NO344249B1

NO344249B1 - Humane monoklonale antistoffer som nøytraliserer human granulocyttmakrofagkolonistimulerende faktor

Info

Publication number: NO344249B1
Application number: NO20075802A
Authority: NO
Inventors: Tobias Raum; Julia Hepp (Nee Henckel); Eva Krinner; Steven Zeman; Andreas Wolf; Sandra Bruckmaier; Silke Petsch
Original assignee: Amgen Res Munich Gmbh
Priority date: 2005-04-18
Filing date: 2007-11-12
Publication date: 2019-10-21
Also published as: EP2468774A2; US10138297B2; US20160130338A1; RU2007138341A; BRPI0608281A2; RU2012115683A; CY1116632T1; EP1874819A2; KR101704809B1; IL186486A0; EA013162B1; ZA200708201B; BRPI0608281B1; PT1874819E; CA2605402A1; HUE025134T2; US9067993B2; CN101184777B; SI1874819T1; EP1874819B1

Description

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører antistoffer og fragmenter av dem som nøytraliserer aktiviteten av human granulocyttmakrofagkolonistimulerende faktor (MG-CSF) som definert i patentkravene. Oppfinnelsen vedrører videre polynukleotidmolekyl som har en nukleotidsekvens som koder for slike antistoffer eller fragmenter.

Oppfinnelsen vedrører videre farmasøytiske sammensetninger som omfatter slike antistoffer og fragmenter av dem, så vel som slike antistoffer og fragmenter av dem til bruk i behandling av inflammatoriske sykdommer eller en tumorsykdom eller en annen tilstand med forsinket celleapoptose, økt celleoverlevelse eller proliferering.

Opprinnelig beskrevet som et potent stimulus av veksten og differensieringen av granulocytt og makrofagforløperceller in vitro, så er granulocyttmakrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF) et ca.23 kDa-glykoprotein med en fire alfa spiralbuntstruktur som binder seg til en heterodimer reseptor som er sammensatt av subenheter som tilhører typen 1 cytokinreseptorfamilien. Den stimulerer modningen av blant andre makrofager, nøytraliserer, granulocytter, eosinofiler og antigenpresenterende dendrittceller slik at deres funksjonelle kapasitet bekjemper infeksjoner. Genetiske fjerningseksperimenter, det vil si eksperimenter som stilner eller slår ut genet av interesse - her GM-CSF - i mus indikerte at GM-CSF er essensiell for opprettholdelsen av den funksjonelle aktiviteten til noen makrofagpopulasjoner slik som de som er involvert i å fjerne overflateaktive stoffer i lungen og i å respondere på visse typer infeksjons- eller immunresponser.

Mens GM-CSF har potente stimulatoriske aktiviteter in vitro på avkomsceller for nøytrofiler, eosinofiler, makrofager og i mindre grad erytroide og megakaryocytiske celler, så tyder resultater som er skaffet til veie in vivo med genknockout mus at den viktigste fysiologiske rollen til GM-CSF er å opprettholde eller å stimulere den funksjonelle aktiviteten til modne makrofager og granulocytter og å stimulere antigen presentasjon til immunsystemet. Den gjør det sist nevnte ved dets direkte effekter på dendrittceller og makrofagproduksjon, men også ved å øke uttrykket av klasse II hovedhistokompatibilitetskomplekset og Fc-reseptorene på makrofager og dendrittceller.

GM-CSF stimulerer de funksjonelle aktivitetene til nøytrofiler, eosinofiler og monocyttmakrofager. Disse inkluderer forsterking av kjemotaktisk aktivitet, økt uttrykk av cellulære adhesjonsmolekyler og økt adhesjon til overflater, og økt fagocyttisk aktivitet så vel som hemming og forsinkelse av apoptose i disse celler. Nøytrofiler representerer den første linjen med forsvar mot aggresjoner. Den programmerte døden til nøytrofiler blir forsinket ved proinflammatorisk stimuli som inkluderer GM-CSF for å sikre en passende resolusjon av inflammasjonen i tid og sted. GM-CSF stimulerer også kapasiteten som disse celler har til å styre antistoffavhengig cellecytotoksisitet og til å drepe mikroorganismer intracellulært og har en "priming" effekt på disse celler til å forsterke deres respons til påfølgende stimuli for det oksidative utbruddet (superoksid anionproduksjon), degranulering og frigjøring av antimikrobielle midler og kjemotakser. Videre så stimulerer GM-CSF frigjøringen av sekundære cytokiner og mediatorer fra disse celler inkludert IL-I, G-CSF, M-CSF og leukotriener fra neutrofiler, så vel som IL-I, TNF, IL-6, G-CSF, M-CSF og prostaglandiner fra makrofager.

Det er klart ovenfor at GM-CSF spiller en nøkkelrolle i å aktivere og opprettholde cellepopulasjonene som er nødvendig for å avparere infeksjon. I noen tilfeller så kan imidlertid aktivering av disse cellepopulasjoner være uønsket. Aktivering av de ovenfor nevnte cellelinjene når ingen patogen er til stede, fører for eksempel i mange tilfeller til akutte og/eller kroniske, inflammatoriske tilstander som i ekstreme tilfeller kan være livstruende. Overuttrykk av GM-CSF kan på samme måte føre til overskuddsimmunaktivering, noe som resulterer i inflammasjon. I slike tilfeller så kan det være ønskelig å nøytralisere aktiviteten til GM-CSF slik at symptomene til disse inflammatoriske tilstander elimineres eller i det minste dempes.

Eksempler på slik nøytraliserende aktivitet finnes i fagfeltet. WO 03068924 A2 beskriver monoklonale antistoffer som binder og nøytraliserer GM-CSF. Kanakura Y. et al., Blood.1991, Vol. No.77, 5, side 1033-1043, EP0344957 og EP0265384 beskriver monoklonale antistoffer mot GM-CSF. For eksempel så ble det funnet at et nøytraliserende anti-GM-CSF-antistoff bidro til en økning i eosinofil apoptosehastighet i perifere blodprøver. (Kankaanranta et al. (2000) Journal of Allergy and Clinical Immunology 106, 77-83). Ettersom forsterket eosinofil overlevelse er korrelert med astma, så ville en økning i eosinofil apoptose forventes å dempe astmatiske symptomer. I kroniske, inflammatoriske sykdommer slik som astma, reumatoid artritt og multippel sklerose så er nivåer av GM-CSF økt lokalt og i noen tilfeller systemisk og er blitt korrelert med den inflammatoriske prosessen i disse sykdommer.

Det er defor formålet med oppfinnelsen å forbedre måtene for å nøytralisere økt og/eller uønsket GM-CSF-aktivitet som tidligere er kjent i fagfeltet.

Følgelig så vedrører ett aspekt ifølge oppfinnelsen et humant, monoklonalt antisoff eller fragment av det som spesifikt binder seg til og nøytraliserer primat GM-CSF, der nevnte antistoff eller fragment er beskrevet heri.

Uttrykket "spesifikt binder" eller relaterte uttrykk slik som "spesifikk binding", "binde spesifikt", "spesifikt binder" og så videre som anvendt her, refererer til evnen det humane, monoklonale antistoffet eller fragmentet av det har til å diskriminere mellom primat GM-CSF og ethvert antall av andre potensielle antigener som er forskjellig fra primat GM-CSF i en slik grad at, fra en pool med flere forskjellige antigener som potensielle bindingspartnere så blir kun primat GM-CSF bundet eller blir signifikant bundet. Innen betydningen av oppfinnelsen så blir primat GM-CSF "signifikant" bundet når, fra blant en pool med flere like tilgjengelige forskjellige antigener som potensielle bindingspartnere, primat GM-CSF ble bundet minst 10 ganger, helst 50 ganger, mest ønskelig 100 ganger eller enda oftere (i en kinetisk betydning) enn ethvert annet antigen som er forskjellig fra primat GM-CSF. Slike kinetiske målinger kan utføres i et Biacoreapparat.

Som anvendt her så refererer "nøytralisering", "en som nøytraliserer", "å nøytralisere" og grammatisk relaterte varianter av dem, til delvis eller fullstendig svekking av de biologiske effektene av GM-CSF som er et resultat av modifikasjon, avbrytning og/eller opphevelse av GM-CSF-styrt signaltransduksjon, som manifesteres for eksempel i intracellulær signalering, cellulær proliferering eller frigjøring av løselige substanser, opp eller nedregulering av intracellulær genaktivering, for eksempel som resulterer i uttrykk av overflatereseptorer for ligander andre enn GM-CSF. Som en fagperson forstår så eksisterer det flere måter for å bestemme om et middel, for eksempel et antistoff det er snakk om eller fragment av det, skal klassifiseres som en nøytralisator. Som et eksempel så kan dette utføres ved en standard in vitro-test som utføres generelt som følger: I et første prolifereringseksperiment så blir en cellelinje hvis grad av proliferering er kjent for å være avhengig av aktiviteten til GM-CSF inkubert i en rekke prøver med forskjellige konsentrasjoner av GM-CSF, hvoretter inkuberingsgraden av proliferering av cellelinjen måles. Fra denne måling så blir konsentrasjonen av GM-CSF som gir halvmaksimal proliferering av cellene, bestemt. Et andre prolifereringseksperiment blir så utført som bruker i en serie med prøver det samme antall celler som anvendt i det første proliferingseksperimentet, den ovenfor bestemte konsentrasjonen av GM-CSF og denne gang, forskjellige konsentrasjoner av et antistoff eller fragment av det som mistenkes for å være en nøytralisator av GM-CSF. Celleproliferering blir igjen mål for å bestemme konsentrasjonen av antistoff eller fragment av det som er tilstrekkelig for å gi halvmaksimal veksthemming. Hvis den resulterende graf med veksthemming versa konsentrasjon av antistoff (eller fragment av det) er sigmoidal i fasong og resulterer i nedsatt celleproliferering med økt konsentrasjon av antistoff (eller fragment av det) så er noen grad av antistoffavhengig veksthemming blitt utført, det vil si aktiviteten av GM-CSF er blitt nøytralisert i noen grad. I et slikt tilfelle så kan antistoffet eller fragmentet av det betraktes som å være en "nøytralisator" i betydningen av den foreliggende oppfinnelsen. Ett eksempel på en cellelinje og graden av proliferering som er kjent for å være avhengig av aktiviteten til GM-CSF, er TF-1-cellelinjen som beskrevet i Kitamura, T. et al. (1989). J Cell Physiol 140, 323-34.

Som en fagperson vil forstå så er ikke graden av cellulær proliferering den eneste parameteren som nøytraliseringskapasiteten kan bestemmes. For eksempel så kan måling av nivået av signaleringsmolekyler (for eksempel cytokiner), nivået av utskillelse som er avhengig av GM-CSF, anvendes for å identifisere en mistenkt GM-CSF-nøytraliserer.

Andre eksempler på cellelinjer som kan anvendes for å bestemme om et antistoff det er spørsmål om eller fragment av det, er en nøytralisator av primat GM-CSF-aktivitet, inkluderer AML-193 (Lange, B. et al (1987). Blood 70, 192-9); GF-D8 (Rambaldi, A. et al (1993). Blood 81, 1376-83); GM/SO (Oez, S. et al (1990). Experimental Hematology 18, 1108-11); M07E (Avanzi, G. C. et al. (1990). Journal of Cellular Physiology 145, 458-64); TALL-103 (Valtieri, M. et al. (1987). Journal of Immunology 138, 4042-50); UT-7 (Komatsu, N. et al (1991). Cancer Research 51, 341-8).

Det humane antistoffet eller fragmentet av det i henhold til oppfinnelsen er monoklonalt. Som anvendt her så må uttrykket "monoklonal" forstås som å ha betydningen som vanligvis brukes i fagfeltet, nemlig et antistoff (eller dets korresponderende fragment) som har oppstått fra en enkel klon av en antistoffproduserende celle slik som en B-celle og som gjenkjenner en enkel epitop på det bundne antigenet. Det er spesielt vanskelig å lage humane antistoffer som er monoklonale. I motsetning til fusjoner av muse B-celler med udødeliggjorte cellelinjer, så er ikke fusjoner av humane B-celler med udødeliggjorte cellelinjer variable. Det humane, monoklonale antistoffet ifølge oppfinnelsen er dermed et resultat av å overvinne signifikante, tekniske hindringer som er akseptert å eksistere innenfor feltet antistoffteknologi. Den monoklonale naturen til antistoffet gjør det spesielt godt egnet for anvendelse som et terapeutisk middel fordi slikt antistoff vil eksistere som en enkel, homogen, molekylær spesies som kan være godt karakterisert og lages reproduserbar og renset. Disse faktorer resulterer i et produkt hvis biologiske aktivitet kan forutsis med et høyt nivå av presisjon, veldig viktig hvis et slikt molekyl skal få regulatorisk godkjennelse for terapeutisk administrering til mennesker.

Det er spesielt viktig at det monoklonale antistoffet (eller det korresponderende fragmentet) i henhold til oppfinnelsen er et humant antistoff (eller korresponderende fragment). I å vurdere et antistoffmiddel som er ment for terapeutisk administrering til mennesker, så er det veldig fordelaktig at dette antistoff er av human opprinnelse. Etter administrering til en human pasient, så vil et humant antistoff eller fragment av det mest sannsynlig ikke fremkalle en sterk immunogen respons fra pasientens immunsystem, det vil si at det ikke vil bli gjenkjent som å være et "fremmed", det vil si ikke-humant protein. Dette betyr at ingen vert, det vil si pasientantistoffer vil bli generert mot det terapeutiske antistoffet som ellers ville blokkere det terapeutiske antistoffets aktivitet og/eller akselerere det terapeutiske antistoffets eliminering fra kroppen til pasienten, og dermed forhindre det fra å anvende dets ønskede terapeutiske effekt.

Uttrykket "humant" antistoff som anvendt her, må forstås som å bety at antistoffet ifølge oppfinnelsen eller dets fragment, omfatter en aminosyresekvens eller sekvenser som finnes i det humane germline-antistoffrepertoaret. For formålet av definisjon her så kan et antistoff eller dets fragment derfor betraktes som humant hvis det består av slik (a) human germline-aminosyresekvens(er), det vil si hvis aminosyresekvensen(e) til antistoffet det er spørsmål om eller fragmentet av det er identisk til en uttrykt human germline-aminosyresekvens(er). Et antistoff eller fragment av det kan også betraktes som humant hvis det består av en sekvens som skiller seg fra dets nærmeste humane germline-sekvens med ikke mer enn det som ville være forventet på grunn av følgende av somatisk hypermutasjon. I tillegg så omfatter antistoffene til mange ikke-humane pattedyr, for eksempel gnagere slik som mus og rotter, VH CDR3-aminosyresekvenser som man kan forvente å eksistere i det uttrykte humane antistoffrepertoaret også.

Enhver slik sekvens av human eller ikke-human opprinnelse som kan forventes å eksistere i det uttrykte humane repertoaret, ville også betraktes som å være "human" for formålene ifølge den foreliggende oppfinnelsen.

I henhold til én utførelsesform ifølge oppfinnelsen så er primat GM-CSF humant (Homo sapiens) GM-CSF eller ikke-humant primat GM-CSF. Spesielt foretrukne varianter av ikke-humane primat GM-CSF inkluderer gibbon-ape (nomascus concolor, også kjent som den vestlige gibbonen med svart topp) GM-CSF og GM-CSF til aper av macaca-familien, for eksempel rhesus-ape (Macaca mulatto) GM-CSF og cynomolgusape (Macaca fasciciilaris) GM-CSF. I henhold til denne utførelsesform ifølge oppfinnelsen så utviser det humane, monoklonale antistoffet eller fragmentet av det kryssreaktivitet mellom både menneske og minst én av apeartene som er nevnt over. Dette er spesielt fordelaktig for et antistoffmolekyl som er ment for terapeutisk administrering i humane individer fordi et slikt antistoff normalt vil måtte gå gjennom en rekke tester før godkjennelse av mulighetene, noen av disse tidlige testene involverer ikke-humane dyrearter. Når man utfører slike tester så er det generelt ønskelig å anvende som en ikke-human art en art som har en høy grad av genetisk likhet med mennesker, fordi resultatene som skaffes til veie generelt vil være veldig forutsigbare for korresponderende resultater som kan forventes når det samme molekylet gis til mennesker. Slik forutsigbar kraft basert på dyretester er imidlertid i det minste avhengig delvis av komparabiliteten til molekylet og er veldig høy når, på grunn av kryssartsreaktivitet, det samme terapeutiske molekylet kan administreres til mennesker og dyremodeller. Som i denne utførelsesform ifølge oppfinnelsen, når et antistoffmolekyl kryssreagerer med det samme antigenet i mennesker som i andre nært relaterte arter, så kan tester utføres ved å anvende det samme antistoffmolekylet i mennesker som i denne nært relaterte arten, for eksempel i én av apeartene som er nevnt over. Dette øker både effektiviteten av testene i seg selv så vel som forutsigbar kraft som gis ved slike tester med hensyn til oppførselen av slike antistoffer i mennesker, den endelige arten av interesse fra et terapeutisk standpunkt.

I henhold til en videre utførelsesform ifølge oppfinnelsen så kan det humane, monoklonale antistoffet være et IgG-antistoff. Som er velkjent i fagfeltet så omfatter et IgG ikke kun de variable antistoffregionene som er ansvarlig for den veldige forskjellsantigengjenkjenningen og bindingen, men også de konstante regionene til de tung og lett antistoffpolypeptidkjedene om normalt er til stede i endogent produserte antistoffer og i noen tilfeller selv utsmykking ved én eller flere seter med karbohydrater. Slik glykosylering er generelt et kjennetegn for IgG-formatet og deler av disse konstante regionene utgjør det såkalte Fc-regionene til et fullstendig antistoff som er kjent for å fremkalle forskjellige effektorfunksjoner in vivo. I tillegg så styrer Fcregionene binding av IgG til Fc-reseptor, og forlenger følgelig halveringstid in vivo så vel som å fasilitere målsøking av IgG til steder med økt Fc-reseptortilstedeværelse -inflammert vev, for eksempel. IgG-antistoffet er fordelaktig et IgG1-antistoff eller et IgG4-antistoff, formater som er foretrukket fordi deres virkningsmekanisme in vivo er spesielt godt forstått og karakterisert. Dette er spesielt tilfelle for IgG1-antistoffer.

I henhold til en videre utførelsesform ifølge oppfinnelsen så kan fragmentet av det humane, monoklonale antistoffet være en scFv, et Fv, et diastoff, et tandem diastoff, en Fab, en Fab' eller en F(ab)2. Disse formater kan generelt deles inn i to underklasser, nemlig de som består av en enkelt polypeptidkjede, og de som omfatter minst to polypeptidkjeder. Medlemmer av den første underklassen inkluderer en scFv (som omfatter én VH-regin og én VL-region forbundet til en enkel polypeptidkjede via en polypeptidlinker);. Medlemmer av den sist nevnte undergruppen inkluderer en Fv (som omfatter en VH-region og én VL-region som separate polypeptidkjeder som er ikkekovalent assosiert med hverandre); et diastoff (som omfatter to ikke-kovalent assosierte polypeptidkjeder, som hver omfatter to antistoffvariable regioner - normalt én VH og én VL per polypeptidkjede - de to polypeptidkjedene er arrangert i hode-til-halekonformasjon som resulterer i et bivalent antistoffmolekyl); et tandem diastoff (bispesifikke enkeltkjede Fv-antistoffer som omfatter fire kovalent koblede immunoglobulinvariable - VH og VL - regioner med to forskjellige spesifisiteter, som danner en homodimer som er to ganger så stor som diastoffet beskrevet over); en Fab (som omfatter som én polypeptidkjede en fullstendig antistoff lett kjede, som i seg selv omfatter en VL-region og som en annen polypeptidkjede, en del av en antistoff tung kjede som omfatter en fullstendig VH-region og del av de tung kjedekonstante regionene, nevnte to polypeptidkjeder er forbundet intermolekylært via en interkjededisulfidbinding); en Fab' (som en Fab, over, unntatt at den har i tillegg reduserte disulfidbindinger som er på antistoff tung kjeden); og en F(ab)2 (som omfatter to Fab'-molekyler, hver Fab'-molekyl er koblet til det respektive andre Fab'-molekylet via interkjededisulfidbindinger). Generelt så tillater antistoff-fragmenter av typen som er beskrevet her over, stor fleksibilitet med hensyn til å skreddersy for eksempel de farmakokinetiske egenskapene til et antistoff som er ønsket for terapeutisk administrering for den bestemte situasjonen som foreligger. For eksempel så kan det være ønskelig å redusere størrelsen av antistoffet som gis for å øke graden av vevspenetrering når man behandler vev som er kjent for å være dårlig vaskularisert (for eksempel ledd). Under noen tilfeller så kan det også være ønskelig å øke hastigheten som det terapeutiske antistoffet elimineres fra kroppen, nevnte hastighet er generelt akselererbar ved å redusere størrelsen av antistoffet som administreres.

