM-CSF与其它灵长类集落刺激因子(例如灵长类G-CSF和M-CSF)的混合物中，这些尤其优选的具体实施方式所述的结合分子能高度区分出灵长类GM-CSF，而在相同环境中不识别其他集落刺激因子。这是指，这些具体实施方式所述的人单克隆抗体或其片段，在向人给药时，将被预见到只能特异结合并中和所需的靶，而并不结合与中和其他不希望的靶。最终，这导致了关于体内治疗作用模式的高度可预测性。
第二，这些尤其优选的具体实施方式的结合物以非常高的亲和力结合灵长类GM-CSF。对于该类分子所观察到的KD值从约4x10-9M低至约0.04x1O-9M，后者相当于约40pM。由于在含水介质中该分子的动力学结合速率极大地受扩散控制，因此不能提高到超出在生理条件下局部扩散条件所能达到的速率，因此低的KD主要由动力学解离速率(koff)造成，koff对于亲和力最高的抗体结合物来说约为10-5s-1。这是指，一旦作为一方的本发明这些具体实施方式所述的人单克隆抗体或其片段与作为另一方的灵长类GM-CSF之间形成复合物，就不能容易地、或至少不能迅速地分离。对于要作为生物活性中和剂的结合分子来说，这些特点是高度有益的，这是因为所希望的中和效果通常将只能当其生物活性要被中和的分子(本文中的灵长类GM-CSF)仍旧被中和性结合分子结合时才能持续。因此，仍长时间结合其所要结合的靶的中和性分子将继续中和相当长的一段时间。
人单克隆抗体或其片段与灵长类GM-CSF的高度结合亲和力也具有优势。通常，抗体或其片段将以大小依赖性的形式从患者血流中被清除出，排出并清除较小的分子，然后是较大的。由于2种多肽(抗体或抗体片段和所结合的GM-CSF)的复合物明显大于抗体本身，因此上述低koff使得治疗性中和剂比它不结合GM-CSF的情况更慢地从患者身体中被排出并清除。因此，中和活性的幅度与其体内持续时间都增加了。
最后，这些尤其优选的具体实施方式所述的结合物所确定的中和活性出人意料地高。如将在下文中更具体地描述的，可利用TF-1生长抑制测试进行体外测量中和活性(Kitamura，T.等(1989).JCellPhysiol140，323-34)。测定IC50值作为中和潜力的指标，IC50表示本发明这些具体实施方式所述的人单克隆抗体或其片段引发半最大TF-1细胞增殖抑制所需的浓度。对于本发明这些具体实施方式所述的人单克隆抗体或其片段，确定的IC50.值约为3x10-10M、或约为0.3nM。因此，本发明这些具体实施方式所述的结合分子是灵长类GM-CSF活性的很强有力的中和剂。
然后，总之，本发明以上具体实施方式所述的人单克隆抗体或其片段显示出对所希望的抗原的高度区分能力，非常牢固地结合该抗原并持续长时间，并在它所结合的长时间内显示出高度有效的中和活性。同时，长时间保持结合物-抗原复合物能减缓该结合物从身体中被清除，由此延长所希望的体内治疗效果的持续时间。
本发明的另一方面提供了人单克隆抗体或其片段，其包含与如SEQIDNO：1-48和/或52-56之任一所示的氨基酸有至少70％同源性的氨基酸序列。同源性可通过标准序列比对程序来确定，如VectorNTI(InforMaxTM，Maryland，美国)。该程序在一个氨基酸一个氨基酸的基础上比较被比对的序列，并设置各种水平的比较严谨度(如等同氨基酸、保守氨基酸替换等)。作为本文中所用的术语，如果它们每一个属于相同的化学组别，即酸性、非极性、不带电荷的极性和碱性组，则所论及的2个氨基酸被认为是互相“保守的替换”。例如而不限于，2个属于非极性氨基酸组的不同氨基酸被认为是互相“保守的替换”，即使这2个氨基酸不相同，而非极性氨基酸和碱性氨基酸不被认为是互相“保守的替换”。Alberts，Johnson，Lewis，Raff，Roberts和Walter的“MolecularBiologyoftheCell”(第4版(2002))的第3.1节把氨基酸分成四个主要的组：酸性、非极性、不带电荷的极性和碱性。该分组方式可用于在本发明中确定特定氨基酸是否能保守替换另一个所论及的氨基酸。
本发明的另一方面提供了多核苷酸分子，其具有编码如SEQIDNO：1-48和/或52至56之任一所示氨基酸序列的核苷酸序列或与其显示出有至少70％同源性的核苷酸序列，其中同源性可通过序列比对(如上述针对氨基酸序列的)比较编码SEQIDNO：1-48和/或52-56之任一的氨基酸序列的核苷酸序列与所论及的核苷酸序列来确定，如果其与编码SEQIDNO：1-48和/或52-56之任一的相应氨基酸序列的核苷酸序列中的相应核苷酸是等同的，或如果所论及的序列与编码SEQIDNO：1-48和/或52-56之任一的氨基酸序列的核苷酸序列中的相应的一个或多个核苷酸的区别形成了核苷酸三联体，该三联体被翻译后会形成等同于(由于简并三联体)SEQIDNO：1-48和/或52-56之任一的相应氨基酸序列中的相应氨基酸或其保守替换，则所论及的序列中的核苷酸被认为是同源的。在本文中，术语“保守的替换”如上述来理解。
本发明的另一方面提供了药物组合物，其包含人单克隆抗体或其片段或多核苷酸分子，所述多核苷酸分子具有编码如SEQIDNO：1-48和/或52-56之任一所示氨基酸序列、或编码包含与SEQIDNO：1-48和/或52-56之任一有至少70％同源性的氨基酸序列的氨基酸序列的核苷酸序列，其中“同源性”与上文解释的一样理解。根据本发明，术语“药物组合物”涉及向患者(优选人患者)给药的组合物。在优选的具体实施方式中，药物组合物包含用于非肠道、透皮、内腔内、动脉内、膜内和/或鼻内给药或直接注射入组织的组合物。尤其关注的是，所述药物组合物通过输注或注射向患者给药。合适组合物的给药由不同方式达成，如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或皮内给药。本发明的药物组合物可进一步包括药学上可接受的载体。合适的药物载体的例子是现有公知的，包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂(如油/水乳剂)、各类保湿剂、无菌溶液、脂质体等。包含这些载体的组合物可通过公知的常规方法来配制。这些药物组合物可以合适的剂量向受试者给药。剂量方案可由参与的医生和临床因素来确定。如现有医学技术所公知的，对于任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者的身材、身体表面积、年龄、给药的特定化合物、性别、给药时间和途径、综合健康情况、以及同时给药的其他药物。非肠道给药的制剂包括无菌含水或非含水溶液、混悬液、和乳剂。非含水溶剂的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。含水载体包括水、醇/含水溶液、乳剂或混悬液，包括盐水和缓冲介质。非肠道载体包括氯化钠溶液、Ringer氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、含乳酸盐的(lactated)Ringer氏、或不挥发性油。静脉内载体包括流体和营养物补充剂、电解液补充剂(如基于Ringer氏葡萄糖的那些)等。也可含有防腐剂和其他添加剂，例如，抗微生物、抗氧化、鳌合剂、惰性气体等。另外，本发明的药物组合物可包含蛋白质载体，像诸如，血清白蛋白或免疫球蛋白，优选是人源的。关注的是，除了(如本发明所述的)人单克隆抗体或其片段，本发明的药物组合物还可包含其他生物活性剂，这取决于药物组合物所需的用途。该试剂可以是作用于胃肠系统的药物、起细胞抑制剂(cytostatica)作用的药物、防止高尿酸血症(hyperurikemia)的药物、抑制免疫反应的药物(如皮质类固醇)、调节炎症反应的药物、作用于循环系统的药物和/或诸如细胞因子的现有已知的试剂。
本发明的另一方面提供了人单克隆抗体或其片段如上文所述或多核苷酸分子的用途，所述多核苷酸分子包含编码如SEQIDNO：I-48和/或52-56之任一所示氨基酸序列、或编码包含与SEQIDNO：1-48和/或52-56之任一有至少70％同源性的氨基酸序列的氨基酸序列的核苷酸序列，其中“同源性”与上文解释的一样理解，其用于制备用于治疗炎性疾病的药物，所述药物任选还包含一种或多种抗炎剂。炎性疾病最好是选自由类风湿性关节炎(RA)(包括对用TNF-α中和剂治疗有耐受性的RA)、哮喘、多发性硬化(MS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、Crohn氏症、特发性肺纤维变性(IPF)、炎性肠病(IBD)、色素层炎、黄斑变性、结肠炎、牛皮癣、沃勒变性、抗磷脂综合症(APS)、急性冠状动脉综合症、再狭窄、动脉粥样硬化、复发性多软骨炎(RP)、急性或慢性肝炎、失败的整形外科植入、肾小球肾炎、狼疮或自身免疫疾病所组成的组。
特别感兴趣的是本发明所述的人单克隆抗体或其片段用于制备治疗类风湿性关节炎(RA)(包括对用TNF-α中和剂治疗有耐受性的RA)、哮喘、MS和/或Crohn氏症的药物的用途。
对于RA、哮喘和/或MS，有两种流行的理论涉及类风湿性关节炎(RA)的发病机理。第一种认为，T细胞通过与还未鉴定出的抗原相互作用而是引发疾病并操控慢性炎症过程的主要细胞。该理论基于RA滑膜中RA与II类主要组织相容性抗原、大量CD4+T细胞和非对称的T细胞受体基因利用情况的已知关联性。GM-CSF已知通过提高II类MHC表达增强抗原提呈功能，而且由T细胞产生了GM-CSF，根据该基于T细胞的假说表明了GM-CSF在疾病进程中的推测的作用。
第二种理论认为，尽管T细胞对于引发疾病是重要的，然而慢性炎症通过巨噬细胞和成纤维细胞以T细胞非依赖性方式而自身永久存在。该理论基于在慢性RA中相对缺乏活化的T细胞表型而活化的巨噬细胞和成纤维细胞表型占优势。GM-CSF是巨噬细胞的有力的刺激剂，并能促进单核细胞和巨噬细胞增殖。
如ELISA或mRNA研究所测得的，已知主要由“效应器”细胞(巨噬细胞)和结缔组织细胞(成纤维细胞)产生的GM-CSF在RA滑膜和滑液中大量表达。根据RA的″巨噬细胞-成纤维细胞理论″，这2种细胞类型似乎主要负责产生慢性炎症的自身永久存在状态，其中T细胞的参与不再是关键的。在该情景中，活化的巨噬细胞不断分泌能维持滑膜成纤维细胞活化状态的IL-1和TNF。成纤维细胞依次分泌大量：a)细胞因子——L6、IL8和GM-CSF；b)前列腺素；和c)蛋白酶。GM-CSF反馈以促进新补充的单核细胞成熟为巨噬细胞。IL-8和IL-6也对其他细胞群的补充和/或活化起作用，而前列腺素和蛋白酶直接用于侵蚀并摧毁附近的结缔组织，如骨骼和软骨。
对于Crohn氏症，来自酵母的重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rGM-CSF)显示出对治疗中度至重度Crohn氏症有功效(DieckgraefeBK，KorzenikJR(2002).Lancet360，1478-80)。此后，几篇综述性文章推测了该有力的促炎性细胞因子在该疾病(据信是有炎症性质的)中的治疗效果。对于rGM-CSF作用模式的可能的解释包括Crohn氏症中的免疫缺陷成分、Th2时滞(skewing)、以及扩增了树突状细胞来促进调节性T细胞的分化(WilkNJ，VineyJL(2002).CurrOpinInvestDrugs3，1291-6；FolwacznyC等(2003).EurJGastroenterolHepatol15，621-6)。本发明人相信，应采用较简单的作用模式，其同时与GM-CSF在其他促炎性疾病中的已知作用相一致。
GM-CSF是已知最有力的佐剂之一，这就是为什么在大量正在进行的免疫接种试验中要联合给药该细胞因子。同时，GM-CSF是高度免疫原性的(RagnhammarP等(1994).Blood84，4078-87)。最近期的研究(RiniB等(2005)Cytokine29，56-66)显示在Crohn氏症试验中，每天用来自酵母的rGM-CSF皮下给药，进行治疗(DieckgraefeBK，KorzenikJR(2002).Lancet360，1478-80)，在3个月内会使87％(13/15)的前列腺癌患者产生抗该细胞因子的抗体。60％的患者(9/15)会产生(多克隆)GM-CSF中和性抗体。在Crohn氏症试验中没有调查对GM-CSF的中和性应答的可能性，也没有确定疗法中的GM-CSF血清水平。在本发明具体实施方式的范围内，预计用rGM-CSF治疗的Crohn氏症患者不仅直接应答细胞因子的免疫刺激活性，而且在临床上，至少部分应答抗体应答，该抗体应答中和了给药的和内源性的GM-CSF，其已知在Crohn氏症中过量产生(AgnholtJ等(2004)EurJGastroenterolHepatol16，649-55)。然后，中和性的抗GM-CSF抗体可在Crohn氏症中具有与rGM-CSF相似的治疗活性，如上文所预计的，这应被认为是替代疗法。
本发明的另一方面提供了如上文所述人单克隆抗体或其片段或多核苷酸分子的用途，所述多核苷酸分子包含编码如SEQIDNO：1-48和/或52-56之任一所示氨基酸序列、或编码包含与SEQIDNO：1-48和/或52-56之任一有至少70％同源性的氨基酸序列的氨基酸序列的核苷酸序列，其中“同源性”与上文解释的一样理解，其用于制备用于治疗肿瘤性疾病或延缓细胞凋亡、增加细胞存活或增殖的其他病症的药物，所述药物任选包含一种或多种其他抗癌剂。优选的肿瘤性疾病是癌，其中尤其优选白血病、多发性骨髓瘤、胃癌或皮肤癌。
