EA032829B1 - Водная композиция, содержащая антитело к gm-csf - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к водным композициям, содержащим человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, связывающиеся с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF), содержащие специфические последовательности CDR, дополнительно содержащим специфический модификатор тоничности и специфический буфер, выбранные из определенной группы, где рН составляет от примерно 5 до примерно 7. Ингредиенты композиции предпочтительно обеспечивают стабильность антитела с точки зрения продолжительного хранения. В предпочтительном аспекте композиция предназначена для применения в терапии, предпочтительно для применения в лечении воспалительных и аутоиммунных расстройств, предпочтительно включающих аллергические и псориатические расстройства, а также артритические и астматические расстройства. Кроме того, предложен набор, содержащий композицию по изобретению.

Description

Настоящее изобретение относится к стабильным жидким композициям, содержащим человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, связывающиеся с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF), содержащие специфические последовательности CDR, дополнительно содержащим специфический модификатор тоничности и специфический буфер, выбранные из определенной группы, где рН составляет от примерно 5 до примерно 7. Ингредиенты композиции предпочтительно обеспечивают стабильность в течение длительного срока хранения и циклов замораживания-оттаивания. В предпочтительном аспекте композиция предназначена для применения в терапии, предпочтительно для применения в лечении воспалительных и аутоиммунных заболеваний, предпочтительно включающих аллергические и псориатические расстройства, а также артритические и астматические расстройства. Кроме того, предложен набор, содержащий композиции по изобретению.

Белки имеют широкий ряд применений в области фармацевтики, ветеринарных продуктов, косметики и других потребительских товаров, продуктов питания, кормов, диагностических средств, промышленной химии и деконтаминации. Иногда такие применения ограничены лимитирующими факторами, присущими самим белкам или налагаемыми окружающей средой или средой, в которой они используются. Такие ограничения могут привести к низкой стабильности белков, изменчивости характеристик или к высокой стоимости. Благодаря появлению биотехнологии можно получать широкий спектр белков для терапевтических применений. После приготовления белковые лекарственные средства, как правило, хранятся до их применения. В связи с тем, что белки обычно больше и сложнее, чем традиционные фармацевтические средства, составление композиции и обработка белковых фармацевтических средств, которые пригодны для хранения, могут быть особенно трудными. Обзоры разработок белковых фармацевтических композиций и обработки см. в Carpenter et al. (1997), Pharm. Res. 14: 969-975; Wang (2000), Int. J. Pharmaceutics 203: 1-60; и Tang and Pikal (2004), Pharm. Res. 21: 191-200.

Несколько факторов следует учитывать в разработке композиций и способов получения белкового фармацевтического средства. Первостепенное значение имеет стабильность белка на некоторых или всех стадиях приготовления, отгрузки и обработки, которые могут включать получение композиции, замораживание, лиофилизацию, сушку, хранение, отгрузку, разведение, циклы замораживания/оттаивания и хранение после разведения у конечного пользователя. Другие возможные соображения включают простоту и экономность приготовления, обработки и распределения; состав конечного продукта для введения пациенту и простоту использования конечным пользователем, включающую растворимость лиофилизированного препарата при разведении.

Жидкие композиции могут соответствовать определенным целям. Возможные преимущества жидких композиций включают простоту и экономичность приготовления и удобство для конечного пользователя. Часто при хранении в течение длительных периодов времени полипептиды являются нестабильными в растворе (Manning et al. (1989), Pham. Res. 6: 903-918). Соответственно, были разработаны дополнительные стадии обработки для обеспечения более длительного срока годности, включающие сушку, например лиофилизацию. Лиофилизированные композиции могут также обеспечить определенные преимущества. Возможные преимущества лиофилизации включают повышенную стабильность белка, а также простоту и экономичность отгрузки и хранения. Однако лиофилизированные фармацевтические композиции могут быть менее удобными для конечного пользователя.

В дополнение к выбору основной формы композиции (например, лиофилизированная, жидкая, замороженная и т. д.) оптимизация белковой композиции обычно включает варьирование компонентов композиции и их соответствующих концентраций для максимизации стабильности белка. Ряд факторов может влиять на стабильность белка, в том числе ионная сила, рН, температура, циклы замораживания/оттаивания, сдвиговые силы, замораживание, лиофилизация, сушка, перемешивание и растворение. Белковая нестабильность может быть вызвана физической деградацией (например денатурацией, агрегацией или осаждением) или химической деградацией (например, дезамидированием, окислением или гидролизом). Оптимизация компонентов композиции и концентраций основана исключительно на эмпирических исследованиях и/или рациональных подходах к преодолению источников нестабильности.

Иногда при длительном хранении фармацевтических композиций, содержащих полипептиды, в том числе водные и лиофилизированные композиции, активные пептиды могут быть потеряны из-за агрегации и/или деградации.

Соответственно, типичные приемы улучшения стабильности полипептида могут заключаться в изменении концентрации элементов в композиции или в добавлении эксципиентов для модификации композиции (патенты US 5580856 и 6171586 и патентные заявки US 2003/0202972, 2003/0180287). Патент US 5580856 представляет собой патент-прототип, раскрывающий такие агенты, как природные полимеры, поверхностно-активные вещества, сульфатированные полисахариды, белки и буферы, которые могут быть добавлены для стабилизации сухого белка во время или после регидратации. Однако в отличие от многих вариантов в патенте US 5580856 не указано, какой стабилизатор должен быть добавлен для какого белка. Соответственно, хотя читатель-специалист осознает наличие таких многих вариантов, он или она должны будут найти для его/ее белка наилучшие условия среди многих вариантов, описанных в US 5580856. Патентная заявка US 2003/0202972 описывает стабильную лиофилизированную композицию анти-Her2 антитела, где стабилизатором является сахар, трегалоза или буфер. Однако хотя эти стабили

- 1 032829 заторы могут быть пригодны для антител, их нельзя экстраполировать на другие белки. Патентная заявка US 2003/0180287 аналогична 2003/0202972 в том, что она также описывает стабильный раствор иммуноглобулин-подобного белка, т.е. белка, содержащего Fc-домен. Стабилизатором может быть фосфат натрия, фосфат калия, цитрат натрия или калия, малеиновая кислота, ацетат аммония, Трис-буфер, ацетат, диэтаноламин, гистидин, лизин или цистеин. Среди этих химически отдаленных стабилизаторов, которые могут быть выбраны читателем-специалистом, подходящим оказался лизин. Однако подобно US 2003/0202972 этот конкретный стабилизатор подходит только для конкретного белка, здесь белка, содержащего Fc-домен, и не может быть экстраполирован per se на другой белок. Соответственно, использование добавок нельзя экстраполировать от конкретного белка на другой неродственный белок. Действительно, использование добавок - при улучшении хранения - все же может привести к неактивным полипептидам. Кроме того, в случае лиофилизации стадия регидратации может внести условия, которые приведут к инактивации полипептида в результате, например, агрегации или денатурации (Hora et al. (1992), Pharm. Res., 9: 33-36; Liu et al. (1991), Biotechnol. Bioeng., 37: 177-184). В действительности, агрегация полипептидов является нежелательной, так как она может привести к иммуногенности (Cleland et al. (1993), Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 10: 307-377; и Robbins et al. (1987), Diabetes, 36: 838845).

Сохранение биологической активности во время разработки и приготовления фармацевтических продуктов зависит от собственной устойчивости макромолекулы, а также от используемых методов стабилизации. Существует целый ряд методов стабилизации белка, включая добавление химических стабилизаторов к водному раствору или суспензии белка. Например, в патенте US 4297344 раскрыта стабилизация факторов коагуляции II и VIII, антитромбина III и плазминогена при нагревании путем добавления отдельных аминокислот. В патенте US 4783441 раскрыт способ стабилизации белков путем добавления поверхностно-активных веществ. В патенте US 4812557 раскрыт способ стабилизации интерлейкина-2 с использованием человеческого сывороточного альбумина. Способы замораживания/оттаивания, в которых препарат смешивают с криопротектором и хранят при очень низких температурах, представляют собой другой способ стабилизации белка. Однако не все белки выдерживают цикл замораживания/оттаивания. Холодное хранение с добавкой криопротектора, как правило глицерина, представляет собой еще один вариант. Можно также использовать хранение в форме стекла, как описано в патенте US 5098893. В этом случае белки растворяют в водорастворимых или набухающих в воде веществах, которые находятся в аморфном или стеклообразном состоянии. Наиболее широко используемый способ стабилизации белков представляет собой сублимационную сушку или лиофилизацию. Когда достаточная стабильность белка не может быть достигнута в водном растворе, лиофилизация обеспечивает наиболее реальную альтернативу. Одним недостатком лиофилизации является то, что она требует сложной обработки, занимает много времени и дорого стоит. Кроме того, при неосторожном осуществлении лиофилизации большинство препаратов, по меньшей мере частично, денатурирует на стадиях замораживания и обезвоживания этого метода. Результатом является частая необратимая агрегация части молекул белка, делающая композицию неприемлемой для парентерального введения.

В принципе, деградация белков хорошо описана в литературе, но хранение и растворимость соединений, нейтрализующих гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (далее называемый GM-CSF), в частности полипептидов и анти-GM-CSF антител, не были описаны.

Кроме того, хотя в данной области техники было известно, что имеется множество вариантов стабилизаторов белков, а также агентов, позволяющих использовать высокую концентрацию белка при сохранении стабильности, до настоящего изобретения не было известно в данной области техники, что композиция, содержащая соединения, нейтрализующие GM-CSF, в высоких концентрациях, может быть нестабильной и нуждается в улучшении.

При приготовлении фармацевтической композиции, содержащей белок, такой как антитело, например моноклональное антитело, целью является разработка жидких композиций с высокой концентрацией из-за возможного подкожного введения, которое является более удобным для пациента. Однако существует общее мнение, что разработка высококонцентрированных композиций антител, в частности моноклональных антител, поднимает серьезные проблемы в отношении физической и химической стабильности моноклональных антител, такие как повышенное образование растворимых, а также нерастворимых агрегатов, которые повышают вероятность иммунного ответа, а также приводят к низкой биологической активности.

Образование агрегатов полипептидом при хранении жидкой фармацевтической композиции может отрицательно влиять на биологическую активность этого полипептида, что приводит к потере терапевтической эффективности фармацевтической композиции. Кроме того, образование агрегатов может вызвать другие проблемы, такие как закупорка системы трубок, мембран или насосов при введении полипептидсодержащих фармацевтических композиций с использованием инфузионной системы. Кроме того, сообщается, что высококонцентрированные композиции антител приводят к повышенной вязкости, тем самым создавая серьезные проблемы для возможности их приготовления и введения. Высоковязкие композиции трудно приготовить, втянуть шприцем и инъецировать. Применение силы при манипулировании с вязкими композициями приводит к чрезмерному пенообразованию, что может привести к денату

- 2 032829 рации и инактивации активных моноклональных антител.

Следовательно, существует высокая потребность в стабильной высококонцентрированной белковой фармацевтической композиции, содержащей соединение, нейтрализующее GM-CSF, например антитело, и имеющей низкую и подходящую вязкость, которая пригодна для подкожного введения, например в готовом к применению устройстве. Кроме того, с точки зрения пациента было бы очень желательно иметь продукты, стабильные при комнатной температуре. На данный момент, в частности, на рынке нет композиций антител, для которых возможно хранение при комнатной температуре в течение срока годности лекарственного средства. Обычно происходит увеличение агрегации белка, приводящее к неприемлемо высокому уровню агрегатов и белковых примесей, что может привести к иммуногенным реакциям. Многие из имеющихся на рынке продуктов на основе моноклональных антител содержат поверхностно-активные вещества в своем составе. Обычно поверхностно-активные вещества добавляют для того, чтобы уменьшить межфазное напряжение, которое может вызвать агрегацию белка и образование частиц, приводящее к неприемлемому качеству продукта. Примерами межфазного стресса может быть контакт белка с 1) воздухом, 2) материалом крышки контейнера, таким как резиновый поршень, поршень, стекло, предварительно заполненные шприцы, 3) материалами, связанными с приготовлением, такими как стальные резервуары, трубки и насосы, 4) льдом при замораживании/оттаивании и т.д. Однако поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты, обычно содержат остатки перекисей, которые могут окислять молекулу белка, что приводит к сомнительному качеству продукта. Кроме того, с производственной точки зрения добавление полисорбатов требует дополнительной стадии в производстве, поскольку ультра/диафильтрацию сложно выполнить, когда композиция содержит указанные полисорбаты. Предотвращение образования окисленных продуктов представляет собой сложную задачу, следовательно, требуется аккуратное обращение с полисорбатами, чтобы контролировать образование окисленных продуктов. Таким образом, также желательно разработать композиции без поверхностно-активных веществ, как с точки зрения стабильности, так и приготовления.

Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), первоначально определенный как гемопоэтический фактор, как совсем недавно было показано, является важным цитокином при воспалении и аутоиммунитете. Повышенные уровни мРНК или белка GM-CSF измеряют в различных местах воспаления, в том числе у пациентов с аллергией и псориазом, у пациентов с артритом и бронхиальной астмой. Многочисленные исследования in vivo за последние несколько лет показали, что блокада GM-CSF с помощью нейтрализующих антител может предотвратить или даже вылечить провоспалительные заболевания в различных моделях воспаления, в том числе в моделях артрита, экспериментального аутоиммунного энцефалита, псориаза и заболевания легких. Следовательно, очень желательно иметь доступную композицию с соединением, нейтрализующим GM-CSF, которая, в частности, является стабильной, содержит большое количество соединения, нейтрализующего GM-CSF, и/или может быть введена подкожно.

Таким образом, технической задачей, стоящей перед настоящим изобретением, является удовлетворение описанных выше потребностей.

Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этих потребностей и, таким образом, предлагает в качестве решения указанной технической задачи воплощения, касающиеся композиций, а также способов и применений этих композиций в лечении субъектов, страдающих от заболеваний, для которых полезно введение соединений, нейтрализующих GM-CSF. Эти воплощения охарактеризованы и описаны в данном описании изобретения, проиллюстрированы на примерах и отражены в формуле изобретения.

Следует отметить, что при использовании в данном описании изобретения формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, ссылка на антитело включает одно или более таких разных антител, а ссылка на метод включает ссылку на эквивалентные стадии и методы, известные специалистам в данной области техники, которые могут быть модифицированы или заменены методами, описанными в настоящем документе.

Если не указано иное, термин по меньшей мере, предшествующий ряду элементов, следует понимать, как относящийся к каждому элементу в серии. Специалистам в данной области техники понятны, или они имеют возможность установить, используя не более чем рутинное экспериментирование, многочисленные эквиваленты конкретных воплощений изобретения, описанных здесь. Предполагается, что такие эквиваленты охватываются настоящим изобретением.

В данном описании и следующей за ним формуле, если контекст не требует иного, слово содержать и такие варианты, как содержит и содержащий, следует понимать, как означающее включение указанного целого, или стадии, или группы целых или стадий, но не исключение любого другого целого, или стадии, или группы целых или стадий. При использовании в данном описании термин содержащий может быть заменен термином включающий или иногда при использовании в данном описании изобретения термином имеющий или даже может быть заменен термином состоящий из.

При использовании в данном описании изобретения состоящий из исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не указанные в пункте формулы изобретения. При использовании в данном описании изобретения по существу, состоящий из не исключает вещества или стадии, которые существенно не влияют на основные и новые характеристики пункта формулы изобретения. В каждом случае в

- 3 032829 данном описании любой из терминов состоящий, по существу, из и состоящий из могут быть заменены друг другом.

При использовании здесь термин и/или между несколькими перечисленными элементами следует понимать, как охватывающие и отдельные и комбинированные варианты. Например, когда два элемента соединены с помощью и/или, первый вариант относится к использованию первого элемента без второго. Второй вариант относится к использованию второго элемента без первого. Третий вариант относится к использованию первого и второго элементов вместе. Понятно, что любой из этих вариантов подпадает под указанное значение и, следовательно, удовлетворяет требованиям термина и/или, как он использован здесь. Также понятно, что одновременное использование более чем одного из вариантов также подпадает под указанное значение и, следовательно, удовлетворяет требованиям термина и/или, как он использован здесь.

В тексте данного описания указаны некоторые документы. Каждый из документов, указанных в данном описании изобретения (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.д.), независимо от того, находятся они выше или ниже, включены в данное описание посредством ссылки в их полном объеме. В тех случаях, когда материал, включенный посредством ссылки, противоречит или не согласуется с данной заявкой, заявка отменяет любой такой материал. Ничто в данном описании изобретения не следует истолковывать, как допущение, что изобретение не имеет права отнести к более ранней дате такое раскрытие на основании предшествующего изобретения.

Разные аспекты и воплощения данного изобретения описаны ниже.

Настоящее изобретение относится к водной композиции, содержащей:

1) человеческое моноклональное антитело или его функциональный фрагмент, связывающиеся с GM-CSF, содержащие в вариабельной области легкой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и содержащие в своей вариабельной области тяжелой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 1-13 и 56, в концентрации по меньшей мере 100 мг/мл и менее чем 200 мг/мл,

2) модификатор тоничности, выбранный из маннита, сорбита, сахарозы и/или трегалозы, присутствующий в концентрации от примерно 3 до примерно 7% (масса/объем), и

3) буфер, выбранный из гистидинового, ацетатного и/или цитратного буфера, присутствующий в концентрации от примерно 10 до примерно 50 мМ, где рН составляет от примерно 5 до примерно 7.

Также настоящее изобретение относится к вышеописанной композиции, где модификатор тоничности представляет собой сорбит и буфер представляет собой гистидиновый буфер.

Дополнительно настоящее изобретение относится к такой композиции, которая не содержит поверхностно-активных веществ или дополнительных аминокислот.

Настоящее изобретение также относится к вышеупомянутой композиции, которая содержит:

1) от примерно 100 мг/мл до примерно 180 мг/мл антитела или его функционального фрагмента, связывающихся с GM-CSF,

2) примерно 5% (масса/объем) сорбита,

3) примерно 30 мМ L-гистидина и

4) имеет рН примерно 5,8.

Настоящее изобретение также относится к вышеупомянутой композиции, которая содержит примерно 150 мг/мл антитела или его функционального фрагмента, связывающихся с GM-CSF.

Кроме того, изобретение относится к вышеупомянутой композиции, где указанное антитело или его функциональный фрагмент содержит в вариабельной области легкой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и содержат в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

Дополнительно изобретение относится к вышеупомянутой композиции, где антитело или его функциональный фрагмент содержит в вариабельной области легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 19, 54 и 55, и в вариабельной области тяжелой цепи аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 20-33, 52 и 53.

Дополнительно настоящее изобретение относится к вышеупомянутой композиции, где антитело или его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 34 и аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 35.

Дополнительно настоящее изобретение относится к вышеупомянутой композиции, которая стабильна в течение по меньшей мере 24 месяцев при примерно 2-8°С или по меньшей мере 28 суток при

- 4 032829 комнатной температуре.

Дополнительно настоящее изобретение относится к вышеупомянутой композиции, которая предназначена для внутривенного и/или подкожного введения.

Композиция по изобретению может быть использована в лечении воспалительных и аутоиммунных расстройств.

Эти расстройства выбраны из аллергических, псориатических, артритических и астматических расстройств.

Дополнительно настоящее изобретение относится к набору, содержащему раскрытую выше композицию и контейнер, подходящий для хранения композиции.

С целью предложить композицию, которая имеет высокую концентрацию соединений, нейтрализующих GM-CSF, авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединения, нейтрализующие GMCSF, могут быть нестабильными при высоких концентрациях и могут быть нестабильными в течение продолжительного периода хранения.

Действительно имеется много причин, по которым соединения, нейтрализующие GM-CSF, такие как белки, могут быть нестабильными. Например, нестабильность белка может быть вызвана агрегацией или деградацией белка, а также химической нестабильностью из-за дезаминирования, дезамидирования, окисления, разрыва и образования дисульфидных связей, гидролиза, сукцинимидирования, недисульфидного сшивания, дегликозилирования или ферментативного потемнения (реакция Майяра) или любой комбинации этих явлений; см., например, Wang et al. (1999), Int. J. Pharm. 185: 129-188. Кроме того, физико-химические параметры, такие как температура, значение рН, поверхностная адсорбция, соли, ионы металлов, хелатирующие агенты, физические силы, такие как силы сдвига, агенты, денатурирующие белок, неводные растворители, концентрация белка, источник и чистота белка, морфизм белка или давление могут влиять на стабильность белка.

Однако хотя многие факторы могут влиять на стабильность белка, могут быть предприняты многие мероприятия для стабилизации белка. Например, белок может быть стабилизирован внутри (путем замены аминокислот) или снаружи. Внешняя стабилизация может быть достигнута путем добавления хелатирующих агентов, ионов металлов, восстановителей, полимеров, полиэтиленгликолей/полиолов, сывороточного альбумина, поверхностно-активных веществ, сахаров и многоатомных спиртов, жирных кислот и фосфолипидов, аминокислот, буферов и т.д.; см., например, Wang, Y. and Hanson M. (1988), J. Parental Sci. & Technology, 42, Supplement: 4-26; Wang et al. (1999), Int. J. Pharm. 185: 129-188. В целом, у специалиста имеется много доступных вариантов стабилизации соединений, нейтрализующих GM-CSF, таких как антитела, в композиции.