I henhold til en videre utførelsesform ifølge oppfinnelsen så kan nevnte humane, monoklonale antistoff eller fragment av det være til stede i monovalente monospesifikke; multivalente monospesifikke, spesielt bivalente monospesifikke; eller multivalente multispesifikke, spesielt bivalente, bispesifikke former. Generelt så kan et multivalent monospesifikt, spesielt bivalent monospesifikt antistoff slik som et fullstendig humant IgG som beskrevet her over, bringe med seg den terapeutiske fordelen at nøytraliseringen som utføres av slikt et antistoff, potensieres ved begjærlighetseffekter, det vil si at det samme antistoffet binder til flere molekyler av det samme antigenet, her primat GM-CSF. Flere monovalente, monospesifikke former av fragmenter av antistoffet ifølge oppfinnelsen er blitt beskrevet over (for eksempel en scFv eller en Fv). Multivalente multispesifikke spesielt bivalente, bispesifikke former av det humane, monoklonale anti-primat GM-CSF-antistoffet ifølge oppfinnelsen kan inkludere et fullstendig IgG hvor én bindingsarm binder til primat GM-CSF, mens den andre bindingsarmen binder til et annet antigen som er forskjellig fra primat GM-CSF. En videre multivalent multispesifikk, spesielt bivalent bispesifikk form kan fordelaktig være et humant enkeltkjedebispesifikt antistoff, det vil si en rekombinant antistoffkonstruksjon som omfatter to scFv-deler som beskrevet over, som er sammenbundet til én etterfølgende polypeptidkjede med et kort innskutt polypeptidavstandsstykke som generelt er kjent i fagfeltet (se for eksempel WO 99/54440 for et anti-CD19 x anti-CD3-bispesifikt enkeltkjedeantistoff). Én scFv-del av det bispesifikke enkeltkjedeantistoffet som finnes innen det bispesifikke enkeltkjedeantistoffet vil her spesifikt binde primat GM-CSF som satt frem over, mens den respektive andre scFv-delen av dette bispesifikke enkeltkjedeantistoffet vil binde et annet antigen bestemt til å ha en terapetusik fordel.

Ifølge en videre utførelsesform så kan det humane, monoklonale antistoffet eller fragmentet være derivatisert, for eksempel med en organisk polymer, for eksempel med én eller flere molekyler av polyetylenglykol ("PEG") og/eller polyvinylpyrrolidon ("PVP"). Som er kjent i fagfeltet så kan slik derivatisering være fordelaktig for å modulere de farmakodynamiske egenskapene til antistoffer eller fragmenter av dem. Spesielt foretrukket er PEG-molekyler derivatisert som PEG-maleimid, som muliggjøre konjugering med antistoffet eller fragmentet av det på en setespesifikk måte via sulfhydrylgruppen til en cysteinaminosyre. Av disse så er spesielt foretrukket 20 kD og/eller 40 kD PEG-maleimid, i enten forgrenet eller rettkjedet form. Det kan være spesielt fordelaktig å øke den effektive molekylvekten til mindre humane anti-primat GM-CSF-antistoff-fragmenter slik som scFv-fragmenter ved å koble det sist nevnte til én eller flere molekyler av PEG, spesielt PEG-maleimid.

Ifølge en videre utførelsesform ifølge oppfinnelsen så binder det humane, monoklonale antistoffet eller fragmentet av det, spesifikt til en epitop, spesielt til en diskontinuerlig epitop av humant eller ikke-humant primat GM-CSF som omfatter aminosyrer 23-27 (RRLLN) og/eller aminosyrer 65-77 (GLR/QGSLTKLKGPL).

Variabiliteten ved posisjon 67 innen aminosyresekvensstrekket 65-77 skissert over, reflekterer heterogenisiteten til denne del av primat GM-CSF mellom, på den ene siden, humant og gibbon GM-CSF (hvor posisjon 67 er R) og på den andre siden, aper fra macaca-familien, for eksempel cynomolgus- og rhesus-aper (hvor posisjon 67 er Q).

Som anvendt her så refererer nummereringen av humant og ikke-humant primat GM-CSF til den av modent GM-CSF, det vil si GM-CSF uten dets 17 aminosyresignalsekvens (den totale lengden av modent GM-CSF i både humane og ikke-humane primataper som er beskrevet over, er 127 aminosyrer). Sekvensen til humant GM-CSF og gibbon GM-CSF er som følger:

APARSPSPST QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNETV

EVISEMFDLQ EPTCLQTRLE LYKQGLRGSL TKLKGPLTMM

ASHYKQHCPP TPETSCATQI ITFESFKENL KDFLLVIPFD CWEPVQE

Sekvensen til GM-CSF i visse medlemmer av macaca apefamilien slik som for eksempel rhesusape og cynomolgusape er som følger:

APARSPSPGT QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNKTV

EVVSEMFDLQ EPSCLQTRLE LYKQGLQGSL TKLKGPLTMM

ASHYKQHCPP TPETSCATQI ITFQSFKENL KDFLLVIPFD CWEPVQE

Den minimale epitopen, fordelaktig en diskontinuerlig epitop som er bundet av det humane, monoklonale antistoffet ifølge oppfinnelsen (eller fragment av det) som beskrevet over, er indikert i den ovenfor nevnte GM-CSF-sekvensen som er uthevet. Som anvendt her så må uttrykket "diskontinuerlig epitop" forstås som minst to ikketilstøtende aminosyresekvensstrekk innen en gitt polypeptidkjede, her modent humant og ikke-humant primat GM-CSF som samtidig og spesifikt (som definert over) er bundet av et antistoff. Ifølge denne definisjonen så kan slik samtidig spesifikk binding være av GM-CSF-polypeptidet i lineær form. Man kan her billedgjøre det modne GM-CSF-polypeptidet som danner en utvidet sløyfe, i én region hvor de to sekvensene indikert uthevet over, stilt på linje for eksempel mer eller mindre parallelt og i nærhet av hverandre. I denne tilstand så er de spesifikt og samtidig bundet av antistoff-fragmentet ifølge oppfinnelsen. I henhold til denne definisjonen så kan samtidig spesifikk binding av de to sekvensstrekkene med modent GM-CSF som er indikert over, også ha formen av antistoff som binder til en konformasjonell epitop. Her har modent GM-CSF allerede dannet dets tertiære konformasjon som den normalt eksisterer in vivo (Sun, H. W., J.

Bernhagen, et al. (1996). Proc Natl Acad Sci USA 93, 5191-6). I denne tertiære konformasjon så er polypeptidkjeden av modent GM-CSF foldet på en slik måte at den bringer de to sekvensstrekkene som er indikert over, i rommelig nærhet, for eksempel på den ytre overflaten av en bestemt region av modent, foldet GM-CSF, hvor de så gjenkjennes ved hjelp av deres tredimensjonale konformasjon i sammenheng med de omgivende polypeptidsekvensene.

I en foretrukket utførelsesform så omfatter den ovenfor nevnte (diskontinuerlige) epitopen videre aminosyrer 28-31 (LSRD), i kursiv i sekvensen over av humant og ikke-humant primat GM-CSF. I en bestemt foretrukket utførelsesform så omfatter begge de ovenfor nevnte (diskontinuerlige) epitopene videre aminosyrene 32-33 (TA) og/eller aminosyrer 21-22 (EA), hvor hver strekk er understreket i sekvensene over av humant og ikke-humant primat GM-CSF.

Foreliggende opprinnelse angår humane, monoklonale antistoffer eller fragmentet derav omfattende en lett kjedevariabel region som omfatter en aminosyresekvens som er satt frem i SEKV.ID. NR.19 og en tungkjedevariabel region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.21; eller en lett kjedevariabel region omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.19 og en tungkjedevariabel region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.22; eller en lett kjedevariabel region omfattende en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.19 og en tungkjedevariabel region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.52; eller en lett kjedevariabel region omfattende en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.19 og en tungkjedevariabel region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.53.

Foreliggende opprinnelse angår også humane, monoklonale antistoffer eller fragmenter derav omfattende en lett kjedevariabel region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.54 og en tungkjedevariabel region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.23; eller en lett kjedevariabel region omfattende en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.54 og en tungkjedevariabel region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR. 26; eller en lett kjedevariabel region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.54 og en tungkjedevariabel region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.28.

Foreliggende opprinnelse angår også humane, monoklonale antistoffer eller fragmenter derav omfattende en lett kjedevariabel region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.55 og en tungkjedevariabel region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.21; eller en lett kjedevariabel region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.55 og en tungkjedevariabel region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.22.

Foreliggende opprinnelse angår også humane, monoklonale antistoffer eller fragmenter derav omfattende en lett kjede variable region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.34 og en tung kjede variable region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.35; eller en lett kjede variable region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.34 og en tung kjede variable region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.37; eller en lett kjede variable region somomfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.34 og en tung kjede variable region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.40; eller en lett kjede variable region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.34 og en tung kjede variable region somomfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.42; eller en lett kjede variable region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.34 og en tung kjede variable region som omfatter en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.48.

I en særlig foretrukken utførelsesform angår oppfinnelsen det humane monoklonale antistoffet eller fragment derav, omfattende en lettkjede variable region omfattende en aminosyresekvens som satt frem i SEKV. ID. NR.19 og videre omfattende en tungkjede variable region omfattende en aminosyresekvens som satt frem i SEKV. ID.NR. 21 og 52.

I en anne særlig foretrukken utførelsesform angår oppfinnelsen det humane monoklonale antistoffet eller fragment derav, omfattende en lettkjede variable region omfattende en aminosyre sekvens som satt frem i SEKV. ID. NR.34 og omfattende en tungkjede variable region omfattende en aminosyresekvens som satt frem i SEKV. ID.NR. 35.

De humane, monoklonale antistoffmolekyler og/eller fragmenter av dem ifølge oppfinnelsen er særlig fordelaktige som nøytralisatorer av aktiviteten til primat, spesielt humant GM-CSF.

For det første så gjenkjenner de primat GM-CSF veldig spesifikt, det vil si at for en blanding av primat GM-CSF med andre primatkolonistimulerende faktorer (for eksempel primat G-CSF og M-CSF) så diskriminerer bindingsmolekylene i henhold til disse spesielt foretrukne utførelsesformene veldig for primat GM-CSF, mens de andre kolonistimulerende faktorene i det samme miljøet ikke gjenkjennes. Dette betyr at et humant monoklonalt antistoff eller fragment av det ifølge disse utførelsesformer når de gis til et menneske, ville forventes å spesifikt binde seg til og nøytralisere kun det ønskede målet, mens andre uønskede mål blir verken bundet eller nøytralisert. Til slutt så fører dette til en høy grad av forutsigbarhet med hensyn til den terapeutiske virkningsmåten in vivo.

For det andre så binder bindere ifølge oppfinnelsen til primat GM-CSF med ekstremt høy affinitet. KD-verdier fra ca.4 x 10<-9>M ned til så lavt som ca.0,04 x 10<-9>M, det sist nevnte korresponderer til ca.40 pM, er blitt observert for molekyler av denne klasse. Fordi kinetiske på-hastigheter til slike molekyler i vandige media kontrolleres stort sett ved diffusjon og kan derfor ikke forbedres utover det de lokale diffusjonsbetingelsene vil tillate under fysiologiske betingelser, så oppstår lav KDprimært som et resultat av den kinetiske av-hastigheten, kav, som for den høyeste affinitets antistoffbinderen er ca.

10<-5>s<-1>. Dette betyr at med én gang komplekset mellom et humant monoklonalt antistoff eller et fragment av det i henhold til enhver av disse utførelsesformer ifølge oppfinnelsen på den ene siden og primat GM-CSF på den andre siden, dannes, så separeres det ikke lett eller i det minste ikke raskt. For bindingsmolekyler som er ment å være nøytralisatorer av biologisk aktivitet, så er disse karakteristikaene veldig fordelaktige fordi den ønskelige nøytraliseringseffekten normalt vil vare kun så lenge som molekylet som den biologiske aktiviteten skal nøytraliseres hos (her primat GM-CSF) forblir bundet av det nøytraliserende bindingsmolekylet. Derfor så vil et nøytraliseringsmolekyl som forblir bundet til dets mente mål i lang tid fortsette å nøytralisere i et korresponderende tidsrom.

Den høye bindingsaffiniteten til humane, monoklonale antistoffer eller fragmenter av dem til primat GM-CSF har en tilleggsfordel. Antistoffer eller fragmenter av det vil normalt elimineres fra blodstrømmen hos en pasient på en størrelsesavhengig måte, hvor mindre molekyler blir utskilt og eliminert før de større. Fordi komplekset av de to polypeptidene - antistoff eller antistoff-fragment og bundet GM-CSF - er tydelig større enn antistoffet alene, så har den lave kavsom er nevnt over, den effekt at terapeutisk nøytralisator utskilles og elimineres fra pasientens kropp saktere enn det som ville være tilfelle hvis den ikke bandt GM-CSF. Dermed så øker ikke kun størrelsen på nøytraliseringsaktiviteten, men også varigheten in vivo.

Til slutt så er nøytraliseringsaktiviteten som er bestemt for bindere i henhold til disse spesielt foretrukne utførelsesformer, overraskende høy. Som vil bli beskrevet i mer detalj herunder så blir nøytraliseringsaktivitet målt in vitro ved å anvende en TF-1-veksthemmingsanalyse (Kitamura, T. et al. (1989). J Cell Physiol 140, 323-34). Som en indikasjon på nøytraliseringspotensial så blir IC50-verdier målt, IC50representerer konsentrasjonen av humant, monoklonalt antistoff eller fragment av det i henhold til enhver av disse utførelsesformer ifølge oppfinnelsen som kreves for å fremkalle en halvmaksimal hemming av TF-1-celleproliferering. For humane, monoklonale antistoffer eller fragmenter av dem i henhold til enhver av disse utførelsesformer ifølge oppfinnelsen så ble en IC50-verdi på ca.3 x 10<-10>M eller ca.0,3 nM bestemt.

Bindingsmolekylene i henhold til enhver av disse utførelsesformer ifølge oppfinnelsen er derfor veldig potente nøytralisatorer for aktiviteten til primat GM-CSF.

Som oppsummering da så utviser et humant, monoklonalt antistoff eller fragment av det i henhold til enhver av de ovenfor nevnte utførelsesformene ifølge oppfinnelsen høy grad av diskriminering for det ønskede antigenet, binder dette antigen veldig tett og i lengre tid og utviser veldig potent nøytraliserende aktivitet for den lange tiden hvor det forblir bundet. Samtidig så senker den lange vedvarenheten til binderantigenkomplekset eliminering av denne binder fra kroppen og forlenger dermed varigheten av den ønskede, terapeutiske effekten in vivo.

Et videre aspekt ifølge oppfinnelsen tilveiebringer et polynukleotidmolekyl som har en nukleotidsekvens som koder for et humant monoklonalt antistoff eller fragment som beskrevet heri.

Et videre aspekt ifølge oppfinnelsen tilveiebringer en farmasøytisk sammensetning som omfatter et humant, monoklonalt antistoff eller fragment av det eller et polynukleotidmolekyl som beskrevet heri. I henhold til denne oppfinnelse vedrører uttrykket "farmasøytisk sammensetning" seg til en sammensetning for administrering til en pasient, helst en human pasient. I en foretrukket utførelsesform så omfatter den farmasøytiske sammensetningen en sammensetning for parenteral, transdermal, intraluminal, intraarteriell, intratekal og/eller intranasal administrering eller ved direkte injeksjon inn i vev. Det regnes spesielt med at den nevnte farmasøytiske sammensetning administreres til en pasient via infusjon eller injeksjon. Administrering av de passende sammensetningene kan utføres på forskjellige måter, for eksempel ved intravenøs, intraperitoneal, subkutan, intramuskulær, topikal eller intradermal administrering. Den farmasøytiske sammensetningen ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan videre omfatte en farmasøytisk akseptabel bærer. Eksempler på slike farmasøytiske bærere er vel kjent i fagfeltet og inkluderer fosfatbufret saltvannsløsninger, vann, emulsjoner, slik som olje/vannemulsjoner, forskjellige typer bløtgjøringsmidler, sterile løsninger, liposomer og så videre. Sammensetninger som omfatter slike bærere kan formuleres ved hjelp av kjente fremgangsmåter. Disse farmasøytiske sammensetningene kan administreres til individet ved en passende dose. Dosekuren vil bestemmes av den praktiserende legen og kliniske faktorer. Som er velkjent i medisinsk fagfelt, så er doser for enhver pasient avhengig av mange faktorer, inkludert pasientens størrelse, kroppsoverflateareal, alder, den bestemte forbindelsen som skal administreres, kjønn, tid og administreringsrute, generell helse og andre medikamenter som blir administrert samtidig. Tillaginger for parenteral administrering inkluderer sterile, vandige eller ikkevandige løsninger, suspensjoner og emulsjoner. Eksempler på ikke-vandige løsemidler er propylenglykol, glykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer slik som olivenolje og injiserbare organiske estere slik som etyloleat. Vandige bærere inkluderer vann, alkohol/vandige løsninger, emulsjoner eller suspensjoner, inkludert saltløsning og bufret medium. Parenterale verktøy inkluderer natriumkloridløsning, Ringers dekstrose, dekstrose og natriumklorid, laktert Ringers eller fikserte oljer. Intravenøse verktøy inkluderer væske og næringsfornyere, elektrolyttfornyere (slik som de basert på Ringers dekstrose) og lignende. Konserveringsmidler og andre tilleggsstoffer kan også være til stede slik som for eksempel antimikrobielle, antioksidanter, chelateringsmidler, uvirksomme gasser og lignende. I tillegg så kan den farmasøytiske sammensetningen ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatte proteinlignende bærere, som for eksempel serumalbumin eller immunglobulin helst med human opprinnelse. Det blir regnet med at den farmasøytiske sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan omfatte i tillegg til det humane, monoklonale antistoffet eller fragmentet av det (som beskrevet ifølge denne oppfinnelsen), videre biologisk aktive midler, avhengig av den nevnte anvendelsen av den farmasøytiske sammensetningen. Slike midler kan være medikamenter som virker på det gastrointestinale systemet, medikamenter som virker som cytostatika, medikamenter som forhindrer hyperurikemi, medikamenter som hemmer immunreaksjoner (for eksempel kortikosteroider), medikamenter som modulerer den inflammatoriske responsen, medikamenter som virker på det sirkulatoriske systemet og/eller midler slik som cytokiner som er kjent i fagfeltet.

Et videre aspekt ifølge oppfinnelsen tilveiebringer et humant, monoklonalt antistoff eller fragment av det som beskrevet her over eller et polynukleotidmolekyl som beskrevet her over eventuelt omfattende én eller flere antiinflammatoriske midler, til bruk i behandlingen av inflammatoriske sykdommer. De inflammatoriske sykdommene blir fordelaktig valgt fra gruppen som består av reumatoid artritt (RA) (som inkluderer RA som er resistent for behandling med TNF-alfa-nøytralisatorer), astma, multippel sklerose (MS), kronisk obstruktiv lungesykdom (COPD), akutt respiratorisk distresssyndrom (ARDS), Crohns sykdom, idiopatisk lungefibrose (IPF), inflammatorisk Bowel-sykdom (IBD), uveitt, makulær degenerering, kolitt, psoriasis, Wallerian degenerering, antifosfolipidsyndrom (APS), akutt koronart syndrom, restinose, aterosklerose, tilbakekommende polykondritt (RP), akutt eller kronisk hepatitt, mislykkede, ortopediske implantater, glomerulonefritt, lupus eller autoimmune lidelser.

Av spesiell interesse er det humane, monoklonale antistoffet eller fragmentet av det i henhold til oppfinnelsen til bruk i behandlingen av RA (inkludert RA som er resistent for behandling med TNF-alfa-nøytralisatorer), astma, MS og/eller Crohns sykdom.

Med hensyn til RA, astma og/eller MS så er det to populære teorier med hensyn til patogenesen av reumatoid artritt (RA). Den første sier at T-cellen gjennom interaksjon med et enda uidentifisert antigen, er den primære cellen som er ansvarlig for å initiere sykdommen så vel som for å drive den kroniske, inflammatoriske prosessen. Denne teori er basert på den kjente assosiasjonen av RA med klasse II hovedhistokompatibilitetsantigener, det store antallet CD4+ T-celler og skjev T-cellereseptorgenbruk i RA-synoviumet. GM-CSF er kjent for å forsterke antigenpresenterende funksjon gjennom å øke overflateklasse II MHC-uttrykk og GM-CSF blir produsert av T-celler, noe som indikerer en putativ rolle for GM-CSF i sykdomsprogresjon i henhold til den T-cellebaserte hypotesen.

Den andre teorien sier at mens T-celler kan være viktig i å initiere sykdommen så viderefører kronisk inflammasjon seg selv ved makrofager og fibroblaster på en T-celleuavhengig måte. Denne teori er basert på det relative fraværet av aktiverte T-cellefenotyper i kronisk RA og overvekten av aktiverte makrofager og fibroblastfenotyper. GM-CSF er en potent stimulator av makrofager og fremmer proliferering av monocytter og makrofager.