Olver等((2002)CancerChemotherPharmacol.50，171-8)在患有已知表达GM-CSF受体的实体肿瘤的患者中皮下给药应用了GM-CSF拮抗剂E21R，仅造成PSA血清水平暂时降低。另外，在急性髓细胞样白血病(″AML″)中应用该GM-CSF拮抗剂未显示出临床活性(Jakupovic等(2004)Blood103，3230-2.)。更进一步，向AML患者应用抗GM-CSF单克隆抗体，即使有足够的抗体体内血清水平和生物活性，但仍未显示出抗白血病效应(Bouabdallah等(1998)LeukLymphoma30，539-49)。作者因此断定用抗GM-CSF抗体治疗对AML患者是无效的。
本发明现在将在以下非限制性的实施例和附图中更详细地描述，总体情况如下：
图1用ELISA确定的在4或5轮噬菌体展示淘选后获得的各种抗rhGM-CSFscFv分子的吸收强度(与结合强度成正比例)
图2基于流式细胞计的测试所确定的各种抗rhGM-CSFscFv和其他测试分子的平均荧光强度(与中和强度成反比)
图3利用抗rhGM-CSFscFv分子5-306进行的TF-1增殖抑制测试的结果
图4用ELISA确定的在4或5轮噬菌体展示淘选后获得的各种人抗rhGM-CSFscFv分子的吸收强度(与结合强度成正比)
图5利用各种有代表性的人抗rhGM-CSFscFv击中分子(hit)进行的TF-1增殖抑制测试的结果
图6人单克隆抗体对人GM-CSF和其他人集落刺激因子的结合特异性
图7表征人单克隆抗GM-CSF抗体和其片段动力学结合的表面等离子共振测量
图8A非人灵长类GM-CSF和人GM-CSF的序列比对
图8B表示人单克隆抗GM-CSF片段与人GM-CSF结合的肽斑点的放射图
图9利用各种有代表性的人抗rhGM-CSFscFv抗体片段进行的TF-1增殖抑制测试的定性结果
图10利用各种有代表性的人抗rhGM-CSFIgG和相应scFv片段进行的TF-1增殖抑制测试的定量结果
图11利用各种有代表性的人抗rhGM-CSFscFv抗体片段进行的IL8产量测试的定量结果
图12利用各种有代表性的人抗macGM-CSFIgG和相应scFv片段进行的TF-1增殖抑制测试的定量结果
图13显示出抗GM-CSF抗体IgGB对重组人GM-CSF和来自各种非灵长类物种的GM-CSF结合的选择性的比较结合研究结果
图14调查抗GM-CSF抗体IgGB的中和能力对GM-CSF糖基化的依赖性的测试结果
图15抗GM-CSF抗体IgGB对GM-CSF介导的嗜曙红细胞存活影响的研究结果
图16抗GM-CSF抗体IgGB对GM-CSF介导的嗜曙红细胞活化影响的研究结果
图17利用抗GM-CSF抗体IgGB的离体(exvivo)毒理研究的结果，其基于粒细胞的吞噬(A-C)和氧化爆发(D-F)而测定
图18利用抗GM-CSF抗体IgGB的离体毒理研究的结果，其基于单核细胞的吞噬作用(A-C)和氧化爆发(D-F)而测定
实施例
实施例1：获得用于产生中和性人抗体和其片段的重组人(“rh”) GM-CSF抗原
实施例1.1：克隆、表达和纯化rhGM-CSF抗原
通过PCR导入的限制性内切酶识别位点NdeI和XhoI，将编码人GM-CSF抗原的基因从表达载体pORF-hGM-CSF(Novagen，美国)亚克隆到pET22b(+)载体(Novagene，美国)上。pET22b(+)中编码hGM-CSF的基因与pelB前导序列融合，其适于在大肠杆菌周质中表达。
蛋白质的产生和纯化根据厂商所述来进行。简而言之，用表达质粒转化大肠杆菌BL21DE3并于37℃在选择培养基中生长，长到600nm处的光密度为0.5-0.8。加入IPTG至1mM并降低温度至25℃来诱导蛋白质产生。利用20％蔗糖溶液的渗透压休克，选择性破坏细胞壁并保持细胞膜完整，来进行周质制备。天然的hGM-CSF含两个二硫桥接，而在大肠杆菌氧化性周质中的表达能形成这些对于功能重要的二硫桥接。
通过固定化金属亲和层析(IMAC)和凝胶过滤，以2步纯化过程来纯化重组人GM-CSF(“rhGM-CSF”)。层析使用FPLC系统(Pharmacia)和软件。所有的化学物质都是研究等级的，购自Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。
根据厂商提供的规程，利用QiagenNi-NTA超流柱进行IMAC。用缓冲液A2(20mM磷酸钠pH7.2，0.4MNaCl)平衡该柱，并将周质制品(periplasmicpreparation，“PPP”)(100mL)以2mL/分的流速上样于该柱(2mL)。用5倍柱体积的5％缓冲液B2(20mM磷酸钠pH7.2，0.4MNaCl，0.5M咪唑)洗柱以去除未结合的样品。用5倍柱体积的100％缓冲液B2洗脱结合的蛋白质。合并洗脱的蛋白质级分，以进一步纯化。
在用PBS(Gibco)平衡的Superdex200制备级柱(Pharmacia)上进行凝胶过滤层析。洗脱的蛋白质样品(流速1mL/分)进行标准SDS-PAGE和免疫印迹检测。纯化前，校正柱以确定分子量(分子量标记试剂盒，SigmaMWGF-200)。测量OD280nm并利用序列特异性分子消光系数计算，来确定蛋白质浓度。
实施例1.2：生物素化rhGM-CSF抗原
为了进行噬菌体文库筛选，产自大肠杆菌的rhGM-CSF抗原(见上)被生物素化。在样品混合器(Dynal)中，在含5％DMSO(Sigma)和摩尔数过量5倍的易于连接的硫化NHS-LC-LC-生物素(EZ-LinkSulfoNHS-LC-LC-Biotin)(Pierce)的PBS中于室温进行生物素化1小时。为了分离游离的生物素和生物素化的rhGM-CSF抗原，根据标准规程进行阴离子交换层析(ResourceQ，AmershamBiosciences)。在两种方法(被命名为A和B，如下所述)中，层析都会造成两个洗脱峰。在A情况下，首先洗脱的峰通过第二步阴离子交换层析步骤(与以上相同的条件)再次被分成两个洗脱峰。之后将得到的级分梯度稀释(稀释度1∶2；由峰高确定的起始浓度为6μg/mL)，包被于96孔ELISA板，并检测。进行检测时利用A)，用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠Fab2特异性多克隆抗体(Dianova，1μg/mLPBS/1％BSA)检测的抗人GM-CSF抗体M500-A(Sigma，2.5μg/mL，溶于PBS/1％BSA)和B)用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗大鼠Fab2多克隆抗体(Dianova，1μg/mLPBS/1％BSA)检测的母本抗体(1μg/mLPBS/1％BSA)。成功的生物素化用相似的ELISA实验来确证，其利用辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白链菌素(Dako，1μg/mLPBS/1％BSA)来进行。加入OPD底物溶液(Sigma)来放大信号，并在492nm波长(参照波长620nm)处检测。为了评估生物素化的程度，利用阴离子交换级分直接进行上述ELISA，或与6.7x107个抗生物素蛋白链菌素磁珠(DynabeadsM-280-抗生物素蛋白链菌素，Dynal)一起孵育并轻微震荡30分钟后再进行。得到的上清液包被在96孔ELISA板的孔上，并如以上所述地进行检测。ELISA结果显示，第二个洗脱峰含生物素化的rhGM-CSF，而且95％的洗脱的rhGM-CSF是缀合的。利用原始材料作为标准评估浓度，得到的浓度约为20μg/mL。
根据下述表征单链抗体(scFv)的规程，在TF-1增殖测试中证实了标记了生物素的rhGM-CSF保留了生物活性。
实施例1.3：荧光素标记rhGM-CSF抗原
为了在TF-1细胞上进行结合研究，产自大肠杆菌的重组人GM-CSF抗原(参见以上实施例1.2)与荧光素-5(6)-羧氨基己酸N-琥珀酰亚胺酯(Fluka，荧光素-NHS)缀合在一起。在样品混合器中，在含17.5％DMSO和摩尔数过量5倍的荧光素-NHS的硼酸盐缓冲液(0.05M硼酸，0.1MNaCl，pH8.5)中于室温进行缀合步骤1小时。之后，进行凝胶过滤(SephadexG25，AmershamBiosciences)将标记了荧光素的rhGM-CSF抗原与游离的荧光素-NHS分离。如在485.nm波长(参照波长535nm)处所测得的，凝胶过滤能形成两个峰，而首个峰代表标记了FITC标记的rhGM-CSF。通过定义缀合物的F/P比率来确定标记的程度([mg/mL]＝(A280-0.35xA493)x1.08；F/P＝(A493/73.000)x(15.000/([mg/mL]))。确定的浓度为0.041mg/mL，其中F/P比率为1.2。
实施例2：产生并选择中和性人抗GM-CSF抗体和其片段
实施例2.1：克隆来自于杂交瘤HB-9569的母本VH
如前述实施例中所用的，“母本”(matemal)V区表示所论及的V区源于完整免疫球蛋白分子。
如前述实施例中所用的，“击中分子”(hit)表示已知能结合感兴趣的抗原的分子，但是还未定量评估其结合。“击中分子”是处于早期表征阶段中的分子，可能已经进行小规模生产。该分子处于表征的确认阶段中。
如前述实施例中所用的，“领导”(lead)分子表示其结合和中和潜力已被定量的分子。已经大规模进行了“领导”分子的生产。
在以下实施例中，描述了产生人GM-CSF的完整人单克隆抗体中和剂并产生其片段的一种可能方式。
该实验的目的是分离和亚克隆编码母本单克隆抗体中的VH的基因，所述母本单克隆抗体由杂交瘤细胞系HB-9569产生。杂交瘤HB-9569得自ATCC(USA)。杂交瘤细胞于37℃在5％CO2下被培养在ATCC完全生长培养基中：调节含2mML-谷氨酰胺的RPMI1640培养基，使其含1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、10mMHEPES、和1.0mM丙酮酸钠，并补充0.05mM2-巯基乙醇、胎牛血清10％。为了制备总RNA，使用1x107个细胞并如QiagenOmni-Skript试剂盒(Qiagen，德国)的产品说明书所述来制备RNA。根据标准方法(Sambrook，ColdspringHarborLaboratoryPress1989，第二版)来合成cDNA。
为了分离重链V区DNA，进行RT-PCR，其中使用MHALTlR.V：GCCGAATTCCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT和RaceGSPrIgG2a/b：CACACCGCTGGACAGGGCTCCAGAGTTCC引物组。用以下PCR程序进行扩增：于94℃变性15秒，于52℃引物退火50秒和于72℃引物延伸90秒，进行40个循环，然后于72℃最后延伸10分钟。然后，根据标准规程分离重链DNAV-片段。
根据厂商说明，将重链DNAV-片段克隆进PCRscript-CAM(Stratagene)中。测序鉴定序列。
实施例2.2：选择人VL
该实验的目的是选择人VL，其能与上述克隆到的母本VH配对。
实施例2.2.1：从所选的IgD阳性B细胞中分离RNA
从5个健康人供体中提取100mL血。根据标准方法，通过水溶性聚蔗糖梯度来分离外周血单核细胞(PBMC)。为了选择出IgD阳性细胞，用20μg小鼠抗人IgD-抗体(PharMingen)包被1mL抗小鼠IgG珠(CELLectionTM泛小鼠IgG试剂盒；DYNAL)。向珠中加入约2.5x107个PBMC，并于4℃孵育15分钟。用1mLRPMI培养基(BioChrom)洗4次后，加入8μL释放缓冲液(DNA酶)，使IgD阳性细胞从珠上释放出来并转移至新试管中。通过该方法，可获得0.9x105至3.7x106个IgD阳性细胞。根据厂商的说明书，用Midi试剂盒(QIAGEN)从IgD阳性细胞中分离出总RNA。根据标准方法(Sambrook，ColdspringHarborLaboratoryPress1989，第二版)来合成cDNA。
实施例2.2.2：PCR扩增可变轻链区(VL区)
