JP2008536505A

JP2008536505A - ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の抗体中和剤

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Publication number: JP2008536505A
Application number: JP2008506992A
Authority: JP
Inventors: トビアスラウム; ヘンケル）ユリアヘップ（ネー; エヴァフィエゼル; ミッテルストラッス）シルケペトシャ（ネー; ステファンツェーマン; アンドレアスウォルフ; サンドラブルックマイアール
Original assignee: マイクロメットアクツィエンゲゼルシャフト
Priority date: 2005-04-18
Filing date: 2006-04-18
Publication date: 2008-09-11
Anticipated expiration: 2026-04-18
Also published as: US20120009195A1; AU2006237159B2; US9067993B2; ES2545769T3; IL220412A; JP5085533B2; BRPI0608281B1; WO2006111353A3; KR20150091193A; EA017420B1; UA94403C2; SG161292A1; EP1874819A2; CY1116632T1; HUE025134T2; ME02191B; US20160130338A1; KR101704809B1; HK1190161A1; RU2012115683A

Abstract

本発明は、霊長類GM-CSFに特異的に結合し中和するヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントに関する。

Description

本発明は、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)の活性を中和する抗体およびそのフラグメントに関する。さらに、本発明は、このような抗体およびそのフラグメントを含む薬学的組成物、ならびに様々な状態を治療するための医用薬剤を調製するための、このような抗体およびそのフラグメントの使用に関する。

顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)は、顆粒球前駆細胞およびマクロファージ前駆細胞のインビトロでの増殖および分化の強力な刺激として当初報告された。GM-CSFは、約23kDaの糖タンパク質であり、1型サイトカイン受容体ファミリーに属するサブユニットからなるヘテロ二量体受容体に結合する4つのαヘリックス束構造を有する。GM-CSFは、特に、マクロファージ、好中球、顆粒球、好酸球、および抗原提示樹状細胞の成熟を刺激して、これらの細胞が感染と闘う機能的な能力を高める。マウスにおける遺伝子除去実験、すなわち、関心対象の遺伝子、本明細書ではGM-CSFのサイレンシング実験またはノックアウト実験から、GM-CSFは、肺における界面活性物質の除去およびある種の感染または免疫応答に対する応答に関与するマクロファージ集団などの一部のマクロファージ集団の機能活性の維持に必須であることが分かった。

GM-CSFは、インビトロでは、好中球、好酸球、マクロファージの前駆細胞に対して強力な刺激活性を有し、それより少ない程度で赤血球および巨核球細胞に対して刺激活性を有するのに対して、遺伝子ノックアウトマウスを用いてインビボで得られた結果から、GM-CSFの主な生理学的役割は、成熟したマクロファージおよび顆粒球の機能活性の維持または刺激、ならびに免疫系への抗原提示の刺激であることが示唆されている。GM-CSFは、樹状細胞およびマクロファージの生成に直接影響を及ぼすことによって後者を行うが、マクロファージおよび樹状細胞上にあるクラスII主要組織適合遺伝子複合体およびFc受容体の発現を増大させることによっても後者を行う。

GM-CSFは、好中球、好酸球、および単球-マクロファージの機能活性を刺激する。これらには、走化活性の増強、細胞接着分子の発現増大および表面への接着の増大ならびに食作用活性の増大、ならびにこれらの細胞のアポトーシスの阻害および遅延が含まれる。好中球は攻撃に対して第一線の防御を示す。好中球のプログラム死は、炎症の適切な時間および場所での適切な解決を確実にするために、GM-CSFを含む炎症誘発性刺激によって遅延される。GM-CSFはまた、これらの細胞が抗体依存性細胞傷害を媒介し、微生物を細胞内で死滅させる能力を刺激し、酸化バースト (スーパーオキシドアニオンの生成)、脱顆粒、および抗菌剤の放出、ならびに走化性のための後の刺激に対する応答を増強するために、これらの細胞に対して「プライミング(priming)」作用を有する。さらに、GM-CSFは、好中球からのIL-1、G-CSF、M-CSF、およびロイコトリエンの放出、ならびにマクロファージからのIL-1、TNF、IL-6、G-CSF、M-CSF、およびプロスタグランジンの放出を含む、これらの細胞からの二次サイトカインおよびメディエーターの放出を刺激する。

GM-CSFが感染を防ぐのに必要な細胞集団の活性化および維持において重要な役割を果たしていることは前記から明らかである。しかしながら、場合によっては、これらの細胞集団の活性化は望ましくない場合がある。例えば、病原体が存在しない時の前記の細胞系の活性化は、多くの場合、急性および/または慢性の炎症状態につながり、極端な場合、命を脅かすことがある。同様に、GM-CSFの過剰発現は、炎症をもたらす過剰な免疫活性化につながることがある。このような場合、これらの炎症状態の症状が無くなるか、少なくとも緩和するように、GM-CSFの活性を中和することが望ましい場合がある。

このような中和活性の例は先行技術に存在する。例えば、抗GM-CSF中和抗体が末梢血試料中の好酸球アポトーシス率の増加に寄与することが見出された(Kankaanranta et al. (2000) Journal of Allergy and Clinical Immunology 106, 77-83(非特許文献1))。好酸球生存の上昇は喘息と相関関係があるので、好酸球アポトーシスの増加は喘息症状を緩和すると予想される。喘息、慢性関節リウマチ、および多発性硬化症などの慢性炎症性疾患において、GM-CSFレベルは局所的に、場合によっては全身で増加し、これらの疾患の炎症プロセスと相関付けられてきた。

従って、本発明の目的は、先行技術において以前に知られていた高い、および/または望ましくないGM-CSF活性を中和する方法を改善することである。

Kankaanranta et al. (2000) Journal of Allergy and Clinical Immunology 106, 77-83

従って、本発明の一局面は、霊長類GM-CSFに特異的に結合し中和するヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントに関する。

本明細書で使用する用語「特異的に結合する」、または「特異的結合」、「特異的に結合すること」、「特異的結合剤」などの関連表現は、潜在的な結合パートナーとしての複数の異なる抗原のプールから霊長類GM-CSFだけが結合するような程度で、または有意に結合するような程度で、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントが霊長類GM-CSFと、霊長類GM-CSFとは異なる任意の数の他の潜在的な抗原を区別できることを意味する。本発明の意味において、霊長類GM-CSFは、潜在的な結合パートナーである複数の等しく接近可能な異なる抗原のプールから、霊長類GM-CSFが、(動力学的な意味で)霊長類GM-CSFとは異なる他の任意の抗原の少なくとも10倍、好ましくは50倍、最も好ましくは100倍、またはそれ以上の頻度で結合する時に「有意に」結合する。このようなキネティックの測定はBiacore装置で行うことができる。

本明細書で使用する「中和」、「中和剤」、「中和する」、および文法上関連するその変形は、GM-CSFの生物学的作用の部分的または完全な減弱を意味する。このような部分的または完全な、GM-CSFの生物学的作用の減弱は、GM-CSFを介したシグナル伝達の改変、妨害、および/または抑止に起因し、例えば、細胞内シグナル伝達、細胞増殖または可溶性物質の放出、細胞内遺伝子活性化のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション、例えば、GM-CSF以外のリガンドの表面受容体の発現をもたらす細胞内遺伝子活性化のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションにおいて顕在化する。当業者が理解するように、薬剤、例えば、対象となる抗体またはそのフラグメントが中和剤として分類されるかどうかを確かめる複数の方法が存在する。一例として、これは、以下のように一般的に行われる標準的なインビトロ試験によって達成することができる。第1の増殖実験では、増殖の程度がGM-CSFの活性に依存することが知られている細胞株を、様々な濃度のGM-CSFを含む一連の試料中でインキュベートし、このインキュベーション後に、細胞株の増殖の程度を測定する。この測定から、最大半量の細胞増殖を可能にするGM-CSF濃度を決定する。次いで、一連の各試料中に、第1の増殖実験に使用したものと同数の細胞、前記で決定した濃度のGM-CSF、および今度は、GM-CSF中和剤と思われる様々な濃度の抗体またはそのフラグメントを用いて、第2の増殖実験を行う。再度、細胞増殖を測定して、最大半量の増殖阻害をもたらすのに十分な抗体またはそのフラグメントの濃度を決定する。結果として生じた、増殖阻害対抗体(またはそのフラグメント)濃度のグラフが、抗体(またはそのフラグメント)の濃度が増加すると共に細胞増殖が低下するシグモイド型であれば、ある程度の抗体依存性増殖阻害がもたらされている。すなわち、GM-CSFの活性はある程度まで中和されている。このような場合、抗体またはそのフラグメントは本発明の意味で「中和剤」とみなされ得る。増殖の程度がGM-CSFの活性に依存することが知られている細胞株の一例は、Kitamura, T. et al. (1989). J Cell Physiol 140, 323-34に記載されているTF-1細胞株である。

当業者が理解するように、細胞増殖の程度は、中和能力を実証することができる唯一のパラメータでない。例えば、分泌レベルがGM-CSFに依存するシグナル伝達分子(例えば、サイトカイン)のレベルの測定を用いて、疑わしいGM-CSF中和剤を同定することができる。

対象となる抗体またはそのフラグメントが霊長類GM-CSF活性の中和剤であるかどうか判定するのに使用することができる細胞株の他の例には、AML-193 (Lange, B. et al. (1987) Blood 70, 192-9); GF-D8 (Rambaldi, A. et al. (1993) Blood 81, 1376-83); GM/SO (Oez, S. et al. (1990) Experimental Hematology 18, 1108-11); MO7E (Avanzi, G. C. et al. (1990). Journal of Cellular Physiology 145, 458-64); TALL-103 (Valtieri, M. et al. (1987) Journal of Immunology 138, 4042-50); UT-7 (Komatsu, N. et al. (1991) Cancer Research 51, 341-8)が含まれる。

本発明によるヒト抗体またはそのフラグメントはモノクローナルである。本明細書で使用する用語「モノクローナル」は当技術分野において典型的に与えられる意味を有すると理解される。すなわち、抗体(またはその対応するフラグメント)は、B細胞などの抗体産生細胞の1つのクローンから生じ、結合する抗原上の1つのエピトープを認識すると理解される。モノクローナルのヒト抗体を調製することは特に難しい。マウスB細胞と不死化細胞株の融合とは対照的に、ヒトB細胞と不死化細胞株の融合は非現実的である。従って、本発明のヒトモノクローナル抗体は、抗体技術分野に存在すると一般に認められている大きな技術的ハードルを克服した結果である。抗体のモノクローナル性のために、このような抗体は、十分に特徴付けることができ、再現可能に作成および精製することができる1種類の均一な分子種として存在するので、治療剤として使用するのに特に適している。これらの要因は、生物学的活性を高精度に予測することができる産物をもたらし、このような分子がヒトにおける治療的投与のための規制当局の認可を得ようとしているのであれば非常に重要である。

本発明によるモノクローナル抗体(または対応するフラグメント)はヒト抗体(または対応するフラグメント)であることが特に重要である。ヒトへの治療的投与を目的とする抗体薬剤を考慮した際に、この抗体がヒト由来であることは非常に有利である。ヒト患者への投与後、ヒト抗体またはそのフラグメントは、患者の免疫系による強い免疫原反応を誘発しない可能性が高い、すなわち、「外来」のもの、非ヒトタンパク質であると認識されないだろう。このことは、治療抗体の活性をブロックする、および/または患者の身体からの治療抗体の排除を促す、従って、治療抗体の望ましい治療効果を発揮しないようにする、治療抗体に対する宿主、すなわち、患者の抗体が生じないことを意味する。

本明細書で使用する用語「ヒト」抗体は、本発明の抗体またはそのフラグメントがヒト生殖系列抗体レパートリーに含まれるアミノ酸配列を含むことを意味すると理解される。従って、本明細書における定義のために、抗体またはそのフラグメントは、このような(a)ヒト生殖系列アミノ酸配列からなれば、すなわち、対象となる抗体またはそのフラグメントのアミノ酸配列が、発現されるヒト生殖系列アミノ酸配列と同一であればヒトとみなされ得る。抗体またはそのフラグメントはまた、最も近いヒト生殖系列配列から、体細胞超変異のインプリント(imprint)のために予想される逸脱を超えない程度、逸脱した配列からなればヒトとみなされ得る。さらに、多くの非ヒト哺乳動物、例えば、マウスおよびラットなどのげっ歯類の抗体は、発現されるヒト抗体レパートリーにも存在すると予想され得るVH CDR3アミノ酸配列を含む。発現されるヒトレパートリーに存在すると予想され得る、ヒトまたは非ヒトに由来する任意のこのような配列も本発明の目的では「ヒト」とみなされる。

本発明の１つの態様によれば、霊長類GM-CSFは、ヒト(Homo sapiens)GM-CSFまたは非ヒト霊長類GM-CSFである。非ヒト霊長類GM-CSFの特に好ましい変種には、テナガザル(ノマスカス・コンカラー(nomascus concolor), ウエスタンブラッククレスティッドギボン(western black crested gibbon)としても知られる)GM-CSF、ならびにマカク科のサルのGM-CSF、例えば、アカゲザル(マカカ・ムラッタ(Macaca mulatta))GM-CSFおよびカニクイザル(マカカ・ファシキュラリス(Macaca fascicularis))GM-CSFが含まれる。本発明のこの態様によれば、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ヒトと、前述のサル種の少なくとも1つと交差反応性を示す。これは、ヒト被験者における治療的投与を目的とした抗体分子の場合、特に有利である。なぜなら、このような抗体は、通常、規制当局に認可される前に多くの試験を通らなければならないからである。試験のうち特定の初期の試験は非ヒト動物種を伴う。このような試験の実施において、非ヒト種として、ヒトと高度の遺伝的類似性を有する種を使用することが一般的に望ましい。なぜなら、このように得られた結果は、一般的に、同じ分子をヒトに投与する際に予想され得る対応する結果を高度に予測するものであるからである。しかしながら、動物試験に基づく、このような予測能力は少なくとも部分的に分子の比較性に依存し、異種間反応により同じ治療分子がヒトおよび動物モデルに投与される可能性がある時に非常に高い。本発明のこの態様と同様に、抗体分子が、密接に関連する別の種の抗原と同じヒト抗原に交差反応する場合、試験は、この密接に関連する種、例えば、前述のサル種の1つの抗体分子と同じヒト抗体分子を用いて行われることがある。これによって、試験それ自体の効率、ならびに、治療上の観点から関心対象の最終的な種であるヒトにおける、このような抗体の挙動に関する、このような試験によって与えられる予測能力が高まる。

本発明のさらなる態様によれば、ヒトモノクローナル抗体はIgG抗体でもよい。当技術分野において周知のように、IgGは、高度の識別が可能な抗原認識および抗原結合を担う抗体可変領域だけでなく、内因的に産生された抗体に通常存在する抗体ポリペプチド重鎖および軽鎖の定常領域も含み、場合によっては、1つまたは複数の部位で炭水化物による装飾さえも含む。このようなグリコシル化は、一般的に、IgG型の顕著な特徴であり、これらの定常領域の部分は、インビボで様々なエフェクター機能を誘発することが知られる、抗体全体のいわゆるFc領域を構成する。さらに、Fc領域はIgGとFc受容体の結合を媒介し、従って、インビボでの半減期を延ばし、Fc受容体が多く存在する位置、例えば、炎症組織へのIgGのホーミングを促進する。好都合には、IgG抗体はIgG1抗体またはIgG4抗体であり、これらの型は、インビボでの作用機序が特によく理解され、特徴付けられているので好ましい。これはIgG1抗体に特に当てはまる。

本発明のさらなる態様によれば、ヒトモノクローナル抗体のフラグメントは、scFv、単一ドメイン抗体、Fv、VHH抗体、ダイアボディ、タンデムダイアボディ、Fab、Fab'、またはF(ab)2でもよい。これらの型は、一般的に、2つのサブクラス、すなわち、1本のポリペプチド鎖からなるサブクラスおよび少なくとも2本のポリペプチド鎖を含むサブクラスに分けることができる。前者のサブクラスのメンバーには、scFv(1つのVH領域および1つのVL領域を含み、これらがポリペプチドリンカーを介してつながって1本のポリペプチド鎖になっている);VHH抗体(1つのVH領域を含む)などの単一ドメイン抗体(1つの抗体可変領域を含む)が含まれる。後者のサブクラスのメンバーには、Fv(別々のポリペプチド鎖として1つのVH領域および1つのVL領域を含み、これらが非共有結合によって互いに結合している);ダイアボディ(2本の非共有結合ポリペプチド鎖を含み、これらはそれぞれ2つの抗体可変領域を含み、通常、ポリペプチド鎖1本あたり1つのVHおよび1つのVLを含む。2本のポリペプチド鎖は、二価抗体分子が生じるようにヘッドトゥテール(head-to-tail)構造で配列される);タンデムダイアボディ(2つの異なる特異性の4つの共有結合した免疫グロブリン可変-VHおよびVL-領域を含む二重特異性単鎖Fv抗体。前述のダイアボディの2倍の大きさのホモ二量体を形成する);Fab(1本のポリペプチド鎖として抗体軽鎖全体を含み、抗体軽鎖それ自体はVL領域および軽鎖定常領域全体を含み、もう1本のポリペプチド鎖として完全なVH領域および重鎖定常領域の一部を含む抗体重鎖部分を含む。これらの2本のポリペプチド鎖は鎖間ジスルフィド結合を介して分子間結合している);Fab'(抗体重鎖にさらなる還元ジスルフィド結合を有することを除けば前述のFabと同じである);ならびにF(ab)2(2つのFab'分子を含み、それぞれのFab'分子は鎖間ジスルフィド結合を介してそれぞれの他のFab'分子と結合している)が含まれる。一般的に、前記の型の抗体フラグメントを使用すると、当面の緊急事態に対する、治療的投与に望ましい抗体の調整、例えば、薬物動態学的特性の調整においてかなり融通がきくようになる。例えば、あまり血管新生していないことが知られている組織(例えば、関節)を治療する時に組織浸透の程度を高めるために、投与される抗体のサイズを小さくすることが望ましい場合がある。ある状況の下では、治療抗体が身体から排除される速度を速めることが望ましい場合もある。速度は、一般的に、投与される抗体のサイズを小さくすることによって速めることができる。

本発明のさらなる態様によれば、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、一価単一特異性;多価単一特異性、特に、二価単一特異性;または多価多特異性、特に、二価二重特異性の形で存在してもよい。一般的に、多価単一特異性、特に、二価単一特異性抗体、例えば、前記の全ヒトIgGは、このような抗体によって生じる中和がアビディティ効果によって増強されるという治療上の利点、すなわち、同じ抗体による、同じ抗原、本明細書では霊長類GM-CSFの複数の分子への結合をもたらし得る。本発明の抗体のいくつかの一価単一特異型フラグメント(例えば、scFv、Fv、VHH、または単一ドメイン抗体)は前述されている。多価多特異型、特に二価二重特異型の本発明のヒトモノクローナル抗霊長類GM-CSF抗体は、ある結合アームが霊長類GM-CSFに結合するのに対して、他の結合アームが霊長類GM-CSFとは異なる別の抗原に結合する全IgGを含んでもよい。さらなる多価多特異型、特に二価二重特異型は、都合よく、ヒト単鎖二重特異性抗体、すなわち、前記の2つのscFv実体が、当技術分野において一般に公知の短い介在ポリペプチドスペーサーによってつながって1本の連続したポリペプチド鎖になった組換えヒト抗体構築物でもよい(抗CD19x抗CD3二重特異性単鎖抗体については、例えば、WO 99/54440を参照されたい)。ここで、二重特異性単鎖抗体の中に含まれる二重特異性単鎖抗体の1つのscFv部分は前述の霊長類GM-CSFに特異的に結合するのに対して、この二重特異性単鎖抗体の他のそれぞれのscFv部分は、治療上有益であることが確かめられている別の抗原に結合する。