В данном случае авторы изобретения обнаружили, что соединения, нейтрализующие GM-CSF, демонстрируют агрегацию и/или могут не растворяться в более высоких концентрациях. Многие разные факторы могут вызывать агрегацию белка в композиции. Типичные методы очистки и хранения могут подвергать белковые композиции воздействию условий и компонентов, которые вызывают агрегацию белка. Например, белки в композиции могут агрегировать в результате одной или более из следующих причин: хранение, воздействие повышенных температур, рН композиции, ионная сила композиции и присутствие некоторых поверхностно-активных веществ (например, полисорбата-20 и полисорбата-80) и эмульгаторов. Аналогично, белки могут агрегировать при воздействии напряжения сдвига, например при повторном растворении лиофилизированной белковой таблетки в растворе, очистке белкового образца посредством фильтрования, замораживании-оттаивании, перемешивании или перемещении белкового раствора с помощью шприца. Агрегация также может происходить в результате взаимодействий полипептидных молекул в растворе и на границах раздела жидкость-воздух в сосудах для хранения. Конформационные изменения могут происходить в полипептидах, адсорбированных на границах раздела воздух-жидкость и твердое вещество-жидкость при сжатии или растяжении границ раздела в результате перемешивания во время транспортировки. Такое перемешивание может вызвать агрегацию белка композиции и, в конечном счете, осаждение с другими адсорбированными белками.

Кроме того, воздействие света на белковую композицию может вызвать агрегацию белка. В настоящем изобретении, таким образом, предлагаются композиции, которые обеспечивают высокие концентрации соединений, нейтрализующих GM-CSF, и которые уменьшают агрегацию этих соединений. Без связи с теорией полагают, что уменьшение агрегации будет достигаться посредством контролирования одного или более вышеуказанных механизмов агрегации. Это может привести, например, к улучшенной стабильности продукта и большей гибкости процессов приготовления и условий хранения.

Целью авторов настоящего изобретения являлось предложение композиции с высокой концентрацией соединений, нейтрализующих GM-CSF для того, чтобы, например, обеспечить меньший объем инъекции, который подходит для уменьшения побочных эффектов, таких как боль из-за большого объема инъекции, и обеспечивает возможность подкожного введения небольшого объема.

Поскольку это так, авторы настоящего изобретения обнаружили во время своих исследований некоторую нестабильность соединений, нейтрализующих GM-CSF, и, таким образом, стремились к улучшению этого нежелательного наблюдения. Соответственно, они стремились к концентрированию соединений, нейтрализующих GM-CSF, при сохранении их в растворе, т.е. на стадии растворения. При этом они

- 5 032829 имели множество доступных вариантов и альтернатив, однако без какого-нибудь указания, что какойлибо из них подходит для решения данной проблемы.

Стадия растворения означает, что соединение, нейтрализующее GM-CSF, предпочтительно в концентрации по меньшей мере примерно 20 мг/мл, находится в растворе, т.е. растворено и/или диспергировано непосредственно в водном растворе (т.е. в водной фазе) композиции. Предпочтительно соединение, нейтрализующее GM-CSF, растворено и/или диспергировано гомогенно. Гомогенно означает, что соединение, нейтрализующее GM-CSF, растворено и/или диспергировано в водной композиции почти равномерно, предпочтительно равномерно, распределено в водной композиции таким образом, что концентрация (с) соединения, нейтрализующего GM-CSF (n в случае молярной массы или m в случае массы), почти идентична, предпочтительно идентична в (по всему объему) объеме (v) водного раствора, т.е. c=n/v или c=m/v соответственно, почти постоянна, предпочтительно постоянна. Предпочтительно в композиции нет градиента концентрации.

Соответственно, стабильная композиция по настоящему изобретению, содержащая соединение, нейтрализующее GM-CSF, может предпочтительно рассматриваться как водный раствор, в котором соединение, нейтрализующее GM-CSF, непосредственно растворено и/или диспергировано.

Раствор представляет собой гомогенную смесь двух или более веществ/компонентов. В такой смеси растворенное вещество (в настоящем изобретение соединение, нейтрализующее GM-CSF) растворено (как описано выше) в другом веществе (в настоящем изобретении в водной композиции), также известном как растворитель.

Учитывая вышеизложенное, соединение, нейтрализующее GM-CSF, предпочтительно не является гетерогенно растворенным и/или диспергированным в водном растворе. Термин растворенное состояние также включает, что соединение, нейтрализующее GM-CSF, предпочтительно, по существу, не эмульгировано или более предпочтительно совсем не эмульгировано в водном растворе.

Термин растворенное состояние также включает, что соединение, нейтрализующее GM-CSF, предпочтительно, по существу, не инкапсулировано и/или не заключено (предпочтительно менее 2, 1 или 0,5% соединения, нейтрализующего GM-CSF, может быть инкапсулировано и/или заключено или более предпочтительно совсем не инкапсулировано и/или не заключено, например, в липосомы, многослойные липосомы или т.п.).

Соответственно, одно предпочтительное воплощение настоящего изобретения представляет собой жидкую композицию, содержащую соединение, нейтрализующее GM-CSF, которое является стабильным и не образует конъюгаты/агрегаты или фрагменты/продукты деградации при хранении в течение длительного периода, и эта композиция подходит для подкожного введения.

Конкретно, после тестирования множества разных стабилизирующих агентов авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединения, нейтрализующие GM-CSF, могут быть стабилизированы, если к раствору, который подлежит хранению, добавляют модификатор тоничности. Примеры модификаторов тоничности включают, без ограничения ими, сахара и сахарные спирты. Простые сахара называют моносахаридами и они включают глюкозу, фруктозу, галактозу, ксилозу, рибозу, маннозу, лактулозу, аллозу, альтрозу, гулозу, идозу, талозу, арабинозу и ликсозу. Также могут содержаться дисахариды, которые включают, например, сахарозу, мальтозу, лактозу, изомальтозу, трегалозу и целлобиозу. Сахарные спирты включают сорбит, маннит, глицерин, эритрит, мальтит, ксилит, полиглицитол. В предпочтительном воплощении сахар представляет собой невосстанавливающий сахар, такой как сахароза или трегалоза. Невосстанавливающие сахара характеризуются отсутствием в структуре открытой цепи, поэтому они не подвержены окислительно-восстановительным реакциям. Следовательно, один или более невосстанавливающих сахаров, таких как сахароза или трегалоза, или один или более сахарных спиртов, таких как маннит или сорбит, добавлены к композиции, содержащей соединение, нейтрализующее GM-CSF. Также комбинации невосстанавливающих сахаров и сахарных спиртов могут быть добавлены к раствору, например сахароза и маннит, сахароза и сорбит, трегалоза и маннит или трегалоза и сорбит. Более предпочтительно, когда добавлены сахарные спирты маннит и/или сорбит, предпочтительно в их D-форме, наиболее предпочтительно, когда к раствору добавлен сорбит. Концентрация модификатора тоничности, предпочтительно сорбита, составляет от примерно 1 до примерно 15% (мас./об.), предпочтительно от примерно 2 до примерно 10% (мас./об.), более предпочтительно от примерно 3 до примерно 7% (мас./об.), более предпочтительно от примерно 4 до примерно 6% (мас./об.) и наиболее предпочтительно примерно 5% (мас./об.).

Другим особенно предпочтительным веществом для стабилизации соединений, нейтрализующих GM-CSF, при высокой концентрации в отношении длительного хранения является буферная система с рН от примерно 4 до примерно 10, предпочтительно от примерно 4 до примерно 7, более предпочтительно от примерно 4 до примерно 6 или от примерно 5 до примерно 7, еще более предпочтительно от примерно 5,5 до примерно 6,5 и наиболее предпочтительно с рН примерно 5,8. Буфер по изобретению выбран из гистидинового буфера, ацетатного буфера и цитратного буфера. При упоминании в данном описании предполагается, что аминокислота является L-аминокислотой или D-аминокислотой, причем Lаминокислота является предпочтительной. Предпочтительно для буферной системы используют гистидин или его соль. Предпочтительно соль представляет собой хлорид, фосфат, ацетат или сульфат, более

- 6 032829 предпочтительно соль представляет собой хлорид. рН гистидиновой буферной системы составляет от примерно 5 до примерно 7, предпочтительно от примерно 5,5 до примерно 6,5, более предпочтительно рН составляет примерно или точно 5,8. Значение рН может быть отрегулировано с помощью обычно используемых оснований и кислот, предпочтительно NaOH. Концентрация буферной системы, предпочтительно гистидиновой буферной системы, составляет от примерно 10 до примерно 50 мМ, предпочтительно от примерно 20 до примерно 40 мМ, более предпочтительно примерно 30 мМ.

Согласно предпочтительному воплощению комбинацию буферной системы, предпочтительно гистидинового буфера, и модификатора тоничности, предпочтительно сахарного спирта, более предпочтительно маннита или еще более предпочтительно сорбита, используют для стабилизации соединений, нейтрализующих GM-CSF, в растворе, для того чтобы предотвратить агрегацию и сделать композицию достаточно стабильной для длительного хранения и/или одного или более циклов замораживания/оттаивания. Было показано, что с точки зрения стабильности предпочтительно иметь примерно 6% (мас./об.) и выше сахарного спирта, предпочтительно сорбита, в композиции. Однако верхний предел осмоляльности композиции установлен равным примерно 470 мОсм/кг, что является гиперосмотическим, но подобным осмотическому давлению одобренного продукта (Synagis; Lm. administration). Поэтому следовало найти компромисс между оптимальной стабильностью, тоничностью и концентрацией соединения, нейтрализующего GM-CSF, как описано в примерах настоящего изобретения. Предпочтительная концентрация сахарного спирта, предпочтительно сорбита, следовательно, составляет от примерно 3 до примерно 7% (мас./об.), более предпочтительно от примерно 4 до примерно 6% (мас./об.) и наиболее предпочтительно примерно 5% (мас./об.).

В некоторых воплощениях настоящего изобретения составы или композиции по изобретению, содержащие соединение, нейтрализующее GM-CSF, не требуют дополнительных эксципиентов в дополнение к раскрытым выше (т.е. к буферу и модификатору тоничности), таких как, например, поверхностноактивные вещества и аминокислоты, которые используются в традиционных композициях для стабилизации белков в растворе. Кроме того, композиции, описанные в данном описании изобретения, являются более предпочтительными, чем стандартные композиции, поскольку они имеют пониженную иммуногенность из-за отсутствия дополнительных агентов, обычно необходимых для стабилизации белка.

Известно, что аминокислоты полезны для стабилизации белков в высокой концентрации, опосредуя, в частности, растворимость белка и/или ингибируя агрегацию белка. Хотя треонин (например, при 250 мМ) демонстрирует незначительный стабилизирующий эффект, жидкая композиция по настоящему изобретению предпочтительно свободна от дополнительных аминокислот.

Кроме того, предпочтительно, чтобы настоящая композиция была свободна или, по существу, свободна от хлорида натрия. По существу, свободна означает, что концентрация хлорида натрия равна или очень близка 0 мМ, например менее чем примерно 50 мМ, предпочтительно менее чем примерно 20 мМ, более предпочтительно менее чем примерно 10 мМ, еще более предпочтительно менее чем примерно 5 мМ и наиболее предпочтительно менее чем примерно 2 мМ или даже менее чем примерно 1 мМ.

В биофармацевтических продуктах добавление поверхностно-активных веществ может быть полезным для уменьшения деградации белка во время хранения. Полисорбаты 20 и 80 (Tween 20 и Tween 80) представляют собой хорошо известные эксципиенты для этой цели. Однако из-за отсутствия или негативного воздействия на стабильность соединений, нейтрализующих GM-CSF, жидкая композиция по настоящему изобретению предпочтительно не содержит никаких поверхностно-активных веществ.

Используемая концентрация соответствующих соединений, нейтрализующих GM-CSF, составляет по меньшей мере примерно 100 мг/мл в жидкой композиции, которую требуется хранить, замораживать/оттаивать и/или которая является готовой к применению. В настоящем изобретении используют концентрации от примерно 100 до примерно 180 мг/мл, предпочтительно от примерно 130 до примерно 170 мг/мл, еще более предпочтительно от примерно 135 до примерно 165 мг/мл и наиболее предпочтительно примерно 150 мг/мл.

Срок годности полученной жидкой композиции имеет предпочтительные минимальные требования, составляющие 24 месяца при температуре от 2 до 8°С, предпочтительно 36 месяцев при температуре от 2 до 8°С, более предпочтительно 48 месяцев при температуре от 2 до 8°С, наиболее предпочтительно 60 месяцев при температуре от 2 до 8°С или по меньшей мере 28 суток при комнатной температуре (25±2°С).

Настоящее изобретение относится к стабильной композиции, предпочтительно стабильной жидкой композиции, которая неожиданно обеспечивает возможность длительного хранения соединений, нейтрализующих GM-CSF. Эта композиция полезна, в частности, потому, что пациенту удобнее ее использовать, так как соединения, нейтрализующие GM-CSF, в этой композиции имеют высокую концентрацию, что позволяет уменьшить побочные эффекты, такие как боль, связанные с большим объемом инъекции.

Соответственно, один аспект изобретения основан на обнаружении того, что композиции, содержащие соединение, нейтрализующее GM-CSF, буферную систему, предпочтительно выбранную из гистидинового буфера, ацетатного буфера и/или цитратного буфера с предпочтительным рН от 5 до 7, и

- 7 032829 модификатор тоничности, предпочтительно выбранный из невосстанавливающих сахаров, таких как сахароза или трегалоза, или сахарных спиртов, таких как маннит или сорбит, является достаточно стабильными для длительного хранения, и/или циклов замораживания/оттаивания, и/или напряжении сдвига (вибростабильность). Композиция по изобретению имеет много преимуществ по сравнению со стандартными буферными композициями. В одном аспекте композиция демонстрирует минимальную агрегацию при длительном хранении без разрушительных эффектов, которые можно ожидать от композиций с высоким содержанием белка. Другими преимуществами композиции по изобретению являются минимальная фрагментация соединения, нейтрализующего GM-CSF, и отсутствие существенного влияния на биологическую активность соединения, нейтрализующего GMCSF, во время длительного хранении и низкая вязкость композиции. Наконец, в предпочтительном воплощении композиция не содержит дополнительных эксципиентов, таких как поверхностно-активные вещества, дополнительные аминокислоты и/или хлорид натрия.

В настоящем описании дополнительно раскрыты композиции, где соединение, нейтрализующее GM-CSF, представляет собой полипептид, пептидомиметик, нуклеиновую кислоту или малую молекулу.

В предпочтительном воплощении соединение, нейтрализующее GM-CSF, (которое предпочтительно представляет собой полипептид и более предпочтительно антитело или его функциональный фрагмент) связывается или специфически связывается с GM-CSF или с рецептором GM-CSF. Предполагается, что GM-CSF или рецептор GM-CSF имеют животное происхождение, включая, без ограничения ими, млекопитающих, таких как лабораторные животные (грызуны, такие как крысы, морские свинки, хомяки или мыши, нечеловекообразные приматы, такие как макак или яванский макак), домашние или комнатные животные (например, собаки или кошки), фермерские или сельскохозяйственные животные (например, крупный рогатый скот, овцы, козы и свиньи) и/или человек. Предпочтительно GM-CSF или рецептор GM-CSF представляет собой GM-CSF человека (Homo sapiens) или человеческий рецептор GM-CSF соответственно, или GM-CSF примата, не являющегося человеком, или рецептор GM-CSF примата, не являющегося человеком соответственно. Особенно предпочтительные варианты (гомологи) GM-CSF примата, не являющегося человеком, или рецептора GM-CSF примата, не являющегося человеком, включают GM-CSF или рецептор GM-CSF гиббона (номаскуса одноцветного, также известного как западный черный хохлатый гиббон) и обезьян семейства макак, например макаки-резус (Macaca mulatta) и яванского макака (Macaca fascicularis). Также здесь раскрыто, что соединение, связывающееся с GM-CSF или с рецептором GM-CSF (предпочтительно антитело или его фрагмент), демонстрирует перекрёстную реактивность между человеком и по меньшей мере одним из указанных выше видов обезьян. Например, антитело или его фрагмент способно связываться (и нейтрализовывать) как GM-CSF человека, так и GMCSF яванского макака (Macaca fascicularis). Это особенно полезно для молекулы антитела, которая предназначена для терапевтического введения людям, так как такое антитело обычно должно пройти через множество испытаний, предшествующих разрешению регуляторного органа, из которых некоторые ранние тесты выполняются на видах животных, не являющихся человеком. При выполнении таких тестов обычно желательно использовать в качестве видов, не являющихся человеком, виды с высокой степенью генетического сходства с людьми (например, нечеловекообразных приматов, таких как яванский макак), так как по результатам, полученным таким образом, как правило, можно хорошо предсказать соответствующие результаты, которые можно ожидать при введении этой молекулы человеку. Однако такая прогностическая сила, основанная на тестах на животных, зависит, по меньшей мере частично, от сравнимости молекулы и является очень высокой, когда благодаря межвидовой реактивности та же самая терапевтическая молекула может быть введена людям и животным моделям. Так, в воплощении, когда молекула антитела перекрестно реагирует с одним и тем же антигеном у людей и у другого близкородственного вида, тесты могут быть выполнены с использованием одной и той же молекулы антитела у людей и у этого близкородственного вида, например на одном из видов обезьян, упомянутых выше. Это повышает как эффективность самих тестов, так и прогностическую силу, обеспечиваемую такими тестами, в отношении поведения таких антител у людей, конечного интересующего с терапевтической точки зрения вида. Предпочтительно антитело или его функциональный фрагмент, связывающийся с GM-CSF или с рецептором GM-CSF, представляет собой моноклональное антитело или его функциональный фрагмент. То же самое может быть верно для альтернативных воплощений с соединениями, нейтрализующими GMCSF, которые не являются антителами или не произведены из антител.

Конкретно, соединение, нейтрализующее GM-CSF, по настоящему изобретению представляет собой человеческое моноклональное антитело или его функциональный фрагмент.

Соединение, нейтрализующее GM-CSF, может быть антителом или его функциональным фрагментом, который связывается с эпитопом GM-CSF человека и примата, не являющегося человеком. Этот эпитоп предпочтительно содержит аминокислоты 23-27 (RRLLN) и/или аминокислоты 65-77 (GLR/QGSLTKLKGPL). Изменчивость в положении 67 внутри участка аминокислотной последовательности 65-77 отражает гетерогенность в этой части GM-CSF между GM-CSF человека и гиббона (где положение 67 представляет собой R), с одной стороны, и обезьянами семейства макак, например яванским макаком и макаком-резус (где положение 67 представляет собой Q), с другой стороны. Если эпитоп содержит два участка аминокислотных последовательностей, которые не являются смежными, таких как

- 8 032829

23-27 (RRLLN) и 65-77 (GLR/QGSLTKLKGPL), эпитоп также может называться прерывистым эпитопом. Указанный эпитоп GM-CSF или указанный прерывистый эпитоп GM-CSF может дополнительно содержать аминокислоты 28-31 (LSRD), аминокислоты 32-33 (ТА) и/или аминокислоты 21-22 (ЕА).

Человеческое моноклональное антитело или его функциональный фрагмент содержит в вариабельной области тяжелой цепи CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 1-13 и 56; предпочтительно CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

Любая из указанных последовательностей CDR3 вариабельной области тяжелой цепи в вариабельной области тяжелой цепи также существует вместе с CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, и CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15.

Кроме того, человеческое моноклональное антитело или его функциональный фрагмент содержит в вариабельной области легкой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18.

Настоящее изобретение включает человеческое моноклональное антитело или его функциональный фрагмент, содержащие в вариабельной области легкой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18, и в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO:1-13 и 56, наиболее предпочтительно в SEQ ID NO: 2.

Согласно предпочтительному воплощению, человеческое моноклональное антитело или его функциональный фрагмент содержит в вариабельной области легкой цепи аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 19, 54 и 55. Согласно другому предпочтительному воплощению человеческое моноклональное антитело или его функциональный фрагмент содержит в вариабельной области тяжелой цепи аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 20-33, 52 и 53. Человеческое моноклональное антитело или его функциональный фрагмент может в дополнительном воплощении содержать аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 34, и/или аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из представленных в любой из SEQ ID NO: 35-48, наиболее предпочтительно в SEQ ID NO: 35.

Также раскрыто человеческое моноклональное антитело или его функциональный фрагмент, которые могут содержать одну или более аминокислотных последовательностей, имеющих по меньшей мере 70, 80, 90, 95, 98 или 99% гомологию с соответствующей аминокислотной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 1-48 и 52-56, предпочтительно с соответствующей аминокислотной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 1-18 и 56, и/или с аминокислотной последовательностью каркасных областей (FR) в пределах аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 19-48 и 52-55. Дополнительно раскрыто человеческое моноклональное антитело или его функциональный фрагмент может содержать одну или более аминокислотных последовательностей, имеющих по меньшей мере 70, 80, 90, 95, 98 99% гомологию с соответствующей аминокислотной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 1-18 и 56.

Альтернативно, в любой из аминокислотных последовательностей CDR, представленной в любой из SEQ ID NO: 1-18 и 56 одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или 10 аминокислот могут быть заменены. Предпочтительно такие CDR, имеющие замены, все еще способны связываться с GM-CSF, как описано здесь.

Альтернативно или в дополнение раскрыто, что человеческое моноклональное антитело или его функциональный фрагмент могут содержать одну или более аминокислотных последовательностей, имеющих по меньшей мере 70, 80, 90, 95, 98 или 99% гомологию с соответствующей аминокислотной последовательностью VH, VL, Н или L области соответственно, представленной в любой из SEQ ID NO: 19-48 и 52-55. Раскрыто, что гомология распространяется на всю аминокислотную последовательность VH, VL, H или L. В данном описании гомология присутствует в CDR, как описано выше, или гомология присутствует в FR (или не-CDR) такой VH-, VL-, Н- или L-области, представленной в любой из SEQ ID NO: 19-48 и 52-55. Соответственно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 25 аминокислот могут быть заменены в каждом из FR. Такой вариант FR с заменой по-прежнему способен связываться с GM-CSF, как описано в данном описании изобретения.