为了分离轻链V区DNA，进行RT-PCR，其中使用V-κ-(5’-huVK1-SacI-2001(5’-GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCC-3’)、5’-huVK2/4-SacI-2001(5’-GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGATGACYCAGTCTCC-3’)、5’-huVK3-SacI-2001(5’-GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGWTGACRCAGTCTCC-3’)、5’-huVK5-SacI-2001(5’-GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCACACTCACGCAGTCTCC-3’)、5’-huVK6-SacI-2001(5’-GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGCTGACTCAGTCTCC-3’)、3’-hu-Vk-J1-SpeI-BsiWI(5’-GACGACACTAGTTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCC-3’)、3’-hu-Vk-J2/4-SpeI-BsiWI(5’-GACGACACTAGTTGCAGCCACCGTACGTTTGATCTCCASCTTGGTCC-3’)、3’-hu-Vk-J3-SpeI-BsiWI(5’-GACGACACTAGTTGCAGCCACCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTCC-3’)、3’-hu-Vk-J5-Spel-BsiWI(5’-GACGACACTAGTTGCAGCCACCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCC-3’)引物组。来自IgD阳性B细胞的RNA转录成cDNA(如上所述)并用作PCR反应中的模板DNA。每个PCR反应，用一种5’引物与一种3’引物组合在一起。由5’-和3’引物的可能组合数量来确定不同PCR反应的数量。用以下PCR程序进行扩增：于94℃变性15秒，于52℃引物退火50秒和于72℃引物延伸90秒，进行40个循环，然后于72℃最后延伸10分钟。然后根据标准规程分离轻链DNAV-片段。
实施例2.2.3：文库构建-克隆人VL群
噬菌体展示文库一般根据标准过程来构建，例如公开于“PhageDisplay：ALaboratoryManual”’；编者Barbas，Burton，Scott&Silverman；ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001的。
对于轻链V-片段，为PCR扩增所选的引物产生了5’-SacI和3’-SpeI识别位点。进行两次连接反应，每次由400ngκ轻链片段(用SacI-SpeI消化的)和1400ng质粒pBluescriptKS+(用SacI-SpeI消化的；大片段)组成。然后将两种所得到的抗体V-轻链群通过电穿孔(2.5kV，0.2cm开口的电击杯，25mF，200Ohm，Biorad基因脉冲器)转化入300μL电感受态大肠杆菌XLlBlue，形成大小为5.8x108个独立克隆的文库。
来自不同PCR扩增的κ(轻链)DNA片段对于每个连接按如下称重：每种5’引物限定了特定的组。在这些组内，3’引物限定了亚组。亚组按1∶2∶1∶1称重，对应于引物3’-hu-Vk-J1-SpeI-BsiWI:3’-hu-Vk-J2/4-SpeI-BsiWI:3’-hu-Vk-J3-SpeI-BsiWI:3’-hu-Vk-J5-SpeI-BsiWI。根据生殖系分布来给组称重1∶1∶1∶0.2∶0.2，对应于引物5’-huVK1-Sac-2001:5’-huVK3-Sac-2001:5’-huVK2/4-Sac-2001:5’-huVK5-Sac-2001:5’-huVK6-Sac-2001。
电穿孔后，将测试物孵育于SOC肉汤(Fluka)中，用来表现出表型。然后将培养物孵育于含50μg/mL羧苄青霉素和2％w/v葡萄糖的500mLSB选择培养基中过夜。第二天，通过离心来收获细胞，并利用商品化的质粒制备试剂盒(Qiagen)来进行质粒制备。
实施例2.2.4：构建抗体文库——人VL——母本VH
进行PCR来从上述实施例2.1中的含母本VH的载体中扩增母本VH。为了扩增，按照标准规程进行PCR规程，其中利用了5’引物MVH8(5’-GAGGTTCAGCTCGAGCAGTCTGGAGCT-3’)和3’引物3’-MuVHBstEII(5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3’)。
从分析性琼脂糖凝胶上纯化出约350bp的扩增产物之后，用限制性内切酶BstEII和XhoI切DNA片段。然后消化噬菌粒pComb3H5BHis(该载体在RalfLutterbüse博士的学位论文中有述)，并用上述片段连接大片段。转化入大肠杆菌XL1blue之后，在100mLSB培养基(含50μg/mL羧苄青霉素)中培养单克隆，并根据标准规程来制备质粒。通过测序插入片段来确证克隆成功(Sequiserve，Munich)。
用限制性内切酶SacI和SpeI消化该载体pComb3H5BHis/母本VH。分离大载体片段。含来自于实施例2.2.3的VK文库的质粒DNA被限制性内切酶SacI和SpeI限制性酶切。分离小VK片段条带(约350bp)。
用400ngVK片段连接1200ng载体片段，并通过电穿孔(2.5kV，0.2cm开口的电击杯，25mF，200Ohm)转化入300μL电感受态大肠杆菌XL1Blue，形成大小为2.8x108个独立克隆的总scFv文库。
在表现出表型并缓慢适应羧苄青霉素后，抗体文库转移到SB-羧苄青霉素(50μg/mL)选择培养基中。然后以1x1012粒辅助噬菌体VCSM13的感染剂量来感染抗体文库，由此产生丝状M13噬菌体并使其分泌，其中每个噬菌体颗粒含编码半人scFv片段的单链pComb3H5BHis-DNA，并展示出与噬菌体衣壳蛋白III翻译融合的相应scFv-蛋白质。
实施例2.2.5：噬菌体展示选择人VL
通过PEG8000/NaCl沉淀并离心，由此从培养物上清液中收获带有scFv库的噬菌体颗粒。然后，将约1x1011to1x1012个scFv噬菌体颗粒重悬于0.4mLPBS/0.1％BSA中，并以0.5mL(1-3轮的抗原浓度：100nM；第4轮：10nM；第5轮：1nM)的总体积与重组生物素化的可溶rhGM-CSF(产自如上述实施例1的大肠杆菌中)一起孵育2小时并轻微震荡。然后加入6.7x107个抗生物素蛋白链菌素磁珠(DynabeadsM-280-抗生物素蛋白链菌素，Dynal)并轻微震荡孵育30分钟。
未特异结合靶抗原的scFv噬菌体通过用PBS/0.1％BSA洗涤的步骤来去除。为此，生物素化的抗原-抗生物素蛋白链菌素珠复合物(含有潜在的scFv结合物)用磁体来收集并重悬于1mL洗涤溶液中(一个洗涤步骤)。该洗涤过程在以后的轮次中重复多至4次。
洗涤后，通过利用HCI-甘氨酸(pH2.2)来洗脱结合实体。用2MTris(pH12)中和后，用洗脱物感染新鲜的未感染的大肠杆菌XLlBlue培养物。为了洗脱剩余的高结合性实体，用HC1-甘氨酸(pH1.0)重复该步骤。再中和该第二洗脱物并用于感染新鲜的未感染的大肠杆菌XL1Blue培养物。然后混合两次感染的大肠杆菌，成功导入编码人scFv-片段的噬菌粒拷贝的细胞再次针对羧苄青霉素抗性进行选择，接着用VCSM13辅助噬菌体感染，从而开始第二轮抗体展示和体外选择。
对应于第4和5轮淘选的质粒分离自大肠杆菌培养物。为了产生可溶的scFv蛋白，从质粒上切下(SacI-SpeI)VL-DNA片段，并通过质粒pComb3H5BFlag/His中相同的限制性位点来克隆，母本VH不同于起始pComb3H5BHis/母本VH，在于表达构建体(如scFv)在scFv和His6标签之间包括Flag标签(TGDYKDDDDK)，并去除了其他噬菌体蛋白。
连接后，将每个群(不同淘选轮次)的质粒DNA转化入100μL热休克感受态大肠杆菌XL1blue中，并铺板于羧苄青霉素LB-琼脂上。挑出单克隆，装入100μLLB培养液(carb)(50μg/mL)中。
10μl该细胞悬液通常在5mlSB培养基中于37℃震荡孵育约6小时，其中添加了浓度至50μg/ml的羧苄青霉素和终浓度至20mM的MgC12。然后加入IPTG，至终浓度1mM，并于30℃在震荡器中持续孵育过夜。
细胞被离心成小团，该小团通常重悬于0.5mlPBS中。通过4轮在-70℃冷冻并于37℃熔融，通过渗透压休克破坏细菌外膜，包括scFv在内的可溶性周质蛋白释放到上清液中。通过进一步离心(5分钟，于10,000xg)去除完整细胞和细胞碎片后，收集含scFv的上清液(即PPP)并进一步检查。
RhGM-CSF抗原(LeukineLiquid，Immunex)被固定于ELISA板上于4℃过夜(每孔50μl含1μg抗原/ml的PBS)。用PBS洗孔一次并用PBS3％BSA于室温封闭1小时后，向孔中加入含scFv的100μlPPP并通常于室温孵育1小时。用PBS/0-05％Tween20洗3次后，利用抗标签M2(1μg/mLPBS/1％BSA)进行检测与固定的抗原结合的scFv片段，并用与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠Fab2特异性多克隆抗体(Dianova，1μg/mLPBS/1％BSA)来检测。加入2，2′-连氮基-二[3-乙基-苯噻唑啉-6-磺酸](“ABTS”)底物溶液来放大信号，并根据标准规程在405nm波长处检测。
在检测的20个克隆(10个得自4轮淘选后，而10个得自5轮淘选后)中，有5个溶解产物相对于用PBS阴性对照对重组抗原显示出更强ELISA信号。ELISA结果如图1所示，其中各种检测的scFv分子排列在X轴上，而Y轴显示了所测得的吸收强度，吸收越大，则表示结合越强。PBS阴性对照显示在X轴的最左边。显示出可评估的结合能力的ScFv分子用各自吸收强度柱上的菱形或星形来表示。图1中的菱形和星形代表两种不同的序列，即吸收强度柱用菱形表示的scFv是一种序列的，而所有吸收强度柱用星形表示的scFv有相同的共有序列。
将5个ELISA阳性克隆进行DNA测序。由Sequiserve(Munich)进行测序。总共4个克隆带有对应于scFv5-306的DNA序列，而另一个序列(4-301)只被鉴定出一次。对应于scFv5-306的占优势的序列以及序列4-301是人源的，并与人生殖系序列Vk1-O12显示出有非常接近的同源性。
实施例2.2.6：表征来源于huVL选择的scFv击中分子构建体
以下实验的目的是表征由上述方法产生的scFv击中分子。
实施例2.2.6.1：在大肠杆菌中小规模表达并纯化(来源于上述的)scFv击中分子
为了获得PPP，细胞生长于SB培养基中，其中添加了20mMMgCl2和羧苄青霉素50μg/rnL，并在收获后再溶解于1mLPBS中。通过温度休克(4轮于-70℃冷冻并于37℃熔融)破坏细菌外膜，使包括scFv的可溶性周质蛋白释放到上清液中。离心去除完整细胞和细胞碎片后，收集含scFv的上清液并进一步检测。为了进一步纯化，向各PPP中加入25μL20mMNaH2PO4、400mMNaCl、250mM咪唑(pH7.0)。通过Ni-NTA旋转柱(Qiagen)以说明书推荐的方式纯化PPP。简而言之，将各PPP溶液加入到预先平衡的柱上以结合树脂。用20mMNaH2PO4、400mMNaCl、20mM咪唑、pH7.0洗旋转柱2次。在200μL20mMNaH2PO4、400mMNaCl、250mM咪唑、pH7.0中洗脱结合的蛋白质2次。如以后的实施例所述，纯化的scFv蛋白质被进一步分析结合强度(动力学解离速率)和中和能力(GM-CSF抑制依赖性TF-1增殖)。尽管没有分开并区别出scFv的不同的可能的构象，但是根据免疫印迹分析(数据未显示)判断，该粗纯化的PPP产生了80％纯的scFv蛋白。
实施例2.2.6.2：抑制标记了FITC的rhGM-CSF
该实验的目的是显示出鉴定出的scFv克隆能抑制rhGM-CSF与展示在TF-1细胞表面上的GM-CSF受体复合物的结合。预计中和性scFv构建体能竞争rhGM-CSF分子上的受体结合表位，使rhGM-CSF不能结合GM-CSF受体复合物。考虑到以以上方式抑制rhGM-CSF与其受体的结合，在基于流式细胞计的测试中可预计能观察到标记了荧光素的rhGM-CSF(rhGM-CSF-FITC)的TF-1细胞的荧光染色密度下降。
以下描述了该基于流式细胞计的测试的进行。溶于PBS的0.4μg/mL终浓度的rhGM-CSF-FITC缀合物与10μg/mlscFv的母本抗体或用NiNTA旋转柱纯化的未稀释的周质提取物一起孵育。使蛋白质样品于25℃平衡1小时，然后加入TF-1细胞悬液。TF-1细胞培养于含10％热失活的FCS、并缺少rhGM-CSF的RPMI1640培养基(Gibco；L-谷氨酰胺，不含酚红)中过夜。每个样品使用终浓度为2x106个细胞/mL的150μL细胞悬液。以500xg于4℃离心细胞3分钟并用FACS缓冲液洗2次。洗过的细胞重悬于100μL预先平衡的蛋白质样品中，其中含rhGM-CSF-FITC和各母本抗体或scFv。样品于4℃孵育60分钟。再洗两次后，将细胞重悬于150μL冰冷的FACS缓冲液中，然后用流式细胞计分析。结果如图2所示。图2清晰地显示出一幅图，其中各种测试分子沿X轴排列，而且其中Y轴上显示了平均荧光强度(“MFI”)。如图2所见，观察到用母本抗体的(X轴左边第二个)明显丧失了TF-1细胞的荧光强度。通过TF-1细胞荧光染色的丧失来监测被命名为5-306的scFv分子对rhGM-CSF的竞争结合，而scFv分子4-301几乎不显示出任何效应。由于这些结果提示被命名为5-306的scFv分子是有前途的GM-CSF中和剂，因此中和活性的进一步分析局限于scFv5-306。
实施例2.2.6.3：大规模表达并纯化领导(lead)scFv
如下进行大规模的蛋白质生产和纯化。简而言之，用表达质粒转染大肠杆菌BL21DE3，并于37℃生长在1L选择培养基中，长至600nm处的光密度为0.5-0.8。加入IPTG至1mM来诱导蛋白质产生，而且培养物于25℃的温度震荡再孵育16小时。以5,000xg离心10分钟来收获细胞，并重悬于100mL1×PBS中。通过在乙醇/干冰中最佳的连续冷冻并于37℃水浴中熔融4轮，来提取周质蛋白质。最终，以10,000xg离心提取物20分钟。