さらなる態様によれば、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは誘導体化されてもよく、例えば、有機ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール(「PEG」)および/またはポリビニルピロリドン(「PVP」)の1つまたは複数の分子で誘導体化されてもよい。当技術分野において公知のように、このような誘導体化は、抗体またはそのフラグメントの薬力学的特性の調整において有利な場合がある。PEG-マレイミドとして誘導体化されたPEG分子が特に好ましく、これによって、システインアミノ酸のスルフヒドリル基を介した、抗体またはそのフラグメントとの部位特異的な結合が可能になる。これらのうち、分枝鎖型または直鎖型の20kDおよび/または40kD PEG-マレイミドが特に好ましい。より小さなヒト抗霊長類GM-CSF抗体フラグメント、例えば、scFvフラグメントの有効分子量を、後者とPEGの1つまたは複数の分子、特に、PEG-マレイミドをカップリングすることによって増やすことが特に有利な場合がある。

本発明のさらなる態様によれば、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ヒトGM-CSFまたは非ヒト霊長類GM-CSFのエピトープ、特に、アミノ酸23〜27(RRLLN)および/またはアミノ酸65〜77(GLR/QGSLTKLKGPL)を含む不連続エピトープに特異的に結合する。

前記で図示したアミノ酸配列領域65〜77内の67位での可変性は、霊長類GM-CSFのこの位置での不均一性、一方では、ヒトGM-CSFおよびテナガザルGM-CSF(67位はRである)と、他方では、マカク科のサル、例えば、カニクイザルおよびアカゲザル(67位はQである)を反映している。

本明細書で使用する、ヒトGM-CSFおよび非ヒト霊長類GM-CSFの番号は、成熟GM-CSF、すなわち、17アミノ酸シグナル配列を有さないGM-CSFの番号を指している(前記のヒトおよび非ヒト霊長類種における成熟GM-CSFの全長は127アミノ酸である)。ヒトGM-CSFおよびテナガザルGM-CSFの配列は以下の通りである:

マカクサル科(macaca monkey family)のある特定のメンバー、例えば、アカゲザルおよびカニクイザルにおけるGM-CSFの配列は以下の通りである:

前記の本発明のヒトモノクローナル抗体(またはそのフラグメント)によって結合される、最小エピトープ、都合よく、不連続エピトープは、前記のGM-CSF配列に太字で示した。本明細書で使用する用語「不連続エピトープ」は、ある特定のポリペプチド鎖、本明細書では成熟ヒトGM-CSFおよび非ヒト霊長類GM-CSFの中にあり、抗体によって同時に、かつ(前述で定義したように)特異的に結合される、少なくとも2つの非隣接アミノ酸配列領域と理解される。この定義によれば、このような同時の特異的な結合は、直線の形をしたGM-CSFポリペプチドの結合でもよい。本明細書では、拡張ループを形成する成熟GM-CSFポリペプチドを想像してもよい。この1つの領域では、前記で太字で示した2つの配列は、例えば、多少、平行になり、互いに近接して、一列に並んでいる。この状態において、2つの配列は、本発明の抗体フラグメントによって特異的かつ同時に結合される。この定義によれば、前記の成熟GM-CSFの2つの配列領域の同時の特異的な結合はまた、抗体が構造エピトープと結合する形をとってもよい。本明細書では、成熟GM-CSFは、インビボで通常存在するように三次構造を既に形成している(Sun, H. W., J. Bernhagen, et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93, 5191-6)。この三次構造において、成熟GM-CSFのポリペプチド鎖は、前記の2つの配列領域を空間的に近接させるように、例えば、折り畳まれた成熟GM-CSFの特定の領域の外面で近接させるように折り畳まれ、次いで、外面で、周囲のポリペプチド配列と関連して三次構造によって認識される。

好ましい態様において、前記の(不連続な)エピトープは、ヒトGM-CSFおよび非ヒト霊長類GM-CSFの前記配列においてイタリック体で示したアミノ酸28〜31(LSRD)をさらに含む。特に好ましい態様において、前記の(不連続な)エピトープはいずれもアミノ酸32〜33(TA)および/またはアミノ酸21〜22(EA)をさらに含む。これらの各領域には、ヒトGM-CSFおよび非ヒト霊長類GM-CSFの前記配列に下線を引いた。

本発明のさらなる態様によれば、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、重鎖可変領域において、SEQ ID NO:1〜13または56のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む。SEQ ID NO:14に示される重鎖可変領域CDR1配列、SEQ ID NO:15に示される重鎖可変領域CDR2配列、およびSEQ ID NO:1に示される重鎖可変領域CDR3配列を含むヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント；または、SEQ ID NO:14に示される重鎖可変領域CDR1配列、SEQ ID NO:15に示される重鎖可変領域CDR2配列、およびSEQ ID NO:2に示される重鎖可変領域CDR3配列を含むヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント；または、SEQ ID NO:14に示される重鎖可変領域CDR1配列、SEQ ID NO:15に示される重鎖可変領域CDR2配列、およびSEQ ID NO:3に示される重鎖可変領域CDR3配列を含むヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント；または、SEQ ID NO:14に示される重鎖可変領域CDR1配列、SEQ ID NO:15に示される重鎖可変領域CDR2配列、およびSEQ ID NO:4に示される重鎖可変領域CDR3配列を含むヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント；または、SEQ ID NO:14に示される重鎖可変領域CDR1配列、SEQ ID NO:15に示される重鎖可変領域CDR2配列、およびSEQ ID NO:5に示される重鎖可変領域CDR3配列を含むヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント；または、SEQ ID NO:14に示される重鎖可変領域CDR1配列、SEQ ID NO:15に示される重鎖可変領域CDR2配列、およびSEQ ID NO:6に示される重鎖可変領域CDR3配列を含むヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント；または、SEQ ID NO:14に示される重鎖可変領域CDR1配列、SEQ ID NO:15に示される重鎖可変領域CDR2配列、およびSEQ ID NO:7に示される重鎖可変領域CDR3配列を含むヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント；または、SEQ ID NO:14に示される重鎖可変領域CDR1配列、SEQ ID NO:15に示される重鎖可変領域CDR2配列、およびSEQ ID NO:8に示される重鎖可変領域CDR3配列を含むヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント；または、SEQ ID NO:14に示される重鎖可変領域CDR1配列、SEQ ID NO:15に示される重鎖可変領域CDR2配列、およびSEQ ID NO:9に示される重鎖可変領域CDR3配列を含むヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント；または、SEQ ID NO:14に示される重鎖可変領域CDR1配列、SEQ ID NO:15に示される重鎖可変領域CDR2配列、およびSEQ ID NO:10に示される重鎖可変領域CDR3配列を含むヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント；または、SEQ ID NO:14に示される重鎖可変領域CDR1配列、SEQ ID NO:15に示される重鎖可変領域CDR2配列、およびSEQ ID NO:11に示される重鎖可変領域CDR3配列を含むヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント；または、SEQ ID NO:14に示される重鎖可変領域CDR1配列、SEQ ID NO:15に示される重鎖可変領域CDR2配列、およびSEQ ID NO:12に示される重鎖可変領域CDR3配列を含むヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント；または、SEQ ID NO:14に示される重鎖可変領域CDR1配列、SEQ ID NO:15に示される重鎖可変領域CDR2配列、およびSEQ ID NO:13に示される重鎖可変領域CDR3配列を含むヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント；または、SEQ ID NO:14に示される重鎖可変領域CDR1配列、SEQ ID NO:15に示される重鎖可変領域CDR2配列、およびSEQ ID NO:56に示される重鎖可変領域CDR3配列を含むヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントが好ましい。

さらにより好ましくは、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントには、前記のCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列の14通りの組み合わせのいずれかが存在し、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域において、SEQ ID NO:16で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO:17で示されるアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO:18で示されるアミノ酸配列を含むCDR3をさらに含む。

さらなる態様によれば、本発明のヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域において、SEQ ID NO:19で示されるアミノ酸配列を含む。ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:19で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:20で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:19で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:21で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:19で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:22で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:19で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:23で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:19で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:24で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:19で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:25で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:19で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:26で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:19で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:27で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:19で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:28で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:19で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:29で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:19で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:30で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:19で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:31で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:19で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:32で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:19で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:33で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:19で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:52で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:19で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:53で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。

さらなる態様によれば、本発明のヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域において、SEQ ID NO: 54で示されるアミノ酸配列を含む。ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:54で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:20で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:54で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:21で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:54で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:22で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:54で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:23で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:54で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:24で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:54で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:25で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:54で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:26で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:54で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:27で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:54で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:28で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:54で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:29で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:54で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:30で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:54で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:31で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:54で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:32で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:54で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:33で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく、または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:54で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:52で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:54で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:53で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。

さらなる態様によれば、本発明のヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域において、SEQ ID NO:55で示されるアミノ酸配列を含む。ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:55で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:20で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:55で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:21で示されるアミノ酸配列を含ことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:55で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:22で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:55で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:23で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:55で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:24で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:55で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:25で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:55で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:26で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:55で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:27で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:55で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:28で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:55で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:29で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:55で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:30で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:55で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:31で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:55で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:32で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:55で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:33で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:55で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:52で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましく；または、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:55で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO:53で示されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。

好ましい態様は、軽鎖可変領域において、SEQ ID NO:16で示されるアミノ酸配列を含むCDR1領域、SEQ ID NO:17で示されるアミノ酸配列を含むCDR2領域、およびSEQ ID NO:18で示されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、重鎖可変領域において、SEQ ID NO:14で示されるアミノ酸配列を含むCDR1領域、SEQ ID NO:15で示されるアミノ酸配列を有するCDR2領域、およびSEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または56のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントを提供する。

さらに好ましい態様において、ヒトモノクローナル抗体は、軽鎖においてSEQ ID NO:34で示されるアミノ酸配列および重鎖においてSEQ ID NO:35で示されるアミノ酸配列；または軽鎖においてSEQ ID NO:34で示されるアミノ酸配列および重鎖においてSEQ ID NO:36で示されるアミノ酸配列；または軽鎖においてSEQ ID NO:34で示されるアミノ酸配列および重鎖においてSEQ ID NO:37で示されるアミノ酸配列；または軽鎖においてSEQ ID NO:34で示されるアミノ酸配列および重鎖においてSEQ ID NO:38で示されるアミノ酸配列；または軽鎖においてSEQ ID NO:34で示されるアミノ酸配列および重鎖においてSEQ ID NO:39で示されるアミノ酸配列；または軽鎖においてSEQ ID NO:34で示されるアミノ酸配列および重鎖においてSEQ ID NO:40で示されるアミノ酸配列；または軽鎖においてSEQ ID NO:34で示されるアミノ酸配列および重鎖においてSEQ ID NO:41で示されるアミノ酸配列；または軽鎖においてSEQ ID NO:34で示されるアミノ酸配列および重鎖においてSEQ ID NO:42で示されるアミノ酸配列；または軽鎖においてSEQ ID NO:34で示されるアミノ酸配列および重鎖においてSEQ ID NO:43で示されるアミノ酸配列；または軽鎖においてSEQ ID NO:34で示されるアミノ酸配列および重鎖においてSEQ ID NO:44で示されるアミノ酸配列；または軽鎖においてSEQ ID NO:34で示されるアミノ酸配列および重鎖においてSEQ ID NO:45で示されるアミノ酸配列；または軽鎖においてSEQ ID NO:34で示されるアミノ酸配列および重鎖においてSEQ ID NO:46で示されるアミノ酸配列；または軽鎖においてSEQ ID NO:34で示されるアミノ酸配列および重鎖においてSEQ ID NO:47で示されるアミノ酸配列；または軽鎖においてSEQ ID NO:34で示されるアミノ酸配列および重鎖においてSEQ ID NO:48で示されるアミノ酸配列を含む。

前記の好ましい態様は、霊長類GM-CSF、特に、ヒトGM-CSFの活性の中和剤として特に有利なヒトモノクローナル抗体分子および/またはそのフラグメントを提供する。特に好ましい態様によるヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、いくつかの理由で非常に有利である。

第1に、特に好ましい態様によるヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、高度に特異的に、すなわち、霊長類GM-CSFと他の霊長類コロニー刺激因子(例えば、霊長類G-CSFおよびM-CSF)の混合物から、霊長類GM-CSFを認識する。これらの特に好ましい態様による結合分子は霊長類GM-CSFを高度に識別するが、同じ環境にある他のコロニー刺激因子は認識されない。このことは、これらの態様によるヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントがヒトに投与された時に、望ましい標的だけに特異的に結合し、望ましい標的だけを中和すると予想されるが、他の望ましくない標的は結合も中和もされないことを意味する。最終的に、このことは、インビボでの治療上の作用様式に関する高度の予測性につながる。

第2に、これらの特に好ましい態様による結合剤は極めて高い親和性で霊長類GM-CSFに結合する。このクラスの分子について、約4x10^-9Mから約0.04x10^-9Mと低いK_D値が観察されており、後者の値は約40pMに相当する。水性媒体中での、このような分子のキネティクオンレート(kinetic on-rate)は、大部分は、拡散によって制御され、従って、局所拡散条件が生理学的条件下で許容するもの以上に改善できないので、低いK_Dは、主に、キネティクオフレート(kinetic off-rate)、k_offの結果として生じ、最も高い親和性の抗体結合剤のキネティクオフレートは約10^-5s^-1である。このことは、一方では、本発明のこれらの態様のいずれかによるヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントと、他方では、霊長類GM-CSFの複合体が形成されると、容易に分離しない、または少なくともすぐに分離しないことを意味する。生物学的活性の中和剤として意図される結合分子について、通常、中和しようとする生物学的活性を有する分子(本明細書では霊長類GM-CSF)が中和結合分子と結合している場合に限ってのみ、望ましい中和作用が持続するので、これらの特徴は非常に有利である。そのため、目的の標的に長時間結合した状態になる中和分子は、その分だけ長い時間、中和し続ける。

霊長類GM-CSFに対するヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントの高い結合親和性にはさらなる利点がある。通常、抗体またはそのフラグメントはサイズ依存的に患者の血流から排除され、小さな分子は大きな分子が排出および排除される前に排出および排除される。2つのポリペプチドの複合体- 抗体または抗体フラグメントと結合したGM-CSF -は抗体単独より明らかに大きいので、前述の低いk_offには、治療用中和剤が、GM-CSFと結合していない場合よりゆっくりと患者の身体から排出および排除されるという効果がある。従って、中和活性が上昇するだけでなく、インビボでの持続期間も長くなる。

最後に、これらの特に好ましい態様による結合剤について決定された中和活性は驚くほど高い。本明細書において以下でさらに詳細に述べるように、中和活性は、TF-1増殖阻害アッセイ法(Kitamura, T. et al. (1989) J Cell Physiol 140, 323-34)を用いてインビトロで測定した。中和能を示すものとして、IC₅₀値を測定した。IC₅₀は、TF-1細胞増殖の最大半量阻害を誘発するのに必要な、本発明のこれらの態様のいずれかによるヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントの濃度に相当する。本発明のこれらの態様のいずれかによるヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントについては、約3x10^-10M、すなわち約0.3nMのIC₅₀値が求められた。従って、本発明のこれらの態様のいずれかによる結合分子は、霊長類GM-CSF活性の非常に強力な中和剤である。

次に、要約すると、本発明の前記の態様のいずれかによるヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、望ましい抗原を識別する高度の力を示し、この抗原に極めて堅固にかつ長時間結合し、結合している間、長時間、非常に強力な中和活性を示す。同時に、結合剤-抗原複合体が長時間持続することは、この結合剤の身体からの排除を遅らせ、それによって、インビボでの望ましい治療効果の持続期間が延びる。

本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO:1〜48および/または52〜56のいずれかに示されるアミノ酸と少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を含むヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントを提供する。相同性は、Vector NTI(InforMax(商標), Maryland, USA)などの標準的な配列アラインメントプログラムによって決定されてもよい。このようなプログラムは、アラインメントされた配列をアミノ酸ごとに比較し、比較のために様々なストリンジェンシーレベル(例えば、同一のアミノ酸、保存的アミノ酸置換など)まで設定することができる。この用語が本明細書において用いられるように、対象となる2つのアミノ酸は、それぞれ同じ化学クラス、すなわち、酸性、非極性、非電荷極性、および塩基性に属する場合、互いの「保存的置換」とみなされる。非限定的な例として、非極性アミノ酸のクラスに属する2種類のアミノ酸は、これらの2種類のアミノ酸が同一でなくても互いの「保存的置換」とみなされるが、一方が非極性のアミノ酸、他方が塩基性のアミノ酸は互いの「保存的置換」とみなされない。アミノ酸を4種類の主なグループ:酸性、非極性、非電荷極性、および塩基性に分けた、Alberts、Johnson、Lewis、Raff、Roberts、およびWalterグループによる「Molecular Biology of the Cell」, 4^th Edition (2002)のパネル3.1。このようなグループ分けは、本発明の目的では、ある特定のアミノ酸が、対象となる別のアミノ酸の保存的置換であるかどうかを確かめる目的で用いられてもよい。

本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO:1〜48および/もしくは52〜56のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列と少なくとも70％の相同性を示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を提供する。ここで、相同性は、(アミノ酸配列について前述した)配列アラインメントによって、SEQ ID NO:1〜48および/もしくは52〜56のいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、対象となるヌクレオチド配列を比較することによって決定されてもよい。ここで、対象となる配列中のヌクレオチドは、SEQ ID NO:1〜48および/もしくは52〜56のいずれかの対応するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中の対応するヌクレオチドと同一であれば相同であるとみなされるか、または対象となる配列中の1つもしくは複数のヌクレオチドがSEQ ID NO:1〜48および/もしくは52〜56のいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中の対応する1つもしくは複数のヌクレオチドから逸脱することによって、翻訳時に、SEQ ID NO:1〜48および/もしくは52〜56のいずれかの対応するアミノ酸配列中の対応するアミノ酸と同一のアミノ酸(縮重トリプレットによる)、またはSEQ ID NO:1〜48および/もしくは52〜56のいずれかの対応するアミノ酸配列中の対応するアミノ酸の保存的置換であるアミノ酸を生じるヌクレオチドトリプレットが生じれば相同であるとみなされる。本明細書において、用語「保存的置換」は前述したとおりであると理解される。