Специалист может легко определить FR (или не-CDR) в пределах SEQ ID NO: 19-48 и 52-55, поскольку SEQ ID NO: 1-18 и 56 демонстрируют последовательности CDR, которые содержатся в одной

- 9 032829 или более последовательностях VH, VL, Н или L, показанных в SEQ ID NO: 19-48 и 52-55. А именно, в перечне последовательностей в идентификаторе последовательности <223> представлено обозначение каждой из аминокислотных последовательностей. Идентичные обозначения указывают на то, что эти аминокислотные последовательности подходят друг к другу, это означает, что CDR содержится в области VH, VL, H или L, например SEQ ID NO: 16, 17, 18 представляют собой аминокислотные последовательности CDR, которые содержатся в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 19 (так как все они обозначены 5-306).

В качестве дополнительной иллюстрации, если аминокислоты заменены в одном или более или во всех CDR или FR тяжелой и/или легкой цепи, предпочтительно, чтобы получаемая затем замещенная последовательность была по меньшей мере на 70%, более предпочтительно на 80%, еще более предпочтительно на 90%, особенно предпочтительно на 95%, еще более предпочтительно на 98% или на 99% идентична исходной CDR- или FR-последовательности. Это означает, что степень гомологии с замещенной последовательностью зависит от длины CDR или FR.

Гомология определяется с помощью стандартных программ выравнивания последовательностей, таких как Vector NTI (InforMaxTM, Maryland, USA), или более предпочтительно с помощью программы BLASTP, предпочтительно версии blastp 2.2.5 (November 16, 2002; cf. Altschul, S.F. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402). Процент гомологии основан на выравнивании целых полипептидных последовательностей (матрица: BLOSUM 62; gap costs (штраф за пропуск): 11.1; cutoff value (пороговое значение) установлено на 10^-3) с использованием любой CDR-, VH-, VL-, Н- или L-аминокислотной последовательности в качестве эталона в попарном сравнении. Его рассчитывают, как процент от числа положительных (гомологичных аминокислот), указанных программой BLASTP, деленного на общее число аминокислот, выбранных программой для выравнивания.

При использовании в данном описании изобретения гомология аминокислотных или нуклеотидных последовательностей может быть использована взаимозаменяемо с термином идентичность. Термин гомология, использованный в настоящем изобретении, означает процент парных идентичных остатков после гомологичного выравнивания последовательности аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению с исследуемой последовательностью в отношении числа остатков в более длинной из этих двух последовательностей. Как описано выше, программы для определения гомологии (или идентичности) сравнивают выровненные последовательности аминокислота за аминокислотой и в них могут быть установлены различные уровни жесткости сравнения (например, идентичная аминокислота, консервативная аминокислотная замена и т.д.). При использовании этого термина в данном описании изобретения две рассматриваемые аминокислоты считаются консервативными заменами друг друга, если каждая из них принадлежит к одному и тому же химическому классу, т.е. кислые, неполярные/гидрофобные, незаряженные полярные и основные. В качестве неограничивающего примера две разные аминокислоты, принадлежащие к классу неполярных аминокислот, будут считаться консервативными заменами друг другу, даже если эти две аминокислоты не были идентичны, в то время как неполярная аминокислота, с одной стороны, и основная аминокислота, с другой стороны, не будут считаться консервативными заменами друг другу. В Panel 3.1 Molecular Biology of the Cell, 4th Edition (2002), by Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts and Walter аминокислоты сгруппированы в четыре основные группы: кислые, неполярные, незаряженные полярные и основные. Такую группировку можно использовать в контексте настоящего изобретения для определения, является ли конкретная аминокислота консервативной заменой другой рассматриваемой аминокислоты. Вышеуказанные основные группы могут быть дополнительно подразделены, например, на малые неполярные и большие неполярные аминокислоты, большие ароматические аминокислоты и т.д. Термин консервативная аминокислотная замена также указывает на любую аминокислотную замену для данного аминокислотного остатка, где заменяющий остаток настолько химически подобен данному остатку, что не происходит никакого существенного снижения функции полипептида (например связывания).

Соединение, нейтрализующее GM-CSF, как правило, приготавливают в виде фармацевтической композиции для парентерального, например внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, внутримышечного, местного или внутрикожного введения субъекту, при этом подкожное введение является предпочтительным. Фармацевтическая композиция по изобретению представляет собой жидкую композицию, конкретно водную композицию.

Концентрация соединения, нейтрализующего GM-CSF, в жидкой фармацевтической композиции составляет по меньшей мере 100 мг/мл, предпочтительно от примерно 100 до примерно 200 мг/мл, например, примерно 150 мг/мл. В некоторых воплощениях, например, когда композиция предназначена для подкожной доставки, можно использовать более высокие концентрации соединения, нейтрализующего GM-CSF.

Как отмечалось выше, композиции по настоящему изобретению содержат буфер. При использовании здесь термин буфер относится к добавленной композиции, которая позволяет жидкой композиции сопротивляться изменениям рН. В некоторых воплощениях добавленный буфер позволяет жидкой композиции сопротивляться изменениям рН за счет действия его кислотно-основных сопряженных компонентов. Примеры подходящих буферов включают, без ограничения ими, гистидиновую, ацетатную или

- 10 032829 цитратную буферную систему.

Термин специфично связывается или родственные выражения, такие как специфическое связывание, связывающийся специфично, специфический связывающий агент и т.д., при использовании здесь, относятся к способности GM-CSF-нейтрализующего соединения и предпочтительно (человеческого) (моноклонального) антитела или его функционального фрагмента различать свою мишень (например, GM-CSF или рецептор GM-CSF) и любой другой возможный антиген, отличный от GM-CSF или рецептора GM-CSF в такой степени, что из множества разных антигенов в качестве возможных партнеров по связыванию связывается или в значительной мере связывается только GM-CSF/рецептор GM-CSF. В контексте настоящего изобретения мишень связана в значительной мере, когда из множества одинаково доступных разных антигенов в качестве потенциальных партнеров по связыванию мишень связывается по меньшей мере в 10 раз, предпочтительно по меньшей мере в 50 раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 100 раз или значительно более часто (в кинетическом смысле), чем любой другой антиген, отличный от мишени. Такие кинетические измерения могут быть выполнены, например, с использованием технологии SPR (поверхностного плазмонного резонанса), например прибора Biacore. При использовании здесь термины (специфично) связывающийся с или родственные термины, такие как (специфично) распознающий, направленный на, (специфично) взаимодействующий с и (специфично) реагирующий с означают в соответствии с данным изобретением, что соединение, нейтрализующее GM-CSF (например, антитело), демонстрирует существенную аффинность к своей мишени (например, GM-CSF или рецептору GM-CSF) и обычно не демонстрирует значительной реакционной способности с белками или антигенами, отличными от вышеуказанных мишеней. Значительная аффинность включает связывание с аффинностью примерно 10^-6 М (KD) или выше, например 10^-7 М или выше. Предпочтительно связывание считается специфичным, когда аффинность связывания составляет примерно от 10^-11 до 10^-8 М, предпочтительно примерно от 10^-11 до 10^-9 М, более предпочтительно примерно от 10^-11 до 10^-10 М. Можно легко протестировать, взаимодействует ли или связывается ли специфично соединение (например, антитело) с мишенью, в частности, сравнивая взаимодействие указанного соединения с его белком-мишенью или антигеном с взаимодействием указанного компонента с белками или антигенами, отличными от его мишени. Предпочтительно соединение по изобретению не связывается существенно или не способно связываться с белками или антигенами, отличными от GM-CSF или рецептора GM-CSF. Термин не связывается существенно или не способен связываться означает, что соединения по настоящему изобретению демонстрируют не более чем 30%, предпочтительно более чем 20%, более предпочтительно не более чем 10%, особенно предпочтительно не более чем 9, 8, 7, 6 или 5% реакционную способность с белками или антигенами, отличными от GM-CSF или рецептора GM-CSF.

При использовании здесь нейтрализация, нейтрализующий агент, нейтрализующий и их грамматически родственные варианты относятся к частичному или полному ослаблению биологического(их) эффекта(ов) GM-CSF. Такое частичное или полное ослабление биологического(их) эффекта(ов) GM-CSF происходит из-за модификации, прерывания и/или аннулирования GM-CSF-опосредованных процессов, таких как трансдукция сигнала, что проявляется, например, во внутриклеточной сигнализации, клеточной пролиферации или высвобождении растворимых веществ, активизации или подавлению активации внутриклеточного гена, что приводит, например, к экспрессии поверхностных рецепторов для лигандов, отличных от GM-CSF. Специалисту в данной области понятно, что существует множество способов определения того, следует ли классифицировать соединение, например антитело или его функциональный фрагмент, как нейтрализующий агент. В качестве примера это может быть выполнено с помощью стандартного теста in vitro, в общем случае выполняемого следующим образом. В первом эксперименте по пролиферации клеточную линию, степень пролиферации которой, как известно, зависит от активности GM-CSF, инкубируют с рядом образцов с различной концентрацией GM-CSF, и после этой инкубации измеряют степень пролиферации клеточной линии. Из этого измерения определяют концентрацию GM-CSF, обеспечивающую полумаксимальную пролиферацию клеток. Затем выполняют второй эксперимент по пролиферации, используя в каждом ряде образцов такое же число клеток, что и в первом эксперименте по пролиферации, определенную выше концентрацию GM-CSF и на этот раз изменяя концентрации соединения, предположительно являющегося нейтрализующим агентом для GM-CSF. Снова измеряют пролиферацию клеток, чтобы определить концентрацию анализируемого соединения, которая достаточна, чтобы вызвать полумаксимальное ингибирование роста. Если полученный график зависимости ингибирования роста от концентрации анализируемого соединения имеет сигмоидальную форму, с получением в результате уменьшения клеточной пролиферации при повышении концентрации анализируемого соединения, это значит, что происходило ингибирование роста в некоторой степени, т.е. активность GM-CSF в некоторой степени была нейтрализована. В таком случае рассматриваемое соединение можно считать нейтрализующим агентом в контексте настоящего изобретения. Одним из примеров клеточной линии, степень пролиферации которой, как известно, зависит от активности GM-CSF, является клеточная линия TF-1, как описано в Kitamura, Т. et al. (1989). J. Cell. Physiol. 140, 323-34.

Как понятно специалисту в данной области техники, степень клеточной пролиферации является не единственным параметром, по которому может быть установлена нейтрализующая эффективность GMCSF. Например, измерение уровня сигнальных молекул (например, цитокинов), уровень секреции кото

- 11 032829 рых зависит от GM-CSF, можно использовать для идентификации предполагаемого GM-CSF нейтрализующего агента/GM-CSF ингибирующего соединения.

Другие примеры клеточных линий, которые можно использовать для определения, является ли рассматриваемое соединение, такое как антитело или его функциональный фрагмент, агентом, нейтрализующим активность GM-CSF, включают AML-193 (Lange, В. et al. (1987). Blood 70, 192-9); GF-D8 (Rambaldi, A. et al. (1993). Blood 81, 1376-83); GM/SO (Oez, S. et al. (1990). Experimental Hematology 18, 110811); MO7E (Avanzi, G.G et al. (1990). Journal of Cellular Physiology 145, 458-64); TALL-103 (Valtieri, M. et al. (1987). Journal of Immunology 138, 4042-50); и UT-7 (Komatsu, N. et al. (1991). Cancer Research 51, 3418).

Понятно, что нейтрализация GM-CSF в соответствии с настоящим изобретением может быть осуществлена либо вне клеток, несущих рецепторы GM-CSF, или внутри указанных клеток. Таким образом, нейтрализация GM-CSF с помощью соединения может быть либо ингибированием, либо предотвращением связывания GM-CSF с его специфическим рецептором или ингибированием внутриклеточного сигнала, индуцированного посредством связывания цитокинов с их рецепторами. Соединение, нейтрализующее GM-CSF, может, например, связываться непосредственно с GM-CSF или с рецептором GM-CSF, тем самым препятствуя в обоих случаях биологическим эффектам GM-CSF.

Как определено в данном описании выше, ингибиторы GM-CSF согласно настоящему описанию могут быть выбраны из группы, состоящей из полипептида, пептидомиметика, молекулы нуклеиновой кислоты и малой молекулы.

Термин полипептид при использовании здесь, описывает группу молекул, которые, как правило, состоят по меньшей мере из 30 аминокислот, соединенных друг с другом посредством ковалентной пептидной связи. В соответствии с описанием группа полипептидов содержит белки, состоящие из одного полипептида или более чем одного полипептида. Термин полипептид также описывает фрагменты белков при условии, что эти фрагменты состоят по меньшей мере из 30 аминокислот. Хорошо известно в данной области техники, что полипептиды могут образовывать мультимеры, такие как димеры, тримеры и высшие олигомеры, т.е. состоящие из более чем одной полипептидной молекулы. Такие мультимеры также включены в определение термина полипептид. Полипептидные молекулы, образующие такие димеры, триммеры и т.д., могут быть идентичными или неидентичными. Соответствующие структуры более высокого порядка таких мультимеров, следовательно, называют гомо- или гетеродимеры, гомоили гетеротримеры и т.д. Примером гетеромультимера является молекула антитела, которая в своей природной форме состоит из двух идентичных легких полипептидных цепей и двух идентичных тяжелых полипептидных цепей. Термины полипептид и белок также относятся к модифицированным естественным образом или неестественным образом полипептидам/белкам, где модификация осуществлена, например, посредством посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, образование дисульфидных мостиков и т.п., или посредством химических модификаций, таких как пэгилирование. Такие модификации хорошо известны в данной области техники.

Термин нуклеиновая кислота или полинуклеотид определяет в контексте настоящего описания полимерные макромолекулы, состоящие из нескольких повторяющихся звеньев фосфорной кислоты, сахара и пуриновых и пиримидиновых оснований. Воплощения этих молекул включают ДНК, РНК и ПНК. Нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной или двухцепочечной, линейной или кольцевой. Нуклеиновая кислота в контексте описания представляет собой аптамер. Аптамеры нуклеиновой кислоты представляют собой молекулы ДНК или РНК, которые выбраны из смешанных пулов на основе их способности связывать другие молекулы. Были отобраны аптамеры, которые связывают нуклеиновую кислоту, белки, малые органические соединения и даже целые организмы. Они обычно состоят из коротких нитей олигонуклеотидов, обычно из 50 оснований или менее.

Термин малая молекула определяет группу органических лекарственных соединений, имеющих молекулярную массу менее 1000 Да, предпочтительно до 800 Да, а более предпочтительно от 300 до 700 Да. Верхняя граница молекулярной массы малой молекулы обеспечивает возможность быстрой диффузии через клеточную мембрану так, что они могут достичь внутриклеточных мест приложения действия. Соответствующие малые молекулы могут быть получены, по меньшей мере, из частично рандомизированной пептидной библиотеки. Подходящие библиотеки малых молекул согласно настоящему описанию хорошо известны в данной области техники и/или могут быть приобретены у коммерческих дистрибьюторов.

Термин пептидомиметик согласно настоящему описанию описывает малую протеиноподобную цепь, предназначенную для имитации пептида. Этот тип молекулы искусственно получают путем модификации существующего пептида для того, чтобы изменить свойства молекулы. Например, исходный существующий пептид модифицируют, чтобы изменить стабильность или биологическую активность молекулы. Эти модификации включают изменение остова и включение неприродных аминокислот.

Термин рецептор GM-CSF относится к физиологическому рецептору GM-CSF клеточной поверхности, который описан в данной области техники как гетеромер α-цепи (CD116) и общей β (β-с) субъединицы.

Предпочтительным воплощением нейтрализующего полипептида является антитело или его функ

- 12 032829 циональные фрагменты, конкретно человеческое антитело или его функциональные фрагменты. Методы получения антител хорошо известны в данной области и описаны, например, в Harlow and Lane Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 и Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.

Определение термина антитело включает такие воплощения, как моноклональные, химерные, одноцепочечные, гуманизированные и человеческие антитела. В дополнение к полноразмерным антителам определение включает производные антител и фрагменты антител, такие как, среди прочего, Fabфрагменты. Фрагменты или производные антител также включают фрагменты F(ab')₂, Fv, scFv или однодоменные антитела, такие как доменные антитела или нанотела, единичный вариабельный домен антител или единичный вариабельный домен иммуноглобулина, содержащий только один вариабельный домен, который может представлять собой VHH, VH или VL, который специфично связывается с антигеном или эпитопом независимо от других V-областей или доменов; см., например, Harlow and Lane (1988) и (1999), выше; Kontermann and Dubel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed. 2010 и Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009. Указанный термин также включает диатела или переориентирующиеся антитела с двойной аффинностью (DART). Кроме того, предусмотрены (биспецифическое) одноцепочечное диатело, тандемное диатело (Tandab), минитела, которые проиллюстрированы следующей структурой: (VH-VL-CH3)₂, (scFv-CH3)₂ или (scFv-CH3-scFv)₂, Fc DART и IgG DART, мультитела, такие как триатела. Единичные вариабельные домены иммуноглобулина охватывают не только выделенный полипептид единичного вариабельного домена антитела, но также более крупные полипептиды, которые содержат один или более мономеров полипептидной последовательности единичного вариабельного домена антитела.

Кроме того, термин антитело, при использовании здесь, также относится к производным или вариантам антител, описанных здесь, которые демонстрируют такую же специфичность, что и описанные антитела. Примеры вариантов антител включает гуманизированные варианты нечеловеческих антител, антитела со зрелой аффинностью (см., например, Hawkins et al. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) и Lowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)) и мутантные антитела с измененной эффекторной(ыми) функцией(ями) (см., например, патент US 5648260, Kontermann and Dubel (2010), выше и Little (2009), выше).

Термин антитела также включает иммуноглобулины (Ig) разных классов (т.е. IgA, IgG, IgM, IgD и IgE) и подклассов (таких как IgG1, IgG2 и т.д.). Производные антител, которые также подпадают под определение термина антитело в контексте изобретения, включают модификации молекул, таких как, например, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, образование дисульфидной связи, фарнезилирование, гидроксилирование, метилирование или этерификация.

Функциональный фрагмент антитела включает домен фрагмента F(ab')2, фрагмент Fab, scFv или конструкции, содержащие вариабельные домены одного иммуноглобулина или полипептиды однодоменного антитела, например вариабельные домены одной тяжелой цепи или вариабельные домены одной легкой цепи, а также другие фрагменты антител, как описано в данном описании изобретения выше. F(ab')₂ или Fab можно сконструировать так, чтобы довести до минимума или полностью исключить межмолекулярные дисульфидные взаимодействия, которые возникают между доменами CH1 и CL.

Термин человеческое антитело, при использовании здесь, следует понимать как означающее, что антитело или его функциональный фрагмент содержит аминокислотную(ые) последовательность(и), которая(ые) содержит(ат)ся в репертуаре антител зародышевой линии человека. Для определения в настоящем описании изобретения антитело или его фрагмент, следовательно, можно рассматривать, как человеческое(ий), если он состоит из такой(их) (а) аминокислотной(ых) последовательности(ей) зародышевой линии человека, т.е. если аминокислотная(ые) последовательность(и) рассматриваемого антитела или его функциональный фрагмент идентичны экспрессируемой(ым) аминокислотной(ым) последовательности(ям) зародышевой линии человека. Антитело или его функциональный фрагмент также может рассматриваться, как человеческое, если оно состоит из (а) последовательности(ей), которая(ые) отличает(ют)ся от его(их) ближайшей(их) последовательности(ей) зародышевой линии человека не более чем это можно ожидать из-за импринта соматической гипермутации. Кроме того, антитела многих млекопитающих, не являющихся человеком, например грызунов, таких как мыши и крысы, содержат аминокислотные последовательности VH CDR3, которые, как можно ожидать, также существуют в экспрессируемом репертуаре антител человека. Любая(ые) такая(ие) последовательность(и) человеческого или нечеловеческого происхождения, которая(ые), как можно ожидать, существует(ют) в экспрессируемом репертуаре человека, также следует рассматривать как человеческую(ие) в контексте настоящего изобретения. Термин человеческое антитело, следовательно, включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, по существу, соответствующие последовательностям иммуноглобулина зародышевой линии человека, известным в данной области техники, в том числе, например, описанным в Kabat et al. (см. Kabat et al. (1991) выше). Человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, некодируемые иммуноглобулиновыми последовательностями зародышевой линии человека (например, мутации, введенные в результате случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или посредством соматической мутации in vivo), например в CDR и, в частности, в CDR3. Челове

- 13 032829 ческое антитело может иметь по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или более положений, замещенных аминокислотным остатком, который не кодируется иммуноглобулиновой последовательностью зародышевой линии человека.

