KR102106914B1 - Gm-csf를 중화하는 화합물을 포함하는 액체 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 약 20 mg/ml의 농도로 GM-CSF를 중화하는 화합물, 장성 조절제 및 완충액을 포함하는 수성 조성물로서, 상기 조성물이 안정한 것인 조성물에 관한 것이다. 제제의 성분들은 바람직하게는 장기 저장 측면에서 GM-CSF를 중화하는 화합물에 대한 안정성을 제공한다. 바람직한 양상에서, 제제는 치료법에 사용되며, 바람직하게는 알레르기 및 건선 질환뿐만 아니라 관절염 및 천식 질환을 포함하는, 염증 및 자가 면역 질환의 치료에 바람직하게 사용된다. 또한 본 발명의 제제를 포함하는 키트가 제공된다.

Description

GM-CSF를 중화하는 화합물을 포함하는 액체 제제{Liquid formulation comprising GM-CSF neutralizing compound}
본 발명은 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자 (GM-CSF)를 중화하는 화합물을 함유하는 안정한 액체 제제에 관한 것이다. 본 제제의 성분은 바람직하게는 장기 보존 및 동결-용해 사이클에 걸쳐 안정성을 제공한다. 바람직한 양태에서, 본 제제는 치료에 사용되며, 바람직하게는 알레르기 및 건선 질환뿐만 아니라 관절염 및 천식 질환을 포함하는, 염증 및 자가 면역 질환의 치료에 바람직하게 사용된다. 또한 본 발명의 제제를 포함하는 키트가 제공된다.
단백질은 의약품, 수의학 제품, 화장품 및 기타 소비자 제품, 식품, 사료, 진단, 공업화학 및 제염의 분야에서 광범위한 용도에 사용되고 있다. 때때로, 이러한 사용은 단백질 자체에 내재하거나 이들이 사용되는 환경 또는 매체에 의해 부과되는 제약조건에 의해 제한되어 왔다. 이러한 제약조건은 단백질의 낮은 안정성, 성능의 변동 또는 높은 비용을 초래할 수 있다. 생명공학의 출현으로 인하여, 치료 적 적용을 위해 다양한 단백질을 생산할 수 있다. 이들의 생산 후, 단백질 의약품은 일반적으로 이들의 사용 전에 저장된다. 단백질은 일반적으로 "전통적인" 의약품보다 더 크고 더 복잡하다는 사실로 인하여, 저장에 적합한 단백질 의약품의 제형화 및 처리공정이 특히 도전적이다. 단백질 의약품 제제 및 처리공정 설계를 검토하기 위해 Carpenter et al. (1997), Pharm. Res. 14: 969-975; Wang (2000), Int. J. Pharmaceutics 203: 1 -60; and Tang and Pikal (2004), Pharm. Res. 21: 191-200을 참조한다.
여러 가지 요인들이 단백질 의약품 생산을 위한 제형화 및 처리공정을 설계하는데 고려될 수 있다. 주요 관심사는 조성물의 제조, 냉동, 동결 건조, 건조, 보관, 운송, 재구성, 냉동/해동 사이클, 및 최종 사용자에 의한 재구성후 저장을 포함할 수 있는 제조, 운송 및 취급 단계들의 모든 단계 또는 임의 단계를 통한 단백질의 안정성이다. 다른 잠재적인 고려 사항은 제조, 취급 및 분배의 용이성 및 경제성; 환자 투여용 최종 제품의 조성; 및 재구성시 동결건조 제제의 안정성을 포함하는 최종 사용자의 사용 편의성을 포함한다.
액체 제제는 특정의 목적을 만족시킬 수 있다. 액체 제제의 가능한 이점은 제조의 용이성 및 경제성 및 최종 사용자 편의성을 포함한다. 빈번히, 장기간 동안 저장되는 경우, 폴리펩티드는 용액 중에 불안정하다((Manning et al (1989), Pham. Res. 6: 903-918). 따라서 추가의 처리 단계는 건조, 예를 들면 동결건조를 포함하는 더 긴 수명을 허용하도록 개발되었다. 동결 건조 제제는 또한 특정의 이점을 제공할 수 있다. 동결건조의 잠재적인 이점은 개선된 단백질 안정성은 물론 운반 및 저장의 편의성과 경제성을 포함한다. 그러나, 동결건조된 약제학적 조성물은 최종 사용자에게 덜 편리 할 수 있다.
상기 조성물 (예를 들면, 동결건조, 액체, 냉동 등)의 기본적인 형태의 선택뿐만 아니라, 단백질 제제의 최적화는 통상적으로 단백질 안정성을 최대화하기 위해 제제의 성분들 및 이들 각각의 농도를 변화시키는 것을 포함한다. 다양한 인자들은 이온강도, pH, 온도, 냉동/해동사이클, 전단력, 냉동, 동결동결, 건조, 교반 및 재구성을 포함한 단백질 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 단백질의 불안정성은 물리적 분해 (예를 들면, 변성, 응집 또는 침전) 또는 화학적 분해 (예를 들어, 탈아미드화, 산화 또는 가수분해)에 의해 발생될 수 있다. 제제 성분들과 농도의 최적화는 오로지 불안정성의 원인을 극복하기 위한 실증연구 및/또는 합리적인 접근방식을 기반으로 한다.
때때로, 수성 및 동결건조 제제를 포함한 폴리 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물의 장기간 보존에서 활성 폴리펩티드는 응집 및/또는 분해로 인해 손실 될 수 있다.
따라서, 폴리펩티드의 안정성을 향상시키기 위한 전형적인 관행은 제제 내의 성분들의 농도를 변화시키거나 또는 제제를 개질하기 위해 부형제를 첨가하는 식으로 대응할 수 있다 (미국특허 제5,580,856호 및 제6,171,586호 및 미국특허출원 US 2003/0,202,972호, US2003/0,180,287호). US 5,580,856호는 천연 중합체, 계면활성제, 설페이트화 다당류, 단백질 및 재수화 동안 또는 후에 건조 단백질을 안정화시키기 위해 첨가될 수 있는 완충제와 같은 작용제를 개시히는 모범특허이다. 그러나, 많은 옵션과 별개로, 미국특허 제5,580,856호는 어떠한 단백질에 어떠한 안정화제가 추가되어야 하는지를 교시하지 않고 있다. 따라서, 당업자들은 많은 옵션들을 알면서도, US 5,580,856호에 기술된 많은 옵션 중에서 그들의 단백질에 가장 좋은 조건을 찾아내야 한다. 미국특허출원 2003/0202972호는 안정화제가 당, 트레할로스 또는 완충제인 항-HER2 항체의 안정한 동결건조된 제제를 기술하고 있다. 그런제도, 이들 안정화제가 항체에 유용할 수 있지만, 이들이 다른 단백질로 추정될 수 없다. 미국특허출원 2003/0,180,287호는 면역글로불린 유사 단백질, 즉 Fc 영역을 함유하는 단백질의 안정한 용액을 기술하고 있다는 점에서 미국특허출원 2003/0,202,972호와 유사하다. 안정화제는 인산나트륨, 인산칼륨, 구연산 나트륨 또는 칼륨, 말레산, 아세트산 암모늄, 트리스 완충액, 아세테이트, 디에타올아민, 히스티딘, 리신 또는 시스테인 일 수 있다. 당업자에 의해 선택될 수 있는 이들 화학적으로 별개의 안정화제 중에서, 라이신이 적합한 것으로 밝혀졌다. 그러나, US 2003/0,202,972호와 같이, 특정의 안정제는 특정의 단백질, 여기서 Fc 영역 함유 단백질에 적절할 뿐이고, 그 자체로 다른 단백질로 추정할 수 없다. 따라서 첨가제의 사용은 특이적 단백질을 다른 비-관련 단백질로 추정할 수 없다. 실제로 첨가제의 사용은, 저장을 개선하면서, 아직도 비활성 폴리펩타이드가 발생할 수 있다. 그 외에, 동결건조의 경우에, 재수화 단계는, 예를 들면 응집 또는 변성에 의해 폴리펩티드의 비활성화를 초래하는 조건을 도입할 수 있다 (Hora et al. (1992), Pharm. Res., 9: 33-36; Liu et al. (1991), Biotechnol. Bioeng., 37: 177-184). 실제로, 폴리펩타이드의 응집은 면역원성을 초래할 수 있기 때문에 바람직하지 않다 (Cleland et al. (1993), Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 10: 307-377; and Robbins et al. (1987), Diabetes, 36: 838-845).
의약품의 개발 및 제조 중에 생물학적 활성의 유지는 거대분자의 고유 안정성뿐만 아니라 사용된 안정화 기술에 의존한다. 광범위한 단백질 안정화 기술이 존재하며, 단백질의 수용액 또는 현탁액에 화학 "안정화제"의 첨가를 포함한다. 예를 들어, 미국특허 제4,297,344호는 선택된 아미노산을 첨가하여 열에 대하여 응고인자 II 및 VIII, 안티트롬빈 III 및 플라스미노겐의 안정화를 기술하고 있다. 미국 특허 제4,783,441호는 표면활성물질을 첨가하여 단백질을 안정화시키는 방법을 기술하고 있다. 미국특허 제4,812,557호는 인간 혈청 알부민을 사용하여 인터루킨-2를 안정화시키는 방법을 기술하고 있다. 제제를 동결 방지제와 혼합하고 매우 낮은 온도에서 저장하는 냉동/해동 방법은 단백질을 안정화시키는 또 다른 옵션이다. 그러나, 모든 단백질은 동결/해동 사이클에 살아남지 않을 것이다. 동결 방지제, 전형적으로 글리세롤에 의한 냉장 저장은 추가의 옵션이다. 미국특허 제5,098,893호에 기술된 바와 같이 유리 형태로 또한 저장할 수 있다. 이 경우에, 단백질은 비정질 또는 유리질 상태인 수용성 또는 수팽윤성 물질에 용해된다. 단백질의 안정화를 위해 가장 널리 사용되는 방법은 프리즈-드라이 또는 동결건조이다. 충분한 단백질 안정성은 수용액에서 달성될 수 없을 때마다, 동결건조는 가장 실용적인 대안을 제공한다. 동결건조의 한 가지 단점은 복잡한 처리를 필요로 하고, 시간 소모적이고 비싸다는 것이다. 그외에, 동결건조가 조심스럽게 수행되어 있지 않은 경우, 대부분의 제제는 상기 기술의 냉동 및 탈수 단계에 의해 적어도 부분적으로 변성된다. 그 결과는 빈번히 단백질 분자의 일부의 비가역적 응집되어, 비경구 투여에 허용되는 않는 제제를 만들게 된다.
일반적으로 말하면, 단백질의 분해는 문헌들에 잘 기술되어 있지만, 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자 (추가로 CM-CSF로 언급함)를 중화하는 화합물, 특히 폴리펩티드 및 항-GM-CSF 항체의 저장 및 용해성은 기술되지 않았다.
그 외에, 단백질 안정화제뿐만 아니라 안정적으로 유지하면서 단백질의 고농도를 허용하는 작용제에 대한 다수개의 옵션들이 본 발명까지 가능했던 것으로 알려져 있지만, GM-CSF를 중화하는 화합물을 고농도로 포함하는 제제는 불안정할 수 있으므로 개선이 필요하다는 것이 당업계에 인식되지 않았다.
항체, 예를 들면 모노클로날 항체와 같은 단백질을 포함하는 약제학적 조성물의 제조에 있어서, 환자에게 높은 편리성을 초래할 수 있는 피하투여의 가능성 때문에 고농도 액체 제제를 개발하려고 추구하고 있다. 그러나 항체, 특히 모노클로날 항체의 고농도 제제의 개발은 면역원성 반응성을 증강할 뿐만 아니라 생체활성을 일으키는 가용성 및 불용ㅅ헝 응집체의 형성증가와 같은 모노클로날 항체의 물리적 및 화학적 안정성에 대한 심각한 도전을 제기한다는 일반적 합의가 있다.
액체 약제학적 조성물의 저장 중에 폴리펩티드의 응집체 형성은 폴리펩티드의 생물학적 활성에 악영향을 미칠 수 있으며, 따라서 약제학적 조성물의 치료 효능이 발생한다. 더욱이, 응집체 형성은 폴리펩타이드 함유 약제학적 조성물이 주입 시스템을 사용하여 투여되는 경우 튜브, 막, 또는 펌프의 막힘 등의 다른 문제가 발생할 수 있다. 또한, 항체의 고농도 제제는 점도증가를 초래하여 제조가능성 및 주사가능성에 심각한 도전을 제기하는 것으로 보고되었다. 높은 점성 제제는 제조하거나, 주사기에 끌어들이거나 또는 주입하기가 어렵다. 점성 제제를 조작하는데 힘의 사용은 과도한 거품을 유도하고 이는 활성 모노클로날 항체의 변성 및 불활성화를 유도할 수 있다.
따라서 즉시 사용가능한 장치에서와 같이 피하 투영 적합한 낮은 및 실행가능한 점도를 가지며 또한 GM-CSF, 예를 들면 항체를 중화하는 화합물을 포함하는 안정한 고농도 단백질 약제학적 제제에 대한 높은 필요성이 존재한다. 더욱이, 환자 관점에서 보면, 실온 안정한 제품을 갖는 것이 크게 바람직할 것이다. 바로 이때, 실온에서 저장에 의약품의 저장수명 전반에 걸쳐 가능성이 있는 두드러진 항체 형성은 특별히 없다. 전형적으로, 단백질 응집 증가는 받아들이기 어려울 정도로 높은 수준의 응집체 및 단백질 관련 불순물이 발생하며, 이것은 면역원성 반응을 일으킬 수 있다. 시판되는 모노클로날 항체 제품의 대부분은 이들의 제제 내에 계면활성제를 함유한다. 전형적으로, 계면활성제는 단백질 및 입자 형성을 유발하여 허용불가능한 제품 품질을 초래할 수 있는 계면 응력을 감소시키기 위해 첨가된다. 계면응력의 예는 냉동/해동 중에, i) 공기, ii) 고무 플런저, 피스톤, 유리, 미리 충전된 주사기와 같은 용기 봉합 재료, iii) 강철 탱크, 튜브 및 펌프 등의 생산관련 재료, iv) 얼음과 단백질의 접촉일 수 있다. 그러나, 폴리소르베이트와 같은 계면활성제는 일반적으로 과산화물의 잔기를 함유하며, 이것은 단백질 분자를 산화하여 제품의 품질 저하를 초래할 수 있다. 더욱이, 제조 관점에서 보면, 폴리소르베이트의 첨가는 제제가 상기 폴리소르베이트를 함유할 때 초/투석여과를 수행하는 것을 도전하기 때문에 제조에 있어 추가의 단계를 필요로 한다. 산화된 생성물의 형성을 방지하는 것은 어려운 문제이며, 따라서 폴리소르베이트의 조심스런 취급은 산환된 생성물의 형성을 조절하기 위해 필요하다. 따라서 안성성 및 제조 관점 모두에서 계면활성제 없이 제제를 설계하는 것이 바람직할 것이다.
초기에 조혈성장인자로 확인된, 과립구-마크로파지 클로니 자극인자(GM-CSF)은 염증 및 자가면역에서 중요한 사이토카인이라는 것이 더욱 최근에 밝혀졌다. GM-CSF mRNA 또는 단백질의 수준 상승은 알레르기 및 건선 환자, 관절염 및 천식 환자를 포함하는 다양한 염증 부위에서 측정된다. 다수의 생체내 연구는 중화 항체에 의한 GM-CSF의 차단이 관절염, 실험적 자가 면역성 뇌염, 건선, 및 폐 질환의 모델을 포함하는 다양한 염증 모델의 염증유발성 질환을 예방하거나 또는 치료까지도 할 수 있다는 것이 지난 몇 년에 걸쳐 밝혀졌다. 따라서, 특히 안정하고, 다량의 GM-CSF 중화성 화합물을 함유하고 및/또는 피하경로를 통해 투여될 수 있는 GM-CSF 중화성 화합물과의 제제를 이용하는 것이 매우 바람직하다.
따라서 본 발명의 기술적 과제는 상기 기술된 필요에 부합하는 것이다.
본 발명은 이들 필요를 다루고 있으며, 따라서 기술적 과제에 대한 해결책으로서 제제에 관한 실시형태는 물론 GM-CSF를 중화하는 화합물의 투여로부터 유리할 수 있는 질환을 가진 대상체의 치료에서 이들 제제를 적용시키는 방법 및 용도를 제공한다. 이들 실시형태는 본 명세서에서 특징으로 하고 기술되며, 실시예에서 예시되고 또한 청구범위에서 반영된다.
본 발명은 도면 및 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이들은 단지 예시적인 것이며 본 발명의 범주를 제한하는 것으로서 고려되지 않는다.
도면은 하기를 나타낸다:
도 1: 항-GM-CSF 항체의 모노머 수준에 대한 저장 시간, 저장 온도, 및 단백질 농도의 효과
도 2: 변수로서 삼투압 [mOsmol/kg]으로 표준화된 효과의 파레토(pareto) 차트.
본 명세서에서 사용되는 단수 형태 "하나"(a, an) 및 "상기" (the)는 문맥상 달리 명확하게 명시되지 않는 한 복수 인용대상을 포함한다는 것을 주지해야 한다. 따라서, 예를 들면 "하나의 항체"에 대한 언급은 이러한 상이한 항체들의 하나 또는 그 이상을 포함하며 또한 "상기 방법"에 대한 언급은 본 명세서에서 기술된 방 법에 대해 개량 또는 치환될 수 있는 당업계에서 통상의 기술자에게 알려진 균등한 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.
달리 명시하지 않는 한, 일련의 요소들 앞의 용어 "적어도"는 시리즈에서 모든 요소를 언급하는 것으로 이해하여야 한다. 당업자들은 통상의 실험만을 사용하여 본 명세서에 기술된 발명의 구체적 실시형태에 대한 많은 균등물을 인식할 것이고 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 및 이후의 특허청구범위 전반을 통하여, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단어 "~들을 포함한다" 및 그의 변형어 "~을 포함하다" 및 "포함하는"은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 제외하지 않는다는 것을 내포하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는"는 용어 "함유하는"으로 치환될 수 있거나 또는 때때로 본 명세서에서 사용되는 용어 "갖는"으로 치환될 수 있거나 "~으로 이루어진"으로 치환될 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 "~으로 이루어진"은 청구범위 요소에서 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본 명세서에서 사용되는 "~으로 필수적으로 이루어진"은 특허청구범위의 기본적 및 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다. 각각의 경우에, 용어 "필수적으로~으로 이루어진" 및 "~으로 이루어진"은 서로 대체될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 복수개의 인용 요소들 사이의 접속어 "및/또는"는 개개 옵션 및 조합 옵션 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들면, 두 개의 요소가 "및/또는"으로 결합되는 경우, 첫 번째 옵션은 두번째 없이 제1 요소의 적용가능성을 지칭한다. 두 번째 옵션은 첫 번째 없이 제2 요소의 적용 가능성을 지칭한다. 세 번째 옵션은 상기 제1요소 및 제2 요소 모두의 적용가능성을 지칭한다. 이들 옵션중의 임의의 하나는 상기 의미내에 포함되며, 따라서 본 명세서에서 사용되는 용어 "및/또는"의 요건을 만족시키는 것으로 이해된다. 상기 옵션들 중의 하나 이상의 동시 적용가능성은 또한 상기 의미 내에 포함되며, 따라서 본 명세서에서 사용되는 용어 "및/또는"의 요건을 만족시키는 것으로 이해된다.
몇몇 문헌들이 본 명세서의 본문 전반에 걸쳐 인용된다. 본 명세서에서 인용된 문헌 (모든 특허, 특허출원, 과학 출판물, 제조업자의 설명서, 안내서 등을 포함)의 각각은 위든 아래든 간에 그 기재내용 전체가 여기에서 참고로 인용된다. 참고로 포함된 자료들이 상반되거나 또는 본 명세서와 불일치하는 정도 내에서, 본 명세서는 임의의 이러한 자료를 대체할 것이다. 본 발명이 선행 발명 의해 이러한 기술내용을 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되는 것은 아니다.
GM-CSF를 중화하는 고농도의 화합물을 갖는 제제를 제공하는 것을 목표로, 본 발명자는 GM-CSF를 중화하는 화합물이 고농도에서 불안정할 수 있고 또한 장기간 저장시 불안정할 수 있다는 것을 인식하였다.
실제로, 단백질처럼, GM-CSF를 중화하는 화합물이 불안정할 수 있는 많은 방법들이 있다. 예를 들어, 단백질의 불안정성은 단백질 응집 또는 분해에 의해 원인이 될 수 있지만, 탈아미노화, 탈아미드화, 산화, 이황화 결합 파괴 및 형성, 가수분해, 숙신이미드화, 비-이황화 가교결합, 탈글리코실화 또는 "효소적 갈변" (밀라드 반응) 또는 이들 현상들의 임의 조합으로 인한 화학적 불안정성에 의해 원인이 될 수 있다. 예를 들면, Wang et al. (1999), Int. J. Pharm. 185: 129-188를 참조한다. 또한, 물리화학적 인자들, 예컨대 온도, pH 값, 표면 흡착, 염, 금속 이온, 킬레이트제, 물리력, 예컨대 전단력, 단백질 변성제, 비수성 용매, 단백질 농도, 단백질의 공급원 및 순도, 단백질 모르피즘(protein morphism) 또는 압력이 단백질 안정성에 영향을 미칠 수 있다.
그러나 많은 요인들이 단백질의 안정성에 영향을 미칠 수 있지만, 단백질을 안정화시키기 위해 많은 조치들을 취할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 내부적으로(아미노산을 변화시킴으로써) 또는 외부적으로 안정화시킬 수 있다. 외부 안정화는 킬레이트제, 금속이온, 환원제, 중합체, 폴리에틸렌 글리콜/폴리올, 혈청 알부민, 계면활성제, 당 및 폴리올, 지방산 및 인지질, 아미노산, 완충액 등의 첨가에 의해 달성될 수 있다; 예를 들면, Wang, Y and Hanson M (1988), J. Parental Sci. & Technology, 42, Supplement: 4-26; Wang et al. (1999), Int. J. Pharm. 185: 129-188을 참조한다. 요약하면, 제제에서 항체와 같은 GM-CSF 중화성 화합물을 안정화하기 위해, 당업자들은 많은 옵션들을 이용할 수 있을 것이다.
이러한 경우에, 본 발명자는 GM-CSF를 중화하는 화합물이 응집을 타나낼 수 있고 및/또는 더 높은 농도에서 용해될 수 없다는 것을 관찰했다. 많은 다른 요인들은 제제에서 단백질을 응집하는 원인일 될 수 있다. 전형적인 정제 및 저장 절차는 단백질을 응집하는 원인이 되는 조건 및 성분들에 단백질 제제를 노출할 수 있다. 예를 들어, 제제 중의 단백질은 다음 중의 하나 이상의 결과로서 응집할 수 있다: 저장, 승온에 노출, 제제의 pH, 제제의 이온강도, 및 특정 계면활성제 (예를 들면, 폴리소르베이트-20 및 폴리소르베이트-80) 및 유화제의 존재. 마찬가지로, 단백질은 전단력에 노출되었을 때 응집할 수 있으며, 예를 들면, 용액중에 동결건조된 단백질 케이크를 재구성하고, 단백질 샘플을 여과 정제하고, 냉동-해동하고, 진탕하거나, 또는 단백질 용액을 주사기를 통해 옮긴다. 또한 응집은 저장 바이얼 내에 액체-공기 계면에서 및 용액중 폴리펩타이드 분자의 상호작용의 결과로 발생할 수 있다. 구조적 변화는 운송중에 교반으로부터 생기는 계면의 확장 또는 압축 중에 기체-액체 및 고체-액체 계면에 흡착된 폴리펩티드에서 발생할 수 있다. 이러한 교반은 제제의 단백질을 응집하는 원인이 되어 궁극적으로 다른 흡착된 단백질과 침전할 수 있다.
그 외에, 단백질 제제를 광에 노출하면 단백질 응집이 발생할 수 있다. 따라서 본 발명은 GM-CSF를 중화하는 고농도의 화합물을 가능하게 하고 이들 화합물의 응집을 감소시키는 제제를 제공한다. 이론에 구애되지 않지만, 응집의 감소는 상기 언급한 응집 메카니즘 중의 하나 이상을 제어함으로써 달성될 것으로 여겨진다. 이것은, 예를 들면 개선된 제품 안정성, 및 제조 공정 및 저장조건에서 더 큰 유연성을 초래할 수 있다.
본 발명자들은, 예를 들면 높은 주입 용적으로 인한 통증 같은 부작용을 감소시키는데 적합하거나 또는 낮은 용적에서 피하 투여를 허용하는 더 낮은 주입을 가능하게 하기 위하여 GM-CSF를 중화하는 화합물의 높은 농도를 갖는 제형을 제공하는 것을 추구하였다.
그래서, 본 발명자들은 연구 도중에 GM-CSF를 중화하는 화합물의 특정한 불안정성을 관찰하고, 이러한 원치 않는 관찰을 개선하려고 하였다. 따라서 본 발명자들은 용액중에 즉 용해 단계에서 유지시키면서 GM-CSF를 중화하는 화합물을 농축하려고 하였다. 그렇게 함으로써, 본 발명자들은 이용가능한 다수개의 옵션들 및 대안들을 가지고 있었지만, 이들 중의 어느 것이 목적한 문제점을 해결하기에 적합할 것이라는 것을 나타내는 것은 아니다.
"용해 단계"(dissolved stage)는 GM-CSF를 중화하는 화합물이, 바람직하게는 적어도 약 20 ㎎/㎖의 농도로, 용액중에 있으며, 즉 제제의 수용액 중에 (즉 수성상 중에) 직접 용해 및/또는 분해된다는 것을 의미한다. 바람직하게는, GM-CSF를 중화하는 화합물은 균일하게 용해 및/또는 분산된다. 균일하게란 수성 제제중에 용해 및/또는 분산된 GM-CSF를 중화하는 화합물이 수성 제제 중에 거의 균일하게, 바람직하게는 균일하게 분산되어 GM-CSF를 중화하는 화합물의 농도 ("c") (몰 질량의 경우에 "n" 또는 질량의 경우에 "m")은 수용액의 용적 ("v")에서 (또는 전체를 통해) 거의 동일하며, 바람직하게는 동일하며, 즉 c=n/v 또는 c=m/v은 각각 거의 일정하며, 바람직하게는 일정하다. 바람직하게는 제제 내에 농도 구배가 없다.