本発明のさらなる局面は、ヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメント、あるいはSEQ ID NO:1〜48および/もしくは52〜56のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはSEQ ID NO:1〜48および/もしくは52〜56のいずれかと少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含む薬学的組成物を提供する。ここで、「相同性」は本明細書前記で説明したとおりであると理解される。本発明によれば、用語「薬学的組成物」は、患者、好ましくは、ヒト患者に投与するための組成物に関する。好ましい態様において、薬学的組成物は、非経口投与、経皮投与、腔内投与、動脈内投与、くも膜下腔内投与、および/もしくは鼻腔内投与のための組成物、または組織への直接注射による組成物を含む。特に、薬学的組成物は注入または注射を介して患者に投与されると考えられる。適切な組成物の投与は、異なるやり方で、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、または皮内投与によってもたらされてもよい。本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。適切な薬学的担体の例は当技術分野において周知であり、リン酸緩衝食塩水、水、エマルジョン、例えば、油/水エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液、リポソームなどを含む。このような担体を含む組成物は周知の従来法によって処方することができる。これらの薬学的組成物は適切な用量で被験体に投与することができる。投与計画は主治医および臨床要因によって決定される。医療分野において周知なように、患者の投与量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与しようとする特定の化合物、性別、投与時間および投与経路、身体全体の健康、ならびに同時に投与される他の薬物を含む多くの要因によって決まる。非経口投与の調製物には、滅菌した水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性担体には、食塩水および緩衝培地を含む、水、アルコール溶液/水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、体液および栄養補充物、電解質補充物(例えば、リンガーデキストロースをベースとするもの)などが含まれる。例えば、抗菌剤、抗オキシダント、キレート剤、不活性ガスなどの防腐剤および他の添加物も存在してもよい。さらに、本発明の薬学的組成物は、例えば、血清アルブミンまたは免疫グロブリン、好ましくは、ヒト由来の血清アルブミンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質性担体を含んでもよい。本発明の薬学的組成物は、(本発明に記載の)ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントに加えて、薬学的組成物の目的の使用に応じて、生物学的に活性な薬剤をさらに含んでもよい。このような薬剤は、消化器系に作用する薬物、サイトスタティカ(cytostatica)として作用する薬物、高尿酸血症(hyperurikemia)を予防する薬物、免疫反応を阻害する薬物(例えば、コルチコステロイド)、炎症応答を調整する薬物、循環系に作用する薬物、および/または当技術分野において公知の薬剤、例えば、サイトカインでもよい。

本発明のさらなる局面は、炎症性疾患を治療するための、1つまたは複数の抗炎症剤を任意に含む医用薬剤の製造における、本明細書前記のヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント、あるいはSEQ ID NO:1〜48および/もしくは52〜56のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはSEQ ID NO:1〜48および/もしくは52〜56のいずれかと少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の使用を提供する。ここで、「相同性」は本明細書前記で説明したとおりであると理解される。炎症性疾患は、都合よく、慢性関節リウマチ(RA)(TNF-α中和剤による治療に耐性のRAを含む)、喘息、多発性硬化症(MS)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、クローン病、特発性肺線維症(IPF)、炎症性腸疾患(IBD)、ブドウ膜炎、黄斑変性、大腸炎、乾癬、ウォラーの変性、抗リン脂質症候群(antiphospholipid syndrome)(APS)、急性冠状動脈症候群、再狭窄(restinosis)、アテローム性動脈硬化症、再発性多発性軟骨炎(RP)、急性肝炎もしくは慢性肝炎、失敗した整形外科用移植片、糸球体腎炎、狼瘡または自己免疫疾患からなる群より選択される。

特に関心があるものは、RA(TNF-α中和剤による治療に耐性のRAを含む)、喘息、MSおよび/またはクローン病を治療するための医用薬剤を調製するための本発明によるヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントの使用である。

RA、喘息、および/またはMSに関しては、慢性関節リウマチ(RA)の発生に関する2つの一般的な理論がある。第1の理論では、T細胞が、今のところまだ特定されていない抗原と相互作用することによって、疾患の開始ならびに慢性炎症プロセスの駆動を担う一次細胞であると考えている。この理論は、RAと、クラスII主要組織適合抗原、多数のCD4+T細胞、およびRA滑膜におけるT細胞受容体遺伝子の歪んだ使用の公知の関連に基づいている。GM-CSFは表面クラスII MHC発現を増大させることによって抗原提示機能を高めることが知られており、T細胞によって産生される。このことは、T細胞に基づく仮説による疾患進行におけるGM-CSFの推定上の役割を示している。

第2の理論では、T細胞は疾患の開始において重要である可能性があるが、慢性炎症はT細胞非依存的にマクロファージおよび線維芽細胞によって自己永続化(self-perpetuate)すると考えている。この理論は、慢性RAにおいて活性化T細胞表現型が相対的に存在しないこと、活性化マクロファージ表現型および活性化線維芽細胞表現型が優勢であることに基づいている。GM-CSFは強力なマクロファージ刺激剤であり、単球およびマクロファージの増殖を促進する。

主に「エフェクター」細胞(マクロファージ)および結合組織細胞(線維芽細胞)によって産生されることが知られるGM-CSFは、ELISAまたはmRNA研究によって測定されたようにRA滑膜および滑液において多量に発現する。RAの「マクロファージ-線維芽細胞理論」によれば、これらの2種類の細胞タイプは、T細胞の関与がもはや重要でない可能性がある慢性炎症の自己永続化状態の発生を主に担っているように思われる。このシナリオでは、活性化マクロファージが、滑膜線維芽細胞を活性化状態に維持するIL-1およびTNFを連続して分泌する。次に、線維芽細胞は、多量のa)サイトカイン-IL6、IL8、およびGM-CSF; b)プロスタグランジン;ならびにc)プロテアーゼ酵素を分泌する。GM-CSFは、新たに動員された単球からマクロファージへの成熟を促進するようにフィードバックする。IL-8およびIL-6は、さらに他の細胞集団の動因および/または活性化に寄与するのに対して、プロスタグランジンおよびプロテアーゼは、骨および軟骨などの近くの結合組織を侵食および破壊するように直接作用する。

クローン病に関しては、酵母に由来する組換えヒト顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(rGM-CSF)が中程度から重度のクローン病の治療において効力を示した(Dieckgraefe BK, Korzenik JR (2002) Lancet 360, 1478-80)。それから、いくつかの総説論文が、炎症性があると考えられているこの疾患における、この強力な炎症促進性サイトカインの治療効果について推測してきた。rGM-CSF作用様式の可能性のある説明には、クローン病における免疫不全症成分、Th2のゆがみ、および調節性T細胞の分化を促進する樹状細胞の増殖が含まれた(WiIk NJ, Viney JL (2002) Curr Opin Invest Drugs 3, 1291-6; Folwaczny C et al. (2003) Eur J Gastroenterol Hepatol 15, 621-6)。本発明者らは、他の炎症促進性疾患におけるGM-CSFの公知の役割と同時にさらに一致する、より単純な作用様式が提案され得ると考えている。

GM-CSFは、公知の最も強力なアジュバントの1つであり、そのために、このサイトカインは非常に多くの現行のワクチン接種治験において同時投与されている。同時に、GM-CSFは非常に免疫原性がある(Ragnhammar P et al. (1994) Blood 84, 4078-87)。つい最近の研究(Rini B et al. (2005) Cytokine 29, 56-66)から、クローン病治験において行われたように(Dieckgraefe BK, Korzenik JR (2002) Lancet 360, 1478-80)、酵母由来rGM-CSFを用いて毎日皮下治療を行うと、3ヶ月以内に、前立腺癌患者の87％(13/15)が抗サイトカイン抗体を生じることが分かった。患者の60パーセント(9/15)が(ポリクローナル)GM-CSF中和抗体を生じた。クローン病治験においてGM-CSFに対する中和応答の可能性は調べられておらず、GM-CSFの血清中濃度も治療の下で測定されなかった。本発明のこの態様の範囲内で、rGM-CSF治療を受けたクローン病患者はサイトカインの免役刺激活性に直接応答しなかっただけでなく、少なくとも部分的に、投与されたGM-CSFならびにクローン病において過剰産生されることが知られる内因性GM-CSFの両方を中和する抗体応答に臨床上応答したと考えられる(Agnholt J et al. (2004) Eur J Gastroenterol Hepatol 16, 649-55)。次に、抗GM-CSF中和抗体は、rGM-CSFと同様に、クローン病において同様の治療活性を有する可能性があり、本明細書前記で意図されたように代替の治療アプローチとみなされるはずである。

本発明のさらなる局面は、腫瘍疾患、あるいは細胞アポトーシスが遅延した、細胞生存または細胞増殖が増大した別の状態を治療するための、1種類または複数の種類の抗癌剤を任意に含む医用薬剤の製造における、前記のヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント、あるいはSEQ ID NO:1〜48および/もしくは52〜56のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはSEQ ID NO:1〜48および/もしくは52〜56のいずれかと少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の使用を提供する。好ましい腫瘍疾患は癌であり、このうち白血病、多発性骨髄腫、胃癌、または皮膚癌が特に好ましい。

Olver et al. ((2002) Cancer Chemother Pharmacol. 50, 171-8)は、GM-CSF受容体を発現することが知られる固形腫瘍を有する患者においてGM-CSFアンタゴニストE21Rを皮下に適用した。これによって、PSA血清中濃度は一過的にしか下がらなかった。さらに、このGM-CSFアンタゴニストを急性骨髄性白血病(「AML」)において適用しても臨床活性は認められなかった(Jakupovic et al. (2004) Blood 103, 3230-2)。なおさらに、抗GM-CSFモノクローナル抗体をAML患者に適用しても、抗体がインビボで十分な血清中濃度および生物学的活性があったにもかかわらず抗白血病効果は認められなかった(Bouabdallah et al. (1998) Leuk Lymphoma 30, 539-49)。従って、著者らは抗GM-CSF抗体治療がAML患者において有効でないと結論付けた。

今から、本発明を、以下の非限定的な実施例および図面においてさらに詳細に説明する。その概要は以下の通りである。

実施例
実施例1
ヒト中和抗体およびそのフラグメントの作成に用いられた組換えヒト(「rh」)GM-CSF抗原の入手
実施例1.1
rhGM-CSF抗原のクローニング、発現、および精製
ヒトGM-CSF抗原をコードする遺伝子を、PCRによって導入された制限酵素認識部位NdeIおよびXhoIを介して、発現ベクターpORF-hGM-CSF(Novagen, USA)からpET22b(+)ベクター(Novagene, USA)にサブクローニングした。pET22b(+)中のhGM-CSFコード遺伝子をpelBリーダー配列に融合した。これは、大腸菌ペリプラズムにおける発現に適している。

タンパク質の産生および精製は製造業者が説明したように行った。簡単に述べると、大腸菌BL21DE3を発現プラスミドで形質転換し、選択培地において600nmでの吸光度0.5〜0.8まで37℃で増殖させた。IPTGを1mMまで添加し、温度を25℃まで下げることによってタンパク質産生を誘導した。ペリプラズム調製は、インタクトな細胞膜を維持している細胞壁を選択的に破壊するように、20％スクロース溶液を用いた浸透圧衝撃によって行った。ネイティブなhGM-CSFは2本のジスルフィド架橋を含有し、大腸菌の酸化性ペリプラズムでの発現は、これらの機能的に重要なジスルフィド架橋の形成を可能にする。

組換えヒトGM-CSF(「rhGM-CSF」)を、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー(IMAC)およびゲル濾過による2段階精製プロセスで精製した。クロマトグラフィーには、Akta(登録商標)FPLCシステム(Pharmacia)およびUnicorn(登録商標)ソフトウェアを使用した。全ての化学薬品は研究グレードのものであり、Sigma(Deisenhofen)またはMerck(Darmstadt)から購入した。

IMACは、Qiagen Ni-NTA Superflowカラムを用いて製造業者によって提供されたプロトコールに従って行った。カラムを、緩衝液A2(20mMリン酸ナトリウム pH7.2, 0.4M NaCl)で平衡化し、ペリプラズム調製物(「PPP」)(100mL)を流速2mL/minでカラム(2mL)に供した。結合しなかった試料を除去するために、カラムを、5カラム体積の5％緩衝液B2(20mMリン酸ナトリウムpH7.2, 0.4M NaCl,0.5Mイミダゾール)で洗浄した。結合したタンパク質を、5カラム体積の100％緩衝液B2を用いて溶出させた。溶出したタンパク質画分を、さらに精製するためにプールした。

ゲル濾過クロマトグラフィーは、PBS(Gibco)で平衡化したSuperdex 200 Prep Gradeカラム(Pharmacia)において行った。溶出したタンパク質試料(流速1mL/min)を、検出のために標準的なSDS-PAGEおよびウエスタンブロットに供した。精製前に、分子量を決定するためにカラムを較正した(分子量マーカーキット, Sigma MW GF-200)。タンパク質濃度はOD 280nmを測定して求め、配列特異的な分子吸光率を用いて計算した。

実施例1.2
rhGM-CSF抗原のビオチン化
ファージライブラリー選択のために、大腸菌において産生させたrhGM-CSF抗原(前記を参照されたい)をビオチン化した。ビオチン化は、5％DMSO(Sigma)と5倍モル過剰のEZ-Link Sulfo NHS-LC-LC-ビオチン(Pierce)を含有するPBS中で、サンプルミキサー(Dynal)において室温で1時間行った。遊離ビオチンおよびビオチン化rhGM-CSF抗原を分離するために、陰イオン交換クロマトグラフィー(Resource Q, Amersham Biosciences)を標準的なプロトコールに従って行った。このクロマトグラフィーによって、(AおよびBと名付けた、下記)両アプローチにおいて2つの溶出ピークが得られた。ケースAでは、一次溶出ピークを、第2の陰イオン交換クロマトグラフィー段階(前記と同じ条件)によって2つの溶出ピークに再分画した。その後に、得られた画分を連続希釈し(希釈1:2; 開始濃度6μg/mLはピーク高から求めた)、96ウェルELISAプレートにコーティングし、検出した。検出は、A)抗ヒトGM-CSF抗体M500-A(Sigma, 2,5μg/mL, PBS/1％BSAに溶解)と西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスFab2特異的ポリクローナル抗体(Dianova, 1μg/mL PBS/1％BSA)、およびB)母親由来抗体(maternal antibody)(1μg/mL PBS/1％BSA)と西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ラットポリクローナル抗体(Dianova, 1μg/mL PBS/1％BSA)を用いて行った。ビオチン化が成功したことは、西洋ワサビペルオキシド(peroxide)結合ストレプトアビジン(Dako, 1μg/mL PBS/1％BSA)を用いて行った同様のELISA実験によって証明した。シグナルは、OPD基質溶液(Sigma)を添加することによって発色させ、波長492nm(参照波長620nm)で検出した。ビオチン化の程度を評価するために、陰イオン交換画分を直接使用して、または穏やかに攪拌しながら6.7 x 10exp7ストレプトアビジン磁気ビーズ(Dynabeads M-280-ストレプトアビジン, Dynal)と30分間インキュベーションを行った段階の後に、前述のELISAを行った。結果として生じた上清を、96ウェルELISAプレートのウェルにコーティングし、前記のように検出した。ELISA結果から、第2の溶出ピークはビオチン化rhGM-CSFを含有し、溶出したrhGM-CSFの約95％が結合していることが分かった。濃度は、最初の材料を標準として用いて評価し、約20μg/mLと判明した。

単鎖抗体(scFv)の特徴分析における下記のプロトコールによるTF-1増殖アッセイ法で、ビオチン標識rhGM-CSFの生理活性は保持されていることが確認された。

実施例1.3
rhGM-CSF抗原のフルオレセイン標識
TF-1細胞における結合研究のために、大腸菌において産生させた組換えヒトGM-CSF抗原(前記実施例1.2を参照されたい)を、フルオレセイン-5(6)-カルボキシアミドカプロン酸N-スクシンイミジルエステル(Fluka, フルオレセイン-NHS)と結合させた。結合段階は、17.5％DMSOと5倍モル過剰のフルオレセイン-NHSを含有するホウ酸緩衝液(0.05Mホウ酸、0.1M NaCl、pH8.5)中で、サンプルミキサーにおいて室温で1時間行った。その後に、遊離フルオレセイン-NHSからフルオレセイン標識rhGM-CSF抗原を分離するために、ゲル濾過(Sephadex G25, Amersham Biosciences)を行った。このゲル濾過によって、波長485nm(参照波長535nn)で測定される2つのピークが得られたが、一次ピークがFITC標識rhGM-CSFに相当する。標識の程度は、結合体のF/P比([mg/mL]=(A₂₈₀-0.35 x A₄₉₃) x 1.08; F/P=(A₄₉₃/73.000) x (15.000/([mg/mL]))を定義することによって求めた。求められた濃度は0.041mg/mLであり、F/P比1.2であった。

実施例2
ヒト抗GM-CSF中和抗体およびそのフラグメントの作成および選択
実施例2.1
ハイブリドーマHB-9569からの母親由来VHのクローニング
前述の実施例全体を通じて使用した「母親由来(maternal)」V領域は、対象となるV領域が完全な免疫グロブリン分子に由来することを示す。

前述の実施例全体を通じて使用した「ヒット」は、関心対象の抗原に結合することが分かっているが、この結合が定量評価されたことがない分子を示す。「ヒット」は、小規模産生が既に行われていた可能性のある、特徴分析の初期段階にある分子である。このような分子は、特徴分析の検証段階にある。

前述の実施例全体を通じて使用した「リード」分子は、結合能および中和能が定量されている分子を示す。「リード」分子の産生は既に大規模に行われている。

以下の実施例において、ヒトGM-CSFの完全にヒトモノクローナルな抗体中和剤を作成する、可能性のあるやり方の1つ、およびそのフラグメントの作成を説明する。

本実験の目的は、ハイブリドーマ細胞株HB-9569によって産生された母親由来mAbのVHをコードする遺伝子の単離およびサブクローニングである。ハイブリドーマHB-9569はATCC(USA)から入手した。ハイブリドーマ細胞は、ATCC完全増殖培地: 1.5g/L重炭酸ナトリウム、4.5g/Lグルコース、10mM HEPES、および1.0mMピルビン酸ナトリウムを含有するように調整され、0.05mM 2-メルカプトエタノール、胎児ウシ血清10％を添加した2mM L-グルタミン含有RPMI1640培地において37℃、5％CO₂で培養した。全RNA調製のために、1 x 10exp7細胞を使用し、Qiagen Omni-Skriptキット(Qiagen, Germany)の製品マニュアルに記載のように調製した。cDNAを、標準的な方法(Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, Second Edition)に従って合成した。

重鎖V領域DNAの単離のために、MHALT1R.V:

プライマーセットを使用して、RT-PCRを行った。増幅には以下のPCRプログラムを使用した：94℃15秒の変性、52℃50秒のプライマーアニーリング、および72℃90秒のプライマー伸長を40サイクルにわたって行い、続いて、72℃10分の最終伸張を行った。次いで、標準的なプロトコールに従って、重鎖DNA Vフラグメントを単離した。

製造業者が述べたように、重鎖DNA VフラグメントをPCR script-CAM(Stratagene)にクローニングした。配列は配列決定によって特定した。

実施例2.2
ヒトVLの選択
本実験の目的は、前記のようにクローニングした母親由来VHと対になるヒトVLの選択である。

実施例2.2.1
選択されたIgD陽性B細胞からのRNAの単離
血液100mLを5人の健常ヒトドナーから採取した。標準的な方法に従ってフィコール勾配によって、末梢血単核球(PBMC)を単離した。IgD陽性細胞を選択するために、抗マウスIgG-ビーズ(CELLection(商標)Pan Mouse IgG Kit; DYNAL)1mLを、マウス抗ヒトIgD抗体(PharMingen)20μgでコーティングした。約2.5 x 10exp7 PBMCをビーズに添加し、4℃で15分間インキュベートした。RPMI培地(BioChrom)1mLで4回洗浄した後、放出緩衝液(DNアーゼ)8μLを添加することによって、ビーズからIgD陽性細胞を放出させ、新鮮なチューブに移した。この方法によって、0.9 x 10exp5〜3.7 x 10exp6 IgD陽性細胞を入手することができた。RNeasy(登録商標)Midi Kit(QIAGEN)を使用し、製造業者の説明書に従って、IgD陽性細胞から全RNAを単離した。標準的な方法(Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, Second Edition)に従って、cDNAを合成した。