以固定化金属亲和层析(IMAC)和凝胶过滤的两步纯化过程来分离scFv5-306。根据该方法纯化所有的领导(lead)分子。层析使用了FPLC系统(Pharmacia)和软件。所有化学物质都是研究级别的，购自Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。
根据厂商提供的规程，利用QiagenNi-NTA超流柱来进行IMAC。柱用缓冲液A2(20mM磷酸钠pH7.2，0.4MNaCl)平衡，并将PPP(100mL)以2mL/分的流速上样于柱(2mL)。用5倍柱体积的5％缓冲液B2(20mM磷酸钠pH7.2，0.4MNaCl，0.5M咪唑)洗柱以去除未结合的样品。结合的蛋白质用5倍柱体积的100％缓冲液B2洗脱。收集洗脱的蛋白质级分以进一步纯化。
在HiLoadTM16/60Superdex75制备级柱(Pharmacia)上进行凝胶过滤层析，其用PBS(Gibco)平衡。洗脱的蛋白质样品(流速1mL/min)进行标准SDS-PAGE和免疫印迹检测。在纯化前，校正柱以确定分子量(分子量标记试剂盒，SigmaMWGF-200)。在Superdex75制备级柱上的大小依赖性分离产生了明显可区分的scFv领导(lead)分子的单体和相关二聚体的峰级分。测量280nm处的光密度以确定蛋白质浓度，并用各scFv领导分子的序列特异性分子消光系数计算。
实施例2.2.6.4：通过scFv领导分子抑制TF-1细胞的rhGM-CSF依赖性 增殖
该实验的目的是利用hGM-CSF依赖性细胞系TF-1(DSMZACC334)来获得关于半人scFv5-306中和活性的定性信息。如发放人(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，Braunschweig，德国)所述，TF-1细胞在2.5ng/mLrhGM-CSF存在下培养于含10％热失活的FCS的RPMl1640培养基(Gibco；L-谷氨酰胺，不含酚红)中。细胞生长到细胞密度为0.5x106个细胞/mL。为了进行增殖测试，以300xg离心4分钟以收获TF-1细胞并用1xPBS(Dulbecco’s，Gibco)洗涤。细胞以1x105个细胞/mL的终浓度重悬于RPMI1640、10％FCS中，每个Microtest平底细胞培养板的孔使用90μL细胞悬液(0.9x104个细胞/孔)。用终浓度为0.3ng/mL的rhGM-CSF来刺激TF-1细胞增殖。为了中和hGM-CSF依赖性增殖，10μL纯化的scFv以约100μg/ml至100pg/ml的连续稀释度加入到100μLTF-1和rhGM-CSF溶液中。样品于37℃在5％CO2下孵育72小时。72小时后，加入WST-1来确定TF-1细胞的增殖状态，并用ELISA读数仪在450nm处检测比色改变。利用Prism软件的非线性回归曲线拟合来将数据拟合成增殖的半最大抑制浓度(IC50)。
可见到scFv5-306有明显的剂量依赖性增殖抑制效应，而且对单体和二聚体构象形式是类似的。通过拟合增殖的半最大抑制度，确定单体形式的IC50值为7.3nM，而二聚体形式的为3.5nM。结果如图3所示。
实施例2.3：人VH的抗体文库构建和噬菌体展示选择
以下实验的目的是选出一组人VH区，其能与上述选出的scFv5-306的人VH区配对。
实施例2.3.1：从外周血单核细胞(PBMC)中分离出RNA
从5个健康的人供体中取得100mL血。根据标准方法，通过水溶性聚蔗糖梯度来分离外周血单核细胞(PBMC)。根据厂商的说明书，用Midi试剂盒(QIAGEN)从PBMC中分离出总RNA。根据标准方法(Sambrook，ColdSpringHarborLaboratoryPress1989，第二版)来合成cDNA。
实施例2.3.2：PCR-扩增可变重链区(VH区)
构建VH文库并命名为Lib134-VH。该VH文库由来自PCR扩增出的上述PBMC群的VH区的FR1-CDR2-FR2-CDR2-FR3的人库组成，其与母本抗体的VHCDR3可操作地相连，随后是人FR4生殖系序列。
为了分离人模板VH区，进行RT-PCR，其中利用了5’-VH特异性引物集(5’-huVH1，3，5-XhoI-2001(5’-AGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG-3’)、5’-huVH4-XhoI-2001(5’-CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGG-3’)、5’-huVH4B-XhoI-2001(5’-CAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGG-3’))和一组共两个3’-VH特异性引物(3’-hu-VH-BstEII-2001(5’-CTGAGGAGACGGTGACC-3’)、3’-hu-VH-J3-BstEII-2001(5’-CTGAAGAGACGGTGACC-3’))。每个PCR反应，一种5’引物与一种3’引物组合在一起；由5’-和3’引物可能的组合数来确定不同PCR反应的数量。PBMCcDNA(如上述来自4个供体)仅用作VH基因的来源。用以下PCR程序来扩增：于94℃变性15秒，于52℃引物退火50秒和于72℃引物延伸60秒，进行40个循环，然后于72℃最终延伸10分钟。根据标准方法分离有约350bp大小的扩增产物。
为了分离Lib134-VH区，以两步进行RT-PCR。首先，从分离的模板VH片段中PCR扩增出人重链VH段(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3)，其中利用了与上述相同的5’-VH特异性引物组(5’-huVH1、3，5-XhoI-2001、5’-huVH4-XhoI-2001、5’-huVH4B-XhoI-2001)和3’特异性引物组(3’-Lib134-VH-1A-MH3(5’-GTAATCAAAGTAGACTGCTATCAGACCCGATCTYGCACAGTAATACACGGC-3’)、3’-Lib134-VH-1B-MH3(5’-GTAATCAAAGTAGACTGCTATCAGACCCGATCTYGCACAGTAATACAYRGC-3’)、3’-Lib134-VH-3A-MH3(5’-GTAATCAAAGTAGACTGCTATCAGACCCGATCTNGYACAGTAATACACRGC-3’)、3’-Lib134-VH-3B-MH3(5’-GTAATCAAAGTAGACTGCTATCAGACCCGATCTNGCACAGTAATACAARGC-3’)、3’-Lib134-VH-4-MH3(5’-GTAATCAAAGTAGACTGCTATCAGACCCGATCTSGCACAGTAATACACRGC-3’))，它们针对与FR3最末端区域相匹配的人VH亚家族1、3和4。
使用以下引物组合：
a)5’-huVH1，3，5-XhoI-2001x3’-Lib134-VH-1A-MH3
b)5’-huVH1，3，5-XhoI-2001x3’-Lib134-VH-1B-MH3
c)5’-huVH1，3，5-XhoI-2001x3’-Lib134-VH-3A-MH3
d)5’-huVH1，3，5-XhbI-2001x3’-Lib134-VH-3B-MH3
e)5’-huVH4-XhoI-2001x3’-Lib134-VH-4-MH3
f)5’-huVH4B-XhoI-2001x3’-Lib134-VH-4-MH3
每个PCR反应，一种5’引物与一种3’引物组合在一起；由5’-和3’引物可能的组合数来确定不同PCR反应的数量。PBMCcDNA(如上述4个供体仅用作VH基因的来源)。用以下PCR程序来扩增：于94℃变性15秒，于52℃引物退火50秒和于72℃引物延伸90秒，进行40个循环，然后于72℃最终延伸10分钟。通过该PCR步骤和各个3’引物序列，人VH段延长到母本VHCDR3的部分，然后将其接着作为用于第二步PCR3’引物的引导位置。
然后将这些VH-(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3)DNA-片段用作为第二个PCR反应中的模板，其中再次利用各5’VH特异性引物和与扩增出的通用DNA片段所有3’末端匹配的通用3’引物(3’-Lib134-JH3-BstE2，5’-AGAGACGGTGACCATTGTCCCTTGGCCCCAGTAATCAAAGTAGACTGC-3’)。
用以下PCR程序来扩增：
于94℃变性15秒，于52℃引物退火50秒和于72℃引物延伸60秒，进行40个循环，然后于72℃最终延伸10分钟。根据标准规程分离DNAV片段。
实施例2.3.3：文库构建-克隆人VH群
在前述方法的第二轮中，首先鉴定出scFv5-306的人VL，选择以前的选择物，然后与实施例2.3.2所述的人VH片段文库结合在一起，其目的在于产生人scFv。噬菌体展示文库一般根据标准规程来构建，例如公开于“PhageDisplay：ALaboratoryManual”；编者为Barbas，Burton，Scott&Silverman；ColdSpringHarborlaboratoryPress，2001的。
来自于不同pCR扩增的重链DNA片段按如下量进行每个连接：
a∶b∶c∶d∶e∶f＝3∶1∶3∶1∶1∶1，其中a-f具有以下含义∶
a)5’-huVH1，3，5-XhoI-2001x3’-Lib134-VH-1A-MH3x3’-Lib134-JH3-BstE2
b)5’-huVH1，3，5-XhoI-2001x3’-Lib134-VH-1B-MH3x3’-Lib134-JH3-BstE2
c)5’-huVH1，3，5-XhoI-2001x3’-Lib134-VH-3A-MH3x3’-Lib134-JH3-BstE2
d)5’-huVH1，3，5-XhoI-2001x3’-Lib134-VH-3B-MH3x3’-Lib134-JH3-BstE2
e)5’-huVH4-XhoI-2001x3’-Lib134-VH-4-MH3x3’-Lib134-JH3-BstE2
f)5’-huVH4B-XhoI-2001x3’-Lib134-VH-4-MH3x3’-Lib134-JH3-BstE2
设计的一个连接反应，其由400ng人Lib134-VH片段群(用XhoI-BstEII消化的)和1200ng质粒pComb3H5BHis/5-306VL(根据标准过程，编码scFv5-306的VL区的DNA通过限制性位点SacI和SpeI被克隆入pComb3H5Bhis中)组成。然后，将产生的抗体人VH群通过电穿孔(2.5kV，0.2cm开口的电击杯，25mF，200Ohm，Biorad基因脉冲仪)转化入300μL电感受态大肠杆菌XL1Blue中，由此形成总共大小有1.6x108个独立克隆的文库。
电穿孔后，将测试物在SOC肉汤(Fluka)中孵育，以表现出表型。然后将每个培养物孵育在500mL含50μg/mL羧苄青霉素和2％v/v葡萄糖的SB选择培养基中过夜。第二天，离心收集培养物中的细胞，并利用商品化的质粒制备试剂盒(Qiagen)进行质粒制备以保存DNA文库。
然后将1.5μg这种编码各scFv群的质粒群电穿孔导入大肠杆菌XLlblue中(2.5kV，0.2cm开口的电击杯，25mF，200Ohm，Biorad基因脉冲仪)，由此形成总共大小有2.4x109个独立克隆的文库。表型表现出并缓慢适应羧苄青霉素之后，将抗体文库转移至SB-羧苄青霉素(50μg/mL)选择培养基中。然后以1x1012粒辅助噬菌体VCSM13的感染剂量来感染抗体文库，产生丝状M13噬菌体并使分泌，其中每个噬菌体颗粒包含编码人scFv-片段的单链pComb3H5BHis-DNA，并展示出与噬菌体衣壳蛋白III翻译融合的相应scFv-蛋白。
实施例2.3.4：噬菌体展示选择人VH
通过PEG8000/NaC1沉淀和离心，从培养物上清液中收获得到的带有克隆的scFv库的噬菌体文库。约1x1011至1x1012个scFv噬菌体颗粒重悬于0.4mLPBS/0.1％BSA，并以0.5mL的总体积与重组生物素化的可溶rhGM-CSF(大肠杆菌材料，其如实施例1所述)一起轻微震荡孵育1小时。然后，加入6.7x107个抗生物素蛋白链菌素磁珠(DynabeadsM-280-抗生物素蛋白链菌素，Dynal)，并再轻微震荡孵育30分钟。
通过洗涤步骤，用PBS/0.1％BSA去除未特异结合靶抗原的scFv噬菌体。为此，通过磁体收集生物素化的抗原-抗生物素蛋白链菌素珠复合物(含有潜在的scFv结合物)，并重悬于1mL洗涤溶液(一个洗涤步骤)。该洗涤步骤重复多至4次。洗涤后，通过利用HC1-甘氨酸(pH2.2)来洗脱结合实体，并在用2MTris(pH12)中和后，将洗脱物用于感染新鲜的未感染的大肠杆菌XL1Blue培养物。
为了洗脱剩余的高结合性实体，将珠直接重悬于200μL新鲜的大肠杆菌XL1blue培养物(OD600≥0.5)中，并轻微震荡孵育10分钟。然后混合两种培养物，并再次针对羧苄青霉素抗性筛选成功转导编码人scFv-片段的噬菌粒拷贝的细胞，然后用VCMS13辅助噬菌体感染，从而开始第二轮抗体展示和体外筛选。