따라서, GM-CSF를 중화하는 화합물을 포함하는 본 발명의 안정한 제제는 바람직하게는 수용액으로 간주될 수 있으며, 여기서 GM-CSF를 중화하는 화합물은 그 내부에서 직접 용해 및/또는 분산된다.
"용액"은 두 개 이상의 물질들/성분들의 균일한 혼합물이다. 이러한 혼합물에서, 용질 (본 발명에서 GM-CSF를 중화하는 화합물)은 용매로서 또한 알려진 다른 물질에서(본 발명에서 바람직하게는 수성 제제에서) (상술한 바와 같이) 용해된다.
상기에서, GM-CSF를 중화하는 화합물은 바람직하게는 수용액 중에 불균일하게 용해 및/또는 분해되지 않는다. 용어 "용해 상태"는 또한 GM-CSF를 중화하는 화합물이 본질적으로 유화되지 않거나 또는 더욱 바람직하게는 수용액 중에 전혀 유화되지 않는다는 것을 포함한다.
또한 용어 "용해상태"(dissolved state)는 GM-CSF를 중화하는 화합물이 바람직하게는 필수적으로 캡슐화 및/또는 포착되어 있지 않다 (바람직하게는 GM-CSF를 중화하는 화합물의 2%, 1%, 또는 0.5% 미만이 캡슐화 및/또는 포착될 수 있거나 또는 더욱 바람직하게는, 예를 들면 리포좀, 다중막 리포좀 등에 전혀 캡슐화 및/또는 포착되지 않을 수 있음)는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명의 하나의 바람직한 실시형태는 안정하고, 장기간 저장시 접합체/응집체 또는 단편/분해산물의 형성을 수행하지 않으며 또한 제제가 피하 투여에 적합한 GM-CSF를 중화하는 화합물을 함유하는 액체 제형이다.
구체적으로, 많은 상이한 안정화제를 시험한 후에, 본 발명자들은 저장될 수 있는 용액에 장성조절제(tonicity modifier)가 첨가된 경우에 GM-CSF를 중화하는 화합물이 안정화될 수 있다는 것을 발견하였다. 장성조절제의 예는, 이들로 제한되지 않지만, 당 및 당 알코올을 포함한다. 단순 당은 단당류라 불리우며 또한 포도당, 과당, 갈락토스, 자일로스, 리보스, 만노스, 락툴로스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 아이도스, 탈로스, 아라비노스 및 릭소오스를 포함한다. 본 발명에서는, 예를 들면 수크로오스, 말토오스, 락토오스, 이소말토오스, 트레할로오스 및 셀루비오스를 포함하는 이당류가 더욱 바람직하다. 당 알코올은 소르비톨, 만니톨, 글리세린, 에리스리톨, 말티톨, 자일리톨, 폴리글리시톨을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 당은 수크로스 또는 트레할로스와 같은 비환원당이다. 비환원성 당은 열린 사슬구조의 부재를 특징으로 하므로, 산화- 환원반응에 민감하지 않다. 따라서 수크로스 또는 트레할로스와 같은 비환원성 당의 하나 이상, 또는 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올의 하나 이상이 GM-CSF를 중화하는 화합물를 함유하는 제제에 첨가될 수 있다. 또한 비환원 당과 당 알코올의 조합, 예를 들면 수크로스와 만니톨, 수크로스와 소르비톨, 트레할로오스와 만니톨, 또는 트레할로스와 소르비톨이 용액에 첨가될 수 있다. 보다 바람직하게는 당알콜 만니톨 및/또는 소르비톨은 이들의 D-형태로 바람직하게 첨가되며, 가장 바람직하게 소르비톨은 용액에 첨가된다. 장성 조절제, 바람직하게는 소르비톨의 농도는 약 1% 내지 약 15% (w/v), 바람직하게는 약 2% 내지 약 10% (w/v), 보다 바람직하게는 약 3% 내지 약 7% (w/v), 보다 바람직하게는 약 4% 내지 약 6%(w/v) 및 가장 바람직하게는 약 5% (w/v)이다.
장기간 저장에 대하여 고농도에서 GM-CSF를 중화하는 화합물을 안정화하기 위한 또 다른 특히 바람직한 물질은 pH 약 4 내지 약 10, 바람직하게는 약 4 내지 약 7, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 약 6 또는 약 5 내지 약 7, 더더욱 바람직하게는 약 5.5 내지 약 6.5, 및 가장 바람직하게는 pH 약 5.8을 갖는 완충액 시스템이다. 완충액은 바람직하게는 히스티딘 완충액, 아세테이트 완충액 및 시트레이트 완충액으로부터 선택될 수 있다. 본 명세서에서 언급할 때, 아미노산은 L-아미노산 또는 D-아미노산인 것을 의미하며, 여기서 L-아미노산이 바람직하다. 바람직하게는 히스티딘 또는 그의 염이 완충액 시스템에 사용된다. 바람직하게는 상기 염은 클로라이드, 포스페이트, 아세테이트 또는 설페이트이며, 더욱 바람직하게는 염은 클로라이드이다. 히스티딘 완충액 시스템의 pH는 약 5 내지 약 7, 바람직하게는 약 5.5 내지 약 6.5이며, 더욱 바람직하게 pH는 대략 또는 정확히 5.8이다. pH는 통상적으로 사용되는 염기 및 산, 바람직하게는 NaOH를 사용하여 조절할 수 있다. 완충액 시스템, 바람직하게는 히스티딘 완충액 시스템의 농도는 약 10 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게는 약 20 mM 내지 약 40 mM, 더욱 바람직하게는 약 30mM이다.
바람직한 실시형태에 따르면, 완충액 시스템, 바람직하게는 히스티딘 완충액, 및 장성 조절제, 바람직하게는 당 알코올, 더욱 바람직하게는 만니톨 또는 더더욱 바람직하게는 소르비톨의 조합을 사용하여 용액 중에 GM-CSF를 중화하는 화합물을 안정화하고, 응집을 방지하고 또한 제형을 장기간 저장 및/또는 하나 이상의 냉동/해동 사이클에 충분히 안정하게 한다. 안정성 측면에서 제제 중에 약 6%(w/v) 및 그 이상의 당 알코올, 바람직하게는 소르비톨을 함유하는 것이 바람직한 것으로 나타났다. 그러나 제제의 삼투압에 대한 상한은 약 470 mOsm/kg으로 고정되고, 이것은 아직도 고삼투압성이지만 승인된 생성물 (Synagis; Lm. 투여)의 삼투압과 유사하다. 따라서 GM-CSF를 중화하는 화합물의 최적 안정성, 장성 및 농도간의 조화는 본 발명의 실시예에 기술된 바와같이 나타났다. 따라서 당 알코올, 바람직하게는 소르비톨의 바람직한 농도는 약 3% 내지 약 7%(w/v), 더욱 바람직하게는 약 4% 내지 약 6%(w/v) 및 가장 바람직하게는 약 5%(w/v)이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, GM-CSF를 중화하는 화합물을 포함하는 본 발명의 제제 또는 조성물은, 상술한 것 (즉 완충액 및 장성 조절제), 예를 들면 용액 중에 단백질을 안정화하기 위해 기존의 제제에서 사용되는 계면활성제 및 아미노산에 추가하여, 추가의 부형제를 필요로 하지 않는다. 그 외에, 본 명세서에 기술된 제제는 단백질 안정화에 통상 필요한 추가 작용제의 부족으로 인하여 감소된 면역원성을 가지기 때문에 표준 제제보다 바람직하다.
아미노산은 특히 단백질 용해성을 매개하고 및/또는 단백질의 응집을 억제함으로써, 고농도로 단백질을 안정화하는데 유용한 것으로 알려져 있다. 트레오인 (예를 들어, 250 mM)은 미미한 안정화 효과를 나타내지만, 본 발명의 액체 제제는 바람직하게는 추가의 아마노산을 함유하지 않는다.
또한, 본 제제는 염화나트륨을 불함유하거나 또는 필수적으로 불함유하는 것이 바람직하다. "필수적으로 불함유"란 염화나트륨의 농도가 0(제로) mM 또는 매우 근사, 예를 들면 약 50 mM 미만, 바람직하게는 약 20 mM 미만, 더욱 바람직하게는 약 10 mM 미만, 더더욱 바람직하게는 약 5mM 미만 및 가장 바람직하게는 약 2mM 미만 또는 약 1mM 미만이다는 것을 의미한다.
생물의약품에 있어서, 계면활성제의 첨가는 저장중에 단백질 분해를 감소시키는데 유용할 수 있다. 폴리소르베이트 20 및 80 (트윈 20 및 트윈 80)은 이 목적을 위해 잘 확립된 부형제이다. 그러나 GM-CSF를 중화하는 화합물의 안정성에 대한 부정적인 영향 때문에, 본 발명의 액체 제제는 바람직게는 임의의 계면활성제를 포함하지 않는다.
사용되는 GM-CSF를 중화하는 각 화합물의 농도는 저장되고, 냉동/해동되고 및/또는 즉시 사용되는 액체 제제 중에 적어도 약 20 ㎎/㎖, 바람직하게는 적어도 약 50 ㎎/㎖, 보다 바람직하게는 적어도 약 100 mg/㎖이다. 약 20 mg/ml 내지 약 200 mg/mg, 바람직하게는 약 50 mg/ml 내지 약 200 mg/ml, 더욱 바람직하게는 약 100 mg/ml 내지 약 180 mg/ml, 더더욱 바람직하게는 약 130 mg/ml 내지 약 170 mg/ml, 더더욱 바람직하게는 약 135 mg/ml 내지 약 165 mg/ml, 및 가장 바람직하게는 약 150 mg/ml이 본 발명에서 사용된다.
생산된 액체 제제의 저장수명은 2 내지 8℃에서 24 개월, 바람직하게는 2 내지 8℃에서 36 개월, 더욱 바람직하게는 2 내지 8℃에서 48 개월, 가장 바람직하게는 2 내지 8℃에서 60 개월, 또는 주위 온도 (25℃ ± 2℃)에서 적어도 28일의 바람직한 최소 요건을 갖는다.
본 발명은 안정한 제제, 바람직하게는 GM-CSF를 중화하는 화합물의 장기간 저장을 놀랍게도 허용하는 안정한 액체 제제에 관한 것이다. 이러한 제제는 부분적으로는 고용적 주사로 인한 통증 같은 부작용을 감소시키기 위하여 이 제제중의 GM-CSF를 중화하는 화합물이 고도로 농축됨에 따라 환자가 사용하는데 더욱 편리하기 때문에 유용하다.
따라서 본 발명의 한 가지 양상은
- GM-CSF를 중화하는 화합물,
- 바람직하게는 5 내지 7의 pH를 가진, 히스티딘 완충액, 아세테이트 완충액 및/또는 시트르산 완충액으로부터 바람직하게 선택되는 완충액 시스템, 및
- 수쿠로오스 또는 트레할로오스와 같은 비환원성 당, 또는 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올로부터 바람직하게 선택된 장성 조절제
를 포함하는 제제가 장기간 저장 및/또는 냉동/해동 사이클 및/또는 전단력 (진탕 안정성)에 충분히 안정하다는 발견에 기초하고 있다. 본 발명의 제형은 표준 완충 제제보다 많은 장점을 갖는다. 한 측면에서, 상기 제제는 고단백질 제제에서 예상할 수 있는 악영향 없이 장기간 저장시 최소 응집 거동을 나타낸다. 본 발명에 따른 제제의 다른 장점은 GM-CSF를 중화하는 화합물의 최소 단편화, 및 장기간 저장시 GM-CSF를 중화하는 화합물의 생물 활성에 현저한 영향없음, 그리고 조성물의 낮은 점도이다. 마지막으로, 바람직한 실시형태에서, 제제는 계면활성제, 추가의 아미노산 및/또는 염화 나트륨과 같은 추가의 부형제를 함유하지 않는다.
본 발명의 제1 양상의 바람직한 실시형태는 다음과 같다: GM-CSF를 중화하는 화합물이 폴리펩티드, 펩티드 모방체, 핵산 또는 소분자인 본 발명에 따른 제형.
바람직한 실시형태에서, GM-CSF를 중화하는 화합물 (바람직하게는 폴리펩티드 및 더욱 바람직하게는 항체 또는 그의 작용 단편임)는 GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체에 결합하거나 특이적으로 결합한다. GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체는, 이들로 제한되지 않지만, 포유류, 예컨대 실험실 동물 (설치류, 예컨대 래트, 기니아 피그, 햄스터 또는 마우스, 비인간 영장류, 예컨대 사이노몰거스 또는 마카크 원숭이), 가축 또는 애완동물 (예를 들면, 개 또는 고양이), 농장 또는 농업 동물 (예를 들면, 소, 양, 염소 및 돼지동물) 및/또는 인간를 포함하는 동물이다. 바람직하게는, GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체는 각각 인간 GM-CSF (호모사피언스) 또는 인간 GM-CSF 수용체, 또는 각각 비인간 영장류 GM-CSF 또는 비인간 영장류 GM-CSF 수용체이다. 비인간 영장류 GM-CSF 또는 비인간 영장류 GM-CSF 수용체의 특히 바람직한 변이체(상동체)는 긴팔 원숭이(노마스커스 콘칼라 (nomascus concolor), 웨스턴 블랙 크레스티드 기브본 (western black crested gibbon)으로도 알려져 있음)의 GM-CSF, 및 마카카과의 원숭이의 GM-CSF, 예를 들면 붉은 털 원숭이 (Macaca mulatta) 및 시노몰구스 원숭이 (Macaca fascicularis)의 GM-CSF가 포함된다. 본 발명의 특히 바람직한 실시형태에 따르면, GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체(바람직하게는 항체 또는 그의 단편)에 결합하는 화합물은 인간과 상기 언급된 원숭이 종의 적어도 하나 사이에 교차 반응성을 나타낸다. 예를 들면, 항체 또는 그의 단편은 인간 GM-CSF와 시노몰구스 원숭이 (Macaca fascicularis)의 GM-CSF 모두에 결합 (및 중화)하는 것이 가능하다. 이것은 인간 대상체의 치료적 투여를 목적으로 하는 항체 분자에 특히 유리하다. 그 이유는 그와 같은 항체는 통상 규제 승인에 앞서 다수의 시험을 통하지 않으면 아니되며, 그들 시험중 어느 초기 시험에는 비인간 동물종이 관여하기 때문이다. 그와 같은 시험을 실시하는 경우에 인간과 고도의 유전적 유사성을 갖는 종 (예를 들면, 시모몰구스 원숭이와 같은 비인간 영장류)를 비인간종으로서 사용하는 것은 일반적으로 바람직하다. 그 이유는 이와 같이 수득되는 결과는 일반적으로 동일분자를 인간에게 투여하는 경우에 기대될 수 있는 대응 결과를 매우 높게 예측할 것이기 때문이다. 그러나 동물 실험에 기초한 그와 같은 예측 능력은 적어도 부분적으로는 분자의 비교가능성에 의존하고 있으며, 또한 종간 교차반응성 때문에, 동일 치료용 분자를 인간 및 동물 모델에게 투여하는 것이 가능한 경우에 상기 능력은 매우 높다. 본 발명의 이러한 실시형태에서와 같이, 항체 분자가 인간 및 다른 밀접하게 관련된 종에서 동일 항원에 대해 교차반응성이 있다면, 그의 동일 항체 분자를 사용하여 인간 및 이와 밀접하게 관련된 종, 예를 들면 상기에 언급한 원숭이종 중의 하나에서 시험을 수행할 수 있다. 이렇게 하여 시험 자체의 효율성, 및 치료상의 견지에서 최종적인 목적한 종인 인간에서의 그와 같은 항체의 거동에 관한 그와 같은 시험의 예측능력을 함께 향상시킨다. GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체에 결합하는 항체 또는 그의 단편은 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편인 것이 바람직하다. 이것은 항체 아니거나 파생된 항체가 아닌 GM-CSF를 중화하는 화합물의 대체 실시형태에서도 마찬가지이다.
바람직하게는 GM-CSF를 중화하는 화합물은 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편이다.
GM-CSF를 중화하는 화합물은 인간 및 비인간 영장류 GM-CSF에 결합하는 항체 또는 그의 단편일 수 있다. 이 에피토프는 바람직하게는 아미노산 23-27 (RRLLN) 및/또는 아미노산 65-77 (GLR/QGSLTKLKGPL)을 포함한다. 아미노산 서열 스트레치(stretch) 65-77 내에서 67번 위치의 변이성은 한편으로는 인간 및 긴팔 원숭이 GM-CSF (67번 위치는 R임)와 다른 한편으로는 마카카 과의 원숭이, 예를 들어 시노몰구스 및 레서스 원숭이 (67번 위치는 Q임) 사이에 GM-CSF의 이러한 위치에서 불균질성이 있다는 것을 반영하고 있다. 에피토프가 비인접한 두 개의 아미노산 서열 스트레치 예를 들면 23-27(RRLLN) 및 65-77 (GLR/QGSLTKLKGPL)을 포함하는 경우, 에피토프는 또한 "불연속" 에피토프라고 불릴 수 있다. 상기 GM-CSF 에피토프 또는 상기 GM-CSF 불연속 에피토프는 아미노산 28-31(LSRD), 아미노산 32-33 (TA), 및/또는 아미노산 21-22(EA)를 추가로 포함할 수 있다.
인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 바람직하게는 그의 중쇄 가변 영역에서 서열번호 1-13 및 56으로 표시되는 것들로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다; 바람직하게는 상기 중쇄 가변 영역 CDR3은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
상기 중쇄 가변영역 CDR3 서열의 어느 것은 중쇄 가변영역에서 함께 추가로 존재할 수 있으며, 상기 중쇄 가변영역 CDR1은 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변영역 CDR2는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 그의 경쇄 가변 영역에서 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 양상에서, 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 그의 경쇄 가변 영역에서 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하며, 또한 그의 중쇄 가변영역에서 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 1-13 및 56, 가장 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
바람직한 실시형태에 따르면, 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 그의 경쇄 가변 영역에서 서열번호 19, 54 및 55로 표시되는 것들로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시형태에 따르면, 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 그의 중쇄 가변 영역에서 서열번호 20-33, 52 및 53으로 표시되는 것들로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 실시형태에서 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 서열번호 34로 표시되는 경쇄 아미노산 서열 및/또는 서열번호 35-48, 가장 바람직하게는 서열번호 35로 표시되는 것들로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 서열번호 1-48 및 52-56중의 어느 하나로 표시되는 각각의 아미노산 서열에, 바람직하게는 서열번호 1-18로 표시되는 각각의 아미노산 서열에 및/또는 서열번호 19-48 및 52-55중의 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 내에서 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열에 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 하나 이상의 아미노산을 함유할 수 있다. 따라서 바람직한 실시형태에서 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 서열번호 1-18 및 56 중의 어느 하나로 표시되는 각각의 아미노산 서열에 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
대안적으로, 서열번호 1-18 및 56 중의 어느 하나로 표시되는 CDR의 아미노산 서열중 어느 하나에서, 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉 또는 10개의 아미노산이 치환될 수 있다. 바람직하게, 치환기를 갖는 이러한 CDR은 본 명세서에 기술된 바와 같이 GM-CSF에 결합할 수 있다.
대안적으로 또는 부가적으로, 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 서열번호 19-48 및 52-55 중의 어느 하나로 표시되는 VH, VL, H 또는 L 영역의 각각의 아미노산 서열에 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상동성은 전체 VH, VL, H 또는 L 아미노산 서열 이상이다. 더욱 바람직하게, 상동성은 앞서 기술된 CDR 이내이거나 또는 상동성은 서열번호 19-48 및 52-55중 어느 하나로 표시되는 VH, VL, H 또는 L 영역의 FR (또는 비-CDR)내에 있다. 따라서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 25개의 아미노산은 FR의 각각에서 치환될 수 있다. 이러한 FR 치환 변이체는 본 명세서에 기술된 바와 같이 GM-CSF에 더욱 결합할 수 있다.
당업자는 서열번호 1-18 및 56이 서열번호 19-48 및 52-55로 나타낸 VH, VL, H 또는 L 서열 중의 하나 이상에 포함되는 CDR 서열을 나타내기 때문에 서열번호 19-48 및 52-55 내의 FR (또는 비-CDR)을 용이하게 식별할 수 있다. 즉, 서열목록은 서열식별자 <223> 아미노산 서열의 각각의 지정에 제공한다. 동일한 지정은 아미노산 서열이 함께 "속한다"는 것을 나타내며, 이것은 CDR이 VH, VL, H 또는 L 영역 포함되며, 예를 들면 서열번호 16, 17, 18은 서열번호 19로 나타낸 아미노산 서열에 포함되는 CDR의 아미노산 서열이다 (이들 모두는 "5-306"으로 지정되기 때문임).
다른 예시로서, 아미노산이 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR 또는 FR 중의 하나 이상 또는 모두에서 치환되는 경우, 이후에 얻어진 "치환된" 서열은 "최초의" CDR 또는 FR 서열과 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 80%, 더욱더 바람직하게는 90%, 특히 바람직하게는 95%, 더욱 특히 바람직하게는 98% 또는 99% 동일한 것이 바람직하다. 이것은 "치환된" 서열에 상동적인 정도의 CDR 또는 FR의 길이에 의존하는 것을 의미한다.
상동성은 벡터 NTI (InforMaxTM, 메릴랜드, 미국)과 같은 표준서열정렬 프로그램에 의해 결정되거나, 또는 더욱 바람직하게는 프로그램 BLASTP, 바람직하게는 버전 blstp 2.2.5 (November 16, 2002; cf. Altschul, S. F. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402)에 의해 결정된다. 상동성의 백분율은 상호비교에서 참조로서 CDR, VH, VL, H 또는 L중의 어느 하나를 사용하여 전체 폴리펩티드 서열(매트릭스: BLOSUM 62; 갭비용: 11.1; 컷오프 값 10-3로 설정)의 정렬에 기초한다. 이것은 BLASTP 프로그램 아웃풋에서 결과로 표시된 "포지티브" (상동성 아미노산)의 수를 정렬 프로그램에 의해 선택된 아미노산의 총수로 나눈 백분율로서 계산된다.
여기에서 사용되는 경우, 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 상동성은 용어 "동일성"과 서로 교환적으로 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "상동성"은 본 발명의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 문제되는 서열과 상동성 정렬후에 이들 두 개의 서열의 더 긴것에서 잔기의 수에 관하여 상호 동일한 잔기의 백분율을 의미한다. 상술한 바와 같이, 상동성 (또는 동일성)을 결정하는 프로그램은 아미노산 대 아미노산을 기준으로 정렬 서열을 비교하며, 또한 비교을 위해 다양한 정도의 엄중함(stringency)으로 세팅할 수 있다 (예를 들면 동일 아미노산, 보존적 아미노산 치환 등). 여기에 사용되는 용어에서, 문제되는 두개의 아미노산이 각각 동일한 화학군, 즉 산성, 비극성/소수성, 비전하 극성 및 염기성에 속하는 경우, 이는 서로의 "보존적 치환"인 것으로 고려된다. 비제한적 예로서, 비극성 아미노산의 군에 속하는 두 개의 상이한 아미노산은 동일하지 않더라도 이러한 2개의 아미노산은 서로의 "보존적 치환"으로 고려되는 반면, 한편으로는 비극성 아미노산 및 다른 한편으로는 염기성 아미노산은 서로의 "보존적 치환"으로 고려되지 않는다. Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts 및d Walter의 "세포의 분자생물학" 제4판 (2002)의 Panel 3.1은 아미노산을 4개의 주요 군, 즉 산성, 비극성, 비전하 극성 및 염기성으로 그룹을 분류함. 이러한 그룹 분류는 본 발명의 맥락상 특정한 아미노산이 문제되는 다른 아미노산의 보존적 치환인지의 여부를 결정할 목적으로 사용될 수 있다. 위에서 언급한 주요 그룹은, 예를 들면 작은 비극성 및 큰 비극성 아미노산, 큰 방향족 아미노산 등으로 더욱 세분할 수 있다. 용어 "보존적 아미노산 치환"은 또한 소정의 아미노산 잔기에 대한 임의의 아미노산치환을 나타내며, 여기서 치환 잔기는 폴리펩티드 기능 (예, 결합)에서 실질적 감소가 생기지 않는다는 소정의 잔기와 화학적으로 매우 유사하다.
GM-CSF를 중화하는 화합물은 일반적으로 대상체에게 비경구 투여, 예를 들면 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소 또는 진피내 투여용 약제학적 조성물로서 제형화되며, 여기서 피하 투여가 바람직하다. 특정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 액체 조성물, 바람직하게는 수성 조성물(aqueous composition)이다.
하나의 실시형태에서, 액체 약제학적 조성물에서 GM-CSF를 중화하는 화합물의 농도는 적어도 20 ㎎/㎖, 바람직하게는 50 ㎎/㎖, 보다 바람직하게는 적어도 100 ㎎/㎖, 더더욱 바람직하게는 약 100 mg/ml 내지 약 200 ㎎/㎖, 예컨대 약 150 ㎎/㎖이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어 조성물이 피하 전달을 의도하는 경우, GM-CSF를 중화하는 화합물은 더 높은 농도로 사용될 수있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 완충액을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "완충액"은 액체 조성물의 pH 변화를 억제시키는 첨가 조성물을 지칭한다. 특정의 실시형태에서, 첨가된 완충액은 그의 산-염기 접합체 성분들의 작용에 의해 액체 제제의 pH 변화를 억제시킨다. 적절한 완충액의 예는, 이들로 제한되지 않지만, 완충 히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트 시스템을 포함한다.