実施例2.2.2
軽鎖可変領域(VL領域)のPCR増幅
軽鎖V領域DNAの単離のために、下記のプライマーセットを使用して、RT-PCRを行った：

IgD陽性B細胞からのRNAをcDNAに転写し(前記)、PCR反応におけるテンプレートDNAとして使用した。PCR反応1回につき、1つの5'-プライマーと1つの3'-プライマーを組み合わせた。異なるPCR反応の数は、5'-プライマーおよび3'-プライマーの可能な組み合わせの数によって決まった。増幅には以下のPCRプログラムを使用し、94℃15秒の変性、52℃50秒のプライマーアニーリング、および72℃90秒のプライマー伸長を40サイクルにわたって行い、続いて、72℃10分の最終伸張を行った。次いで、標準的なプロトコールに従って、軽鎖DNA Vフラグメントを単離した。

実施例2.2.3
ライブラリー構築 - ヒトVLプールのクローニング
ファージディスプレイライブラリーは、一般的に、例えば、「Phage Display: A Laboratory Manual」; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に開示されるように標準的な手順に基づいて構築した。

PCR増幅用に選択したプライマーは、軽鎖Vフラグメント用に5'-SacIおよび3'-SpeI認識部位を生じさせた。2回の連結反応を設定し、それぞれの連結反応は、κ軽鎖フラグメント(SacI-SpeI消化)400ngおよびプラスミドpBluescript KS+(SacI-SpeI消化;大きなフラグメント)1400ngからなった。次いで、結果として生じた2つの抗体V軽鎖プールでそれぞれ、エレクトロポレーション(2.5kV、0.2cmギャップキュベット、25mF、200 Ohm、Biorad gene-pulser)によってエレクトロコンピテント大腸菌XL1 Blue 300μLを形質転換し、ライブラリーサイズが5.8 x 10exp8の独立したクローンを得た。

異なるPCR増幅からのκ(軽鎖)DNAフラグメントを、以下のように、それぞれの連結について重みをつけた。それぞれの5'-プライマーが特定のグループを規定する。これらのグループ内で、3'-プライマーがサブグループを規定する。サブグループは、プライマー3'-hu-Vk-J1-SpeI-BsiWI:3'-hu-Vk-J2/4-SpeI-BsiWI:3'-hu-Vk-J3-SpeI-BsiWI:3'-hu-Vk-J5-SpeI-BsiWIに対応して1:2:1:1の重みをつけた。グループは、生殖系列分布に従って、プライマー5'-huVK1-Sac-2001:5'-huVK3-Sac-2001:5'-huVK2/4-Sac-2001:5'-huVK5-Sac-2001:5'-huVK6-Sac-2001に対応して1:1:1:0.2:0.2の重みをつけた。

エレクトロポレーション後、アッセイしたものを、表現型発現のためにSOCブロス(Fluka)中でインキュベートした。次いで、培養物をそれぞれ、50μg/mLカルベニシリンおよび2％w/vグルコースを含有するSB選択培地500mL中で一晩インキュベートした。翌日、細胞を遠心分離によって収集し、市販のプラスミド調製キット(Qiagen)を用いてプラスミド調製を行った。

実施例2.2.4
抗体ライブラリーの構築 - ヒトVL-母親由来VH
実施例2.1に前述した母親由来VHを含有するベクターから母親由来VHを増幅するために、PCRを行った。増幅のために、5'-プライマーMVH8

および
3'-プライマー3'-MuVHBstEII

を使用して、標準的な手順によるPCRプロトコールに従った。

分析用アガロースゲルから約350bp増幅産物を精製した後、DNAフラグメントを制限酵素BstEIIおよびXhoIで切断した。ファージミドpComb3H5BHis(このベクターはDr. RaIf Lutterbuseの学位論文に記載されている)を、それに応じて消化し、大きなフラグメントを、前述のフラグメントと連結した。形質転換によって大腸菌XL1 blueに導入した後、単一のクローンをSB培地(50μg/mLカルベニシリン含有)100mL中で培養し、プラスミドを標準的なプロトコールに従って調製した。クローニングが成功したことは、インサートの配列決定によって確認した(Sequiserve, Munich)。

このベクターpComb3H5BHis/母親由来VHを制限酵素SacIおよびSpeIで処理した。大きなベクターフラグメントを単離した。実施例2.2.3からのVKライブラリーを含有するプラスミドDNAを制限酵素SacIおよびSpeIで処理した。小さなVKフラグメントバンド(約350bp)を単離した。

ベクターフラグメント1200ngをVKフラグメント400ngと連結し、エレクトロポレーション(2.5kV, 0.2cmギャップキュベット, 25mF, 200 Ohm)による形質転換によってエレクトロコンピテント大腸菌XL1 Blue 300μLに導入し、全scFvライブラリーサイズが2.8 x 10exp8の独立したクローンを得た。

表現型を発現させ、カルベニシリンにゆっくりと適応させた後、抗体ライブラリーをSB-カルベニシリン(50μg/mL)選択培地に移した。次いで、抗体ライブラリーを、感染量1 x 10exp12粒子のヘルパーファージVCSM13に感染させ、繊維状M13ファージを産生および分泌させた。ここで、それぞれのファージ粒子は、一本鎖のpComb3H5BHis-半ヒト(half-human)scFVフラグメントコードDNAを含有し、対応するscFvタンパク質をファージコートタンパク質IIIとの翻訳融合としてディスプレイした。

実施例2.2.5
ヒトVLのファージディスプレイ選択
scFvレパートリーを有するファージ粒子を、PEG8000/NaCl沈殿および遠心分離によって培養上清から収集した。次いで、約1 x 10exp11〜1 x 10exp12のscFvファージ粒子をPBS/0.1％BSA 0.4mLに再懸濁し、穏やかに攪拌しながら、組換えビオチン化可溶性rhGM-CSF(実施例1において前述したように大腸菌において産生させた)と総体積0.5mL(抗原濃度1〜3回目:100nM; 4回目:10nM; 5回目:1nM)で2時間インキュベートした。次いで、6.7 x 10exp7のストレプトアビジン磁気ビーズ(Dynabeads M-280-ストレプトアビジン, Dynal)を添加し、穏やかに攪拌しながら、30分間さらにインキュベートした。

標的抗原に特異的に結合しなかったscFvファージを、PBS/0.1％BSAを用いた洗浄段階によって排除した。このために、磁石を用いて、(潜在的なscFv結合剤を有する)ビオチン化抗原-ストレプトアビジンビーズ複合体を収集し、洗浄溶液1mLに再懸濁した(1回の洗浄段階)。この洗浄手順は、後の回において4回まで繰り返した。

洗浄後、結合実体を、HCl-グリシン、pH2.2を用いて溶出させた。2M Tris、pH12で中和した後、溶出液を、新鮮な非感染大腸菌XL1 Blue培養物の感染に使用した。残存している高結合実体を溶出させるために、HCl-グリシン、pH1.0を用いて、この段階を繰り返した。この第2の溶出液を再中和し、新鮮な非感染大腸菌XL1 Blue培養物の感染に使用した。次いで、2つの感染大腸菌培養物を混合し、ヒトscFVフラグメントをコードするファージミドコピーが首尾よく形質導入された細胞をカルベニシリン耐性について再選択し、その後に、VCSM13ヘルパーファージに感染させて、2回目の抗体ディスプレイおよびインビトロ選択を開始した。

4回目および5回目のパニングに対応するプラスミドDNAを大腸菌培養物から単離した。可溶性scFvタンパク質を産生するために、プラスミド(SacI-SpeI)からVL-DNAフラグメントを切り出し、発現構築物(例えば、scFv)がscFvとHis6-タグの間にFlagタグ(TGDYKDDDDK)を含み、さらなるファージタンパク質が欠失している点で最初のpComb3H5BHis/母親由来VHとは異なる、母親由来VHを有するプラスミドpComb3H5BFlag/Hisに同じ制限部位を介してクローニングした。

連結後、それぞれのプラスミドDNAプール(様々な回のパンニング)で熱ショックコンピテント大腸菌XL1 blue 100μLを形質転換し、カルベニシリンLB-寒天にプレートした。シングルコロニーをつつき、LB carb(50μg/mL)100μLに入れた。

典型的に、この細胞懸濁液10μlを、カルベニシリンを濃度50μg/mlまで、MgCl₂を最終濃度20mMまで添加したSB培地5ml中で、攪拌しながら、37℃で約6時間インキュベートした。次いで、IPTGを最終濃度1mMまで添加し、30℃のシェーカーでインキュベーションを一晩続けた。

細胞を遠心分離してペレットにした。このペレットは、典型的に、PBS 0.5mlに再懸濁した。-70℃で凍結、37℃で融解を4回行うことによって、細菌の外膜を浸透圧衝撃によって破壊し、scFvを含む可溶性ペリプラズムタンパク質を上清に放出させた。さらなる遠心分離(10,000 x gで5分)によってインタクトな細胞および細胞破片を排除した後に、scFvを含有する上清(すなわち、PPP)を収集し、さらに調べた。

RhGM-CSF抗原(Leukine Liquid, Immunex)を、ELISAプレート上に4℃で一晩固定した(1ウェルあたり50μl の1μg抗原/ml PBS)。ウェルをPBSで1回洗浄し、PBS 3％BSAで室温で1時間ブロックした後、scFvを含有するPPP 100μlをウェルに添加し、典型的に、室温で1時間インキュベートした。PBS/0.05％Tween20で3回洗浄した後、固定化抗原に結合したscFVフラグメントを、抗flag M2(1μg/mL PBS/1％BSA)および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスFab2特異的ポリクローナル抗体(Dianova, 1μg/mL PBS/1％BSA)を用いて検出した。シグナルは、2,2'-アジノ-ジ[3-エチル-ベンズチアゾリン-6-スルホン酸](「ABTS」)基質溶液を添加することによって発色させ、標準的なプロトコールに従って波長405nmで検出した。

試験した20個のクローン(4回目のパニングの後に10個を入手し、5回目のパニングの後に10個を入手した)から、陰性対照であるPBSとは対照的に、組換え抗原に対して5個の溶解産物が強いELISAシグナルを示した。ELISA結果を図1に示した。図1には、試験した様々なscFv分子をx軸に整列させ、y軸は測定された吸収強度を示し、吸収が高いほど結合が強いことを示す。陰性対照であるPBSをx軸の左端に示した。かなりの結合を示すScFv分子は、それぞれの吸収強度のカラムの上にダイヤモンドまたは星印を付けて示した。図1のダイヤモンドおよび星印は2つの異なる配列に相当する。すなわち、吸収強度カラムがダイヤモンドで示されているscFvは1つの配列のscFvであるが、吸収強度カラムが星印で示されているscFvは全て同じ共通の配列を有する。

5個のELISA陽性クローンをDNA配列決定にかけた。配列決定はSequiserve(Munich)で行った。合計4個のクローンが、scFv5-306に対応するDNA配列を共有していたのに対して、他の配列(4-301)は1つだけ特定された。scFv5-306に対応する優勢な配列ならびに配列4-301はヒト由来であり、ヒト生殖細胞系列配列Vk1-O12と非常に近い相同性を示した。

実施例2.2.6
huVL選択から得られたscFvヒット構築物の特徴分析
以下の実験の目的は、前記の方法によって作成されたscFvヒットの特徴分析であった。

実施例2.2.6.1
大腸菌における(前記のように得られた)scFvヒットの小規模発現および精製
PPPを得るために、細胞を、20mM MgCl₂およびカルベニシリン50μg/mLを添加したSB培地において増殖させ、収集後にPBS 1mLに再溶解した。細菌外膜を温度ショック(-70℃での凍結、37℃での融解を4回)によって破壊し、scFvを含む可溶性ペリプラズムタンパク質を上清に放出させた。遠心分離によってインタクトな細胞および細胞破片を排除した後に、scFvを含有する上清を収集し、さらに調べた。さらなる精製のために、20mM NaH₂PO₄、400mM NaCl、250mMイミダゾール, pH7.0 25μLを、それぞれのPPPに添加した。Ni-NTAスピンカラム(Qiagen)を介してマニュアルに推奨されるように、PPPを精製した。簡単に述べると、それぞれのPPP溶液を、予め平衡化したカラムに添加して、樹脂に結合させた。スピンカラムを20mM NaH₂PO₄、400mM NaCl、20mMイミダゾール、pH7.0で2回洗浄した。結合したタンパク質を、20mM NaH₂PO₄、400mM NaCl、250mM イミダゾール、pH7.0 200μLで2回溶出させた。精製scFvタンパク質を、後の実施例に記載のように結合強度(キネティックオフレート)および中和能力(GM-CSF依存性TF-1増殖の阻害)に関してさらに分析した。可能性のある異なるscFv構造を分離および区別していないが、このPPP粗精製から、ウエスタンブロット分析により判断されたように80％の純度のscFvタンパク質が得られる(データ示さず)。

実施例2.2.6.2
FITC標識rhGM-CSFの阻害
本実験の目的は、特定されたscFvクローンが、rhGM-CSFと、TF-1細胞表面にディスプレイされたGM-CSF受容体複合体の結合を阻害できることを示すことである。中和scFv構築物は、rhGM-CSF分子上にある受容体結合エピトープにおいて競合し、rhGM-CSFがGM-CSF受容体複合体に結合できないようにすると予想された。rhGM-CSFによる受容体との結合が前記のように阻害される程度まで、フローサイトメトリーに基づくアッセイ法において、フルオレセイン標識rhGM-CSF(rhGM-CSF-FITC)によるTF-1細胞の蛍光染色の強度の低下が観察されると予想された。

以下は、このようなフローサイトメトリーに基づくアッセイ法の実施について述べている。PBSに溶解した最終濃度0.4μg/mLのrhGM-CSF-FITC結合体を、10μg/mlの母親由来抗体、またはNiNTAスピンカラムで精製されたscFvの未希釈ペリプラズム抽出物とインキュベートした。タンパク質試料を、TF-1細胞懸濁液を添加する前に1時間、25℃で平衡にした。TF-1細胞を、rhGM-CSF非存在下で、RPMI1640培地(Gibco; L-グルタミン、フェノールレッドフリー)、10％熱不活化FCSにおいて一晩培養した。試料1つにつき最終濃度2 x 10exp6細胞/mLの細胞懸濁液150μLを使用した。細胞を、4℃で3分間、500 x gの遠心分離によって収集し、FACS緩衝液で2回洗浄した。洗浄した細胞を、rhGM-CSF-FITCおよびそれぞれの母親由来抗体またはscFvを含有する予め平衡化したタンパク質試料100μLに再懸濁した。試料を4℃で60分間インキュベートした。さらに2回洗浄した後、細胞を氷冷FACS緩衝液150μLに再懸濁し、その後に、フローサイトメトリーによって分析した。結果を図2に示した。具体的には、図2は、様々な試験分子をx軸に沿って整列させ、平均蛍光強度(「MFI」)をy軸に示したグラフを示す。図2から分かるように、母親由来抗体では、TF-1細胞の明らかな蛍光強度消失が観察された(x軸に沿って左から2番目)。rhGM-CSFと5-306と名付けたscFv分子の競合結合はTF-1細胞の蛍光染色消失によってモニタリングできたのに対して、scFv分子4-301はほどんど効果を示さなかった。これらの結果は、5-306と名付けたscFv分子が有望なGM-CSF中和剤であり得ることを示唆しており、さらなる中和活性分析がscFv5-306に限定された。

実施例2.2.6.3
scFvリードの大規模発現および精製
大規模なタンパク質の産生および精製を以下のように行った。簡単に述べると、大腸菌BL21DE3を発現プラスミドで形質転換し、1L選択培地中、37℃で、600nmでの光学密度0.5〜0.8まで増殖させた。タンパク質の産生は、IPTGを1mMまで添加することによって誘導し、培養物を、攪拌しながら、さらに16時間、25℃の温度でインキュベートした。5,000 x g、10分間の遠心分離によって細胞を収集し、1 x PBS 100mLに再懸濁した。ペリプラズムタンパク質を、エタノール/ドライアイス中での最適な連続凍結、および37℃水浴中での解凍の4サイクルによって抽出した。最後に、抽出物を10,000xgで20分間遠心分離した。

scFv 5-306を、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー(IMAC)およびゲル濾過の2段階精製プロセスにおいて単離した。全てのリードを、この方法に従って精製した。Akta(登録商標)FPLCシステム(Pharmacia)およびUnicorn(登録商標)ソフトウェアをクロマトグラフィーに使用した。全ての化学化学薬品は研究グレードのものであり、Sigma(Deisenhofen)またはMerck(Darmstadt)から購入した。

IMACは、Qiagen Ni-NTA Superflowカラムを使用し、製造業者によって提供されたプロトコールに従って行った。カラムを、緩衝液A2(20mMリン酸ナトリウムpH7.2, 0.4M NaCl)を用いて平衡化し、PPP(100mL)を流速2mL/minでカラム(2mL)に供した。結合しなかった試料を除去するために、カラムを、5カラム体積の5％緩衝液B2(20mMリン酸ナトリウムpH7.2, 0.4M NaCl,0.5Mイミダゾール)で洗浄した。結合したタンパク質を、5カラム体積の100％緩衝液B2を用いて溶出させた。溶出したタンパク質画分を、さらに精製するためにプールした。

ゲル濾過クロマトグラフィーは、PBS(Gibco)で平衡化したHiLoadTM 16/60 Superdex 75 Prep Gradeカラム(Pharmacia)において行った。溶出したタンパク質試料(流速1mL/min)を、検出のために標準的なSDS-PAGEおよびウエスタンブロットに供した。精製前に、分子量を決定するために、カラムを較正した(分子量マーカーキット, Sigma MW GF-200)。Superdex 75 Prep Gradeカラムによるサイズ依存性の分離によって、はっきりと区別可能な、scFvリードの単量体ピーク画分および結合二量体ピーク画分が得られた。タンパク質濃度は280nmでの光学密度を測定して求め、それぞれのscFvリードの配列特異的な分子吸光率を用いて計算した。

実施例2.2.6.4
scFvリードによるTF-1細胞のrhGM-CSF依存性増殖の阻害
本実験の目的は、hGM-CSF依存性細胞株TF-1(DSMZ ACC334)を用いて、半ヒトscFv 5-306の中和活性に関する定性情報を得ることである。TF-1細胞を、販売業者(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany)が説明したように、2.5ng/mL rhGM-CSFの存在下で、RPMI1640培地(Gibco; L-グルタミン、フェノールレッドフリー)、10％熱不活化FCSにおいて培養した。細胞を細胞密度0.5 x 10exp6細胞/mLまで増殖させた。増殖アッセイ法のために、TF-1細胞を、300 x g、4分間の遠心分離によって収集し、1 x PBS(Dulbecco's, Gibco)で洗浄した。細胞を最終濃度1 x 10exp5細胞/mLでRPMI1640、10％FCSに再懸濁し、マイクロテスト平底細胞培養プレート1ウェルにつき90μLの細胞懸濁液を使用した(0.9 x 10exp4細胞/ウェル)。TF-1細胞の増殖を刺激するために、最終濃度0.3ng/mLのrhGM-CSFを使用した。hGM-CSF依存性増殖を中和するために、精製scFv 10μLをTF-1 100μLに添加した。rhGM-CSF溶液の希釈シリーズは約100μg/ml〜100pg/mlであった。試料を37℃、5％CO₂で72時間インキュベートした。72時間後、WST-1を添加し、ELISAリーダーを用いて450nmで比色変化をモニタリングすることによって、TF-1細胞の増殖状態を確かめた。Prismソフトウェアの非線形回帰曲線フィットを用いて、最大半量増殖阻害(IC₅₀)のためにデータをフィットさせた。