Человеческие антитела или их функциональные фрагменты по изобретению являются моноклональными. Особенно трудно получить человеческие антитела, которые являются моноклональными. В отличие от слияний мышиных В-клеток с иммортализованными клеточными линиями, слияния человеческих В-клеток с иммортализованными клеточными линиями нежизнеспособны. Таким образом, получение человеческих моноклональных антител является результатом преодоления значительных технических трудностей, которые по общему признанию существуют в области технологии получения антител. Моноклональная природа антител делает их особенно подходящими для использования в качестве терапевтических агентов, так как такие антитела будут существовать в виде отдельного, гомогенного молекулярного вида, который может быть хорошо охарактеризован, и воспроизводимо получен и очищен. Эти факторы приводят к получению продуктов, биологическую активность которых можно предсказать с высокой степенью точности, что очень важно для получения такими молекулами разрешения регуляторного органа для терапевтического введения людям. Термин моноклональное антитело при использовании здесь, относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, т. е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными за исключением возможных природных мутаций и/или посттрансляционных модификаций (например, изомеризации, амидирования), которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от обычных (поликлональных) препаратов антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. В дополнение к их специфичности, моноклональные антитела обладают тем преимуществом, что они синтезируются гибридомной культурой, незагрязненной другими иммуноглобулинами. Определение моноклональное указывает на природу антитела, как полученного, по существу, из гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать, как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены с помощью метода гибридом, впервые описанного Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), или могут быть получены методами рекомбинантной ДНК (см., например, патент US 4816567). Моноклональные антитела также могут быть выделены из фаговых библиотек антител с использованием методов, описанных, например, в Clackson et al., Nature, 352: 624628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

Моноклональные антитела или соответствующие функциональные фрагменты по изобретению являются человеческими антителами или соответствующими функциональными фрагментами. При рассмотрении агентов-антител, предназначенных для терапевтического введения людям, большим преимуществом является то, что эти антитела имеют человеческое происхождение. После введения пациентучеловеку человеческое антитело или его функциональный фрагмент, скорее всего, не будет вызывать сильного иммуногенного ответа со стороны иммунной системы пациента, т.е. не будет признано чужеродным, т.е. нечеловеческим белком. Это означает, что против терапевтического антитела не будут образовываться антитела у хозяина, т.е. пациента, что в противном случае блокировало бы терапевтическую активность антитела и/или ускорило бы выведение терапевтического антитела из организма пациента, таким образом препятствуя оказанию нужного терапевтического эффекта.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения человеческое моноклональное антитело или его функциональный фрагмент для использования в фармацевтических целях могут обладать реактивностью и у человека, и у по меньшей мере одного вида обезьян. Та же самая межвидовая реактивность также является предпочтительной для всех других, не являющихся антителами или не происходящих из антител соединений, нейтрализующих/ингибирующих GM-CSF.

Также здесь раскрыто, что антитело может быть IgG-антителом. Изотип IgG содержит не только вариабельные области тяжелых и легких цепей антитела, ответственные за высокое различительное распознание и связывание антигена, но также и константные области тяжелых и легких полипептидных цепей антитела, обычно присутствующие в производимых естественным образом антителах и в некоторых случаях даже модификации углеводами в одном или более сайтах. Такое гликозилирование является, как правило, признаком IgG-формата и локализовано в константных областях, содержащих так называемую Fc-область полного антитела, которое, как известно, вызывает различные эффекторные функции in vivo. Кроме того, Fc-область опосредует связывание IgG с Fc-рецептором, а также содействует хомингу IgG в места с повышенным присутствием Fc-рецептора, например в воспаленную ткань. Предпочтительно IgGантитело представляет собой IgG1-антитело или IgG4-антитело, форматы, которые являются предпочтительными, так как их механизм действия in vivo является особенно хорошо изученным и охарактеризованным. Это особенно относится к IgG1-антителам.

Согласно еще одному воплощению изобретения функциональный фрагмент антитела может предпочтительно представлять собой scFv, однодоменное антитело, Fv, VHH антитело, диатело, тандемное диатело, Fab, Fab' или F(ab)2. Эти форматы обычно можно разделить на два подкласса, а именно такие,

- 14 032829 которые состоят из одной полипептидной цепи, и такие, которые содержат по меньшей мере две полипептидные цепи. Первый подкласс включает scFv (содержащий одну VH область и одну VL область, соединенные в одну полипептидную цепь посредством полипептидного линкера); однодоменное антитело (содержащее одиночную вариабельную область антитела), такое как VHH-антитело (содержащее единичную VH-область). Последний подкласс включают Fv (содержащий одну VH-область и одну VLобласть в виде отдельных полипептидных цепей, которые нековалентно связаны друг с другом); диатело (содержащее две нековалентно связанные полипептидные цепи, каждая из которых содержит две вариабельные области антитела - обычно одну VH и одну VL на полипептидную цепь -эти две полипептидные цепи расположены в конформации голова к хвосту, так что образуется двухвалентная молекула антитела); тандемное диатело (биспецифические одноцепочечные Fv-антитела, содержащие четыре ковалентно связанных вариабельных -VH и VL - области иммуноглобулина с двумя разными специфичностями, образующие гомодимер, который в два раза больше диатела, описанного выше); Fab (содержащий в качестве одной полипептидной цепи целую легкую цепь антитела, которая сама содержит область VL и всю константную область легкой цепи, и в качестве другой полипептидной цепи часть тяжелой цепи антитела, содержащую целую область VH и часть константной области тяжелой цепи, где две указанные полипептидные цепи межмолекулярно соединены посредством дисульфидной связи между цепями); Fab' (как Fab выше, за исключением дополнительных восстановленных дисульфидных связей, содержащихся на тяжелой цепи антитела); и F(ab)₂ (содержащий две молекулы Fab', где каждая молекула Fab' связана с другой соответствующей молекулой Fab' посредством дисульфидных связей между цепями). В целом, функциональные фрагменты антител описанного выше типа способствуют большей гибкости в приспособлении, например, фармакокинетических свойств антитела, желательного для терапевтического введения, к частным имеющимся потребностям. Например, может быть желательно уменьшить размер вводимого антитела для того, чтобы увеличить степень проникновения в ткань при лечении тканей, которые известны как плохо васкуляризированные (например, суставов). В некоторых обстоятельствах может быть желательно увеличить скорость, с которой терапевтическое антитело выводится из организма, при этом указанная скорость может быть повышена путем уменьшения размера вводимого антитела. Фрагмент антитела определяется, как функциональный фрагмент антитела в контексте настоящего изобретения, пока фрагмент сохраняет характеристики специфического связывания в отношении эпитопа/мишени родительского антитела, т.е. пока он специфично связывается с GM-CSF или с рецептором GM-CSF.

Также здесь раскрыто, что указанное антитело или его функциональный фрагмент может присутствовать в моновалентной моноспецифической; поливалентной моноспецифической, в частности бивалентной моноспецифической; или поливалентной мультиспецифической, в частности бивалентной биспецифической форме. В общем случае, поливалентное моноспецифическое, в частности бивалентное моноспецифическое антитело, такое как полный человеческий IgG, как описано в данном описании изобретения выше, может принести с собой терапевтическое преимущество, заключающееся в том, что нейтрализация, осуществляемая таким антителом, усиливается за счет эффектов авидности, т. е. связывания тем же самым антителом нескольких молекул того же самого антигена, здесь GM-CSF или рецептора GM-CSF. Некоторые моновалентные моноспецифические формы фрагментов антител были описаны выше (например, scFv, Fv, VHH или однодоменное антитело). Поливалентные мультиспецифические, в частности бивалентные биспецифические формы антитела могут включать полноразмерный IgG, в котором одно связывающее плечо связывается с GM-CSF/рецептором GM-CSF приматов, в то время как другое связывающее плечо связывается с другим антигеном, отличным от GM-CSF/рецептора GM-CSF. Другая поливалентная мультиспецифическая, в частности бивалентная биспецифическая, форма может преимущественно быть человеческим одноцепочечным биспецифическим антителом, т.е. рекомбинантной конструкцией человеческого антитела, содержащей два scFv фрагмента, как описано выше, соединенных в одну непрерывную полипептидную цепь посредством короткого промежуточного полипептидного спейсера, хорошо известного в данной области техники (см., например, WO 99/54440 для анти0019x^^^-003 биспецифического одноцепочечного антитела). Здесь одна scFv-часть биспецифического одноцепочечного антитела, содержащаяся в биспецифическом одноцепочечном антителе, будет специфично связываться с GM-CSF/рецептором GM-CSF, как изложено выше, в то время как соответствующая другая scFv-часть этого биспецифического одноцепочечного антитела будет связываться с другим терапевтически полезным антигеном.

Согласно еще одному воплощению антитела или их функциональные фрагменты могут быть дериватизиврованы, например, органическим полимером, например одной или более молекулами полиэтиленгликоля (PEG) и/или поливинилпирролидона (PVP). Как известно в данной области техники, такая дериватизация может быть полезной в модулировании фармакодинамических свойств антител и их функциональных фрагментов. Особенно предпочтительными являются молекулы PEG, дериватизированные как PEG-малеимид, обеспечивающие конъюгацию с антителом или его функциональным фрагментом сайт-специфическим образом через сульфгидрильную группу аминокислоты цистеина. Из них особенно предпочтительными являются 20 кД и/или 40 кД PEG-малеимид в разветвленной или прямоцепочечной форме. Может быть особенно полезно увеличивать эффективную молекулярную массу более мелких фрагментов анти-GM-CSF-антитела человека, таких как scFv-фрагменты, путем соединения по

- 15 032829 следних с одной или более молекулами PEG, особенно PEG-малеимида.

Раскрытые здесь антитела также включают химерные антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из определенного вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, в то время как остаток цепи(ей) идентичен(ны) или гомологичен(ны) соответствующим последовательностям в антителах, полученных из других видов или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют необходимую биологическую активность (патент US 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Химерные интересующие антитела в данном описании изобретения включают primitized (примитизированные) антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, полученные из примата, не являющегося человеком (например, мартышек, обезьян и т.д.) и последовательностей человеческой константной области.

Гуманизированные формы нечеловеческих (например, мышиных) антител являются химерными иммуноглобулинами, иммуноглобулиновыми цепями или их фрагментами (такими как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител) главным образом из человеческих последовательностей, которые содержат минимальную последовательность, происходящую от нечеловеческого иммуноглобулина. Большей частью гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельной области (также CDR) реципиента заменены остатками из гипервариабельной области видов, не являющихся человеком (донорное антитело), таких как мышь, крыса или кролик, обладающие нужной специфичностью, аффинностью и активностью. В некоторых случаях остатки каркасного Fv-участка (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими нечеловеческими остатками. Кроме того, гуманизированные антитела, при использовании здесь, также могут содержать остатки, которые не обнаружены ни в реципиентном антителе, ни в донорном антителе. Такие модификации делают для дальнейшего улучшения и оптимизации характеристик антитела.

Гуманизированное антитело возможно также содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно человеческого иммуноглобулина. Дополнительные подробности см. В. Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al, Nature, 332: 323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

При использовании в данном описании изобретения нумерация аминокислотных остатков или положений в GM-CSF человека и не являющегося человеком примата относится к зрелому GM-CSF, т.е. GM-CSF без его 17 аминокислотной сигнальной последовательности (общая длина зрелого GM-CSF как у человека, так и у видов приматов, не являющихся человеком, описанного выше, составляет выше 127 аминокислот). Последовательность GM-CSF человека и GM-CSF гиббона является следующей:

SEQ Ш NO: 49

APARSPSPST QPWEHVNAIQ EARRLLN/A/? DTAAEMNETV EVISEMFDLQ

EPTCLQTRLE LYKQGLRGSL TKLKGPLTMM ASHYKQHCPP TPETSCATQI ITFESFKENL KDFLLVIPFD CWEPVQE

Последовательность GM-CSF некоторых обезьян семейства макак, таких как, например, макакарезус и яванский макак, является следующей:

SEQ ID NO: 50

APARSPSPGT QPWEHVNAIQ EARRLLNAS7? DTAAEMNKTV EVVSEMFDLQ

EPSCLQTRLE LYKQGLQGSL TKLKGPLTMM ASHYKQHCPP TPETSCATQI

ITFQSFKENL KDFLLVIPFD CWEPVQE Последовательность GM-CSF человека (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 58) являются следующими:

SEQ ГО NO: 57 и 58

APARSPSPST

57) и последовательность GM-CSF гиббона

QPWEHVNAIQ

EARRLLNLSR

DTAAEMNETV

EVISEMFDLQ

EPTCLQTRLE

LYKQGLRGSL

TKLKGPLTMM

ASHYKQHCPP

TPETSCATQI

ITFESFKENL

KDFLLVIPFD CWEPVQE

Последовательности GM-CSF некоторых обезьян семейства макак, резус (SEQ ID NO: 59) и яванский макак (SEQ ID NO: 60) также являются следующими: SEQ ГО NO: 59 и 60

APARSPSPGT таких как, например, макакаQPWEHVNAIQ

EARRLLNLSR

DTAAEMNKTV

EVVSEMFDLQ

EPSCLQTRLE

LYKQGLQGSL

TKLKGPLTMM

ASHYKQHCPP

TPETSCATQI

ITFQSFKENL описано в данном описании

KDFLLVIPFD CWEPVQE

Минимальный эпитоп, преимущественно прерывистый эпитоп, как изобретения, связываемый антителом, предпочтительно человеческим моноклональным антителом (или его функциональным фрагментом), указанный в последовательности(ях) GM-CSF выше жирным шрифтом.

- 16 032829

Согласно предпочтительному воплощению человеческое моноклональное антитело, нейтрализующее GM-CSF, или его функциональный фрагмент, который связывается с GM-CSF, связывается с эпитопом GM-CSF, который предпочтительно содержит аминокислоты 23-27 (RRLLN) и/или аминокислоты 65-77 (GLR/QGSLTKLKGPL). Эти участки аминокислотной последовательности указаны в вышеуказанной последовательности GM-CSF жирным шрифтом. Термин эпитоп относится к сайту на антигене или мишени (например GM-CSF), с которым соединение, такое как антитело или его функциональный фрагмент, специфично связывается. Указанное связывание/взаимодействие также следует понимать как специфическое распознавание. Эпитопы могут быть образованы как соседними аминокислотами, так и несоседними аминокислотами, помещенными рядом друг с другом в результате третичной укладки белка. Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, в котором первичная аминокислотная последовательность содержит распознанный эпитоп. Линейный эпитоп обычно включает по меньшей мере 3 или по меньшей мере 4 и более часто по меньшей мере 5, или по меньшей мере 6, или по меньшей мере 7, например от примерно 8 до примерно 10 аминокислот или более в уникальной последовательности. В контексте настоящего изобретения предпочтительно, чтобы эпитоп GM-CSF представлял собой прерывистый эпитоп. В случае, когда антитело связывается с обоими участками последовательностями от 23 до 27 и от 65 до 77, эпитоп может быть назван прерывистым. Во вторичной структуре человеческого GM-CSF аминокислоты 15-35 расположены в спирали А, в то время как остатки, соответствующие положениям 65-77, являются частью петлеобразной структуры, расположенной между спиралями С и D. Трехмерная модель укладки молекулы показывает близкую пространственную близость этих сайтов друг к другу (см. также WO 2006/111353). При использовании здесь термин прерывистый эпитоп следует понимать, как по меньшей мере два несмежных участка аминокислотной последовательности в данной полипептидной цепи, в данном случае в зрелом GM-CSF человека и примата, не являющегося человеком, которые одновременно и специфично связываются антителом. Согласно этому определению, такое одновременное специфическое связывание может происходить с полипептидом GM-CSF в линейной форме. Здесь можно представить зрелый полипептид GM-CSF, формирующий удлиненную петлю, в одной области которой две последовательности, указанные выше жирным шрифтом, выстраиваются, например, более или менее параллельно и в непосредственной близости друг от друга. В таком состоянии они специфично и одновременно связываются фрагментом антитела. Согласно этому определению одновременное специфическое связывание двух областей последовательности зрелого GM-CSF, указанных выше, может также принять форму связывания антитела с конформационным эпитопом. Здесь зрелый GM-CSF уже сформировал свою третичную конформацию, в которой он обычно существует in vivo. В этой третичной конформации полипептидная цепь зрелого GM-CSF уложена таким образом, чтобы привести два отрезка последовательности, указанных выше, в пространственную близость, например, на наружной поверхности определенного участка зрелого сложенного GM-CSF, где они затем распознаются благодаря их трехмерной конформации в контексте окружающих полипептидных последовательностей.

В еще одном предпочтительном воплощении приведенный выше эпитоп или приведенный выше прерывистый эпитоп GM-CSF дополнительно содержит аминокислоты 28-31 (LSRD), выделенные курсивом в приведенных выше последовательностях GM-CSF человека и примата, не являющегося человеком;

аминокислоты 32-33 (ТА), подчеркнутые в приведенных выше последовательностях GM-CSF человека и примата, не являющегося человеком; и/или аминокислоты 21-22 (ЕА), подчеркнутые в приведенных выше последовательностях GM-CSF человека и примата, не являющегося человеком.

Предпочтительные человеческие моноклональные анти-GM-CSF антитела или их функциональные фрагменты представляют собой такие, которые конкретно описаны в WO 2006/111353 как SEQ ID NO: 148 и 52-56 с изображением аминокислотных последовательностей областей, определяющих комплементарность (CDR) 1-3, тяжелых и легких цепей, а также вариабельных областей тяжелых и легких цепей и полноразмерных тяжелых и легких цепей.

Особенно предпочтительными являются анти-GM-CSF антитела или их функциональные фрагменты, содержащие последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 15, и последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 1; или содержащие последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 15, и последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR3, представленную в SEQ ID NO: 2; или содержащие последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 15, и последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 3; или содержащие последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 15, и последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 4; или содержащие последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, представленную

- 17 032829 в SEQ ID NO: 14, последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 15, и последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 5; или содержащие последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 15, и последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 6; или содержащие последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 15 и последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 7; или содержащие последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 15, и последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 8; или содержащие последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 15, и последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 9; или содержащие последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 15, и последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 10; или содержащие последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 15, и последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 11; или содержащие последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 15, и последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 12; или содержащие последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 15, и последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 13; или содержащие последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 15, и последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 56.

Еще более предпочтительно, когда любая из вышеуказанных 14 комбинаций CDR1, CDR2 и CDR3 последовательностей тяжелой цепи существует в антителе или его функциональном фрагменте, также содержащем в вариабельном участке легкой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18.

Особенно предпочтительное анти-GM-CSF антитело или его функциональный фрагмент содержит последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 15, и последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 2, а также содержит в вариабельной области легкой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17, и CDR3, содержащую аминокислотная последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18. Это анти-GM-CSF антитело представляет собой наиболее предпочтительное соединение для нейтрализации GM-CSF и также описано в WO 2006/111353.

Согласно еще одному воплощению анти-GM-CSF антитело или его функциональный фрагмент содержит в вариабельной области легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19. Предпочтительным является антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24; или антитело или его функциональ

- 18 032829 ный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53.

Согласно еще одному воплощению анти-GM-CSF антитело или его функциональный фрагмент содержит в вариабельной области легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54. Предпочтительным является антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29; или антитело

- 19 032829 или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53.

Согласно еще одному воплощению анти-GM-CSF антитело или его функциональный фрагмент содержит в вариабельной области легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55. Предпочтительным является антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в

- 20 032829

SEQ ID NO: 52; или антитело или его функциональный фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53.

Анти-GM-CSF антитело или его функциональный фрагмент по изобретению содержит в вариабельной области легкой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18 и содержит в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 56.

В еще одном предпочтительном воплощении антитело содержит в легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, и в тяжелой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35; или в легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, и в тяжелой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36; в тяжелой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37; в легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, и в тяжелой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38; в легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, и в тяжелой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39; в легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, и в тяжелой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40; в легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, и в тяжелой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41; в легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, и в тяжелой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42; в легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, и в тяжелой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 43; в легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, и в тяжелой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 44; в легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, и в тяжелой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 45; в легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, и в тяжелой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 46; в легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, и в тяжелой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 47; в легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, и в тяжелой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 48. Анти-GM-CSF антитело, содержащее в своей легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, и в своей тяжелой цепи аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35, представляет собой наиболее предпочтительное соединение для нейтрализации GM-CSF и оно также описано в WO 2006/111353.

Молекулы человеческого моноклонального антитела и/или его функциональные фрагменты по изобретению особенно предпочтительны в качестве нейтрализаторов активности GM-CSF людей. Антитела и их функциональные фрагменты в соответствии с этими особенно предпочтительными воплощениями являются очень полезными по нескольким причинам.

Во-первых, они узнают GM-CSF людей с высокой специфичностью. То есть из смеси GM-CSF приматов с другими колониестимулирующими факторами человека связывающие молекулы согласно этим воплощениям являются высокоселективными к GM-CSF людей, в то время как другие колониестимулирующие факторы в этой же среде не распознаются. Это означает, что антитело или его функциональный фрагмент в соответствии с этими воплощениями при введении человеку, как ожидается, будут специфично связывать и нейтрализовать только нужную мишень, в то время как другие нежелательные мишени не связываются и не нейтрализуются. В конечном счете, это приводит к высокой степени прогнозирования в отношении терапевтического образа действия in vivo.