GM-CSF kjent for å bli produsert primært av "effektor"-celler (makrofager) og bindevevsceller (fibroblaster) uttrykkes i overvekt i RA-synovium og synovial væske, målt ved ELISA eller mRNA-studier. Ifølge "makrofagfibroblastteorien" til RA, så synes disse to celletyper å være hovedsakelig ansvarlig for å danne en selv-videreførende tilstand med kronisk inflammasjon hvor T-celledeltagelse ikke lenger er kritisk. I dette scenariet så utskiller den aktiverte makrofagen kontinuerlig IL-1 og TNF som opprettholder den synoviale fibroblasten i en aktivert tilstand. Fibroblastene, igjen, utskiller store mengder av: a) cytokiner - cytokiner - IL6, IL8 og GM-CSF; b) prostaglandiner og c) proteaseenzymer. GM-CSF tilbakeføres for å fremme modningen av nylig rekrutterte monocytter til makrofager. IL-8 og IL-6 bidrar til rekrutteringen og/eller aktiveringen av enda andre cellepopulasjoner, mens prostaglandinene og proteasene virker direkte for å bryte ned eller å ødelegge nærliggende bindevev slik som bein og brusk.

Med hensyn til Crohns sykdom så har rekombinant human granulocytt/makrofagkolonistimulerende faktor (rGM-CSF) fra gjær vist seg å være effektiv i behandlingen av moderat til alvorlig Crohns sykdom (Dieckgraefe BK, Korzenik JR (2002). Lancet 360, 1478-80). Flere oversiktsartikler har siden da spekulert om den terapeutiske effekten av dette potente proinflammatoriske cytokinet i denne sykdom som antas å være av en inflammatorisk natur. Mulige forklaringer på virkningsmåten til rGM-CSF inkluderer en immundefisient komponent i Crohns sykdom, Th 2 vridning og ekspansjon av dendrittceller som fremmer differensiering av regulatoriske T-celler (Wilk NJ, Viney JL (2002). Curr Opin Invest Drugs 3, 1291-6; Folwaczny C et al. (2003). Eur J Gastroenterol Hepatol 15, 621-6). Oppfinnerne tror at en enklere virkningsmåte som samtidig er mer konsistent med den kjente rollen til GM-CSFi andre proinflammatoriske sykdommer, kan foreslås.

GM-CSF er én av de mest potente adjuvanser som er kjent som er hvorfor cytokinet koadministreres i flere pågående vaksinasjonsutprøvinger. Samtidig så er GM-CSF immunogent (Ragnhammar P et al. (1994). Blood 84, 4078-87). En nylig studie (Rini B et al. (2005) Cytokine 29, 56-66) har vist at daglig subkutan behandling med rGM-CSF fra gjær, som utført i Crohns sykdomsutprøvingen (Dieckgraefe BK, Korzenik JR (2002). Lancet 360, 1478-80), førte innen tre måneder i 87 % (13/15) av prostatacancerpasienter til utviklingen av antistoffer mot cytokinet.60 % av pasienter (9/15) utviklet (polyklonale) GM-CSF-nøytraliserende antistoffer. Muligheten for en nøytraliseringsrespons for GM-CSF ble ikke undersøkt i Crohns sykdomsutprøvingen, flere nivåer av GM-CSF ble heller ikke bestemt under terapi. Innen omfanget av denne utførelsesform ifølge oppfinnelsen så blir det overveid at Crohns sykdomspasienter behandlet med rGM-CSF ikke direkte responderte kun på den immunstimulatoriske aktiviteten av cytokinet, men også i det minste delvis responderte klinisk på en antistoffrespons som nøytraliserte både det administrerte så vel som det endogene GM-CSF som er kjent for å være overprodusert i Crohns sykdom (Agnholt J et al. (2004) Eur J Gastroenterol Hepatol 16, 649-55). Nøytralisering av anti-GM-CSF-antistoffer kan så ha en lignende terapeutisk aktivitet i Crohns sykdom som rGM-CSF og bør betraktes som en alternativ terapeutisk tilvenningsmåte som blir overveid her over.

Et videre aspekt ifølge oppfinnelsen tilveiebringer et humant, monoklonalt antistoff eller fragment av det som beskrevet her over eller et polynukleotidmolekyl som beskrevet her over somvalgfritt i tillegg omfatter én eller flere anticancermidler til bruk i behandlingen av en tumorsykdom eller annen tilstand med forsinket celleapoptose økt celleoverlevelse eller proliferering. En foretrukket tumorsykdom er en cancer hvor leukemi, multippelt myelom, magekarsinom eller hudkarsinom er spesielt foretrukket.

Olver et al. ((2002) Cancer Chemother Pharmacol.50, 171-8) benyttet subkutant GM-CSF-antagonisten E21R i pasienter med solide tumorer kjent for å uttrykke GM-CSF-reseptorer, noe som førte til kun en temporær reduksjon i PSA-serumnivåene. Bruken av denne GM-CSF-antagonisten i akutt myeloid leukemi ("AML") avslørte videre ikkeklinisk aktivitet (Jakupovic et al. (2004), Blood 103, 3230-2.). Enda videre så avslørte bruken av anti-GM-CSF-monoklonale antistoffer på AML-pasienter ikke en antileukemisk effekt til tross for tilstrekkelige serumnivåer og biologisk aktivitet av antistoffet in vivo (Bouabdallah et al. (1998) Leuk Lymphoma 30, 539-49). Forfatterne konkluderte dermed med at behandling med anti-GM-CSF-antitoffer ikke er effektive i AML-pasienter.

Oppfinnelsen vil nå beskrive i mer detalj i de følgende eksemplene og figurene, en oversikt som følger:

Fig. 1 absorpsjonsintensitet (direkte proporsjonal med bindingsstyrke) for en rekke antirhGM-CSF scFv-molekyler skaffet tilveie etter fire eller fem runder med panorering i fagdisplay som bestemt ved ELISA

Fig. 2 gjennomsnittlig fluorescensintensitet (inverst proporsjonal med nøytraliseringsstyrke) for en rekke anti-rhGM-CSF scFv og andre testmolekyler som bestemt ved en flowcytometrisk basert analyse.

Fig. 3 resultater av en TF-1-prolifereringshemmingsanalyse utført ved å anvende antirhGM-CSF scFv-molekylet 5-306.

Fig. 4 absorpsjonsintensitet (direkte proporsjonal med bindingsstyrke) for en rekke humane anti-rhGM-CSF scFv-molekyler skaffet tilveie etter fire eller fem runder med panorering i fagdisplay som bestemt ved ELISA

Fig. 5 resultater av en TF-1-prolifereringshemmingsanalyse utført ved å anvende diverse representative, humane anti-rhGM-CSF scFv-treff.

Fig. 6 bindingsspesifisitet av humane, monoklonale antistoffer for humant GM-CSF og andre humane kolonistimulerende faktorer.

Fig. 7 overflateplasmonresonansmålinger som karakteriserer kinetikkbinding til humane, monoklonale anti-GM-CSF-antistoffer og fragmenter av dem.

Fig. 8A sekvensoppstilling av ikke-human, primat GM-CSF og human GM-CSF.

Fig. 8B peptidspot-radiogram som viser binding av et fragment av et humant, monoklonalt anti-GM-CSF til humant GM-CSF.

Fig. 9 kvalitative resultater av en TF-1-prolifereringshemmingsanalyse utført ved å anvende forskjellige, representative, humane anti-rhGM-CSF scFv-antistoff-fragmenter.

Fig. 10 kvantitative resultater av TF-1-prolifereringshemmingsanalysen utført ved å anvende diverse representative, humane anti-rhGM-CSF IgG-er og korresponderende scFv-fragmenter.

Fig. 11 kvantitative resultater av IL8-produksjonsanalysen utført ved å anvende diverse representative, humane anti-rhGM-CSF scFv-antistoff-fragmenter.

Fig. 12 kvantitative resultater av TF-1-prolifereringshemmingsanalysen utført ved å anvende diverse representative, humane anti-macGM-CSF IgG-er og korresponderende scFv-fragmenter.

Fig. 13 resultater av komparativ bindingsstudie som viser selektivitet av binding av anti-GM-CSF-antistoff IgG B for rekombinant humant GM-CSF og GM-CSF fra diverse ikke-primate arter.

Fig. 14 resultater av analyse som undersøker avhengigheten av å nøytralisere potensialet til anti-GM-CSF-antistoff IgG B på glykosyleringen av GM-CSF.

Fig. 15 resultater av studie av effekten av anti-GM-CSF-antistoff IgG B på GM-CSF-styrt eosinofil overlevelse.

Fig. 16 resultater av studie av effekten av anti-GM-CSF-antistoff IgG B på GM-CSF-styrt eosinofil aktivering.

Fig. 17 resultater av eks vivo-toksilogistudier ved å anvende anti-GM-CSF-antistoff IgG B, målt basert på fagocytose (A-C) og oksidativ sprenging (D-F) ved granulocytter.

Fig. 18 resultater av eks vivo-toksilogistudier ved å anvende anti-GM-CSF-antistoff IgG B, målt basert på fagocytose (A-C) og oksidativ sprenging (D-F) ved monocytter.

EKSEMPLER

Eksempel 1

Fremskaffing av det rekombinante, humane ("rh") GM-CSF-antigenet anvendt for genereringen av nøytraliserende, humane antistoffer og fragmenter av dem

Eksempel 1.1:

Kloning, uttrykk og rensing av rhGM-CSF-antigenet

Genet som koder for humant GM-CSF-antigen ble subklonet inn i pET22b(+)vektoren (Novagene, USA) fra uttrykksvektoren pORF-hGM-CSF (Novagen, USA) via de PCR-introduserte restriksjonsenzymgjenkjenningssetene Ndel og Xhol. Det hGM-CSF-kodende genet i pET22b(+) ble fusert til pelB-ledersekvensen og er passende for uttrykk i E. coli periplasma.

Proteinproduksjon og rensing ble utført som beskrevet av produsenten. I korthet så ble E. coli BL21DE3 transformert med uttrykksplasmidet og dyrket ved 37 °C i selektivt medium til en optisk tetthet på 0,5-0,8 ved 600 nm. Proteinproduksjon ble indusert ved tilsetting av IPTG til 1 mM og reduksjon av temperatur til 25 °C. En periplasmatisk preparering ble utført ved osmotisk sjokk ved å anvende 20 % sukroseløsning for selektivt å ødelegge celleveggen og å opprettholde en intakt cellemembran. Nativt hGM-CSF inneholder to disulfidbroer og uttrykk i det oksidative periplasma til E. coli tillater dannelsen av disse funksjonelt viktige disulfidbroene.

Rekombinant, humant GM-CSF ("rhGM-CSF") ble renset i en totrinns rensingsprosess via immobilisert metallaffinitetskromatografi (IMAC) og gelfiltrering. Et Akta® FPLC System (Pharmacia) og Unicorn® Software ble anvendt for kromatografi. Alle kjemikalier var av forskningsgrad og kjøpt fra Sigma (Deisenhofen) eller Merck (Darmstadt).

IMAC ble utført ved å anvende en Qiagen Ni-NTA Superflow-kolonne i henhold til protokollen tileiebrakt av produsenten. Kolonnen ble ekvilibrert med buffer A2 (20 mM natriumfosfat pH 7,2, 0,4 M NaCl) og det periplasmatiske preparatet ("PPP") (100 ml) ble satt på kolonnen (2 ml) ved en strømningshastighet på 2 ml/min. Kolonnen ble vasket med 5 kolonnevolumer 5 % buffer B2 (20 mM natriumfosfat pH 7,2, 0,4 M NaCl, 0,5 M imidazol) for å fjerne ubundet prøve. Bundet protein ble eluert ved å anvende 100 % buffer B2 i 5 kolonnevolumer. Eluerte proteinfraksjoner ble slått sammen for videre rensing.

Gelfiltreringskromatografi ble utført på en Superdex 200 Prep graderingskolonne (Pharmacia) ekvilibrert med PBS (Gibco). Eluerte proteinprøver (strømningshastighet 1 ml/min) ble utsatt for standard SDS-PAGE og Western Blot for deteksjon. Før rensing så ble kolonnen kalibrert med molekylvektbestemmelse (molekylvekt markørkitt, Sigma MW GF-200). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved å måle OD 280 nm og beregnet ved å anvende den sekvensspesifikke molekylære ekstinksjonskoeffisienten.

Eksempel 1.2:

Biotinylering av rhGM-CSF-antigenet

For fagbiblioteksseleksjon så ble rhGM-CSF-antigen produsert i E. coli (se over ) biotinylert. Biotinylering ble utført i PBS som inneholdt 5 % DMSO (Sigma) med et fem gangers molart overskudd av EZ-Link Sulfo NHS-LC-LC -Biotin (Pierce) i 1 time ved romtemperatur i en prøveblander (Dynal). For separeringen av fritt Biotin og biotinylert rhGM-CSF-antigen så ble anionutbyttelseskromatografi (Resource Q, Amersham Biosciences) ble utført i henhold til standard protokoller. Kromatografien resulterte i begge tilnærmingsmåter (benevnt A og B, beskrevet under) i to elueringstopper. I tilfelle A så ble den primære, eluerte toppen fraksjonert igjen via et andre anionutbyttelseskromatografitrinn (samme betingelser som over) til to elueringstopper. Etterpå så ble de tilveieskaffede fraksjonene seriefortynnet (fortynninger 1:2; startkonsentrasjon 6 μg/ml bestemt fra topphøyden) overtrukket i 96 brønners ELISA-plater og detektert. Deteksjon ble utført ved å anvende A) et anti-humant GM-CSF-antistoff M500-A (Sigma, 2,5 μg/ml i PBS/1 % BSA) detektert med pepperrotperoksidasekonjugert geite antimus Fab2-spesifikt polyklonalt antistoff (Dianova, 1 μg/ml PBS/1 % BSA) og B) morsantistoffet (1 μg/ml PBS/1 % BSA) detektert med pepperrotperoksidase-konjugert geite anti-rotte-polyklonalt antistoff (Dianova, 1 μg/ml PBS/1 % BSA). Den vellykkede biotinyleringen ble demonstrert med et lignende ELISA-eksperiment som ble utført ved å anvende pepperrotperoksidasekonjugert streptavidin (Dako, 1 μg/ml PBS/1 % BSA). Signalet ble fremkalt ved å tilsette OPD-substratløsning (Sigma) og detektert med en bølgelengde på 492 nm (referansebølgelengde 620 nm). For å estimere graden av biotinylering så ble den ovenfor nevnte ELISA utført ved å anvende anionutbyttelsesfraksjonene direkte eller etter et inkuberingstrinn med 6,7 x 10<7>streptavidinmagnetiske kuler (Dynabeads M-280-Streptavidin, Dynal) med forsiktig agitering i 30 min. Den resulterende supernatanten ble overtrukket på brønnene i 96-brønners ELISA-plater og detektert som beskrevet over. ELISA-resultatene viste at den andre eluerte toppen inneholdt det biotinylerte rhGM-CSF og at ca.95 % av det eluerte rhGM-CSF var konjugert. Konsentrasjoner ble estimert ved å anvende det opprinnelige materialet som en standard og konsentrasjonene viste seg å være ca.20 μg/ml.

Den bevarte bioaktiviteten til det biotinmerkede rhGM-CSF ble bekreftet i TF-1-prolifereringsanalyser i henhold til protokoller beskrevet under i karakteriseringen av enkeltkjedeantistoffene (scFvs).

Eksempel 1.3:

Fluoresceinmerking av rhGM-CSF-antigenet

For bindingsstudier på TF-1-celler så ble rekombinant humant GM-CSF-antigen produsert i E. coli (se eksempel 1.2 over) konjugert med fluorescein-5(6)-karboksamidokaproinsyre N-succinimidylester (Fluka, fluorescein-NHS). Konjugattrinnet ble utført i boratbuffer (0,05 M borsyre, 0,1 M NaCl, pH 8,5) som inneholdt 17,5 % DMSO med et fem gangers molart overskudd av fluorescein-NHS i 1 time ved romtemperatur i en prøveblander. Etterpå så ble gelfiltrering (Sephadex G25, Amersham Biosciences) utført for å dissosiere fluoresceinmerket rhGM-CSF-antigen fra fritt fluorescein-NHS. Gelfiltreringen resulterte i to topper målt ved en bølgelengde på 485 nm (referansebølgelengde 535 rm), mens den primære toppen representerer det FITC-merkede rhGM-CSF. Graden av merking ble bestemt ved å definere F/P-forholdet til konjugatet ([mg/ml] = (A280- 0,35 x A493) x 1,08; F/P=(A493/73.000) x (15.000/([mg/ml])). Den bestemte konsentrasjonen var 0,041 mg/ml med et F/P-forhold på 1.2.

Eksempel 2

Generering og seleksjon av nøytraliserende, humane anti-GM-CSF-antistoffer og fragmenter av dem

Eksempel 2.1:

Kloning av moder-VH fra hybridoma HB-9569

Som anvendt gjennom de foregående eksemplene så betegner en "moder"-V-region at V-regionen det er spørsmål om kommer fra et fullstendig immunoglobulinmolekyl.

Som anvendt gjennom de foregående eksemplene så betegner et "treff" et molekyl som er kjent for å binde et antigen av interesse, men hvor bindingen ikke er blitt kvantitativt evaluert. Et "treff" er et molekyl i et tidlig trinn av karakterisering som småskalaproduksjon allerede er blitt utført for. Et slikt molekyl er i valideringstrinnet for karakterisering.

Som anvendt gjennom de foregående eksemplene så betegner et "leder"-molekyl et molekyl hvor bindings- og nøytraliseringspotensialene for molekylet er blitt kvantifisert. Produksjon av et "leder"-molekyl har allerede funnet sted i stor skala.

I de følgende eksemplene så blir en mulig måte å generere en fullstendig human monoklonal antistoffnøytralisator for humant GM-CSF og generering av fragmenter av dem, beskrevet.

Hensikten med dette eksperiment er isoleringen og subkloningen av genet som koder for VH i moder-mAb produsert av hybridomacellelinjen HB-9569. Hybridoma HB-9569 ble skaffet tilveie fra ATCC (USA). Hybridomaceller ble dyrket i ATCC fullstendig vekstmedium: RPMI 1640 medium med 2 mM L-glutamin justert til å inneholde 1,5 g/l natriumbikarbonat, 4,5 g/l glukose, 10 mM HEPES og 1,0 mM natriumpyruvat og supplementert med 0,05 mM 2-merkaptoetanol, føtalt bovint serum 10 % ved 37 °C med 5 % CO2. For total RNA-tillaging så ble 1 x 10<7>celler anvendt og RNA ble laget som beskrevet i produktmanualen til Qiagen Omni-Skript-kittet (Qiagen, Tyskland). cDNA ble syntetisert i henhold til standard fremgangsmåter (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 2. utgave).

For isoleringen av tungkjede V-region DNA så ble RT-PCR utført ved å anvende MHALT1R.V: GCC GAA TTC CAC CAT GGR ATG SAG CTG KGT MAT SCT CTT og Race GSP rIgG2a/b: CAC ACC GCT GGA CAG GGC TCC AGA GTT CC primersett. Det følgende PCR-programmet ble anvendt for oppformering. Denaturering ved 94 °C i 15 sek, primerannealing ved 52 °C i 50 sekunder og primerutvidelse ved 72 °C i 90 sekunder ble utført gjennom 40 sykluser, etterfulgt av sluttutvidelse ved 72 ºC i 10 min. Tungkjede-DNA V-fragmenter ble så isolert i henhold til standard protokoller.

Det tungkjede-DNA V-fragmentet ble klonet inn i PCR-script-CAM (Stratagene) som beskrevet av produsenten. Sekvensene ble identifisert ved sekvensering.

Eksempel 2.2:

Seleksjon av et humant VL

Hensikten med dette eksperiment er seleksjonen av et humant VL som kan parre med moder-VH klonet som beskrevet over.

Eksempel 2.2.1:

Isolering av RNA fra selekterte, IgD-positive B-celler

100 ml blod ble tatt fra fem friske, humane donorer. Perifere blodmononukleære celler (PBMC-er) ble isolert på en ficoll-gradient i henhold til standard fremgangsmåter. For å selektere IgD-positive celler så ble 1 ml anti-mus IgG-kuler (CELLection™ Pan Mouse IgG Kit; DYNAL) overtrukket med 20 μg muse-anti-humant IgD-antistoff (PharMingen). Ca. 2,5 x 10<7>PBMC-er ble tilsatt til kulene og inkubert ved 4 °C i 15 min. Etter vasking fire ganger med 1 ml RPMI-medium (BioChrom) så ble IgD-positive celler frigjort fra kulene ved å tilsette 8 μl frigjøringsbuffer (DNase) og overført til et friskt rør. Ved hjelp av denne fremgangsmåte så kunne 0,9 x 10<5>til 3,7 x 10<6>IgD-positive celler skaffes tilveie. Total RNA ble isolert fra IgD-positive celler ved å anvende RNeasy® Midi-kittet (QIAGEN) ved å følge produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert i henhold til standard fremgangsmåter (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 2. utgave).