对两种抗体进行总共4轮选择。选择期间，抗原浓度减少到如下终浓度：
分离来自大肠杆菌培养物的质粒DNA，对应于第3和4轮淘选。
为了产生可溶性scFv-蛋白质，从质粒上切下VH-VL-DNA片段(XhoI-SpeI)，并通过质粒pComb3H5BFlag/His(不含噬菌体感染所需的另外的噬菌体蛋白)中相同的限制性位点克隆。连接后，质粒DNA的每个群(不同淘选轮次)被转化入100μL热休克感受态大肠杆菌TG1，并铺板于羧苄青霉素LB琼脂上。挑出单克隆，并孵育在96孔板(Greiner)的120μL含1％葡萄糖的LB培养液(carb)(50μg/mL)中。用半透膜(Greiner)密封孔，并将板在震荡孵育箱(主平板)中于37℃孵育过夜。然后，10μL主平板培养物被转入第二个96孔板(工作板)，每孔含90μLLB培养液(50μg/mL)和0.1％葡萄糖。在37℃震荡孵育箱中孵育4小时，向每个孔中加入20μLLB培养液(carb)和6mMIPTG，来诱导scFv产生。在于30℃震荡孵育过夜的步骤之后，于室温用40μL裂解缓冲液(400mM硼酸，320mMNaCl，4mMEDTApH8，2.5mg/mL溶菌酶)孵育1小时，裂解细胞。以1,900xg离心(Hettich)12分钟来分离掉剩余的细胞和细胞碎片。
然后，用含scFv分子的上清液在ELISA测试中进行结合测试。检测与固定的rhGM-CSF抗原(Leukine)结合的scFv片段，其利用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠Fab2特异性多克隆抗体(Dianova，1μg/mLPBS/1％BSA)检测抗标签M2(1μg/mLPBS/1％BSA)。加入ABTS底物溶液放大信号，并在405nm波长处检测。
在3轮选择后测试的约100个克隆中，12个克隆显示出能与rhGM-CSF强结合。在4轮选择后测试的约160个克隆中，超过80％的溶解产物与用PBS作的阴性对照相比对重组抗原显示出强ELISA信号。来自有代表性的克隆的结果如图4所述，其中这些有代表性的克隆沿X轴排列，而吸收强度显示在Y轴上。如图4所见，PBS阴性对照(X轴右边第二个)未显示出可评估的结合性，而有代表性的scFv克隆scFvA、scFv3035、scFv3039、scFv3080和scFv5-306通过ELISA显示出不同程度的结合强度。
在平行实验中，所有溶解产物在没有rhGM-CSF的情况下测试，测试其与封闭剂的非特异性结合。没有观察到显著的可检测的信号，这显示了与rhGM-CSF的结合特异性。
确定了超过13个ELISA阳性scFv克隆的DNA序列。总共鉴定出6种不同的序列。所有的序列都是人源的，并与人生殖系序列VH-11-O2密切相关。
实施例2.3.5：表征含人VL和VH区的人scFv构建体
实施例2.3.5.1：大规模制备并纯化通过实施例3所述方法产生的scFv 领导(lead)分子构建体
如实施例2.2.6.3所述，分离scFv领导(lead)分子并纯化。
实施例2.3.5.2：通过表面等离子共振(SPR)对scFv(lead)分子的动力 学结合进行分析
该实验的目的是深入表征scFv领导(lead)分子。通过注入10μL以10μg/mL至1pg/mL纯化scFv的连续稀释的纯化蛋白质，并在25℃监测解离100秒，来测量scFv领导(lead)分子的结合动力学(kd和ka)。蛋白质于HBS-EP(0.01MHEPES，pH7.4，0.15MNaCl，3mMEDTA，0.005％表面活性剂P20)中缓冲。利用BIAevalutionTM软件拟合数据，根据1∶1朗缪尔结合方程(式1和2)，确定了解离和结合动力学的速率常数，其中A为注入的分析物的浓度，而B为配体的浓度。
dB/dt＝-(ka*[A]*[B]-kd*[AB])(1)
dAB/dt＝-(ka*[A]*[B]-kd*[AB])(2)
每种要分析的scFv领导(lead)分子以多至8个浓度，来确定动力学结合曲线。原始数据的独立拟合形成了解离和结合速率常数，将其用于计算平衡解离常数(KD，结果如表1所述)。
表1
2.3.5.3：通过scFv领导(lead)分子抑制TF-1细胞的rhGM-CSF依赖 性增殖
在确证了scFv领导(lead)分子中保留了特异结合强度之后，该实验的目的是评估scFv领导(lead)分子与抗原rhGM-CSF相互作用的特异性。在TF-1增殖抑制实验中表征了用scFv结合抗原rhGM-CSF对生物功能的抑制力。
如上所述，进行TF-1增殖抑制实验。以1x105个细胞/mL的终浓度将细胞重悬于RPMI1640、10％FCS，每孔使用90μL细胞悬液(0.9x104个细胞/孔)。用终浓度为0.3ng/mL的rhGM-CSF刺激TF-1细胞增殖。为了中和rhGM-CSF依赖性增殖，加入溶于1xPBS的纯化的scFv，其被连续稀释，使最终蛋白质浓度达到100μg/mL至10pg/mL。将10μL经透析、无菌过滤的蛋白质溶液(0.22μm滤膜)加入100μLTF-1和rhGM-CSF溶液中。样品于37℃在5％CO2下孵育72小时。72小时后，加入WST-1来确定TF-1细胞的增殖状态，并用ELISA读数仪监测450nm处的比色改变(图5)。如图5所见，清楚地证实了有人GM-CSF中和活性。ScFvA展示出最强的中和活性。
实施例2.4：最优化所选的scFv的结合特征
通过增加中和剂和配体间的结合强度，尤其增加中和剂的解离速率，预计可改善或甚至优化中和剂对单体配体的生物活性。
这优选通过以随机的方式突变各VH和VL区的序列来实现，其通过(i)在整个序列中随机插入一个或两个突变，或通过(ii)在有高度可能性与抗原相互作用的scFv区中插入单突变或多个连续的突变(如五、六、七、八、九或十个氨基酸的片段)。然后，必须表征各突变体是否增加了活性，或在表征前，必须通过合适的选择方法(即噬菌体展示)对具有优选性质(如较强的结合力)的进行富集。
实施例2.4.1：通过在一个或多个位置上突变VHCDR3而来增加亲和力
为了通过单个点或短氨基酸片段突变改善抗体片段(例如scFv分子)的结合特征，则必须靶向于有很高的可能性与各抗原相互作用的氨基酸残基。用该方法，不必筛选超过有限数量的突变体而且不会减少成功的可能性。抗体或其片段的重链CDR3通常对该抗体或抗体片段全面结合抗原起重要的作用。因此预计增加抗体或抗体片段的结合亲和力的有前途的方式是突变编码VHCDR3的核苷酸序列。
有各种不同的方法用来进行该靶向随机诱变，其中一些描述于以下各项中，以下各项描述了上述scFv分子的结合亲和力如何能增加：
A)为了靶向VHCDR3，必须将合适的限制性位点导入VHCDR3内的核苷酸序列中，优选通过基因合成含修饰的CDR3核苷酸序列、并保留了原有的氨基酸序列的整个VH区来实现(Entelechon，德国)。通过用各限制性酶裂解并加入S1核酸酶/KlenowDNA聚合酶I和dGTP，然后加入突变的寡聚物二倍体，可根据Matteucci和Heyneker，NucleicAcidsResearch11：3113ff(1983)在一个或多个氨基酸位置上进行靶向随机诱变。然后，诱变的VH与各VL(通过合适的接头)在合适的scFv表达载体中组合，并转化入大肠杆菌细胞中。然后，挑取表达变体scFv的单个克隆，并如在以前实施例中筛选和表征scFv击中(hit)分子和领导(lead)分子中所述的来筛选出改善了的scFv。
B)可选的方法是通过双引物法进行的寡核苷酸介导的突变，其详情如Sambrook、Fritsch、Maniatis(1989)″Alaboratorymanual″中所述。主要是将VH区克隆进基于M13的载体中，并分离单链质粒。能与含随机序列的单链质粒模板杂交的引物退火并延伸。在大肠杆菌中增殖各质粒群之后，可从质粒群中收获突变的VH，并与原VL(通过合适的接头)组合在合适的scFv表达载体中，并转化入大肠杆菌细胞中。挑取表达变体scFv的单个克隆，并如在以前实施例中筛选和表征scFv击中(hit)分子和领导(lead)分子中所述的来筛选出改善了的scFv。
C)另外可选的是突变多至6个或更多的连续氨基酸。为该目标，可构建VH核苷酸序列的缺失变体，使其缺失CDR3和FR4。该构建体被用作模板来进行一步或两步PCR扩增，其中合适的5′引物(能与VH序列的5′末端杂交，而且加入了合适的克隆位点)与一组3′引物组合在一起，所述3′引物能退火在作为模板的FR3区的3′末端上并能将CDR3和FR4区(以合适的限制性位点)加到扩增片段上。该组3′引物包含一个或多个三联体序列以在CDR3序列内插入随机密码子。然后，该群含随机化的CDR3区的VH区接着与各VL(通过合适的接头)组合在合适的scFv表达载体中，并转化入大肠杆菌细胞中。然后，挑取表达变体scFv的单个克隆，并如在以前实施例中筛选和表征scFv击中(hit)分子和领导(lead)分子中所述的来筛选出改善了的scFv。
各群具有较高多样性的突变scFv(可被容易地筛选出)可被克隆入合适的噬菌体展示载体中，然后通过对感兴趣的抗原进行噬菌体展示(优选在逐渐降低的抗原浓度的条件下)来选择改善的scFv，来选择更高的亲和力。根据本文其他部分所述的标准规程，进行噬菌体展示筛选。以上方法A至C之任一可组合在一起，或以重复循环的形式来进行，以此进一步改善并优化已经修饰的scFv。
实施例2.4.2：通过在整个序列中随机突变V区来增加亲和力
除了突变有高度的可能性与各抗原相互作用的特定scFv位点，可进行更注重实效的方法，其通过在整个VH和/或VL序列中导入点突变，然后筛选优化的scFv或选择并筛选优化的scFv而实现。例如，利用大肠杆菌突变体菌株(如Low等260：359ffJMolBiol(1996)所述)或通过DNA聚合酶错掺入核苷酸，来诱变VH和/或VL序列，所述错掺入核苷酸具体如Sambrook，Fritseh，Maniatis(1989)″Alaboratorymanual”所述。克隆、表达和选择优化的seFv分子变体，可通过噬菌体展示或通过常用的核糖体展示技术(如EP0975748A1中所述)来进行。最优的方式是在合适的载体/大肠杆菌系统中表达，从而筛选出改善的scFv候选物。
实施例2.4中的上述合适的方法可用于优化有代表性的scFv领导(lead)分子(scFvA)，由此形成一类单克隆人抗GM-CSF中和性抗体片段，其用scFv分子B-N表示。在以下实施例中将进一步阐述并描述这些scFv分子的特征。从所选的scFv分子中产生单克隆IgG分子将在以下实施例中描述。
实施例3：从所选的scFv中克隆并真核表达单克隆抗体
尽管已知细菌能表达功能性Fab片段，然而它们通常不能产生完整的功能性免疫球蛋白。为了产生完整的功能性抗体，必须用哺乳动物细胞，因此在前面实施例中所选出的scFv5-306的VL区和scFv分子的不同VH区(尤其是scFvA和scFvB的VH区)被亚克隆到哺乳动物表达载体中。
实施例3.1：基于scFv5-306来克隆人轻链
为了产生合适的末端限制性位点，PCR扩增编码scFv5-306VL区的DNA片段，这形成Vκ片段，其在5’末端处带有Bsu36I位点并在3’末端处带有XhoI位点。然后，通过Bsu36I和XhoI，该片段被亚克隆到质粒BSPOLL中，其中利用5’引物(5’-ACGTCACCTFAGGTGTCCACTCCGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGC-3’)和3’引物(5’-CATGCACTCGAGCTTGGTCCCTCCGCCGAAAG-3’)，由此加入了哺乳动物前导序列和人Cκ恒定区，并通过测序验证。利用EcoRI和SalI，从BSPOLL中切下5-306VL-CκDNA，并通过用编码鼠腺苷脱氨酶(ADA)的cDNA来代替编码鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)的cDNA，亚克隆入源自表达载体pEF-DHFR的真核表达载体pEF-ADA中(Mack等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92，7021-5)。
实施例3.2：克隆人重链可变结构域
从以前实施例中所选的不同人VH区(尤其是scFvA和scFvB的VH区)中，通过PCR重新扩增出可变区，在两端都产生Bsu36I限制性位点。对所有构建体，使用两种引物组合：5’引物VH-Bsu36I(5’-ACGTCACCTTAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTCCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGC-3’)和3`引物(5’-ACGTCACCTGAGGAGACGGTGACCATTGTCCCTTG-3’)。然后用这些限制性位点将产生的DNA-片段亚克隆入已经含真核前导序列和编码人IgG1重链恒定区的DNA片段的真核表达载体pEF-DHFR。由此将重链可变区插入前导序列和重链恒定区之间。通过测序来确证可变区的正确序列。
实施例3.3：将scFv片段转变入完整的人IgG中
根据用于瞬时蛋白质表达的标准规程，将编码轻链(VL5-306/Cκ)的质粒和编码一个重链(VH/人IgG1恒定区)的质粒共转染入HEK细胞中，培养细胞使免疫球蛋白表达并产生，进入培养基。以这种方式，产生源自scFvA的IgGA，和源自scFvB的IgGB。产生出各种抗体之后，收获上清液，并根据标准规程，通过蛋白质A层析来分离人免疫球蛋白，以此纯化免疫球蛋白。然后用免疫球蛋白以进行进一步的表征实验。