"특이적으로 결합하는"이란 용어, 또는 "특이적으로 결합한", "특이적 결합제" 등과 같은 관련 표현은 본 명세서 중에 사용되는 경우 GM-CSF 중화성 화합물 및 바람직하게는 (인간)(모노클로날) 항체 또는 그의 기능적 단편이 잠재적 결합 파트너로서 복수의 상이한 항원으로부터 GM-CSF/GM-SCF 수용체만으로 결합 또는 현저하게 결합할 정도로 GM-CSF/GM-SCF 수용체와 다른 임의의 수의 다른 잠재적 항원과 그의 표적 (예를 들면, GM-CSF 또는GM-SCF 수용체)를 구별하는 능력을 나타낸다. 본 발명의 의미 내에서, 상기 표적은, 잠재적 결합 파트너로서 다수개의 동일하게 접근가능한 다른 항체들 중에서, 상기 표적과 상이한 임의의 다른 항원보다 (동력학적 감각 면에서) 흔히 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 50배, 가장 바람직하게는 적어도 100배 또는 그 이상 결합되는 경우 "현저하게" 결합된다. 이러한 동력학적 측정은, 예를 들면 Biacore 기구와 같은 SPR 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 여기에서 사용되는 바와 같이 용어 "(특이적으로) 결합하는" 또는 관련 용어 "(특이적으로) 인식하는", "지향하는", "(특이적으로) 상호작용하는" 및 "(특이적으로) 반응하는"은 본 발명에 따라 GM-CSF를 중화하는 화합물(예를 들면, 항체)이 그의 표적(예를 들면, GM-CSF 또는GM-SCF 수용체)에 대해 두드러진 친화성을 나타내며 또한 일반적으로 전술한 표적 이외의 단백질 또는 항원과 현저한 반응성을 나타내지 않는다. "두드러진 친화성"은 약 10-6 M (KD) 또는 더 강한 친화성, 예를 들면 약 10-7M 또는 더 강한 친화성으로 결합하는 것을 포함한다. 바람직하게, 결합은 결합친화성이 약 10-11 내지 10-8M, 바람직하게는 약 10-11 내지 10-9M, 더욱 바람직하게는 약 10-11 내지 10-10M인 경우에 특이적인 것으로 고려된다. 화합물 (예를 들면 항체)가 표적과 특이적으로 반응하거나 표적에 결합하는지 여부는 특히 상기 화합물과 그의 표적 단백질 또는 항원과의 반응을 상기 화합물과 그의 표적 이외의 단백질 또는 항원과의 반응을 비교함으로써 용이하게 시험할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 화합물은 필수적으로 결합하지 않거나 또는 GM-CSF 또는GM-SCF 수용체 이외의 단백질 또는 항원에 결합할 수 없다. 용어 "실질적으로 결합하지 않는다" 또는 "결합할 수 없는"은 본 발명의 화합물이 GM-CSF 또는GM-SCF 수용체 이외의 단백질 또는 항원과 30% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 이상, 특히 바람직하게는 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5% 이상의 반응성을 나타낸다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "중화", "중화제", "중화하는" 및 이의 문법적으로 관련된 변형어들은 GM-CSF의 생물학적 효과(들)의 부분적 또는 전체적 약화를 나타낸다. GM-CSF의 생물학적 효과(들)의 부분적 또는 전체적 약화는 신호 전달과 같은 GM-CSF-매개 과정의 변경, 방해 및/또는 실효로부터 야기되며, 이는, 예를 들면 세포내 신호전달, 세포증식 또는 가용성 물질의 방출, 예를 들면 GM-CSF 이외의 리간드에 대한 표면 수용체의 발현을 야기하는 세포내 유전자 활성화의 상향 또는 하향 조절 등으로 야기된다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 화합물, 예를 들어 항체 또는 이의 기능적 단편이 중화제로서 분류되는지 여부를 결정하는 방법은 다양하게 존재한다. 일례로서, 이것은 일반적으로 하기와 같이 수행되는 표준 시험관내 테스트에 의해 달성될 수 있다: 첫번째 증식 실험에서, 세포주의 증식 정도가 GM-CSF의 활성에 의존한다고 알려져 있는 세포주가 GM-CSF의 농도를 다르게 한 일련의 샘플에서 배양되고, 그 배양 이후에 세포주의 증식 정도가 측정된다. 이러한 측정으로부터, 세포 증식의 최대의 반값을 허용하는 GM-CSF의 농도가 측정된다. 그 후, 두번째 증식 실험은 첫번째 증식 실험에서 사용된 동일한 수의 세포를 일련의 샘플의 각각에서 사용하고, GM-CSF의 상기 측정된 농도를 사용하며, 이번에는 GM-CSF의 중화제인 것으로 의심되는 화합물의 농도를 다르게하여, 수행된다. 세포 증식을 다시 측정하여, 성장 억제의 최대의 반값을 가져오기에 충분한 항체 또는 이의 기능적 단편의 농도를 결정한다. 만일 성장 억제 대 분석 화합물의 농도의 결과 그래프가 S자 모양이고, 분석 화합물의 농도가 증가함에 따라 세포 증식의 감소를 야기한다면, 어느 정도의 항체-의존 성장 억제를 가져오며, 이는 즉 GM-CSF의 활성이 어느 정도까지 중화되었다는 것을 의미한다. 이러한 경우에, 문제되는 화합물은 본 발명의 의미에서 "중화제"로 고려될 수 있다. 세포주의 증식정도가 GM-CSF의 활성에 의존한다고 알려져 있는 세포주의 하나의 예는 [Kitamura, T. 등 (1989). J Cell Physiol 140, 323-34]에 기재되어 있는 TF-1 세포주이다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 세포 증식의 정도가 GM-CSF를 중화시키는 능력이 설정될 수 있는 유일한 파라미터는 아니다. 예를 들어, 신호 분자(예컨대, 사이토카인)의 수준, GM-CSF에 의존하는 분비의 수준의 측정은, 의심되는 GM-CSF 중화제(GM-CSF를 억제하는 화합물)를 식별하기 위해 사용될 수 있다.
문제되는 화합물이 GM-CSF 활성의 중화제인지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있는 세포주의 다른 예에는, AML-193 (Lange, B. 등 (1987). Blood 70, 192-9); GF-D8 (Rambaldi, A. 등 (1993). Blood 81, 1376-83); GM/SO (Oez, S. 등 (1990). Experimental Hematology 18, 1108-11); MO7E (Avanzi, G. C. 등 (1990). Journal of Cellular Physiology 145, 458-64); TALL-103 (Valtieri, M. 등 (1987). Journal of Immunology 138, 4042-50); 및 UT-7 (Komatsu, N. 등의 (1991). Cancer Research 51, 341-8)가 포함된다.
본 발명에 따라 GM-CSF의 중화는 GM-CSF 수용체를 갖는 세포 외부에서 또는 상기 세포 내에서 수행될 수 있는 것으로 이해된다. 따라서 화합물에 의한 GM-CSF 의 중화는, 그의 특이적 수용체에 대한 GM-CSF의 결합의 억제 또는 방지이거나, 또는 그의 수용체에 대한 사이톤카인의 결합에 의해 유도되는 세포내 신호의 억제일 수 있다. GM-CSF를 중화하는 화합물은, 예를 들면 직접 GM-CSF에 결합하거나 또는 GM-CSF 수용체에 결합하여, 양자의 경우에 GM-CSF의 생물학적 효과를 간섭할 수 이다.
상기에서 정의된 바와 같이, GM-CSF의 억제제는 폴리펩티드, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 핵산 분자 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 통상 공유 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 적어도 30개의 아미노산으로 이루어진 분자의 군을 기술한다. 본 발명에 따르면, 폴리펩티드의 군은 하나의 폴리펩티드 또는 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 "단백질"을 포함한다. 또한, 용어 "폴리펩티드"는 단백질의 단편이 적어도 30개의 아미노산으로 이루어지는 한, 단백질의 단편을 기술한다. 폴리펩티드는 다량체, 예컨대 이량체, 삼량체 및 고급 올리고머, 즉 하나 이상의 폴리펩티드 분자로 이루어진 형태를 형성할 수 있다는 것이 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 다량체는 또한 상기 용어 "폴리펩티드"의 정의에 포함된다. 상기 이량체, 삼량체 등을 형성하는 폴리펩티드 분자는 동일할 수도 있고 동일하지 않을 수도 있다. 따라서, 상기 다량체의 대응하는 고차구조는 호모- 또는 헤테로이량체, 호모- 또는 헤테로삼량체 등으로 지칭된다. 헤테로다량체의 예는, 천연적으로 발생하는 형태에서 2개의 동일한 폴리펩티드 경쇄 및 2개의 동일한 폴리펩티드 중쇄로 이루어진 항체 분자이다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 또한 자연적으로 또는 비자연적으로 변형된 폴리펩티드/단백질을 나타내며, 상기 변형은, 예컨대 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 이황화 가교의 형성 등과 같은 번역 후의 변형에 의해 또는 PEG길화 등의 화학적 변형에 의해 야기된다. 이러한 변형은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 문맥에서 용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 인산, 당 및 푸린 및 피리미딘 염기의 다중 반복 단위로 이루어진 고분자 거대분자로 정의된다. 이들 분자의 실시형태는 DNA, RNA 및 PNA를 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥, 선형 또는 원형일 수 있다. 본 발명의 문맥에서 핵산의 특히 바람직한 실시형태는 앱타머(aptamer)이다. 핵산 앱타머는 DNA 또는 RNA 분자로서, 다른 분자를 결합하는 그의 능력에 기초하여 랜덤 풀로부터 선택된 것이다. 핵산, 단백질, 작은 유기 화합물 및 심지어 전체 유기체를 결합하는 앱타머가 선택되었다. 이들은 통상 짧은 가닥의 올리고뉴클레오티드, 전형적으로 50개 또는 그 미만의 염기로 구성되어 있다.
용어 "소분자"는 1000 달톤 미만, 바람직하게는 800 달톤 이하, 및 더욱 바람직하게는 300 내지 700 달톤의 분자량을 갖는 유기 약물 화합물의 군을 정의한다. 소분자의 분자량 상한은 세포내 작용 부위에 도달할 수 있도록 세포막에 걸쳐 신속하게 분산하는 능력을 허용한다. 상응하는 소분자는 적어도 부분적으로 랜덤화된 펩티드 라이브러리로부터 유도될 수 있다. 본 발명에 따라 적합한 소분자의 라이브러리는 당해 분야에 잘 알려져 있으며 및/또는 상업적 판매업자로부터 구입할 수 있다.
용어 "펩티도미메틱"은 펩티드를 모방하도록 설계된 작은 단백질-유사 사슬을 기술한다. 이러한 유형의 분자는 분자의 성질을 바꾸기 위하여 현존하는 펩티드를 변형시켜 인위적으로 유도된 것이다. 예를 들어, 현존하는 모체 펩티드는 분자의 안정성 또는 생물학적 활성이 바뀌도록 변형된다. 이러한 변형은 백본(backbone)의 변경 및 비천연적 아미노산의 삽입을 포함한다.
용어 "GM-CSF 수용체"는 GM-CSF의 생리학적 세포 표면 수용체를 나타내며, 이는 당업계에서 공통 베타(배터-c) 서브유닛 및 알파체인(CD116)의 헤테로머로서 서술된다.
중화 펩티드의 바람직한 실시형태는 항체 또는 그의 기능적 단편, 더욱 바람직하게는 인간 항체 또는 그의 기능적 단편이다. 항체의 제조 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대 [Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988] 및 [Harlow and Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999]에 기재되어 있다.
용어 "항체"란 정의는 모노클로날, 키메라, 단일 체인, 인간화 및 인간 항체 등의 실시형태를 포함한다. 전체 길이의 항체 외에도, 상기 정의는 항체 유도체 및 항체 단편 등, 특히 Fab 단편을 또한 포함한다. 항체 단편 또는 그의 유도체는 F (ab')2 및 Fv, scFv 단편 또는 단일 도메인 항체, 예를 들어 도메인 항체 또는 나노 바디, 단일 가변 도메인 항체 또는 단지 하나의 가변 도메인을 포함하는 면역 글로불린 단일 가변 도메인을 추가로 포함하며, 이는 다른 V 영역 또는 도메인과는 독립적으로 항원 또는 에피토프를 특이적으로 결합하는 VHH, VH 또는 VL일 수 있다. 예를 들면, Harlow and Lane (1988) and (1999), loc. cit.; Kontermann and Dubel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed. 2010 and Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009를 참조한다. 상기 용어는 또한 디아바디 또는 Dual-Affinity Re-Targeting (DART) 항체를 포함한다. 또한 (이중특이성) 단일 사슬 디아바디, 탠덤 디아바디(Tandab), 다음과 같은 구조: (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2 또는 (scFv-CH3-scFv)2로 예시되는 미니바디, "FcDART" 및 "IgG DART", 트리바디 등의 멀티바디를 포함한다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 분리 항체 단일 가변 도멘인 뿐만아니라 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 단량체를 포함하는 더 큰 폴리펩티드가 추가로 고안되었다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 기술된 항체와 동일한 특이성을 표시하는 본 명세서에 기술된 항체의 유도체 또는 변이체에 관한 것이다. "항체 변이체"의 예는 비인간 항체의 인간화 변이체, "친화성 성숙" 항체를 포함한다(참조, 예를 들면 Hawkins et al. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) 및 Lowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)) 및 변경된 이펙터 기능(들)을 가진 항체 변이체 (참조, 예를 들면 미국특허 제5,648,260호, Kontermann and Dubel (2010), loc. cit. and Little(2009), loc. cit.).
용어 "항체"는 또한 상이한 클래스 (즉, IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE)과 서브 클래스 (예를 들어 IgG1, IgG2 등)의 면역 글로불린(Ig)을 포함한다. 본 발명의 의미에서 항체란 용어의 정의에 속하는 항체 유도체는 이러한 분자의 변형, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 이황화 결합 형성, 파네실화, 히드록실화, 메틸화 또는 에스테르화를 포함한다.
항체의 기능적 단편은 F(ab')2단편, Fab단편, scFv의 도메인 또는 단일 면역 글로불린 가변 도메인 또는 단일 도메인 항체 폴리펩티드를 포함하는 구조물, 예를 들면 단일 중쇄 가변 도메인 또는 단일 경쇄 가변 도메인은 물론, 여기에서 상술한 바와 같은 다른 항체 단편을 포함한다. F(ab')2 또는 Fab는 CH11와 CL 도메인 사이에 일어나는 분자간 이황화 상호작용을 최소화하거나 또는 완전히 제거하도록 설계할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "인간" 항체는 항체 또는 그의 기능적 단편이 인간 생식계(germline) 항체 레퍼토리(repertoire)에 함유되어 있는 아미노산 서열(하나 또는 복수개)을 포함하는 것을 의미하는 것으로서 이해된다. 따라서 본 명세서 중에서 정의하는 경우, 항체 또는 그의 단편은 (a) 그것이 인간 생식계 아미노산 서열(들)로 이루어진 경우, 즉 문제되는 항체 또는 그의 기능적 단편의 아미노산 서열(들)이 발현된 인간 생식계 아미노산 서열(들)과 동일한 경우에, 인간 항체로 간주될 수 있다. 또한, 항체 또는 그의 기능적 단편은 그의 (그들의) 가장 가까운 인간 생식계 서열(들)로부터의 이탈(들)이 체세포 초변이의 흔적에 기인되는 것으로 예상되는 정도라면, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편은 인간 항체로 간주될 수 있다. 그 외에, 많은 비인간 포유류, 예를 들면 마우스 및 래트와 같은 설치류의 항체는 발현된 인간 항체 레퍼토리에도 존재하는 것으로 예측될 수 있는 VH CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 발현된 인간 레퍼토리에 존재하는 것으로 예측될 수 있는 인간 또는 비인간 기원의 임의의 상기 서열(들)은 본 발명의 목적을 위한 "인간" 항체로 간주될 수 있다. 따라서 용어 "인간 항체"는, 예를 들면 Kabat et al. (See Kabat et al . (1991) loc. cit.)에 기술된 것들을 포함하여, 당해 분야에 알려진 인간 생식계 면역글로불린 서열에 실질적으로 상응하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체들을 포함한다. 본 발명의 인간 항체는, 예를 들면 CDRs에서 및 특히 CDR3에서 인간 생식계 면역글로불린 서열 (예를 들면, 시험관내 랜덤 또는 부위 특이적 돌연변이에 의해 도입된 변이)에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 인간 항체는 인간 생식계 면역글로불린 서열에 인코딩 되지 않는 아미노산 잔기로 치환된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 위치를 가질 수 있다.
비-인간 및 인간 항체 또는 그의 기능적 단편은 바람직하게는 단일클론이다. 단일 클론성인 인간 항체를 제조하는 것은 특히 곤란하다. 불멸화 세포주와 뮤린 B 세포의 융합과 대조적으로, 불멸화 세포주와 인간 B 세포의 융합은 실행가능하지 않다. 따라서, 인간 모노클로날 항체는 항체 기술 분야에서 존재하는 것으로 일반적으로 인정되는 상당한 기술적 장애물을 극복하는 결과이다. 이러한 항체는 잘 특성화되고 재현 가능하게 만들어 정제할 수 있는 하나의 균질한 분자 종으로서 존재하기 때문에 모노 클로날 항체의 성질은 치료제로서 사용하기에 특히 적합하다. 이러한 요소들은 이러한 분자가 인간에서 치료적 투여를 위한 규제 승인을 획득하려는 경우 매우 중요한, 생물학적 활성을 높은 수준의 정밀도로 예측할 수 있는 생성물을 초래한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질 한 항체의 집단으로부터 얻어지는 항체를 지칭하며, 즉 상기 집단을 포함하는 개개 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연적으로 발생하는 돌연변이 및/또는 번역후 변형 (예를 들면, 이성체화 또는 아미드화)를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원 부위에 대하여 지향된다. 또한, 통상적으로 상이한 결정 인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (다중 클론) 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원상의 단일 결정 인자에 대해 지시된다. 이들의 특이성 외에도, 모노클로날 항체는 다른 면역 글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리하다. 개질제 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되기 때문에 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법으로 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 단일 클론 항체는 Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)에 처음으로 기술된 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(예를 들면, 미국특허 제4,816,567호 참조)에 의해 만들 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들면 Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)에 기술된 기술을 사용하여 페이지 항체 라이브러리(phage antibody libray)로부터 분리할 수 있다.
모노클로날 항체 또는 대응하는 기능적 단편은 인간 항체 또는 대응하는 기능적 단편인 것이 특히 바람직하다. 인간에게 치료적 투여를 목적으로 한 항체 작용제(antibody agent)를 고려하는 경우, 항체가 인간을 기원(origin)으로 하는 것은 매우 유리하다. 인간 환자에게 투여한 후에, 인간 항체 또는 그의 기능적 단편은 환자의 면역계에 의한 강력한 면역원성 반응을 대부분 야기하지 않고, 결국 비인간 단백질인 이물질로는 인식되지 않을 것이다. 이것은 본래로부터 치료 항체의 활성을 차단하고, 및/또는 환자 체내로부터의 치료용 항체의 제거를 가속시켜, 그것에 의해 치료용 항체가 원하는 치료효과를 발휘하는 것을 방해한다. 치료용 항체에 대한 숙주 항체, 즉 환자 항체가 생산되지 않는다는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 약제학적 목적으로 사용되는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 인간과 적어도 하나의 원숭이 종 사이에 교차반응성을 나타낸다. 동일한 종간 교차 반응성은 GM-CSF의 모든 다른 비-항체 또는 비항체-유래된 중화/억제성 화합물의 경우에도 바람직하다.
본 발명의 추가의 실시형태에 따르면, 인간 모노클로날 항체는 IgG 항체일 수 있다. IgG 이소타입은 고도로 특이적인 항원 인식 및 결합에 관여하는 가변성 항체 영역 뿐만 아니라 통상은 내인성으로 생산되는 항체에 존재하고, 어느 경우에는 하나 또는 복수개의 부위에서 당에 의한 수식까지도 존해하는 중 및 경 항체 폴리펩티드 쇄의 불변영역도 포함한다. 이와같은 글리코실화는 일반적으로 IgG 형태의 특징이 있으며, 이들 불변 영역의 부분은 생체내에서 다양한 이펙터(effector) 기능을 유발하는 것으로 알려져 있는 전체 항체의 소위 Fc 영역을 형성한다. 그 외에, Fc 영역은 Fc 수용체에 대한 IgG의 결합을 매개하며, 따라서 생체내에서의 반감기를 연장시킬 뿐만 아니라, Fc 수용체의 존재가 증가하는 부위, 예를 들면 염증 조직에 IgG의 유도를 촉진시킨다. 유리하게는, IgG항체는 IgG1 항체 또는 IgG4 항체이며, 이들의 형태가 바람직한 것은 이들의 작용기전이 생체내에서 특히 잘 이해되고 특징화되어 있기 때문이다. 이것은 특히 IgG1 항체의 경우에 그러하다.
본 발명의 추가적인 실시형태에 따르면, 인간 모노클로날 항체의 기능적 단편은 scFv, 단일 도메인 항체, Fv, VHH 항체, 디아바디(diabody), 탠덤 디아바디(tandem diabody), Fab, Fab' 또는 F(ab)2일 수 있다. 이들 형태는 일반적으로 두 개의 서브클래스로 분류, 즉 단일 폴리펩티드 사슬로 이루어진 것, 및 적어도 두 개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것으로 분류된다. 전자의 서브클래스의 멤버에는 scFv(폴리펩티드 링커(linker)에 결합되어 단일 폴리펩티드 사슬로 된 하나의 VH 영역 및 하나의 VL 영역을 포함함); VHH 항체 (단일 VH 영역을 포함함)와 같은 단일 도메인 항체(단일 항체 가변영역을 포함함)을 포함된다. 후자의 서브클래스의 멤버에는 Fv(하나의 VH 영역 및 하나의 VL 영역을 비공유결합으로 서로 결합하고 있는 별개의 폴리펩티드 사슬로서 포함함); 디아바디(비공유결합으로 결합하고 있는 두 개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 이들 각각은 폴리펩티드 사슬의 각각이 두 개의 항체 가변영역, 통상은 한 개의 폴리펩티드 사슬 당 하나의 VH 및 하나의 VL을 포함하며, 이가 항체 분자가 생기도록 두 개의 폴리펩티드 사슬이 머리-꼬리의 고차구조로 배치되어 있음); 탠덤 디아바디(공유결합으로 결합되어 있으며, 상술한 디아바디의 2배 대형의 호모다이머를 형성하고, 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 면역 글로불린 가변영역, VH 및 VL영역을 포함하는 이중특이적 단일 사슬 Fv 항체); Fab(그 자체가 VL 영역 및 경쇄 불변영역 전체를 포함하는 항체 경쇄 전체를 하나의 폴리펩티드쇄로서 포함하고, 완전한 VH영역 및 중쇄 불변영역의 일부를 포함하는 항체 중쇄의 일부를 별도의 폴리펩티드로서 포함하고, 상기 2개의 폴리펩티드 사슬이 사슬간 이황화 결합에 의해 분자간으로 결합되어 있음); Fab'(추가적인 이황화 결합이 항체 중쇄에 포함되어 있는 것 외에는, 상기 Fab와 동일함); 및 F(ab)2 (2개의 Fab'분자를 포함하고, 각각의 Fab' 분자가 사슬간 이황화 결합에 의해 각각 다른 Fab'분자에 결합되어 있음)이 포함된다. 일반적으로, 상기에 기재되어 있는 타입의 기능적 항체 단편은, 예를 들면 직면하는 특정의 사태에 대한 치료적 투여에 요망되는 항체의 약물동태특성에 맞추어 제작하는 경우에 높은 유연성을 초래한다. 예를 들면, 혈관 싱생이 불량인 것이 알려져 있는 조직(예컨대, 관절)을 치료하는 경우, 조직 침투성의 정도를 증가시키기 위해서, 투여하는 항체의 사이즈를 증가시키기 위해 투여하는 항체의 사이즈를 줄이는 것이 바람직한 경우가 있다. 어떤 환경하에서는 치료용 항체가 체내로부터 제거되는 속도를 증가시키는 것이 바람직한 경우도 있고, 일반적으로 상기 속도는 투여하는 항체의 사이즈를 줄임으로써 가속할 수 있다. 항체 단편은 본 발명의 경우에는 단편이 모 항체의 에피토프 표적의 특이적 결합 특성을 유지하고 있는 한, 즉 항체 단편이 GM-CSF 또는 IL-17에 각각 특이적으로 결합되어 있는 한, 기능적 항체 단편으로 정의된다.
본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편은 1가 단일특이적; 다가 단일특이적, 특히 2가 단일특이적; 또는 다가 다중 특이적, 특히 2가 이중특이적 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 다가 단일특이적, 특히 2가 단일특이적 항체, 예를 들어 상기에 기재되어 있는 바와 같은 완전 인간 IgG는 그와 같은 항체에 의해 행해지는 중화가 친화성 효과(avidity effect), 즉 동일한 항원, 본 명세서 중에서는 GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체의 다수 분자에 대한 동일 항체에 의한 결합을 통해 증강되도록 하는 치료학적 이점을 초래할 수 있다. 여러가지 일가 단일 특이적 형태의 항체 단편은 상기에 기재되어 있다 (예를 들면, scFv, Fv, VHH 또는 단일 도메인 항체). 항체의 다가성 다중 특이적 형태, 특히 이가성 이중 특이적 형태는 하나의 결합 암(arm)이 영장류 GM-CSF/GM-CSF 수용체에 결합하고, 항체의 다른 결합 암이 GM-CSF/GM-CSF 수용체와 상이한 다른 항원에 결합하는 완전 IgG를 포함할 수 있다. 추가의 다가성 다중 특이적 형태, 특히 이가성 이중특이적 형태는 유리하게는 인간 단쇄 이중 특이성 항체, 즉 당해 기술분야에서 일반적으로 알려져 있는 바와 같이 (예를 들면, 항 CD19 x 항 CD3 이중 특이적 단쇄 항체에 대하여는 국제공개 제99/54440호 팜플렛을 참조), 짧은 삽입 폴리펩티드 스페이서에 의해 결합되어 하나의 연속한 폴리펩티드 사슬로 되어 있는 상기에 기재되어 있는 바와 같은 2개의 scFv 실체를 포함하는 재조합 인간 항체 구축물(construct)일 수 있다. 본 명세서에서는 이중 특이적 단쇄 항첸재에 포함되는 이중 특이적 단일 사슬 항체의 하나의 scFv 부분은 상기에서 나타낸 바와 같은 GM-CSF/GM-CSF 수용체에 특이적으로 결합하고, 이러한 이중특이적 단일 사슬 항체의 다른 scFv 부분은 각각 치료적 효과가 있는 것으로 판명하고 있는 다른 항원에 결합한다.
추가의 실시형태에 따르면, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편은, 예를 들어 하나 유기 폴리머, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜("PEG") 및/또는 폴리비닐피롤리돈("PVP")의 하나 또는 복수의 분자로 유도체화될 수 있다. 본 기술분야에 공지되어 있는 바와 같이, 그와 같은 유도체화는 항체 또는 그의 기능적 단편의 약동력학적 성질을 조절하는데 유리할 수 있다. 시스테인 아미노산의 설프하이드릴기(sulfhydryl group)에 의해 부위-특이적 방식으로 항체 또는 이의 기능적 단편과 결합 가능한, PEG-말레이미드로 유도체화된 PEG 분자가 특히 바람직하다. 이들 중에서, 분지 또는 직쇄상의 2OkD 및/또는 40 kD의 PEG-말레이미드가 특히 바람직하다. scFv 단편과 같은 더 작은 인간 항 GM-CSF 항체 단편의 유효분자량을, PEG, 특히 PEG-말레이미드의 하나 또는 복수의 분자를 후자에 결합시킴으로써 증가시키는 것이 특히 유리할 수 있다.