Во-вторых, связывающие вещества согласно этим особенно предпочтительным воплощениям связываются с GM-CSF людей с существенной аффинностью. Существенная аффинность включает связывание с аффинностью примерно 10^-6 М (KD) или выше. Предпочтительно связывание считается существенным (или высоким или специфичным), когда аффинность связывания составляет примерно от 10^-12 до 10^-8 М, от 10^-12 до 10^-9 M, от 10^-12 до 10^-10 М, от 10^-11 до 10^-8 М, предпочтительно примерно от 10^-11 до 10^-9 М. Соответственно, связывающее вещество по изобретению предпочтительно имеет KD в пределах этого диапазона. Учитывая, что для молекул антител, описанных здесь, наблюдались значения KD, составляющие от примерно 4х10^-9 М вплоть до примерно 0,04х0^-9 М, где последнее значение соответствует примерно 40 пМ, предпочтительно, чтобы молекулы антител по изобретению имели KD в пределах этого диапазона. Однако также предпочтительно, чтобы молекулы антител по изобретению имели K_D, как описано выше в данном описании изобретения. Поскольку кинетическая скорость ассоциации таких молекул

- 21 032829 в водной среде в значительной степени контролируется диффузией и, следовательно, не может быть улучшена за пределы того, что позволяют условия локальной диффузии в физиологических условиях, низкое значение KD возникает, главным образом, как результат кинетической скорости диссоциации koff, которая для связывающего антитела с самой высокой аффинностью составляет приблизительно 10^-5 с^-1. Это означает, что как только образуется комплекс между человеческим моноклональным антителом или его функциональным фрагментом по любому из этих воплощений, с одной стороны, и GM-CSF, с другой стороны, его не легко или, по меньшей мере, не быстро разделяется. Для связывающих молекул, предполагаемых для применения в качестве нейтрализаторов биологической активности, эти характеристики являются очень предпочтительными, так как нужный нейтрализующий эффект будет продолжаться только до тех пор, пока молекула, биологическую активность которой следует нейтрализовать (здесь GM-CSF человека), остается связанной с нейтрализующей связывающей молекулой. Таким образом, нейтрализующая молекула, которая остается связанной со своей предполагаемой мишенью в течение длительного времени, будет продолжать нейтрализацию в течение соответствующего длительного времени.

Высокая аффинность связывания антител или их функциональных фрагментов с GM-CSF людей имеет дополнительное преимущество. Как правило, антитела или их функциональные фрагменты будут удаляться из кровотока пациента зависимым от размера образом, при этом молекулы меньшего размера выделяются и удаляются раньше, чем более крупные. Поскольку комплекс двух полипептидов - антитела или фрагмента антитела и связанного GM-CSF - очевидно больше, чем одно антитело, результатом низкого указанного выше значения koff является то, что терапевтический нейтрализатор выделяется и удаляется из организма пациента медленнее, чем в том случае, когда он не связан с GM-CSF. Таким образом, увеличивается не только величина нейтрализующей активности, но и ее длительность in vivo.

Нейтрализующая активность, определенная для связывающих веществ в соответствии с вышеуказанными воплощениями, является неожиданно высокой. Как будет описано более подробно ниже, GMCSF-нейтрализующую активность измеряли in vitro с использованием анализа подавления роста TF-1 (Kitamura, Т. et al. (1989). J. Cell Physiol. 140, 323-34). В качестве показателя нейтрализующего потенциала измеряли значения IC₅₀, представляющие собой концентрацию антитела или его функционального фрагмента согласно любому из этих воплощений, необходимую для того, чтобы вызвать полумаксимальное ингибирование пролиферации клеток TF-1. Для человеческих моноклональных анти-GM-CSF антител или их функциональных фрагментов, описанных выше, было определено значение IC50, составляющее приблизительно 3х10^-10 М или примерно 0,3 нМ. Связывающие молекулы, следовательно, являются очень эффективными нейтрализаторами активности GM-CSF человека.

Другие примеры нейтрализующих анти-GM-CSF антител представляют собой человеческое антитело E10 и человеческое антитело G9, описанные в Li el al., (2006) PNAS 103(10):3557-3562. E10 и G9 представляют собой антитела IgG-класса. E10 обладает аффинностью связывания 870 пМ в отношении GM-CSF, и G9 обладает аффинностью связывания 14 пМ в отношении GM-CSF. Оба антитела являются специфичными в отношении связывания с человеческим GM-CSF и демонстрируют сильную нейтрализующую активность, как определено с помощью анализа подавления клеточной пролиферации TF-1. Другими примерами являются человеческие анти-GM-CSF антитела, как описано в WO 2006/122797.

Также раскрыты GM-CSF-антагонисты, которые включают антитела к α-цепи или β-цепи рецептора GM-CSF. Антитело к рецептору GM-CSF, раскрытое здесь, может находиться в любой форме антитела, как описано выше, например интактного, химерного, моноклонального, поликлонального антитела, в форме фрагмента или производного антитела, одноцепочечного, гуманизированного, подвергнутого гуманирингу (humaneered) и тому подобного. Примеры антител к рецептору GM-CSF, например, нейтрализующих антитела с высокой аффинностью, известны в данной области техники (см., например, патент US 5747032 и Nicola et al., Blood 82:15 1724, 1993).

Примеры известных антител к GM-CSF представлены в WO 2006/122797, WO 2007/049472, WO 2007/092939, WO 2009/134805, WO 2009/064399, WO 2009/038760. Антитела к рецептору GM-CSF представлены в WO 2007/110631.

Таким образом, антитела против GM-CSF и их функциональные фрагменты демонстрируют высокую степень дифференциации в отношении нужного антигена, связывают этот антиген очень сильно и в течение продолжительного промежутка времени и демонстрируют высокоэффективную нейтрализующую активность в течение продолжительного промежутка времени, когда они остаются связанными. В то же время продолжительная стабильность комплекса связывающее вещество-антиген замедляет удаление этого связывающего вещества из организма, тем самым увеличивая длительность нужного терапевтического эффекта in vivo. Такие же характеристики могут также применяться для антител, которые узнают рецептор GM-CSF, как описано выше.

Композиция по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой фармацевтическую композицию. В соответствии с настоящим воплощением термин фармацевтическая композиция относится к композиции для введения пациенту, предпочтительно пациенту-человеку. Фармацевтические композиции или составы находится обычно в такой форме, чтобы позволить биологической активности

- 22 032829 активного ингредиента быть эффективной и, следовательно, могут быть введены субъекту для терапевтического применения, как описано в данном описании изобретения. Обычно фармацевтическая композиция содержит подходящие (т.е. фармацевтически приемлемый) составы носителей, стабилизаторов и/или эксципиентов. В предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция представляет собой композицию для парентерального, трансдермального, внутрипросветного, внутриартериального, интратекального и/или интраназального введения или для непосредственной инъекции в ткань. В частности, предусмотрено, что указанную композицию вводят пациенту посредством инфузии или инъекции. Введение подходящих композиций может быть осуществлено разными способами, например посредством внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, внутримышечного, местного или внутрикожного введения. Композиция по настоящему изобретению может также содержать фармацевтически приемлемый носитель. Примеры подходящих фармацевтических носителей хорошо известны в данной области техники и включают буферные солевые растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода, различные виды смачивающих агентов, стерильные растворы, липосомы и т. д. Композиции, содержащие такие носители, могут быть приготовлены хорошо известными традиционными способами.

В соответствии с настоящими воплощениями термин эффективное количество относится к количеству соединения, нейтрализующего GM-CSF, которое эффективно для лечения заболеваний, ассоциированных с GM-CSF, таких как воспалительные и аутоиммунные расстройства.

Предпочтительными дозами и предпочтительными способами введения являются такие, которые после введения соединения, нейтрализующего GM-CSF, присутствуют в крови в эффективных дозировках. Режим введения можно регулировать, наблюдая за болезненными состояниями и анализируя сывороточные уровни соединения, нейтрализующего GM-CSF, в лабораторных тестах, после чего либо увеличивают интервал между введениями, например, от двух раз в неделю или одного раза в неделю до одного раза в две недели, одного раза в три недели, одного раза в четыре недели и тому подобного, или, альтернативно, затем соответственно уменьшают интервал между введениями.

Фармацевтические композиции можно вводить субъекту в подходящей дозе. Схема приема лекарственного средства определяется лечащим врачом и клиническими факторами. Как хорошо известно в области медицины, дозы для любого пациента зависят от многих факторов, включая размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное вводимое соединение, пол, время и способ введения, общее состояние здоровья и другие лекарственные средства, вводимые одновременно.

Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и буферные среды. Парентеральные носители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, раствор Рингера с лактатом или нелетучие масла. Внутривенные носители включают жидкие и питательные наполнители, электролитные наполнители (например, на основе декстрозы Рингера) и т.п. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты, инертные газы и тому подобное. Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать белковоподобные носители, такие как, например, сывороточный альбумин или иммуноглобулин, предпочтительно человеческого происхождения. Предполагается, что фармацевтическая композиция по изобретению может содержать в дополнение к описанным выше соединениям дополнительные биологически активные агенты в зависимости от предполагаемого использования фармацевтической композиции. Такими агентами могут быть лекарственные средства, действующие на желудочно-кишечный тракт, лекарственные средства, действующие в качестве цитостатиков, лекарственные средства, предотвращающие гиперурикемию, лекарственные средства, подавляющие иммунные реакции (например, кортикостероиды), лекарственные средства, модулирующие воспалительную реакцию, лекарственные средства, действующие на систему кровообращения, и/или такие агенты, как цитокины, известные в данной области техники.

Для анализа эффекта GM-CSF-нейтрализующего соединения, например, при ревматоидном артрите (RA), итоговые критерии могут быть выбраны, например, из фармакокинетики, иммуногенности и эффективности в улучшении клинических признаков и симптомов RA, измеренных посредством DAS28, ACR20/50/70 и/или ответа по критериям EULAR (Европейская лига против ревматизма), магнитнорезонансной визуализации (MRI) для синовита и отека костного мозга, а также результатов, сообщаемых пациентом. ACR (критерий Американской коллегии ревматологии) представляет собой критерий, суммирующий улучшение в отношении количества болезненных и распухших суставов, по шкале боли, по оценке улучшения по мнению пациентов и врачей, и улучшение некоторых лабораторных маркеров. ACR 20 описывает процент участников исследования, которые достигают 20%-го улучшения клинических признаков и симптомов, например 20%-го улучшения числа болезненных или опухших суставов, а также 20%-го улучшения трех других критериев, соответствующих заболеванию.

Другой основной задачей в разработке лекарственных средств, таких как фармацевтическая композиция по изобретению, является предсказуемое изменение фармакокинетических свойств. С этой целью

- 23 032829 устанавливают фармакокинетический профиль лекарственного средства-кандидата, т.е. профиль фармакокинетических параметров, которые влияют на способность конкретного лекарственного средства лечить данное состояние. Фармакокинетические параметры лекарственного средства, влияющие на способность лекарственного средства лечить определенную нозологическую форму, включают, без ограничения ими, время полувыведения, объем распределения, эффект первого прохождения через печень и степень связывания сывороткой крови. Эффективность данного лекарственного средства может зависеть от каждого из указанных выше параметров. Время полувыведения означает время, когда 50% введенного лекарственного средства удалено посредством биологических процессов, например метаболизма, выведения и т.д. Эффект первого прохождения через печень означает склонность лекарственного средства подвергаться метаболизму при первом контакте с печенью, т.е. во время его первого прохождения через печень. Объем распределения означает степень удерживания лекарственного средства в различных компартментах тела, таких как, например, внутриклеточные и внеклеточные пространства, ткани и органы и т.д., и распределение лекарственного средства внутри этих компартментов. Степень связывания сывороткой крови означает склонность лекарственного средства взаимодействовать и связываться с белками сыворотки крови, такими как альбумин, что приводит к уменьшению или потере биологической активности лекарственного средства.

Фармакокинетические параметры также включают биодоступность, латентный период (Tlag), Tmax, скорости абсорбции и/или C_max для данного количества введенного лекарственного средства. Биодоступность означает количество лекарственного средства в компартенте крови. Латентный период означает задержку по времени между введением лекарственного средства и его обнаружением и измерением в крови или плазме. T_max представляет собой время, после которого достигается максимальная концентрация в крови, абсорбцию определяют как продвижение лекарственного средства из места введения в системный кровоток, и C_max представляет собой максимальную полученную концентрацию в крови данного лекарственного средства. На время достижения концентрации лекарственного средства в крови и ткани, которая требуется для его биологического эффекта, оказывают влияние все параметры.

Термин токсичность, при использовании здесь, относится к токсическим эффектам лекарственного средства, проявляющимся в нежелательных явлениях или тяжелых нежелательных явлениях. Эти побочные явления могут быть связаны с отсутствием переносимости лекарственного средства в целом и/или отсутствием местной переносимости после введения. Токсичность может также включать тератогенные и канцерогенные эффекты, вызванные лекарственным средством.

Термины безопасность, in vivo безопасность или переносимость, при использовании здесь, определяют введение лекарственного средства без индуцирования тяжелых нежелательных явлений непосредственно после введения (местная переносимость) и в течение более длительного периода применения препарата. Безопасность, in vivo безопасность или переносимость может быть оценена, например, через регулярные промежутки времени во время лечения и периода наблюдения. Измерения включают клиническую оценку, например органные проявления, и скрининг лабораторных аномалий. Клиническая оценка может быть выполнена и отклонения от нормальных результатов записаны/закодированы в соответствии с NCI-СТС (Общие критерии токсичности Национального института исследования рака) и/или стандартами MedDRA (Медицинский словарь терминов регламентирующей деятельности). Органные проявления могут включать такие критерии, как аллергия/иммунология, кровь/костный мозг, сердечная аритмия, коагуляция и т.п., как изложено, например, в Общих терминологических критериях оценки нежелательных явлений v3.0 (CTCAE). Лабораторные параметры, которые могут быть исследованы, включают, например, гематологию, клиническую химию, профиль коагуляции и анализ мочи, и исследование других жидкостей организма, таких как сыворотка, плазма, лимфоидная или спинно-мозговая жидкость, ликвор и т.д. Безопасность, таким образом, можно оценить, например, посредством медицинского осмотра, методик визуализации (т.е. ультразвука, рентгена, КТ (компьютерная томография)-сканирования, магнитно-резонансной визуализации (MPI), других измерений с помощью технических устройств (т.е. электрокардиограмма), основных показателей состояния организма, путем измерения лабораторных параметров и регистрации побочных нежелательных явлений. Термин эффективная и нетоксичная доза, при использовании здесь, относится к переносимой дозе соединения, нейтрализующего GM-CSF, предпочтительно антитела, как определено здесь, которая является достаточно высокой, чтобы вылечить или стабилизировать интересующее заболевание без или, по существу, без значительных токсических эффектов. Такие эффективные и нетоксичные дозы могут быть определены, например, посредством исследований с повышением дозы, описанных в данной области техники, и они должны быть ниже дозы, индуцирующей тяжелые нежелательные побочные явления (дозолимитирующая токсичность, DLT).

Композиция по настоящему изобретению (иногда также называемая в данном описании композиция вещества; состав или раствор) предпочтительно может находиться в различных физических состояниях, таких как жидкие, замороженные, лиофилизированные, сублимированные, высушенные распылением и восстановленные композиции, предпочтительно жидкие и замороженные.

Жидкая композиция, при использовании здесь, относится к композиции вещества, которая существует в виде жидкости, характеризуемой свободным передвижением составляющих молекул между со

- 24 032829 бой, но без тенденции к расслаиванию при комнатной температуре. Жидкие композиции включают водные и неводные жидкости, при этом водные композиции являются предпочтительными. Водной композицией является композиция, в которой растворителем или основным растворителем является вода, предпочтительно вода для инъекции (WFI). Растворение соединения, нейтрализующего GM-CSF, в композиции, может быть гомогенным или гетерогенным, причем гомогенное является предпочтительным, как описано выше.

Любая подходящая неводная жидкость может быть использована при условии, что она обеспечивает стабильность композиции по изобретению. Предпочтительно неводная жидкость представляет собой гидрофильную жидкость. Иллюстративные примеры подходящих неводных жидкостей включают глицерин; диметилсульфоксид (DMSO); полидиметилсилоксан (PMS); этиленгликоли, такие как этиленгликоль, диэтиленгликоль, триэтиленгликоль, полиэтиленгликоль (PEG) 200, PEG 300 и PEG 400; и пропиленгликоли, такие как дипропиленгликоль, трипропиленгликоль, полипропиленгликоль (PPG) 425 и PPG 725.

Смешанная водная/неводная жидкая композиция, при использовании здесь, относится к жидкой композиции, которая содержит смесь воды, предпочтительно WFI, и дополнительную жидкую композицию.

При использовании в данном описании изобретения препарат или композиция представляет собой смесь соединения, нейтрализующего GM-CSF (т.е. активного лекарственного средства/вещества), и дополнительных химических веществ и/или добавок, необходимых для медицинского продукта, который предпочтительно находится в жидком состоянии. Композиция по настоящему изобретению включает фармацевтическую композицию.

Приготовление композиции включает процесс, в котором разные химические вещества, в том числе активное лекарственное средство, объединяют с получением конечного медицинского продукта, такого как фармацевтическая композиция. Активным лекарственным средством композиции по изобретению является соединение, нейтрализующее GM-CSF.

В некоторых воплощениях соединение, нейтрализующее GM-CSF, которое следует приготовить в виде препарата, является, по существу, чистым и/или, по существу, гомогенным (т.е., по существу, не содержащим загрязняющих веществ, например белков и т.д., которые могут быть примесями, связанными с продуктом и/или с процессом). Термин по существу, чистый означает композицию, содержащую по меньшей мере примерно 80%, предпочтительно примерно 90, предпочтительно по меньшей мере примерно 95, более предпочтительно по меньшей мере примерно 97 или наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 98 мас.% соединения, предпочтительно соединения в мономерном состоянии. Термин по существу, гомогенный означает композицию, содержащую по меньшей мере примерно 99 мас.% соединения, предпочтительно соединения в мономерном состоянии, исключая массу различных стабилизаторов и воды в растворе.

При использовании в данном описании изобретения под термином примерно подразумевается, что может иметь место варьирование соответствующего значения или диапазона (такого как рН, концентрация, процент, молярность, число аминокислот, время и т.д.), которое может составлять вплоть до 5%, вплоть до 10%, вплоть до 15%, или вплоть до и включая 20% от данного значения. Например, если композиция содержит примерно 5 мг/мл соединения, это следует понимать, что препарат может содержать от 4 до 6 мг/мл, предпочтительно от 4,25 до 5,75 мг/мл, более предпочтительно от 4,5 до 5,5 мг/мл, и еще более предпочтительно от 4,75 до 5,25 мг/мл, при этом наиболее предпочтительным является 5 мг/мл. При использовании здесь, интервал, который определен как (от) X до Y соответствует интервалу, который определен как между X и Y. Оба интервала, в частности, включают верхнюю границу, а также нижнюю границу. Это означает, что, например, интервал от 5 мг/мл до 10 мг/мл или между 5 мг/мл и 10 мг/мл включает концентрации 5, 6, 7, 8, 9 и 10 мг/мл, а также любое промежуточное значение.

Стабильная композиция представляет собой композицию, в которой соединение, нейтрализующее GM-CSF, по существу сохраняет свою физическую стабильность, и/или химическую стабильность, и/или биологическую активность при хранении и/или не показывает существенных признаков агрегации, осаждения, фрагментации, деградации и/или денатурации по сравнению с контрольным образцом, предпочтительно при визуальной проверке цвета и/или чистоты или при измерении с помощью УФ-светорассеяния или с помощью гель-хроматографии. Различные дополнительные аналитические методы измерения стабильности белка доступны в данной области техники и рассматриваются), например, в Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) и Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993).

Во время хранения, при использовании здесь, означает, что композиция, единожды приготовленная, не используется немедленно; точнее, после ее приготовления ее упаковывают для хранения либо в жидком виде, в замороженном состоянии либо в высушенной форме для последующего восстановления в жидкую форму или в другую форму.

Предполагается, что соединение, нейтрализующее GM-CSF, является предпочтительно стабильным, поскольку оно, по существу, не образует агрегаты или фрагменты/продукты деградации (например по одной или более вышеуказанных причин) во время хранения, и/или во время или после заморажива

- 25 032829 ния/оттаивания, и/или во время или после сдвигового напряжения (например, встряхивания). Соответственно, предпочтительно предусмотрено, что не более 10% соединения, нейтрализующего GM-CSF, более предпочтительно не более 8%, еще более предпочтительно не более 5%, особенно предпочтительно не более 2% относительно количества соединения, нейтрализующего GM-CSF, в начале хранения, или перед выполнением одного или более циклов замораживания/оттаивания, или перед выполнением исследований со встряхиванием образуют агрегаты и/или фрагменты. Эта стабильность предпочтительно применима для диапазона времени по меньшей мере 1 месяц, по меньшей мере 2 месяца или по меньшей мере месяца; предпочтительно по меньшей мере 4 месяца, по меньшей мере 5 месяцев или по меньшей мере 6 месяцев; более предпочтительно по меньшей мере 9 месяцев или по меньшей мере 12 месяцев; еще более предпочтительно по меньшей мере 18 месяцев или по меньшей мере 24 месяца и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 месяцев, или по меньшей мере 36 месяцев, или по меньшей мере 48 месяцев, или по меньшей мере 54 месяца, или по меньшей мере 60 месяцев. Предпочтительными температурными условиями хранения является комнатная температура (от примерно 20 до примерно 25°С), более предпочтительно примерно 2-8°С, наиболее предпочтительный временной диапазон составляет по меньшей мере 3 года или даже по меньшей мере 4 года. Число циклов замораживания/оттаивания, во время которых соединение является предпочтительно стабильным в соответствии с вышеуказанными параметрами, составляет по меньшей мере один цикл, предпочтительно по меньшей мере 2, 3 или 4 цикла, более предпочтительно по меньшей мере 5, 6 или 7 циклов и наиболее предпочтительно по меньшей мере 8, 9 или 10 циклов. Число суток встряхивания, в течение которых соединение является предпочтительно стабильным в соответствии с вышеуказанными параметрами (например, при температуре +5±3°С, см. также пример 12d), составляет по меньшей мере 1 сутки, предпочтительно по меньшей мере 2, 3 или суток, более предпочтительно по меньшей мере 5, 6 или 7 суток, еще более предпочтительно по меньшей мере 8, 9, 10 или 11 суток и наиболее предпочтительно по меньшей мере 12, 13 или 14 суток.