Eksempel 2.2.2:

PCR-oppformering av variable lettkjederegioner (VL-regioner)

For isoleringen av lettkjede V-region DNA så ble RT-PCR utført ved å anvende V-kappa-(5'-huVKl-SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CCAGATGACC CAGTCTCC-3'), 5'-huVK2/4-SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATGACY CAGTCTCC- 3'), 5'-huVK3-SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGWTGACR CAGTCTCC-3'), 5'-huVK5-SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CACACTCACG CAGTCTCC-3'), 5'-huVK6-SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGCTGACT CAGTCTCC-3'), 3'-hu-Vk-Jl-SpeI-BsiWI (5'-GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATTTCCACC TTGGTCC-3'), 3'-hu-Vk-J2/4-SpeI-BsiWI (5'-GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATCTCCASC TTGGTCC-3'), 3'-hu-Vk-J3-SpeI-BsiWI (5'-GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATATCCACT TTGGTCC-3'), 3'-hu-Vk-J5-SpeI-BsiWI (5'-GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT AATCTCCAGT CGTGTCC-3') primersett. RNA fra IgD-positive B-celler ble transkribert til cDNA (som beskrevet over) og anvendt som templat-DNA i PCR-reaksjoner. Per PCR-reaksjon så ble én 5 '-primer kombinert med én 3'-primer. Antallet forskjellige PCR-reaksjoner ble bestemt ved antallet mulige kombinasjoner av 5'- og 3'-primere. Det følgende PCR-programmet ble anvendt for oppformering: denaturering ved 94 °C i 15 sek, primerannealing ved 52 °C i 50 sek og primerutvidelse ved 72 °C i 90 sek ble utført i 40 sykluser, etterfulgt av sluttutvidelse ved 72 °C i 10 min. Lettkjede DNA V-fragmenter ble så isolert i henhold til standardprotokoller.

Eksempel 2.2.3:

Bibliotekkonstruksjon - kloning av den humane VL-poolen

Et fagdisplaybibliotek ble vanligvis konstruert basert på standardprosedyrer som for eksempel utgreid i "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

Primerne som ble valgt for PCR-oppformering ga opphav til 5'-SacI- og 3'-SpeI-gjenkjenningsseter for lettkjede V-fragmentene. To ligeringsreaksjoner ble satt opp som hver besto av 400 ng av kappa lettkjedefragmentene (SacI-SpeI-kuttet) og 1400 ng av plasmidet pBluescript KS+ (SacI-SpeI-kuttet; stort fragment). De to resulterende antistoff V-lettkjedepooler ble så hver transformert inn i 300 μl av elektrokompetente Escherichia coli XL1 Blue ved elektroporering (2,5 kV, 0,2 cm gap cuvette, 25 mF, 200 Ohm, Biorad genpulser) som resulterte i en bibliotekstørrelse på 5,8 x 10<8>uavhengige kloner.

Kappa (lett kjede) DNA-fragmenter fra de forskjellige PCR-oppformeringene ble avveid for hver ligering som følger: Hver 5'-primer definerer en spesifikk gruppe. Innen disse grupper så definerer de 3'-primerne undergruppene. Undergruppene ble avveid 1:2:1:1 som korresponderer til primerne 3'-hu-Vk-J1-SpeI-BsiWI : 3'-hu-Vk-J2/4-SpeI-BsiWI : 3'-hu-Vk-J3-SpeI-BsiWI : 3'-hu-Vk-J5-SpeI-BsiWI. Gruppene ble avveid i henhold til deres germline-fordeling 1:1:1:0,2:0,2 som korresponderer til primerne 5'-huVK1-Sac-2001 : 5'-huVK3-Sac-2001 : 5'- huVK2/4-Sac-2001 : 5'-huVK5-Sac-2001 : 5'-huVK6-Sac-2001.

Etter elektroporering så ble analysen inkubert i SOC-medium (Fluka) for fenotypeuttrykk. Kulturene ble så hver inkubert i 500 ml SB-seleksjonsmedium som inneholdt 50 μg/ml carbenicillin og 2 % w/v glukose over natten. Den neste dagen så ble cellene høstet ved sentrifugering og plasmidtillaging utført ved å anvende et kommersielt tilgjengelig plasmidtillagingskitt (Qiagen).

Eksempel 2.2.4:

Konstruksjon av antistoffbiblioteket - humant VL - moder VH

PCR ble utført for å oppformere moder-VH fra vektoren som inneholdt moder-VH beskrevet over i eksempel 2.1. For oppformering så ble en PCR-protokoll i henhold til standardprosedyrer fulgt ved å anvende den 5'-primeren MVH8 (5'-GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGA GCT-3') og den 3'-primeren 3'-MuVHBstEII (5'-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G-3').

Etter rensing av det ca.350 bp oppformeringsproduktet fra en analytisk agarosegel så ble DNA-fragmentet kuttet med restriksjonsenzymene BstEII og XhoI. Fagemidet pComb3H5BHis (denne vektor er beskrevet i doktorgraden til Dr. Ralf Lutterbüse) ble kuttet i henhold til dette og det store fragmentet ble ligert med det ovenfor nevnte fragmentet. Etter transformering inn i E. coli XL1-blå, så ble en enkel klon dyrket i 100 ml SB-medium (som inneholdt 50 μg/ml carbenicilline) og plasmidet ble laget i henhold til standard protokoller. Den vellykkede kloningen ble bekreftet ved å sekvensere innskuddet (Sequiserve, Munich).

Denne vektor pComb3H5BHis/moder-VH ble kuttet med restriksjonsenzymene SacI og SpeI. Det store vektorfragmentet ble isolert. Plasmid-DNA som inneholdt VK-biblioteket fra eksempel 2.2.3 ble kuttet med restriksjonsenzymene SacI og SpeI. Det små VK-fragmentbåndet (ca.350 bp) ble isolert.

1200 ng av vektorfragmentet ble ligert med 400 ng av VK-fragmentene og transformert inn i 300 μl elektrokompetente E. coli XL1 Blue ved elektroporering (2,5 kV, 0,2 cm gap cuvette, 25 mF, 200 Ohm) og resulterte i en total scFv-bibliotekstørrelse på 2,8 x 10<8>uavhengige kloner.

Etter fenotypeuttrykk og langsom adapsjon til carbenicillin så ble antistoffbiblioteket overført inn i SB-Carbenicillin (50 μg/ml) seleksjonsmedium. Antistoffbiblioteket ble så infisert med en infeksiøs dose av 1 x 10<12>partikler med hjelpefag VCSM13 som resulterte i produksjonen og utskillelsen av filamentøs M13-fag, hvor hver fagpartikkel inneholdt enkelttrådet pComb3H5BHis-DNA som kodet for et halvthumant scFvfragment og viste det korresponderende scFv-proteinet som en translasjonsfusjon til fagkappeprotein III.

Eksempel 2.2.5:

Fagdisplayseleksjon av et humant VL

Fagpartiklene som bærer scFv-repertoaret ble høstet fra dyrkningssupernatanten ved PEG8000/NaCl presipitering og sentrifugering. Deretter ble ca.1 x 10<11>til 1 x 10<12>scFv fagpartikler resuspendert i 0,4 ml PBS/0,1 % BSA og inkuberte med rekombinant biotinylert løselig rhGM-CSF (produsert i E. coli som beskrevet over i eksempel 1) i 2 timer med forsiktig agitering i et totalvolum på 0,5 ml (antigenkonsentrasjoner runder 1-3: 100 nM; runde 4: 10 nM; runde 5: 1 nM). Deretter så ble 6,7 x 10<7>streptavidinmagnetiske kuler (Dynabeads M-280-Streptavidin, Dynal) tilsatt og inkuberte videre under forsiktig agitering i 30 min.

scFv-fag som ikke spesifikt binder til målantigenet, ble eliminert ved vasketrinn med PBS/0,1 % BSA. For dette formål så ble de biotinylerte antigen - streptavidinkulekompleksene (med de potensielle scFv-binderne) samlet med en magnet og resuspendert i 1 ml av vaskeløsningen (ett vasketrinn). Denne vaskeprosedyre ble repetert i opp til fire ganger i enda flere runder.

Etter vasking så ble bindingsobjektene eluert ved å anvende HCl-glysin, pH 2,2. Etter nøytralisering med 2 M Tris, pH 12, så ble eluatet anvendt for infeksjon av en frisk ikke-infisert E. coli XL1 Blue-kultur. For å eluere de gjenværende høybindingsobjektene så ble dette trinn repetert ved å anvende HCl-glysin, pH 1,0. Dette andre eluatet ble igjen nøytralisert og anvendt for å infisere en frisk ikke-infisert E. coli XL1 Blue-kultur. Begge infiserte E. coli-kulturer ble så blandet og celler som var vellykket transdusert med en fagemid kopi som koder for et humant scFv-fragment, ble igjen selektert for carbenicillinresistens og deretter infisert med VCSM13-hjelpefag for å starte runden med antistoffdisplay og in vitro-seleksjon.

Plasmid-DNA som korresponderer til 4 og 5 runder med panorering, ble isolert fra E. coli-kulturer. For produksjonen av løselig scFv-protein så ble VL-DNA-fragmenter kutet ut fra plasmidene (SacI-SpeI) og klonet via de samme restriksjonssetene i plasmidet pComb3H5BFlag/His med moder-VH som skiller seg fra det initiale pComb3H5BHis/moder-VH i at uttrykkskonstruksjonen (for eksempel scFv) inkluderer en Flag-tag (TGDYKDDDDK) mellom scFv og His6-tag og de tilleggsfagproteinene blir slettet.

Etter ligering så blir hver pool (forskjellige runder panorering) plasmid-DNA transformert inn i 100 μl varmesjokkede, kompetente E. coli XL1 blue og platet ut på carbenicillin LB-agar. Enkle kolonier ble plukket i 100 μl LB-carb (50 μg/ml).

10 μl av denne cellesuspensjon ble vanligvis inkubert i 5 ml SB-medium supplementert med carbenicillin til en konsentrasjon på 50 μg/ml og MgCl2til en sluttkonsentrasjon på 20 mM i ca.6 timer ved 37 °C under agitering. Deretter ble IPTG tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1 mM og inkuberingen fortsatte over natt på en rister ved 30 °C.

Celler ble sentrifugert til en pellet og denne pellet ble vanligvis resuspendert i 0,5 ml PBS. Med fire runder frysing ved -70 °C og tining ved 37 °C så ble den ytre membranen til bakteriene ødelagt ved osmotisk sjokk og de løselige periplasmatiske proteinene som inkluderte scFv'ene ble frigjort inn i supernatanten. Etter eliminering av intakte celler og celle-debris ved videre sentrifugering (5 min ved 10000 x g) ble supernatanten (det vil si PPP) som inneholdt scFv-ene, samlet og undersøkt videre.

RhGM-CSF-antigen (Leukine Liquid, Immunex) ble immobilisert på ELISA-plater over natt ved 4 °C (50 μl av 1 μg antigen/ml PBS per brønn). Etter vasking av cellene én gang med PBS og blokkering med PBS 3 % BSA i 1 time ved romtemperatur så ble 100 μl PPP-er som inneholdt scFv-er, tilsatt til brønnene og inkuberte vanligvis i 1 time ved romtemperatur. Etter tre vasker med PBS/0,05 % Tween20 så ble deteksjon av scFv-fragmenter bundet til immobilisert antigen utført ved å anvende et anti-flag M2 (1 μg/ml PBS/1 % BSA) og detektert med pepperrotperoksidasekonjugert geiteantimus-Fab2 spesifikt polyklonalt antistoff (Dianova, 1 μg/ml PBS/1 % BSA). Signalet ble utviklet ved å tilsette 2,2'-azino-di[3-etylbenztiazolin-6-sulfonsyre] ("ABTS") substratløsning og detektert ved en bølgelengde på 405 nm i henhold til standard protokoller.

Fra 20 kloner som ble testet (10 skaffet tilveie etter 4 runder og 10 skaffet tilveie etter 5 runder med panorering) så viste fem lysater sterke ELISA-signaler i motsetning til PBS som en negativ kontroll på det rekombinante antigenet. ELISA-resultater er vist i fig.1, hvor de forskjellige scFv-molekylene som blir testet, er satt opp langs x-aksen og yaksen viser absorpsjonsintensiteten som ble målt med høyere absorpsjon som indikerer sterkere binding. Den PBS-negative kontrollen er indikert på x-aksen helt til venstre. ScFv-molekyler som utviser godtatt binding, er angitt over den respektive absorpsjonsintensitetskolonne enten med en diamant eller en stjerne. Diamanten og stjernen i fig.1 representerer to forskjellige sekvenser, det vil si scFv hvis absorpsjonsintensitetskolonne er indikert med en diamant, hadde én sekvens, mens alle scFv-ene hvis absorpsjonsintensitetskolonner er indikert med stjerner, deler den samme felles sekvensen.

De fem ELISA-positive klonene ble utsatt for DNA-sekvensering. Sekvensering ble utført ved Sequiserve (Munich). Totalt fire kloner delte DNA-sekvensen som korresponderer til scFv 5-306, mens den andre sekvensen (4-301) kun ble identifisert én gang. Den dominante sekvensen som korresponderer til scFv 5-306 så vel som sekvensen 4-301, var av human opprinnelse og viste veldig nær homologi til human germlinesekvens Vk1-012.

Eksempel 2.2.6:

Karakterisering av scFv-treffkonstruksjoner utledet fra huVL-seleksjonen Formålet med de følgende eksperimentene var karakteriseringen av scFv-treffene generert ved fremgangsmåtene beskrevet over.

Eksempel 2.2.6.1:

Småskalauttrykk og rensing av scFv-treff (utledet som beskrevet over) i E. coli For å skaffe tilveie PPP-er så ble cellene dyrket i SB-medium supplementert med 20 mM MgCl2og carbenicillin 50 μg/ml og ble oppløst i 1 ml PBS etter høsting. Den ytre membranen til bakteriene ble ødelagt med temperatursjokk (fire runder frysing ved -70 °C og tining ved 37 °C) og de løselige periplasmatiske proteinene som inkluderer scFv-ene ble frigjort til supernatanten. Etter eliminering av intakte celler og celle-debris ved sentrifugering så ble supernatantene som inneholdt scFv-ene, samlet og undersøkt videre. For videre rensing så ble 25 μl 20 mM NaH2PO4, 400 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 7,0, tilsatt til en respektiv PPP. PPP-en ble renset via Ni-NTA-spinnkolonner (Qiagen) som anbefalt i manualen. I korthet så ble en respektiv PPP-løsning tilsatt til den preekvilibrerte kolonnen for å binde til resinet. Spinnkolonnene ble vasket to ganger med 20 mM NaH2PO4, 400 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 7,0. Det bundne proteinet ble eluert to ganger i 200 μl 20 mM NaH2PO4, 400 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 7,0. De rensede scFv-proteinene ble videre analysert med hensyn til bindingsstyrke (kinetikk av-hastighet) og nøytraliseringsevne (hemming av GM-CSF-avhengig TF-1-proliferering) som beskrevet i de etterfølgende eksemplene. Selv om det ikke separeres og skilles mellom de forskjellige konformasjonene av scFv, så ga denne råe rensing av PPP 80 % ren scFv-protein bedømt ved Western-blott-analyse (data ikke vist).

Eksempel 2.2.6.2:

Hemming av FITC-merket rhGM-CSF

Hensikten med dette eksperiment er å vise at de identifiserte scFv-klonene er i stand til å hemme binding av rhGM-CSF til GM-CSF-reseptorkomplekset som ble vist på overflaten av TF-1-celler. Nøytraliserende scFv-konstruksjoner ville forventes å konkurrere med reseptorbindingsepitopen på rhGM-CSF-molekylet og gjøre det umulig for rhGM-CSF å binde seg til GM-CSF-reseptorkomplekset. I den grad binding av rhGM-CSF til sin reseptor hemmes på den ovenfor nevnte måten, så ville man forvente å observere en nedgang i intensiteten av fluorescensfarging av TF-1-celler ved fluoresceinmerket rhGM-CSF (rhGM-CSF-FITC) i en flowcytometribasert analyse.

Det følgende beskriver utførelsen av en slik flowcytometribasert analyse. En sluttkonsentrasjon på 0,4 μg/ml rhGM-CSF-FITC-konjugat i PBS ble inkubert med

10 μg/ml av moderantistoffet eller ufortynnet periplasmatisk ekstrakt av scFv som var blitt renset med NiNTA spinnkolonne. Proteinprøvene fikk ekvilibrere ved 25 ºC i 1 time før tilsettingen av en suspensjon med TF-1-celler. TF-1-cellene ble dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco; L-glutamin, fenolrødt fri), 10 % varmeinaktivert FCS i fraværet av rhGM-CSF over natten. En sluttkonsentrasjon på 2 x 10<6>celler/ml og 150 μl cellesuspensjon ble anvendt per prøve. Cellene ble høstet ved sentrifugering ved 500 x g ved 4 ºC i 3 min og vasket to ganger med FACS-buffer. De vaskede cellene ble resuspendert i 100 μl preekvilibrert proteinprøve som inneholdt rhGM-CSF-FITC og det respektive moderantistoffet eller scFv. Prøvene ble inkubert ved 4 °C i 60 min. Etter to videre vasker så ble cellene resuspendert i 150 μl iskald FACS-buffer og deretter analysert ved hjelp av flowcytometri. Resultatene er vist i fig.2. Spesifikt så viser fig. 2 en graf hvor forskjellige testmolekyler er oppstilt langs x-aksen og hvor den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten ("MFI") er indikert på y-aksen. Som kan ses i fig.2 så ble et klart tap av fluorescensintensitet på TF-1-celler observert med moderantistoffet (nr.2 fra venstre langs x-aksen). Konkurransebindingen til rhGM-CSF av scFv-molekylet betegnet 5-306, kunne måles ved tap i fluorescensfarging av TF-1-celler, mens scFvmolekylet 4-301 knapt viste noen effekt. Fordi disse resultater tyder på at scFvmolekylet betegnet 5-306 kan være en lovende nøytralisator av GM-CSF, så ble videre analyse av nøytraliseringsaktiviteten begrenset til scFv 5-306.

Eksempel 2.2.6.3:

Storskalauttrykk og rensing av scFv-leder

Proteinproduksjon og rensing på en storskala ble utført som følger. I korthet så ble E. coli BL21DE3 transformert med uttrykksplasmidet og ble dyrket ved 37 ºC i 1 liter selektivt medium til en optisk tetthet ved 600 nm på 0,5-0,8. Proteinproduksjon ble indusert ved å tilsette IPTG til 1 mM og kulturene ble inkubert i enda 16 timer med agitering ved en temperatur på 25 ºC. Cellene ble høstet ved sentrifugering ved 5000 x g i 10 min og resuspendert i 100 ml 1 x PBS. Periplasmatiske proteiner ble ekstrahert ved optimal, sekvensiell frysing i etanol/tørris og tining i et 37 °C vannbad i fire sykluser. Til slutt så ble ekstraktet sentrifugert ved 10000 x g i 20 min.

scFv 5-306 ble isolert i en totrinns renseprosess med immobilisert metallaffinitetskromatografi (IMAC) og gelfiltrering. Alle ledere ble renset i henhold til denne fremgangsmåte. Äkta® FPLC System (Pharmacia) og Unicorn® Software ble anvendt for kromatografi. Alle kjemikalier var av forskningsgrad og kjøpt fra Sigma (Deisenhofen) eller Merck (Darmstadt).

IMAC ble utført ved å anvende en Qiagen Ni-NTA Superflowkolonne i henhold til protokollen tilveiebrakt av produsenten. Kolonnen ble ekvilibrert med buffer A2 (20 mM natriumfosfat pH 7,2, 0,4 M NaCl) og PPP (100 ml) ble satt på kolonnen (2 ml) ved en strømningshastighet på 2 ml/min. Kolonnen ble vasket med 5 kolonnevolumer 5 % buffer B2 (20 mM natriumfosfat pH 7,2, 0,4 M NaCl, 0,5 M imidazol) for å fjerne ubundet prøve. Bundet protein ble eluert ved å anvende 100 % buffer B2 i 5 kolonnevolumer. Eluerte proteinfraksjoner ble slått sammen for videre rensing.

Gelfiltreringskromatografi ble utført på en HiLoadTM 16/60 Superdex 75 Prep Gradekolonne (Pharmacia) ekvilibrert med PBS (Gibco). Eluerte proteinprøver (strømningshastighet 1 ml/min) ble utsatt for standard SDS-PAGE og Western Blot for deteksjon.

Før rensing så ble kolonnen kalibrert for molekylvektsbestemmelse (molekylvektmarkørkitt, Sigma MW GF-200). Den størrelsesavhengige separeringen på Superdex 75 Prep Grade-kolonnen resulterte i klart skillbare monomerer og assosierbare dimertoppfraksjoner av scFv-lederne. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved å måle optisk tetthet ved 280 nm og ble beregnet ved å anvende den sekvensspesifikke molekylekstinksjonskoeffisienten av den respektive scFv-lederen.