본 발명의 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속하거나 또는 특정한 종으로부터 유래된 항체에서 대응하는 서열과 동일하거나 또는 이에 상동성인 반면, 사슬(들)의 나머지는 다른 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속거나 또는 다른 종으로부터 유래된 대응하는 서열과 동일하거나 이에 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린)뿐만 아니라, 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이러한 항체의 단편를 포함한다 (미국특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). 여기에서 목적한 키메라 항체는 비인간 영장류 (예를 들면, 긴꼬리원숭이(Old World Monkey), 원숭이 등) 및 인간 불변영역 서열로부터 유도된 가변 도메인 항체 결합 서열을 포함하는 "초기(primitized)"의 항체를 포함한다.
비인간 (예를 들면, 뮤린)의 "인간화" 형태는 키메라 면역 글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 거의 인간 서열의 다른 항원 결합 서브 서열이며, 이는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유한다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 인간 면역글로불린 (수용체 항체)이며, 여기서 수용체의 초가변 영역 (또한 CDR)로부터 잔기는 원하는 특이성, 친화성 및 용량을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종 (공여 항체)의 초가변 영역으로부터 잔기로 대체된다. 약간의 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 영역(FR)잔기는 대응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "인간화 항체"는 또한 수여 항체에서나 공여 항체에서나 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 정제하고 최적화하기 위해 행한다. 인간화 항체는 또한 최적으로는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역 글로불린의 일부를 포함할 것이다. 더욱 자세한 것은 Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al ., Nature, 332: 323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)를 참조하라.
본 명세서 중에서 사용되는 바와 같이, 인간 및 비인간 영장류 GM-CSF의 넘버링은 성숙 GM-CSF, 즉 그의 17개 아미노산의 신호배열을 갖지 않는 GM-CSF (상기에 기재되어 있는 인간 및 비인간 영장류종의 양방의 성숙 GM-CSF의 총 길이는 127개 아미노산임)의 넘버링을 일컫는다. 인간 GM-CSF 및 긴팔 원숭이 GM-CSF의 서열은 다음과 같다:
서열번호 49:
Figure 112015032142798-pct00001
예를 들어 레서스 원숭이 및 시모몰구스 원숭이와 같은 마카카 원숭이패미리의 특정 멤버에서 GM-CSF의 서열은 다음과 같다:
서열번호 50:
Figure 112015032142798-pct00002
인간 GM-CSF의 서열은 또한 서열번호 57로 나타낸다. 긴팔 GM-CSF의 서열은 서열번호 58로 나타낸다:
Figure 112015032142798-pct00003
(서열번호 57 및 58)
예를 들어 레서스 원숭이 (서열번호 59) 및 시모몰구스 원숭이(서열번호 60)와 같은 마카카 원숭이 패미리의 특정 멤버에서 GM-CSF의 서열은 다음과 같다:
Figure 112015032142798-pct00004
(서열번호 59 및 60)
항체, 바람직하게는 인간 모노클로날 항체(또는 그의 기능적 단편)이 결합하는 최소한의 에피토프, 유리하게는 불연속 에피토프는 상기 GM-CSF 서열(들)중 굵은 체로 표시되어 있다.
바람직한 실시형태에 따르면, GM-CSF를 중화하는 화합물은 GM-CSF에 결합하는 항체 (바람직하게는 인간 모노클로날 항체) 또는 그의 기능적 단편이다. 보다 바람직하게는 이것은 바람직하게 아미노산 23-27 (RRLLN) 및/또는 아미노산 65-77 (GLR/QGSLTKLKGPL)를 포함하는 GM-CSF의 에피토프에 결합한다. 이들 아미노산 스트레치는 상기 GM-CSF 서열에서 굵은 체로 표시된다. 용어 "에피토프"는 화합물, 예를 들어 항체 또는 그의 기능적 단편이 특이적으로 결합하는 항원 또는 표적 (예를 들면, GM-CSF)상의 부위를 일컫는다. 상기 결합/상호작용은 또한 "특이적 인식"을 정의하는 것으로 이해된다. "에피토프"는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병렬된 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산 모두에 의해 형성될 수 있다. "선형 에피토프"는 아미노산 일차 서열이 인식된 에피토프를 포함하는 에피토프이다. 선형 에피토프는 전형적으로, 예를 들면, 비반복 서열에서 적어도 3 또는 적어도 4, 및 더욱 통상적으로 적어도 5 또는 적어도 6 또는 적어도 7, 예를 들면 약 8 내지 약 10개의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 문맥에서, GM-CSF 에피토프는 불연속 에피토프인 것이 바람직하다. 항체가 2개의 서열 스트레치 23-27 및 65-77 모두에 결합하는 경우에, 에피토프는 "불연속"라고 할 수 있다. 인간 GM-CSF의 2차 구조에서, 아미노산 15-35는 나선 A에 위치하는 반면, 위치 65-77에 대응하는 잔기는 나선 C와 D 사이에 위치한 루프 구조의 일부이다. 분자의 폴딩의 3차원 모델은 서로에 대하여 이들 부위의 밀접한 입체 근접을 나타낸다(또한 국제공보 WO 2006/111353 참조). 본 명세서에서 사용되는 용어 "불연속 에피토프" 서열은 주어진 폴리펩티드 쇄 내에 적어도 두 개의 인접하지 않은 아미노산 서열 스트레치, 여기서는 성숙한 인간 및 비-인간 영장류로서, 항체에 의해 동시적으로 및 특이적으로 결합되는 것으로서 이해되어야 한다. 이 정의에 따르면, 이러한 동시 특이적 결합은 선형 형태의 GM-CSF 폴리펩티드일 수 있다. 여기서, 연장된 루프를 형성하는 성숙한 GM-CSF 폴리펩티드로서, 그의 한 영역이 상기 정렬의 굵은체로 표시된 2개의 서열, 예를 들면 대략 병렬이고 서로 인접한 것을 상상할 수 있다. 이 상태에서 이들은 항체 단편에 의해 특이적으로 및 동시적으로 결합된다. 이 정의에 따르면, 상기 표시된 성숙 GM-CSF의 2개의 서열 스트레치의 동시 특이적 결합은 또한 형태적인 에피토프에 결합하는 항체의 구조를 가질 수 있다. 여기서, 성숙 GM-CSF는 보통 생체내에서 존재하는 것과 같은 그의 3차 구조가 이미 형성되어 있다. 이러한 3차 구조에서, 성숙 GM-CSF의 폴리펩티드 쇄는 상기 표시된 2개의 서열 스트레치를 공간적인 근접성 내로, 예들 들면 성숙한, 접힌 GM-CSF의 특정 영역의 외부 표면 상으로 가져오는 것과 같은 방식으로 접힌 후, 주변 폴리펩티드 서열의 맥락에서 그의 3 차원 구조로 인해 인식되게 된다.
추가의 바람직한 실시형태에서, GM-CSF의 상기 불연속 에피토프 또는 상기 상기 에피토프는 추가로 다음을 포함한다:
아미노산 28-31 (LSRD), 인간 및 비-인간 영장류 GM-CSF의 상기 서열에서 이탤릭체로 표시됨;
아미노산 32-33 (TA), 인간 및 비-인간 영장류 GM-CSF의 상기 서열에서 밑줄로 표시됨; 및/또는
아미노산 21-22 (EA), 인간 및 비-인간 영장류 GM-CSF의 상기 서열에서 밑줄로 표시됨.
바람직한 인간 모노클로날 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편은 구체적으로 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 1-3 뿐만 아니라 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 전장 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 표시하는, 언급된 서열번호 1 내지 48 및 52 내지 56으로 국제 공보 WO2006/111353에 개시된 것들이다.
특히 바람직하게는 서열번호 14로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR2 서열 및 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 14로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR2 서열 및 서열번호 2로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR3을 포함하거나; 또는 서열번호 14로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR2 서열 및 서열번호 3으로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 14로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR2 서열 및 서열번호 4로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 서열번호 14로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR2 서열 및 서열번호 5로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 서열번호 14로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR2 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 14로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR2 서열 및 서열번호 7로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 14로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR2 서열 및 서열번호 8로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 14로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR2 서열 및 서열번호 9로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 14로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR2 서열 및 서열번호 10으로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 14로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR2 서열 및 서열번호 11로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 14로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR2 서열 및 서열번호 12로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 14로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR2 서열 및 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 14로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR2 서열 및 서열번호 56으로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하는 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편이다.
더더욱 바람직하게는, 상기 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 14개 조합 중 임의의 하나는 그의 경쇄 가변 영역에 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 추가로 포함하는 항체 또는 그의 기능적 단편 내에 존재한다.
특히 바람직한 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편은 서열번호 14로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR2 서열 및 서열번호 2로 표시되는 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하고 그의 경쇄 가변 영역에 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 추가로 포함한다. 이 항-GM-CSF 항체는 GM-CSF를 중화하기 위한 가장 바람직한 화합물이고 또한 국제공보 WO　2006/111353에 기술되어 있다.
추가의 실시형태에 따르면, 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편은 그의 경쇄 가변 영역에 서열번호 19로 표시되는 아미노산을 포함한다. 바람직하게는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 52로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 53으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 실시형태에 따르면, 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편은 그의 경쇄 가변 영역에 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 52로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 53으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 실시형태에 따르면, 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편은 그의 경쇄 가변 영역에 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 27으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 52로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역이 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역이 서열번호 53으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편은 그의 경쇄 가변 영역에 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고 그의 중쇄 가변 영역에 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 56 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
추가의 바람직한 실시형태에서 항체는 그의 경쇄에 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 그의 중쇄에 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 그의 경쇄에 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 그의 중쇄에 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 그의 경쇄에 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 그의 중쇄에 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 그의 경쇄에 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 그의 중쇄에 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 그의 경쇄에 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 그의 중쇄에 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 그의 경쇄에 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 그의 중쇄에 서열번호 40으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 그의 경쇄에 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 그의 중쇄에 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 그의 경쇄에 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 그의 중쇄에 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 그의 경쇄에 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 그의 중쇄에 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 그의 경쇄에 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 그의 중쇄에 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 그의 경쇄에 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 그의 중쇄에 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 그의 경쇄에 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 그의 중쇄에 서열번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 그의 경쇄에 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 그의 중쇄에 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 그의 경쇄에 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 그의 중쇄에 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 그의 경쇄에 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 그의 중쇄에 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항-GM-CSF 항체가 GM-CSF를 중화하기 위해 가장 바람직하며 또한 국제공보 WO　2006/111353에 기술되어 있다.
상기 바람직한 실시형태는 항체 분자 및/또는 그의 기능적 단편, 바람직하게는 인간 모노클로날 항체 분자 및/또는 그의 기능적 단편을 제공하는데, 특히 영장류 및 인간 GM-CSF의 활성 중화제로서 특히 유리하다. 이러한 특히 바람직한 실시형태에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편은 하기와 같은 몇가지 이유로 특히 유리하다.
첫째, 이들은 높은 특이성으로 영장류 및 인간 GM-CSF를 인식한다. 즉, 영장류 GM-CSF와 다른 영장류 콜로니와의 혼합물로부터, 이들 바람직한 실시형태에 따른 결합 분자는 영장류 GM-CSF를 현저하게 구별하는 반면, 동일한 환경에서 존재하는 다른 콜로니 자극인자는 인식하지 않는다. 이는 필요한 부분만 약간 수정되어 인간 GM-CSF에게 동일하게 적용된다. 이는 본 실시형태에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편을 인간에게 투여할 때, 원하는 표적에만 특이적으로 결합하여 중화시키는 것이 예상되는 반면, 원하지 않는 다른 표적에는 결합하지도, 중화시키지도 않는 것을 의미한다. 결국, 이는 생체내에서의 치료적 작용 모드에 관하여 고도의 예측성을 부여한다.
둘째, 본 발명의 특히 바람직한 실시형태에 따른 결합제는 영장류 및 인간 비인간 영장류 및 인간 GM-CSF에 상당한 친화성으로 결합한다. "상당한 친화성"은 약 10-6M (KD) 또는 이상의 친화성으로 결합하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 결합은 결합 친화성이 약 10-12 내지 10-8, 10-12 내지 10-9　M, 10-12 내지 10-10　M, 10-11 내지 10-8M, 바람직하게는 약 10-11 내지 10-9　M인 경우 상당한 (또는 높거나 특이적)인 것으로 고려된다. 따라서, 본 발명의 결합제는 바람직하게는 상기 범위 내의 KD를 갖는다. 약 4 x 10-9　M로부터 최소 약 0.04 x 10-9　M까지의 이 주어지는 경우, 약 40 pM에 상응하는 후자가 본 명세서에 기술된 항체 분자에 대해 관찰되었는데, 본 발명의 항체 분자가 상기 범위 내의 KD를 갖는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 항체 분자가 상기 본 명세서에 기술된 바와 같은 KD를 갖는 것이 또한 바람하다. 수성 매질 내에서 상기 분자의 키네틱 온 속도(kinetic on-rate)는 주로 확산에 의해 조절되므로 생리학적 조건하에서 국소 확산 조건이 허용하는 것 이상으로 개선될 수 없기 때문에, 낮은 KD는 주로 키네틱 오프속도(kinetic off-rate; koff)의 결과로서 발생되며, 가장 높은 친화력의 항체 결합제의 경우 약 10-5　s-1이다. 이는 일단 복합체가 한 쪽으로는 이들 실시형태 중 어느 하나에 따른 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능성 단편과 다른 쪽으로는 GM-CSF 사이에 형성된다면, 이들 복합체는 용이하게 분리되지 않거나, 적어도 빠르게 분리되지 않음을 의미한다. 생물학적 활성의 중화제로 사용되는 결합 분자의 경우, 이러한 특성은 매우 유리하며, 그 이유는 중화시키고자 하는 분자(여기에서는 영장류 및 인간 GM-CSF)의 생물학적 활성이 중화 결합 분자에 의해 결합되어 있는 동안에 한해서만 원하는 중화 효과가 통상 지속되기 때문이다. 따라서, 오랜 시간 동안 원하는 표적에 대해 결합을 유지하는 중화 분자는 그에 상응하는 오랜 시간 동안 중화가 지속될 것이다.
항체 또는 그의 기능적 단편이 영장류 및 인간 GM-CSF에 높은 결합 친화성으로 결합하는 것은 추가의 이점을 갖는다. 통상적으로, 항체 또는 이의 기능적 단편은 크기-의존적 방식으로 환자의 혈류에서 제거되며, 더 작은 분자가 더 큰 분자보다 먼저 배출 및 제거된다. 두 개의 폴리펩티드-항체 또는 항체 단편 및 결합된 GM-CSF-의 복합체는 명백하게 항체 단독보다 더 크기 때문에, 상기 언급한 낮은 k off로 인해 치료적 중화제는 GM-CSF에 결합되지 않은 경우보다 더 느리게 환자의 신체에서 배출 및 제거되게 된다. 따라서, 중화 활성의 크기 뿐만 아니라 생체내에서의 지속 기간도 증가하게 된다.
상기 실시형태에 따른 결합제에 대해 측정된 중화 활성은 놀라울 정도로 높다. 하기에서 더욱 자세히 기술하겠지만, GM-CSF-중화 활성은 시험관내에서 TF-1 성장 억제 어세이(Kitamura, T. et al. (1989). J. Cell Physiol. 140, 323-34)를사용하여 측정되었따. 중화력의 지표로서 IC50 값이 측정되었으며, IC50은 TF-1 세포 증식의 억제의 최대의 반을 유발하는데 요구되는 이들 실시형태 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편의 농도를 의미한다. 상기 기재된 인간 모노클로날 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편에 대해, IC50 값은 대략 3　x　10-10　M, 또는 약 0.3　nM로 측정되었다. 따라서, 결합 분자는 영장류 및 인간 GM-CSF의 활성의 매우 강력한 중화제이다.
중화성 항-GM-CSF 항체의 다른 예는 [Li el al., (2006) PNAS 103(10):3557-3562. E10 and G9 are IgG class antibodies]에 기술된 인간 E10 항체 및 인간 G9 항체이다. E10은 GM-CSF에 대해 870 pM의 결합 친화성을 가지고 G9는 GM-CSF에 대해 14 pM의 친화성을 갖는다. 두 항체는 인간 GM-CSF에 대해 특이적이며 TF-1 세포 증식 어세이로 평가한 바와 같이 강한 중화 활성을 보여준다. 다른 예는 국제공보 WO　2006/122797에 개시된 바와 같은 인간 항-GM-CSF 항체이다.
또한 항-GM-CSF 수용체 항체인 GM-CSF 길항체 또는 중화제가 본 발명에서 사용될 수 있다. 이러한 GM-CSF 길항제는 GM-CSF 수용체 알파사슬 또는 베타사슬에 대한 항체를 포함한다. 본 발명에서 사용된 항-GM-CSF 수용체 항체는 상기 설명된 바와 같은 임의의 항체 형태, 예컨대 무손상, 키메라, 모노클론성, 폴리클론성, 항체 단편 또는 유도체, 단일쇄, 인간화된, 인간관계된(humaneered), 등과 같은 형태일 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 항-GM-CSF 수용체 항체의 예는, 예를 들면 중화성 고-친화성 항체이고 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, US Patent 5,747,032 및 Nicola et al., Blood 82:15 1724, 1993를 참조).
적합한 항체에 대한 더욱 추가적인 서열은 명세서에 제공되며 그 전체가 참고로서 포함된다. 항-GM-CSF 항체는 국제공보 WO2006/122797, 국제공보 WO2007/049472, 국제공보 WO2007/092939, 국제공보 WO2009/134805, 국제공보 WO2009/064399, 국제공보 WO2009/038760에서 제공된다. GM-CSF 수용체에 대한 항체는 WO2007/110631에서 제공된다.
요약하면, 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편은 원하는 항원에 대하여 고도의 식별력을 나타내고, 이 항원에 극히 견고하게 그리고 장시간 동안 결합하며, 결합되어 있는 장시간 동안 매우 강력한 중화 활성을 나타낸다. 이와 동시에, 결합제-항원 복합체는 오래 지속되므로 신체로부터 결합제가 천천히 제거되고, 이에 따라 생체내에서의 원하는 치료적 효과의 지속기간이 길어진다. 또한, 바람직하게는 상기 기술된 바와 같이, GM-CSF 수용체를 인식하는 항체에 대해 동일한 특성이 적용된다.
본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 약제학적 조성물이다. 본 발명에 따르면, 용어 "약제학적 조성물"은 환자, 바람직하게는 인간 환자에게 투여하기 위한 조성물을 의미한다. 약제학적 조성물 또는 제형은 보통 활성 성분의 생리학적 활성을 효과적으로 하는 형태로 본 명세서에 기술된 바와 같이 치료적 용도를 위해 대상체에 투여될 수 있다. 통상적으로, 약제학적 조성물은 적합한(즉, 약제학적으로 허용가능한) 형태의 담체, 안정화제 및/또는 부형제를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 비경구적, 경피, 강내, 동맥내, 척수강내 및/또는 비강내 투여를 위한 조성물, 또는 조직으로 직접적인 주사를 위한 조성물을 포함한다. 특히, 상기 약제학적 조성물은 주입(infusion) 또는 주사에 의해 환자에게 투여되는 것이 고려된다. 적합한 조성물의 투여는 다양한 방법, 예를 들면 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소 또는 피부내 투여에 의해 시행될 수 있다. 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 여기에는 인산 완충 식염수, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 다양한 형태의 습윤제, 멸균 용액, 리포좀 등이 포함된다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 공지된 종래 방법에 의해 제형화될 수 있다.
본 실시형태 따르면, 용어 "유효량"은 GM-CSF와 관련된 질환, 예컨대 염증성 및 자가면역 장애의 치료에 효과적인 GM-CSF를 중화하는 화합물의 양을 의미한다.
투여의 바람직한 용량 및 방법은 투여 후 GM-CSF를 중화하는 화합물이 효과적인 용량으로 혈액 내에 존재하도록 하는 것이다. 투여 계획은 질환의 상태를 관찰하고 시험관내 시험에서 GM-CSF를 중화하는 화합물의 혈청 수준을 분석한 후, 투여 간격, 예를 들면, 주 2회 또는 주 1회 내지 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 등을 연장하거나 또는 대안적으로 상응하게 투여 간격을 감소시켜 조정될 수 있다.
약제학적 조성물은 적합한 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 용량 계획은 담당 의사 및 임상적 요인에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 잘 알려져 있는 바와 같이, 임의의 환자에 대한 투여량은 환자의 크기, 신체 표면적, 나이, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적 건강 상태 및 동시에 투여되는 다른 약물 등과 같은 다수의 인자에 의존한다.
비경구 투여용 제제에는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼이 포함된다. 비수성 용매의 예에는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르가 있다. 수성 담체는 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함하며, 이는 식염수 및 완충 매질을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유당화된 링거액 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥내 매질은 유체 영양성 보충액, 전해질 보충액(예, 링거 덱스트로스에 기초한 것들) 등을 포함한다. 또한, 보존제 및 기타 첨가제는, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제, 불활성 가스 등일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 단백질성 담체, 예를 들면 혈청 알부민 또는 면역글로불린 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 인간을 기원으로 한 것이다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 상기에서 기재된 화합물 이외에, 상기 약제학적 조성물을 사용하고자 하는 용도에 따라, 생물학적으로 활성인 제제를 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 제제는 위장관 시스템에 작용하는 약물, 세포증식억제제로서 작용하는 약물, 고뇨산혈증을 방지하는 약물, 면역 반응을 억제하는 약물(예, 코르티코스테로이드), 염증 반응을 조절하는 약물, 순환계에 작용하는 약물 및/또는 본 기술분야에 공지된 사이토카인과 같은 제제일 수 있다.
예를 들어 류마티스성 관절염 (RA)에 대한 GM-CSF를 중화하는 화합물의 효과를 분석하기 위해서, 결과 측정은 약동학, 면역원성, 및 DAS28, ACR20/50/70 및/또는 EULAR 반응 기준으로서 측정된 임상 징후 및 증상을 개선하기 위한 잠재력, 활액 및 골 부종에 대한 MRI 이미징 뿐만 아니라 환자 보고된 결과로부터 선택될 수 있다. ACR은 연성 및 부은 관절의 개수, 통증 척도의 개선, 환자와 의사의 개선의 평가 및 특정 실험실 마커을 요약한 척도이다. ACR20은 임상 징후 및 증상에서의 20% 개선, 예를 들면 연성 또는 부은 관절 계수의 20% 개선 뿐만 아니라 3개의 다른 질환-연관 기준에서의 20% 개선을 달성한 연구 참여자의 비율을 설명한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물과 같은 약물의 개발에 있어서 부딪치는 다른 주요 장애물은 약동학적 특성의 예측가능한 조절이다. 본 목적을 위하여, 약물 후보의 약동학적 프로파일, 즉, 주어진 상태를 치료하기 위한 특정 약물의 능력에 영향을 주는 약동학적 파라미터의 프로파일이 확립된다. 특정 질환 실체를 치료하기 위한 약물의 능력에 영향을 주는 약물의 약동학적 파라미터에는 반감기, 분포 용적, 간의 초회-통과 대사 및 혈청 결합 정도가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 주어진 약제의 효능은 전술한 파라미터 각각에 의해 영향받을 수 있다. "반감기"는 투여된 약물의 50%가 대사, 분비 등과 같은 생물학적 과정들을 통하여 제거되는 시간을 의미한다. "간의 초회-통과 대사(hepatic first-pass metabolism)"는 약물이 간에 최초 접촉시, 즉 간을 통한 약물의 최초 통과가 이루어지는 동안에, 약물이 대사되는 경향을 의미한다. "분포 용적"은, 예컨대 세포내 및 세포외 공간, 조직 및 기관 등과 같은 신체의 다양한 구획들을 통한 약물의 보유 정도 및 이러한 구획들 내에서 약물의 분포를 의미한다. "혈청 결합 정도"는 약물이 알부민과 같은 혈청 단백질들과 상호작용하고 이에 결합하여 약물의 생물학적 활성의 감소 또는 소실을 야기하는 약물의 경향을 의미한다.
또한, 약동학적 파라미터에는 생체이용률, 지체 시간(Tlag), Tmax, 흡수율, 더 많은 개시 및/또는 투여된 약물의 주어진 양에 대한 Cmax가 포함된다. "생체이용률(bioavailability)"은 혈액의 구획에 있는 약물의 양을 의미한다. "지체 시간"은 약물의 투여와 혈액 또는 혈장에서 약물의 검출 및 측정가능함 사이의 지연된 시간을 의미한다. "Tmax"는 약물의 혈중 농도가 최대에 도달한 후의 시간이며, "Cmax"는 주어진 약물을 사용하여 최대로 획득되는 혈중 농도이다. 생물학적 효과에 요구되는 약물의 혈중 또는 조직 농도에 도달하는 시간은 모든 파라미터들에 의해 영향받는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "독성"은 이상 반응(adverse event) 또는 중대한 이상 반응으로 나타나는 약물의 유독한 효과를 가리킨다. 이러한 부작용은 일반적으로 약물의 내약성의 결핍 및/또는 투여 후 국소적 내성의 결핍을 가리킬 수 있다. 또한, 독성은 약물에 의해 야기되는 기형발생 또는 발암 효과를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "안전성", "생체내 안전성" 또는 "내약성(tolerability)"이라는 용어는 투약 직후(국소적 내성) 및 약물의 오랜 복용 기간 동안에 중대한 이상 반응을 유도하지 않는 약물의 투여를 의미한다. "안전성", "생체내 안전성" 또는 "내약성"은, 예컨대 치료 및 후속 조치 기간 동안에 정기적인 시간 간격으로 평가될 수 있다. 측정에는 임상 평가, 예컨대 기관 징후발현, 및 실험실 검사결과 이상의 스크리닝이 포함된다. 임상 평가가 수행될 수 있으며, NCI-CTC 및/또는 MedDRA 표준에 따라 기록되고/코드화되는 정상적인 발견으로 벗어날 수 있다. 기관 징후발현은 알레르기/면역학, 혈액/골수, 심부정맥, 응집 및 예컨대, 이상 반응에 대한 공통용어 기준(Common Terminology Criteria) v3.0(CTCAE)에 제시된 것과 같은 기준을 포함할 수 있다. 테스트될수 있는 실험실 파라미터에는, 예를 들면 혈액학, 임상 화학, 응집 프로파일 및 소변 분석 및 혈청, 혈장, 림프구 또는 척수액, 분비액 등과 같은 다른 체액들의 검사가 포함된다. 따라서, 안전성은, 예컨대 신체 검사, 영상기술(즉, 초음파, X-선, CT 스캔, 자기공명영상(MRI)), 기술적 장치에 의한 다른 측정(즉, 심전도), 활력징후에 의하여, 실험실 파라미터를 측정하고 이상 반응을 기록함으로써 평가될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "유효한 비독성 투여량"은 주요한 독성 효과가 없거나 또는 본질적으로 없이 병적 세포의 감소, 종양의 제거, 종양의 수축 또는 질환의 안정화를 야기하기에 충분히 높은, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 허용 투여량을 가리킨다. 상기 유효한 비독성 투여량은, 예컨대 본 기술분야에 공지된 투여량 단계적 확대 연구에 의하여 결정될 수 있으며, 이는 심각하고 불리한 이상 반응(투여량 제한적 독성, DLT)을 유도하는 투여량 미만이어야 한다.