实施例3.4：重新将IgG专一性转变入scFv片段
根据标准规程，来自于IgG构建体(IgGA和IgGB，如上述的)的VH区被亚克隆入合适的scFv表达载体中，并通过柔性接头可操作地与源于实施例3.1的人轻链的VL区可操作地偶联。在上述大肠杆菌周质中产生了这些构建体，其为可溶的。这些scFv(源于IgGA的scFvO，和源于IgGB的scFvP)的特征在以下实施例中有描述。
实施例4：评估针对灵长类和人GM-CSF的人单克隆抗GM-CSF抗 体的结合特异性
该实验的目的是显示如上所述而获得的抗体特异结合GM-CSF。因此通过ELISA，比较该抗体与不同的重组人(“rh”)集落刺激因子(rhG-CSF和rhM-CSF，Strathmann)的结合力与相同抗体对rhGM-CSF的结合力。
将50μL特定的抗原(1μg/mL，溶于PBS)于室温包被于ELISA板(Nunc，Maxisorp)上1小时。用PBS/0.05％Tween20洗3次后，每孔用200μLPBS/3％脱脂奶粉于室温封闭孔1.5小时，然后用PBS/0.05％Tween20洗3次。50μL/孔的一系列人抗体(例如IgGA和IgGB)，其中每一个与SEQIDNO.34所述序列的轻链相同，但带有SEQIDNO.35-48所述的不同重链，将它们以1μg/mL至0.5ng/mL(溶于PBS/0.05％Tween20/3％脱脂奶粉)连续稀释后而被加入，并孵育1小时。PBS/0.05％Tween20洗3次之后，用50μL辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG抗体(Dianova；用PBS/0.05％Tween20/3％脱脂奶粉以1∶1000稀释)检测结合的抗体。加入50μL/孔ABTS溶液(Roche)来放大信号并在405nm处测量吸收，其中将450nm波长用作参照。
分别对rhM-CSF和rhG-CSF有特异性的商品化的兔抗体(StrathmannBiotechAG)用作阳性对照来结合这些抗原，所述结合用碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔抗体检测。用50μL/孔pNpp溶液(Sigma)放大信号，并测量405nm处的吸收，其中利用450nm波长作为参照。
对于两个有代表性的人抗体，IgGA和IgGB，其结果如图6A、6B和6C所示。
如图6A所见，抗体滴定浓度的增加会导致吸收增加，这表明有代表性的抗体IgGA和B都能很好地结合rhGM-CSF。图6B显示了还是这两个有代表性的抗体与rhM-CSF结合的结果。如该图所见，兔抗rhM-CSF抗体浓度的增加会导致吸收增加，即该对照抗体结合(实心点)增加，而上述这两个有代表性的抗体(实心方块和实心三角)叠加作为连续基线吸收，所述连续基线吸收不随测试抗体浓度的增加而增加。对于对照抗体以及有代表性的测试的IgGA和B，图6C可见到完全类似的结果，这表示与rhG-CSF结合的结果。
综合而言，图6A、6B和6C中所示的数据表明，这两个有代表性的测试抗体IgGA和B能特异结合rhGM-CSF，但不结合其他集落刺激因子，如M-CSF和G-CSF。该抗原结合特异性对于有前景的抗体治疗剂来说是至关重要的。
实施例5：表征人单克隆抗GM-CSF抗体和其片段的结合数据
希望能够通过实施例2中的上述ELISA得出各种被鉴定为rhGM-CSF的阳性结合物的成员的定性等级排名。该等级排名要能反映出由此鉴定出的各有代表性的抗体结合物的动力学(解离速率)和平衡(亲和力)参数。为此，在BIAcoreTM2000设备(BiacoreAB(Uppsala，瑞典))上于25℃进行表面等离子共振(SPR)，其中流速为5μL/分并将HBS-EP(0.01MHEPES，pH7.4，0.15MNaCl，3mMEDTA，0.005％表面活性剂P20)用作运行缓冲液。产自酵母的重组人GM-CSF(Leukine，Berlex，下文也可被称为“抗原”或“rhGM-CSF”)固定在CM5感应芯片的流动单元(flowcell)2-4上。通过注入80μL0.1M羟基琥珀酰亚胺钠、0.4MN-乙基-N’(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(NHS/EDC)，来活化芯片表面。通过人工注入溶于0.01M乙酸钠(pH4.7)的10μg/mLrhGM-CSF，来偶联抗原。将不同密度的抗原固定在流动单元2-4上，调节人工注入次数。不修饰流动单元1，而流动单元2用尽可能高的密度的rhGM-CSF(800RU)来包被。流动单元3以固定在流动单元2上的抗原量的50％来包被，而流动单元4用最低密度的rhGM-CSF(通常为10％)来包被。注入85μL1M乙醇胺来封闭感应芯片的活化表面，并使芯片以5μL/分HBS-EP的恒定流速来平衡过夜。
实施例5.1：定量确定人单克隆抗GM-CSF抗体的scFv片段的动力 学结合参数(解离速率)
如上一段所示来进行Biacore实验。在实验前，周质制品(“PPP”)的蛋白质洗脱溶液用PBS于25℃透析2小时并用HBS-EP1∶1稀释。通过将10μL纯化的周质蛋白溶液于25℃注入感应芯片，来测量所述类型的成员的结合动力学。从固定rhGM-CSF的流动单元(FC2，FC3，FC4)中的响应信号中扣除蛋白质与未修饰的感应芯片表面(FC1)的非特异性背景吸收。确定相对响应信号(FC2-1，FC3-1，FC4-1)，并监测特定解离速率100秒。
对于一系列在ELISA实验中被鉴定为阳性rhGM-CSF结合物的有代表性的scFv片段，这些实验的结果如图7A所示。图7A所示Biacore数据所针对的有代表性的scFv抗体片段如下：scFvA，scFvB，scFvC，scFvD，scFvE，scFvF，scFvG，scFvH，scFvI，scFvJ，scFvK，seFvL，scFvM和scFvN。
一般而言，在Biacore结果的解释过程中，结合峰的幅度(RUmax)直接与注射的样品中的蛋白质浓度相关。动力学结合率(ka)是浓度依赖性的，而且由于PPP中蛋白质浓度会变化，不能用作为所述类型成员的定量等级排名。动力学解离速率(kd)是蛋白质浓度非依赖性的，而且对所述类型各成员的结合强度具有特征性。所述类型的所有鉴定出的成员显示出与固定的rhGM-CSF的特异结合。鉴定出具有最佳表观解离速率的所述类型成员，并通过在BIAcore上的平衡结合实验进一步将SPR数据与提交的抑制数据关联，从而确定出亲和力。
然后，在检视图7A的过程中，察看每个有代表性的scFv抗体片段A-N的特异峰，其上部分分别显示出有特征的曲率，外推该曲率以获得所论及的scFv片段的解离速率。然后可定量地断定，每个有代表性的scFv片段能很好地结合人GM-CSF。
实施例5.2：定量确定某些人抗GM-CSF抗体和其scFv片段的平衡结 合参数(亲和力)
既然已经在实施例5.1中定性地建立了已经在先前通过ELISA测得其为GM-CSF结合阳性的抗GM-CSF抗体的许多scFv片段在与人GM-CSF结合时证明有合理的动力学解离速率，然后希望通过关注重组人GM-CSF特有的平衡结合特征获得这些抗体及其片段结合的定量表征情况。如以上实施例4所示，与抗原(本文中的rhGM-CSF)的特异性结合是本文所述的抗GM-CSF抗体及其片段类型的特有而且特定的特征。
通过以10μg/mL至1pg/mL纯化蛋白质的连续稀释注入纯化的蛋白质(即抗体或其片段)，并于25℃监测解离100秒，来测量人抗GM-CSF抗体及其片段类型中某些有代表性的成员的结合动力学(解离速率(kd)和结合率(ka))。纯化的蛋白质溶于HBS-EP缓冲液。利用BIAevalutionTM软件来拟合数据，通过1∶1朗缪尔结合方程(参见下式1和2)确定解离和结合动力学率常数，其中A为注入的纯化的蛋白质分析物的浓度和B[0]为Rmax：
dB/dt＝-(ka*[A]*[B]-kd*[AB])(式1)
dAB/dt＝-(ka*[A]*[B]-kd*[AB])(式2)
用要分析的每种有代表性的人抗GM-CSF抗体或其片段的多至8种浓度来确定结合动力学曲线。对原始数据的独立拟合得出了解离和结合速率常数，其用于计算平衡解离常数(KD)。由每种有代表性的人抗GM-CSF抗体或其片段所得的结果如图7B-I所示。具体地，图7B显示了得自有代表性的IgGB的结合数据；图7C显示了得自有代表性的IgGA的结合数据；图7D显示了得自有代表性的seFvC的结合数据；图7E显示了得自有代表性的scFvI的结合数据；图7F显示了得自有代表性的scFvB的结合数据，图7G显示了得自有代表性的scFvA的结合数据；图7H显示了得自有代表性的scFvE的结合数据；和图7I显示了得自有代表性的scFvD的结合数据。数据在下表2中有总结。
表2：某些有代表性的人抗GM-CSF抗体和其片段的亲和力结合定量数据
抗体/其片段 图 ka(s-1M-1) kd(s-1) KD(M)
scFv A 7G 4.41exp5±3.00exp5 1.84exp-3±6.55exp-4 4.17exp-9
scFv B 7F 1.016±4.085 8.07-4±3.73-5 7.98-10
scFv E 7H 1.265±5.574 2.55-4±8.12-5 2.03-9
scFv C 7D 1.735±8.234 4.77-4±1.91-4 2.76-9
scFv D 71 7.605±6.705 8.66-4±2.13-4 1.14-9
scFv I 7E 2.326±2.135 3.47-4±8.78-5 1.50-9
IgG A 7C 2.096±1.326 1.81-4±8.77-5 8.70-11
IgG B 7B 3.635±2.405 1.68-5±5.74-6 4.64-11
实施例6：人抗GM-CSF抗体中某些有代表性的片段所需的最小表位
希望确定如本文所述并要求的人抗GM-CSF抗体及其片段结合的表位。为此，用scFvA作为该类分子的有代表性的成员并用人GM-CSF作为抗原，由此进行肽点样(peptidespotting)(“肽点”(pepspot))分析。
一般而言，肽点样实验按如下方式进行。源自hGM-CSF的氨基酸序列(对于人和其他某些灵长类的GM-CSF序列，参见上文以及图8A、以及SEQIDNO：49-51)的重叠的13-mer肽的C-末端共价连接于Whatman50纤维素膜上，而乙酰化的N-末端仍保持游离。(由JPTPeptideTechnologiesGmbH产生的)单个13聚肽分别如下表3所示。任意两个不同肽的重叠序列长度被设定为11个氨基酸。根据厂商规程，用无水EtOH洗膜1分钟，然后用TBS洗，并用TBS/3％BSA封闭过夜。在每次随后的孵育和洗涤中，于室温进行封闭。用TBS/0.05％Tween20洗3次，每次10分钟，然后用溶于TBS/3％BSA的1μg/mLscFvA孵育膜2.5小时，之后如前所述进行洗涤。通过用抗Penta-His抗体(Qiagen，0.2μg/mL，溶于TBS/3％BSA)并接着用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(Fc-γ-特异性的)抗体(Dianova，1∶10.000，溶于TBS/3％BSA)，用这些抗体中的每一个分别进行孵育1小时，进行scFv检测。用TBS/0.05％Tween20洗3次，每次10分钟，通过增强的化学发光(SuperSignalWestPicoLuminol/Enhancer溶液和SuperSignalWestPicoStablePeroxide溶液；Pierce)来放大信号并在BioMax胶片(Kodak)上曝光。
在点A和B间的肽点串上以及在点C上，检测scFvA与人GM-CSF片段的强结合信号(参见下表3、和图8B)。如图8B所见，与其它点的结合看上去强度较低。跨越点A和B的点串对应于氨基酸残基第15-35位。所有组成该区域的13-mer肽含有氨基酸第23-27位(RRLLN)的一个最小氨基酸片段。点C对应于人GM-CSF的氨基酸残基第65-72位(GLRGSLTKLKGPL)。这些发现暗示scFvA很可能识别非连续的表位。
在人GM-CSF的二级结构中，氨基酸第15-35位位于螺旋A中，而对应于点C的残基是位于螺旋C和D之间的环结构的一部分。分子的三维折叠模型显示出这些位点相互在空间上接近。
点A-B的肽中的最小氨基酸序列基序对应于人GM-CSF的残基第23-27位(RRLLN)。从点A至B逐渐增加的信号强度可以被解释为，对应于点B的肽比对应于点A的肽中的RRLLN表位有更好的可接近性。在肽A中，表位直接位于与膜相连的C-末端上，而在肽B中，它位于更易接近的肽的N-末端上。
表3：固定在纤维素膜上的重叠的13-mer肽的序列。
实施例7：某些人抗人GM-CSF抗体/抗体片段的中和能力
实施例7.1：定性评估某些有代表性的人抗人GM-CSF抗体和其片段 的中和能力
该实验的目的是获得关于有代表性的人抗GM-CSF中和抗体和其片段中和活性的定性信息。为此，使用人GM-CSF依赖性细胞系TF-1(DSMZ，ACC334)。该细胞系的增殖率取决于人GM-CSF的存在，由此在存在和不存在怀疑具有GM-CSF-中和活性的抗体的条件下将细胞与人GM-CSF孵育后测量细胞生长被用于确定事实上是否存在该中和活性。