明らかに用量依存性のscFv5-306増殖阻害作用が認められ、単量体構造型および二量体構造型について同等であった。最大半量増殖阻害のためのフィッティングによって、単量体型については7.3nMのIC50値、二量体型については3.5nMのIC50値が求められた。結果を図3に示す。

実施例2.3
抗体ライブラリーの構築およびヒトVHのファージディスプレイ選択
以下の実験の目的は、前記のように選択されたscFv 5-306のヒトVL領域と対になるヒトVH領域セットの選択である。

実施例2.3.1
末梢血単核球(PBMC)からのRNAの単離
5人の健常ヒトドナーから血液100mLを採取した。末梢血単核球(PBMC)を、標準的な方法によるフィコール勾配によって単離した。RNeasy(登録商標)Midi Kit(QIAGEN)を使用し、製造業者の説明書に従って、全RNAをPBMCから単離した。標準的な方法(Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, Second Edition)に従って、cDNAを合成した。

実施例2.3.2
重鎖可変領域(VH領域)のPCR増幅
VHライブラリーを構築し、Lib 134-VHと名付けた。このVHライブラリーは、母親由来抗体のVH CDR3とそれに続くヒトFR4生殖系列配列に機能的に連結された、前記のPBMCプールのPCR増幅VH領域からのFR1-CDR2-FR2-CDR2-FR3ヒトレパートリーからなる。

ヒトテンプレートVH領域を単離するために、5'-VH特異的プライマーセット

および2つ一組の3'-VH特異的プライマー

を用いて、RT-PCRを行った。PCR反応1回につき、1つの5'-プライマーと1つの3'-プライマーを組み合わせた。異なるPCR反応の数は、5'-プライマーおよび3'-プライマーの可能な組み合わせの数によって決まった。PBMC cDNA(前記のように、VH遺伝子供給源として4人のドナーしか使用しなかった)。増幅には以下のPCRプログラムを使用した：94℃15秒の変性、52℃50秒のプライマーアニーリング、および72℃60秒のプライマー伸長を40サイクルにわたって行い、続いて、72℃10分の最終伸張を行った。次いで、標準的なプロトコールに従って、サイズが約350bpの増幅産物を単離した。

Lib 134-VH領域を単離するために、RT-PCRを2段階で行った。最初に、前記と同じ5'-VH特異的プライマーセット(5'-huVH1,3,5-XhoI-2001, 5'-huVH4-XhoI-2001, 5'-huVH4B-XhoI-2001)、ならびにFR3超末端領域においてマッチするヒトVHサブファミリー1、3、および4の3'特異的プライマーセット

を用いて、単離されたテンプレートVHフラグメントから、ヒト重鎖VHセグメント(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3)をPCR増幅した。

以下のプライマーの組み合わせを使用した：

PCR反応1回につき、1つの5'-プライマーと3'-プライマーを組み合わせた。異なるPCR反応の数は、5'-プライマーおよび3'-プライマーの可能な組み合わせの数によって決まった。増幅には以下のPCRプログラムを使用した：94℃15秒の変性、52℃50秒のプライマーアニーリング、および72℃90秒のプライマー伸長を40サイクルにわたって行い、続いて、72℃10分の最終伸張を行った。このPCR段階およびそれぞれの3'-プライマー配列によって、母親由来VH CDR3の一部のためにヒトVHセグメントを伸張し、そして次に、母親由来VH CDR3の一部は、第2の段階のPCR 3'-プライマーのプライミング部位になる。

次いで、これらのVH-(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3)DNAフラグメントを、再度、それぞれの5'VH特異的プライマーおよび増幅されたDNAフラグメントの普遍的な3'末端にマッチするユニバーサル3'プライマー

を用いた第2のPCR反応のテンプレートとして使用した。

増幅には以下のPCRプログラムを使用した：94℃15秒の変性、52℃50秒のプライマーアニーリング、および72℃60秒のプライマー伸長を40サイクルにわたって行い、続いて、72℃10分の最終伸張を行った。標準的なプロトコールに従って、DNA Vフラグメントを単離した。

実施例2.3.3
ライブラリー構築 - ヒトVHプールのクローニング
前述の方法の2回目において、前の選択である、1回目の方法において特定されたscFv5-306のヒトVLを選択し、その後に、ヒトscFvを作成する目的で、実施例2.3.2に記載のヒトVHフラグメントライブラリーと組み合わせた。一般的に、ファージディスプレイライブラリーは、例えば、「Phage Display: A Laboratory Manual」; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に開示されるように標準的な手順に基づいて構築した。

異なるPCR増幅からの重鎖DNAフラグメントを、以下:
a:b:c:d:e:f=3:1:3:1:1:1のように、それぞれの連結について加重した。ここで、a〜fは、以下の意味を有する:

ヒトLib 134-VHフラグメントプール(XhoI-BstEII消化)400ngおよびプラスミドpComb3H5BHis/5-306VL(scFv 5-306のVL領域をコードするDNAを、標準的な手順に従って、制限部位SacIおよびSpeIを介してpComb3H5BHisにクローニングした)1200ngからなる1回の連結反応を設定した。次いで、結果として生じた抗体ヒトVHプールで、エレクトロポレーション(2.5kV、0.2cmギャップキュベット、25mF、200 Ohm、Biorad gene-pulser)によってエレクトロコンピテント大腸菌XL1 Blue 300μLを形質転換して、ライブラリーサイズが合計1.6 x 10exp8の独立したクローンを得た。

エレクトロポレーション後、アッセイしたものを、表現型発現のためにSOCブロス(Fluka)中でインキュベートした。次いで、培養物をそれぞれ、50μg/mLカルベニシリンおよび2％v/vグルコースを含有するSB選択培地500mL中で一晩インキュベートした。翌日、培養物の細胞を遠心分離によって収集し、DNAライブラリーを保存するために、市販のプラスミド調製キット(Qiagen)を用いてプラスミド調製を行った。

次いで、それぞれのscFvプールをコードする、このプラスミドプール1.5μgを大腸菌XL1 blueにエレクトロポレートして(2.5kV、0.2cmギャップキュベット、25mF、200 Ohm、Biorad gene-pulser)、ライブラリーサイズが合計2.4 x 10exp9の独立したクローンを得た。表現型を発現させ、カルベニシリンにゆっくりと適応させた後、抗体ライブラリーをSB-カルベニシリン(50μg/mL)選択培地に移した。次いで、抗体ライブラリーを、感染量1 x 10exp12粒子のヘルパーファージVCSM13に感染させて、繊維状M13ファージを産生および分泌させた。ここで、それぞれのファージ粒子は、一本鎖のpComb3H5BHis-ヒトscFVフラグメントコードDNAを含有し、対応するscFvタンパク質をファージコートタンパク質IIIとの翻訳融合としてディスプレイした。

実施例2.3.4
ヒトVHのファージディスプレイ選択
クローニングされたscFvレパートリーを有する、結果として生じたファージライブラリーを、PEG8000/NaCl沈殿および遠心分離によって培養上清から収集した。約1 x 10exp11〜1 x 10exp12のscFvファージ粒子をPBS/0.1％BSA 0.4mLに再懸濁し、穏やかに攪拌しながら、組換えビオチン化可溶性rhGM-CSF(実施例1に記載の大腸菌材料)と総体積0.5mLで1時間インキュベートした。次いで、6.7 x 10exp7ストレプトアビジン磁気ビーズ(Dynabeads M-280-ストレプトアビジン、Dynal)を添加し、穏やかに攪拌しながら30分間さらにインキュベートした。

標的抗原に特異的に結合しなかったscFvファージを、PBS/0.1％BSAを用いた洗浄段階によって排除した。このために、磁石を用いて、(潜在的なscFv結合剤を有する)ビオチン化抗原-ストレプトアビジンビーズ複合体を収集し、洗浄溶液1mLに再懸濁した(1回の洗浄段階)。この洗浄手順は4回まで繰り返した。洗浄後、HCl-グリシンpH2.2を用いて結合実体を溶出させ、2M Tris pH12で中和した後に、溶出液を、新鮮な非感染大腸菌XL1 Blue培養物の感染に使用した。

残存している高結合実体を溶出させるために、ビーズを新鮮な大腸菌XL1 blue培養物200μLに直接再懸濁し(OD600>0.5)、穏やかに攪拌しながら10分間インキュベートした。次いで、2つの培養物を混合し、ヒトscFVフラグメントをコードするファージミドコピーが首尾よく形質導入された細胞をカルベニシリン耐性について再選択し、その後に、VCMS13ヘルパーファージに感染させて、2回目の抗体ディスプレイおよびインビトロ選択を開始した。

2つの抗体について合計4回の選択を行った。選択中に、抗原濃度を以下のように最終濃度まで下げた。
1回目 100nM
2回目 10nM
3回目 10nM
4回目 10nM

3回目および4回目のパンニングに対応する大腸菌培養物由来プラスミドDNAを単離した。

可溶性scFvタンパク質を産生するために、VH-VL-DNAフラグメントをプラスミド(XhoI-SpeI)から切り出し、プラスミドpComb3H5BFlag/His(ファージ感染に必要なさらなるファージタンパク質なし)に同じ制限部位を介してクローニングした。連結後、それぞれのプラスミドDNAの各プール(様々な回のパンニング)で熱ショックコンピテント大腸菌TG1 100μLを形質転換し、カルベニシリンLB-寒天にプレートした。シングルコロニーをつつき、96ウェルプレート(Greiner)中のLB carb(50μg/mL)1％グルコース120μLに入れた。ウェルを半透膜(Greiner)で密封し、プレートを振盪インキュベーターにおいて37℃で一晩インキュベートした(マスタープレート)。次いで、マスタープレート培養物10μLを、1ウェルあたり90μLのLB carb(50μg/mL)0.1％グルコースを含有する第2の96ウェルプレート(ワーキングプレート)に移した。37℃振盪インキュベーターにおいて4時間インキュベートした後、各ウェルにLB carb 6mM IPTG 20μLを添加することによって、scFv産生を誘導した。振盪しながら30℃で一晩、もう1回インキュベーション段階を行った後、細胞を、溶解緩衝液(400mMホウ酸、320mM NaCl、4mM EDTA pH8、2.5mg/mLリゾチーム)40μLと室温で1時間インキュベートすることによって溶解した。残存している細胞および細胞破片を、1,900 x g(Hettich)で12分間の遠心分離によって分離した。

次いで、scFv分子を含有する上清を、ELISAアッセイ法において結合について試験した。固定化rhGM-CSF抗原(リューカイン)に結合したscFVフラグメントの検出は、抗flag M2(1μg/mL PBS/1％BSA)と西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスFab2特異的ポリクローナル抗体(Dianova, 1μg/mL PBS/1％BSA)を用いて行った。シグナルは、ABTS基質溶液を添加することによって発色させ、405nmの波長で検出した。

3回目の選択の後に試験した約100個のクローンのうち、12個のクローンがrhGM-CSFと強い結合を示した。4回目の後に試験した約160個のクローンのうち、陰性対照であるPBSと比較して、組換え抗原に対して溶解産物の80％超が強いELISAシグナルを示した。代表的なクローンからの結果を図4に示した。図4には、これらの代表的なクローンをx軸に沿って整列させ、吸光度強度をy軸に示した。図4から分かるように、陰性対照であるPBS(x軸の右から2番目)は結合をほとんど示さなかったのに対して、代表的なscFvクローンであるscFv A、scFv 3035、scFv 3039、scFv 3080、およびscFv 5-306はELISAによって様々な程度の結合強度を示した。

ブロッキング剤との非特異的結合の並列実験において、rhGM-CSF非存在下で全ての溶解産物を試験した。有意な検出可能なシグナルは観察できなかった。このことは、rhGM-CSFへの結合の特異性を示している。

13を超えるELISA陽性scFvクローンのDNA配列を決定した。合計6種類の配列を特定した。全ての配列はヒト由来であり、ヒト生殖系列配列VH-11-O2と密接に関連していた。

実施例2.3.5
ヒトVL領域およびVH領域を含有するヒトscFv構築物の特徴分析
実施例2.3.5.1
実施例3に記載の方法によって作成したscFvリード構築物の大規模な産生および精製
実施例2.2.6.3に記載のように、scFvリードを単離および精製した。

実施例2.3.5.2
表面プラズモン共鳴(SPR)によるscFvリードのキネティック結合分析
本実験の目的は、scFvリードの徹底的な特徴分析である。scFvリードの結合キネティクス(kdおよびka)は、10μg/mL〜1pg/mL精製scFvの希釈シリーズの精製タンパク質10μLを注入し、25℃で100秒間の解離をモニタリングすることによって測定した。タンパク質を、HBS-EP(0.01M HEPES, pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005％界面活性剤P20)で緩衝化した。1:1 Langmuir結合式(式1および2)によって解離および会合キネティクスの速度定数を求めるBIAevalution(商標)ソフトウェアを用いて、データをフィットさせた。式中、Aは注入された分析物の濃度であり、Bはリガンドの濃度である。
dB/dt = -(ka＊[A]＊[B]-kd＊[AB]) (1)
dAB/dt = -(ka＊[A]＊[B]-kd＊[AB]) (2)

分析した8種類までの濃度の各scFvリードを用いて、キネティック結合曲線を求めた。生データの独立したフィッティングによって、解離速度定数および会合解離速度定数が得られた。解離速度定数および会合解離速度定数を使用して、平衡解離定数(KD、結果を表1に示す)を計算した。

（表１）

2.3.5.3
scFvリードによるTF-1細胞rhGM-CSF依存性増殖の阻害
特異的結合の強度がscFvリードにおいて保存されていることを確認した後、本実験の目的は、scFvリードと抗原rhGM-CSFとの相互作用の特異性を評価することであった。scFv結合による抗原rhGM-CSFの生物学的機能の阻害を、TF-1増殖阻害実験において特徴分析した。

TF-1増殖阻害実験を前記のように行った。細胞を、最終濃度1 x 10exp5細胞/mLでRPMI1640、10％FCSに再懸濁し、1ウェルあたり90μLの細胞懸濁液を使用した(0.9 x 10exp4細胞/well)。TF-1細胞の増殖を刺激するために、最終濃度0.3ng/mLのrhGM-CSFを使用した。rhGM-CSF依存性増殖を中和するために、1x PBSに溶解した精製scFvを希釈シリーズで添加した。最終タンパク質濃度は100μg/mL〜10pg/mLであった。透析および滅菌濾過したタンパク質溶液(0.22μmフィルター)10μLを、TF-1およびrhGM-CSFの溶液100μLに添加した。試料を37℃、5％CO₂で72時間インキュベートした。72時間後、WST-1を添加し、ELISAリーダーを用いて450nmでの比色変化をモニタリングすることによって、TF-1細胞の増殖状態を確かめた(図5)。図5から分かるように、ヒトGM-CSF中和活性がはっきりと証明された。ScFvAが最も強い中和活性を示した。

実施例2.4
選択されたscFvの結合特性の最適化
中和剤とリガンドの結合強度を高めることによって、特に、中和剤のオフレートを高めることによって、単量体(monomelic)リガンドに対する中和薬剤の生物学的活性が改善、さらには最適化され得ると考えた。

これは、好ましくは、(i)配列全体を通して1つもしくは複数の変異を無作為に挿入することによって、または(ii) 抗原と相互作用する可能性の高いscFv領域に、1つの変異もしくは複数の連続した変異(例えば、5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、または10アミノ酸の領域)を挿入することによって、それぞれのVH領域およびVL領域の配列を無作為に変異させることによって達成することができる。次いで、それぞれの変異体は、活性の上昇について特徴分析されるか、または特徴分析の前に、適切な選択方法(すなわち、ファージディスプレイ)を介して優先する品質(例えば、より強い結合)を強化される。

実施例2.4.1
VH CDR3を1つまたは複数の位置で変異させることによる親和性の増大
抗体フラグメント、例えば、scFv分子の結合特性を、1つの点変異または短いアミノ酸領域によって改善するために、それぞれの抗原と相互作用する可能性が非常に高いアミノ酸残基を標的としなければならない。このアプローチでは、成功する見込みが下がることがなければ、ほんの限られた数の変異体を上回る変異体をスクリーニングする必要はない。抗体またはそのフラグメントの重鎖CDR3は、通常、この抗体または抗体フラグメントによる抗原の結合全体に強く寄与する。従って、抗体または抗体フラグメントの結合親和性を高める有望なやり方は、VH CDR3をコードするヌクレオチド配列の変異であり得ると考えた。

このような標的化ランダム変異誘発を実施する多種多様な方法が存在する。この方法のいくつかを、前記scFv分子の結合親和性をどのように高めることができるかに関して以下で説明する。

A)VH CDR3を標的とするために、優先的には、元のアミノ酸配列を保持することにより改変CDR3ヌクレオチド配列を有するVH全領域を遺伝子合成することによって(Entelechon, Germany)、VH CDR3の中のヌクレオチド配列に、適切な制限部位を導入しなければならない。Matteucci and Heyneker, Nucleic Acids Research 11: 3113 ff (1983)に従って、それぞれの制限酵素により切断し、S1ヌクレアーゼ/クレノウDNAポリメラーゼIおよびdGTPを添加し、その後に、変異オリゴマー二重鎖を添加することによって、1つまたは複数のアミノ酸位置に標的化ランダム変異誘発を行ってもよい。その後に、変異誘発されたVHを、適切なscFv発現ベクター内で(適切なリンカーを介して)それぞれのVLと組み合わせ、形質転換によって大腸菌細胞に導入する。次いで、変種scFvを発現するシングルコロニーをつつき、scFvヒットおよびリードのスクリーニングおよび特徴分析について前実施例において説明したように、改善したscFvがあるかどうかスクリーニングすることができる。

B)代替法は、Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989)「A laboratory manual」に詳述されている二重プライマー法による、オリゴヌクレオチドを介した変異誘発である。本質的には、VH領域を、M13をベースとするベクターにクローニングし、一本鎖プラスミドを単離する。無作為化された配列を含有する一本鎖プラスミドテンプレートにハイブリダイズすることができるプライマーをアニールし、伸長させる。それぞれのプラスミドプールを大腸菌において増殖させた後、プラスミドプールから変異VHを収集し、適切なscFv発現ベクター内で(適切なリンカーを介して)元のVLと組み合わせ、形質転換によって大腸菌細胞に導入することができる。変種scFvを発現するシングルコロニーをつつき、scFvヒットおよびリードのスクリーニングおよび特徴分析について前実施例において説明したように、改善したscFvがあるかどうかスクリーニングする。