Eksempel 2.2.6.4:

Hemming av rhGM-CSF-avhengig proliferering av TF-1-celler ved en scFv-leder Formålet med dette eksperiment er å oppnå kvalitativ informasjon på den nøytraliserende aktiviteten til halvt-human scFv 5-306 ved å anvende den hGM-CSF-avhengige cellelinjen TF-1 (DSMZ ACC 334). TF-1-celler ble dyrket i RPMI 1640-medium (Gibco; L-glutamin, fenol-rød fri), 10 % varmeinaktivert FCS i nærværet av 2,5 ng/ml rhGM-CSF som beskrevet ved distributøren (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Tyskland). Celler ble dyrket til en celletetthet på 0,5 x 10<6>celler/ml. For prolifereringsanalysen så ble TF-1-celler høstet ved sentrifugering ved 300 x g i 4 min og vasket med 1 x PBS (Dulbecco's, Gibco). Celler ble resuspendert ved en sluttkonsentrasjon på 1 x 10<5>celler/ml i RPMI 1640, 10 % FCS og 90 μl cellesuspensjon per Microtest flatbunnet celledyrkningsplatebrønn ble anvendt (0,9 x 10<4>celler/brønn). En sluttkonsentrasjon på 0,3 ng/ml rhGM-CSF ble anvendt for å stimulere prolifereringen av TF-1-celler. For nøytralisering av hGM-CSF-avhengig proliferering så ble 10 μl av renset scFv tilsatt til 100 μl TF-1 og rhGM-CSF-løsning i en fortynningsserie i området fra ca.100 μg/ml til 100 pg/ml. Prøvene ble inkubert ved 37 ºC ved 5 % CO2i 72 timer. Etter 72 timer så ble den proliferative statusen til TF-1-cellene bestemt ved å tilsette WST-1 og å måle fargeforandringen med en ELISA-leser ved 450 nm. Dataene ble tilpasset halvmaksimal hemming av proliferering (IC50) ved å anvende den ikke-lineære regresjonskurvetilpassingen til prismesoftwaren.

En klar doseavhengig prolifereringshemmende effekt av scFv 5-306 kunne ses og var sammenlignbar for de monomere og de dimere konformasjonsformene. Ved å tilpasse den halvmaksimale hemmingen av proliferering så ble en IC50-verdi på 7,3 nM bestemt for den monomere formen og 3,5 nM for den dimere formen. Resultatene er vist i fig.3.

Eksempel 2.3:

Konstruksjon av antistoffbiblioteker og fagdisplayseleksjon av humane VH-er Formålet med de følgende eksperimentene er seleksjonen av et sett humane VH-regioner som ville pare med den humane VL-regionen til scFv 5-306 selektert som beskrevet over.

Eksempel 2.3.1:

Isolering av RNA fra perifere, blodmononukleære celler (PBMC-er)

100 ml blod ble tatt fra fem friske, humane givere. Perifere blodmononukleære celler (PBMC-er) ble isolert med en ficoll-gradient i henhold til standard fremgangsmåter. Total RNA ble isolert fra PBMC-er ved å anvende RNeasy® Midi-kittet (QIAGEN) ved å følge produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert i henhold til standard fremgangsmåter (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 2. utgave).

Eksempel 2.3.2:

PCR-oppformering av variable tungkjederegioner (VH-regioner)

VH-biblioteket ble konstruert og kalt Lib 134-VH. Dette VH-biblioteket består av det humane repertoaret av FR1-CDR2-FR2-CDR2-FR3 fra de PCR-oppformerte VH-regionene av den ovenfor beskrevne PBMC-poolen, koblet operativt til VH CDR3 fra moderantistoffet, etterfulgt av en human FR4-germline-sekvens.

For isoleringen av humane templat-VH-regioner så ble RT-PCR utført ved å anvende et 5'-VH-spesifikt primersett (5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 (5'-AGG TGC AGC TGC TCG AGT CTG G-3'), 5'-huVH4-XhoI-2001 (5'-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3'), 5'-huVH4B-XhoI-2001 (5'-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TGG GG-3')) og et sett med to 3'-VH-spesifikke primere (3'-hu-VH-BstEII-2001 (5'-CTG AGG AGA CGG TGA CC-3'), 3'-hu-VH-J3-BstEII-2001 (5'-CTG AAG AGA CGG TGA CC-3')). Per PCR-reaksjon så ble én 5'-primer kombinert med én 3'-primer; antallet forskjellige PCR-reaksjoner ble bestemt ved antallet mulige kombinasjoner av 5'- og 3'-primere. PBMC-cDNA-et (som beskrevet over fra kun fire donorer ble anvendt som en kilde fra VH-gener). Det følgende PCR-programmet ble anvendt for oppformering: Denaturering ved 94 ºC i 15 sek, primerannealing ved 52 °C i 50 sek og primerutvidelse ved 72 ºC i 60 sek ble utført i 40 sykluser, etterfulgt av sluttutvidelse ved 72 °C i 10 minutter.

Oppformeringsproduktene med en størrelse på ca.350 bp ble isolert i henhold til standard fremgangsmåter.

For isoleringen av Lib 134-VH-regioner så ble RT-PCR utført i to trinn. Først så ble de humane tungkjede-VH-segmentene (FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3) PCR-oppformert fra de isolerte templat-VH-fragmentene ved å anvende det samme 5'-VH-spesifikke primersettet som beskrevet over (5'-huVH1,3,5-XhoI-2001, 5'-huVH4-XhoI-2001, 5'-huVH4B-XhoI-2001) og et 3'-spesifikt primersett (3'-Lib 134-VH-1A-MH3 (5'-GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT YGC ACA GTA ATA CAC GGC-3'), 3'-Lib 134-VH-1B-MH3 (5'-GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT YGC ACA GTA ATA CAY RGC-3'), 3 '-Lib 134-VH-3A-MH3 (5'-GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT NGY ACA GTA ATA CAC RGC-3'), 3 '-Lib 134-VH-3B-MH3 (5'-GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT NGC ACA GTA ATA CAA RGC-3'), 3'-Lib 134-VH-4-MH3 (5'-GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT SGC ACA GTA ATA CAC RGC-3')) for de humane VH-subfamiliene 1, 3 og 4 som treffer i den helt terminale regionene av FR3.

De følgende primerkombinasjonene ble anvendt:

a) 5'-huVHl,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-1A-MH3

b) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-1B-MH3

c) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-3A-MH3

d) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-3B-MH3

e) 5'-huVH4-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-4-MH3

f) 5'-huVH4B-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-4-MH3

Per PCR-reaksjon så ble én 5'-primer kombinert med den 3'-primeren; antallet forskjellige PCR-reaksjoner ble bestemt ved antallet mulige kombinasjoner av 5'- og den 3'-primeren. Det følgende PCR-programmet ble anvendt for oppformering: Denaturering ved 94 ºC i 15 sek, primerannealing ved 52 °C i 50 sek og primerutvidelse ved 72 °C i 90 sek ble utført i 40 sykluser, etterfulgt av sluttutvidelse ved 72 °C i 10 min. Gjennom dette PCR-trinn og den respektive 3'-primersekvensen så blir de humane VH-segmentene forlenget for en del av moder-VH CDR3, som så igjen er primingssetet for den andre trinns PCR 3'-primeren.

Disse VH-(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3) DNA-fragmentene ble så anvendt som templater i en andre PCR-reaksjon ved å anvende igjen den respektive 5' VH-spesifikke primeren og en universal 3'-primer som treffer den universale 3'-terminale enden av de oppformerte DNA-fragmentene (3'-Lib 134-JH3-BstE2, 5'-AGA GAC GGT GAC CAT TGT CCC TTG GCC CCA GTA ATC AAA GTA GAC TGC-3').

Det følgende PCR-programmet ble anvendt for oppformering:

Denaturering ved 94 °C i 15 sek, primerannealing ved 52 °C i 50 sek og primerutvidelse ved 72 °C i 60 sek ble utført i 40 sykluser, etterfulgt av sluttutvidelse ved 72 °C i 10 min. DNA V-fragmentene ble isolert i henhold til standard protokoller.

Eksempel 2.3.3:

Bibliotekkonstruksjon - kloning av den humane VH-poolen

I en andre runde av den foregående fremgangsmåten så ble det humane VL fra scFv 5-306 identifisert i den første, tidligere seleksjonen valgt og deretter kombinert med biblioteket av humane VH-fragmenter beskrevet i eksempel 2.3.2 med det formål å generere et humant scFv. Et fagdisplaybibliotek ble generelt konstruert basert på standard prosedyrer som for eksempel utgreid i "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor laboratory Press, 2001.

Tungkjede-DNA-fragmenter fra de forskjellige PCR-oppformeringene avveid for hver ligering som følger: a:b:c:d:e:f = 3:1:3:1:1:1, hvor a-f har de følgende betydningene:

a) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-1A-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2

b) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-1B-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2

c) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-3A-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2

d) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-3B-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2

e) 5'-huVH4-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-4-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2

f) 5'-huVH4B-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-4-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2

Én ligeringsreaksjon ble satt opp som besto av 400 ng human Lib 134-VH-fragmentpool (XhoI-BstEII kuttet) og 1200 ng av plasmidet pComb3H5BHis/5-306 VL (DNA-et som koder for VL-regionen til scFv 5-306 ble klonet via restriksjonssetene SacI og SpeI inn i pComb3H5BHis i henhold til standard prosedyrer). Den resulterende antistoffhumane VH-poolen ble så transformert inn i 300 μl elektrokompetente Escherichia coli XL1 Blue ved elektroporering (2,5 kV, 0,2 cm gap cuvette, 25 mF, 200 Ohm, Biorad genpulser) og resulterte i en bibliotekstørrelse på 1,6 x 10<8>uavhengige kloner totalt.

Etter elektroporering så ble bakteriene inkubert i SOC medium (Fluka) for fenotypeuttrykk. Kulturene ble så hver inkubert i 500 ml SB-seleksjonsmedium som inneholdt 50 μg/ml carbenicillin og 2 % v/v glukose over natten. Den neste dagen så ble cellene fra kulturene høstet ved sentrifugering og plasmidtillaging ble utført ved å anvende et kommersielt tilgjengelig plasmidtillagingskitt (Qiagen) for å opprettholde DNA-biblioteket.

1,5 μg av denne plasmidpool som koder for den respektive scFv-poolen, ble så elektroporert inn i E. coli XL1blue (2,5 kV, 0,2 cm gap cuvette, 25 mF, 200 Ohm, Biorad genpulser) og resulterte i en bibliotekstørrelse på 2,4 x 10<9>uavhengige kloner totalt. Etter fenotypeuttrykk og langsom adapsjon til carbenicillin så ble antistoffbiblioteket overført til SB-Carbenicillin (50 μg/ml) seleksjonsmedium. Antistoffbiblioteket ble så infisert med en infeksiøs dose av 1 x 10<12>partikler med hjelperfag VCSM13 som resulterte i produksjonen og utskillelsen av filamentøs M13-fag, hvor hver fagpartikkel inneholdt enklettrådet pComb3H5BHis-DNA som koder for et humant scFv-fragment og viste det korresponderende scFv-proteinet som en translasjonsfusjon til fagkappeprotein III.

Eksempel 2.3.4:

Fagdisplayseleksjon av et humant VH

Det resulterende fagbiblioteket som bærer det klonede scFv-repertoaret ble høstet fra dyrkningssupernatanten ved PEG8000/NaCl-presipitering og sentrifugering. Ca.1 x 10<11>til 1 x 10<12>scFv-fagpartikler ble resuspendert i 0,4 ml PBS/0,1% BSA og ble inkubert med rekombinant biotinylert løselig rhGM-CSF (E. coli-material som beskrevet i eksempel 1) i 1 time under forsiktig agitering i et totalt volum på 0,5 ml. Deretter ble 6,7 x 10<7>streptavidinmagnetiske kuler (Dynabeads M-280-Streptavidin, Dynal) tilsatt og inkuberte videre under forsiktig agitering i 30 min.

scFv-fag som ikke spesifikt bandt til målantigenet, ble eliminert med vasketrinn med PBS/0,1 % BSA. For det formål så ble de biotinylerte antigen-streptavidinkulekompleksene (med de potensielle scFv-binderne) samlet via en magnet og resuspendert i 1 ml av vaskeløsningen (ett vasketrinn). Denne vaskeprosedyre ble repetert opp til fire ganger. Etter vaskingen så ble bindingsdelene eluert ved å anvende HCl-glysin pH 2,2 og etter nøytralisering med 2 M Tris pH 12 så ble eluatet anvendt for infeksjon av en frisk, uinfisert E. coli XLl Blue-kultur.

For å eliminere gjenværende høy bindingsdeler så ble kulene resuspendert direkte i 200 μl av en frisk E. coli XL1 blue-kultur (OD600� 0,5) og ble inkubert i 10 min med forsiktig agitering. Begge kulturer ble så blandet og cellene ble vellykket transdusert med en fagemidkopi som koder for et humant scFv-fragment, ble igjen selektert for carbenicillin-resistens og deretter infisert med VCMS 13 hjelperfag for å starte den andre runden med antistoff-fremvisning og in vitro-seleksjon.

Totalt 4 runder seleksjoner ble utført for de to antistoffene. Antigenkonsentrasjoner ble redusert under seleksjon til sluttkonsentrasjonene som følger:

1. runde 100 nM

2. runde 10 nM

3. runde 10 nM

4. runde 10 nM

Plasmid DNA fra E. coli kulturer ble isolert korresponderende til 3. og 4. runde med panorering.

For produksjonen av løselig scFv-protein så ble VH-VL-DNA-fragmentene kuttet ut fra plasmidene (XhoI-SpeI) og klonet via de samme restriksjonssetene i plasmidet pComb3H5BFlag/His (w/o tilleggsfagproteiner nødvendig for faginfeksjon). Etter ligering så ble hver pool (forskjellige runder panorering) plasmid-DNA transformert inn i 100 μl varmesjokk-kompetente E. coli TG1 og platet ut på carbenicillin LB-agar. Enkle kolonier ble plukket og inokulert i 120 μl LB-carb (50 μg/ml) 1 % glukose i 96-brønners plater (Greiner). Brønnene ble forseglet med en semipermeabel membran (Greiner) og platene ble inkubert over natt ved 37 °C i en risteinkubator (masterplate). Deretter så ble 10 μl av masterplatekulturene overført til en andre 96 brønners plate (arbeidsplate) som inneholdt 90 μl LB-carb (50 μg/ml) 0,1 % glukose per brønn. Etter inkubering i 4 timer i en 37 °C risteinkubator så ble scFv-produksjon indusert ved å tilsette 20 μl LB-carb 6 mM IPTG til hver brønn. Etter et annet inkuberingstrinn over natt ved 30 °C med risting så ble celler lysert i en 1 times inkubering ved romtemperatur med 40 μl lysisbuffer (400 mM borsyre, 320 mM NaCl, 4 mM EDTA pH 8, 2,5 mg/ml lysozym). Gjenværende celler og celledebris ble preparert ved sentrifugering i 12 min ved 1900 x g (Hettich).

Supernatantene som inneholder scFv-molekyler ble så testet for binding i ELISA-analyser. Deteksjon av scFv-fragmenter bundet til immobilisert rhGM-CSF-antigen (Leukine) ble utført ved å anvende en anti-flagg M2 (1 μg/ml PBS/1 % BSA) detektert med pepperrotperoksidasekonjugert geit-antimus Fab2-spesifikt, polyklonalt antistoff (Dianova, 1 μg/ml PBS/1 % BSA). Signalet ble utviklet ved å tilsette ABTS-substratløsning og deteksjonen ble gjort ved bølgelengde 405 nm.

Av ca.100 kloner som ble testet etter den tredje seleksjonsrunden så viste 12 kloner sterk binding til rhGM-CSF. Av ca.160 kloner som ble testet etter den fjerde runden så viste 80 % av lysatene sterke ELISA-signaler sammenlignet med PBS som en negativ kontroll på det rekombinante antigenet. Resultater fra representative kloner er skissert i fig. 4, hvor disse representative kloner er oppstilt langs x-aksen og absorbansintensitet er indikert på y-aksen. Som kan ses fra fig.4 så viste den PBS-negative kontrollen (nr.2 fra høyre på x-aksen) ingen akseptert binding, mens representative scFv-kloner scFv A, scFv 3035, scFv 3039, scFv 3080 og scFv 5-306 viste forskjellig grad av bindingsstyrke ved ELISA.

Alle lysater ble testet uten rhGM-CSF i parallelle eksperimenter for uspesifikk binding til blokkeringsmidlet. Ingen signifikante, detekterbare signaler kunne observeres, noe som indikerer på at bindingen til rhGM-CSF var spesifikk.

DNA-sekvensene til mer enn 13 ELISA-positive scFv-kloner ble bestemt. Totalt så ble seks forskjellige sekvenser identifisert. Alle sekvenser var av human opprinnelse og var nært relatert til den humane germline-sekvensen VH-11-O2.

Eksempel 2.3.5:

Karakterisering av humane scFv-konstruksjoner som inneholder humane VL- og VH-regioner

Eksempel 2.3.5.1:

Storskalaproduksjon og rensing av scFv-lederkonstruksjoner produsert ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 3

scFv-lederne ble isolert og renset som beskrevet i eksempel 2.2.6.3.

Eksempel 2.3.5.2:

Kinetikkbindingsanalyse av scFv-ledere ved overflateplasmonresonans (SPR) Hensikten med eksperimentet er den i dybde-karakteriseringen av scFv-lederne.

Bindingskinetikker (kd og ka) til scFv-lederne ble målt ved å injisere 10 μl renset protein i fortynningsserier i området 10 μg/ml til 1 pg/ml renset scFv og å måle dissosieringen ved 25 °C i 100 sek. Protein var bufret i HBS-EP (0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % overflateaktivt stoff P20). Data ble tilpasset ved å anvende BIAevalution™ softwaren for å bestemme hastighetskonstanten for dissosiering og assosieringskinetikker med en 1:1 Langmuir-bindingsligning (formel 1 og 2), hvor A er konsentrasjonen av injisert analytt og B er konsentrasjonen av ligand.

dB / dt = -(ka * [A] * [B]-kd * [AB]) (1)

dAB / dt = -(ka * [A] * [B]-kd * [AB]) (2)

Kinetikkbindingskurver ble bestemt ved å anvende opp til 8 konsentrasjoner av hver scFv-leder analysert. Den uavhengige tilpassingen av rådata resulterte i dissosiasjonsog assosiasjonshastighetskonstanter som ble anvendt for å beregne likevektsdissosiasjonskonstanten (KD, resultatene er vist i tabell 1).

Tabell 1

2.3.5.3:

Hemming av rhGM-CSF-avhengig proliferering av TF-1-celler ved scFv-ledere Etter å ha bekreftet at styrken av spesifikk binding ble bevart i scFv-lederne, så var formålet med dette eksperimentet å bedømme spesifisiteten av interaksjonen av scFvlederen med antigenet rhGM-CSF. Hemmingen av den biologiske funksjonen til antigenet rhGM-CSF ved å binde scFv ble karakterisert i et TF-1-prolifereringshemmingseksperiment.

TF-1-prolifereringshemmingseksperimentene ble utført som beskrevet over. Celler ble resuspendert ved en sluttkonsentrasjon på 1 x 10<5>celler/ml i RPMI 1640, 10 % FCS og 90 μl cellesuspensjon per brønn ble anvendt (0,9 x 10<4>celler/brønn). En sluttkonsentrasjon på 0,3 ng/ml rhGM-CSF ble anvendt for å stimulere prolifereringen av TF-1-cellene. For nøytralisering av rhGM-CSF-avhengig proliferering så ble renset scFv i 1 x PBS tilsatt i en fortynningsserie med sluttproteinkonsentrasjoner i området fra 100 μg/ml til 10 pg/ml. 10 μl dialysert og sterilfiltrert proteinløsning (0,22 μm filter) ble tilsatt til 100 μl TF-1 og rhGM-CSF-løsning. Prøvene ble inkubert ved 37 °C ved 5 % CO2i 72 timer. Etter 72 timer så ble prolifereringsstatusen til TF-1-cellene bestemt ved å tilsette WST-1 og å måle fargeforandringen med en ELISA-leser ved 450 nm (Fig.5). Som kan ses i fig.5 så blir den humane GM-CSF-nøytraliseringsaktiviteten klart demonstrert. ScFv A viste den sterkeste nøytraliseringsaktiviteten.

Eksempel 2.4:

Optimalisering av bindingskarakteristikaene for de valgte scFv-ene

Det ble overveid at den biologiske aktiviteten til et nøytraliserende middel for en monomer ligand kan forbedres eller til og med optimaliseres ved å øke bindingsstyrken mellom nøytralisator og ligand, spesielt ved å øke av-hastigheten til nøytralisatoren.

Dette kan helst oppnås ved å mutere sekvensen til den respektive VH- og VL-regionen på en tilfeldig måte ved (i) å sette inn én eller flere mutasjoner tilfeldig gjennom hele sekvensen eller ved (ii) å sette inn enkle mutasjoner eller flere etterfølgende mutasjoner (for eksempel strekk på fem, seks, sju, åtte, ni eller ti aminosyrer) inn i regionene til scFv som har en høy mulighet for å interagere med antigenet. De respektive mutantene må så karakteriseres for enhver økning i aktivitet eller før karakterisering så må de anrikes for foretrukne kvaliteter (for eksempel sterkere binding) via passende seleksjonsfremgangsmåter (det vil si fagdisplay).