본 발명의 제제(종종 "물질의 조성물", "조성물", 또는 "용액")으로서 본 명세서에서 또한 지칭됨)은 바람직하게는 액체 및 냉동인 것으로, 바람직하게는 액체, 냉동, 동결건조, 냉동-건조, 분무-건조 및 재구성된 제형과 같은 다양한 물리적인 상태일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "액체 제제"는 실온에서 분리되는 경향 없이 그들 사이에서 구성 분자가 자유롭게 이동하는 것을 특징으로 하는, 액체로 발견되는 물질의 조성물을 의미한다. 액체 제형은 수성 제형이 바람직하며, 수성 및 비-수성 액체을 포함한다. 수성 제형은 용매 또는 주 용매가 물인, 바람직하게는 주사를 위한 물(WFI)인 제형이다. 제형에서 GM-CSF를 중화하는 화합물의 용해는 상기 기술된 바와 같이 균질인 것이 바람직하며, 균질 또는 비균질일 수 있다.
본 발명의 제형에 대해 안정성을 제공하는 경우 임의의 적합한 비-수성 액체가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 비-수성 액체는 친수성 액체이다. 적합한 비-수성 액체의 설명적인 예는 글리세롤, 디메틸 설폭사이드 (DMSO); 폴리디메틸실록산 (PMS); 에틸렌 글리콜들, 예컨대 에틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜("PEG") 200, PEG 300, 및 PEG 400; 및 프로필렌 글리콜들, 예컨대 디프로필렌 글리콜, 트리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 ("PPG") 425 및 PPG 725를 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같은 "혼합된 수성/비-수성 액체 제형"은 물 바람직하게는 WFI의 혼합물, 및 추가의 액체 조성물을 함유하는 액체 제형을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 경우 "제제" 또는 "조성물"은 GM-CSF를 중화하는 화합물(즉, 활성 약물/성분)과 바람직하게는 액체 상태인 의료 제품을 위해 필요한 첨가제 및/또는 화학 성분의 혼합물이다. 본 발명의 제제는 약제학적 제제를 포함한다.
제제의 제조는 약제학적 조성물과 같은 최종 의료 제품을 만들기 위해 활성 약물을 포함하는 상이한 화학 물질을 결합하는 공정을 포함한다. 본 발명의 제형의 활성 약물은 GM-CSF를 중화하는 화합물이다.
특정한 실시형태에서, 제형화되는 GM-CSF를 중화하는 화합물은 본질적으로 순수하고/하거나 본질적으로 균질(즉, 제제와 연관되고/되거나 공정과 연관된 불순물일 수 있는, 오염시키는 물질, 예컨대 단백질 등과 같은 물질이 실질적으로 없음)하다. 용어 "본질적으로 순수한"은 화합물의 중량에 대해 적어도 약 80%, 바람직하게는 약 90%, 바람직하게는 화합물의 중량에 대해 적어도 약 95%, 더욱 바람직하게는 화합물의 중량에 대해 적어도 약 97% 또는 화합물의 중량에 대해 적어도 약 98%, 바람직하게는 모노모성 상태인 화합물을 포함하는 조성물을 의미한다. 용어 "본질적으로 균질한"은 용액 중 다양한 안정화제 및 물의 질량을 제외하고, 화합물의 중량에 대해 적어도 약 99%, 바람직하게는 모노모성 상태인 화합물을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 경우, 용어 "약"은 주어진 값의 5%까지, 10%까지, 15%까지 또는 20% 포함하여 20% 까지일 수 있는 각각의 값 또는 범위(예컨대 pH, 농도, 백분율, 몰농도, 아미노산의 개수, 등)에 변화가 있을 수 있음을 의미한다. 예를 들면, 제제가 화합물의 약 5 mg/ml를 포함하는 경우, 이는 제형이 4와 6 mg/ml 사이, 바람직하게는 4.25와 5.75　mg/ml 사이, 더욱 바람직하게는 4.5와 5.5　mg/ml 사이 및 더더욱 바람직하게는 4.75와 5.25　mg/ml 사이, 그리고 가장 바람직하게는 5　mg/ml의 화합물을 포함할 수 있음을 의미하는 것으로 이해된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "X(부터) 내지 Y"로서 정의되는 간격은 "X와 Y 사이"로서 정의되는 간격과 동일하다. 두 간격 모두 구체적으로 상한치와 또한 하한치를 포함한다. 이것은, 예를 들면, "5 mg/ml 내지 10 mg/ml" 또는 "5 mg/ml와 10 mg/ml 사이"가 5, 6, 7, 8, 9, 및 10 mg/ml 뿐만 아니라 임의의 주어진 중간 값의 농도를 포함하는 것을 의미한다.
"안정한" 제제는 그안에서 GM-CSF를 중화하는 화합물이 저장시 그의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 유지하고/하거나 바람직하게는 색 및/또는 순도의 시각적 검사 시, 또는 UV 산란 광 또는 크기배제 크로마토그래피로 관찰하는 경우 대조군 샘플과 비교할 때 응집, 침전, 단편화, 분해 및/또는 변성을 실질적으로 나타내지 않는 것을 의미한다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 추가의 분석 기술이 당해 기술분야에 이용가능하며, 예를 들면 [Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)에서 리뷰되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 "저장 동안"은 제제가 일단 제조되어 바로 사용되기 보다는; 제조 후, 저장을 위해 액체 형태, 냉동 상태, 또는 액체 형태 또는 다른 형태 내로 나중에 재구성하기 위해 건조 상태로 포장되는 것을 의미한다.
GM-CSF를 중화하는 화합물은 바람직하게는 저장 동안 및/또는 냉동/해동 동안 또는 이후에 및/또는 전단(예컨대, 진탕) 스트레스 동안 또는 이후에 (예를 들면, 하나 이상의 전술된 원인으로 인해) 응집체 또는 단편/분해 산물을 실질적으로 형성하지 않는 안정한 것으로 고려된다. 따라서, 저장 시작 시점 또는 하나 이상의 냉동/해동 사이클이 수행되기 이전 또는 응집체 및/또는 단편을 형성하는 진탕 연구가 수행되기 전에 GM-CSF를 중화하는 화합물의 양과 비교하여, 바람직하게는 GM-CSF를 중화하는 화합물의 최대 10%, 더욱 바람직하게는 최대 8%, 더더욱 바람직하게는 최대 5%, 특히 바람직하게는 최대 2%로 고려된다. 이 안정성은 바람직하게는 적어도 1개월, 적어도 2개월, 또는 적어도 3개월; 바람직하게는 적어도 4개월, 적어도 5개월 또는 적어도 6개월; 더욱 바람직하게는 적어도 9개월 또는 적어도 12개월; 더더욱 바람직하게는 적어도 18개월 또는 적어도 24개월; 및 가장 바람직하게는 적어도 30개월 또는 적어도 36개월 또는 적어도 48개월 또는 적어도 54개월 또는 적어도 60개월의 시간 범위 동안 적용된다. 바람직한 저장 시간 조건은 실온 이하(약 20℃ 내지 약 25℃), 더욱 바람직하게는 약 2-8℃이며, 가장 바람직한 시간 범위는 적어도 3년 또는 심지어 적어도 4년이다. 화합물이 상기 파라미터에 따라 바람직하게는 안정한 경우의 냉동/해동 사이클의 개수는 적어도 1 사이클, 바람직하게는 적어도 2, 3, 또는 4 사이클, 더욱 바람직하게는 적어도 5, 6 또는 7 사이클, 및 가장 바람직하게는 적어도 8, 9 또는 10 사이클이다. 화합물이 상기 파라미터(예컨대, +5℃±3℃의 온도에서, 또한 실시예 12d 참고)에 따라 바람직하게는 안정한 경우 진탕의 일수는 상기 파라미터에 적어도 1일, 바람직하게는 적어도 2, 3, 또는 4일, 더욱 바람직하게는 적어도 5, 6, 또는 7일, 더더욱 바람직하게는 적어도 8, 9, 10 또는 11일 및 가장 바람직하게는 적어도 12, 13, 또는 14일이다.
대안적으로, GM-CSF를 중화하는 화합물은 바람직하게는 다이머, 올리고머 또는 단편을 형성하지 않는 한 안정한 것으로 고려된다. 다르게 말하면, GM-CSF를 중화하는 화합물의 안정성은 낮은 백분율의 분해된(예컨대, 단편화된) 및/또는 응집된 단백질과 함께, 용액 중에 모노머 단백질의 백분율에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 항체와 같은 GM-CSF를 중화하는 화합물을 포함하는 본 발명의 제형은 GM-CSF를 중화하는 화합물의 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 92%, 더더욱 바람직하게는 적어도 95%, 특히 바람직하게는 적어도 98%, 및 가장 바람직하게는 적어도 99% 모노머를 포함할 수 있다.
"응집하다"는 가용성으로 남아 있을 수 있는 공유 또는 비-공유 이량체 또는 올리고머(즉, 높은 분자량 독립체)의 형성을 유도하거나, 또는 용액 밖으로 침전되는 불가용성 응집체를 형성하는 단백질 사이의 물리적 상호작용을 의미한다. 또한 "응집체"는 분해되고/되거나 단편화된 단백질을 포함한다.
본 명세서에서 상기 언급된 바와 같이, 많은 다양한 분석 방법을 사용하여 GM-CSF를 중화하는 화합물을 포함하는 제형에서 응집체의 수준 및 존재를 검출할 수 있다. 이들 방법의 예는, 이들로 제한되지 않지만, 천연 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE), 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE), 모세관 겔 전기영동 (CGE), 크기배제 크로마토그래피 (SEC), 분석적 초원심분리 (AUC), 필드 유동 분획 (FFF), 광산란 검출, 침강 속도, UV 분광법, 시차 주사 칼로리메트리(calorimietry), 비탁법, 혼탁측정법, 현미경, 크기배제-고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC), 역상-고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC), 전기 분무 이온화 텐덤 질량 분광법 (ESI-MS) 및 탠덤 RP-HPLC/ESI-MS, 유동 필드-유동 분획법 및 정적 및/또는 동적 광산란을 포함한다. 이러한 방법은 단독, 또는 조합하여 사용될 수 있다. 바람직하게는, GM-CSF를 중화하는 화합물을 포함하는 제형에서 단편 및/또는 응집체의 수준 및 존재를 검출하는 분석 방법은 크기배제 크로마토그래피, 예컨대 SE-HPLC, 분석적 초원심분리 및 비대칭 필드 유동 분획법이다. GM-CSF를 중화하는 화합물의 생물학적 활성을 결정하는 방법은, 예를 들어 화합물의 (고정화) GM-CSF (또는 GM-CSF 수용체)에 결합하는 정도의 측정이며, 소위 표면 플라즈몬 공명 (SPR)이다.
단백질을 포함하는 제제의 공통적인 장애는 시간, 열, 또는 전단 스트레스로 인한 응집체의 비가역적 축적이다. 전형적으로, 응집체가 침전하는 경우, 응집체는 쉽게 검출가능한 큰 입자를 형성한다. 그러나, 종종 침전의 전구체로부터 큰 입자가 되는 비-공유 가용성 침전물은 검출하고 정량화하기가 더 어렵다. 따라서, 단백질 제형에서 단백질 침전물을 검출하고 정량화하기 위한 방법은 평가되는 응집체의 종류를 기초로 하는 것이 필요하다.
상기 방법 들 중, 단백질 제제 중 가용성, 공유 응집체의 존재 및/또는 양을 측정하기 위해 제안된 방법은 SEC/광 산란법, SDS-PAGE, CGE, RP-HPLC/ESI-MS, FFF 및 AUC이다. 단백질 제형 중 가용성, 비-공유 응집체의 존재 및/또는 양을 측정하기 위해 제안된 방법은 SEC, PAGE, SDS-PAGE, CGE, FFF, AUC, 및 동적 광 산란법이다. 단백질 제제 중 불가용성, 비-공유성 응집체의 존재 및/또는 양을 측정하기 위해 제안된 방법은 UV 분광법, 비탁법, 혼탁측정법, 현미경, AUC, 비대칭 필드 유동 분획 및 동적 광 산란법이다.
또한, 본 발명의 제제는 GM-CSF를 중화하는 화합물이 액체 또는 냉동, 바람직하게는 액체 형태로 저장 기간에 걸쳐 안정할 수 있도록 장기간 저장을 개선시킨다. 본 명세서에서 사용되는, 어구 "장기간" 저장은 제형이 적어도 1개월, 2개월 또는 3개월 이상, 6개월 이상 및 바람직하게는 1년 이상 또는 2년, 3년 또는 4년 또는 5년 이상 동안 저장될 수 있음을 의미하는 것으로 이해된다. 또한, 장기가 저장은 약제학적 조성물이 2-8℃ 또는 주위 온도, 바람직하게는 2-8℃에서 저장되어, 이에 따라 상기 제형이 바람직하게는 본 명세서에 기술된 바와 같은 정도로 그 생물학적 활성을 잃지 않고/않거나 본 명세서에 기술된 바와 같은 정도로 응집체를 형성하지 않고/않거나 본 명세서에 기술된 바와 같은 정도로 단량체를 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 이들 특성에 대한 시험은 본 명세서 다른 곳에서 기술되어 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 제제중에서 GM-CSF를 중화하는 화합물은 적어도 1개월, 2개월, 3개월; 적어도 4개월, 적어도 5개월; 적어도 6개월; 적어도 12개월; 적어도 24개월; 적어도 36개월; 적어도 48개월, 적어도 60개월 동안 액체 형태에서 안정하다. 또한, 상기 언급된 기간에 대한 중간 범위, 예컨대 9개월 등이 본 발명의 부분인 것으로 의도된다. 추가로, 상한치 및/또는 하한치로서 상기 언급된 값의 임의의 조합을 사용하는 값의 범위가 포함되는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 제형은 적어도 1개월 동안 실온(약 20℃ 내지 25℃)에서 안정하고/안정하거나 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 동안 약 2-8℃에서 안정하거나, 또는 더욱 바람직하게는 적어도 2년, 적어도 3년, 적어도 4년 또는 심지어 적어도 5년 동안 약 2-8℃에서 안정하다.
안정성의 다른 중요한 양태는 본 발명에 따른 조성물 내에 GM-CSF를 중화하는 화합물이 저장 기간 동안 및 저장 조건, 특히 온도 및 가능한 온도 변화 내에서 그의 생리학적 활성 및 강도를 유지하는 것이다. 활성 또는 강도는 화합물의 그 자체의 능력 (상기 본 명세서에 설명된 바와 같은, 세포-기반 분석으로 측정될 수 있음) 또는 GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체에 결합하기 위한 GM-CSF를 중화하는 화합물의 능력에 의해 반영된다. 결합 친화성은 SPR 또는 당해 기술 분야에 잘 알려진 다른 방법, 예컨대 Biacore 또는 Scatchard 분석에 의해 평가될 수 있다.
본 발명의 제제는, 예를 들면 본 명세서에 기술된 바와 같은 GM-CSF를 중화하는 화합물에 수성 용액, 완충액 및 장성 조절제를 첨가시켜 제조된다. 당업자는 제제에 포함될 다양한 성분을 결합시키는 것이 임의의 적절함 순서로 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 완충액은 처음, 중간, 또는 마지막에 첨가될 수 있고 또한 장성 조절제는 처음, 중간, 또는 마지막에 첨가될 수 있다. 또한 당업자는 이들 화학물질의 일부가 특정한 조합에서 양립불가능할 수 있고, 따라서 유사한 특성을 가지지만 관련있는 혼합물에서 양립가능한 다른 화학물질로 쉽게 치환될 수 있음을 이해한다.
본 발명의 바람직한 양태에서 제제는 완충액을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "완충액" 또는 "완충제"는 원하는 범위에서 pH를 유지하는 제제를 포함한다. 완충액은 약산과 그의 컨쥬게이트 염기 또는 약한 염기와 그의 컨쥬게이트 산의 혼합물로 구성된 수성 용액이다. 완충액은 적은양의 강산 또는 강염기가 첨가되는 경우 용액의 pH가 거의 변하지 않는 특성을 갖는다. 완충 용액은 매우 다양한 화학적 적용에서 거의 불변한 값으로 pH를 유지하는 수단으로서 사용된다. 일반적으로 본 발명의 제형에서 적용되는 경우 바람직하게는 GM-CSF를 중화하는 화합물을 안정화시킨다.
본 명세서에서 사용되는 경우 "아미노산 완충액"은, 예를 들면 아미노산 염기, 예컨대 히스티딘 및 그의 컨쥬게이트된 염을 포함한다. 아미노산 완충액의 예는 히스티딘/염화 히스티딘이다. 이 예는 바람직하게는 본 명세서에서 적용된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 제제의 바람직한 pH는 다음의 범위로부터 선택될 수 있다: 약 4 내지 약 10, 바람직하게는 약 4 내지 약 6 또는 약 5 내지 약 7, 더욱 바람직하게는 약 5.5 내지 약 6.5, 가장 바람직하게는 pH는 약 또는 정확히 5.8이다. 따라서, 바람직하게는 용액을 pH 5 내지 7로 유지시킬 수 있는 완충액이 사용된다. pH 값/범위의 맥락에서 사용되는 경우 용어 "약"은 바람직하게는 언급된 값 근처 +/- 20%를 갖는 수치값을 의미한다. 약제학적 조성물의 pH가 생리학적 수준 또는 그 근처로 맞춰지는 경우, 투여 시 환자의 편안함은 최대가 된다. pH는 특정 제제에서 GM-CSF를 중화하는 화합물의 안정성 및 가용성을 최대로하기 위해 필요한 바와 같이 조정될 수 있고, 이와 같이 생리학적 범위 바깥의 pH이지만 바람직하게는 환자에게 용인되는 것이 본 발명의 범주에 속한다.
본 명세서에 기술된 제제에서 사용될 수 있는 완충액의 비-제한적인 예는 히스티딘, 숙시네이트, 글루코네이트, 시트레이트, 아르기닌, 라이신, 아스파르트산, 글루탐산, 트리스(트로메타몰), Bis-Tris, MOPS, ACES, TES, HEPES, EPPS, 에틸렌디아민, 인산, 말레산/포스페이트, 2-모르포리노에탄설폰산 (MES), 포스페이트, 아세테이트 및 디에탄올아민을 포함한다.
바람직한 완충액은 히스티딘, 아세테이트 시트레이트 완충액이다. 더욱 바람직하게는 히스티딘 완충액이 본 발명의 제형에 적용되고, 바람직하게는 pH 5 내지 7, 더욱 바람직하게는 pH가 5.5 내지 6.5, 더더욱 바람직하게는 pH 5.8이다. 본 발명에 적용된 완충액은 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 상업적 공급 업체에서 제공하는 공지된 방법에 의해 제조된다.
일부 실시형태에서, 제제는 추가로 수산화 나트륨 (NaOH)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 제제는 1-200 ㎜, 또는 50 mM 미만, 40 mM 미만, 35 mM, 30 미만 mM, 25 mM 미만, 20 mM 미만, 또는 15 mM 미만, 예를 들어 10 mM NaOH 이하, 예컨대 5 mM 또는 1 mM의 수산화 나트륨을 포함한다.
GM-CSF를 중화하는 화합물 및 완충액 이외에, 본 발명에 따른 제제는 또한, 이로 한정되는 것은 아니지만, 완정화 제제(안정화제)를 포함하는 다른 물질을 함유한다.
따라서, 바람직한 양태에서, 제제는 또한 장성 조절제로서 작용할 수 있는 안정화제를 포함한다. 용어 "안정화제"는 제형, 특히 GM-CSF를 중화 화합물의 안정성을 개선하거나 다르게는 향상시키키는 제제를 나타낸다. 장성 조절제인 안정화제는 비-환원성 당, 당 알코올 또는 이들의 조합일 수 있다. 본 발명의 액체 조성물에서 장성 조절제는 용액의 장성, 즉, 용액의 삼투압이 본질적으로 정상적인 생리적 유체와 동일하므로, 조성물과 생리학적 유체 간의 상이한 이온 농도에 기인한 조성물의 빠른 흡수 또는 투여 이후 부종을 방지하는 것이 보장된다. 일반적으로, 본 명세서에 기술된 바와 같은 제제의 성질은 제형의 삼투압이 약 240 내지 약 470 mOsmol/kg, 더욱 바람직하게는 약 300 내지 약 400 mOsmol/kg, 가장 바람직하게는 약 350 mOsmol/kg이 되도록 한다.
바람직하게는, 안정화제/장성 조절제는 하나 이상의 비-환원성 당, 예컨대 수크로스 또는 트레할로스 또는 하나 이상의 당 알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 또한 비-환원성 당 및 당 알코올의 조합이 바람직하다. 특정한 실시형태에서, 상기 조성물에서 안정화제/장성 조절제의 농도는 다음의 범위로부터 선택된다: 1 내지 15% (w/v), 2 내지 10 % (w/v), 3 내지 8% (w/v), 4 내지 6,5% (w/w), 4,5 내지 6%. 본 발명의 제형에 적용될 바람직한 안정화제/장성 조절제는 소르비톨, 바람직하게는 5 % (w/w)이다.
바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 제제는 아미노산(완충액이 히스티딘 완충액과 같은 아미노산 완충액으로부터 선택되는 경우를 제외함) 또는 계면활성제와 같은, 추가의 부형제를 포함하지 않는다.
덜 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 제제는 추가의 부형제를 포함한다. 바람직하게는 부형제는 아미노산, 동결방지제, 동결건조보호제, 계면활성제, 증량제, 항-산화제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 용액 (또한 건조 또는 냉동 형태) 중에 GM-CSF를 중화하는 화합물을 안정화시키는 화학 첨가제, 공-용질, 또는 공-용매로서 또한 지칭되는 부형제가 본 발명의 제제에 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 부형제는 GM-CSF 중화 화합물의 안정성에 기여하지만, 부형제는 달리 제제의 물리적, 화학적, 및 생물학적 특성에 기여할 수 있는 것으로 이해되어 진다. 부형제는 당해 분야에 공지되어 있으며, 상업적 공급 업체에서 제공하는 공지된 방법에 의해 제조된다.
부형제의 예는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 당/폴리올, 예컨대 수크로오스, 락토오스, 글리세롤, 자일리톨, 소르비톨, 만니톨, 말토오스, 이노시톨, 트레할로스, 글루코스; 중합체, 예컨대 혈청 알부민 (소 혈청 알부민 (BSA), 인간 SA 또는 재조합 HA), 덱스트란, PVA, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스 (HPMC), 폴리에틸렌이민, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 하이드록시에틸셀룰로오스 (HEC), 하이드록시에틸전분 (HES); 비 수성 용매, 예컨대 다가 알코올 (예, PEG, 에틸렌 글리콜 및 글리세롤) 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 디메틸포름아미드 (DMF); 아미노산, 예컨대 트레오닌, 세린, 프롤린, 알라닌, 발린, 글루타민, 메티오닌, 시스테인, 이소류신, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 글리신, 히스티딘, 라이신, 페닐알라닌, 류신, 아스파라긴, 트립토판 및 티로신; 계면활성제, 예컨대 트윈-80, 트윈-20, SDS, 폴리 소르베이트, 폴리옥시에틸렌 공중합체; 및 기타 부형제, 예컨대 인산 칼륨, 아세트산 나트륨, 황산 암모늄, 황산 마그네슘, 황산 나트륨, 트리메틸아민 N- 옥사이드, 베타인, 금속 이온(예를 들면, 아연, 구리, 칼슘, 망간, 마그네슘), CHAPS, 모노라우레이트, 2-O-베타-만노글리세레이트 또는 상기의 임의의 조합을 포함한다.
"동결방지제는"는 제조, 냉동, 저장, 처리, 유통, 재구성, 또는 사용 동안 냉동 단백질에 안정성을 제공하는 물질을 포함한다. 특정 양태에서, "동결방지제"는 냉동 과정에서 유도된 스트레스로부터 단백질을 보호하는 성분을 포함한다. 동결방지제는 동결건조보호 효과를 가질 수 있다. 동결방지제의 비-제한적인 예는 당, 예컨대 수크로오스, 글루코오스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨, 만노스 및 락토스; 중합체, 예컨대 덱스트란, 하이드록시에틸 전분, 폴리비닐피롤리돈 (PVP) 및 폴리에틸렌 글리콜; 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (예, PS-20 또는 PS-80); 및 아미노산, 예컨대 글리신, 아르기닌, 류신, 및 세린을 포함한다. 생물학적 시스템에서 낮은 독성을 나타내는 동결방지제가 일반적으로 사용된다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 이당류는 동결건조보호제 또는 동결방지제로서 작용할 수있다. "동결건조보호제"는 동결건조 및 후속 저장 시 단백질의 화학적 또는 물리적 불안정성을 방지 또는 감소시키는 물질을 포함한다. 하나의 양태에서, 동결건조보호제는 물이 건조 과정 동안 조성물로부터 제거되기 때문에 단백질에서 화학적 또는 물리적 불안정을 방지 또는 감소시킨다. 추가의 양태에서, 동결건조보호제는 수소 결합을 통해 단백질의 적절한 형태를 유지하는 것을 도움으로써 단백질을 안정화시킨다.