C)さらに別の代替法は、6個までまたはさらに多くの連続アミノ酸を変異させる方法である。このために、CDR3およびFR4に欠失があるVHヌクレオチド配列欠失変種が構築されてもよい。この構築物は、1段階または2段階PCR増幅用のテンプレートとして用いられる。ここで、(VH配列の5'末端にハイブリダイズし、適切なクローニング部位を付加する)適切な5'-プライマーが、テンプレートであるFR3領域の3'末端でアニールし、増幅フラグメントにCDR3およびFR4領域(と適切な制限部位)を付加する3'-プライマーセットと組み合わされる。この3'-プライマーセットは、CDR3配列の中にランダムコドンを挿入する1つまたは複数のトリプレットの配列を含有する。次いで、無作為化CDR3領域を含有する、このVH領域プールを、適切なscFv発現ベクター内で(適切なリンカーを介して)それぞれのVLと組み合わせ、形質転換によって大腸菌細胞に導入してもよい。次いで、変種scFvを発現するシングルコロニーをつつき、scFvヒットおよびリードのスクリーニングおよび特徴分析について前実施例において説明したように、改善したscFvがあるかどうかスクリーニングする。

(簡単にスクリーニングできるような)高い多様性を有する変異scFvのそれぞれのプールは、適切なファージディスプレイベクターにクローニングすることができる。次いで、改善したscFvは、高親和性を選択するために優先的に抗原濃度の低い条件下で、関心対象の抗原に対するファージディスプレイによって選択されてもよい。ファージディスプレイ選択は、本明細書の他の場所に記載のように標準的なプロトコールに従って行われる。既に改変されたscFvをさらに改善および最適化するために、前記方法A〜Cをどれでも組み合わせてよく、反復サイクルで行ってもよい。

実施例2.4.2
全配列を通じてV領域を無作為に変異させることによる親和性の増大
それぞれの抗原と相互作用する可能性が高い、scFvの特定の部位を変異させる代わりに、VH配列全体および/またはVL配列全体を通じて点変異を導入し、次いで、最適化されたscFvをスクリーニングするか、または最適化されたscFvを選択およびスクリーニングすることによって、より実際的なアプローチが行われてもよい。一例として、(Low et al. 260: 359 ff J Mol Biol (1996)に記載のように)大腸菌ミューテーター株を用いて、または Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989)「A laboratory manual」に詳述されるようにDNAポリメラーゼによるヌクレオチドの誤取り込みを用いて、VH配列および/またはVL配列が変異誘発されてもよい。最適化されたscFv分子変種のクローニング、発現、および選択は、ファージディスプレイによって、または頻繁に用いられるリボソームディスプレイ技術(EP 0 975 748 A1に記載)によって行うことができる。最適化バージョンは、改善したscFv候補をスクリーニングするために適切なベクター/大腸菌系において発現される。

実施例2.4において前述した適切な方法を適用して、代表的なscFvリード(scFv A)を最適化し、scFv分子B〜Nによって表されるモノクローナルヒト抗GM-CSF中和抗体フラグメントのクラスを得た。これらのscFv分子の特徴を以下の実施例においてさらに解明および説明する。選択されたscFv分子からのモノクローナルIgG分子の作成を以下の実施例において説明する。

実施例3
選択されたscFvからのモノクローナル抗体のクローニングおよび真核生物発現
細菌は機能的なFabフラグメントを発現することが知られているが、通常、完全な機能的免疫グロブリンを発現することができない。完全な機能的抗体を産生するために、哺乳動物細胞を使用しなければならない。従って、前実施例において選択されたscFv 5-306のVL領域およびscFv分子の様々なVH領域を哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした(特に、scFv AおよびscFv BのVH領域)。

実施例3.1
scFv 5-306に基づくヒト軽鎖のクローニング
適切な末端制限部位を作成するために、scFv 5-306のVL領域をコードするDNAフラグメントをPCRによって再増幅して、5'末端にBsu36I部位、3'末端にXhoI部位を有するVκフラグメントを得た。次いで、このフラグメントを、哺乳動物リーダー配列およびヒトCκ定常領域を付加する5'-プライマー

および3'-プライマー

を用いて、Bsu36IおよびXhoIによってプラスミドBSPOLLにサブクローニングし、配列決定によって確認した。EcoRIおよびSalIを用いて、5-306 VL-CκDNAをBSPOLLから切り出し、マウスジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をコードするcDNAをマウスアデノシンデアミナーゼ(ADA)をコードするcDNAで置換することによって発現ベクターpEF-DHFR(Mack et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 7021-5)から得られた真核生物発現ベクターpEF-ADAにサブクローニングした。

実施例3.2
ヒト重鎖可変ドメインのクローニング
前実施例において選択された様々なヒトVH領域(特に、scFv AおよびscFv BのVH領域)から、可変領域をPCRによって再増幅して、両端にBsu36I制限部位を作成した。全ての構築物について、2つのプライマー:5'-プライマーVH-Bsu36I

および3'-プライマー

の組み合わせをを使用した。次いで、結果として生じたDNAフラグメントを、これらの制限部位を用いて、真核生物リーダー配列およびヒトIgG1重鎖定常領域コードDNAフラグメントを既に含んでいる真核生物発現ベクターpEF-DHFRにサブクローニングした。従って、重鎖可変領域をリーダーと重鎖定常領域の間に挿入した。可変領域の正確な配列を配列決定によって確認した。

実施例3.3
scFvフラグメントから完全なヒトIgGへの変換
軽鎖(VL 5-306/Cκ)をコードするプラスミドおよび重鎖(VH/ヒトIgG1定常領域)をコードするプラスミドを、一過的タンパク質発現のための標準的なプロトコールに従ってHEK細胞に共トランスフェクトし、免疫グロブリンを培地に発現および産生させるように細胞を培養した。このやり方で、scFv Aに由来するIgG AおよびscFv Bに由来するIgG Bを作成した。それぞれの作成期間の後に、上清を収集し、免疫グロブリン精製の標準的なプロトコールに従ってプロテインAクロマトグラフィーによって、ヒト免疫グロブリンを単離した。次いで、精製した免疫グロブリンを、さらなる特徴分析実験に使用した。

実施例3.4
IgG特異性からscFvフラグメントへの再変換
IgG構築物(前記のIgG AおよびIgG B)からのVH領域を、標準的なプロトコールに従って適切なscFv発現ベクターに再クローニングし、可動性リンカーを介して、実施例3.1のヒト軽鎖に由来するVL領域に機能的に連結した。これらの構築物は、前記のように大腸菌のペリプラズムに可溶性をもって産生された。これらのscFv(IgG Aに由来するscFv OおよびIgG Bに由来するscFv P)の特徴分析を以下の実施例において説明する。

実施例4
霊長類GM-CSFおよびヒトGM-CSFに対するヒトモノクローナル抗GM-CSF抗体の結合特異性の評価
本実験の目的は、前記で得られた抗体がGM-CSFに特異的に結合することを示すことであった。従って、このような抗体と様々な組換えヒト(「rh」)コロニー刺激因子(rhG-CSFおよびrhM-CSF、Strathmann)の結合を、同じ抗体とrhGM-CSFの結合とELISAで比較した。

特定の抗原(PBS中に1μg/mL)50μLをELISAプレート(Nunc, Maxisorp)に室温で1時間コーティングした。PBS/0.05％Tween20で3回洗浄した後、ウェルを、1ウェルあたり200μLのPBS/3％乾燥脱脂粉乳で室温で1.5時間ブロックした後、PBS/0.05％Tween20で3回洗浄した。50μL/ウェルの一連のヒト抗体(例えば、IgG AおよびIgG B)はそれぞれ、SEQ ID NO: 34の配列の同一軽鎖を有するが、SEQ ID NO: 35〜48の異なる重鎖を有し、1μg/mL〜0.5ng/mLの希釈シリーズ(PBS/0.05％Tween20/3％乾燥脱脂粉乳に溶解)で添加し、1時間インキュベートした。PBS/0.05％Tween20で3回洗浄した後、結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgG抗体(Dianova;PBS/0.05％Tween20/3％乾燥脱脂粉乳で1:1000希釈)50μLを用いて検出した。シグナルは50μL/well ABTS溶液(Roche)を添加することによって発色させ、参照として450nmの波長を用いて405nmで吸収を測定した。

rhM-CSFおよびrhG-CSFに特異的な市販のウサギ抗体(Strathmann Biotech AG)を、それぞれ、これらの抗原の結合の陽性対照として使用した。この結合は、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体を用いて検出した。シグナルは50μL/ウェル pNpp溶液(Sigma)を用いて発色させ、参照として450nmの波長を用いて405nmで吸収を測定した。

2つの代表的なヒト抗体IgG AおよびIgG Bについて、結果を図6A、6B、および6Cに示す。

図6Aから分かるように、滴定された抗体の濃度を上げると吸収が増加した。このことから、rhGM-CSFと代表的な抗体IgG AおよびBは良好に結合することが分かる。図6Bは、rhM-CSFとの同じ2種類の代表的な抗体結合の結果を示す。この図から分かるように、ウサギ抗rhM-CSF抗体の濃度を上げると吸収が増加した。すなわち、この対照抗体(黒色の点)の結合は増加したが、前記の2種類の代表的な抗体(黒色の四画および黒色の三角)は、試験抗体濃度の上昇と共に増加しない連続的なベースライン吸光度として重なる。rhG-CSFとの結合結果を示す図6Cでは、対照抗体ならびに代表的な試験IgG AおよびBについて完全に類似する結果が見られる。

まとめると、図6A、6B、および6Cに示したデータから、2種類の代表的な試験抗体IgG AおよびBはrhGM-CSFに特異的に結合するが、M-CSFおよびG-CSFなどの他のコロニー刺激因子には特異的に結合しないことが分かる。このような抗原結合特異性は有望な抗体治療剤にとって重要である。

実施例5
ヒトモノクローナル抗GM-CSF抗体およびそのフラグメントの結合データの特徴分析
実施例2において前述したようにELISAによって陽性のrhGM-CSF結合剤として特定された様々なメンバーの定性的順位付けを作成することが望まれた。この順位付けは、このように特定された様々な代表的な抗体結合剤のキネティック(オフレート)パラメータおよび平衡(親和性)パラメータを反映することを目的とした。このために、表面プラズモン共鳴(SPR)を、BIAcore(商標) 2000装置、Biacore AB(Uppsala, Sweden)において、流速5μL/minおよびランニング緩衝液としてHBS-EP(0.01M HEPES、pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％界面活性剤P20)を用いて25℃で行った。酵母において産生させた組換えヒトGM-CSF(リューカイン, Berlex, 本明細書以下「抗原」または「rhGM-CSF」とも称する)を、CM5センサーチップのフローセル2〜4に固定化した。0.1Mナトリウム-ヒドロキシスクシンイミド,0.4M N-エチル-N'(3-ジメチルアミンプロピル)-カルボジイミド(NHS/EDC)80μLを注入することによって、チップ表面を活性化した。0.01M酢酸ナトリウム、pH4.7に溶解した10μg/mL rhGM-CSFを手作業で注入することによって、抗原を結合させた。手作業による注入回数の量を調節して、異なる密度の抗原をフローセル2〜4に固定化した。フローセル1は修飾しなかったのに対して、フローセル2は最大限の密度のrhGM-CSF(800 RU)でコーティングした。フローセル3は、フローセル2に固定化した抗原の量の50％でコーティングし、フローセル4は最低密度のrhGM-CSF(典型的に10％)でコーティングした。1Mエタノールアミン85μLを注入することによってセンサーチップの活性化表面をブロックし、チップを、5μL/min HBS-EPの一定の流速で一晩平衡化した。

実施例5.1
ヒトモノクローナル抗GM-CSF抗体のscFvフラグメントのキネティック結合パラメータ(オフレート)の定性的決定
前段落に示されるようにBiacore実験を行った。この実験の前に、ペリプラズム調製物(「PPP」)の溶出タンパク質溶液をPBSに対して25℃で2時間透析し、HBS-EPで1:1に希釈した。センサーチップ上に精製ペリプラズムタンパク質溶液10μLを25℃で注入することによって、主張したクラスのメンバーの結合キネティクスを測定した。rhGM-CSF固定化フローセル(FC2、FC3、FC4)における応答シグナルから、タンパク質と非修飾センサーチップ表面(FC1)との非特異的バックグラウンド吸着を差し引いた。相対応答シグナル(FC2-1、FC3-1、FC4-1)を求め、特異的解離速度を100秒間モニタリングした。

ELISA実験において陽性rhGM-CSF結合剤と以前に特定された一連の代表的なscFvフラグメントについて、これらの実験の結果を図7Aに示した。図7AにBiacoreデータを示した代表的なscFv抗体フラグメントは、以下のとおりである:scFv A、scFv B、scFv C、scFv D、scFv E、scFv F、scFv G、scFv H、scFv I、scFv J、scFv K、scFv L、scFv M、およびscFv Nである。

一般的に、Biacore結果の解釈において、結合ピーク(RUmax)の振幅は注入試料中のタンパク質濃度と直接相関する。キネティクオンレート(ka)は濃度依存性であり、PPPには様々な濃度のタンパク質があるために、主張したクラスのメンバーの定性的順位付けに使用できない。キネティックオフレート(kd)はタンパク質濃度非依存性であり、主張したクラスのそれぞれのメンバーの結合強度に特有のものである。主張したクラスの特定されたメンバーは全て、固定化されたrhGM-CSFに対して特異的結合を示す。最高の見かけのオフレートを有する主張したクラスのメンバーを特定し、SPRデータと阻害データをさらに相関付けした後に、BIAcoreでの平衡結合実験による親和性決定にかけた。

次いで、図7Aを調べると、代表的なscFv抗体フラグメントA〜Nのそれぞれの異なるピークが見られる。それぞれのピークの上部は、対象となるscFvフラグメントのオフレートを得るために外挿することができる特徴的な湾曲を示している。次いで、定性的には、代表的なscFvフラグメントはそれぞれヒトGM-CSFに良好に結合すると結論付けることができる。

実施例5.2
ある特定のヒト抗GM-CSF抗体およびそのscFvフラグメントの平衡結合パラメータ(親和性)の定量的決定
実施例5.1において、ELISAによってGM-CSF結合について陽性と以前に判定された多くの抗GM-CSF抗体のscFvフラグメントがヒトGM-CSFとの結合時に妥当なキネティックオフレートを示すことを定性的に実証したので、次に、組換えヒトGM-CSFに対する平衡結合特性に焦点を当てることによって、抗体およびそのフラグメントのこのような結合の定量的表示を得ることが望まれた。前記の実施例4において示したように、抗原- 本明細書ではrhGM-CSF -に対する特異的結合は、本明細書において主張した抗GM-CSF抗体およびそのフラグメントのクラスの特徴および特異的な属性の1つである。

精製タンパク質(すなわち、抗体またはそのフラグメント)10μLを10μg/mL〜1pg/mL精製タンパク質の希釈シリーズで注入し、25℃で100秒間の解離をモニタリングすることによって、ヒト抗GM-CSF抗体およびそのフラグメントのクラスのある特定の代表的なメンバーの結合キネティクス(オフレート、kdおよびオンレート、ka)を測定した。精製タンパク質をHBS-EPで緩衝化した。1:1 Langmuir結合式(以下の式1および2を参照されたい)によって解離および会合キネティクスの速度定数を求めるBIAevalution(商標)ソフトウェアを用いて、データをフィットさせた。式中、Aは、注入された精製タンパク質分析物の濃度であり、B[0]はRmaxである。
dB/dt = -(ka＊[A]＊[B]-kd＊[AB]) (式1)
dAB/dt = -(ka＊[A]＊[B]-kd＊[AB]) (式2)

分析した8種類までの濃度のそれぞれの代表的なヒト抗GM-CSF抗体またはそのフラグメントを用いて、キネティック結合曲線を求めた。生データの独立したフィッティングによって解離速度定数および会合解離速度定数が得られた。解離速度定数および会合解離速度定数を使用して、平衡解離定数(KD)を計算した。それぞれの代表的なヒト抗GM-CSF抗体またはそのフラグメントについて得られた結果を図7B〜Iに示す。具体的には、図7Bは、代表的なIgG Bについて得られた結合データを示し；図7Cは、代表的なIgG Aについて得られた結合データを示し；図7Dは、代表的なscFv Cについて得られた結合データを示し；図7Eは、代表的なscFv Iについて得られた結合データを示し；図7Fは、代表的なscFv Bについて得られた結合データを示し；図7Gは、代表的なscFv Aについて得られた結合データを示し；図7Hは、代表的なscFv Eについて得られた結合データを示し；図7Iは、代表的なscFv Dについて得られた結合データを示す。データを以下の表2にまとめた。

（表２）ある特定の代表的なヒト抗GM-CSF抗体およびそのフラグメントの親和性結合定量データ

実施例6
ヒト抗GM-CSF抗体のある特定の代表的なフラグメントの最小エピトープ必要条件
本明細書において記載および主張されたヒト抗GM-CSF抗体およびそのフラグメントが結合するエピトープを決定することが望まれた。このために、ペプチドスポッティング(「ペプスポット」)分析を、このクラスの分子の代表的なメンバーとしてscFv A、抗原としてヒトGM-CSFを用いて行った。

一般的に、ペプスポット実験は以下のように行った。hGM-CSFアミノ酸配列(ヒトおよびある特定の他の霊長類のGM-CSF配列については、本明細書前記ならびに図8AならびにSEQ ID NO:49〜51を参照されたい)に由来する重複13マーペプチドをC末端によってWhatman 50セルロース膜に共有結合させたのに対して、アセチル化N末端は遊離したままにした。(JPT Peptide Technologies GmbHによって)作成した個々の13マーペプチドを以下の表3に示す。任意の2つのそれぞれのペプチドの重複配列の長さが11アミノ酸になるように設定した。製造業者のプロトコールに従って、膜を無水EtOHで1分間すすぎ、その後、TBSで洗浄し、TBS/3％BSAで一晩ブロックした。後の全てのインキュベーションおよび洗浄と同様に、ブロッキングは室温で行った。TBS/0.05％Tween20で10分間3回洗浄した後、膜を、TBS/3％BSAに溶解した1μg/mL scFv Aと2.5時間インキュベートし、その後に、前のように洗浄を行った。scFvは、抗Penta-His抗体(Qiagen、TBS/3％BSAに溶解して0.2μg/mL)、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG(Fcγ特異的)抗体(Dianova、TBS/3％BSAに溶解して1:10.000)を用いて行った。これらのそれぞれの抗体とのインキュベーションを1時間行った。TBS/0.05％Tween20で10分間3回洗浄した後、シグナルを、強化化学ルミネセンス(SuperSignalWest Pico Luminol/Enhancer Solution and SuperSignalWest Pico StablePeroxide Solution; Pierce)によって発色させ、BioMaxフィルム(Kodak)に暴露した。

スポットAとBの間のペプチドスポット領域ならびにスポットCにおいて、scFv AとヒトGM-CSF領域との強い結合シグナルを検出した(以下の表3および図8Bを参照されたい)。図8Bから分かるように、他のスポットとの結合は低強度の結合であるように見えた。点Aと点Bにわたるスポット領域はアミノ酸残基15〜35に対応する。この領域を構成する13マーペプチドは全て、アミノ酸23〜27(RRLLN)の最小アミノ酸領域を含有している。スポットCは、ヒトGM-CSFのアミノ酸残基65〜72(GLRGSLTKLKGPL)に対応する。これらの知見は、scFv Aが不連続エピトープを認識する可能性が高いことを示している。

ヒトGM-CSFの二次構造において、アミノ酸15〜35はへリックスAに位置しているのに対して、スポットCに対応する残基は、へリックスCとへリックスDの間に位置するループ構造の一部である。分子の折り畳みの三次元モデルから、これらの部位が互いに立体的に近接していることが分かる。