Альтернативно предполагается, что соединение, нейтрализующее GM-CSF, предпочтительно является стабильным, поскольку оно не образует димеры, олигомеры или фрагменты. Другими словами, стабильность соединения, нейтрализующего GM-CSF, может быть определена по проценту мономерного белка в растворе с низким процентом деградированного (например, фрагментированного) и/или агрегированного белка. Например, композиция по изобретению, содержащая соединение, нейтрализующее GM-CSF, такое как антитело, может включать по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, особенно предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% мономера соединения, нейтрализующего GM-CSF.

Под агрегатом подразумевается физическое взаимодействие между молекулами белка, которое приводит к образованию ковалентных или нековалентных димеров или олигомеров (т. е. высокомолекулярных объектов), которые могут оставаться растворимыми или образовывать нерастворимые агрегаты, которые выпадают в осадок из раствора. Агрегат также включает деградированный и/или фрагментированный белок.

Как указано в данном описании выше, целый ряд разных аналитических методов можно использовать для обнаружения присутствия и уровня агрегатов в композиции, содержащей соединение, нейтрализующее GM-CSF. Они включают, без ограничения ими, например, нативный электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE), электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), капиллярный гель-электрофорез (CGE), гель-фильтрацию (SEC), аналитическое ультрацентрифугирование (AUC), фракционирование в потоке под действием поля (FFF), обнаружение светорассеяния, скорость седиментации, УФ-спектроскопию, дифференциальную сканирующую калориметрию, турбидиметрию, нефелометрию, микроскопию, эксклюзионную высокоэффективную жидкостную хроматографию (SE-HPLC), обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (RPHPLC), тандемную масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (ESI-MS) и тандемную RPHPLC/ESI-MS, методику поточного фракционирование в потоке под действием поля и статическое и/или динамическое светорассеяние. Эти методы могут быть использованы отдельно, либо в комбинации. Предпочтительно аналитическими методами для обнаружения присутствия и уровней агрегатов и/или фрагментов в композиции, содержащей соединение, нейтрализующее GM-CSF, являются гельфильтрационная хроматография, такая как SE-HPLC, аналитическое ультрацентрифугирование и фракционирование в потоке под действием ассиметричного поля. Способом определения биологической активности соединения, нейтрализующего GM-CSF, является, например, измерение его степени связывания с (иммобилизованным) GM-CSF (или рецептором GM-CSF) с помощью так называемого поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

Общей проблемой композиции, содержащей белок, является необратимое накопление агрегатов с течением времени, под действием тепла или напряжения сдвига. Как правило, когда агрегаты выпадают в осадок, они образуют крупные частицы, которые легко обнаружить. Однако более мелкие, нековалентные растворимые агрегаты, которые часто являются предшественниками осаждения крупных частиц, труднее обнаружить и количественно определить. Таким образом, способы определения и количественного определения агрегатов белка в белковой композиции должны быть основаны на типе оцениваемого

- 26 032829 агрегата.

Среди вышеуказанных способов рекомендуемыми методами определения присутствия и/или количества растворимых, ковалентных агрегатов в белковой композиции являются SEC/рассеяние света, SDSPAGE, CGE, RP-HPLC/ESI-MS, FFF и AUC: Рекомендуемыми методами определения присутствия и/или количества растворимых, нековалентных агрегатов в белковой композиции являются SEC, PAGE, SDSPAGE, CGE, FFF, AUC и динамическое рассеяние света. Рекомендуемыми методами определения присутствия и/или количества нерастворимых, нековалентных агрегатов в белковой композиции являются УФ-спектроскопия, турбидиметрия, нефелометрия, микроскопия, AUC, фракционирование в потоке под действием ассиметричного поля и динамическое рассеяние света.

Кроме того, композиция по изобретению предпочтительно обеспечивает улучшенное длительное хранение так, чтобы соединение, нейтрализующее GM-CSF, оставалось стабильным в течение срока хранения либо в жидком, либо в замороженном, предпочтительно в жидком виде. При использовании здесь фразу длительное хранение следует понимать как то, что композиция может храниться в течение по меньшей мере одного месяца, двух или трех месяцев или более, в течение шести месяцев или более и предпочтительно в течение одного года и более, или даже 2 лет, 3 лет или 4 лет или 5 лет и более. Под длительным хранением также следует понимать, что фармацевтическая композиция хранится либо при температуре 2-8°С, либо при комнатной температуре, предпочтительно при 2-8°С, таким образом, композиция предпочтительно не теряет своей биологической активности в такой степени, как описано в данном описании изобретения, и/или не образует агрегаты в такой степени, как описано в данном описании изобретения, и/или содержит мономеры в такой степени, как описано в данном описании изобретения. Проверка этих свойств описана в другом месте данного документа.

В одном аспекте изобретения соединение, нейтрализующее GM-CSF, в композиции, является стабильным в жидком виде в течение по меньшей мере 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев; по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев; по меньшей мере 6 месяцев; по меньшей мере 12 месяцев; по меньшей мере 24 месяцев; по меньшей мере 36 месяцев; по меньшей мере 48 месяцев, наконец 60 месяцев. Диапазоны, являющиеся промежуточными для вышеприведенных периодов времени, как предполагается, также являются частью изобретения, например 9 месяцев и так далее. Кроме того, предполагается, что включены диапазоны значений с использованием комбинации любых вышеперечисленных значений, таких как верхние и/или нижние границы.

Предпочтительно композиция является стабильной при комнатной температуре (примерно от 20 до 25°С) в течение по меньшей мере 1 месяца и/или стабильной примерно при 2-8°С в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев или более предпочтительно является стабильной примерно при 2-8°С в течение по меньшей мере 2 лет, по меньшей мере 3 лет, по меньшей мере 4 лет или даже по меньшей мере 5 лет.

Другим важным аспектом стабильности является то, что соединение, нейтрализующее GM-CSF, в композиции по изобретению, сохраняет свою биологическую активность или эффективность во время хранения и при условиях хранения, особенно это касается температуры и возможных изменений температуры. Активность или эффективность, например, отражает сама нейтрализующая способность соединения (которую можно измерить в клеточных анализах, как описано в данном описании изобретения выше) или способность соединения, нейтрализующего GM-CSF, связываться с GM-CSF или с рецептором GM-CSF. Аффинность связывания может быть оценена с помощью SPR или других методов, хорошо известных в данной области техники, например, с помощью Biacore или анализа Скэтчарда.

Композицию по изобретению готовят путем добавления к соединению, нейтрализующему GM-CSF, как описано в данном описании изобретения, в водном растворе, буфера и модификатора тоничности. Специалистам обычной квалификации в данной области техники понятно, что объединение различных компонентов, которые следует включить в композицию, можно выполнять в любом подходящем порядке. Например, буфер может быть добавлен первым, средним или последним, и модификатор тоничности также может быть добавлен первым, средним или последним. Специалисту в данной области техники также понятно, что некоторые из этих химических веществ могут быть несовместимы в некоторых комбинациях и, соответственно, могут быть легко замещены другими химическими веществами, которые обладают аналогичными свойствами, но являются совместимыми в соответствующей смеси.

Композиция по изобретению содержит буфер. Термин буфер или буферный агент, при использовании здесь, включает агенты, которые поддерживают рН в нужном диапазоне. Буфер представляет собой водный раствор, состоящий из смеси слабой кислоты и сопряженного с ней основания, или слабого основания и сопряженной с ней кислотой. Его свойством является то, что рН раствора изменяется очень мало при добавлении небольшого количества сильной кислоты или основания. Буферные растворы используются как средство поддержания почти постоянного значения рН в широком ряде химических применений. В общем случае буфер при использовании в композиции по изобретению предпочтительно стабилизирует соединение, нейтрализующее GM-CSF.

Аминокислотные буферы при использовании в данном описании изобретения включают, например, аминокислотное основание, например гистидин и его сопряженную соль. Примером аминокислотного буфера является гистидин/гистидин хлорид. Этот пример предпочтительно используют в настоя

- 27 032829 щем изобретении.

Предпочтительное значение рН композиции, как описано в данном описании изобретения, может быть выбрано из следующих диапазонов: от примерно 5 до примерно 7, более предпочтительно от примерно 5,5 до примерно 6,5. Наиболее предпочтительно рН равен примерно или точно 5,8. Соответственно, предпочтительно используют буфер, который может поддерживать раствор при рН от 5 до 7. Термин примерно при использовании в контексте значения/диапазона рН предпочтительно означает числовое значение в диапазоне ±20% от указанного значения. Когда рН фармацевтической композиции установлен на физиологическом уровне или вблизи него, комфорт пациента при введении является максимальным. Следует понимать, что рН можно при необходимости регулировать, чтобы максимально увеличить стабильность и растворимость соединения, нейтрализующего GM-CSF, в конкретной композиции и, таким образом, значение рН за пределами физиологического диапазона, но все еще предпочтительно является переносимым для пациента, входит в объем настоящего изобретения.

Неограничивающие примеры других буферов, которые можно использовать в композиции, описанной здесь, включают гистидиновый, сукцинатный, глюконатный, цитратный, аргининовый, лизиновый, на основе аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, трис (трометамол), Bis-Tris, MOPS (3-(Nморфолино)пропансульфоновая кислота), ACES Щ-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновая кислота), TES Щ-трис(гидроксиметил)метил-2-аминоэтансульфоновая кислота), HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1пиперазинэтансульфоновая кислота), EPPS (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинпропансульфоновая кислота), этилендиамина, фосфорной кислоты, малеиновой кислоты/фосфата, 2- морфолиноэтансульфоновой кислоты (MES), фосфата, ацетата и диэтаноламина.

В композиции по изобретению буферами являются гистидиновый, ацетататный и цитратный буферы. Более предпочтительно в композиции по изобретению используется гистидиновый буфер, предпочтительно при рН от 5 до 7, более предпочтительно при рН от 5,5 до 6,5, еще более предпочтительно при рН 5,8. Буферы, используемые в настоящем изобретении, хорошо известны в данной области техники, изготавливаются известными способами и имеются в продаже у коммерческих поставщиков.

Композиция может дополнительно содержать гидроксид натрия (NaOH). В некоторых воплощениях композиция содержит 1-200 мМ или менее 50 мМ, менее 40 мМ, менее 35 мМ, менее 30 мМ, менее 25 мМ, менее 20 мМ или менее 15 мМ, например 10 мМ NaOH или менее, например 5 или 1 мМ гидроксида натрия.

В дополнение к соединению, нейтрализующему GM-CSF, и буферу композиция по изобретению может также содержать другие вещества, которые включают, без ограничения ими, стабилизирующие агенты (стабилизаторы).

Кроме того, композиция по изобретению содержит стабилизатор, который также может действовать как модификатор тоничности. Термин стабилизирующий агент относится к агенту, который повышает или иным образом улучшает стабильность композиции, в частности соединений, нейтрализующих GMCSF. Стабилизирующий агент, который представляет собой модификатор тоничности, определен как восстанавливающий сахар, сахарный спирт или их комбинация. Модификаторы тоничности в жидких композициях по настоящему изобретению гарантируют, что тоничность, т.е. осмолярность, раствора, по существу, является такой же, как в нормальных физиологических жидкостях, и, таким образом, предотвращают набухание после введения или быструю абсорбцию композиции из-за разных концентраций ионов в композиции и физиологических жидкостях. Обычно характер композиции, как описано в данном описании изобретения, таков, что осмолярность композиции составляет от примерно 240 до примерно 470 мОсм/кг, более предпочтительно от примерно 300 до примерно 400 мОсм/кг, наиболее предпочтительно примерно 350 мОсм/кг.

Стабилизирующим агентом/модификатором тоничности могут быть один или более из невосстанавливающих сахаров, таких как сахароза или трегалоза, или один или более из сахарных спиртов, таких как маннит или сорбит, а также комбинации невосстанавливающих сахаров и сахарных спиртов. В настоящем изобретении концентрацию стабилизирующего агента/модификатора тоничности в композиции выбирают из следующих диапазонов: от 3 до 8% (мас./об.), от 4 до 6,5% (мас./об.), от 4,5 до 6% (мас./об.). В конкретных воплощениях концентрация составляет примерно 5-6% (мас./об.). Предпочтительным стабилизатором/модификатором тоничности, используемым в композиции по изобретению, является сорбит предпочтительно в количестве 5% (мас./об.).

В предпочтительном воплощении композиция, описанная в данном описании изобретения, не содержит дополнительных эксципиентов, таких как аминокислоты (за исключением случая, когда буфер выбирают из аминокислотного буфера, такого как гистидиновый буфер) или поверхностно-активные вещества.

В менее предпочтительном воплощении композиция, описанная в данном описании изобретения, содержит дополнительный эксципиент. Предпочтительно эксципиент выбран из группы, состоящий из аминокислоты, криопротектора, лиопротектора, поверхностно-активного вещества, наполнителя, антиоксиданта и их комбинаций.

Эксципиенты, также упоминаемые как химические добавки, совместно растворенные вещества или сорастворители, которые предпочтительно стабилизируют соединения, нейтрализующие GM-CSF, нахо

- 28 032829 дясь в растворе (также в сухом или замороженном виде) могут быть добавлены к композиции по изобретению. Предпочтительно эксципиенты способствуют стабильности соединений, нейтрализующих GMCSF, но следует понимать, что эксципиенты могут иным способом содействовать физическим, химическим и биологическим свойствам композиции. Эксципиенты хорошо известны в данной области техники, производятся известными способами и имеются в продаже у коммерческих поставщиков.

Примеры эксципиентов включают, без ограничения ими, сахара/полиолы, такие как сахароза, лактоза, глицерин, ксилит, сорбит, маннит, мальтоза, инозит, трегалоза, глюкоза; полимеры, такие как сывороточный альбумин (бычий сывороточный альбумин (BSA), человеческий SA или рекомбинантный НА), декстран, PVA (поливинилацетат), гидроксипропилметилцеллюлоза (НРМС), полиэтиленимин, желатин, поливинилпирролидон (PVP), гидроксиэтилцеллюлоза (НЕС), гидроксиэтилкрахмал (HES); неводные растворители, такие как многоатомные спирты, (например, PEG, этиленгликоль и глицерин), диметилсульфоксид (DMSO) и диметилформамид (DMF); аминокислоты, такие как треонин, серин, пролин, аланин, валин, глютамин, метионин, цистеин, изолейцин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аргинин, глицин, гистидин, лизин, фенилаланин, лейцин, аспарагин, триптофан и тирозин; поверхностноактивные вещества, такие как Tween-80, Tween-20, SDS (додецилсульфат натрия), полисорбат, сополимер полиоксиэтилена; и разные эксципиенты, такие как фосфат калия, ацетат натрия, сульфат аммония, сульфат магния, сульфат натрия, триметиламина N-оксид, бетаин, ионы металлов (например, цинк, медь, кальций, марганец и магний), CHAPS (3-[(3-холамидопропил)диметиламмоний]-1-пропансульфонат), монолаурат, 2-О-3-манноглицерат или любая комбинация вышеперечисленного.

Криопротекторы включают вещества, которые обеспечивают стабильность замороженного белка в процессе приготовления, заморозки, хранения, обработки, распределения, восстановления или использования. В конкретном аспекте криопротекторы включают вещества, которые защищают белок от стрессов, возникающих в процессе замораживания. Криопротекторы могут иметь лиопротекторный эффект. Неограничивающие примеры криопротекторов включают сахара, такие как сахароза, глюкоза, трегалоза, маннит, сорбит, манноза и лактоза; полимеры, такие как декстран, гидроксиэтилкрахмал, поливинилпирролидон (PVP) и полиэтиленгликоль; поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты (например, PS-20 или PS-80); и аминокислоты, такие как глицин, аргинин, лейцин и серин. Обычно используют криопротектор, демонстрирующий низкую токсичность в биологических системах.

Дисахарид, как описано в данном описании изобретения, может действовать как лиопротектор или криопротектор. Лиопротекторы включают вещества, которые предотвращают или уменьшают химическую или физическую нестабильность белка при лиофилизации и последующем хранении. В одном аспекте, лиопротектор предотвращает или уменьшает химические или физические нестабильности в белке, когда вода удаляется из композиции в процессе сушки. В дополнительном аспекте лиопротектор стабилизирует белок, помогая поддерживать правильную конформацию белка посредством водородных связей.

Соответственно, в одном аспекте дисахарид, как описано в данном описании изобретения, может служить для стабилизации соединения, нейтрализующего GM-CSF, при замерзании. Так как защита при замораживании может зависеть от абсолютной концентрации дисахарида (Carpenter et al., Pharm. Res. (1997), 14:969-975) могут быть необходимыми концентрации выше 5% для увеличения стабильности.

В одном воплощении лиопротектор может быть добавлен к композиции, описанной в данном описании изобретения. Термин лиопротектор при использовании здесь включает агенты, которые обеспечивают стабильность белка в процессе лиофилизации или дегидратации (первичные и вторичные циклы лиофильной сушки), обеспечивая аморфную стекловидную матрицу и связываясь с белком через водородные связи, заменяя молекулы воды, которые удаляются в процессе сушки. Это помогает поддерживать конформацию белка, минимизирует деградацию белка во время цикла лиофилизации и улучшает длительную стабильность продукта. Лиопротектор добавляют к прелиофилизированной композиции в лиопротекторном количестве, что означает, что после лиофилизации соединения, нейтрализующего GM-CSF, в присутствии лиопротекторного количества лиопротектора соединения, по существу, сохраняют свою физическую и химическую стабильность и целостность при лиофилизации и хранении.

Неограничивающие примеры лиопротекторов включают сахара, такие как сахароза или трегалоза; аминокислоту, такую как мононатрия глутамат, глицин или гистидин; метиламин, такой как бетаин; лиотропную соль, такую как сульфат магния; полиол, такой как трехатомные или выше сахарные спирты, например арабит, ксилит, сорбит и маннит; полиэтиленгликоль; плюроники и их комбинации. Предпочтительно лиопротекторы являются такими, как описано выше в отношении стабилизирующих агентов. Количество лиопротектора, добавленного к композиции, обычно представляет собой количество, которое не приводит к неприемлемой степени деградации/агрегации белка, когда белковая композиция лиофилизирована.

Другой эксципиент представляет собой поверхностно-активное вещество. Термин поверхностноактивное вещество обычно включает такие агенты, которые защищают соединения, нейтрализующие GM-CSF, от стресса, индуцированного границей воздух/раствор и стресса, индуцированного границей раствор/поверхность. Например, поверхностно-активные вещества могут защищать белок от агрегации.

Примеры поверхностно-активных веществ включают, без ограничения ими, неионные поверхност

- 29 032829 но-активные вещества, такие как полисорбаты (например, полисорбат 80 или полисорбат 20); полоксамеры (например, полоксамер 188); тритон, додецилсульфат натрия (SDS); лаурилсульфат натрия; октилгликозид натрия; лаурилсульфобетаин, миристил-сульфобетаин, линолеил-сульфобетаин, стеарилсульфобетаин, лаурил-саркозин, миристил-саркозин, линолеил-саркозин, стеарил-саркозин, линолеилбетаин, миристил-бетаин, цетил-бетаин, лауроамидопропил-бетаин, кокамидопропил-бетаин, линолеамидопропил-бетаин, миристамидопропил-бетаин, палмидопропил-бетаин, изостеарамидопропил-бетаин (например, лаурамидопропил), миристамидопропил-, пальмидопропил- или изостеарамидопропилдиметиламин; метил-кокоил натрия или динатрия метил-олеил-таурат; и Monaquat-серия (Mona Industries, Inc., Paterson, NJ.), полиэтилгликоль, полипропиленгликоль и сополимеры этилена и пропиленгликоля (например, плюроники, PF68). Добавленное количество поверхностно-активного вещества таково, что оно поддерживает агрегацию белка на приемлемом уровне, определенном с использованием, например, SEC-HPLC или посредством измерения методом светоблокировки для определения процента высокомолекулярных (HMW) частиц или низкомолекулярных (LMW) частиц, и минимизирует образование частиц белковой композиции, описанной в настоящем документе.

Эксципиентом также может быть наполнитель. Термин наполнитель при использовании здесь включает агенты, которые обеспечивают структуру лиофилизированного продукта без непосредственного взаимодействия с фармацевтическим продуктом. В дополнение к обеспечению фармацевтически удачной лиофилизированной таблетки наполнители также могут придавать полезные свойства в отношении изменения температуры коллапса, обеспечивая защиту при замерзании-оттаивании и повышая стабильность белка при длительном хранении. Неограничивающие примеры наполнителей включают маннит, глицин, лактозу и сахарозу. Наполнители могут быть кристаллическими (такие как глицин, маннит или хлорид натрия) или аморфными (такие как декстран, гидроксиэтилкрахмал) и обычно используются в белковых композициях в количестве от 0,5 до 10%.

Предпочтительно наполнитель, используемый в композиции по изобретению, способствует образованию лиофилизированной таблетки, которая является эстетически приемлемой, гомогенной или механически прочной. Наполнители также предпочтительно способствуют образованию структуры с открытыми порами и легкому и быстрому восстановлению препарата. Наполнители также предпочтительно уменьшают или предотвращают коллапс таблетки, эвтектическое плавление или сохранение остаточной влажности. В другом аспекте наполнители предпочтительно способствуют защите соединения, нейтрализующего GM-CSF, от стресса (например, физических и химических стрессов) и помогают поддерживать активность белка.