따라서, 하나의 양태에서, 본 명세서서 기술된 바와 같은 이당류는 냉동 동안 GM-CSF를 중화하는 화합물을 안정화시키는 역할을 할 수 있다. 동결 동안 보호는 이당류의 절대 농도에 의존하기 때문에 [Carpenter et al., Pharm. Res. (1997), 14:969-975], 5 %보다 큰 농도가 안정성을 최대화시키는데 필요할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 동결건조보호제는 본 명세서에 기술된 제제에 첨가된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "동결건조보호제"는, 비정형 유리질 매트릭스를 제공하고 수소 결합을 통해 단백질과 결합함으로써, 건조 공정 동안 제거되는 물 분자 교체하는 냉동-건조 또는 탈수 처리 (일차 및 이차 동결 건조 사이클) 동안 단백질 안정성을 제공하는 제제를 포함한다. 이는 동결 건조 사이클 동안 단백질 분해를 최소화하고, 장기간 안전성을 개선하는 단백질 형태를 유지하는 것을 돕는다. 동결건조보호제는 "동결보호하는 양"으로 미리-동결된 제형에 첨가되는데, 이는 동결보호하는 양의 존재 하에서 GM-CSF를 중화하는 화합물의 동결화 후에, 화합물은 동결화 및 저장 시 본질적으로 물리적 및 화학적 안정성 및 무결성을 유지하고 있다는 것을 의미한다.
동결건조보호제의 비-제한적인 예는 수크로스 또는 트레할로스와 같은 당; 글루탐산 일나트륨, 글리신 또는 히스티딘과 같은 아미노산; 베타인과 같은 메틸아민; 황산 마그네슘와 같은 리오트로픽 염; 3가 이상의 당 알코올과 같은 다가 알코올, 예를 들면, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 및 만니톨; 폴리에틸렌 글리콜; 플루로닉 및 및 이들의 조합을 포함한다. 바람직하게는 동결건조보호제는 안정화제에 대해 상기 기술된 바이다. 제제에 첨가되는 동결건조보호제의 양은 일반적으로 단백질 제제가 동결 건조될 때 단백질의 분해/응집을 허용되지 않을 정도로 초래하지 않는 양이다.
다른 부형제는 계면활성제이다. 용어 "계면활성제는" 일반적으로 공기/용액 인터페이스-유도된 스트레스 및 용액/표면 유도된 스트레스로부터 GM-CSF를 중화하는 화합물을 보호하는 제제를 포함한다. 예를 들어 계면활성제는 단백질 응집을 방지 할 수 있다.
계면활성제의 예는, 제한적이지 않지만, 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트(예를 들면, 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20); 폴록사머 (예를 들면, 폴록사머 188); 트리톤, 소디움 도데실 설페이트 (SDS); 소디움 라우릴 설페이트; 소디움 옥틸 글리코사이드; 라우릴-설포베타인, 미리스틸-설포베타인, 리놀레일-설포베타인, 스테아릴-설포베타인, 라우릴-사르코신, 미리스틸-사르코신, 리놀레일- 사르코신, 스테아릴-사르코신, 리놀레일-베타인, 미리스틸-베타인, 세틸-베타인, 라우로아미도프로필-베타인, 코카미도프로필-베타인, 리놀레아미도프로필-베타인, 미리스트아미도프로필-베타인, 팔미도프로필-베타인, 이소스테아르아미도프로필베타인 (예를 들면, 라우로아미도프로필), 미리스트아르니도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 소디움 메틸 코코일-, 또는 디소디움 메틸 오페일-타우레이트; 및 모나쿠에트(Monaquat) 시리즈 (Mona Industries, Inc., Paterson, NJ.), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌과 프로플렌 글리콜의 공중합체 (예를 들면, 플루로닉, PF68)을 포함한다. 첨가된 계면활성제의 양은, 예를 들면, SEC-HPLC, 또는 고분자량 (HMW) 종 또는 저분자량 (LMW) 종의 백분율을 결정하기 위한 광 엄폐 측정을 이용하여 분석된 바와 같은 허용가능한 수준으로 단백질의 응집을 유지하고, 본 명세서에 기술된 단백질 제형의 입자체의 형성을 최소화하도록 첨가된다.
추가의 바람직한 부형제는 증량제일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "증량제"는 의약품과 직접 상호 작용하지 않고 동결 건조 생성물의 구조를 제공하는 제제를 포함한다. 약제학적으로 엘러건트 케이크(elegant cake)를 제공 할 뿐만 아니라, 증량제는 또한 붕괴 온도 수정, 냉동-해동 보호 제공, 및 장기간 보관을 통한 단백질의 안정성 향상에 관해서 유용한 특성을 부여 할 수 있다. 증량제의 비-제한적인 예는 만니톨, 글리신, 락토오스, 및 수크로스를 포함한다. 증량제는 결정형 일 수 있거나(예: 글리신, 만니톨, 또는 염화 나트륨) 또는 비정질 (예: 덱스트란, 하이드록시에틸전분)일 수 있고 일반적으로 0.5 % 내지 10 %의 양으로 단백질 제형에 사용된다.
바람직하게는, 본 발명의 제제에 적용되는 증량제는 심미적으로 허용가능하거나, 균일하거나, 또는 기계적으로 강한 케이크의 형성을 촉진한다. 증량제는 또한 바람직하게는, 열린 기공 구조의 형성 및 재구성의 용이성과 속도를 촉진한다. 또한 증량제는 바람직하게는 케이크 붕괴, 공융, 또는 잔류 수분의 유지를 감소시키거나 방지한다. 다른 양태에서, 증량제는 바람직하게는 스트레스(예, 물리적 및 화학적 스트레스) 대 GM-CSF를 중화하는 화합물을 보호하는 것을 돕고, 단백질 활성을 유지할 수 있도록 돕는다.
다른 바람직한 부형제는 항산화제이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "항산화제"는 다른 분자의 산화를 둔화시키거나 방지할 수 있는 분자이다. 산화는 물질로부터 산화제로 전자를 전송하는 화학 반응이다. 본 발명의 조성물에 사용하기 위해, 생리학적으로 허용가능한 항산화제가 관심 대상이다. 항산화제는, 제한되지 않지만, 환원제, 아스코르브산 (비타민 C), 리포산, 멜라토닌, 요산, 카로틴, 레티놀, 토코페롤 및 토코트리에놀, 예컨대 α-토코페롤 (비타민 E), 유비퀴논 (조효소 Q) 등 을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제제는 임의로 보존제를 함유할 수 있다. "보존제"는 박테리아 활성을 감소시키기 위해 본 명세서의 제제에 첨가될 수 있는 화합물이다. 보존제의 첨가는, 예를 들어, 다목적 (복수-용량) 제형의 제조를 용이하게 할 수 있다. 잠재적인 보존제의 예는 옥타데실디메틸벤질 염화 암모늄, 염화 헥사메토늄, 염화 벤즈알코늄 (알킬기가 장쇄 화합물인 염화 알킬벤질디메틸암모늄), 및 염화 벤제토늄을 포함한다. 보존제의 다른 유형은 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올과 같은 방향족 알코올, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸을 포함한다. 본 명세서에서 가장 바람직한 보존제는 벤질 알콜이다.
따라서, 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제제는 약 100 ㎎/ml 내지 200 ㎎/ml의 GM-CSF를 중화하는 화합물 및 약 5 내지 약 7의 pH에서, 히스티딘, 아세테이트 및 시트레이트로 구성된 군으로부터 선택되는 완충액을 포함하는 장기간 저장을 위한, 액체, 바람직하게는 수성인, 제제이고, 제형은 안정화제/장성 조절제로서 하나 이상의 수크로스, 트레할로스, 만니톨 및/또는 소르비톨을 추가적으로 포함할 수 있다.
특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 제제는 약 100 ㎎/ml 내지 200 ㎎/ml, 더욱 바람직하게는 약 150 ㎎/ml의 GM-CSF를 중화하는 화합물 및 약 5.5 내지 약 6.5, 더욱 바람직하게는 5.8의 pH에서 약 20 mM 내지 약 40 mM, 더욱 바람직하게는 약 30 mM 농도의 히스티딘을 포함하는 장기간 저장을 위한, 액체, 바람직하게는 수성인 제형이고, 제형은 약 4 % 내지 약 6 %, 더욱 바람직하게는 약 5 % (w/v)의 소르비톨을 추가적으로 포함할 수 있고, 선택적으로 계면활성제, 아미노산 및/또는 NaCl과 같은 추가의 부형제를 포함하지 않을 수 있다.
조성물의 특정한 성분은 당업계에 공지된 대안물질로 상호교환될 수 있음을이해해야한다. 그러나, 당업자는 또한 특정 성분의 포함하는 것이 화학적 양립성, pH, 장성, 및 안정성을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다른 이유로 인해, 다른 성분, 농도, 또는 제제의 제조 방법의 사용을 배제하지 않을 것이라는 점을 이해할 것이다.
본 발명의 액체 제제는 즉시 사용가능한 장치와 같이, 피하 투여를 위해 적합한 낮고 가능한 점도를 갖는 것이 유익하다. 따라서 본 발명에 따른 점도는 바람직하게는 약 50 내지 약 1000 [1/초]의 전단 속도 및 약 20℃의 온도에서 20 mPa*s 이하이다. 더욱 바람직하게는 점도는 상기 조건에서 15 mPa*s 이하이다.
본 명세서에서 언급된 바와 같이, 본 출원은 일반적으로 GM-CSF를 중화하는 화합물을 포함하는 제제에 여러가지 성분을 첨가하는 것이 제제에서 이들 화합물의 응집 및/또는 분해/단편화를 감소시킬 수 있다는 발견에 관한 것이다. 제제에서 GM-CSF를 중화하는 화합물이 응집되거나 분해되는 원인이 무엇인지에 관계없이, 본 명세서에 기술된 바와 같은 성분을 첨가하는 것은 제제에서 GM-CSF를 중화하는 화합물의 응집/단편화가 감소된다. 특정 실시형태에서, 기술된 성분이 첨가는 저장, 증가된 온도에의 노출, 광에 노출, 전단 스트레스에 노출, 계면활성제의 존재, pH 및 이온성 상태, 및 이들의 임의의 조합에 기인한 제제에서의 응집/분해를 감소시킨다.
본 발명자에 의해 밝혀진 조치는 특히 액체 및 냉동 형태로 제형화된 GM-CSF를 중화하는 화합물의 응집 및/또는 분해/단편화를 감소시키는데 사용될 수 있다. 따라서 감소된 응집/단편화는 바람직하게는 액체 형태로 관찰된다. 이는 감소된 응집/분해가 차후 사용을 위해 액체 형태로 직접적으로 저장되거나, 냉동 상태로 저장되고 사용전 해동되거나, 또는 사용 전에 액체 형태 또는 다른 형태로 차후 재구성을 위해 동결건조, 공기-건조된, 또는 분무-건조된 형태와 같이 건조된 형태로 준비되는 경우 또한 관찰될 수 있는 것으로 가정된다.
본 명세서에 기술된 제형은 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 저장 될 수 있는 것으로 고려된다. 비-제한적인 예는 제형을 냉각, 냉동, 동결건조, 및 분무 건조하는 것을 포함하며, 냉각에 의한 저장이 바람직하다.
일부 경우에, 단백질 제제는 저장을 위해 냉동된다. 따라서, 제형은 냉동-해동 사이클을 포함하는 조건 하에서 상대적으로 안정한 것이 바람직하다. 제제의 이러한 안정성을 결정하는 한 가지 방법은 제제의 샘플을 적어도 1회, 예를 들어, 1회, 3회, 5회, 7회 및 10회 이하의 냉동 및 해동 사이클(예를 들면, 약 -80℃ ± 10℃에서 밤새 냉동시키고, 예를 들면 6시간 동안 실온에서 빠르게 해동시키거나 얼음상에서 천천히 해동시킴)에 적용시켜, 냉동-해동 사이클 이후에 축적되는 저분자량 (LMW) 종 및/또는 고분자량 (HMW) 종을 측정하고 이를 냉동-해동 절차 전에 샘플 중에 존재하는 LMW 종 도는 HMW 종의 양과 비교하는 것이다. LMW 또는 HMW 종의 증가는 제형의 일부로 저장된 단백질의 안정성이 감소하였음을 나타낸다. 크기배제 고성능 액체 크로마토 그래피 (SE-HPLC)를 사용하여 LMW 및 HMW 종의 존재를 측정할 수 있다.
바람직하게는, 단백질 제제는 액체로서 저장 될 수있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 다양한 온도를 포함하는 조건 하에서 안정한 액체 제형이 바람직하다. 예를 들어, 제형의 적합성을 결정하는 하나의 방법은 여러 온도(예컨대, 2-8℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 및 50℃)에서 샘플 제형을 저장하고 시간에 따라 축적되는 HMW 및/또는 LMW 종의 양을 모니터링하는 것이다. 시간에 따라 축적되는 HMW 및/또는 LMW의 양이 더 적을수록, 제제에 대한 저장 조건이 더 나은 것이다. 또한, 단백질의 전하 프로파일은 양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피 (CEX-HPLC)에 의해 모니터링 될 수있다. 대안적으로, 제제는 동결건조 후 저장될 수 있다. 제제는 전단 스트레스의 조건 하에서 안정한 것이 더욱 바람직하다. 제제의 적합성을 결정하는 하나의 방법은 수용기에서 제제를 원하는 온도(예컨대, 2-8℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 및 50℃, 바람직하게는 +5℃ ± 3℃)로 진탕기, 예를 들면, 수직 진탕기 상에서 진탕하는 것이다. 수용기(예, 바이알)는 진탕기 상에서 원하는 기간 동인, 예를 들면 14일 이상까지 저장할 수 있고, 동일한 온도에서 진탕없이 저장된 대조군과 비교할 수 있다. 데이터는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 내지 14일 후에 수집할 수 있다. 진탕 저장 후 축적되는 저분자량 (LMW) 종 및/또는 고분자량 (HMW) 종의 양을 측정하고 진탕하지 않은 샘플에 존재하는 LMW 종 또는 HMW 종의 양과 비교할 수 있다. LMW 또는 HMW 종의 증가는 제형의 일부로서 저장된 단백질의 감소된 안정성을 나타낸다. 크기배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)를 사용하여 LMW 및 HMW 종의 존재를 결정할 수 있다.
일부의 경우, 제제는 분무-건조된 후 저장된다. 분무-건조의 경우, 액체 제형은 건조 가스 흐름의 존재 하에서 에어로졸화 된다. 제제 액적으로부터 가스 흐름으로 물이 제거되고, 약물 제제의 건조된 입자가 생성된다. 부형제가 제제 중에 포함되어 (i) 분무-건조 탈수 동안 단백질을 보호하고, (ii) 분무-건조 후 저장 동안 단백질을 보호하고/하거나, (iii) 에어로졸화를 위해 적합한 용액 특성을 부여할 수 있다. 이 방법은 샘플 제형이 용매 중 냉동, 재구성되는 대신에 분무-건조되는 것을 제외하고는 냉동을 위해 상기 기술된 방법과 유사하고, 재구성된 제제는 LMW 종 및/또는 HMW 종의 존재하는지 시험한다. 동결건조되지 않았던 상응하는 샘플 제형과 비교하여 분무-건조된 샘플 중 LMW 또는 HMW 종의 증가는 스프레이-드라이된 샘플에서 감소된 안정성을 나타낸다.
용어 "동결건조된" 또는 "냉동-건조된"은 적어도 90% 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98%의 수분이 제거되는, 동결건조와 같은 건조 절차를 거친 물질의 상태를 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "동결건조"는 먼저 건조 될 재료가 냉동되고, 이어서 진공 환경에서 승화에 의해 얼음 또는 냉동 용매가 제거되는 과정을 의미한다. 저장 시 동결건조된 생성물의 안정성을 향상시키기 위해 부형제 (예, 동결건조보호제)를 동결건조하는 제제에 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "재구성된 제형"은 GM-CSF를 중화 화합물이 희석제에 분산되도록 희석제에 동결건조된 단백질 제제를 용해시켜 제조한 제제를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "희석제"는 약제학적으로 허용가능(인간에 투여하기에 안전하고 독성이 없음)하고 동결건조 후 제제 재구성과 같이, 액체 제제의 제조를 위해 유용한 성분이다. 희석제의 비-제한적인 예는 멸균수, 주사용 정균수 (BWFI), pH 완충 용액(예, 인산염 완충 식염수), 멸균 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액 및/또는 완충액의 수성 용액을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 제제는 치료법에서 사용이 고려된다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 제제를 포함하는 약제학적 조성물(또는 약제)를 고려한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 제제의 치료학적으로 유효량을 투여하는 것을 포함하는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 대상체는 GM-CSF를 중화하는 화합물로 유익하게 치료될 수 있는 질환 또는 장애를 갖는 것이다.
바람직하게는, 본 명세서에 기술된 제형은 GM-CSF를 중화하는 화합물로 예방 및/또는 치료 및/또는 개선될 수 있는 질환의 예방 및/또는 치료에 적용된다.
용어 "대상체"는 살아있는 유기체를 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예는 포유동물, 예를 들면, 인간, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 랫트 및 트랜스제닉 비-인간 동물을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
용어 "유효량" 또는 "유효한 양"은 원하는 효과를 달성하거나 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양으로서 정의된다. 용어 "치료학적 유효량"은 질환 및 그 질환으로 이미 고통받고 있는 환자의 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로서 정의된다. 이러한 사용을 위해 효과적인 양은 대상체의 면역 시스템의 일반 상태 및 의학적 증상의 중등도에 따라 달라질 것이다. 용어 "환자"는 예방 또는 치료적 치료를 받는 인간 및 다른 포유동물 대상체를 포함한다.
제제의 적절한 용량, 또는 치료학적 유효량은 치료되는 상태, 요법 전에 증상의 중증도, 및 환자의 임상 이력 및 치료제에 대한 반응에 의존할 것이다. 적절한 용량은 환자에게 1회 또는 일련의 투여를 통해 투여될 수 있도록 주치의의 판단에 따라 조정될 수 있다. 약제학적 조성물은 단독 치료법 또는 필요에 따란 추가의 요법과 병용하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 특히, 비경구 투여, 즉 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 및/또는 활액내 투여를 위해 유용하고, 피하 투여가 바람직하다. 비경구 투여는 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해 수행될 수 있다.
주사를 위한 약제학적 조성물은 단위 용량 형태, 예를 들면 첨가 보존제와 함께 앰플 또는 다용량 용기로 제공될 수 있다. 또한, 최근 다수의 약물 전달 접근법이 개발되었고 본 발명의 조성물은 이러한 새로운 방법, 예를 들면 inject-ease, Genject, Genen과 같은 인젝터 펜, 및 MediJector와 BioJector 같은 바늘 장치를 사용한 투여에 적합하다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 아직 발견되지 않은 투여 방법에도 적용될 수 있다. 또한, [Langer, 1990, Science, 249: 1527-1533]를 참고한다.
동결건조된 약제학적 조성물은 바람직하게는 활성 성분을 함유하는 바이알로 제공될 수 있다. 하나의 실시형태에서 약제학적 조성물은 추가적으로 재구성을 위한 용액을 포함한다.
약제학적 조성물은 추가의 약제학적으로 허용가능한 성분을 더 포함할 수 있다. 성분이 제제의 원하는 특성에 반대로 영향을 미치지 않는한, [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기술된 것과 같은 다른 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정제가 또한 본 명세서에 기술된 단백질 제제에 포함될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 약제학적 조성물과 양립가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제를 말한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 적용되는 용량 및 농도에서 사용 및 투여 량 및 농 도에서 수용자에게 비독성이며 다음을 포함한다: 장성 조절제; 추가의 완충제; 보존제; 공-용매; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; EDTA와 같은 킬레이트화제; 금속 복합체(예, Zn-단백질 복합체); 폴리에스테르와 같은 생분해성 고분자; 나트륨, 다가 당 알코올과 같은 염-형성 반대 이온; 알라닌, 글리신, 아스파라긴, 2-페닐알라닌 및 트레오닌과 같은 아미노산; 락티올, 스타키오스, 만노오스, 소르보스, 자일로스, 리보스, 리비톨, 미오이니시토스, 미오이니시톨, 갈락토스, 갈락시톨, 글리세롤, 시클리톨 (예를 들면, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜과 같은 당 또는 당 알코올; 글루타티온, 티옥산, 티오글리콜산 나트륨, 티오글리세롤, [알파]-모노티오글리세롤, 및 티오황산나트륨과 같은 환원제를 포함하는 황; 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 다른 면역글로불린과 같은 저분자 단백질; 및 폴리비닐 피롤리돈과 같은 친수성 중합체.
본 명세서에 기술된 제제는 이를 필요로 하는 환자의 장애, 또는 질환의 치료 및/또는 예방 및/또는 경감에 있어서 약제학적 조성물로서 유용하다. 용어 "치료"는 치료적 치료 및 예방 또는 방지적 조치를 모두 나타낸다. 치료는 질환, 질환의 증상, 또는 질환에 대한 소인을 치료, 치유, 완화, 감소, 변경, 해결, 경감, 개선하거나, 또는 영향을 미칠 목적으로, 질환/장애, 질환/장애의 증상, 또는 질환/장애에 대한 소인을 갖는 환자로부터의 조직, 또는 분리된 조직, 신체에 제형을 적용하거나 투여하는 것을 포함한다.
"치료를 필요로 하는"은 이미 장애를 가진 대상 뿐만 아니라, 장애가 방지되어야 하는 대상을 포함한다. 용어 "장애"는 본 명세서에 기술된 단백질 제제를 이용한 치료로 유익할 수 있는 임의의 상태이다. 이는 포유동물이 문제의 장애에 걸리게 하는 병리적 상태를 포함하는 만성 및 급성 질환을 포함한다. 본 명세서에서 치료될 장애의 비-제한적인 예는 바람직하게는 알레르기 및 건선 질환을 포함하는 염증성 및 자가면역성 질환, 뿐만 아니라 관절염 및 천식 장애, 예를 들면, 관절염, 류마티스성 관절염 (RA), 자가면역성 뇌염, 건선, 다발성 경화증, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 및 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 등과 같은 폐 질환; 크론병, 특발성 폐 섬유증 (IPF), 염증성 장 질환 (IBD), 포도막염, 황반 변성, 대장염, 월러(Wallerian) 변성, 항인지질 증후군 (APS), 급성 관상동맥 증후군, 협착, 동맥경화증, 재발성 연골염 (RP), 급성 또는 만성 간염, 실패한 정형외과적 임플란트, 사구체 신염, 루푸스, 아토피성 피부염 및 염증성, 관절성 및 골관절 통증을 포함한다.
알레르기 장애는 알레르기 또는 알레르기 반응에 의해 야기된 임의의 장애이다. 알레르기는 면역 시스템의 과민성 장애이다. 이는 개인의 면역 시스템이 음식, 꽃가루, 곰팡이, 집 먼지, 동물 비듬, 집먼지 진드기와 같은 정상적인 무해한 외래 물질(알레르기원)에 반응하거나 과반응하는 경우 발생한다.
건선은 주로 피부에 영향을 미치는 자가면역 질환이다. 피부 세포 성장 주기가 면역 시스템에 의해 내보내진 잘못된 신호 때문에 빨라지는 것이다. 건선의 종류는 플라크, 물방울양, 역위, 농포성 및 홍피성의 5가지가 있다. 가장 흔한 유형은 플라크 건선으로, 표피(피부)의 최외부 층에 나타나는 붉고 흰 색깔의 비늘로 덮인 패치로 주로 발견된다. 그러나, 일부 환자는 어떠한 피부과적 징후 또는 증상도 가지지 않는다. 상기 장애는 경미한 국소 패치에서부터 전신 범위까지 중증도가 다양한 만성의 재발성 상태이다. 손톱과 발톱이 흔히 영향을 받고(건선성 손발톱 이영양증) 독립된 징후로서 나타날 수 있다. 또한 건선은 건선성 관절염으로 알려진 관절의 염증을 야기할 수 있다.
관절염은 하나 이상의 관절염의 염증을 수반하는 관절 장애의 형태이다. 100가지가 넘는 형태의 관절염이 존재한다. 가장 흔한 형태인 골관절염(퇴행성 관절 질환)은 관절의 외상, 관절의 감염, 또는 나이의 결과이다. 다른 관절염 형태는 류마티스성 관절염, 건선성 관절염 및 다른 관련된 자가면역 질환이다. 패혈성 관절염은 관절 감염에 의해 야기된다.
천식은 많은 세포와 세포내 요소가 역할을 하는 기도의 흔한 만성 염증성 장애이다. 천식은 천명, 기침, 흉통, 및 호흡곤란의 재발성 에피소드를 초래하는 기도 과민성과 연관된다. 이들 에피소드는 보통 널리 퍼져 있지만, 종종 자발적으로 또는 치료에 의해 가역성인 폐 내의 가변적 기류 폐색과 연관된다. 천식은 증상의 빈도, 1초간 노력성 호기량 및 최대 호기 유속에 따라 분류될 수 있다. 천식은 또한 아토피성(외인성) 또는 비-아토피성(내인성)으로서 분류될 수 있다.
GM-CSF를 중화하는 화합물 외에도, 본 발명의 약제학적 조성물은 추가의 치료적 또는 생물학적 활성제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 골관절염과 같은 특정한 적응증의 치료에 유용한 치료 인자(예, 항-메탈로프로티나제, 사이클린 화합물, 사이토카인 길항제, 코르티코스테로이드, TNF 억제제, IL-억제제, 항-혈관신생 억제제, 아그레카나제 억제제, p38 키나제 억제제, 아폽토시스 억제제, 히알루로디나제억제제 및 단백질 가수분해 효소의 억제제로부터 선택되지만, 이들로 제한되지 않는 관절 연골 또는 활액 성분의 파괴와 관련된 하나 이상의 억제제)가 존재할 수 있다. 이들 인플락시맙, 엔타네르셉트(etanercerpt), 아다리무랍(adalimulab), 네레리몬맙(nerelimonmab), 레네르셉트(lenercerpt) 등, 또는 이들의 조합을 포함하여 염증을 제어하는 인자가 또한 조성물의 일부일 수 있다. 또한 상기 약제학적 조성물은 세포 외 매트릭스 성분, 예를 들어 히알루론산 또는 이의 염, 에스테르, 내부 에스테르 및 황화 유도체를 비롯한 유도체, 바람직하게는 히알루론산의 부분적 에스테르를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 제제를 함유하는 키트 (또는 제조 물품) 또는 용기에 관한 것이다. 제제는 바람직하게는 이미 액체 상태 일 수 있다. 그러나, 대안적으로, 이는 바람직하게는 동결건조된 상태일 수 있다. 또한 냉동, 동결건조, 냉동-건조 또는 분무-건조된 상태일 수 있다. 따라서, 제제가 액체가 아닌 다른 상태의 경우, 이는 기술자에 의해 (액체) 수성 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 제형은 동결건조될 수 있으며, 그 후 재구성되어야 할 것이다. 따라서, 키트는 냉동, 동결건조, 냉동-건조 또는 분무-건조된 제형의 재구성을 위한 수단 및/또는 제제를 희석하기 위한 수단 및/또는 제제 또는 약제학적 조성물을 투여하기 위한 수단, 각각, 예를 들어 시린지, 펌프, 인퓨저, 바늘 등과 같은 수단을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 본 발명의 제제를 포함하는 하나 이상의 바이알을 포함할 수 있다. 이 키트는 또한 사용 지침서를 동반할 수 있다.