如分发人(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZelIkulturenGmbH，Braunschweig，德国)所述，TF-1细胞培养于RPMI1640培养基(Gibco；L-谷氨酰胺，不含酚红)、10％热失活FCS中，其中存在2.5ng/mLrhGM-CSF。细胞生长至细胞密度为0.5x106个细胞/mL。为了进行增殖测试，以300xg离心4分钟来收获TF-1细胞并用1xPBS(Dulbecco’s，Gibco)洗。细胞以1x105个细胞/mL的终浓度重悬RPMI1640、10％FCS中，每个Microtest平底细胞培养板的孔中使用90μL细胞悬液(0.9x104个细胞/孔)。终浓度为0.3ng/mL的rhGM-CSF被用来刺激TF-1细胞的增殖。为了中和GM-CSF依赖性的增殖，含人抗GM-CSF抗体的有代表性的片段的纯化的PPP于25℃用1xPBS透析2小时。将10μl经透析并无菌过滤的蛋白质溶液(0.22μm滤膜)加到100μl含TF-1和rhGM-CSF的溶液中。
于37℃在5％CO2下孵育72小时后，用基于活细胞中线粒体脱氢酶裂解四唑盐(WST-1，Roche)的比色测试来确定TF-1细胞的增殖状态。由代谢活性细胞产生的甲染料通过用ELISA读数仪测量其在450nm处的吸收来定量。
测试的人抗人GM-CSF抗体片段的有代表性的片段对TF-1细胞的人GM-CSF依赖性增殖的抑制，其强度参差不齐(图9)。尽管两种这样的片段不具有中和效果(scFvF和scFvL)；五种构建体(scFvJ，scFvK，scFvM，scFvN，和scFvH)显示出中度的抑制，而有七种构建体(scFvB，scFvI，scFvE，scFvD，scFvG，scFvC，scFvA)显示出对TF-1细胞的GM-CSF依赖性增殖的强抑制。缺乏中和效果或较低程度的中和效果可能是由于特定的有代表性的scFv的较低的表达水平而造成的，或由特定的有代表性的scFv和rhGM-CSF在37℃孵育的72小时期间形成了较不稳定的复合物而造成的。
实施例7.2：通过细胞增殖测定来定量评估某些有代表性的人抗人 GM-CSF抗体和其片段的中和能力
然后对选出的以上显示出有强TF-1增殖抑制性的有代表性的scFv分子进行中和功效的定量分析。为此，使用相同的人GM-CSF依赖性细胞系TF-1(DSMZACC334)。如以上实施例7.1中所详细描述的，培养并制备TF-1细胞以进行增殖测试。终浓度为0.3ng/mL的rhGM-CSF被用于刺激TF-1细胞增殖。为了中和GM-CSF依赖性的增殖，将10μl有代表性的人抗人GM-CSF中和性单克隆抗体或其片段的纯化的样品加入到含100μlTF-1和连续稀释的rhGM-CSF的溶液中。最终蛋白质浓度为10μg/ml至10pg/ml。
样品于37℃在5％CO2下孵育72小时。72小时后，如以上实施例7.1所述来确定TF-1细胞的增殖状态。利用Prism软件的非线性回归曲线拟合，使数据被拟合成增殖的半最大抑制浓度(IC50)。
可确定并定量如以上实施例7.1中所述的定性增殖-抑制实验中清楚可见的GM-CSF中和效应。在该增殖-抑制实验中，所有测试的人抗人GM-CSF单克隆中和抗体的scFv片段显示出在纳摩尔水平的半最大抑制常数(IC50)。如图10A所见，可确立中和效应的清楚等级排名。
测试的人抗人GM-CSF单克隆中和IgG抗体显示出显著高于它们scFv对应物的中和功效。该实验中得到的IgG分子的半最大抑制常数是在亚纳摩尔范围内的。如图10B所见，由IgGA所评估出的IC50为0.9nM，而IgGB具有0.3nM的IC50。
为了检查得自IgGA和B的scFv抗体片段(分别是seFvO和P)的中和能力是否在量上与scFvA和B相当，如上所述来进行类似的TF-1中和测试，但其中利用scFvO和P作为测试分子。对于scFvP和O，结果分别如图10C和10D所示。如图10D所见，scFvO与scFvA具有相同的中和潜力，这显示将IgG还原为scFv形式是可能的，并且不丧失生物活性。
实施例7.3：通过测定降低的1L-8产量来定量评估某些有代表性的人抗 rhGM-CSF抗体和其片段的中和能力
通过测量U-937细胞的GM-CSF依赖性IL-8产量，进行该实验以定量有代表性的人抗人GM-CSF抗体及其片段的中和活性。前述实验中所用的GM-CSF抗原是rhGM-CSF。如分发人(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，Braunschweig，德国)所述，单核细胞U-937细胞培养于RPMI1640培养基Gibco(L-谷氨酰胺，不含酚红)中，其中补加了10％热失活的FCS。细胞生长至细胞密度为1x106个细胞/mL。
为了进行基于测量IL-8产量的抑制测试，以300xg离心4分钟来收获细胞，并以1x106个细胞/mL的终浓度重悬于RPMI1640、10％FCS中。1.8x105个细胞/孔(180μL细胞悬液)接种于Microtest平底细胞培养板的孔中。终浓度为1ng/mL的rhGM-CSF被用来刺激U-937细胞产生IL-8。将20μl纯化的scFv或IgG加入到180μlU937细胞和连续稀释成10μg/mL至10pg/mL最终蛋白质浓度的rhGM-CSF溶液中。
于37℃和5％CO2孵育18小时后，以600xg离心培养板2分钟来沉淀细胞。通过吸入新的板中来收获培养物上清液，并利用OptEIA人IL-8ELISA套件(BectonDickensonandCompany)分析以确定其中IL-8的浓度。
根据厂商的说明书进行ELISA检测。简而言之，50μL用0.1M碳酸钠(pH9.5)稀释的捕获抗体于4℃包被于Microtest板上过夜。用PBS/0.05％Tween20洗3次后，每孔用200μLPBS/10％FCS于室温封闭孔1小时，然后用PBS/0.05％Tween20洗三次。然后，将50μL培养物上清液样品加到孔中并于室温孵育2小时。对于此后对IL-8浓度的定量，在过程中使用由厂商提供的连续稀释的IL-8标准品。
用PBS/0.05％Tween20洗5次后，利用OptEIA人IL-8ELISA套件提供的50μLWorkingDetector(检测Ab+Av-HRP)进行检测。于室温孵育1小时后，再洗孔7次。加入OPD底物溶液(Sigma)放大信号，并在490nm波长处检测(利用参照波长620nm)。
画出IL-8标准曲线来进行校正，并根据该校正曲线计算出培养物上清液样品中的IL-8浓度。利用Prism软件的非线性回归曲线，将数据拟合成IL-8产量的半最大抑制浓度(IC50)。
如图11中所清晰可见的随着scFv浓度增加而IL-8浓度减少，所有测试的人抗rhGM-CSF单克隆中和抗体的有代表性的片段显示能明显抑制U-937细胞的GM-CSF依赖性IL-8产生。在该实验中所见的中和功效等级排名符合在上述TF-1增殖-抑制实验中测试相同分子中和效应所得的等级排名。
将能注意到，在该实验中所确定的IC50值比在之前TF-1增殖实验中相同分子所得的那些要大。这是由于刺激U-937细胞产生IL-8所需的GM-CSF浓度比刺激TF-1所需的要大而造成的。
实施例7.4：通过测定细胞增殖来定量评估有代表性的人抗人GM-CSF 抗体和其片段对重组猕猴GM-CSF的中和能力
该实验的目的是显示有代表性的人抗人GM-CSF抗体及其片段对来自于猕猴科非人灵长类的GM-CSF(“macGM-CSF”)的中和能力。
为了显示所选的scFv和IgG分子对macGM-CSF的中和效应，根据实施例7.1和7.2中所述的规程进行增殖-抑制实验，其中利用了macGM-CSF来代替hGM-CSF。hGM-CSF和macGM-CSF都以相同的半最大功效(EC50)来刺激TF-1细胞的增殖。在测试scFv分子的实验中，终浓度为3ng/ml的macGM-CSF被用于刺激TF-1细胞增殖，而在测试作为有代表性的人抗人GM-CSF抗体的IgGB的实验中，用0.3ng/mLrhGM-CSF细胞。为了中和TF-1细胞的增殖，将10μl纯化的人抗人GM-CSF抗体或其片段加入到100μlTF-1和连续稀释的macGM-CSF溶液中。最终蛋白质浓度为10μg/ml至10pg/ml。样品于37℃在5％CO2下孵育72小时。72小时后，如实施例7.1和7.2所述来确定TF-1细胞的增殖状态。利用Prism软件的非线性回归曲线，将数据拟合成增殖的半最大抑制浓度(IC50)。
如图12A所见，某些有代表性的人抗人GM-CSF单克隆抗体片段也显示出明显的macGM-CSF中和潜力(scFvB，scFvE，scFvC，scFvI，scFvA)。另外，如图12B所见，有代表性的人抗人GM-CSF单克隆抗体IgGB的浓度增加清楚地使TF-1增殖降低，这证明了该抗体的中和潜力。有趣的是，在该实验中利用IgGB抑制由macGM-CSF诱导的TF-1细胞增殖而得到的IC50值(0.3nM)等于在利用hGM-CSF的实验中得到的，这显示IgGB对这些物种中的GM-CSF有清楚的交叉反应性。
实施例8：IgGB与来自各种物种的GM-CSF的交叉反应性
研究IgGB与来自各种非人物种的GM-CSF的交叉反应性以确定适于进行以后体内研究的物种。在第一组实验中，在ELISA实验中测试IgGB与来自人(Berlex)、猪、狗、大鼠(R&DSystems，Wiesbaden，德国)和小鼠(StrathmannBiotech，Hamburg，德国)的商品化的重组GM-CSF的结合。具体地，用来自所述各种物种的1μg/mLGM-CSF来包被ELISA板。加入连续稀释的IgGB并用辣根过氧化物酶缀合的抗人IgGl抗体检测。加入邻苯二氨(“OPD”，与过氧化物酶反应时呈黄-橘黄色)底物溶液(Roche，德国)使ELISA显色，并测定490nm处。
如图13所见，IgGB显示出与重组人GM-CSF强结合，而来自于其他测试的物种的GM-CSF不被识别。因此，猪、狗、大鼠或小鼠不是合适的用于体内测试的物种。可是，如以上实施例7.4所见，IgGB显示出与macGM-CSF(来自于食蟹猴(cynomolgousmonkey)，macacafascicularis)有显著的交叉反应性，这暗示至少一种来自于猕猴科的猴子物种适于进行IgGB的体内研究。
实施例9：IgGB与GM-CSF的不同糖基化变体的结合
该实验的目的是确定IgGB与GM-CSF的结合程度依赖于后者糖基化模式。为此，测试连续稀释的含天然hGM-CSF(人糖基化)、以及来自于大肠杆菌(未糖基化)和酵母(酵母糖基化)的重组hGM-CSF、以及重组猕猴GM-CSF的条件培养基，测试它们诱导TF-1增殖的能力。
人糖基化的GM-CSF得自IL-1β处理的BEAS-2B细胞(人肺细胞，其得自ATCCCRL-9609)的培养物上清液。BEAS-2B细胞在用BEGMBullet试剂盒(Cambrex，Verviers，比利时)替换的BEBM培养基中增殖，但培养于RPMI1640、10％FCS中，其中存在50ng/mLIL-1β(StrathmannBiotech，Hamburg，德国)，由此诱导GM-CSF产生。于37℃、5％CO2孵育48小时后，根据厂商的说明书，利用OptEIA人GM-CSFElisa套件(BDBiosciences，Heidelberg，德国)分析培养物上清液的GM-CSF含量。
如WO2005/105844实施例1.1所示，来内在产生来自大肠杆菌的重组hGM-CSF。来自酵母的重组hGM-CSF来自商业途径，其商品名为“Leukine”(Berlex，美国)。猕猴GM-CSF在HEK293细胞中重组产生。
首先测试连续稀释的含天然hGM-CSF、以及来自于大肠杆菌和酵母的重组hGM-CSF、和猕猴GM-CSF的条件培养基，测试其诱导TF-1增殖的能力。所有三种人GM-CSF的糖基化变体和猕猴GM-CSF对于TF-1活化都显示出非常相似的EC50值。这些分别为，对于大肠杆菌产生的hGM-CSF为10pg/mL，对于酵母产生的hGM-CSF为15pg/mL对于人肺细胞产生的hGM-CSF为36pg/mL，而且对于猕猴GM-CSF为11pg/mL(图14A)。
然后，在存在0.3ng/mL重组hGM-CSF、或0.2ng/mL生理hGM-CSF的情况下，确定IgGB的中和活性，72小时后，通过比色反应来定量存在不同IgGB浓度的情况下的TF-1细胞的增殖状态(图14B)。
综合而言，图14中所示的数据显示IgGB以亚摩尔浓度抑制TF-1细胞的GM-CSF依赖性增殖，明显不依赖于人GM-CSF的糖基化模式。因此，人GM-CSF的糖基化模式基本不影响IgGB中和GM-CSF活性的能力。
实施例10：IgGB对嗜曙红细胞上GM-CSF的生物活性的影响
实施例10.1：IgGB对GM-CSF介导的嗜曙红细胞存活的影响
GM-CSF的各种生物活性之一是延长嗜曙红和嗜中性粒细胞的存活。因为肺炎性疾病与在维持炎症中起实质作用的嗜曙红细胞局部积聚相关，因此可以测试IgGB抑制GM-CSF介导的嗜曙红细胞存活的功效。