Eksempel 2.4.1:

Økning av affiniteten ved å mutere VH CDR3 i én eller flere posisjoner

For å forbedre bindingskarakteristikkene til et antistoff-fragment, for eksempel et scFvmolekyl, ved enkle punktmutasjoner eller korte aminosyrestrekk, så må aminosyreresiduer som har en høy sannsynlighet for å interagere med det respektive antigenet, målrettes. Med denne tilnærmingsmåten så er det ikke nødvendig å screene mer enn kun et begrenset antall mutanter uten å redusere muligheten for suksess. Det tungkjede-CDR3 til et antistoff eller et fragment av det bidrar vanligvis sterkt til den totale bindingen av et antigen av dette antistoff eller antistoff-fragment. Det ble derfor overveid at en lovende måte for å øke bindingsaffiniteten til et antistoff eller antistofffragment kan være å mutere nukleotidsekvensen som koder for VH CDR3. En rekke forskjellige metodologier eksisterer for å utføre slik målrettet tilfeldig mutagenese, noen av disse er beskrevet i det følgende i lys av hvordan bindingsaffiniteten av scFvmolekyler som er beskrevet over, kan økes.

A) For å målrette VH CDR3 så må et passende restriksjonssete introduseres inn i nukleotidsekvensen innen VH CDR3, helst ved gensyntese av hele VH-regionen med en modifisert CDR3-nukleotidsekvens ved å bevare den originale aminosyresekvensen (Entelechon, Tyskland). Via kløyving ved det respektive restriksjonsenzymet og å tilsette S1-nuklease/Klenow DNA-polymerase I og dGTP, etterfulgt av en mutant oligomerdupleks, så kan målrettet tilfeldig mutagenese i én eller flere aminosyreposisjoner utføres i henhold til Matteucci and Heyneker, Nucleic Acids Research 11: 3113 ff (1983). De mutageniserte VH-ene blir deretter kombinert med de respektive VL (via en passende linker) i en passende scFv-uttrykksvektor og blir så transformert inn i E. coli-celler. Enkle kolonier som uttrykker variant scFv-ene kan så plukkes og screenes for forbedret scFv-er som beskrevet for å screene og karakterisere scFv-treff og ledere i de tidligere eksemplene.

B) En alternativ fremgangsmåte er den oligonukleotidstyrte mutagenesen med den doble primerfremgangsmåten som beskrevet i detalj i Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) "A laboratory manual". I hovedsak så blir VH-regionen klonet inn i en M13-basert vektor og enkelttrådet plasmid blir isolert. En primer som er i stand til å hybridisere til det enkelttrådede plasmidtemplatet som inneholder en randomisert sekvens, blir annealet og utvidet. Etter propagering av den respektive plasmidpoolen i E. coli, så kan de muterte VH-ene høstes fra poolen med plasmider og bli kombinert med det opprinnelige VL (via en passende linker) i en passende scFv-uttrykksvektor og deretter transformert inn i E. coliceller. Enkle kolonier som uttrykker variant scFv-ene plukkes og screenes for forbedrede scFv-er som beskrevet for screening og karakterisering av scFv-treff og ledere i de tidligere eksemplene.

C) Enda et annet alternativ er å mutere opp til seks eller selv flere etterfølgende aminosyrer. Til dette formål så kan en slettingsvariant av VH-nukleotidsekvensen konstrueres som har et slettet CDR3 og FR4. Denne konstruksjon anvendes som et templat for en én- eller totrinns PCR-oppformering, hvor en passende 5'-primer (som hybridiserer til den 5'-enden av VH-sekvensen og tilsetter et passende kloningssete) kombineres med et sett 3'-primere som annealer til den 3'-enden av FR3-regionen som templat og tilsetter en CDR3- og FR4-region (med et passende restriksjonssete) til oppformeringsfragmentet. Dette sett med 3'-primere inneholder en sekvens på én eller flere tripletter for å sette inn tilfeldige kodoner innen CDR3-sekvensen. Denne pool med VH-regioner som inneholdt randomiserte CDR3-regioner kan så deretter kombineres med den respektive VL (via en passende linker) i en passende scFv-uttrykksvektor og bli transformert inn i E. coli-celler. Enkle kolonier som uttrykker variant scFv-ene, ble så plukket og screenet for forbedrede scFv-er som beskrevet for screening og karakterisering av scFv-treff og ledere i de tidligere eksemplene.

Respektive pooler med muterte scFv-er som har en høyere diversitet (som lett kan screenes) kan klones inn i en passende fagdisplayvektor og forbedrede scFv-er kan så selekteres ved fagdisplay på antigenet av interesse helst under betingelser for å redusere antigenkonsentrasjoner for å selektere for høyere affiniteter. Fagdisplayseleksjoner utføres i henhold til standard protokoller som beskrevet annet sted her. Enhver av de ovenfor nevnte fremgangsmåtene A til C kan kombineres eller utføres i repeterte sykluser og videre å forbedre og optimalisere allerede modifiserte scFv-er.

Eksempel 2.4.2:

Å øke affiniteten ved å mutere V-regionene tilfeldig gjennom hele sekvensen Istedenfor å mutere spesifikke seter på scFv som har en høy mulighet for interaksjon med det respektive antigenet, så kan en mer pragmatisk tilnærmingsmåte utføres ved å introdusere punktmutasjoner gjennom hele VH- og/eller VL-sekvensen og deretter screene for optimaliserte scFv-er og å selektere og å screene for optimaliserte scFv-er. Som et eksempel kan VH- og/eller VL-sekvensen mutageniseres ved å anvende E. colimutatorstammer (som beskrevet i Low et al.260: 359 ff J MoI Biol (1996)) eller feilinkorporering av nukleotider ved DNA-polymeraser som beskrevet i detalj i Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) "A laboratory manual". Kloning, uttrykk og seleksjon av optimaliserte varianter av scFv-molekyler kan utføres ved fagdisplay eller ved den ofte anvendte ribosomdisplayteknologien (som beskrevet i EP 0975 748 Al ). Optimaliserte versjoner blir uttrykt i passende vektor/E. coli-systemer for å screene for forbedrede scFv-kandidater.

Passende metodologi som beskrevet over under eksempel 2.4, benyttes for å optimalisere en representativ scFv-leder (scFv A) og resulterer i en klasse monoklonale, humane anti-GM-CSF-nøytraliserende antistoff-fragmenter representert ved scFvmolekylene B-N. Karakteristikkene til disse scFv-molekyler vil bli tydeliggjort og beskrevet videre i de følgende eksempler. Genereringen av monoklonale IgG-molekyler fra de valgte scFv-molekylene er beskrevet i det følgende eksemplet.

Eksempel 3

Kloning og eukaryot uttrykk av monoklonale antistoffer fra de valgte scFv-ene Selv om bakterier er kjent for å uttrykke funksjonelle Fab-fragmenter så er de vanligvis ikke i stand til å produsere fullstendig funksjonelle immunglobuliner. For produksjonen av fullstendig funksjonelle antistoffer så må pattedyrceller anvendes og derfor så ble VL-regionen til scFv 5-306 og forskjellige VH-regioner av scFv-molekyler valgt i de tidligere eksemplene, subklonet inn i pattedyruttrykksvektorer (spesielt VH-regioner til scFv A og scFv B).

Eksempel 3.1:

Kloning av den humane, lette kjeden basert på scFv 5-306

For å generere passende terminale restriksjonsseter så ble DNA-fragmentet som koder for VL-regionen til scFv 5-306, reoppformert ved hjelp av PCR og resulterte i Vkappafragmenter med et Bsu36I-sete i den 5'-enden og et Xho I-sete i den 3'-enden. Dette fragment ble så subklonet inn i plasmidet BSPOLL ved hjelp av Bsu36I og XhoI ved å anvende den 5'-primeren (5'-ACGTCACCTTAGGTGTCCACT CCGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGC-3') og den 3'-primeren (5'-CATGCACTCGAGCTTGGTCCCTCCGCCGAAAG-3') og tilsatte dermed en pattedyrledersekvens og en human Ckappa konstant region og dette ble verifisert ved sekvensering. Ved å anvende EcoRI og Sal1 så ble 5-306 VL-Ckappa DNA kuttet ut fra BSPOLL og subklonet inn i den eukaryote uttrykksvektoren pEF-ADA utledet fra uttrykksvektoren pEF-DHFR (Mack et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA.92, 7021-5) ved å erstatte cDNA-et som koder for murindihydrofolatreduktase (DHFR) med det som koder for murinadenosindeaminas (ADA).

Eksempel 3.2:

Kloning av humane tungkjedevariable domener

Fra forskjellige humane VH-regioner valgt i de tidligere eksemplene (spesielt VH-regioner fra scFv A og scFv B) så ble den variable regionen reoppformert ved hjelp av PCR og dannet Bsu36I-restriksjonsseter i begge ender. For alle konstruksjoner så ble kombinasjonen av to primere anvendt: 5'-primer VH-Bsu36I (5'-ACGTCACCTTAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGT CCAGTCTGGGGCT GAGGTGAAGAAGC-3') og 3'-primer (5'-ACGTCACCTGAGGAGACGGTGACCATTGTC CCTTG-3'). De resulterende DNA-fragmentene ble så subklonet ved å anvende disse restriksjonsseter inn i den eukaryote uttrykksvektoren pEF-DHFR som allerede inneholdt en eukaryot ledersekvens og et DNA-fragment som koder for den humane IgG1-tungkjedekonstante regionen. De tungkjedevariable regionene ble dermed satt inn mellom lederen og den tungkjedekonstante regionen. De korrekte sekvensene til de variable regionene ble bekreftet ved sekvensering.

Eksempel 3.3:

Omdannelse av scFv-fragmenter til fullstendige, humane IgG-er

Plasmid som koder for den lette kjeden (VL 5-306/Ckappa) og plasmid som koder for én tung kjede (VH/humant IgG1 konstant region) ble kotransfektert i HEK-celler i henhold til standard protokoller for transient proteinuttrykk og cellene ble dyrket for å tillate uttrykket og produksjonen av immunglobulinene i dyrkningsmediet. På denne måten så ble IgG A, utledet fra scFv A og IgG B, utledet fra scFv B produsert. Etter den respektive produksjonsperioden så ble supernatantene høstet og de humane immunoglobuliner ble isolert via protein A-kromatografi i henhold til standard protokoller for rensingen av immunglobuliner. Rensede immunglobuliner ble så anvendt for videre karakteriseringseksperimenter.

Eksempel 3.4:

Reomdannelse av IgGs spesifisiteter til scFv-fragmenter

VH-regioner fra IgG-konstruksjonene (IgG A og IgG B, som beskrevet over) ble reklonet inn i en passende scFv-uttrykksvektor i henhold til standard protokoller og ble operativt koblet via en fleksibel linker til VL-regionen som stammet fra den humane lette kjeden i eksempel 3.1. Disse konstruksjoner ble produsert løselige i periplasma til E. coli som beskrevet over. Karakteriseringen til disse scFv (scFv O, utledet fra IgG A, og scFv P, utledet fra IgG B) er beskrevet i de følgende eksemplene.

Eksempel 4

Evaluering av bindingsspesifisitet til et humant, monoklonalt anti-GM-CSF-antistoff for primat og humant GM-CSF

Hensikten med dette eksperiment var å vise at et antistoff skaffet tilveie som satt frem over, binder spesifikt til GM-CSF. Derfor så ble bindingen av et slikt antistoff til forskjellige, rekombinante, humane ("rh"), kolonistimulerende faktorer (rhG-CSF og rhM-CSF, Strathmann) sammenlignet med det samme antistoffets binding til rhGM-CSF ved hjelp av ELISA.

50 μl av det bestemte antigenet (1 μg/ml i PBS) ble overtrukket på en ELISA-plate (Nunc, Maxisorp) i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking 3 ganger med PBS/0,05 % Tween 20 så ble brønnene blokkert med 200 μl PBS/3 % tørrmelkpulver uten fett per brønn i 1,5timer ved romtemperatur, etterfulgt av vasking 3 ganger med PBS/0,05 % Tween 20.50 μl/brønn av en rekke humane antistoffer (for eksempel IgG A og IgG B), hver med identiske lette kjeder med sekvens i henhold til SEKV.ID. NR.34, men med forskjellige tunge kjeder i henhold til SEKV.ID. NR.35-48, ble tilsatt i en fortynningsrekke i området fra 1 μg/ml til 0,5 ng/ml (i PBS/0,05 % Tween 20/3 % tørrmelkpulver uten fett) og inkubert i 1 time. Etter 3 vaskinger med PBS/0,05 % Tween 20 så ble bundet antistoff detektert ved å anvende 50 μl av et pepperrot-peroksidasekonjugert geite anti-humant IgG-antistoff (Dianova; 1:1000 fortynnet i PBS/0,05 % Tween 20/3 % tørrmelkpulver uten fett). Signalet ble utviklet ved å tilsette 50 μl/brønn ABTS-løsning (Roche) og absorpsjon ble målt ved 405 nm ved å anvende en bølgelengde på 450 nm som en referanse.

Kommersielt tilgjengelige kaninantistoffer (Strathmann Biotech AG) spesifikke for henholdsvis rhM-CSF og rhG-CSF, ble anvendt som positive kontroller for binding til disse antigener, nevnte binding ble detektert med et alkalisk fosfatasekonjugert geitantikanin-antistoff. Signalet ble utviklet med 50 μl/brønn pNpp-løsning (Sigma) og absorpsjon ble målt ved 405 nm ved å anvende en bølgelengde på 450 nm som en referanse.

Resultatene er vist i fig.6A, 6B og 6C for to representative, humane antistoffer, IgG A og IgG B.

Som kan sees i fig.6A så førte økende konsentrasjon av titrert antistoff til en økning i absorpsjon, noe som indikerer god binding til rhGM-CSF for begge representative antistoffer IgG A og B. Fig.6B viser resultatene av de samme to representative antistoffene med binding til rhM-CSF. Som kan sees i denne figur så førte økende konsentrasjoner av et kaninanti-rhM-CSF-antistoff til økende absorpsjon, det vil si økende binding av dette kontrollantistoff (fylte rundinger), mens de to representative antistoffene beskrevet over (fylte firkanter og fylte triangler) er lagt ovenpå som en kontinuerlig grunnlinjeabsorbans som ikke øker med økende testantistoffkonsentrasjon.

Et fullstendig analogt resultat ses for begge kontrollantistoff så vel som representative test-IgG-er A og B i fig.6C, som viser resultatene av bindingen til rhG-CSF.

Sammen så indikerer data vist i fig.6A, 6B og 6C at de to representative testantistoffer IgG A og B spesifikt binder seg til rhGM-CSF, men ikke til noen andre kolonistimulerende faktorer slik som M-CSF og G-CSF. Slik antigenbindende spesifisitet er viktig for et lovende antistoffterapeutisk middel.

Eksempel 5

Karakterisering av bindingsdata for humane, monoklonale anti-GM-CSF-antistoffer og fragmenter av dem

Det var ønsket å generere en kvalitativ rekkefølge av forskjellige medlemmer identifisert som positive bindere av rhGM-CSF ved ELISA som beskrevet over i eksempel 2. Rekkefølgen var ment å reflektere kinetikk (av-hastighet) og ekvilibrium (affinitet) parametere av diverse, representative antistoffbindere som var identifisert. For dette så ble overflateplasmonresonans (SPR) utført på BIAcore™ 2000-apparatet, Biacore AB (Uppsala, Sverige) med en strømningshastighet på 5 μl/min og HBS-EP (0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % overflateaktivt stoff P20) som kjører bufferen ved 25 ºC. Rekombinant humant GM-CSF (Leukine, Berlex, heretter alternativt referert til som "antigenet" eller "rhGM-CSF") produsert i gjær, ble immobilisert på strømningsceller 2-4 på en CM5-sensorchip. Chip-overflaten ble aktivert ved å injisere 80 μl av 0,1 M natriumhydroksysuccinimid, 0,4 M n-etyl-N'-(3-dimetylaminpropyl)-karbodiimid (NHS/EDC). Antigenet ble koblet ved manuell injeksjon av 10 μg/ml rhGM-CSF i 0,01 M natriumacetat, pH 4,7. Forskjellige tettheter av antigen ble immobilisert på strømningsceller 2-4 ved å justere mengden av manuelle injeksjonstider. Strømningscelle 1 forble ikke-modifisert mens strømningscelle 2 ble overtrukket med den høyest mulige tettheten av rhGM-CSF (800 RU). Strømningscelle 3 ble overtrukket med 50 % av mengden antigen immobilisert på strømningscelle 2 og strømningscelle 4 ble overtrukket med den laveste tettheten av rhGM-CSF (vanligvis 10 %). Den aktiverte overflaten av sensorchipen ble blokkert ved å injisere 85 μl 1 M etanolamin og chipen ble ekvilibrert over natten ved en konstant strømningshastighet på 5 μl/min av HBS-EP.

Eksempel 5.1:

Kvalitativ bestemmelse av kinetiske bindingsparametere (av-hastighet) for scFvfragmenter av humane, monoklonale anti-GM-CSF-antistoffer

Biacore-eksperimenter ble utført som satt frem i den foregående paragrafen. Før eksperimentet så ble eluerte proteinløsninger av det periplasmatiske preparatet ("PPP") dialysert mot PBS ved 25 ºC i 2 timer og fortynnet 1:1 i HBS-EP. Bindingskinetikk til medlemmer av hevdet klasse ble målt ved å injisere 10 µl av renset periplasmatisk proteinløsning ved 25 ºC over sensorchipen. Den ikke-spesifikke bakgrunnsadsorpsjonen av protein til den ikke-modifiserte sensorchipoverflaten (FC1) ble trukket fra responssignalet i de rhGM-CSF-immobiliserte strømningscellene (FC2, FC3, FC4). Det relative responssignalet (FC2-1, FC3-1, FC4-1) ble bestemt og den spesifikke dissosiasjonshastigheten ble målt i 100 sek.

Resultatene av disse eksperimenter er vist i fig.7A for en rekke representative scFvfragmenter som tidligere var blitt identifisert som positive rhGM-CSF-bindere i ELISA-eksperimenter. Representative scFv-antistoff-fragmenter som Biacore-data, er vist for i fig. 7A er som følger: scFv A, scFv B, scFv C, scFv D, scFv E, scFv F, scFv G, scFv H, scFv I, scFv J, scFv K, scFv L, scFv M og scFv N.

Når Biacore-resultatene tolkes så korrelerer vanligvis amplituden til bindingstoppen (RUmax) direkte med proteinkonsentrasjonen i den injiserte prøven. Kinetikk påhastigheten (ka) er konsentrasjonsavhengig og på grunn av varierende konsentrasjoner av protein i PPP, kan den ikke anvendes for den kvalitative rekkefølgen av medlemmene av hevdet klasse. Kinetikk av-hastigheten (kd) er proteinkonsentrasjonuavhengig og karakteristisk for bindingsstyrken til de respektive medlemmene av hevdet klasse. Alle identifiserte medlemmer av hevdet klasse viser spesifikk binding til det immobiliserte rhGM-CSF. Medlemmene av hevdet klasse med den tilsynelatende beste av hastigheten ble identifisert og etter videre korrelering av SPR-data med hemmingsdata innsendt for bestemmelse av affinitet via likevektsbindingseksperimenter på BIAcoren.

Ved å undersøke fig.7A så ser man distinkte topper for hvert representative scFvantistoff-fragment A-N, de øvre delene av disse viser hver en karakteristisk kurve som kan ekstrapoleres for å skaffe tilveie en avhastighet for scFv-fragmentet det er spørsmål om. Kvalitativt så kan man så konkludere at hver av de representative scFv-fragmentene binder godt til humant GM-CSF.

Eksempel 5.2:

Kvantitativ bestemmelse av likevektsbindingsparametere (affinitet) for visse humane anti-GM-CSF-antistoffer og scFv-fragmenter av dem

Etter å ha etablert kvalitativt i eksempel 5.1 at en rekke scFv-fragmenter av anti-GM-CSF-antistoffer som tidligere har testet positivt for GM-CSF-binding med ELISA, viste fornuftige kinetikk av-hastigheter når de bandt til humant GM-CSF, så ble det så ønsket å skaffe tilveie en kvantitativ representasjon av slik binding for antistoffer og fragmenter av dem ved å fokusere på likevektsbindingskarakteristika til rekombinant humant GM-CSF. Som vist over i eksempel 4 så er spesifikk binding til antigenet - her rhGM-CSF - én av karakteristikaene og de spesifikke attributtene til klassen med anti-GM-CSF-antistoffer og fragmenter av dem som krevd her.

Bindingskinetikk (av-hastigheten, kd, og på-hastigheten, ka) til visse representative medlemmer av klassen med humane anti-GM-CSF-antistoffer og fragmenter av dem ble målt ved å injisere 10 μl renset protein (det vil si antistoff eller fragment av det) i en fortynningsserie i området fra 10 μg/ml til 1 pg/ml renset protein og ved å måle dissosiasjonen ved 25 ºC i 100 sek. Det rensede proteinet var bufret i HBS-EP. Data ble tilpasset ved å anvende BIAevalution™ software og å bestemme hastighetskonstanten for dissosiasjon og assosiasjonskinetikker med en 1:1 Langmuir-bindingsligning (se formel 1 og 2 under) hvor A er konsentrasjonen av injisert renset proteinanalytt og B[O] er Rmaks:

dB / dt = -(ka * [A] * [B]- kd * [AB]) (formel 1)

dAB / dt = -(ka * [A] * [B]- kd * [AB]) (formel 2)

Kinetikkbindingskurver ble bestemt med opp til 8 konsentrasjoner av hvert representative, humane anti-GM-CSF-antistoff eller fragment av det som ble analysert. Den uavhengige tilpassingen av rådata resulterte i dissosiasjons- og assosiasjonshastighetskonstanter som ble anvendt for å beregne likevektsdissosiasjonskonstanten (KD).