따라서, 제조 물품은 본 명세서에 기술된 제제를 함유하여 제공되고 바람직하게는 그의 사용을 위한 지침서를 제공한다. 제조 물품은 제제를 함유하기에 적합한 용기를 포함한다. 적합한 용기는, 제한적이지 않지만, 병, 바이알 (예, 이중 챔버 바이알), 시린지 (예, 단일 또는 이중 챔버 시린지), 시험 튜브, 뉴블라이져, 흡입기 (예, 계량 흡입기 또는 건조 분말 흡입기) 또는 저장소를 포함한다. 용기는 유리, 금속 또는 플라스틱 (예, 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리올레핀) 등의 다양한 재료로부터 형성 될 수 있다. 용기는 제형을 담고, 라벨이 붙거나 이를 수반하고, 용기는 재구성 및/또는 사용을 위한 지침을 나타낸다. 라벨은 제제가 피하 투여용으로 유용하거나 의도된 것을 나타낼 수 있다. 제제를 담고 있는 용기는 다회 투여될 수 있는데, 이는 제제의 반복된 투여 (예를 들어, 2-6회 투여)를 가능하게 한다. 제조 물품은 추가로 적절한 희석제 (예, WFI, 0.9 % 염화나트륨, BWFI, 인산염 완충 생리식염수)를 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 제조 물품은 GM-CSF 제제를 중화하는 화합물의 동결건조된 버전을 포함하는 경우, 동결건조된 제제와 희석제의 혼합은 재구성된 제제에 원하는 최종 단백질 농도를 제공할 것이다. 제조 물품은 기타 완충액, 희석제, 필터, 니들, 시린지 및 사용 설명서가 수반된 포장 삽입물을 포함하는 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 포함 할 수 있다.
또한 본 발명의 제제를 전달하는데 사용할 수 장치가 본 발명에 포함된다. 이러한 장치의 예는 주사기, 펜, 임플란트, 무침-주사 장치, 흡입 장치, 및 패치를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다음 항들은 또한 본 발명을 특징으로 한다:
1. 적어도 약 20 mg/ml의 농도로 GM-CSF를 중화하는 화합물, 장성 조절제 및 완충액을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물이 안정한 것인 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 GM-CSF를 중화하는 화합물이 적어도 약 50 mg/ml의 농도로 존재하고, 장성 조절제는 약 1% 내지 약 15% (w/v)의 농도로 존재하며 또한 완충액은 약 10 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재하는 것인 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 장성 조절제가 만니톨, 소르비톨, 수크로스 및/또는 트레할로스로부터 선택되는 것인 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나에 있어서, 상기 완충액이 히스티딘, 아세테이트 및/또는 시트레이트 완충액으로부터 선택되는 것인 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나에 있어서, 상기 GM-CSF를 중화하는 화합물이 적어도 약 100 mg/ml 및 약 200 mg/ml 이하의 농도로 존재하고, 장성 조절제가 약 3% 내지 약 7% (w/v)의 농도로 존재하며 또한 완충액이 약 20 mM 내지 약 40 mM의 농도로 존재하는 것인 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나에 있어서, pH가 약 5 내지 약 7인 것인 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나에 있어서, 상기 장성 조절제가 소르비톨이고 완충액이 히스티딘 완충액인 것인 조성물.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나에 있어서, 계면활성제 또는 아미노산을 함유하지 않는 것인 조성물.
9. 제4항 내지 제7항 중 어느 하나에 있어서, 계면활성제 또는 추가의 아미노산을 함유하지 않는 것인 조성물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나에 있어서, 염화나트륨을 본질적으로 함유하지 않는 것인 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나에 있어서, 임의의 추가적인 부형제를 함유하지 않는 것인 조성물.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나에 있어서, 상기 GM-CSF를 중화하는 화합물이 폴리펩티드, 펩티도미메틱, 핵산 및 소분자로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
13. 제12항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편인 것인 조성물.
14. 제13항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능 단편인 것인 조성물.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 항체가 IgG, IgG1 또는 IgG4 항체인 것인 조성물.
16. 제13항 내지 제15항 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 GM-CSF의 에피토프에 결합하고, 에피토프가 바람직하게는 아미노산 23-27 (RRLLN) 및/또는 아미노산 65-77 (GLR/QGSLTKLKGPL)를 포함하는 것인 조성물.
17. 제16항에 있어서, 상기 에피토프가 하기(i) 내지 (iii)를 추가로 포함하는 것인 조성물:
(ⅰ) 아미노산 28-31 (LSRD);
(ⅱ) 아미노산 32-33 (TA) 및/또는
(iii) 아미노산 21-22 (EA).
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 에피토프가 불연속 에피토프인 것인 조성물.
19. 제13항 내지 제18항 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 그의 중쇄 가변 영역에 서열번호 1-13 내지 56 중 어느 하나로 표시되는 것들로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 것인 조성물.
20. 제19항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역 CDR3의 어느 것은 중쇄 가변 영역에서 함께 존재할 수 있으며, 상기 중쇄 가변영역 CDR1은 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변영역 CDR2는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
21. 제13항 내지 제20항 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 그의 경쇄 가변 영역에 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 것인 조성물.
22. 제13항 내지 제21항 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 그의 경쇄 가변 영역에 서열번호 19, 54 및 55 중 임의의 것으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
23. 제13항 내지 제22항 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 그의 중쇄 가변 영역에 서열번호 20-23, 52 내지 53 중 임의의 것으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
24. 제13항 내지 제23항 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 그의 경쇄 가변 영역에 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고; 그의 중쇄 가변 영역에 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 1-13 내지 56으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 것인 조성물.
25. 제13항 내지 제24항 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 그의 경쇄 가변 영역에 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고; 그의 중쇄 가변 영역에 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 것인 조성물.
26. 제13항 내지 제25항 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 서열번호 34로 표시되는 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호 35-48 중 어느 하나로 표시되는 것으로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
27. 제13항 내지 제26항 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 서열번호 1-48 및 52-56 중 어느 하나로 표시되는 각각의 아미노산 서열에, 바람직하게는 서열번호 1-18 및 56 중 어느 하나로 표시되는 각각의 아미노산 서열에 및/또는 서열번호 19-48 및 52-55 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 내의 골격 영역의 아미노산 서열에 적어도 70%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
i ) 약 100　mg/ml 내지 약 180 mg/ml의 GM-CSF를 중화하는 화합물,
ii) 약 5 % (w/v) 소르비톨,
iii) 약 30 mM L-히스티딘 및
iv) 약 5.8의 pH를 갖는 것,
을 포함하는 조성물.
29. 제28항에 있어서, 약 150　mg/ml의 GM-CSF를 중화하는 화합물을 포함하는 조성물.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 액체, 바람직하게는 수성 조성물인, 조성물.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2-8℃에서 적어도 24개월 또는 실온에서 적어도 28일 동안 안정한 것인 조성물.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 치료법에 사용하기 위한 조성물.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 정맥내 및/또는 피하 투여를 위한 것인 조성물.
34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 알레르기성 및 건선성 장애, 뿐만 아니라 관절성 및 천식성 장애를 포함하는, 염증성 및 자가면역성 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것인 조성물.
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 키트.
본 명세서에 기술된 발명은 이들이 변할 수 있기 때문에 특정의 방법론, 프로토콜, 또는 시약으로 제한되지 않는 것으로 이해하여야 한다. 본 명세서에서 제공된 논의 및 실시예는 단지 특정의 실시형탱를 설명할 목적으로 나타내는 것이지, 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니며, 이들은 전적으로 특허청구범위에 의해 정의된다. 다음 실시예들은 본 발명을 예시할 것이다.
실시예 1: 재료
하기 실시예는 WO 2006/111353에 기술되어 있는, 고 친화성 및 특이성 인간 GM-CSF에 결합하고 이들로 중화되는 인간 모노크로날 IgG1 항체 (이하 "상기 항체"로 언급됨)로 수행하였다. 그의 생성은 WO 2006/111353의 실시예 2에 기술되어 있다. 더욱 구체적으로, 상기 항체는 서열 번호 16, 17, 18, 14, 15 및 2로 표시되는 경쇄 및 중쇄 CDR 서열을 포함한다. 이들 CDR 서열은 각각 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 포함되고, 이들은 각각 서열 번호: 34 및 35로 표시된다. GM-CSF는 인간의 다양한 염증 유발 및 자가면역 질환에서 비정상적으로 과잉 생성되고, 재조합 GM-CSF를 첨가하면 이러한 질환이 악화되는 것으로 나타났다. GM-CSF-중화성 항체로 치료가능한 질환에는 류마티스 관절염 (RA), 천식 및 기타 형태의 폐 염증, 다발성 경화증 (MS) 및 건선이 포함된다.
상기 항체는 생물반응기에서 혈청- 및 단백질-무함유 배지를 사용하여 제조하였다. 단일 바이알의 상기 항체 생산 클론으로부터 생산 발효조의 접종물을 제조하였다. 발효 과정 완료시, 분비 항체를 포함하는 수집물을 여과 처리하여, 상청액으로부터 세포 및 파편을 분리하였다. 상기 수집물의 정제는 HCP, DNA 및 가능한 바이러스를 감소시키는 통상의 크로마토그래피법을 기반으로 한다. 내재 바이러스 불활성화 단계는 하류 과정의 추가 부분이었다. 상기 제형화를 위해, 농도 및 완충액 교체 단계를 수행하였다.
실시예 2: 실험 방법
크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)를 시행하여 상기 항체의 응집 정도를 측정하였다 (HPLC: Agilent 1100 Chemstation; column: Tosoh Biosep TSKgel G4000SWXL). SE-HPLC 방법는 9-포인트 범위 테스트를 수행하여 정량화하였고, 이로부터 정밀도 (6회의 반복주입) 및 직선성 (3차 표준곡선)을 측정하고 시험하였다. 모든 분석은 러닝 버퍼로서 pH 6.6의 100 mM KH2PO4, 200 mM Na2SO4를 사용하여 수행하였다.
표면 플라스몬 공명 (SPR) 방법을 실시하여, 고정된 GM-CSF와의 항체 결합 활성 정도를 측정하였다 (Biacore 3000 / CM5 센서 칩/ HBS-EP 러닝 버퍼). SPR 방법은 9-포인트 범위 테스트를 수행하여 정량화하고, 이로부터 정밀도 (6 회의 반복 주입) 및 직선성 (3차 표준 곡선)을 측정하고 시험하였다.
상기 항체의 응집물 및 분해 생성물 (단편)의 검출을 위해, 환원 및 비환원 SDS-PAGE를 수행하였다.
실시예 3: Ph 및 온도 응력의 효과
3 내지 10 범위의 pH 값에서, 낮은 이온 강도의 스크리닝 완충액 (LISSB: 2 mM 글리신, 2 mM 시트르산, 2 mM HEPES, 2 mM MES, 및 2 mM Tris)에서 상기 항체의 안정성을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 항체 샘플을 14일 동안 55℃에서 각각의 용액에 저장하였다. T0, T7 및 T14(일)에, 상기 샘플을 분석하였다. SPR 분석은, 상기 항체가 pH 4-7에서 가장 안정하다는 것을 나타낸다. SE-HPLC에 의해 분석하는 경우 상기 항체 단량체는 pH 4-6에서 가장 안정한 것으로 나타났다 (T14). T14 샘플의 비환원 및 환원 SDS-PAGE 둘다의 경우, pH 4-6에서 분해 생성물 및 응집물이 단지 최소량으로 형성되는 것으로 나타났다.
실시예 4: 이온 강도 및 온도 응력의 효과
0, 10, 100 및 500 mM NaCl의 존재 하에, 낮은 이온 강도의 스크리닝 완충액 (LISSB)에서 상기 항체의 안정성을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 항체 샘플을 대략 1 mg/ml의 농도로 추가의 NaCl이 포함된 LISSB 용액 (pH 4.5 및 pH 7.5)으로 투석하고, 55℃ 에서 14일 동안 저장하였다. T0, T7 및 T14 (일)에, 상기 샘플을 SE-HPLC 및 SPR에 의해 분석하였다.
HPLC 및 SPR 연구는 염 추가시 항체의 안정성이 악화되고, 그 효과는 pH 7.5에서 보다 pH　4.5에서 더욱 현저하다는 것을 나타낸다. 또한 SE-HPLC 데이터는 pH 4.5에서 증가된 농도의 염 (≥100 mM)으로 상기 항체를 불안정화하는 경우, 대체로 항체의 응집물이 축적된다는 것을 나타낸다. pH 7.5에서, 증가된 농도의 염 (500 mM)으로 상기 항체를 불안정화하는 경우, 대체로 항체의 분해 생성물이 축적되었다. LISSB pH 4.5; 500 mM NaCl에서, 상기 항체의 침전물의 수준 (T7 및 T14 )은 매우 높았다.
실시예 5: 완충액의 효과
pH 5-7의 다양한 완충액에서 상기 항체의 안정성을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 항체 샘플을 대략 1 mg/ml의 농도로 pH 5, 6 및 7의 20　mM 시트르산염 완충액; pH 6 및 pH 7의 20　mM 인산염 완충액; pH 6 및 pH 7의 20　mM 숙신산염 완충액, pH 6 및 pH 7의 20　mM 히스티딘 완충액; 및 pH 5 및 pH 6의 20　mM 아세트산염 완충액의 용액으로 투석하고, 55℃ 에서 14일 동안 저장하였다. T0, T7 및 T14 (일)에, 상기 샘플을 SE-HPLC, SPR, 및 환원 및 비환원 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
SPR 연구, HPLC 단량체 및 응집물 데이터 및 환원 및 비환원 SDS-PAGE는 상기 항체가 pH 5의 아세트산염 완충액, pH　6의 히스티딘 완충액 및 pH　5, 6 및 7의 시트르산염 완충액에서 가장 안정하다는 것을 나타냈다 (T14 데이터).
실시예 6: 아미노산의 효과
상이한 아미노산을 첨가하여, 낮은 이온 강도의 스크리닝 완충액 (LISSB)에서 상기 항체의 안정성을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 항체 샘플을 55℃에서 14일 동안 각 아미노산 250 Mm이 포함된 pH 6의 용액에 저장하였다. T0, T7 및 T14 (일)에, 상기 샘플을 분석하였다. SPR 연구는 특히 글루탐산, 트레오닌, 리신 및 발린에서 다소의 안정화 효과가 있다는 것을 시사하였다 (T14). HPLC 데이터는 아미노산을 첨가하지 않은 참조군에 비하여, 각각 대략 2-3%의 더욱 순수한 단량체 및 약 30%, 31% 및 20% 적은 응집물을 초래하는, 글루탐산, 트레오닌 및 알라닌의 현저한 안정화 효과를 나타내었다.
실시예 7: 당 및 계면활성제의 효과
다양한 당 또는 계면활성제를 첨가하여, 낮은 이온 강도의 스크리닝 완충액 (LISSB)에서 상기 항체의 안정성을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 항체 샘플을 대략 1　mg/ml의 농도로, 추가의 6% (w/v) 당 (D-만니톨, D-소르비톨, 수크로오스, D-만노오스, D-말토오스, D-트레할로오스, D-글루코오스), 0.05% (v/v) Tween　20 또는 0.02% (v/v) Tween　80을 포함하는 LISSB 용액으로 투석하고, 55℃에서 14일 동안 저장하였다. T0, T7 및 T14 (일)에, 상기 샘플을 SE-HPLC, SPR 및 환원 및 비환원 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
SPR 및 HPLC 연구는 D-소르비톨 및 D-만니톨이 항체의 안정성을 각각 20% / 3% (SPR/HPLC 데이타, T14) 및 14% / 4% (SPR/HPLC 데이타, T14) 향상시켰다는 것을 나타냈다. 트레할로오스 및 수크로오스 둘 모두는 효과를 각각 7%　/　0.7% (SPR/HPLC 데이타, T14) 및 6%　/　2% (SPR/HPLC 데이타, T14) 감소시켰다. 또한, HPLC 데이터는, D-소르비톨 및 D-만니톨이 항체 응집물 형성을 각각 43% 및 50% 감소시켰다는 것을 나타내었고, 이는 또한 SDS-PAGE에 의해 수득된 데이터에 의해 뒷받침되었다. 0.05% (v/v) Tween 20 또는 0.02% (v/v) Tween 80은 항체의 안정성을 현저하게 향상시키지 않은 것으로 보인다.
실시예 8: 완충액, 아미노산 및 당의 조합물의 효과
상기 연구에 기초하여, 완충액, 아미노산 및 당의 조합물에서 제형화된 항체 1 mg/ml의 안정성을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 상기 연구들은 pH 5의 20 Mm 아세트산염; pH 6의 20 Mm 히스티딘; 250 mM 글루탐산; 250 mM 트레오닌, 6% (w/v) 소르비톨 및 6% (w/v) 만니톨의 안정화 효과를 나타냈다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 항체를 5.4 mg/ml의 농도에서, 20 mM 완충액, 250　mM 아미노산 및 6% (v/v) 당의 조합 용액으로 제형화하고, 55℃에서 14일 동안 저장하였다. 1xPBS 중의 항체를 대조군으로서 포함시켰다. T0, T7 및 T14 (일)에, 상기 샘플을 SE-HPLC 및 SPR에 의해 분석하였다.
또한, 1xPBS 중의 항체 (5.4 mg/ml)를 포함하는 T0 샘플을 동결 및 해동 감수성에 대해 시험하였다. 저장 바이알을 -20℃의 냉동고에서 천천히 동결시켰다. 동결이 완료된 후, 상기 샘플을 실온에서 해동시켰다. 5 회의 동결-해동 싸이클이 완료될 때까지 이 과정을 반복하였다. 각 샘플을 2 회 및 5 회 싸이클 후 SPR 및 SE-HPLC 회수에 대해 분석하였다.
완충액, 당 및 아미노산의 조합물 (Ac = 아세트산염 완충액, His = 히스티딘 완충액; M = 만니톨; S = 소르비톨)
샘플 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
완충액 Ac x x x x x x x x
Figure 112015032142798-pct00005
His x x x x x x x x
아미노산 Glu x x x x x x
Thr x x x x x x
당 M x x x x x x
S x x x x x x
SPR 데이터는 T14/55℃에서 샘플 5-16의 결합 활성이 T0와 비교하여 >93%이라는 것을 나타낸다. 1xPBS (샘플 17) 및 샘플 1-4 (모두 만니톨 또는 소르비톨이 없음)중 항체에서, 그 수는 각각 62%, 19%, 26%, 91% 및 85%이다. 따라서 SPR 데이타는 만니톨 또는 소르비톨의 첨가에 의해 결합 활성의 안정성이 향상된다는 것을 시사한다. 또한 샘플 1-4는 T7 및 T14에서 노란색을 띠었고, 이는 산화되었다는 것을 시사한다. SE-HPLC 데이타는 최소 수준의 응집물 (3.5%-5.6%) 및 분해 생성물 (4.2%-5.4%)이 샘플 5-8, 11-12 및 15-16에서 나타났음 (T14/55℃ 데이타)을 보여주며, 이는 만니톨 및 소르비톨의 항체 단량체에 대한 안정화 효과를 뒷받침하는 것으로서, 250 mM 트레오닌 첨가에 의한 소폭의 가능한 효과를 나타내는 것이다. 그러나 트레오닌의 효과는 샘플 5-8, 11-12 및 15-16에서 나타난 단량체 수준에 의해 판단된 최소한의 아주 적은 것일 뿐이다 (각각 91.2%, 89.8%, 91.5%, 90.8%, 89.8%, 89.0%, 91.4% 및 90.9%) - 샘플 17 (PBS)의 경우, 그 수치는 80.3%이었다 (T14/55℃ 데이타). 250 mM 글루탐산은 소르비톨 또는 만니톨과 함께 항체 단량체의 안정성에 대해 특히 아세트산염 완충액에서 음의 효과를 나타내었다. 결론적으로, 항체 단량체는 pH　5의 20　mM 아세트산염 완충액 또는 pH　6의 20　mM 히스티딘 완충액 및 6% (w/v) 소르비톨 또는 6% (w/v) 만니톨의 조합물에서 가장 안정한 것으로 보인다.
동결/해동 실험의 SE-HPLC 데이타는 항체 단량체의 안정화에 있어서, 만니톨 보다 소르비톨의 경우가 약간 더 우수한 효과가 있음을 나타낸다. 5 회의 동결/해동 후, 샘플　6 및 8의 단량체 함량은, 샘플 5 및 7의 96.9% 및 96.0%에 비교하여, 각각 98.6% 및 98.4%이었다
실시예 9: 히스티딘 또는 아세트산염 완충액, 소르비톨 또는 만니톨, 및 Tween　20 또는 Tween　80의 조합물의 효과
상기 연구의 안정성 데이타 (특히, pH　5의 20　mM 아세트산염, pH　6의 20　mM 히스티딘, 6% (w/v) 소르비톨 및 6% (w/v) 만니톨의 안정화 효과를 나타냄)에 기초하여, 히스티딘 또는 아세트산염 완충액, 소르비톨 또는 만니톨, 및 Tween　20 또는 Tween　80의 조합물에서 제형화된 항체 10　mg/ml의 안정성을 평가하기 위한 새로운 연구를 수행하였다. 10　mg/ml의 항체 농도에서, 0.02% (w/v) Tween　20 및 0.02% (w/v) Tween　80을 첨가하여, 응집 효과를 추가로 실험하였다.
표 2에 기재된 바와 같이, 첨가제와 함께 pH　5.0의 20　mM 아세트산염 완충액 또는 pH　6.0의 20　mM 히스티딘 완충액의 용액으로 10　mg/ml의 농도로 항체를 제형화하고, 55℃에서 14일 동안 저장하였다. T0, T7 및 T14 (일)에서, SE-HPLC 및 SPR에 의해 샘플을 분석하였다.
또한, 동결 및 용해 감수성에 대해 항체 샘플을 시험하였다. -20℃의 냉동고에서 10　mg/ml의 농도의 항체를 서서히 동결시켰다. 동결이 완료된 후, 상기 샘플을 실온에서 용해시켰다. 3 회 및/또는 5회의 동결 및 용해 싸이클이 완료될때까지 이 과정을 반복하였다. 3 회 및/또는 5 회의 동결 및 용해 싸이클 후, 각 샘플을 SPR 및 SE-HPLC 회수에 대해 시험하였다.
완충액, 당 및 세척제의 조합물 (Ac = 아세트산염 완충액; His = 히스티딘 완충액; M = 만니톨; S = 소르비톨; T20 = Tween　20; T80 = Tween　80)
샘플 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
완충액 Ac x x x x x x
His x x x x x x
당 M x x x x x x
S x x x x x x
세척제 T20 x x x x
T80 x x x x
HPLC 데이타는 0.02% (w/v) Tween　20 및 0.02% (w/v) Tween　80이 항체 단량체의 안정성에 대해 음의 효과를 가졌다는 것을 분명하게 보여주었다. 55℃에서 14일 동안의 저장 후, 세척제 없이 제형화된 항체 중 약 89-90% 단량체가 남았고, 세척제를 첨가하여 제형화된 항체 중에는 약 83-88% 단량체가 남았다. 세척제가 첨가된 경우, 항체 단량체의 손실은 대체로 높은 수준의 항체 응집물 (약 7.6%-10.3%)을 초래하였다. Tween　20 및 Tween　80의 부재의 경우, 항체 응집물은 약 5.2%-6.4%를 구성하였다. 완충 시스템으로서 아세트산염과 히스티딘의 차이가 작을지라도, 히스티딘은 적어도 아세트산염과 동일하게 양호한 것으로 나타났다.
동결 및 용해 실험은 5 회의 동결 및 용해 후, 세척제의, 항체 단량체의 수준에 대한 최소한의 양의 효과도 존재하지 않는다는 것을 시사한다. 그러나, 6% (w/v) 만니톨의 경우와 비교하면, 6% (w/v) 소르비톨을 첨가하여 제형화된 경우에, 항체 단량체가 더욱 안정하였다. 만니톨을 첨가한 경우, 5 회의 동결 및 용해 후, 항체 단량체가 더 많이 응집하였다. 동결 및 용해 실험의 HPLC 데이타는 아세트산염을 사용한 경우와 히스티딘을 사용한 경우에 차이가 없다는 것을 보여주었다.
결론적으로, 항체 단량체의 안정성에 있어서, pH　6.0의 20　mM 히스티딘 및 6% (w/v) 소르비톨을 포함하는 사전-제형물이 최적의 것으로 나타났다.
실시예 10: 20　mM 히스티딘, 6% (w/v) D-소르비톨 사전 제형물의 단기 안정성 평가
최적의 사전-제형물(pre-formulation)로서 pH　6.0의 20　mM 히스티딘, 및 6% (w/v) 소르비톨의 감정에 기초하여, 더욱 고농도의 항체에서 상기 사전-제형물을 평가하기 위한 단기 안정성 실험을 수행하였다.
대략 22, 36, 42, 83 및 118　mg/ml의 농도로, 항체를 상기 용액으로 제형화하였다. 이렇게 제형화된 항체를 5℃ 및 25℃에서 최대 4 주의 기간 동안 저장하였다. T0, T14 및 T28 (일)에, SE-HPLC에 의해 샘플을 분석하였다.
SE-HPLC 데이타는 pH　6.0의 20　mM 히스티딘, 6% (w/v) 소르비톨에서 항체가 안정하다는 것을 분명하게 보여준다. 5℃ 또는 25℃에서 28일 동안의 저장 후 검출된 항체 단량체의 농도는 항상 97% 이상이었으며, 단, 항체 단량체의 농도가 약 96.5%인, 25℃에서 실험된 최고 항체 농도 (118　mg/ml)를 제외하며, 여기서 항체 단량체 농도는 항상 97% 이상이었다. 결과는 도 1에 나타낸다.
실시예 11: 최종 부형제의 미세 조정
상기 실험에서 생성된 데이타에 기초하여, 소르비톨 및 히스티딘을 항체 안정화를 위해 선택하였다. 다음 단계에서, 3 중심 포인트를 포함하고, 30 회로 개별적으로 진행된 "실험 설계" (DOE)를 이용하여, 10 내지 100　mg/ml의 항체 농도에서, pH 값뿐만 아니라 부형제의 양을 미세 조정하였다. 하기와 같은 파라미터의 무작위화 실험 계획을 수행하였다:
항체: 10-55-100 mg/ml
pH: 5-6-7
히스티딘: 10-30-50 mM
소르비톨: 2-6-10 % (w/v)
단기 평가를 위해, 50℃에서 14일 동안 가속 상태 (accelerated condition)에서 샘플에 응력(stress)을 가하였다. 또한, 항체의 모의 저장에 대해, 3 회의 동결 용해 싸이클 (-20℃)을 시행하였다.