Также эксципиентом может быть антиоксидант. При использовании здесь антиоксидант представляет собой молекулу, способную замедлять или предотвращать окисление других молекул. Окисление представляет собой химическую реакцию, которая передает электроны из вещества окислителю. Для использования в композиции могут представлять интерес физиологически приемлемые антиоксиданты. Такие антиоксиданты включают, без ограничения ими, восстановители, аскорбиновую кислоту (витамин С), липоевую кислоту, мелатонин, мочевую кислоту, каротины, ретинолы, токоферолы и токотриенолы, например α-токоферол (витамин Е), убихинон (кофермент Q) и тому подобное.

Композиция возможно может содержать консервант. Консервант представляет собой соединение, которое может быть добавлено к композициям в данном изобретении для уменьшения бактериальной активности. Добавление консерванта может, например, облегчить получение многократно используемой (с многократными дозами) композиции. Примеры возможных консервантов включают октадецилдиметилбензиламмония хлорид, гексаметония хлорид, бензалкония хлорид (смесь алкилдиметилбензиламмония хлоридов, в которых алкильные группы представляют собой длинноцепочечные соединения) и бензетония хлорид. Другие типы консервантов включают ароматические спирты, такие как фенол, бутиловый и бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехин, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и метакрезол. Наиболее предпочтительным консервантом в данном изобретении является бензиловый спирт.

Соответственно, композиция по настоящему изобретению представляет собой жидкую, конкретно водную композицию для длительного хранения, которая содержит от примерно 100 до 200 мг/мл соединения, нейтрализующего GM-CSF, и буфер, выбранный из группы, состоящей из гистидина, ацетата и цитрата, при рН от примерно 5 до примерно 7, и композиция может дополнительно содержать один или более из сахарозы, трегалозы, маннита и/или сорбита в качестве стабилизатора/модификатора тоничности.

В особенно предпочтительных воплощениях композиция по изобретению представляет собой жидкую, конкретно водную композицию для длительного хранения, которая может содержать от примерно 100 до 200 мг/мл соединения, нейтрализующего GM-CSF, более предпочтительно примерно 150 мг/мл и гистидиновый буфер в концентрации от примерно 20 до примерно 40 мМ, более предпочтительно примерно 30 мМ, при рН от примерно 5,5 до примерно 6,5, более предпочтительно 5,8, и композиция может дополнительно содержать от примерно 4 до примерно 6%, более предпочтительно примерно 5% (мас./об.) сорбита и возможно не содержит дополнительных эксципиентов, таких как поверхностноактивные вещества, аминокислоты и/или NaCl.

- 30 032829

Следует понимать, что некоторые компоненты композиции могут быть взаимозаменяемыми с альтернативами, известными в данной области техники. Однако специалистам в данной области техники будет также понятно, что включение определенных компонентов будет препятствовать использованию других компонентов, концентраций или способов получения композиции по причинам, которые включают, без ограничения ими, химическую совместимость, рН, тоничность и стабильность.

Полезно, чтобы жидкая композиции по изобретению имела низкую и приемлемую вязкость, которая пригодна для подкожного введения, например в готовом к использованию устройстве. Вязкость композиции по изобретению, следовательно, предпочтительно составляет ниже 20 МПа-с при скорости сдвига от примерно 50 до примерно 1000 [1/с] и при температуре примерно 20°С. Более предпочтительно вязкость составляет ниже 15 МПа-с при указанных выше условиях.

Как указано выше, настоящая заявка в целом относится к обнаружению того, что добавление некоторых веществ к композиции, содержащей соединения, нейтрализующие GM-CSF, может уменьшить агрегацию и/или деградацию/фрагментацию этих соединений в композиции. Независимо от того, что вызывает агрегацию или деградацию соединения, нейтрализующего GM-CSF, в композиции, добавление веществ, описанных в данном описании изобретения, уменьшает агрегацию/фрагментацию соединений, нейтрализующих GM-CSF, в композиции. В некоторых воплощениях добавление описанных веществ уменьшает агрегацию/деградацию в композиции, вызванную, например, хранением, воздействием повышенных температур, воздействием света, воздействием напряжения сдвига, присутствием поверхностно-активных веществ, рН и ионными условиями и любыми их комбинациями.

Для уменьшения агрегации и/или деградации/фрагментации соединения, нейтрализующего GMCSF, приготовленного, в частности, в виде препарата в жидком и замороженном виде, можно использовать меры, обнаруженные авторами настоящего изобретения. Уменьшенная агрегация/фрагментация, таким образом, предпочтительно наблюдается в жидкой композиции. Предполагается, что уменьшенная агрегация/деградация может также наблюдаться при хранении непосредственно в жидком виде для дальнейшего использования, при хранении в замороженном состоянии и оттаивании перед использованием или при получении в сухой форме, такой как лиофилизированная, высушенная воздухом или высушенной распылением, для последующего восстановления в жидкую форму или в другую форму перед использованием.

Таким образом, предполагается, что композиция, описанная в данном описании изобретения, может храниться любым способом, известным специалисту в данной области. Неограничивающие примеры включают охлаждение, замораживание, лиофилизацию и распылительную сушку композиции, где сохранение посредством охлаждения является предпочтительным.

В некоторых случаях белковые композиции замораживают для хранения. Соответственно, желательно, чтобы композиция была относительно стабильной в таких условиях, включая циклы замораживания-оттаивания. Один способ определения такой пригодности композиции заключается в воздействии на образец композиции по меньшей мере одного, например одного, трех, пяти, семи и вплоть до 10 циклов замораживания и оттаивания (например, замораживание при температуре примерно -80±10°С в течение ночи и быстрое оттаивание при комнатной температуре или медленное оттаивание на льду, например, в течение 6 часов), определение количества низкомолекулярных частиц (LMW) и/или высокомолекулярных частиц (HMW), которые накапливаются после циклов замораживания-оттаивания, и сравнение их с количеством LMW-частиц или HMW-частиц, присутствующих в образце до процедуры замораживания-оттаивания. Увеличение количества LMW- или HMW-частиц указывает на уменьшенную стабильность белка, хранящегося как часть композиции. Метод эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-HPLC) можно использовать для определения присутствия LMW- и HMW-частиц.

Предпочтительно белковая композиция может храниться в виде жидкости. Соответственно, как описано в данном описании изобретения, желательно, чтобы жидкая композиция была стабильна при таких условиях, в том числе при различных температурах. Например, один способ определения пригодности композиции заключается в хранении образца композиции при нескольких температурах (например, 2-8°С, 15°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С, 40°С и 50°С) и определение количества HMW- и/или LMWчастиц, которые накапливаются со временем. Чем меньше количества HMW- и/или LMW-частиц, которые накапливаются со временем, тем лучше условия хранения композиции. Кроме того, с помощью высокоэффективной катионообменной жидкостной хроматографии (CEX-HPLC) можно определить профиль заряда белка. Альтернативно, композиции могут быть сохранены после лиофилизации. Кроме того, желательно, чтобы композиция была стабильна в условиях напряжения сдвига. Один способ определения пригодности композиции заключается во встряхивании композиции в приемном резервуаре на шейкере, например вертикальном шейкере, при нужной температуре (такой как 2-8°С, 15°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С, 40°С и 50°С, предпочтительно 5±3°С). Емкость (например, флакон) можно хранить на шейкере в течение нужного периода времени, например вплоть до 14 суток или дольше, в сравнении с контролем, который хранится без встряхивания при той же температуре. Сбор данных может быть осуществлен, например, через 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 14 суток. Количество частиц с низкой молекулярной массой (LMW) и/или частиц с высокой молекулярной массой (HMW), которые накапливаются после

- 31 032829 хранения при встряхивании, можно определить и сравнить с количеством LMW-частиц или HMWчастиц, присутствующих в образце без встряхивания. Увеличение количества LMW- или HMW-частиц указывает на уменьшение стабильности белка, хранящегося как часть композиции. Для определения присутствия LMW- и HMW-частиц можно использовать эксклюзионную ВЭЖХ (SE-HPLC).

В некоторых случаях композицию высушивают распылением и затем хранят. Для сушки распылением жидкую композицию переводят в аэрозольное состояние в присутствии потока сухого газа. Воду удаляют из капель композиции в газовый поток, что приводит к образованию сухих частиц лекарственной композиции. Эксципиенты могут быть включены в композицию, чтобы (1) защитить белок во время дегидратации при сушке распылением, (2) защитить белок во время хранения после сушки распылением и/или 3) придать раствору свойства, подходящие для изготовления аэрозоля. Способ аналогичен тому, который описан выше для замораживания, за исключением того, что образец композиции подвергают сушке распылением, а не замораживают, восстанавливают в разбавителе, и восстановленную композицию тестируют на присутствие LMW-частиц и/или HMW-частиц. Увеличение частиц LMW или HMW в высушенном распылением образце по сравнению с соответствующим образцом композиции, которая не была лиофилизирована, указывает на уменьшенную стабильность в образце, высушенном распылением.

Термин лиофилизированный или высушенный сублимацией включает состояние вещества, подвергнутого процедуре сушки, такой как лиофилизация, где по меньшей мере 90%, предпочтительно 95%, наиболее предпочтительно 98% влаги было удалено. Соответственно, термин лиофилизация при использовании здесь, относится к процессу, посредством которого вещество, подлежащее сушке, сначала замораживают, а потом удаляют лед или замороженный растворитель сублимацией в вакууме. Эксципиент (например, лиопротектор) может быть включен в композиции, которые должны быть лиофилизированы, чтобы увеличить стабильность лиофилизированного продукта при хранении. Термин восстановленная композиция при использовании здесь относится к композиции, которая была получена посредством растворения лиофилизированной белковой композиции в разбавителе, так что соединение, нейтрализующее GM-CSF, диспергировано в разбавителе.

Термин разбавитель при использовании здесь представляет собой вещество, которое является фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксичным для введения человеку) и пригодно для получения жидкой композиции, такой как композиция, восстановленная после лиофилизации. Неограничивающие примеры разбавителей включают стерильную воду, бактериостатическую воду для инъекции (BWFI), рН-буферный раствор (например, фосфатно-солевой буфер), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы или водные растворы солей и/или буферы.

В другом аспекте изобретения предполагается применение композиции в терапии. Соответственно, в изобретении предлагается фармацевтическая композиция (или лекарственное средство), содержащая состав, описанный в данном описании изобретения.

В еще одном воплощении в описании изобретения предложен способ лечения субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества композиции, описанного здесь, где субъект страдает заболеванием или расстройством, которое можно успешно лечить соединением, нейтрализующим GM-CSF.

Предпочтительно композицию, описанную здесь, применяют для профилактики и/или лечения заболевания, которое можно предупредить, и/или лечить, и/или уменьшить соединениями, нейтрализующими GM-CSF.

Термин субъект, как предполагается, включает живые организмы. Примеры субъектов включают млекопитающих, например людей, собак, коров, лошадей, свиней, овец, коз, кошек, мышей, кроликов, крыс и трансгенных животных, не являющихся человеком. В предпочтительном воплощении изобретения субъектом является человек.

Термин эффективная доза или эффективная дозировка определен как количество, достаточное для достижения или, по меньшей мере, частичного достижения нужного эффекта. Термин терапевтически эффективная доза определяется, как количество, достаточное для лечения или, по меньшей мере, частичной остановки заболевания и его осложнений у пациента, уже страдающего этим заболеванием. Количества, эффективные для такого использования, будут зависеть от тяжести медицинского состояния и общего состояния собственной иммунной системы пациента. Термин пациент включает человека и других млекопитающих, которые получают профилактическое или терапевтическое лечение.

Подходящая доза или терапевтически эффективное количество композиции будут зависеть от состояния, подлежащего лечению, тяжести состояния до терапии и клинической истории пациента и реакции на терапевтический агент. Надлежащая доза может быть скорректирована в соответствии с решением лечащего врача так, чтобы ее можно было вводить пациенту однократно или в виде ряда введений. Фармацевтическую композицию можно вводить в качестве единственного терапевтического средства или в комбинации с дополнительными терапевтическими средствами по мере необходимости.

Фармацевтические композиции по данному изобретению особенно полезны для парентерального введения, т.е. подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного и/или внутрисиновиального, где подкожное введение является предпочтительным. Парентеральное введение может быть осуществлено посредством болюсной инъекции или непрерывной инфузии.

- 32 032829

Фармацевтические композиции для инъекции могут быть представлены в стандартной лекарственной форме, например в ампулах или в многодозовых контейнерах, с добавленным консервантом. Кроме того, был разработан ряд современных подходов доставки лекарственных средств и фармацевтические композиции по настоящему изобретению подходят для введения с помощью этих новых методов, например Inject-ease, Genject, ручки-инжекторы, такие как Genen, и безыгольные устройства, такие как MediJector и BioJector. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также может быть адаптирована для разработанных в будущем способов введения. См. также Langer, 1990, Science, 249: 1527-1533.

Лиофилизированные фармацевтические композиции предпочтительно могут быть представлены во флаконе, содержащем активный ингредиент. В одном воплощении фармацевтические композиции дополнительно содержат растовор для восстановления.

Фармацевтическая композиция также может содержать дополнительные фармацевтически приемлемые компоненты. Другие фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы, такие как описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences 16^oe изд., Osol, A. Ed. (1980), также могут быть включены в белковую композицию, описанную в данном описании изобретения, при условии, что они не оказывают отрицательного воздействия на необходимые характеристики композиции. При использовании здесь фармацевтически приемлемый носитель означает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты, совместимые с фармацевтическим введением. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают модификаторы тоничности; дополнительные буферные агенты; консерванты; сорастворители; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту и метионин; хелатирующие агенты, такие как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота); комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы); биоразлагаемые полимеры, такие как сложные полиэфиры; солеобразующие противоионы, такие как натрий, многоатомные сахарные спирты; аминокислоты, такие как аланин, глицин, аспарагин, 2-фенилаланин и треонин; сахара или сахарные спирты, такие как лактит, стахиоза, манноза, сорбоза, ксилоза, рибоза, рибит, миоинозитоза, миоинозитол, галактоза, галактит, глицерин, циклитолы (например, инозит), полиэтиленгликоль; серосодержащие восстанавливающие агенты, такие как глутатион, тиоктовая кислота, тиогликолят натрия, тиоглицерин, [а]-монотиоглицерин и тиосульфат натрия; низкомолекулярные белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, бычий сывороточный альбумин, желатин или другие иммуноглобулины; и гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон.

Композиции, описанные в данном описании изобретения, пригодны в качестве фармацевтических композиций для лечения, и/или предупреждения, и/или уменьшения симптомов заболевания или расстройства у пациента, нуждающегося в этом. Термин лечение относится и к терапевтическому лечению и к профилактическим или превентивным мерам. Лечение включает применение или введение композиции в организм, изолированную ткань или клетку пациента с заболеванием/расстройством, симптомом заболевания/расстройства или предрасположенностью к заболеванию/расстройству с целью вылечить, исцелить, облегчить, ослабить, изменить, излечить, улучшить состояние, изменить в лучшую сторону или воздействовать на это заболевание, этот симптом заболевания или предрасположенность к этому заболеванию.

Нуждающиеся в лечении включают тех, у кого уже есть расстройство, а также тех, у кого следует предупредить расстройство. Термин расстройство представляет собой любое состояние, которое полезно лечить с помощью белковой композиции, описанной в настоящем документе. Он включает в себя хронические и острые расстройства или заболевания, в том числе такие патологические состояния, которые вызывают предрасположенность млекопитающих к рассматриваемому расстройству. Неограничивающие примеры расстройств, подлежащих лечению в данном изобретении, включают воспалительные и аутоиммунные расстройства, предпочтительно включающие аллергические и псориатические расстройства, а также артиритические и астматические расстройства, например артрит, ревматоидный артрит (RA), аутоиммунный энцефалит, псориаз, рассеянный склероз, заболевание легких, такое как астма, хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD) и острый респираторный дистресс-синдром (ARDS); болезнь Крона, идиопатический легочный фиброз (IPF), воспалительное заболевание кишечника (IBD), увеит, дегенерацию желтого пятна, колит, валлеровскую дегенерацию, антифосфолипидный синдром (APS), острый коронарный синдром, рестеноз, атеросклероз, рецидивирующий полихондрит (RP), острый или хронический гепатит, неудачные ортопедические имплантаты, гломерулонефрит, волчанку, атопический дерматит и воспалительные, артритические и остеоартритические боли.

Аллергическое расстройство представляет собой любое расстройство, которое вызвано аллергией или аллергической реакцией. Аллергия представляет собой расстройство, вызванное гиперчувствительностью иммунной системы, Это происходит, когда иммунная система человека реагирует или слишком остро реагирует на обычно безвредные посторонние вещества (аллергены), такие как продукты питания, пыльца, плесень, домашняя пыль, шерсть животных, пылевые клещи.

Псориаз является аутоиммунным заболеванием, которое в основном поражает кожу. Цикл роста

- 33 032829 кожных клеток ускоряется из-за ошибочных сигналов, посылаемых иммунной системой. Существует пять типов псориаза: бляшковидный, каплеобразный, обратный, пустулезный и эритродермический. Наиболее распространенная форма, бляшковидный псориаз, обычно проявляется как чешуйчатые пятна красного и белого цвета, появляющиеся на верхнем первом слое эпидермиса (кожа). Некоторые пациенты, однако, не имеют дерматологических признаков или симптомов. Это расстройство является хроническим рекуррентным состоянием, тяжесть которого варьируется от незначительных локализованных пятен до полного охвата тела. Часто оказываются затронутыми ногти рук и ног (псориатическая дистрофия ногтей), что может рассматриваться как отдельный признак. Псориаз может также вызвать воспаление суставов, которое известно как псориатический артрит.

Артрит представляет собой форму расстройства сустава, которое включает воспаление одного или более суставов. Существует более 100 разных форм артрита. Наиболее распространенная форма остеоартрита (дегенеративное заболевание суставов) является результатом травмы сустава, инфекции сустава или возраста. Другие формы артрита представляют собой ревматоидный артрит, псориатический артрит и другие родственные аутоиммунные заболевания. Септический артрит вызван инфекцией сустава.

Астма представляет собой распространенное хроническое воспалительное расстройство дыхательных путей, в котором задействованы многие клетки и клеточные элементы. Астма связана с гиперчувствительностью дыхательных путей, что приводит к рекуррентным эпизодам одышки, кашля, чувства стеснения в груди и к затрудненному дыханию. Эти эпизоды обычно связаны с обширной, но непостоянной обструкцией дыхательных путей в легких, которая часто является обратимой спонтанно или благодаря лечению. Астма может быть классифицирована в соответствии с частотой симптомов, объемом форсированного выдоха за одну секунду и максимальной скоростью выдоха. Астма также может быть классифицирована как атопическая (экзогенная) или неатопическая (эндогенная).

В дополнение к соединениям, нейтрализующим GM-CSF, фармацевтическая композиция по изобретению может содержать дополнительные терапевтические агенты или биологически активные вещества. Например, могут присутствовать терапевтические факторы, полезные в лечении конкретного показания, такого как остеоартрит (например, один или более ингибиторов, которые вовлечены в разрушение суставного хряща или синовиальных компонентов, выбранных, без ограничения ими, из антиметаллопротеиназ, циклиновых соединений, цитокиновых антагонистов, кортикостероидов, ингибиторов TNF (фактор некроза опухоли), ингибиторов IL (интерлейкина), антиангиогенных веществ, ингибиторов аггреканазы, ингибиторов киназы р38, ингибиторов апоптоза, ингибиторов гиалуронидазы и ингибиторов протеолитических ферментов). Факторы, которые контролируют воспаление, включающие инфликсимаб, этанерцепт, адалимумаб, нерелимонмаб, ленерцерпт и т.п. или их комбинацию, также могут являться частью композиции. Предполагается также, что фармацевтическая композиция может включать в себя компоненты внеклеточного матрикса, такие как гиалуроновая кислота или ее производные, включая соли, сложный эфир, внутренний эфир и сульфатные производные, предпочтительно неполный эфир гиалуроновой кислоты.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к набору (или к изделию) или контейнеру, который содержит композицию по изобретению. Композиция предпочтительно может уже находиться в жидком состоянии. Однако, альтернативно, предпочтительно она может находиться в лиофилизированном состоянии. Он также может находиться в замороженном, лиофилизированном, сублимированном или высушенном посредством распылительной сушки состоянии. Соответственно, если композиция находится в состоянии, отличном от жидкого, она может быть приготовлена врачом в виде (жидкой) водной фармацевтической композиции. Например, композиция может быть лиофилизирована и затем должна быть растворена. Соответственно, набор может дополнительно включать в себя средство для восстановления замороженной, лиофилизированной, сублимированной или высушенной посредством распылительной сушки композиции, и/или средство для разбавления композиции, и/или средство для введения композиции или фармацевтической композиции соответственно, такое как шприц, насос, инфузионная система, иглы и т.д. Набор может содержать один или более флаконов, содержащих препарат по изобретению. Набор также может сопровождаться инструкцией по применению.

Таким образом, предлагается изделие, которое содержит композицию, описанную в данном описании изобретения, и предпочтительно содержит инструкцию по его применению. Изделие содержит контейнер, подходящий для хранения композиции. Подходящие контейнеры включают, без ограничения ими, бутыли, флаконы (например, двухкамерные флаконы), шприцы (например, однокамерные или двукамерные шприцы), пробирки, небулайзеры, ингаляторы (например, дозированные ингаляторы или ингаляторы сухого порошка) или депо. Контейнер может быть выполнен из различных материалов, таких как стекло, металл или пластмасса (например, поликарбонат, полистирол, полипропилен, полиолефин). Контейнер содержит композицию, и этикетка на контейнере или присоединенная к нему может содержать инструкции по восстановлению и/или применению. Этикетка может дополнительно указывать, что композиция пригодна и предназначена для подкожного введения. Контейнер с композицией может представлять собой флакон для многоразового использования, который обеспечивает возможность повторных введений (например, 2-6 введений) композиции. Изделие может также содержать второй контейнер, содержащий подходящий разбавитель (например, WFI (воду для инъекций), 0,9% NaCl, BWFI (бактерио

- 34 032829 статическую воду для инъекций), фосфатно-солевой буфер). Когда изделие содержит лиофилизированную форму композиции соединения, нейтрализующего GM-CSF, смешивание разбавителя с лиофилизированной композицией обеспечивает необходимую конечную концентрацию белка в восстановленной композиции. Изделие может дополнительно включать другие материалы, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши с инструкциями по применению.