Resultatene skaffet tilveie for hvert representative, humane anti-GM-CSF-antistoff eller fragment av det er vist i fig.7B-I. Spesifikt så viser fig.7B bindingsdataene skaffet tilveie for representativ IgG B; fig.7C viser bindingsdataene skaffet tilveie for representativ IgG A; fig.7D viser bindingsdataene skaffet tilveie for representativ scFv C; fig. 7E viser bindingsdataene skaffet tilveie for representativ scFv I; fig.7F viser bindingsdataene skaffet tilveie for representativ scFv B, fig.7G viser bindingsdataene skaffet tilveie for representativ scFv A; fig. 7H viser bindingsdataene skaffet tilveie for representativ scFv E; og fig.7I viser bindingsdataene skaffet tilveie for representativ scFv D. Dataene er oppsummert under i tabell 2.

Tabell 2

Kvantitative affinitetsbindingsdata for visse representative, humane anti-GM-CSF-antistoffer og fragmenter av dem

Eksempel 6

Minimale epitopkrav for et visst representativt fragment av et humant anti-GM-CSF-antistoff

Det var ønskelig å bestemme epitopen bundet av humane anti-GM-CSF-antistoffer og fragmenter av dem som beskrevet og krevd her. Til dette så ble en peptidspotting ("pepspot") analyse utført ved å anvende scFv A som et representativt medlem av denne klasse med molekyler og humant GM-CSF som antigen.

Generelt så blir et pepspot-eksperiment utført som følger. Overlappende 13mer peptider utledet fra aminosyresekvensen av hGM-CSF (for GM-CSF-sekvensen til mennesker og visse andre primater, se her over så vel som fig.8A, så vel som SEKV.ID. NR.: 49-51) ble kovalent koblet til et Whatman 50-cellulosemembran ved den C-terminale enden mens den acetylerte N-terminale enden forble fri. De individuelle 13mer-peptidene generert (av JPT Peptide Technologies GmbH) er vist under i tabell 3. Lengden av den overlappende sekvensen til ethvert av de to respektive peptider ble satt til å være 11 aminosyrer. I henhold til produsentens protokoll så ble membranen skylt med absolutt EtOH i 1 min, etterfulgt av vasking med TBS og blokkering med TBS/3 % BSA over natt. Som ved enhver etterfølgende inkubering og vasking så ble blokkeringen utført i romtemperatur. Etter vasking 3 ganger med TBS/0,05 % Tween 20 i 10 min så ble membranen inkubert med 1 μg/ml scFv A i TBS/3 % BSA i 2,5 timer etterfulgt av vasking utført som tidligere. Deteksjon av scFv ble utført ved å anvende et anti-Penta-His-antistoff (Qiagen, 0,2 μg/ml i TBS/3 % BSA) og etterfulgt av et pepperrot-peroksidasekonjugert geit-antimus IgG (Fc-gamma-spesifikt) antistoff (Dianova, 1:10 000 i TBS/3 % BSA) så ble inkuberingen med hver av dise respektive antistoffer utført i 1 time. Etter 3 vaskinger med TBS/0,05 % Tween 20 i 10 min så ble signalet fremkalt med forsterket kjemiluminescens (SuperSignalWest Pico Luminol/Enhancer Solution and SuperSignalWest Pico StablePerokside Solution; Pierce) og eksponering for en BioMax-film (Kodak).

Sterke bindingssignaler for scFv A til strekk av humant GM-CSF ble detektert på et strekk med peptidspot mellom spot A og B så vel som på spot C (se tabell 3 under og fig. 8B). Som kan ses i fig.8B så syntes binding til andre spot å være av lavere styrke. Strekket med spot som dekker punktene A og B korresponderer til aminosyreresiduer 15-35. Alle 13mer-peptider som utgjør denne region, inneholder ett minimalt aminosyrestrekk med aminosyrer 23-27 (RRLLN). Spot C korresponderer til aminosyreresiduer 65-72 (GLRGSLTKLKGPL) av humant GM-CSF. Disse funn tyder på at scFv A sannsynligvis gjenkjenner en diskontinuerlig epitop.

I den sekundære strukturen til humant GM-CSF så er aminosyrer 15-35 plassert i heliks A, mens residuer som korresponderer til spot C er del av en sløyfestruktur som er lokalisert mellom heliks C og D. En tredimensjonal modell av folding av molekylet avslører nær sterisk nærhet for disse steder med hensyn til hverandre.

Det minimale aminosyresekvensmotivet i peptidene til spot A-B korresponderer til residuer 23-27 i humant GM-CSF (RRLLN). En økende signalstyrke fra spot A til B kan forklares ved bedre tilgjengelighet av RRLLN-epitopen i peptid som korresponderer til spot B enn i peptidet som korresponderer til spot A. I peptid A så er epitopen lokalisert direkte ved den C-terminale enden som er koblet til membranen, mens den er i peptid B lokalisert ved den mer tilgjengelige N-terminale enden av peptidet.

Tabell 3

Sekvenser av overlappende 13mer-peptider immobilisert på cellulosemembranen

Eksempel 7

Nøytraliseringspotens til visse humane, anti-humane GM-CSF-antistoffer/antistoff-fragmenter

Eksempel 7.1:

Kvalitativ evaluering av nøytraliseringspotensialet til visse representative, humane, anti-humane GM-CSF-antistoffer og fragmenter av dem

Formålet med dette eksperiment er å oppnå kvalitativ informasjon om den nøytraliserende aktiviteten til representative, humane anti-GM-CSF-nøytraliserende antistoffer og fragmenter av dem. For dette så ble den humane GM-CSF-avhengige cellelinjen TF-1 (DSMZ, ACC 334) anvendt. Prolifereringshastigheten til denne cellelinje er avhengig av tilstedeværelsen av humant GM-CSF slik at å måle cellevekst etter inkubering av celler med humant GM-CSF med og uten et antistoff mistenkt for å ha GM-CSF-nøytraliserende aktivitet, kan anvendes for å bestemme om slik nøytraliseringsaktivitet faktisk eksisterer.

TF-1-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco; L-glutamin, fenol-rød fri), 10 % varmeinaktivert FCS i nærværet av 2,5 ng/ml rhGM-CSF som beskrevet av distributøren (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Tyskland). Cellene ble dyrket til en celletetthet på 0,5 x 10<6>celler/ml. For prolifereringsanalysen så ble TF-1-celler høstet ved sentrifugering ved 300 x g i 4 min og vasket med 1 x PBS (Dulbecco's, Gibco). Celler ble resuspendert til en sluttkonsentrasjon på 1 x 10<5>celler/ml i RPMI 1640, 10 % FCS og 90 μl cellesuspensjon per Microtest flatbunnet celledyrkningsplatebrønn ble anvendt (0,9 x 10<4>celler/brønn). En sluttkonsentrasjon på 0,3 ng/ml rhGM-CSF ble anvendt for å stimulere prolifereringen av TF-1-cellene. For nøyralisering av GM-CSF-avhengig proliferering så ble renset PPP av representative fragmenter av et humant anti-GM-CSF-antistoff dialysert mot I x PBS ved 25 ºC i 2 timer.10 μl dialysert og sterilfiltrert proteinløsning (0,22 μm filter) ble tilsatt til 100 μl løsning som inneholdt TF-1 og rhGM-CSF.

Etter inkubering i 72 timer ved 37 ºC ved 5 % CO2så ble den proliferative statusen til TF-1-celler bestemt med en fargeanalyse basert på kløyvingen av tetrazoliumsalter (WST-I, Roche) ved mitokondriell dehydrogenase i viable celler. Formazanfargen dannet ved metabolsk aktive celler, ble kvantitert ved å måle dets absorbans med en ELISA-leser ved 450 nm.

Hemmingen av den humane GM-CSF-avhengige prolifereringen av TF-1-celler ved de testede, representative fragmentene av humane antihumane GM-CSF-antistofffragmenter var varierende i styrke (fig.9). Mens to slike fragmenter ikke hadde en nøytraliserende effekt (scFvF og scFvL); så viste fem konstruksjoner (scFv J, scFv K, scFv M, scFv N og scFv H) intermediathemming og sju konstruksjoner (scFv B, scFv I, scFv E, scFv D, scFv G, scFv C, scFv A) viste sterk hemmings av den GM-CSF-avhengige prolifereringen av TF-1-celler. Mangelen eller den lavere grad av nøytraliseringseffekt kunne skyldes et lavere uttrykksnivå av den bestemte representative scFv eller et mindre stabilt kompleks dannet mellom et bestemt representativt scFv og rhGM-CSF i løpet av inkuberingsperioden på 72 h ved 37 °C.

Eksempel 7.2:

Kvantitativ evaluering av nøytraliseringspotensial av visse representative, humane, anti-humane GM-CSF-antistoffer og fragmenter av dem som målt ved celleproliferering

Valgte representative scFv-molekyler som vist over og som innehar sterk hemming av TF-1-proliferering, ble så utsatt for en kvantitativ analyse av nøytraliseringseffektivitet. Til dette så ble den samme humane GM-CSF-avhengige cellelinjen TF-1 (DSMZ ACC 334) anvendt. TF-1-celler ble dyrket og laget for prolifereringsanalysen som beskrevet i detalj i eksempel 7.1 over. En sluttkonsentrasjon på 0,3 ng/ml rhGM-CSF ble anvendt for å stimulere prolifereringen av TF-1-cellene. For nøytralisering av GM-CSF-avhengig proliferering så ble derfor 10 μl av rensede prøver med representative, humane, anti-humane GM-CSF nøytraliseringsmonoklonale antistoffer eller fragmenter av dem tilsatt til en løsning som inneholdt 100 μl TF-1 og rhGM-CSF i en fortynningsrekke. Sluttproteinkonsentrasjoner var i området fra 10 μg/ml til 10 pg/ml.

Prøver ble inkubert ved 37 ºC ved 5 % CO2i 72 timer. Etter 72 timer så ble den proliferative statusen til TF-1-cellene bestemt som beskrevet i eksempel 7.1 over.

Dataene ble tilpasset halvmaksimal hemming av proliferering (IC50) ved å anvende den ikke-lineære regresjonskurve tilpasningen til Prismesoftwaren.

Den klare GM-CSF-nøytraliseringseffekten som ses i det kvalitative prolifereringshemmingseksperimentet beskrevet i eksempel 7.1 over kunne bekreftes å kvantifisere. Alle testede scFv-fragmenter av humane, anti-humane, GM-CSF-monoklonale, nøytraliserende antistoffer viste en halvmaksimal hemmingskonstant (IC50) i nanomolarområdet i dette prolifereringshemmingseksperimentet. En klar rekkefølge i nøytraliseringseffektiviteten kunne etableres som ses i fig.10A.

De testede humane, anti-humane, GM-CSF-monoklonalt nøytraliserende IgG-antistoffene viste en signifikant høyere nøytraliseringseffektivitet enn deres scFv-motparter. Den halvmaksimale hemmingskonstanten for IgG-molekylene generert i dette forsøk, var i det subnanomolare området. Som kan ses i fig.10B så var IC50evaluert for IgG A, 0,9 nM og IgG B hadde en IC50 på 0,3 nM.

For å sjekke om scFv-antistoff-fragmentene generert fra IgG A og B (henholdsvis scFv O og P) kvantitativt korresponderer i deres nøytraliseringspotensiale for scFv A og B, så ble analoge TF-1-nøytraliseringsanalyser utført som beskrevet over unntatt at scFv O og P ble anvendt som testmolekyler. Resultatene er vist i fig.10C og 10D for henholdsvis scFv P og O. Som kan ses fra fig.10D så har scFv O det samme nøytraliseringspotensialet som scFv A og viser at gjenomdannelsen fra IgG tilbake til scFv-format er mulig uten tap av biologisk aktivitet.

Eksempel 7.3:

Kvantitativ evaluering av nøytraliseringspotensial til visse representative, humane anti-rhGM-CSF-antistoffer og fragmenter av dem, som målt ved å redusere IL-8-produksjon

Dette eksperimentet ble utført for å kvantifisere nøytraliseringsaktiviteten til representative, humane, anti-humane GM-CSF-antistoffer og fragmenter av dem ved å måle GM-CSF-avhengig IL-8-produksjon av U-937-celler. GM-CSF-antigenet anvendt i de foregående eksperimentene var rhGM-CSF. De monocyttiske U-937-cellene ble dyrket i RPMI 1640-medium Gibco (L-glutamin, fenol-rød fri) supplementert med 10 % varmeinaktivert FCS som beskrevet av distributøren (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Tyskland). Celler ble dyrket til en celletetthet på 1 x 10<6>celler/ml.

Ved å utføre hemmingsanalysen basert på måling av IL-8-produksjon så ble celler høstet ved sentrifugering ved 300 x g i 4 min og resuspendert til en sluttkonsentrasjon på 1 x 10<6>celler/ml i RPMI 1640, 10 % FCS.1,8 x 10<5>celler/brønn (180 μl cellesuspensjon) ble sådd ut per Microtest flatbunnet cellekulturplatebrønn. En sluttkonsentrasjon på 1 ng/ml rhGM-CSF ble anvendt for å stimulere IL-8-produksjon ved U-937-cellene. 20 μl renset scFv eller IgG ble tilsatt til 180 μl U937-celler og rhGM-CSF-løsning i en fortynningsserie som resulterte i sluttproteinkonsentrasjonen i området fra 10 μg/ml til 10 pg/ml.

Etter inkubering i 18 timer ved 37 °C og 5 % CO2ble celler spunnet ned ved sentrifugering av dyrkningsplater i 2 min ved 600 x g. Dyrkningssupernatanter ble høstet ved å pipettere til en ny plate og ble analysert for å bestemme konsentrasjonen av IL-8 ved å anvende det OptEIA Human IL-8 ELISA-settet (Becton Dickenson and Company).

ELISA-deteksjon ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet så ble 50 μl av fangingsantistoff fortynnet i 0,1 M natriumkarbonat, pH 9,5 overtrukket på en mikrotestplate over natt ved 4 °C. Etter 3 vaskinger med PBS/0,05 % Tween 20 så ble brønnene blokkert med 200 μl PBS/10 % FCS per brønn i 1 time ved romtemperatur, etterfulgt av vasking 3 ganger med PBS/0,05 % Tween 20. Deretter ble 50 μl av dyrkningssupernatantprøvene tilsatt til brønnene og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. For senere kvantifisering av IL-8-konsentrasjonen så ble en seriefortynning av IL-8 standard tilveiebrakt av produsenten utført samtidig gjennom prosedyren.

Etter 5 vasker med PBS/0,05 % Tween 20 så ble deteksjon utført ved å anvende 50 μl av Working Detector (deteksjon Ab Av-HRP) tilveiebrakt i det OptEIA Human IL-8 ELISA-settet. Etter 1 times inkubering ved romtemperatur så ble brønnene vasket enda 7 ganger. Signalet ble utviklet ved å tilsette OPD-substratløsning (Sigma) og ble detektert ved en bølgelengde på 490 nm (ved å anvende en referansebølgelengde på 620 nm).

En IL-8 standardkurve ble plottet for kalibrering og IL-8-konsentrasjon i dyrkningssupernatantprøvene ble beregnet i henhold til denne kalibreringskurve. Data ble tilpasset halvmaksimal hemming av IL-8-produksjon (IC50) ved å anvende den ikke-lineære regresjonskurvetilpasningen til Prismesoftwaren.

Alle representative fragmenter av humane anti-rhGM-CSF-monoklonale nøytraliseringsantistoffer som ble testet, viste klar hemming av den GM-CSF-avhengige IL-8-produksjonen til U-937-celler som klart kan ses ved nedgangen i IL-8-konsentrasjon med økende scFv-konsentrasjon i fig.11. Rekkefølgen i nøytraliseringseffektivitet som ses i dette eksperiment er i overensstemmelse med rekkefølgen skaffet tilveie ved å teste de samme molekylene for deres nøytraliseringseffekt i TF-1-prolifereringshemmingseksperimentet som er beskrevet over.

Det vil bli lagt merke til at IC50-verdiene som er bestemt i dette eksperiment, er høyere sammenlignet med de som er skaffet tilveie med de samme molekylene i det foregående TF-1-polifereringseksperimentet. Dette skyldes den høyere GM-CSF-konsentrasjonen som er nødvendig for simulering av IL-8-produksjon av U-937-celler i forhold til det som er nødvendig for å stimulere TF-1.

Eksempel 7.4:

Kvantitativ evaluering av nøytraliseringspotensial til representative, humane antihumane GM-CSF-antistoffer og fragmenter av dem på rekombinant macacan GM-CSF, målt ved celleproliferering

Hensikten med dette eksperiment var å vise nøytraliseringspotensen til representative, humane, antihumane GM-CSF-antistoffer og fragmenter av dem for GM-CSF fra ikkehumane primater fra Macaca-familien ("macGM-CSF").

For å vise nøytraliseringseffekten til valgte scFv- og IgG-molekyler på macGM-CSF så ble et prolifereringshemmingseksperiment utført i henhold til protokollen beskrevet i eksemplene 7.1 og 7.2 ved å anvende macGM-CSF istedenfor hGM-CSF. Både hGM-CSF og macGM-CSF stimulerer prolifereringen av TF-1-celler med den samme halvmaksimale effektiviteten (EC50). En sluttkonsentrasjon på 3 ng/ml macGM-CSF ble anvendt for å stimulere prolifereringen av TF-1-cellene i eksperimentet som tester scFvmolekylene og 0,3 ng/ml rhGM-CSF-celler i eksperimentet som tester IgG B som et representativt, humant, anti-humant GM-CSF-antistoff. For å nøytralisere prolifereringen av TF-1-cellene så ble 10 μl renset, humant anti-humant GM-CSF-antistoff eller et fragment av det, tilsatt til 100 μl TF-1 og macGM-CSF-løsning i en fortynningsrekke. Sluttproteinkonsentrasjoner var i området fra 10 μg/ml til 10 pg/ml. Prøver ble inkubert ved 37 ºC ved 5 % CO2i 72 timer. Etter 72 timer så ble den proliferative statusen til TF-1-cellene bestemt som beskrevet i eksemplene 7.1 og 7.2. Dataene ble tilpasset halvmaksimal hemming av proliferering (IC50) ved å anvende den ikke-lineære regresjonskurvetilpassingen til Prismesoftwaren.

Som ses i fig.12 A så utviste visse representative, humane, antihumane GM-CSF-monoklonale antistoff-fragmenter også et klart nøytraliseringspotensiale til mac GM-CSF (scFv B, scFv E, scFv C, scFv I, scFv A). Videre, som kan ses i fig.12B, så førte økende konsentrasjoner av det representative, humane, anti-humane GM-CSF-monoklonale antistoff IgG B klart til en nedgang i TF-1-proliferering og viste dette antistoffs nøytraliserende potensiale. IC50-verdien generert for IgG B i dette eksperiment (0,3 nM) ved å anvende mac GM-CSF for induksjon av TF-1-celleproliferering er interessant nok lik den som ble generert i eksperimentet med å anvende hGM-CSF, noe som viser en klar kryss-reaktivitet for IgG B for GM-CSF i disse arter.

Eksempel 8

Kryssreaktivitet av IgG B med GM-CSF fra diverse arter

Kryssreaktiviteten til IgG B med GM-CSF fra diverse ikke-humane arter ble undersøkt for å identifisere arter som er passende for senere in vivo-studier. I et første sett med eksperimenter så ble binding av IgG B til kommersielt tilgjengelig rekombinant GM-CSF fra mennesker (Leukine®, Berlex), gris, hund, rotte (R&D Systems, Wiesbaden, tyskland) og mus (Strathmann Biotech, Hamburg, Tyskland) testet i et ELISA-eksperiment. Spesifikt så ble en ELISA-plate overtrukket med 1 μg/ml GM-CSF fra de forskjellige artene som er nevnt. IgG B ble tilsatt i en fortynningsrekke og ble detektert ved å anvende et pepperrot-peroksidasekonjugert, anti-humant IgG1-antistoff. ELISA ble fremkalt ved å tilsette OPD o-fenylendiamin ("OPD", gulorange når den reagerer med peroksidase) substratløsning (Roche, Tyskland) og ble målt ved 490 nm..

Som ses i fig.13 så viste IgG B robust binding til rekombinant, humant GM-CSF, mens GM-CSF fra andre arter som ble testet, ble ikke gjenkjent. Gris, hund, rotte eller mus kan derfor ikke være egnede arter for in vivo-testing. Som ses over i eksempel 7.4 så viser imidlertid IgG B en markert kryss-reaktivitet med macGM-CSF (fra cynomolgusape, macaca fascicularis), noe som antyder at minst én apeart fra macacanfamilien er passende for in vivo-studier av IgG B.

Eksempel 9

Binding ved IgG B til forskjellige, glykosylerte varianter av GM-CSF Hensikten med dette eksperiment var å bestemme i hvilken grad bindingen av IgG B til GM-CSF er avhengig av sist nevntes glykosyleringsmønster. For dette så ble en fortynningsserie av kondisjonert medium som inneholdt naturlig hGM-CSF (human glykosylering), så vel som rekombinant hGM-CSF fra E. coli (ingen glykosylering) og gjær (gjærglykosylering), så vel som rekombinant makak GM-CSF, testet for deres potens til å indusere TF-1-proliferering.