通过从密度梯度离心而得到的粒细胞群中去除CD16+嗜中性白细胞并裂解红血球，自健康供体的外周血中分离嗜曙红细胞。新分离的外周血嗜曙红细胞以5x104个细胞/孔的密度接种于96孔平板Microtest板中的RPMI1640/10％FCS和Pen/Strep中。将GM-CSF连续稀释成33ng/mL至10pg/mL，将其加入以监测浓度依赖性的嗜曙红细胞的存活。为了分析IgGB对GM-CSF依赖性嗜曙红细胞存活的抑制潜力，加入抗体，其被连续稀释至10μg/mL至0.1ng/mL。终浓度为0.1ng/mL的GM-CSF被用于影响嗜曙红细胞存活。于37℃、5％CO2孵育72小时，加入WST-1试剂。通过测量450nm处的吸收，来定量所得到的对应于活细胞部分的比色反应。利用prism软件包的非线性回归曲线拟合来分析数据，并拟合出存活的半最大抑制浓度(IC50)。如图15A所见，确定rhGM-CSF的半最大效应剂量(EC50)为0.02ng/mL。如图15B所见，观察到IgGB的有效中和效应，嗜曙红细胞存活的半最大抑制浓度达到0.13nM抗体浓度。
这些数据显示IgGB能以剂量依赖性方式来有效抑制GM-CSF依赖性-嗜曙红细胞存活。
实施例10.2：IgGB对GM-CSF诱导的嗜曙红细胞活化的影响
也希望研究IgGB对GM-CSF诱导的嗜曙红细胞活化的影响。在刺激20小时或3天后的分离自人血的外周嗜曙红细胞(CD16-)上，发现CD69表达能被上调，其中所述细胞的刺激用(a)0.1ng/mLGM-CSF或(b)0.1ng/mLGM-CSF、IL-3和IL-5，但不单用(c)0.1ng/mLIL-3和IL-5(图16A)。在仅存在培养基的情况下培养的嗜曙红细胞显示出不能上调CD69。因此，CD69可被当作GM-CSF活化嗜曙红细胞的标记，而且监测CD69的表达水平来测量GM-CSF依赖性嗜曙红细胞活化。如在流式细胞计中缺少CD69表达而见到的，在两个时间点(20小时和3天)上，IgGB(10μg/mL)几乎能完全防止嗜曙红细胞的GM-CSF依赖性活化。
如上述实施例10.1来分离嗜曙红细胞并以5x105个细胞/孔的密度培养于48孔平底Microtest板中的RPMI1640/10％FCS和Pen/Strep中。单独用培养基孵育细胞，或在只存在0.1ng/mLGM-CSF的情况下，或同时用0.1ng/mLIL-3或IL-5。用10μg/mLIgGB中和GM-CSF。孵育1或3天后，通过流式细胞计来分析细胞的CD69表达。
通过流式细胞计检测CD69：在FACSCalibur仪器(BectonDickinson)上确定CD69在嗜曙红细胞上的表达。105个细胞与5μLFITC-缀合的抗人CD16(克隆3G8，BDBiosciences)和PE缀合的抗人CD69抗体(克隆FN50，BDBiosciences)于4℃分别孵育1小时。使用无关的、同型匹配的FITC-和PE缀合的抗体作为阴性对照。孵育后，细胞用PBS、1％FCS、0.05％NaN3洗两次，并重悬于250μLPBS、1％FCS、0.05％NaN3中。加入碘化丙锭至终浓度1μg/mL，以标记死细胞，然后立即进行FACS分析。利用CellQuestPro软件(BDBiosciences)进行数据解释。碘化丙锭阳性(即，死的)细胞排除出CD69表达的分析中。
如通过亚丙基碘染色CD16-/CD69+细胞而监测到的，存在0.1ng/mLGM-CSF时，IgGB也降低了活的和活化的嗜曙红细胞的百分比。IgGB降低了活化细胞的百分比，在1天后从35％降至8％，而在3天培养后从43％降至3％。在存在0.1ng/mLGM-CSF、IL-3和IL-5的情况下，活的和活化的嗜曙红细胞的百分比在1和3天后分别从32％降至8％和从48％降至11％。即使CD69的上调完全被IgGB抑制了，但在存在0.1ng/mLGM-CSF、IL-3和IL-5的情况下，相对于只用培养基或GM-CSF孵育的细胞，有更多的静息嗜曙红细胞(CD16-/CD69-)存活了3天(图16A，最后一栏)。对于存在0，1ng/mLIL-3和IL-5的情况下孵育的细胞，观察到了相同结果。
在剂量发现实验中，将连续稀释的IgGB加入到在存在0.1ng/mLGM-CSF的情况下培养的嗜曙红细胞中(图16B)。观察到了IgGB对CD69依赖性平均荧光强度(MFI)的抑制效应，其半最大浓度为0.22nMIgGB。
综合而言，这些数据显示了，在与炎性气道疾病(例如哮喘)高度相关的生物状况中，IgGB是有效的GM-CSF活性中和剂。
实施例11：利用IgGB的初步离体毒理研究
如上所解释的，中和GM-CSF活性对于许多疾病情况有治疗优势。可是同时，GM-CSF在正常的免疫系统功能中起重要作用，能对抗外来病源，例如通过嗜中性粒细胞和单核细胞而起吞噬作用。在存在治疗量的IgGB的情况下，该嗜中性白细胞和单核细胞的天然功能应当仍旧不受影响。因此，我们研究了吞噬过程的两个方面：1)消化细菌(吞噬作用)；和2)氧化爆发(burst)活性(预示细胞内杀伤)。这些研究在以下实施例中有详述。
实施例11.1：消化细菌(吞噬作用)
利用Orpegen(Heidelberg，德国)的Phagotest试剂盒，从而在肝素化的全血中确定粒细胞和单核细胞吞噬活性。该测试基于吞噬细胞调理素作用的、荧光标记的大肠杆菌的消化。然后，在流式细胞计中通过绿色荧光来检测这些细胞。将20μl荧光素标记的调理素作用的大肠杆菌加入到100μl肝素化的全血中并于37℃孵育。在0℃孵育用以作为阴性对照。10分钟后，在冰上冷却样品并加入100μl淬灭溶液(Orpegen)来停止吞噬过程。通过淬灭表面结合的细菌的FITC荧光，该溶液能区分细菌的粘附和内在化，而内在化的颗粒的荧光仍不受影响。用3ml洗涤溶液(Orpegen)进行3次洗涤步骤后，溶解红血球。剩下的白细胞用3ml洗涤溶液(Orpegen)洗一次。加入200μlDNA染色溶液，其能排除集聚的细菌或细胞，然后用流式细胞计分析细胞。通过FITC-荧光法来确定已进行吞噬作用的细胞百分比。
为了确定IgGB对吞噬作用的影响，将IgGB加入3个一致的血样中，其终浓度为10μg/ml。然后使这些3个样品于37℃与IgGB孵育不同时间，然后加入大肠杆菌。将大肠杆菌立即加入到第一个样品中，而在24和48小时后分别将大肠杆菌加入到第二个和第三个样品中。
通过粒细胞所观察到的结果：直接取血后，在存在或缺失IgGB的情况下，超过98％的粒细胞消化细菌(图17A)。将血样与IgGB孵育24小时后，测定到无IgGB的情况下下降到约92％，而在存在IgGB的情况下下降到90％(图17B)。48小时后，在缺失IgGB的情况下有81％的粒细胞是吞噬作用阳性的，而在存在IgGB的情况下有89％(图17C)。
通过单核细胞所观察到的结果：无论IgGB存在与否，直接取血后，有98％单核细胞是能进行吞噬的(图18A)。与IgGB预先孵育24小时后，90％的单核细胞是阳性的(图18B)。在没有IgGB的情况下预先孵育24小时后，有92％的单核细胞。48小时后，我们发现在不存在IgGB的情况下有81％的单核细胞，而在存在IgGB的情况下有89％为吞噬作用阳性的(图18C)。
实施例11.2：氧化爆发
利用Orpegen(Heidelberg，德国)的Phagotest试剂盒，从而在肝素化的全血中确定粒细胞和单核细胞的氧化爆发活性。该测试能确定吞噬细胞的百分比，所述细胞通过将底物二氢若丹明(DHR)123氧化成荧光R123，能产生反应性氧化剂。在流式细胞计中能鉴定出显示氧化爆发活性的细胞。肝素化的血与不同刺激物一起孵育以诱导出氧化爆发活性：将佛波醇12-豆蔻酰13-乙酯(“PMA”)作为强刺激物；将未标记的、调理素作用的大肠杆菌作为中度刺激物，并将趋化肽N-甲酰-MetLeuPhe(fMLP)作为弱刺激物。100μl全血与这些刺激物于37℃在一起孵育。作为阴性对照，不刺激而进行孵育。10分钟后，加入孵育DHR123底物溶液，并再孵育10分钟。通过氧化细胞，将DHR123转化为有荧光的R123。用3ml洗涤溶液(Orpegen)进行3次洗涤步骤后，溶解红血球。剩下的白细胞用3ml洗涤溶液(Orpegen)洗一次。加入200μlDNA染色溶液，其能排除集聚的细菌或细胞，然后用流式细胞计分析细胞。
为了确定IgGB对氧化爆发的影响，将IgGB加入3个一致的血样中，其终浓度为10μg/ml。然后使这些3个样品的每一个分成3等分并使之于37℃孵育不同时间，然后向每个等分加入大肠杆菌、fMLP或PMA。将大肠杆菌、fMLP或PMA立即加入到第一个样品的三个等分中，而在24和48小时后分别将大肠杆菌加入到第二个和第三个样品的三个等分中。缺乏IgGB的平行血样如上一样地处理，作为对照。结果如下表4所示，其中左边第二个柱中的“+”表示IgGB存在于所测试的样品等分中，而左边第二栏中的“-“表示不含IgGB的对照。
表4：IgGB对粒细胞氧化爆发行为的影响
利用单核细胞代替粒细胞，获得了相似的结果。如上所述来进行相似实验，结果如下表5所示，其中左边第二栏中的“+”表示IgGB存在于所测试的样品等分中，而左边第二栏中的“-”’表示不含IgGB的对照。
表5：IgGB对单核细胞氧化爆发行为的影响
因此整体上来说可以断定，在生理相关温度下，IgGB的存在并不对粒细胞或单核细胞的吞噬作用或氧化杀死细菌作用产生不利影响。然后，这些结果提示，在体内情况下，治疗性给药IgGB预计不会不利地影响患者的正常免疫防御。

Claims (19)

1.一种人单克隆抗体或其片段，其特异结合并中和灵长类GM-CSF，其中SEQIDNO:16所示氨基酸序列在其轻链CDR1中，SEQIDNO:17所示氨基酸序列在其轻链CDR2中，SEQIDNO:18所示氨基酸序列在其轻链CDR3中，SEQIDNO:14所示氨基酸序列在其重链CDR1中，SEQIDNO:15所示氨基酸序列在其重链CDR2中，SEQIDNO:1-13或56中任一个所示氨基酸序列在其重链CDR3中，并且其中所述人单克隆抗体或其片段具有4×10-9M至0.04×10-9M的平衡解离常数KD。
2.根据权利要求1所述的人单克隆抗体或其片段，其中SEQIDNO:16所示氨基酸序列在其轻链CDR1中，SEQIDNO:17所示氨基酸序列在其轻链CDR2中，SEQIDNO:18所示氨基酸序列在其轻链CDR3中，SEQIDNO:14所示氨基酸序列在其重链CDR1中，SEQIDNO:15所示氨基酸序列在其重链CDR2中，SEQIDNO:2所示氨基酸序列在其重链CDR3中。
3.根据权利要求1或2所述的人单克隆抗体或其片段，其特异结合灵长类GM-CSF的表位，其中在第23-27位的氨基酸序列RRLLN和/或在第65-77位的氨基酸序列GLR/QGSLTKLKGPL在所述表位中。
4.根据权利要求3所述的人单克隆抗体或其片段，其中在第28-31位的氨基酸序列LSRD、在第32-33位的氨基酸序列TA和/或在第21-22位的氨基酸序列EA进一步在所述表位中。
5.根据权利要求1、2或4所述的人单克隆抗体或其片段，其中所述灵长类是人或非人灵长类。
6.根据权利要求5所述的人单克隆抗体或其片段，其中所述非人灵长类是食蟹猴、恒河猴或长臂猿。
7.根据权利要求1、2、4或6所述的人单克隆抗体，其中所述抗体是IgG。
8.根据权利要求7所述的人单克隆抗体，其中所述IgG是IgG1或IgG4。
9.根据权利要求1、2、4、6或8所述的人单克隆抗体或其片段，其中所述片段是scFv、单结构域抗体、Fv、VHH抗体、双抗体、Fab、Fab’或F(ab)2。
10.根据权利要求1、2、4、6或8所述的人单克隆抗体或其片段，其中所述片段是串联双抗体。
11.根据权利要求1、2、4、6或8所述的人单克隆抗体或其片段，其中SEQIDNO:19、54或55中任一个所示的氨基酸序列在其轻链可变区中。
12.根据权利要求1、2、4、6或8所述的人单克隆抗体或其片段，其中SEQIDNO:20-33、52或53中任一个所示的氨基酸序列在其重链可变区中。
13.根据权利要求1、2、4、6或8所述的人单克隆抗体，其中SEQIDNO:34所示氨基酸序列在其轻链中，SEQIDNO:35-48中任一个所示氨基酸序列在其重链中。
14.根据权利要求13所述的人单克隆抗体，其中SEQIDNO:34所示氨基酸序列在其轻链中，SEQIDNO:35所示氨基酸序列在其重链中。
15.一种多核苷酸分子，其编码根据权利要求1-14中任一项所述的人单克隆抗体或其片段。
16.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的人单克隆抗体或其片段。
17.根据权利要求1-14中任一项所述的人单克隆抗体或其片段在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途，所述药物任选包含一种或多种其他炎性试剂，其中所述炎性疾病选自类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫综合征、特发性肺纤维变性、炎性肠病、色素层炎、黄斑变性、结肠炎、牛皮癣、沃勒变性、抗磷脂综合症、急性冠状动脉综合症、再狭窄、动脉粥样硬化、复发性多软骨炎、急性或慢性肝炎、肾小球肾炎和狼疮。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述类风湿性关节炎为对用TNF-α中和剂治疗有抗性的类风湿性关节炎。
19.根据权利要求1-14中任一项所述的人单克隆抗体或其片段在制备用于治疗白血病、多发性骨髓瘤、胃癌或皮肤癌的药物中的用途，所述药物任选包含一种或多种其他抗癌剂。
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