スポットA〜Bのペプチドにおける最小アミノ酸配列モチーフはヒトGM-CSFの残基23〜27(RRLLN)に対応する。スポットAからBへのシグナル強度の増加は、スポットAに対応するペプチドよりスポットBに対応するペプチド中のRRLLNエピトープへの接近しやすさで説明することができる。ペプチドAのエピトープは、膜に結合しているC末端に直接位置しているのに対して、ペプチドBのエピトープは、より接近しやすいペプチドN末端に位置している。

（表３）セルロース膜に固定化された重複13マーペプチドの配列

実施例7
ある特定のヒト抗ヒトGM-CSF抗体/抗体フラグメントの中和能
実施例7.1
ある特定の代表的なヒト抗ヒトGM-CSF抗体およびそのフラグメントの中和能の定性評価
本実験の目的は、代表的なヒト抗GM-CSF中和抗体およびそのフラグメントの中和活性に関する定性情報を得ることである。このために、ヒトGM-CSF依存性細胞株TF-1(DSMZ, ACC334)を使用した。この細胞株の増殖速度はヒトGM-CSFの存在に依存し、そのため、GM-CSF中和活性を有すると思われる抗体の存在下または非存在下で細胞をヒトGM-CSFとインキュベーションした後の細胞増殖の測定を用いて、このような中和活性が実際に存在するかどうか確かめることができる。

TF-1細胞を、販売業者(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany)が説明したように、2.5ng/mL rhGM-CSFの存在下で、RPMI1640培地(Gibco; L-グルタミン、フェノールレッドフリー)、10％熱不活化FCSにおいて培養した。細胞を細胞密度0.5 x 10exp6細胞/mLまで増殖させた。増殖アッセイ法のために、TF-1細胞を、300 x g、4分間の遠心分離によって収集し、1x PBS(Dulbecco's, Gibco)で洗浄した。細胞を最終濃度1 x 10exp5細胞/mLでRPMI1640、10％FCSに再懸濁し、マイクロテスト平底細胞培養プレート1ウェルにつき90μLの細胞懸濁液を使用した(0.9 x 10exp4細胞/ウェル)。TF-1細胞の増殖を刺激するために、最終濃度0.3ng/mLのrhGM-CSFを使用した。GM-CSF依存性増殖を中和するために、ヒト抗GM-CSF抗体の代表的なフラグメントの精製PPPを1x PBSに対して25℃で2時間透析した。透析および滅菌濾過したタンパク質溶液(0.22μmフィルター)10μLを、TF-1およびrhGM-CSFを含有する溶液100μlに添加した。

37℃、5％CO₂で72時間インキュベートした後、TF-1細胞の増殖状態を、生細胞中のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるテトラゾリウム塩(WST-I, Roche)の切断に基づく比色アッセイ法で確かめた。代謝的に活性な細胞によって形成されたホルマザン色素を、ELISAリーダーで450nmでの吸光度を測定することによって定量した。

ヒト抗ヒトGM-CSF抗体フラグメントの代表的な試験フラグメントによるTF-1細胞のヒトGM-CSF依存性増殖の阻害は強度がさまざまにあった(図9)。このような2つのフラグメントには中和作用が無かったが(scFv FおよびscFv L)、5つの構築物(scFv J、scFv K、scFv M、scFv N、およびscFv H)は中間の阻害を示し、7つの構築物(scFv B、scFv I、scFv E、scFv D、scFv G、scFv C、scFv A)は、TF-1細胞のGM-CSF依存性増殖の強力な阻害を示した。特定の代表的なscFvの発現レベルが低かったために、または37℃で72時間のインキュベーション期間にわたって特定の代表的なscFvとrhGM-CSFで形成される安定した複合体が少なかったために、中和作用が無かったか、または中和作用の程度が低かったのかもしれない。

実施例7.2
細胞増殖によって測定された、ある特定の代表的なヒト抗ヒトGM-CSF抗体およびそのフラグメントの中和能の定量評価
次いで、強力なTF-1増殖阻害を示すことが前記で分かった、選択された代表的なscFv分子を、中和効力の定量分析に供した。このために、同じヒトGM-CSF依存性細胞株TF-1(DSMZ ACC334)を使用した。TF-1細胞を、前記の実施例7.1に詳述したように増殖アッセイ法のために培養および調製した。最終濃度0.3ng/mL rhGM-CSFを使用して、TF-1細胞の増殖を刺激した。GM-CSF依存性増殖を中和するために、代表的なヒト抗ヒトGM-CSF中和モノクローナル抗体またはそのフラグメントの精製試料10μlを、TF-1およびrhGM-CSFの希釈シリーズを含有する溶液100μlに添加した。最終タンパク質濃度は10μg/ml〜10pg/mlであった。

試料を、5％CO₂、37℃で72時間インキュベートした。72時間後、TF-1細胞の増殖状態を、前記の実施例7.1に記載のように確かめた。Prismソフトウェアの非線形回帰曲線フィットを用いて、最大半量増殖阻害(IC₅₀)についてデータをフィットさせた。

前記の実施例7.1に記載の定性増殖阻害実験において見られた明らかなGM-CSF中和作用を確認および定量することができた。この増殖阻害実験において、ヒト抗ヒトGM-CSFモノクローナル中和抗体の全ての試験scFVフラグメントがnM範囲の最大半量阻害定数(IC₅₀)を示した。図10Aに見られるように、中和効力の明らかな順位を実証することができた。

試験したヒト抗ヒトGM-CSFモノクローナル中和IgG抗体は、これらのscFv対応物より有意に高い中和効力を示す。本実験において作成したIgG分子の最大半量阻害定数はnM以下の範囲にあった。図10Bに見られるように、IgG Aについて評価したIC₅₀は0.9nMであり、IgG Bについて評価したIC₅₀は0.3nMであった。

IgG AおよびBから作成したscFv抗体フラグメント(それぞれ、scFv OおよびP)が中和能の点でscFv AおよびBと定量的に相関するかどうか調べるために、試験分子としてscFv OおよびPを使用した以外は前述したとおりに、類似のTF-1中和アッセイ法を行った。scFv PおよびOについての結果を、それぞれ、図10Cおよび10Dに示した。図10Dから分かるように、scFv OはscFv Aと同じ中和能を有する。このことから、生物学的活性を失うことなく、IgGからscFv形式へ再変換することが可能であることが分かる。

実施例7.3
IL-8産生の低下によって測定された、ある特定の代表的なヒト抗rhGM-CSF抗体およびそのフラグメントの中和能の定量評価
本実験は、代表的なヒト抗ヒトGM-CSF抗体およびそのフラグメントの中和活性を定量するために、U-937細胞によるGM-CSF依存性IL-8産生を測定することによって行った。前述の実験において使用したGM-CSF抗原はrhGM-CSFであった。単球U-937細胞を、10％熱不活化FCSを添加したRPMI1640培地Gibco(L-グルタミン、フェノールレッドフリー)中で、販売業者(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany)が説明したように培養した。細胞を細胞密度1 x 10exp6細胞/mLまで増殖させた。

IL-8産生の測定に基づく阻害アッセイ法の実施では、細胞を、300 x g、4分間の遠心分離によって収集し、最終濃度1 x 10exp6細胞/mLまでRPMI1640、10％FCSに再懸濁した。マイクロテスト平底細胞培養プレート1ウェルあたり1.8 x 10exp5細胞/well(180μL細胞懸濁液)を播種した。最終濃度1ng/mL rhGM-CSFを使用して、U-937細胞によるIL-8産生を刺激した。精製scFvまたはIgG 20μlを、U937細胞および最終タンパク質濃度10μg/mL〜10pg/mLのrhGM-CSF希釈シリーズの溶液180μlに添加した。

5％CO₂、37℃で18時間のインキュベーション後、培養プレートを600 x gで2分間遠心分離することによって、細胞を遠沈した。新しいプレートにピッペッティングすることによって培養上清を収集し、IL-8濃度を求めるために、OptEIA Human IL-8 ELISA Set(Becton Dickenson and Company)を用いて分析した。

製造業者の説明書に従って、ELISA検出を行った。簡単に述べると、0.1M炭酸ナトリウム、pH9.5で希釈した捕捉抗体50μLをマイクロテストプレートに4℃で一晩コーティングした。PBS/0.05％Tween20で3回洗浄した後、ウェルを200μL PBS/10％FCS/ウェルで室温で1時間ブロックし、その後に、PBS/0.05％Tween20で3回洗浄した。次いで、培養上清試料50μLをウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。IL-8濃度を後で定量するために、製造業者によって提供されたIL-8標準の段階希釈を手順に沿って行った。

PBS/0.05％Tween 20で5回洗浄した後、OptEIA Human IL-8 ELISA Setに備えられているWorking Detector(Detection Ab+Av-HRP)50μLを用いて検出を行った。室温で1時間インキュベーションした後、ウェルをさらに7回洗浄した。OPD基質溶液(Sigma)を添加することによってシグナルを発色させ、(620nmの参照波長を使用して)490nmの波長で検出した。

較正のためにIL-8検量線をプロットし、この較正曲線に従って培養上清試料中のIL-8濃度を計算した。Prismソフトウェアの非線形回帰曲線フィットを用いて、IL-8産生の最大半量阻害(IC₅₀)についてデータをフィットさせた。

図11においてscFv濃度が増加すると共にIL-8濃度が減少することからはっきりと分かるように、試験したヒト抗rhGM-CSFモノクローナル中和抗体の全ての代表的なフラグメントが、U-937細胞のGM-CSF依存性IL-8産生の明らかな阻害を示した。本実験において見られる中和効力の順位は、前記のTF-1増殖阻害実験において同じ分子を中和作用について試験して得られた順位と一致する。

本実験において求められたIC₅₀値は、前のTF-1増殖実験において同じ分子について得られたIC₅₀値と比較して高いことに気付くだろう。これは、U-937細胞によるIL-8産生の刺激に求められるGM-CSF濃度がTF-1の刺激に求められるGM-CSF濃度より高いためである。

実施例7.4
細胞増殖によって測定された、組換えマカク(macacan)GM-CSFに及ぼす代表的なヒト抗ヒトGM-CSF抗体およびそのフラグメントの中和能の定量評価
本実験の目的は、マカク科の非ヒト霊長類に由来するGM-CSF(「macGM-CSF」)に対する代表的なヒト抗ヒトGM-CSF抗体およびそのフラグメントの中和力を示すことであった。

macGM-CSFに及ぼす選択されたscFvおよびIgG分子の中和作用を示すために、実施例7.1および7.2に記載のプロトコールに従って、hGM-CSFの代わりにmacGM-CSFを用いて増殖阻害実験を行った。hGM-CSFおよびmacGM-CSFは両方とも、同じ最大半量効力(EC₅₀)でTF-1細胞の増殖を刺激する。scFv分子を試験した実験では最終濃度3ng/ml macGM-CSFを使用してTF-1細胞の増殖を刺激し、代表的なヒト抗ヒトGM-CSF抗体としてIgG Bを試験した実験では0.3ng/mL rhGM-CSFを使用してTF-1細胞の増殖を刺激した。TF-1細胞の増殖を中和するために、精製ヒト抗ヒトGM-CSF抗体またはそのフラグメント10μlを、TF-1およびmacGM-CSF希釈シリーズの溶液100μlに添加した。最終タンパク質濃度は10μg/ml〜10pg/mlであった。試料を、5％CO₂、37℃で72時間インキュベートした。72時間後、TF-1細胞の増殖状態を、実施例7.1および7.2に記載のように確かめた。Prismソフトウェアの非線形回帰曲線フィットを用いて、最大半量増殖阻害(IC₅₀)についてデータをフィットさせた。

図12Aに見られるように、ある特定の代表的なヒト抗ヒトGM-CSFモノクローナル抗体フラグメントも明らかなmacGM-CSF中和能を示した(scFv B、scFv E、scFv C、scFv I、scFv A)。さらに、図12Bから分かるように、代表的なヒト抗ヒトGM-CSFモノクローナル抗体IgG Bの濃度を上げると、TF-1増殖ははっきりと低下した。このことは、この抗体の中和能を証明している。興味深いことに、TF-1細胞増殖誘導のためにmacGM-CSFを使用した本実験におけるIgG BのIC50値(0.3nM)は、hGM-CSFを使用した実験におけるIC50値と同じであった。このことは、これらの種のGM-CSFに対するIgG Bの明らかな交差反応性を示している。

実施例8
IgG Bと様々な種に由来するGM-CSFとの交差反応性
後のインビボ研究に適した種を特定するために、IgG Bと様々な非ヒト種に由来するGM-CSFとの交差反応性を調べた。第1の実験セットでは、IgG Bと、市販のヒト由来組換えGM-CSF(リューカイン(登録商標)、Berlex)、ブタ由来組換えGM-CSF、イヌ由来組換えGM-CSF、ラット由来組換えGM-CSF(R&D Systems, Wiesbaden, Germany)、およびマウス由来組換えGM-CSF(Strathmann Biotech, Hamburg, Germany)との結合をELISA実験において試験した。具体的には、述べられた様々な種に由来する1μg/mL GM-CSFでELISAプレートをコーティングした。IgG Bを希釈シリーズで添加し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトIgG1抗体を用いて検出した。OPD o-フェニレンジアミン(「OPD」、ペルオキシダーゼと反応するとイエローオレンジになる)基質溶液(Roche, Germany)を添加することによって、ELISAを発色させ、490nmで測定した。

図13に見られるように、IgG Bは組換えヒトGM-CSFと強い結合を示したのに対して、試験した他の種に由来するGM-CSFは認識されなかった。従って、ブタ、イヌ、ラット、またはマウスはインビボ試験に適した種でないかもしれない。しかしながら、前記の実施例7.4に見られるように、IgG Bは、macGM-CSF(カニクイザル、マカカ・ファシキュラリス(macaca fascicularis)に由来)と著しい交差反応性を示す。このことは、マカク属ファミリーに由来する少なくとも1つのサル種がIgG Bのインビボ研究に適していることを意味している。

実施例9
異なってグリコシル化されたGM-CSF変種へのIgG Bによる結合
本実験の目的は、IgG BとGM-CSFの結合が後者のグリコシル化パターンに依存する程度を確かめることであった。このために、天然hGM-CSF(ヒトグリコシル化)、ならびに大腸菌由来組換えhGM-CSF(非グリコシル化)および酵母由来組換えhGM-CSF(酵母グリコシル化)、ならびに組換えマカク属GM-CSFを含有する条件培地の希釈シリーズを、TF-1増殖を誘導する効力について試験した。

IL-1β処理BEAS-2B細胞(ATCC CRL-9609から入手したヒト肺細胞)の培養上清からヒトグリコシル化GM-CSFを得た。BEAS-2B細胞は、BEGM Bullet Kit(Cambrex, Verviers, Belgium)で代用したBEBM培地中で増殖したが、GM-CSF産生の誘導には50ng/mL IL-1β(Strathmann Biotech, Hamburg, Germany)の存在下、RPMI1640, 10％FCS中で培養した。37℃、5％CO₂で48時間のインキュベーション後、OptEIA Human GM-CSF Elisa Set(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)を使用し、製造業者の説明書に従って、培養上清のGM-CSF含有量を分析した。

大腸菌由来組換えhGM-CSFを、WO 2005/105844の実施例1.1に示されるように内部で産生させた。酵母由来組換えhGM-CSFは商品名「リューカイン」(Berlex, USA)で商業的に入手した。マカク属GM-CSFはHEK293細胞において組換え産生した。

まず最初に、天然hGM-CSFならびに大腸菌由来組換えhGM-CSFおよび酵母由来組換えhGM-CSFならびにマカク属GM-CSFを含有する条件培地の希釈シリーズを、TF-1増殖を誘導する効力について試験した。ヒトGM-CSFおよびマカク属GM-CSFの3種類全てのグリコシル化変種がTF-1活性化について非常に似たEC50値を示した。これらは、それぞれ、大腸菌産生hGM-CSFについては10pg/mL、酵母産生hGM-CSFについては15pg/mL、ヒト肺細胞産生hGM-CSFについては36pg/mL、およびマカク属GM-CSFについては11pg/mLであった(図14A)。

次いで、IgG B中和活性を、0.3ng/mL組換えhGM-CSFまたは0.2ng/mL生理学的hGM-CSFの存在下で確かめた。72時間後、異なるIgG B濃度存在下でのTF-1細胞の増殖状態を比色反応によって定量した(図14B)。

まとめると、図14に示したデータは、IgG BがヒトGM-CSFのグリコシル化パターンとは明らかに無関係に、nM以下の濃度でTF-1細胞のGM-CSF依存性増殖を阻害したことを示している。従って、ヒトGM-CSFのグリコシル化パターンは、IgG BがGM-CSF活性を中和する能力に実質的に影響を及ぼさない。

実施例10
好酸球に対するGM-CSFの生物学的活性に及ぼすIgG Bの影響
実施例10.1
GM-CSFを介した好酸球生存に及ぼすIgG Bの影響
GM-CSFの様々な生物学的活性の1つは、好酸性顆粒球および好中性顆粒球の生存の延長である。肺炎症性疾患は、炎症維持において実質的な役割を果たしている好酸球の局所的な蓄積と関連するので、GM-CSFを介した好酸球生存の阻害におけるIgG Bの効力を試験した。

密度勾配遠心分離および赤血球溶解によって得られた顆粒球集団からCD16⁺好中球を枯渇させることによって、健常ドナーの末梢血から好酸球を単離した。新鮮に単離された末梢血好酸球を、RPMI1640/10％FCSおよびPen/Strepを含む96ウェル平底マイクロテストプレートに5x10⁴細胞/wellの密度で播種した。濃度依存性好酸球生存をモニタリングするために、GM-CSFを33ng/mL〜10pg/mLの希釈シリーズで添加した。GM-CSF依存性好酸球生存に及ぼすIgG Bの阻害能力を分析するために、抗体を10μg/mL〜0.1ng/mLの希釈シリーズで添加した。好酸球を生存させるために、最終濃度0.1ng/mLのGM-CSFを使用した。37℃、5％CO₂で72時間のインキュベーション後、WST-1試薬を添加した。450nmでの吸光度を測定することによって、生細胞の一部に対応する結果として生じた比色反応を定量した。prismソフトウェアパッケージの非線形回帰曲線フィットを用いて、最大半量生存阻害(IC50)についてデータを分析し、フィットさせた。図15Aに見られるように、0.02ng/mL rhGM-CSFの最大半量有効量(EC50)が確かめられた。図15Bに見られるように、抗体濃度0.13nMで好酸球生存を最大半量阻害するIgG Bの強力な中和作用が見られた。

これらのデータは、IgG BがGM-CSF依存性好酸球生存の用量依存的な阻害に有効であることを示している。

実施例10.2
GM-CSF誘導性好酸球活性化に及ぼすIgG Bの影響
好酸球のGM-CSF誘導性活性化に及ぼすIgG Bの影響を調べることも望まれた。ヒト血液から単離した末梢好酸球(CD16^-)において、CD69発現は、(a)0.1ng/mL GM-CSFまたは(b)0.1ng/mL GM-CSF、IL-3、およびIL-5で2、0時間または3日間刺激した後にアップレギュレートされるが、(c)0.1ng/mL IL-3およびIL-5単独で刺激した後ではアップレギュレートされないことが見出された(図16A)。培地のみの存在下で培養した好酸球はCD69のアップレギュレーションを示さなかった。従って、CD69は、GM-CSFによる好酸球活性化のマーカーとしてみなすことができ、GM-CSF依存性好酸球活性化の尺度としてCD69発現レベルをモニタリングした。両時点(20時間または3日)で、IgG B(10μg/mL)は、フローサイトメトリーにおけるCD69発現の欠如から分かるように好酸球のGM-CSF依存性活性化をほぼ完全に阻止した。