Humant glykosylert GM-CSF ble skaffet tilveie fra dyrkningssupernatanten til IL-1βbehandlede BEAS-2B-celler (humane lungeceller skaffet tilveie fra ATCC CRL-9609). BEAS-2B-celler ble propagert i BEBM-medium substituert med BEGM Bullet Kit (Cambrex, Verviers, Belgia), men dyrket i RPMI 1640, 10 % FCS i nærværet av 50 ng/ml IL-IB (Strathmann Biotech, Hamburg, Tyskland) for induksjon av GM-CSF-produksjon. Etter 48-timers inkubering ved 37 °C, 5 % CO2så ble dyrkningssupernatanten analysert for dets GM-CSF-innhold ved å anvende OptEIA Human GM CSF Elisa-settet (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner.

Rekombinant hGM-CSF fra E. coli ble internt produsert som satt frem i eksempel 1.1 i WO 2005/105844. Rekombinant hGM-CSF fra gjær ble skaffet tilveie kommersielt under varenavnet "Leukine" (Berlex, USA). Makak GM-CSF ble rekombinant produsert i HEK293-celler.

En fortynningsserie med kondisjonert medium som inneholdt naturlig hGM-CSF, så vel som rekombinant hGM-CSF fra E. coli og gjær, og makak GM-CSF ble først testet for deres potens til å indusere TF-1-proliferering. Alle tre glykosyleringsvarianter av humant GM-CSF og makak GM-CSF utviste veldig lignende EC50-verdier for TF-1-aktivering. Disse var henholdsvis 10 pg/ml for E. coli-produsert hGM-CSF, 15 pg/ml gjærprodusert hGM-CSF, 36 pg/ml human lungecelleprodusert hGM-CSF og 11 pg/ml for makak GM-CSF (fig. 14A).

Nøytraliseringsaktiviteten til IgG B ble så bestemt i nærværet av 0,3 ng/ml rekombinant hGM-CSF, eller 0,2 ng/ml fysiologisk hGM-CSF. Etter 72 timer så ble den proliferative statusen til TF-1-celler i nærværet av forskjellige IgG B-konsentrasjoner kvantifisert med en kolorimetrisk reaksjon (fig.14B).

Som oppsummering så viser data som er vist i fig.14 at IgG B hemmet GM-CSF-avhengig proliferering av TF-1-celler ved subnanomolar konsentrasjoner tilsynelatende uavhengig av glykosyleringsmønsteret av humant GM-CSF. Glykosyleringsmønsteret til humant GM-CSF influerer derfor ikke vesentlig evnen IgG B har til å nøytralisere GM-CSF-aktivitet.

Eksempel 10

Effekt av IgG B på biologiske aktiviteter til GM-CSF på eosinofiler

Eksempel 10.1:

Effekt av IgG B på GM-CSF-styrt eosinofil overlevelse

Én av de forskjellige biologiske aktivitetene til GM-CSF er forlengingen av eosinofil og nøytrofil granulocyttoverlevelse. Fordi lungeinflammatoriske sykdommer er assosiert med lokal akkumulering av eosinofiler som spiller en vesentlig rolle i å opprettholde inflammasjon, så ble effekten IgG B har på å hemme GM-CSF-styrt eosinofil overlevelse testet.

Eosinofiler ble isolert fra perifert blod fra friske givere ved utarming av CD16<+>nøytrofiler fra granulocyttpopulasjonen skaffet tilveie by tetthetsgradientsentrifugering og lysis av erytrocytter. Friskt isolerte perifere blodeosinofiler ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10<4>celler/brønn i RPMI 1640/10 % FCS og Pen/Strep i en 96-brønners flatbunnet mikrotestplate. GM-CSF ble tilsatt i en fortynningsrekke i området fra 33 ng/ml til 10 pg/ml for å måle den konsentrasjonsavhengige eosinofile overlevelsen. For å analysere det hemmende potensialet til IgG B på GM-CSF-avhengig eosinofil overlevelse, så ble antistoffet tilsatt i en fortynningsrekke i området fra 10 μg/ml til

0,1 ng/ml. En sluttkonsentrasjon på 0,1 ng/ml GM-CSF ble anvendt for å fremkalle eosinofil overlevelse. Etter inkubering i 72 timer ved 37 °C, 5 % CO2så ble WST-1-reagens tilsatt. Den resulterende fargereaksjonen som korresponderer til delen med viable celler ble kvantifisert ved å måle absorbansen ved 450 nm. Data ble analysert og tilpasset halvmaksimal hemming av overlevelse (IC50) ved å anvende den ikke-lineære regresjonskurvetilpassingen til prismesoftwarepakken. Som ses i fig.15A så ble en halvmaksimal, effektiv dose (EC50) på 0,02 ng/ml rhGM-CSF bestemt. Som ses i fig.

15B så ble en potent nøytraliseringseffekt av IgG B sett med en halvmaksimal hemming av eosinofil overlevelse ved en antistoffkonsentrasjon på 0,13 nM.

Disse data indikerer at IgG B er effektiv i å hemme GM-CSF-avhengig, eosinofil overlevelse på en doseavhengig måte.

Eksempel 10.2:

Effekt av IgG B på GM-CSF-indusert, eosinofil aktivering

Det var også ønsket å undersøke effekten av IgG B på GM-CSF-indusert aktivering av eosinofiler. CD69-uttrykk ble funnet å være oppregulert på perifere eosinofiler (CD16-) som var isolert fra humant blod etter stimulering i 20 timer eller 3 dager med (a) 0,1 ng/ml GM-CSF eller (b) 0,1 ng/ml GM-CSF, IL-3 og IL-5, men ikke med (c) 0,1 ng/ml IL-3 og IL-5 alene (fig.16A). Eosinofiler dyrket i nærværet av medium alene viste ingen oppregulering av CD69. CD69 kan derfor tas som en markør for eosinofil aktivering av GM-CSF, og uttrykksnivået til CD69 ble målt som et mål for GM-CSF-avhengig eosinofil aktivering. Ved begge tidspunkter (20 timer og 3 dager) så forhindret IgG B (10 μg/ml) nesten fullstendig GM-CSF-avhengig aktivering av eosinofiler som ses ved mangel på CD69-uttrykk i flowcytometri.

Eosinofiler ble isolert som beskrevet over i eksempel 10.1 og dyrket ved en tetthet på 5 x 10<5>celler/brønn i RPMI 1640/10 % FCS og Pen/Strep i en 48-brønners flatbunnet mikrotestplate. Celler ble inkubert med medium alene eller i nærværet av 0,1 ng/ml GM-CSF alene eller sammen med 0,1 ng/ml IL-3 eller IL-5.10 μg/ml IgGB ble anvendt for å nøytralisere GM-CSF. Etter en inkubering på 1 eller 3 dager så ble celler analyert for CD69-uttrykk ved flowcytometri.

CD69-deteksjon ved flowcytometri: Uttrykk av CD69 på eosinofiler ble bestemt på et FACS Calibur-instrument (Becton Dickinson). 10<5>celler ble inkubert med 5 μl av et FITC-konjugert anti-humant CD16 (klon 3G8, BD Biosciences) og et PE-konjugert, anti-humant CD69-antistoff (klon FN50, BD Biosciences) hver i 1 time ved 4 ºC. Som en negativ kontroll så ble irrelevante isotypetilpasset FITC- og PE-konjugerte antistoffer anvendt. Etter inkubering så ble celler vasket to ganger med PBS, 1 % FCS, 0,05 % NaN3og resuspendert i 250 μl PBS, 1 % FCS, 0,05 % NaN3. Propidiumjodid ble tilsatt for å merke døde celler til en sluttkonsentrasjon på 1 μg/ml rett før FACS-analyse. Datatolkning ble gjort ved å anvende CellQuestPro-softwaren (BD Biosciences). Propidiumjodidpositive (det vil si døde) celler ble ekskludert fra analysen av CD69-uttrykk.

IgG B reduserte også prosenten av levende og aktiverte eosinofiler som målt ved propidiumjodidfarging av CD16-/CD69<+>celler i nærværet av 0,1 ng/ml GM-CSF. IgG B reduserte prosenten aktiverte celler fra 35 % til 8 % etter 1 dag og fra 43 % til 3 % etter 3 dager med dyrking. I nærværet av 0,1 ng/ml GM-CSF, IL-3 og IL-5 ble prosenten med levende og aktiverte eosinofiler redusert fra 32 % til 8 % og fra 48 % til 11 % etter henholdsvis 1 og 3 dager. Selv om oppreguleringen av CD69 ble fullstendig hemmet av IgG B så overlevde høyere antall av hvilende eosinofiler (CD16-/CD69-) i 3 dager i nærværet av 0,1 ng/ml GM-CSF, IL-3 og IL-5 sammenlignet med celler inkubert med medium eller GM-CSF alene (fig.16A, siste kolonne). Det samme ble observert for celler inkubert i nærværet av 0,1 ng/ml IL-3 pluss IL-5.

I dosefunneksperimenter så ble IgG B tilsatt i fortynningsrekker til eosinofiler dyrket i nærværet av 0,1 ng/ml GM-CSF (fig.16B). En hemmende effekt av IgG B på CD69-avhengig medianfluorescerende intensitet (MFI) ble observert ved en halvmaksimal konsentrasjon på 0,22 nM IgG B.

Til sammen så indikerer disse data at IgG B er en effektiv nøytralisator av GM-CSF-aktivitet i en biologisk sammenheng som er veldig relevant for inflammatoriske luftveissykdommer, for eksempel astma.

Eksempel 11

Preliminære eks vivo-toksikologiske studier ved å anvende IgG B

Som forklart over så kan nøytralisering av GM-CSF-aktivitet være terapeutisk fordelaktig i en rekke sykdomssettinger. Samtidig så spiller imidlertid GM-CSF en viktig rolle i den normale funksjonen til immunsystemet i å bekjempe eksogene fatogener, for eksempel som i fagocytose ved neutrofile granulocytter og monocytter. Denne naturlige funksjon av neutrofiler og monocytter bør bevares upåvirket i nærværet av terapeutiske mengder IgG B. Derfor så undersøkte vi to aspekter av den fagocyttiske prosessen: 1) opptak avbakterier (fagocytose); og 2) oksidativ sprengningsaktivitet (indikasjon på intracellulær dreping). Disse studier er beskrevet i detalj i de følgende eksemplene.

Eksempel 11.1:

Opptak av bakterier (fagocytose)

Bestemmelse av granulocytt og monocytt-fagocytisk aktivitet i heparinisert fullblod ble utført ved å anvende fagotestkittet ved Orpegen (Heidelberg, Tyskland). Denne test er basert på opptaket av opsonisert, fluorescensmerket E. coli ved fagocytiske celler. Disse celler kan så detekteres med grønn fluorescens i flowcytometri.20 μl fluoresceinmerket opsonisert E. coli ble tilsatt til 100 μl heparinisert fullblod og inkuberte ved 37 ºC. Inkubering ved 0 °C ble utført som en negativ kontroll. Etter 10 min ble fagocytoseprosessen stoppet ved å nedkjøle prøvene på is og tilsette 100 μl Quenchingløsning (Orpegen). Denne løsning tillater diskriminering av festing og internalisering av bakterier ved å bremse FITC-fluorescens til overflatebundne bakterier mens fluorescens til internaliserte partikler forblir upåvirket. Etter tre vasketrinn med 3 ml vaskeløsning (Orpegen) ble erytrocytter lysert. De gjenværende leukocyttene ble vasket én gang med 3 ml vaskeløsning (Orpegen). Etter tilsetting av 200 μl DNA-fargeløsning som tillater eksklusjon av aggregerte bakerier eller celler, så ble cellene analysert ved flowcytometri. Prosenten med celler som har utført fagocytose, ble bestemt ved hjelp av FITC-fluorescens.

For å bestemme innflytelsen IgG B har på fagocytose så ble IgG B tilsatt til tre identiske blodprøver til en sluttkonsentrasjon på 10 μg/ml. Disse tre prøver fikk så lov til å inkubere ved 37 °C med IgG B i forskjellige tidsperioder før tilsetting av E. coli. E. coli ble tilsatt til den første prøven øyeblikkelig, mens E. coli ble tilsatt til den andre og tredje prøven etter henholdsvis 24 og 48 timer.

Resultater observert for granulocytter: Direkte etter blod ble tatt så hadde over 98 % av granulocytter tatt opp bakterier enten i nærværet eller fraværet av IgG B (fig. 17A).

Etter inkubering av blodprøver med IgG B i 24 timer så ble en reduksjon til ca.92 % bestemt uten IgG B og til 90 % i nærværet av IgG B (Fig.17B). Etter 48 timer så var 81 % av granulocyttene fagocytosepositive i fraværet og 89 % i nærværet av IgG B (fig.

17C).

Resultater observert for monocytter: Uansett om IgG B var til stede eller ikke så var 98 % av monocyttene fagocyterende direkte etter at blod ble tatt (fig.18A). Etter 24 timers preinkubering med IgG B så var 90 % av monocyttene positive (fig.18B). Etter 24 timer med preinkubering uten IgG B så var 92 % av monocyttene positive. Etter 48 timer så fant vi at 81 % av monocyttene uten IgG B og 89 % med IgG B var fagocytosepositive (Fig. 18C).

Eksempel 11.2: Oksidativ sprenging

Bestemmelse av granulocytt- og monocyttoksidativ sprengningsaktivitet i heparinisert fullblod ble utført ved å anvende Phagoburst-kittet fra Orpegen (Heidelberg, Tyskland). Denne analyse tillater bestemmelse av prosenten med fagocytiske celler som produserer reaktive oksidanter ved oksidering av substratet dihydrorhodamin (DHR) 123 til det fluorescerende R 123. Celler som har oksidativ sprengningsaktivitet, kan identifiseres i flowcytometri. Heparinisert blod ble inkubert med forskjellige stimuli for å indusere oksidativ sprengningsaktivitet: forbol 12-myristat 13-acetat ("PMA") som en sterk stimulus; umerket, opsonisert E. coli som mellomstimulus og det kjemotaktiske peptidet N-formyl-MetLeuPhe (fMLP) som lav stimulus. 100 μl fullblod ble inkubert med disse stimuli ved 37 °C. Som en negativ kontroll så ble inkubering utført uten stimulering. Etter 10 minutters inkubering så ble DHR 123-substratløsning tilsatt og inkuberte i enda 10 min. DHR 123 blir omdannet til det fluorescerende R 123 ved å oksidere celler. Etter tre vasketrinn med 3 ml vaskeløsning (Orpegen) ble erytrocytter lysert. De gjenværende leukocyttene ble vasket én gang med 3 ml vaskeløsning (Orpegen). Etter tilsetting av 200 μl DNA-fargeløsning som tillater eksklusjon av aggregerte bakterier eller celler, så ble cellene analysert ved flowcytometri.

For å bestemme innflytelsen IgG B har på oksidativ sprenging så ble IgG B tilsatt til tre identiske blodprøver til en sluttkonsentrasjon på 10 μg/ml. Hver av disse tre prøver ble så oppdelt i tre aliquoter og fikk inkubere ved 37 °C i forskjellige tider før tilsetting, til separate aliquoter av E. coli, fMLP eller PMA. E. coli, fMLP eller PMA ble tilsatt til de tre aliquotene til den første prøven øyeblikkelig, mens E. coli, fMLP eller PMA ble tilsatt til de tre aliquotene av den andre og tredje prøven etter henholdsvis 24 og

48 timer. Parallelle blodprøver som manglet IgG B, ble behandlet identisk som over som kontroller. Resultatene er vist under i tabell 4, hvor "+" i den andre kolonnen fra venstre indikerer at IgG B er til stede i prøvealiquoten som ble testet og "-" i den andre kolonnen fra venstre indikerer den IgG B-frie kontrollen.

Tabell 4

Effekt av IgG B på oksidativ sprengningsoppførsel av granulocytter

Lignende resultater ble skaffet tilveie ved å anvende monocytter istedenfor granulocytter. Eksperimentet ble utført analogt som beskrevet over, og resultatene er vist under i tabell 5, hvor "+" i den andre kolonnen fra venstre indikerer at IgG B er til stede i prøvealiquoten som ble testet, og "-" i den andre kolonnen fra venstre indikerer den IgG B-fri kontrollen.

Tabell 5

Effekt av IgG B på oksidativ sprengningsoppførsel av monocytter

Totalt så kan det derfor konkluderes at tilstedeværelsen av IgG B ved fysiologisk relevante temperaturer ikke alvorlig påvirker fagocytosen eller den oksidative drepingen av bakterier ved enten granulocytter eller monocytter. I en in vivo-sammenheng så tyder disse resultatene dermed på at terapeutisk administrering av IgG B ikke ville forventes å alvorlig påvirke det normale immunforsvaret til pasienten.

Claims

Patentkrav

1.

Humant monoklonalt antistoffet eller fragment derav, omfattende

a) en lettkjede variable region omfattende en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.

ID. NR.19 og videre omfattende en tungkjede variable region valgt fra:

i. en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.21;

ii. en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.22;

iii. en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.52; og

iv. en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.53; eller

b) en lettkjede variable region omfattende en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.

ID. NR.54 og videre omfattende en tungkjede variable region valgt fra:

i. en aminosyresekvens som satt frem i SEKV. ID. NR.23;

ii. en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.26; og

iii. en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.28; eller

c) en lettkjede variable region omfattende en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.

ID. NR.55 og videre omfattende en tungkjede variable region valgt fra:

i. en aminosyresekvens som satt frem i SEKV. ID. NR.21; og

ii. en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.22; eller

d) en lettkjede variable region omfattende en aminosyre sekvens som satt frem i SEKV. ID. NR.34 og videre omfattende en tungkjede variable region valgt fra: i. en aminosyresekvens som satt frem i SEKV. ID.NR.35;

ii. en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.37;

iii. en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.40;

iv. en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.42; og

v. en aminosyresekvens som satt frem i SEKV.ID. NR.48.

2.

Det humane monoklonale antistoffet eller fragment derav ifølge krav 1, omfattende en lettkjede variable region omfattende en aminosyresekvens som satt frem i SEKV. ID. NR. 19 og videre omfattende en tungkjede variable region omfattende en aminosyresekvens som satt frem i SEKV. ID.NR.21 og 52.

3.

Det humane monoklonale antistoffet eller fragment derav ifølge krav 1, omfattende en lettkjede variable region omfattende en aminosyre sekvens som satt frem i SEKV. ID. NR. 34 og omfattende en tungkjede variable region omfattende en aminosyresekvens som satt frem i SEKV. ID.NR.35.

4.

Det humane monoklonale antistoffet eller fragment derav ifølge krav 1 til 3, hvori nevnte fragment er en scFv, et Fv, et diastoff, et tandem diastoff, en Fab, en Fab' eller en F(ab)2.

5.

Polynukleotidmolekyl som har en nukleotidsekvens som koder for et humant monoklonalt antistoff eller fragmenter derav ifølge ethvert av kravene 1-3.

6.

Farmasøytisk sammensetning, omfattende et humant monoklonalt antistoff eller fragment derav ifølge ethvert av kravene 1-4 eller polynukleotidmolekylet ifølge krav 5.

7.

Det humane monoklonale antistoffet eller fragment derav ifølge ethvert av kravene 1-4 eller polynukleotidmolekylet ifølge krav 5 som valgfritt i tillegg omfatter én eller flere anti-inflammatoriske midler, til bruk i behandlingen av inflammatoriske sykdommer.

8.

Det humane monoklonale antistoffet eller fragment derav eller polynukleotidet til bruk ifølge krav 7, hvor nevnte inflammatoriske sykdommer er valgt fra gruppen som består av reumatoid artritt (RA) (som inkluderer RA som er resistent for behandling med TNF-alfa-nøytralisatorer), astma, multippel sklerose (MS), kronisk obstruktiv lungesykdom (COPD), akutt respiratorisk distressyndrom (ARDS), idiopatisk lungefibrose (IPF), inflammatorisk bowelsykdom (IBD), uveitt, makulær degenerering, kolitt, psoriasis, Wallerian degenerering, antifosfolipidsyndrom (APS), akutt koronar syndrom, restinose, aterosklerose, tilbakekommende polykondritt (RP), akutt eller kronisk hepatitt, mislykkede ortopediske implantater, glomerulonefritt, lupus eller autoimmune lidelser.

9.

Det humane monoklonale antistoffet eller fragment derav ifølge ethvert av kravene 1-4 eller polynukleotidmolekylet ifølge krav 5, som valgfritt i tillegg omfatter én eller flere anti-cancermidler til bruk i behandlingen av en tumorsykdom eller annen tilstand med forsinket celleapoptose, økt celleoverlevelse eller proliferering.

10.

Det humane monoklonale antistoffet eller fragment derav eller polynukleotidet til bruk ifølge krav 9, hvor nevnte tumorsykdom er en cancer.

11.

Det humane monoklonale antistoffet eller fragment derav eller polynukleotidet for anvendelsen ifølge krav 10, hvor nevnte cancer er leukemi, multippelt myelom, magekarsinom eller hudkarsinom.