결과:
상기 제제의 생리학적 상태를 확인하기 위해, 삼투압을 측정하였다. 항체의 정맥내 또는 피하 적용의 경우, 삼투압의 허용가능 범위는 250 내지 450　mOsmol/kg이다. 도 2에서 나타낸 바와 같이, 상기 제제에서 삼투압은 주로 소르비톨의 양에 의해 조절된다. 저농도 (10-50　mM)의 히스티딘 및 항체 자체의 두 경우 모두 삼투압에 대해 단지 최소한의 영향만을 나타내었다.
소르비톨 및 히스티딘 농도에 대한 삼투압의 의존성은 윤곽 블롯 (contour blot)으로 표시할 수 있다. 상기 블롯은, 생리적 범위에서 삼투압을 유지하기 위해서는, 3% 내지 7% (w/v)의 농도의 소르비톨이 필요함을 보여준다. 생성 데이타는, 다소 높은 삼투압 값 (>400　mOsmol/kg)을 초래하는 약 6%의 소르비톨 농도가 최적의 것이라는 것을 시사한다. 소르비톨이 일부 감소되는 경우, 항체의 안정성에 영향이 없기 때문에, 350　mOsmol/kg의 삼투압을 달성하여, 환자 편의를 증가시키기 위해, 소르비톨 농도를 5% 감소시킬 수 있다.
생성 데이타에 기초하여, 최적 히스티딘 농도를 30　mM로 맞추었다. 10　mM 내지 50　mM의 농도 범위의 히스티딘에서, HP-초에 의해 측정된 바와 같이, 응집 또는 단편화에 대한 영향이 관찰되지 않았다.
항체의 응집은 대체로 농도에 의존적이다. 항체의 농도를 증가시키면, 가속 온도 응력 상태에서 동결/해동 중에, 응집물의 수준이 증가하고, 선명도가 증가하였다. 또한, pH 값이 항체의 단량체 함량에 영향을 미쳤다. pH<6의 가속 응력이 항체의 단편화를 증가시킨 반면, 동결/해동 중에 안정성에는 영향을 미치지 않았으나, 안정성이 약간 좋아진 것이 관찰되었다. pH>6의 pH 값에서, 가속 온도 및 동결/해동 처리의 두 경우 모두에서, HP-SEC 및 선명도 분석을 이용하여, 단량체 함량의 감소를 측정할 수 있을 것이다. 반대 효과와의 균형을 위해, 5.8의 pH가 상기 항체 제제에 가장 적합한 것으로 보인다.
이것은 하기 파라미터의 제제를 생성하였다:
항체 10　mg/ml-55　mg/ml-100　mg/ml
D-소르비톨 5% (w/v)
L-히스티딘 완충액 30 mM (하이드로클로라이드 모노하이드레이트)
pH 5.8 (2M 수산화 나트륨으로 조정함)
또한 상기 조성물의 상태 또는 파라미터는 하기 실시예에서 개시되는 바와 같이 고농도의 항체를 갖는 조성물에 적용할 수 있다.
실시예　12: 안정성 연구
a) 장기간 연구
이 연구는 최고 60 개월의 시험 기간으로 설계되었다. 이 기간 동안, 항체 샘플은 DIN R2 유리 바이알 중에 +5℃±3℃에서 저장되었다. 또한, +25℃±2℃에서의 가속 연구 및 +40℃±2℃에서의 응력 연구를 DIN R2 유리 바이알에서 각각 최고 12 개월 및 6 개월 동안 수행하였다. pH 5.8에서 5%　(w/v) 소르비톨 및 30　mM 히스티딘 모노하이드로클로라이드가 포함된 제제에서, 106　mg/ml 및 145　mg/ml의 농도의 항체를 사용한 실험을 수행하였다.
하기 파라미터를 측정하였다: pH, 삼투압, 농도 (OD280), SE-HPLC에 의한 단량체, 응집물 및 단편의 백분율, 효능 (세포 기반 분석). 결과는 하기 표 3-8에 나타낸다.
+5℃±3℃ (106 mg/ml 항체)에서 안정성 실험
저장 시간 pH 삼투압 농도
(OD280)		 단량체 (M)
응집물 (A)
단편 (F)
SE-HPLC		 효능
(세포 기반 분석)
[개월] - [mOsmol·/kg] [mg·/ml] M / A / F [%] 상대 효능 (참조 표준과 비교)
0 5.83 379 106.51 99.20 0.80 0 0.83
1 5.88 379 103.00 99.18 0.82 0 1.03
3 5.90 379 108.75 99.07 0.93 0 1.23
6 5.89 376 100.05 98.87 1.13 0 0.89
9 5.83 377 102.59 99.01 0.99 0 1.00
12 5.86 387 103.34 98.97 1.03 0 1.01
18 5.87 379 102.49 98.78 1.04 0.18 0.84
24 5.85 377 101.73 98.68 1.11 0.21 1.05
30 5.81 383 102.52 98.55 1.17 0.28 0.83
36 5.84 380 107.78 98.56 1.18 0.25 1.06
42 5.92 384 96.32 98.34 1.11 0.55 1.26
48 5.90 376 94.33 98.54 1.23 0.23 1.03
54 5.86 382 107.67 98.25 1.28 0.47 1.04
60 5.90 379 106.79 98.26 1.26 0.48 0.97
+5℃±3℃ (145 mg/ml 항체)에서 안정성 실험
저장 시간 pH 삼투압 농도
(OD280)		 단량체 (M)
응집물 (A)
단편 (F)
SE-HPLC		 효능
(세포 기반 분석)
[개월] - [mOsmol·kg-1] [mg·mL-1] M / A / F [%] 상대효능 (참조 표준과 비교)
0 5.91 392 143.31 99.10 0.90 0 0.72
1 5.91 393 139.52 99.06 0.94 0 0.95
3 5.93 385 139.44 98.89 1.11 0 1.06
6 5.90 381 145.66 98.79 1.21 0 0.81
9 5.87 383 144.12 98.86 1.14 0 1.07
12 5.89 388 140.52 98.80 1.20 0 1.13
18 5.90 387 143.66 98.62 1.22 0.16 1.09
24 5.85 385 137.07 98.45 1.38 0.17 0.83
30 5.84 387 131.98 98.30 1.42 0.28 0.87
36 5.88 384 148.55 98.35 1.39 0.26 0.99
42 5.94 383 134.11 98.17 1.33 0.50 0.97
48 5.94 385 125.09 98.23 1.50 0.26 1.03
54 5.90 394 150.81 97.94 1.57 0.49 1.04
60 5.90 386 147.01 97.94 1.53 0.53 0.82
+25℃±2℃ (106 mg/ml 항체)에서 안정성 실험
저장 시간 pH 삼투압 농도
(OD280)		 단량체 (M)
응집물 (A)
단편 (F)
SE-HPLC		 효능
(세포 기반 분석)
[개월] - [mOsmol·kg-1] [mg·mL-1] M / A / F [%] 상대 효능 (참조 표준과 비교)
0 5.83 379 106.51 99.20 0.80 0 0.83
1 5.84 385 101.35 98.77 1.06 0.17 1.20
3 5.90 382 107.36 98.15 1.44 0.42 0.92
6 5.85 387 100.14 97.85 1.51 0.64 1.00
9 5.83 374 107.49 94.71 1.49 3.80 1.10
12 5.85 383 106.27 94.71 1.56 3.73 1.30
+25℃±2℃ (145 mg/ml 항체)에서 안정성 실험
저장 시간 pH 삼투압 농도
(OD280)		 단량체 (M)
응집물 (A)
단편 (F)
SE-HPLC		 효능
(세포 기반 분석)
[개월] - [mOsmol·kg-1] [mg·mL-1] M / A / F [%] 상대 효능 (참조 표준과 비교)
0 5.91 392 143.31 99.10 0.90 0 0.72
1 5.90 384 142.84 98.49 1.19 0.31 0.95
3 5.93 386 147.84 98.12 1.50 0.37 1.04
6 5.88 383 134.73 97.62 1.78 0.60 0.78
9 5.91 387 144.59 94.46 1.85 3.69 0.97
12 5.87 387 143.12 94.36 1.90 3.74 1.23
+40℃±2℃ (106 mg/ml 항체)에서 안정성 실험
저장 시간 pH 삼투압 농도
(OD280)		 단량체 (M)
응집물 (A)
단편 (F)
SE-HPLC		 효능
(세포 기반 분석)
[개월] - [mOsmol·kg-1] [mg·mL-1] M / A / F [%] 상대 효능 (참조 표준과 비교)
0 5.83 379 106.51 99.20 0.80 0 0.83
1 5.88 377 102.68 94.66 1.34 3.99 1.05
3 5.89 382 108.60 91.85 2.06 6.09 1.01
6 5.85 378 99.75 87.39 2.46 10.15 0.97
+40℃±2℃ (145 mg/ml 항체)에서 안정성 실험
저장 시간 pH 삼투압 농도
(OD280)		 단량체 (M)
응집물 (A)
단편 (F)
SE-HPLC		 효능
(세포 기반 분석)
[개월] - [mOsmol·kg-1] [mg·mL-1] M / A / F [%] 상대 효능 (참조 표준과 비교)
0 5.91 392 143.31 99.10 0.90 0 0.72
1 5.92 388 136.96 94.96 1.69 3.35 0.77
3 5.91 386 143.07 92.02 2.40 5.58 0.87
6 5.88 388 137.11 86.56 3.33 10.11 0.94
b) 가속 / 응력 연구
규모 확장 후 약물 물질의 비교가능성을 입증하기 위하여, 가속 (25℃) 및 응력(40℃) 상태에서, pH　5.8, 30　mM 히스티딘, 5% 소르비톨의 용액에서 제형화된 165　mg/ml 및 171　mg/ml의 항체 농도를 갖는 약물 물질의 2 배치를 사용하여 수행하였다.
하기 파라미터를 측정하였다: pH, 삼투압, 농도 (OD280), SE-HPLC에 의한 단량체, 응집물 및 단편의 백분율, 효능 (세포 기반 분석). 171　mg/ml의 항체 농도에 대한 결과는 하기 표 9 및 10에 제시하였다.
+25℃±2℃ (171 mg/ml 항체)에서 안정성 실험
저장 시간 pH 삼투압 농도
(OD280)		 단량체 (M)
응집물 (A)
단편 (F)
SE-HPLC		 효능
(세포 기반 분석)
[개월] - [mOsmol·kg-1] [mg·mL-1] M / A / F [%] 비교 효능 (참조 표준과 비교)
0 5.7 -- 169.00 >99.0 0.6 <1% 0.97
2 5.6 -- 171.00 98.3 1.7 <1% 0.92
3 5.7 -- 173.00 98.0 2.0 <1% 1.14
+40℃±2℃ (171 mg/ml 항체)에서 안정성 실험
저장 시간 pH 삼투압 농도
(OD280)		 단량체 (M)
응집물 (A)
단편 (F)
SE-HPLC		 효능
(세포 기반 분석)
[개월] - [mOsmol·kg-1] [mg·mL-1] M / A / F [%] 비교 효능 (참조 표준과 비교)
0 5.7 -- 169.0 >99.0 0.6 <1% 0.97
2 5.6 -- 171.0 92.5 2.9 <5% 0.90
3 5.7 -- 175.0 90.3 3.5 <7% 0.91
c) 동결 / 해동 연구
동결/해동 안정성을 pH　5.8의 30　mM 히스티딘 및 5% 소르비톨의 용액에서 제형화된 106　mg/ml 및 145　mg/ml의 항체 농도에 대해 시험하였다. 항체를 최소 하룻밤 동안 -80℃±10℃에서 동결시켰다. 실온에서 6 시간 동안 용해시켰다. 0, 1, 3, 5, 7 및 10 회의 동결/용해 싸이클을 시행하였다.
하기 파라미터를 측정하였다: pH, 삼투압, 농도 (OD280), SE-HPLC에 의한 단량체, 응집물 및 단편의 백분율, 효능 (세포 기반 분석). 결과는 하기 표 11 및 12에 나타낸다.
-80℃±10℃ (106 mg/ml 항체)에서 동결/해동 안정성 실험
F/T 싸이클 횟수 pH 삼투압 농도
(OD280)		 단량체 (M)
응집물 (A)
단편 (F)
SE-HPLC		 효능
(세포 기반 분석)
[No.] - [mOsmol·kg-1] [mg·mL-1] M / A / F [%] 상대효능 (참조 표준과 비교)
0x 5.86 373 99.07 99.05 0.95 0 0.84
1x 5.86 381 99.37 99.19 0.81 0 1.05
3x 5.89 379 98.23 99.20 0.80 0 1.11
5x 5.87 380 99.69 99.15 0.85 0 1.15
7x 5.86 380 99.96 99.12 0.88 0 1.24
10x 5.87 378 98.94 99.08 0.92 0 0.83
-80℃±10℃ (145 mg/ml 항체)에서의 동결 / 해동 안정성 실험
F/T 싸이클 횟수 pH 삼투압 농도
(OD280)		 단량체 (M)
응집물 (A)
단편 (F)
SE-HPLC		 효능
(세포 기반 분석)
[No.] - [mOsmol·kg-1] [mg·mL-1] M / A / F [%] 상대 효능 (참조 표준과 비교)
0x 5.86 373 133.13 98.94 1.06 0 0.81
1x 5.90 379 132.98 99.11 0.89 0 1.16
3x 5.89 380 134.56 99.09 0.91 0 1.04
5x 5.90 384 132.74 99.07 0.93 0 1.11
7x 5.90 383 134.54 99.03 0.97 0 1.04
10x 5.91 385 132.89 98.96 1.04 0 1.05
d) 진탕 안정성
충진(filling)에서 환자까지의 과정 (예를 들어, 충진, 포장, 운송) 중에, 항체에 대한 전단응력의 영향에 대한 정보를 얻기 위해 연구를 시작하였다. 따라서, pH　5.8의 30　mM 히스티딘 및 5% 소르비톨의 용액에서 제형화된 106　mg/ml 및 145　mg/ml의 농도의 항체를 기본적인 포장 재료의 수직 진탕기 (DIN R2 유리 바이알)에서 이리저리 흔들었다. 대조군 (+5℃±3℃에서 비진탕 저장)과 대비하여, 상기 바이알을 +5℃±3℃에서 최대 14일 동안 진탕기에서 저장하였다. 0, 1, 2, 3, 7 및 14일 후에, 데이타 포인트를 수집하였다.
하기 파라미터를 측정하였다: pH, 삼투압, 농도 (OD280), SE-HPLC에 의한 단량체, 응집물 및 단편의 백분율, 효능 (세포 기반 분석). 결과는 하기 표 13-16에 제시하였다.
진탕 존재하에 +5℃±3℃ (106 mg/ml 항체)에서 진탕 안정성 실험 (shaking stability testing )
저장 시간 pH 삼투압 농도
(OD280)		 단량체 (M)
응집물 (A)
단편 (F)
SE-HPLC		 효능
(세포 기반 분석)
[days] - [mOsmol·kg-1] [mg·mL-1] M / A / F [%] 상대 효능 (참조 표준과 비교)
0 5.86 373 99.07 99.05 0.95 0 0.84
1 5.89 375 96.37 99.07 0.93 0 n.d.
2 5.92 376 99.84 99.04 0.96 0 n.d.
3 5.88 384 99.69 99.04 0.96 0 0.95
7 5.85 377 99.39 99.05 0.95 0 1.00
14 5.89 379 100.14 99.06 0.94 0 0.87
진탕 부존재하에 +5℃±3℃ (106 mg/ml 항체)에서 진탕 안정성 실험
저장 시간 pH 삼투압 농도
(OD280)		 단량체 (M)
응집물 (A)
단편 (F)
SE-HPLC		 효능
(세포 기반 분석)
[days] - [mOsmol·kg-1] [mg·mL-1] M / A / F [%] 상대 효능 (참조 표준과 비교)
0 5.86 373 99.07 99.05 0.95 0 0.84
1 5.93 380 96.54 99.09 0.91 0 n.d.
2 5.94 379 99.60 99.08 0.92 0 n.d.
3 5.86 378 98.98 99.05 0.95 0 0.98
7 5.85 378 98.79 99.02 0.98 0 1.04
14 5.92 384 99.43 99.08 0.92 0 1.13
진탕 존재하에 +5℃±3℃ (145 mg/ml 항체)에서 진탕 안정성 실험
저장 시간 pH 삼투압 농도
(OD280)		 단량체 (M)
응집물 (A)
단편 (F)
SE-HPLC		 효능
(세포 기반 분석)
[days] - [mOsmol·kg-1] [mg·mL-1] M / A / F [%] 상대 효능 (참조 표준과 비교)
0 5.96 382 133.13 98.94 1.06 0 0.81
1 5.92 381 132.32 98.97 1.03 0 n.d.
2 5.94 385 135.31 98.93 1.07 0 n.d.
3 5.89 384 133.54 98.91 1.09 0 0.89
7 5.85 382 132.17 99.01 0.99 0 1.19
14 5.90 384 134.88 98.95 1.05 0 0.98
진탕 부존재하에 +5℃±3℃ (145 mg/ml 항체)에서 진탕 안정성 실험
저장 시간 pH 삼투압 농도
(OD280)		 단량체 (M)
응집물 (A)
단편 (F)
SE-HPLC		 효능
(세포 기반 분석)
[days] - [mOsmol·kg-1] [mg·mL-1] M / A / F [%] 상대 효능 (참조 표준과 비교)
0 5.96 382 133.13 98.94 1.06 0 0.81
1 5.92 382 132.70 98.98 1.02 0 n.d.
2 5.95 383 137.85 98.98 1.02 0 n.d.
3 5.89 385 138.28 98.93 1.07 0 0.71
7 5.88 380 133.11 98.93 1.07 0 1.16
14 5.90 387 135.40 98.93 1.07 0 0.79
e) 결과 및 결론
가속 및 응력 상태를 포함하는 장기간 안정성 연구를 약 106 mg/ml 및 약 145　mg/ml의 항체 농도에서 최고 60 개월 동안 수행하였다. 또한, 가속 및 응력 상태 하의 추가의 안정성 연구를 최고 약 171　mg/ml의 항체 농도에서 수행하였다.
+5℃±3℃에서 60 개월 동안 저장된 샘플은 두 가지 농도 모두에서 2% 미만의 응집을 나타내었고, 표준품과 비교할 경우, 그 효능이 동일하였다.
가속 상태 (+25℃±2℃)에서 12 개월 동안 저장 후, 두 가지 농도 모두 (106　mg/ml 및 145　mg/ml)에서, 2% 미만의 응집이 나타났고, 참조와 비교할 경우, 그 효능이 동일하였다. 응력 상태 (+40℃±2℃)에서 6 개월 동안 저장 후, 두 가지 농도 모두에서, 5% 미만의 응집이 나타났고, 참조와 비교할 경우, 그 효능이 거의 동일하였다.
추가의 가속/응력 연구의 데이타는 25℃ 및 40℃에서 각각 3　개월 및 1　개월 동안 안정하였다. 이것은 상기에서 논의된 바와 같이, 2-8℃에서의 안정성이 106　mg/ml 및 145　mg/ml의 항체 농도에서 수득된 것과 비슷할 것으로 예상할 수 있다.
또한, 항체는 약 106 mg/ml 및 약 145　mg/ml의 항체 시험 농도의 두 가지 경우 모두에서 -80℃±10℃에서 최소 10　회의 동결/용해 싸이클 과정 동안 안정하였다.
마지막으로, 진탕 안정성 연구를 비진탕 대조군과 대비하여, +5℃±3℃의 수직 진탕기에서 14일 동안 시행하였다. 이 기간 동안, pH, 삼투압, 분해, 응집, 단편화, 농도 또는 효능 평가를 위한 파라미터 상에 어떠한 동향도 검출되지 않았다. 진탕은 항체 안정성에 영향이 없는 것으로 나타났다.
상기 데이타에 기초하여, +5℃±3℃에서 최고 약 171 mg/ml의 농도의 경우, 최소 60 개월의 저장 수명이 제안될 수 있다.
실시예 13: 점도 평가
점도를 유동계로 측정하였다. 단일 값의 점도에 의해 정의될 수 없고, 따라서 설정하기 위해 더 많은 파라미터가 필요한 유체의 경우, 유동계를 사용하여, 측정한 다음, 점도계에 적용하였다.
일부 유체의 경우, 점도는 광범위한 전단 속도의 상수이었다 (뉴턴 유체). 일정한 점도가 없는 유체 (비뉴턴 유체)는 단일 숫자로 정의할 수 없다. 비뉴턴 유체는 전단력과 전단 속도 사이에 다양한 다른 상관 관계를 나타내었다. 따라서, 비뉴턴 유체의 경우, 점도는 전단 속도뿐만 아니라 온도에 의존적이다. 점도는 주어진 온도 및 주어진 전단 속도 γ[1/초]에서 밀리 파스칼 *　초 (mPas*s)로 제시된다.
약 150 mg/ml의 항체가 포함된 제제의 점도는 20℃의 온도에서 약 50 내지 약 1000 [1/초]의 전단 속도에서 12　mPas*s 이하이다.
약 150 mg/ml의 항체가 포함된 제제의 점도는 5℃의 온도에서 약 50 내지 약 1000 [1/초]의 전단 속도에서 20　mPas*s 이하이다.
<110> Amgen Research (Munich) GmbH; Takeda GmbH <120> Liquid formulation comprising GM-CSF neutralizing compound <130> IPA150189-DE <150> US61/720,892 <151> 2012-10-31 <150> EP12199191.3 <151> 2012-12-21 <160> 56 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 7A-701 <400> 1 Ser Gly Leu Ile Ala Asn His Met Thr Pro 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 7B1-502 <400> 2 Thr Thr Leu Ile Ser Val Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 L38-A1 <400> 3 Ser Gly Leu Ile Phe Asp Tyr Trp Leu Asp 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 L38-A12 <400> 4 Ser Gly Leu Ile Ile Asp Ala Leu Ser Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 L38-G7 <400> 5 Thr Ser Leu Met Ser Ile Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 L39-D11 <400> 6 Ser 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Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 46 <211> 449 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Heavy Chain with CDR-H3 = Ln4p-65* <400> 46 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Leu Ile Met Asp Lys Leu Asp Asn Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 47 <211> 449 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Heavy Chain with CDR-H3 = Ln4p-90* <400> 47 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Leu Ile Ile Asp Asn Leu Asn Pro Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 48 <211> 449 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Heavy Chain with CDR-H3 = 3077* <400> 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Gly Leu Ile Ala Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 49 <211> 127 <212> PRT <213> human GM-CSF <400> 49 Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val 1 5 10 15 Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr 20 25 30 Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp 35 40 45 Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln 50 55 60 Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met 65 70 75 80 Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys 85 90 95 Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp 100 105 110 Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 115 120 125 <210> 50 <211> 127 <212> PRT <213> macaca GM-CSF <400> 50 Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Gly Thr Gln Pro Trp Glu His Val 1 5 10 15 Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr 20 25 30 Ala Ala Glu Met Asn Lys Thr Val Glu Val Val Ser Glu Met Phe Asp 35 40 45 Leu Gln Glu Pro Ser Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln 50 55 60 Gly Leu Gln Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met 65 70 75 80 Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys 85 90 95 Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Gln Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp 100 105 110 Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 115 120 125 <210> 51 <211> 127 <212> PRT <213> gibbon GM-CSF <400> 51 Ala Pro Ser Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val 1 5 10 15 Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr 20 25 30 Ala Ala Glu Ile Asn Glu Thr Val Glu Val Val Ser Glu Met Phe Asp 35 40 45 Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln 50 55 60 Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met 65 70 75 80 Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys 85 90 95 Ala Thr Gln Ile Ile Ile Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp 100 105 110 Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Gly 115 120 125 <210> 52 <211> 119 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> VH with CDR-H3 7B1-502 <400> 52 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Thr Leu Ile Ser Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 53 <211> 119 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> VH with CDR-H3 3077 <400> 53 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Gly Leu Ile Ala Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 54 <211> 107 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> VL 5-306 <400> 54 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg Asn Ile 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Met Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 55 <211> 107 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> VL 5-306* V-version <400> 55 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg Asn Ile 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Met Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 3077 <400> 56 Ser Gly Leu Ile Ala Val Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10

Claims (15)

  1. 수성 조성물(aqueous composition)로서,
    i ) GM-CSF에 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편이며, 그의 경쇄 가변 영역에서 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하며, 또한 그의 중쇄 가변 영역에서 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 1 내지 13 및 56으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고, 100 mg/ml 이상이며 200 mg/ml 미만의 농도의, GM-CSF를 중화하는 화합물;
    ii) 3 % 내지 7 % (w/v) 농도의 장성 조절제(tonicity modifier)로서, 상기 장성 조절제는 소르비톨인, 장성 조절제; 및
    iii) 20 mM 내지 40 mM 농도의 완충액으로서, 상기 완충액은 히스티딘 완충액인, 완충액;
    을 포함하고, 상기 조성물이 5 내지 7의 pH를 가지며, 상기 조성물이 안정한 것인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 계면활성제 또는 아미노산을 함유하지 않는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    i ) 100 mg/ml 내지 180 mg/ml의, GM-CSF에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편,
    ii) 5 % (w/v)의 소르비톨, 및
    iii) 30 mM의 L-히스티딘을 포함하고,
    iv) 5.8의 pH를 갖는 것인,
    조성물.
  4. 제3항에 있어서, 150 mg/ml의 GM-CSF에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함하는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 그의 중쇄 가변 영역에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 그의 경쇄 가변 영역에서 서열번호 19, 54 및 55로 표시되는 것들 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 그의 중쇄 가변 영역에서 서열번호 20 내지 33, 52 및 53으로 표시되는 것들 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 서열번호 34로 표시되는 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호 35로 표시되는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 2 내지 8℃에서 적어도 24개월 또는 실온에서 적어도 28일 동안 안정한 것인, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 치료법에 사용하기 위한, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 정맥내 및/또는 피하 투여를 위한 것인, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 염증성 및 자가 면역성 질환의 치료에 사용하기 위한, 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 질환이 알레르기성, 건선성, 관절성 및 천식성 질환으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  13. 제1항의 조성물을 포함하는, 키트.
  14. 삭제
  15. 삭제
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