実施例10.1において前述したように好酸球を単離し、RPMI1640/10％FCSおよびPen/Strepを含む48ウェル平底マイクロテストプレートにおいて5x10⁵細胞/wellの密度で培養した。細胞を、培地のみで、あるいは0.1ng/mL GM-CSFのみ、または0.1ng/mL GM-CSFと0.1ng/mL IL-3もしくはIL-5の存在下でインキュベートした。GM-CSFの中和には10μg/mL IgG Bを使用した。1日間または3日間のインキュベーション後、細胞のCD69発現をフローサイトメトリーによって分析した。

フローサイトメトリーによるCD69検出:好酸球におけるCD69発現をFACS Calibur instrument(Becton Dickinson)によって確かめた。10⁵個の細胞を、FITC結合抗ヒトCD16(クローン3G8, BD Biosciences)およびPE結合抗ヒトCD69抗体(クローンFN50, BD Biosciences)5μLとそれぞれ4℃で1時間インキュベートした。陰性対照としてアイソタイプが一致する無関係のFITC結合抗体およびPE結合抗体を使用した。インキュベーション後、細胞をPBS、1％FCS、0.05％NaN₃で2回洗浄し、PBS、1％FCS、0.05％NaN₃250μLに再懸濁した。FACS分析の直前に、死細胞を標識するために、ヨウ化プロピジウムを最終濃度1μg/mLまで添加した。データ解釈はCellQuestProソフトウェア(BD Biosciences)を用いて行った。ヨウ化プロピジウム陽性(すなわち、死んだ)細胞はCD69発現分析から除外した。

IgG Bはまた、0.1ng/mL GM-CSF存在下でのCD16^-/CD69⁺細胞のヨウ化プロピジウム染色によってモニタリングされたように、生きている活性化好酸球のパーセントも下げた。IgG Bは、活性化細胞のパーセントを、培養して1日後に35％から8％へ下げ、培養して3日後に43％から3％へ下げた。0.1ng/mL GM-CSF、IL-3、およびIL-5の存在下では、生きている活性化好酸球のパーセントは、1日後に32％から8％へ、3日後に48％から11％へ低下した。CD69のアップレギュレーションはIgG Bによって完全に阻害されたが、0.1ng/mL GM-CSF、IL-3、およびIL-5の存在下で3日間生存した休止好酸球(CD16^-/CD69^-)の数は培地のみまたはGM-CSFのみとインキュベートした細胞と比較して多かった(図16A、最後のカラム)。同じことが、0.1ng/mL IL-3+IL-5の存在下でインキュベートした細胞について観察された。

用量決定実験において、0.1ng/mL GM-CSFの存在下で培養した好酸球に、IgG Bを希釈シリーズで添加した(図16B)。CD69依存性の中央値蛍光強度(MFI)に及ぼすIgG Bの阻害作用は0.22nM IgG Bの最大半量濃度で観察された。

まとめると、これらのデータは、IgG Bが、炎症性気道疾患、例えば、喘息に非常に関連する生物学的な状況において有効なGM-CSF活性中和剤であることを示している。

実施例11
IgG Bを用いたエクスビボ毒物学予備研究
前記で説明したように、GM-CSF活性の中和は多くの疾患状況において治療上有利であり得る。しかしながら、同時に、GM-CSFは、例えば、好中性顆粒球および単球による食作用のように外因性病原体と戦うという免疫系の正常機能において重要な役割を果たしている。好中球および単球のこの天然の機能は、治療量のIgG Bの存在下で無影響のままでなければならない。従って、本発明者らは、食作用プロセスの2つの局面:1)細菌の摂取(食作用);および2)酸化バースト活性(細胞内死滅を示す)を調べた。これらの研究を以下の実施例において詳述する。

実施例11.1
細菌の摂取(食作用)
ヘパリン処置全血中の顆粒球および単球の食作用活性を、Orpegen(Heidelberg, Germany)によるPhagotest Kitを用いて確かめた。この試験は、食細胞によるオプソニン化蛍光標識大腸菌の摂取に基づいている。次いで、これらの細胞は、フローサイトメトリーにおいて緑色蛍光によって検出することができる。フルオレセイン標識オプソニン化大腸菌20μlをヘパリン処置全血100μlに添加し、37℃でインキュベートした。陰性対照として0℃でインキュベーションを行った。10分後、試料を氷上で冷却し、Quenching solution(Orpegen) 100μlを添加することによって、食作用プロセスを止めた。この溶液は、表面結合細菌のFITC蛍光をクエンチすることによって細菌の付着と内部移行を識別することができるのに対して、内部移行した粒子の蛍光は影響を受けないままである。洗浄溶液(Orpegen)3mlで3回洗浄段階を行った後、赤血球を溶解した。残存している白血球を洗浄溶液(Orpegen) 3mlで1回洗浄した。凝集した細菌または細胞を排除するDNA染色溶液200μlを添加した後、細胞をフローサイトメトリーで分析した。FITC蛍光によって、食作用を行った細胞のパーセントを求めた。

食作用に及ぼすIgG Bの影響を確かめるために、IgG Bを、3つ同一の血液試料に最終濃度10μg/mlまで添加した。次いで、これらの3つの試料を、IgG Bと37℃で、大腸菌添加前に様々な時間インキュベートした。第1の試料には、すぐに大腸菌を添加したが、第2の試料および第3の試料には、それぞれ、24時間後および48時間後に大腸菌を添加した。

顆粒球について観察された結果:
血液を採取した直後、顆粒球の98％超がIgG Bの存在下または非存在下で細菌を摂取した(図17A)。血液試料とIgG Bを24時間インキュベートした後、IgG Bの非存在下では約92％までの減少、IgG B存在下では90％までの減少が確かめられた(図17B)。48時間後、IgG B非存在下では顆粒球の81％、IgG B存在下では89％が食作用陽性であった(図17C)。

単球について観察された結果:
IgG Bが存在するか存在しないかに関係なく、血液を採取した直後に、98％の単球が貪食していた(図18A)。IgG Bとプレインキュベートして24時間後、単球の90％が陽性であった(図18B)。IgG B非存在下でプレインキュベートして24時間後、単球の92％が陽性であった。48時間後、本発明者らは、IgG B非存在下では単球の81％、IgG B存在下では単球の89％が食作用陽性であることを見出した(図18C)。

実施例11.2
酸化バースト
ヘパリン処置全血中の顆粒球および単球の酸化バースト活性を、Orpegen (Heidelberg, Germany)によるPhagoburst Kitを用いて確かめた。このアッセイ法は、蛍光R123への基質ジヒドロローダミン(DHR)123の酸化による、反応性オキシダントを産生する食細胞のパーセントを求める。酸化バースト活性を示す細胞はフローサイトメトリーにおいて特定することができる。ヘパリン処置血液を、酸化バースト活性を誘導する様々な刺激:高刺激としてホルボール12-ミリステート13-アセテート(「PMA」)、中間の刺激として非標識オプソニン化大腸菌、および低刺激として走化性ペプチドN-ホルミル-MetLeuPhe(fMLP)とインキュベートした。全血100μlを37℃でこれらの刺激とインキュベートした。陰性対照として、刺激なしでインキュベーションを行った。インキュベーションの10分後、DHR123基質溶液を添加し、さらに10分間インキュベートした。DHR123は酸化性細胞によって蛍光R123に変換される。洗浄溶液(Orpegen) 3mlで3回洗浄した後、赤血球を溶解した。残存している白血球を洗浄溶液(Orpegen) 3mlで1回洗浄した。凝集した細菌または細胞を排除するDNA染色溶液200μlを添加した後、細胞をフローサイトメトリーで分析した。

酸化バーストに及ぼすIgG Bの影響を確かめるために、IgG Bを、3つ同一の血液試料に最終濃度10μg/mlまで添加した。次いで、これらの3つの試料をそれぞれ3つのアリコートに分け、アリコートを分けるために、大腸菌、fMLP、またはPMAの添加前に様々な時間、37℃でインキュベートした。第1の試料の3つのアリコートには、すぐに大腸菌、fMLP、またはPMAを添加したが、第2の試料および第3の試料の3つのアリコートには、それぞれ、24時間後および48時間後に大腸菌、fMLP、またはPMAを添加した。対照として前記と同じように、IgG Bを欠く並行血液試料を処理した。結果を以下の表4に示す。表4において、左から2番目のカラムの「+」は、IgG Bが試験した試料アリコート中に存在することを示し、左から2番目のカラムの「-」は、IgG Bを含まない対照を示す。

（表４）顆粒球の酸化バースト挙動に及ぼすIgG Bの影響

顆粒球の代わりに単球を用いて、同様の結果が得られた。この実験は前記と同様に行った。結果を以下の表5に示した。表5において、左から2番目のカラムの「+」は、IgG Bが試験した試料アリコート中に存在することを示し、左から2番目のカラムの「-」は、IgG Bを含まない対照を示す。

（表５）単球の酸化バースト挙動に及ぼすIgG Bの影響

従って、全体的に見ると、生理学的に関連する温度でIgG Bが存在することは、顆粒球または単球による細菌の食作用または酸化的死滅に悪影響を及ぼさなかったと結論付けることができる。次いで、インビボの状況では、これらの結果は、IgG Bの治療的投与が患者の正常な免役防御に悪影響を及ぼすと予想されないことを示唆している。

ファージディスプレイにおいて4回目または5回目のパニング後に得られた様々な抗rhGM-CSF scFv分子の、ELISAによって測定された吸収強度(結合強度と正比例する)。様々な抗rhGM-CSF scFv分子および他の試験分子の、フローサイトメトリーに基づくアッセイ法によって測定された平均蛍光強度(中和強度と反比例する)。抗rhGM-CSF scFv分子 5-306を用いて行われたTF-1増殖阻害アッセイ法の結果。ファージディスプレイにおいて4回目または5回目のパニング後に得られた様々なヒト抗rhGM-CSF scFv分子の、ELISAによって測定された吸収強度(結合強度と正比例する)。様々な代表的なヒト抗rhGM-CSF scFvヒットを用いて行われたTF-1増殖阻害アッセイ法の結果。ヒトGM-CSFおよび他のヒトコロニー刺激因子に対するヒトモノクローナル抗体の結合特異性。ヒトGM-CSFおよび他のヒトコロニー刺激因子に対するヒトモノクローナル抗体の結合特異性。ヒトGM-CSFおよび他のヒトコロニー刺激因子に対するヒトモノクローナル抗体の結合特異性。ヒトモノクローナル抗GM-CSF抗体およびそのフラグメントのキネティック結合を特徴付ける表面プラズモン共鳴測定。ヒトモノクローナル抗GM-CSF抗体およびそのフラグメントのキネティック結合を特徴付ける表面プラズモン共鳴測定。ヒトモノクローナル抗GM-CSF抗体およびそのフラグメントのキネティック結合を特徴付ける表面プラズモン共鳴測定。ヒトモノクローナル抗GM-CSF抗体およびそのフラグメントのキネティック結合を特徴付ける表面プラズモン共鳴測定。ヒトモノクローナル抗GM-CSF抗体およびそのフラグメントのキネティック結合を特徴付ける表面プラズモン共鳴測定。ヒトモノクローナル抗GM-CSF抗体およびそのフラグメントのキネティック結合を特徴付ける表面プラズモン共鳴測定。ヒトモノクローナル抗GM-CSF抗体およびそのフラグメントのキネティック結合を特徴付ける表面プラズモン共鳴測定。ヒトモノクローナル抗GM-CSF抗体およびそのフラグメントのキネティック結合を特徴付ける表面プラズモン共鳴測定。ヒトモノクローナル抗GM-CSF抗体およびそのフラグメントのキネティック結合を特徴付ける表面プラズモン共鳴測定。非ヒト霊長類GM-CSFおよびヒトGM-CSFの配列アラインメント。ヒトモノクローナル抗GM-CSFフラグメントとヒトGM-CSFの結合を示すペプチドスポットラジオグラム。様々な代表的なヒト抗rhGM-CSF scFv抗体フラグメントを用いて行われたTF-1増殖阻害アッセイ法の定性結果。様々な代表的なヒト抗rhGM-CSF scFv抗体フラグメントを用いて行われたTF-1増殖阻害アッセイ法の定性結果。様々な代表的なヒト抗rhGM-CSF IgGおよび対応するscFvフラグメントを用いて行われたTF-1増殖阻害アッセイ法の定量結果。様々な代表的なヒト抗rhGM-CSF IgGおよび対応するscFvフラグメントを用いて行われたTF-1増殖阻害アッセイ法の定量結果。様々な代表的なヒト抗rhGM-CSF IgGおよび対応するscFvフラグメントを用いて行われたTF-1増殖阻害アッセイ法の定量結果。様々な代表的なヒト抗rhGM-CSF IgGおよび対応するscFvフラグメントを用いて行われたTF-1増殖阻害アッセイ法の定量結果。様々な代表的なヒト抗rhGM-CSF scFv抗体フラグメントを用いて行われたIL8産生アッセイ法の定量結果。様々な代表的なヒト抗macGM-CSF IgGおよび対応するscFvフラグメントを用いて行われたTF-1増殖阻害アッセイ法の定量結果。様々な代表的なヒト抗macGM-CSF IgGおよび対応するscFvフラグメントを用いて行われたTF-1増殖阻害アッセイ法の定量結果。組換えヒトGM-CSFおよび様々な非霊長類種に由来するGM-CSFに対する抗GM-CSF抗体IgG Bの結合の選択性を示す比較結合研究の結果。 GM-CSFのグリコシル化への抗GM-CSF抗体IgG B中和能の依存性を調べたアッセイ法の結果。 GM-CSFを介した好酸球生存に及ぼす抗GM-CSF抗体IgG Bの影響の研究の結果。 GM-CSFを介した好酸球活性化に及ぼす抗GM-CSF抗体IgG Bの影響の研究の結果。顆粒球による食作用(A〜C)および酸化バースト(D〜F)に基づいて測定された、抗GM-CSF抗体IgG Bを用いたエクスビボ毒物学研究の結果。単球による食作用(A〜C)および酸化バースト(D〜F)に基づいて測定された、抗GM-CSF抗体IgG Bを用いたエクスビボ毒物学研究の結果。

Claims

霊長類GM-CSFに特異的に結合し中和するヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
霊長類がヒトまたは非ヒト霊長類である、請求項1記載のヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
非ヒト霊長類がカニクイザル、アカゲザル、またはテナガザルである、請求項2記載のヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
抗体がIgGである、前記請求項のいずれか一項記載のヒトモノクローナル抗体。
IgGがIgG1またはIgG4である、請求項4記載のヒトモノクローナル抗体。
scFv、単一ドメイン抗体、Fv、VHH抗体、ダイアボディ、タンデムダイアボディ、Fab、Fab'、またはF(ab)2である、請求項1〜3のいずれか一項記載のヒトモノクローナル抗体フラグメント。
アミノ酸23〜27(RRLLN)および/またはアミノ酸65〜77(GLR/QGSLTKLKGPL)を含む霊長類GM-CSFのエピトープ、好ましくは不連続エピトープに特異的に結合する、前記請求項のいずれか一項記載のヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
不連続エピトープがアミノ酸28〜31(LSRD)をさらに含む、請求項7記載のヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
不連続エピトープがアミノ酸32〜33(TA)および/またはアミノ酸21〜22(EA)をさらに含む、請求項7または8記載のヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
重鎖可変領域において、SEQ ID NO:1〜13または56のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む、前記請求項のいずれか一項記載のヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
重鎖可変領域CDR3配列のいずれかが、重鎖可変領域においてSEQ ID NO:14で示される重鎖可変領域CDR1配列およびSEQ ID NO:15で示される重鎖可変領域CDR2配列と共に存在する、請求項10記載のヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
軽鎖可変領域において、SEQ ID NO:16で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO:17で示されるアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO:18で示されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む、請求項10または11記載のヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
軽鎖可変領域において、SEQ ID NO:19、54、または55で示されるアミノ酸配列をさらに含む、請求項10または11記載のヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
重鎖可変領域において、SEQ ID NO:20〜33、52、または53のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項10〜13のいずれか一項記載のヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
軽鎖可変領域において、SEQ ID NO:16で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO:17で示されるアミノ酸配列を有するCDR2、およびSEQ ID NO:18で示されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、重鎖可変領域において、SEQ ID NO:14で示されるアミノ酸配列を含むCDR1領域、SEQ ID NO:15で示されるアミノ酸配列を有するCDR2領域、およびSEQ ID NO:1〜13または56のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む、前記請求項のいずれか一項記載のヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
SEQ ID NO:34で示される軽鎖アミノ酸配列およびSEQ ID NO:35〜48のいずれかで示される重鎖アミノ酸配列を含む、請求項10〜15のいずれか一項記載のヒトモノクローナル抗体。
SEQ ID NO:1〜48および/または52〜56のいずれかで示される各アミノ酸配列に対して少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項10〜16のいずれか一項記載のヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
SEQ ID NO:1〜48および/もしくは52〜56のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列と少なくとも70％の相同性を示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子であって、
相同性は、SEQ ID NO:1〜48および/もしくは52〜56のいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子と、対象となるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を配列アラインメントによって比較することによって決定されてもよく、
対象となる配列中のヌクレオチドは、SEQ ID NO:1〜48および/もしくは52〜56のいずれかの対応するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中の対応するヌクレオチドと同一であるか、または対象となる配列中の1つもしくは複数のヌクレオチドがSEQ ID NO:1〜48および/もしくは52〜56のいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中の対応する1つもしくは複数のヌクレオチドから逸脱することによって、翻訳時に、SEQ ID NO:1〜48および/もしくは52〜56のいずれかの対応するアミノ酸配列中の対応するアミノ酸と同一のアミノ酸(縮重トリプレットによる)、またはその保存的置換であるアミノ酸を生じるヌクレオチドトリプレットが生じれば相同であるとみなされる、ポリヌクレオチド分子。
請求項1〜17のいずれか一項記載のヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントまたは請求項18記載のポリヌクレオチド分子を含む、薬学的組成物。
炎症性疾患を治療するための、1つまたは複数のさらなる炎症剤を任意に含む医用薬剤の製造における、請求項1〜17のいずれか一項記載のヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントまたは請求項18記載のポリヌクレオチド分子の使用。
炎症性疾患が、慢性関節リウマチ(RA)(TNF-α中和剤による治療に耐性のRAを含む)、喘息、多発性硬化症(MS)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、特発性肺線維症(IPF)、炎症性腸疾患(IBD)、ブドウ膜炎、黄斑変性、大腸炎、乾癬、ウォラーの変性、抗リン脂質症候群 (APS)、急性冠状動脈症候群、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、再発性多発性軟骨炎(RP)、急性肝炎もしくは慢性肝炎、失敗した整形外科用移植片、糸球体腎炎、狼瘡、または自己免疫疾患からなる群より選択される、請求項20記載の使用。
腫瘍疾患、または細胞アポトーシスが遅延した、細胞生存もしくは細胞増殖が増大した別の状態を治療するための、1つまたは複数のさらなる抗癌剤を任意に含む医用薬剤の製造における、請求項1〜17のいずれか一項記載のヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントまたは請求項18記載のポリヌクレオチド分子の使用。
腫瘍疾患が癌である、請求項22記載の使用。
癌が、白血病、多発性骨髄腫、胃癌、または皮膚癌である、請求項23記載の使用。