Кроме того, в настоящее описание входят устройства, которые могут быть использованы для доставки композиции согласно настоящему описанию. Примеры таких устройств включают, без ограничения ими, шприц, ручку, имплантат, безыгольное инъекционное устройство, ингаляционное устройство и пластырь.

Изобретение далее проиллюстрировано графическими материалами и примерами, которые являются лишь иллюстративными и не являются ограничением объема настоящего изобретения.

Фиг. 1 - влияние времени хранения, температуры хранения и концентрации белка на уровень мономера анти-GM-CSF антитела.

Фиг. 2 - диаграмма Парето стандартизированного эффекта с переменным осмотическим давлением [мОсмоль/кг].

Раскрыты также следующие аспекты.

1. Композиция, содержащая соединение, нейтрализующее GM-CSF, в концентрации по меньшей мере примерно 20 мг/мл, модификатор тоничности и буфер, где композиция является стабильной.

2. Композиция согласно аспекту 1, где соединение, нейтрализующее GM-CSF, присутствует в концентрации по меньшей мере примерно 50 мг/мл, модификатор тоничности присутствует в концентрации от примерно 1 до примерно 15% (мас./об.), и буфер присутствует в концентрации от примерно 10 до примерно 50 мМ.

3. Композиция согласно аспекту 1 или 2, где модификатор тоничности выбран из маннита, сорбита, сахарозы и/или трегалозы.

4. Композиция согласно любому из аспектов 1-3, где буфер выбран из гистидинового, ацетатного и/или цитратного буфера.

5. Композиция согласно любому из аспектов 1-4, где соединение, нейтрализующее GM-CSF, присутствует в концентрации по меньшей мере примерно 100 мг/мл и менее чем примерно 200 мг/мл, модификатор тоничности присутствует в концентрации от примерно 3 до примерно 7% (мас./об.), и буфер присутствует в концентрации от примерно 20 до примерно 40 мМ.

6. Композиция согласно любому из аспектов 1-5, где рН составляет от примерно 5 до примерно 7.

7. Композиция согласно любому из аспектов 1-6, где модификатор тоничности представляет собой сорбит, и буфер представляет собой гистидиновый буфер.

8. Композиция согласно любому из аспектов 1-6, которая не содержит поверхностно-активных веществ или аминокислот.

9. Композиция согласно любому из аспектов 4-7, которая не содержит поверхностно-активных веществ или дополнительных аминокислот.

10. Композиция согласно любому из аспектов 1-9, которая, по существу, не содержит хлорида натрия.

11. Композиция согласно любому из аспектов 1-10, которая не содержит никакого дополнительного эксципиента.

12. Композиция согласно любому из аспектов 1-11, где соединение, нейтрализующее GM-CSF, выбрано из группы, состоящей из полипептида, пептидомиметика, нуклеиновой кислоты и малой молекулы.

13. Композиция согласно аспекту 12, где полипептид представляет собой антитело или его функциональный фрагмент, связывающий GM-CSF или рецептор GM-CSF.

14. Композиция согласно аспекту 13, где антитело или его функциональный фрагмент представляет собой моноклональное антитело человека или его функциональный фрагмент.

15. Композиция согласно аспекту 13 или 14, где антитело представляет собой антитело IgG, IgG1 или IgG4.

16. Композиция согласно любому из аспектов 13-15, где антитело или его функциональный фрагмент связывается с эпитопом GM-CSF, эпитопом, предпочтительно содержащим аминокислоты 23-27 (RRLLN) и/или аминокислоты 65-77 (GLR/QGSLTKLKGPL).

17. Композиция согласно аспекту 16, где указанный эпитоп также содержит:

(1) аминокислоты 28-31 (LSRD);

(2) аминокислоты 32-33 (ТА) и/или (3) аминокислоты 21-22 (ЕА).

18. Композиция согласно аспекту 16 или 17, где указанный эпитоп представляет собой прерывистый эпитоп.

19. Композиция согласно любому из аспектов 13-18, где указанное антитело или его функциональный фрагмент содержит в своей вариабельной области тяжелой цепи область CDR3, содержащую ами

- 35 032829 нокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 1-13 и 56.

20. Композиция согласно аспекту 19, где любая из указанных последовательностей CDR3 вариабельной области тяжелой цепи находится в вариабельной области тяжелой цепи вместе с CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14 и CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15.

21. Композиция согласно любому из аспектов 13-20, где указанное антитело или его функциональный фрагмент содержит в своей вариабельной области легкой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18.

22. Композиция согласно любому из аспектов 13-21, где указанное антитело или его функциональный фрагмент содержит в своей вариабельной области легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 19, 54 и 55.

23. Композиция согласно любому из аспектов 13-22, где указанное антитело или его функциональный фрагмент содержит в своей вариабельной области тяжелой цепи аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 20-33, 52 и 53.

24. Композиция согласно любому из аспектов 13-23, где указанное антитело или его функциональный фрагмент содержит в своей вариабельной области легкой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18; и содержит в своей вариабельной области тяжелой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, и область CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-13 и 56.

25. Композиция согласно любому из аспектов 13-24, где указанное антитело или его функциональный фрагмент содержит в своей вариабельной области легкой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, CDR2 содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18; и содержит в своей вариабельной области тяжелой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

26. Композиция согласно любому из аспектов 13-25, где указанное антитело или его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 35-48.

27. Композиция согласно любому из аспектов 13-26, где указанное антитело или его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% гомологию с соответствующей аминокислотной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 1-48 и 52-56, предпочтительно с соответствующей аминокислотной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 1-18 и 56, и/или с аминокислотной последовательностью каркасных областей в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 19-48 и 52-55.

28. Композиция согласно любому из аспектов 1-27, которая содержит:

1) от примерно 100 до примерно 180 мг/мл соединения, нейтрализующего GM-CSF,

2) примерно 5% (мас./об.) сорбита,

3) примерно 30 мМ L-гистидина и

4) имеет рН примерно 5,8.

29. Композиция согласно аспекту 28, которая содержит примерно 150 мг/мл соединения, нейтрализующего GM-CSF.

30. Композиция согласно любому из аспектов 1-29, которая представляет собой жидкую, предпочтительно водную композицию.

31. Композиция согласно любому из аспектов 1-30, которая стабильна в течение по меньшей мере 24 месяцев при примерно 2-8°С или по меньшей мере в течение 28 суток при комнатной температуре.

32. Композиция согласно любому из аспектов 1-32 для применения в терапии.

33. Композиция согласно любому из аспектов 1-32, которая предназначена для внутривенного и/или подкожного введения.

34. Композиция согласно любому из аспектов 1-33 для применения в лечении воспалительных или аутоиммунных расстройств, предпочтительно включающих аллергические и псориатические расстройства, а также артритических и астматических расстройств.

35. Набор, содержащий композицию согласно любому из аспектов 1-34.

- 36 032829

Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение.

Пример 1. Вещество.

Следующие примеры выполняли с человеческим моноклональным антителом IgG1 (ниже обозначенным как антитело), которое связывает и нейтрализует с высокой аффинностью и специфичностью человеческий GM-CSF и который описан в WO 2006/111353. Его получение описано в примере 2 WO 2006/111353. Более конкретно, антитело содержит последовательности CDR легкой и тяжелой цепи, представленные в SEQ ID NO: 16, 17, 18, 14, 15 и 2. Эти CDR-последовательности содержатся в вариабельном домене тяжелой и легкой цепи соответственно, показанных в SEQ ID NO: 34 и 35 соответственно. GM-CSF аномально сверхпродуцируется при многих провоспалительных и аутоиммунных заболеваниях человека, и было обнаружено, что добавление рекомбинантного GM-CSF усугубляет такие заболевания. Возможные заболевания для лечения с помощью GM-CSF-нейтрализующего антитела включают ревматоидный артрит (RA), астму и другие формы легочного воспаления, рассеянный склероз (MS) и псориаз.

Антитело получали в биореакторе с использованием бессывороточной и безбелковой среды. Инокулят для производственного ферментера готовили из одного флакона антителопродуцирующего клона. После завершения процесса ферментации сбор, содержащий секретированное антитело, обрабатывали посредством фильтрации для отделения клеток и дебриса от супернатанта. Очистка сбора основана на обычных хроматографических подходах для уменьшения НСР (белки клетки-хозяина), ДНК и потенциально опасных вирусов. Стадия полной инактивации вируса была дополнительной частью последующего процесса. Для приготовления композиции выполняли концентрирование и стадию замены буфера.

Пример 2. Методы тестирования.

Эксклюзионная ВЭЖХ (SE-HPLC) была использована для определения степени агрегации антител (HPLC: Agilent 1100 Chemstation; колонка: Tosoh Biosep TSKgel G4000SWXL). Метод SE-HPLC проверяли на соответствие путем проведения испытания с девятиточечным критерием размаха выборки, из которого точность (шесть повторных инъекций) и линейность (стандартные кривые в трех экземплярах) были определены и проверены. Все анализы выполняли, используя 100 мМ KH₂PO₄, 200 мМ Na₂SO₄, pH 6,6 в качестве подвижного буфера.

Метод поверхностного плазмонного резонанса (SPR) использовали для определения степени связывающей активности антител с иммобилизованным GM-CSF (Biacore 3000/СМ5 сенсорный чип/HBS-EP подвижный буфер). Метод SPR проверяли на соответствие путем проведения испытания с девятиточечным критерием размаха выборки, из которого точность (шесть повторных инъекций) и линейность (стандартные кривые в трех экземплярах) были определены и проверены.

Восстанавливающий и невосстанавливающий SDS-PAGE выполняли для определения продуктов деградации (фрагментов) и агрегатов антитела.

Пример 3. Влияние рН и температурного стресса.

Исследование проводили для оценки стабильности антитела в буфере для скрининга с низкой ионной силой (LISSB: 2 мМ глицина, 2 мМ лимонной кислоты, 2 мМ HEPES, 2 мМ MES, и 2 мМ Трис) при значениях рН, варьирующихся от 3 до 10. Образцы антител хранили в соответствующих растворах при 55°С в течение 14 суток. В моменты времени T0, Т7 и Т14 (сутки) образцы анализировали. Анализ SPR показывает, что антитело является наиболее стабильным при рН 4-7. При анализе посредством SE-HPLC было обнаружено, что мономер антитела наиболее стабилен при рН 4-6 (Т14). Как невосстанавливающий, так и восстанавливающий SDS-PAGE образцов Т14 показали только минимальное образование продуктов деградации и агрегатов при рН 4-6.

Пример 4. Влияние ионной силы и температурного стресса.

Исследование проводили для оценки стабильности антитела в буфере для скрининга с низкой ионной силой (LISSB) в присутствии 0, 10, 100 и 500 мм NaCl. Образцы антител диализировали в растворах LISSB (рН 4,5 и рН 7,5) с дополнительным NaCl при концентрации приблизительно 1 мг/мл и хранили при 55°С в течение 14 суток. В моменты времени Т0, Т7 и Т14 (сутки) образцы проанализировали посредством SE-HPLC и SPR.

Исследования посредством HPLC и SPR демонстрируют, что добавление соли ухудшает стабильность антитела и что этот эффект больше выражен при рН 4,5, чем при рН 7,5. Кроме того, данные SEHPLC демонстрируют, что дестабилизация антитела при повышенных концентрациях соли (>100 мм) при рН 4,5 в основном приводит к накоплению агрегатов антитела. При рН 7,5 дестабилизация антитела с повышенными концентрациями соли (500 мм) в основном приводит к накоплению продуктов деградации антитела. В LISSB с рН 4,5; 500 мМ NaCl уровень преципитации (Т7 и Т14) антитела был очень высоким.

Пример 5. Влияние буферов.

Исследование проводили для оценки стабильности антитела в различных буферах с рН 5-7. Образцы антител диализировали в растворы 20 мМ цитратного буфера рН 5, 6 и 7; 20 мМ фосфатного буфера рН 6 и рН 7; 20 мМ сукцинатного буфера рН 6 и рН 7, 20 мМ гистидинового буфера рН 6 и рН 7 и 20 мМ ацетатного буфера рН 5 и рН 6 в концентрации приблизительно 1 мг/мл и хранили при 55°С в течение 14 суток. В моменты времени Т0, Т7 и Т14 (сутки) образцы анализировали посредством SE-HPLC, SPR и

- 37 032829 восстанавливающего и невосстанавливающего SDS-PAGE.

Исследование посредством SPR, данные HPLC о мономерах и агрегатах и восстанавливающий и невосстанвливающий SDS-PAGE указывают, что антитело наиболее стабильно в ацетатном буфере с рН 5, гистидиновом буфере с рН 6 и цитратном буфере с рН 5, 6 и 7 (Т14 данные).

Пример 6. Влияние аминокислот.

Исследование проводили для оценки стабильности антитела в буфере для скрининга с низкой ионной силой (LISSB) с добавлением разных аминокислот. Образцы антител хранили в растворе при рН 6 с 250 мМ соответствующей аминокислоты при 55°С в течение 14 суток. В моменты времени Т0, Т7 и Т14 (сутки) образцы анализировали. Исследование посредством SPR указывает на небольшой стабилизирующий эффект, особенно глутаминовой кислоты, треонина, лизина и валина (Т14). Данные HPLC демонстрируют стабилизирующий и значительный эффект глутаминовой кислоты, треонина и аланина, приводящий к увеличению приблизительно на 2-3% интактного мономера и уменьшению примерно на 30%, 31% и 20% агрегатов соответственно по сравнению с контролем без добавления каких-либо аминокислот.

Пример 7. Влияние сахаров и поверхностно-активных веществ.

Исследование проводили для оценки стабильности антитела в буфере для скрининга с низкой ионной силой (LISSB) с добавлением различных сахаров или поверхностно-активных веществ. Образцы антител диализировали в растворе LISSB с рН 6,0 в концентрации приблизительно 1 мг/мл с добавлением 6% (мас./об.) сахаров (D-маннит, D-сорбит, сахароза, D-манноза, D-мальтоза, D-трегалоза, D-глюкоза), 0,05% (об./об.) Tween 20 или 0,02% (об./об.) Tween 80 и хранили при 55°С в течение 14 суток. В момент времени Т0, Т7 и Т14 (сутки) образцы анализировали с помощью SE-HPLC, SPR и восстанавливающего и невосстанавливающего SDS-PAGE.

Исследования SPR и HPLC демонстрируют, что D-сорбит и D-маннит улучшают стабильность антитела примерно на 20%/3% (SPR/HPLC данные, Т14) и на 14%/4% (SPR/HPLC данные, Т14) соответственно. И трегалоза, и сахароза имели уменьшенные эффекты на 7%/0,7% (SPR/HPLC данные Т14) и на 6%/2% (SPR/HPLC данные, Т14) соответственно. Кроме того, данные HPLC демонстрируют, что Dсорбит и D-маннит уменьшают образование агрегатов антитела на 43% и 50% соответственно, что также подтверждается данными, полученными с помощью SDS-PAGE. Представляется, что ни 0,05% (об./об.) Tween 20, ни 0,02% (об./об.) Tween 80 не улучшают значительно стабильность антитела.

Пример 8. Влияние комбинации буферов, аминокислот и сахаров.

На основании предыдущих исследований было проведено определение оценки стабильности 1 мг/мл антитела, приготовленного в виде композиции в комбинации буферов, аминокислот и сахаров. Предыдущие исследования показали стабилизирующие эффекты: 20 мМ ацетата, рН 5; 20 мМ гистидина, рН 6; 250 мМ глутаминовой кислоты; 250 мМ треонина, 6% (мас./об.) сорбита и 6% (мас./об.) маннита. Антитело было приготовлено в виде композиции в концентрации 5,4 мг/мл в растворах из комбинации 20 мМ буфера, 250 мМ аминокислоты и 6% (об./об.) сахара, как указано в табл. 1, и его хранили при 55°С в течение 14 суток. Антитело в 1XPBS было включено в качестве контроля. В моменты времени Т0, Т7 и Т14 (сутки) образцы анализировали с помощью SE-HPLC и SPR.

Кроме того, Т0 образцы, содержащие антитело (5,4 мг/мл) в 1XPBS протестировали на чувствительность к замораживанию и оттаиванию. Флаконы для хранения медленно замораживали при -20°С в морозильной камере. После окончания замораживания образцы оттаивали при комнатной температуре. Этот процесс повторяли до завершения пяти циклов замораживания-оттаивания. Восстановление каждого образца исследовали с помощью SPR и SE-HPLC после двух и пяти циклов.

Таблица 1

- 38 032829

>93% по сравнению с T0. Для антитела в 1XPBS (образец 17) и образцов 1-4 (все без маннита или сорбита) эти числа составляют 62%, 19%, 26%, 91% и 85% соответственно. Следовательно, данные SPR демонстрируют, что добавление маннита или сорбита улучшает стабильность связывающей активности. Кроме того, образцы 1-4 желтеют к Т7 и Т14, что указывает на окисление. Данные SE-HPLC демонстрируют, что самые низкие уровни агрегатов (3,5-5,6%) и продуктов деградации (4,2-5,4%) обнаружены в образцах 5-8, 11-12 и 15-16 (данные для Т14/55°С), что подтверждает стабилизирующий эффект маннита и сорбита на мономеры антитела и показывает возможное незначительное влияние добавления 250 мМ треонина. Однако о влиянии треонина, по меньшей мере, только минимально можно судить по уровням мономеров, обнаруженным в образцах 5-8, 11-12 и 15-16 (91,2%, 89,8%, 91,5%, 90,8%, 89,8%, 89,0%, 91,4% и 90,9% соответственно) - для образца 17 (PBS) это число составляло 80,3% (данные для Т14/55°С). 250 мМ глутаминовой кислоты вместе с сорбитом или маннитом оказывает негативное влияние на стабильность мономера антитела, особенно в ацетатном буфере. В заключение необходимо отметить, что, как представляется, мономер антитела является наиболее стабильным в комбинации 20 мМ ацетатного буфера, рН 5 или 20 мМ гистидинового буфера, рН 6 и 6% (мас./об.) сорбита или 6% (мас./об.) маннита.

SE-HPLC данные экспериментов по замораживанию/оттаиванию демонстрируют незначительно превосходящий эффект сорбита над маннитом в стабилизации мономера антитела. В образцах 6 и 8 содержание мономера составляет 98,6 и 98,4% соответственно после 5 циклов замораживания/оттаивания по сравнению с содержанием мономеров в образцах 5 и 7, составляющим 96,9 и 96,0%.

Пример 9. Влияние комбинаций гистидинового или ацетатного буфера, сорбита или маннита и Tween 20 или Tween 80.

На основании данных по стабильности из предыдущих исследований (показывающих стабилизирующий эффект, в частности 20 мМ ацетата, рН 5, 20 мМ гистидина, рН 6, 6% (мас./об.) сорбита и 6% (мас./об.) маннита), выполняли новое исследование для оценки стабильности 10 мг/мл антитела, приготовленного в виде композиции в комбинации гистидинового или ацетатного буфера, сорбита или маннита и Tween 20 или Tween 80. С учетом концентраций антитела 10 мг/мл, также исследовали влияние добавления 0,02% (мас./об.) Tween 20 и 0.02% (мас./об.) Tween 80 на агрегацию.

Антитело готовили в виде композиции в концентрации 10 мг/мл в растворах 20 мМ ацетатного буфера, рН 5,0 или 20 мМ гистидинового буфера, рН 6,0 и с добавками, указанными в табл. 2, и хранили при 55°С в течение 14 суток. В моменты времени T0, Т7 и Т14 (сутки) образцы анализировали с помощью SE-HPLC и SPR.

Кроме того, образцы антител тестировали на чувствительность к замораживанию и оттаиванию. Антитело медленно замораживали в концентрации 10 мг/мл при -20°С в морозильной камере. После завершения замораживания образцы оттаивали при комнатной температуре. Этот процесс повторяли вплоть до окончания трех и/или пяти циклов замораживания и оттаивания. В каждом образце определяли восстановление с помощью SPR и SE-HPLC после трех и/или пяти циклов замораживания и оттаивания.

- 39 032829

Таблица 2 Комбинация буферов, сахаров и детергентов (Ас = ацетатный буфер;

His = гистидиновый буфер; М = маннит; S = сорбит; Т20 = Tween 20; Т80 = Tween 80)

Образец

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Буфер

Ас

X

X

X

X

X

X

His

X

X

X

X

X

X

Сахар

М

X

X

X

X

X

X

S

X

X

X

X

X

X

Детергент

Т20

X

X

X

X

Т80

X

X

X

X

Данные HPLC ясно показали, что 0,02% (мас./об.) Tween 20 и 0,02% (мас./об.) Tween 80 оказывают негативное влияние на стабильность мономера антитела. Через 14 суток хранения при 55°С осталось примерно 89-90% мономеров антитела, приготовленного в виде композиции без детергента, и осталось примерно 83-88% мономера антитела, приготовленного в виде композиции с добавленными детергентами. Потеря мономера антитела в основном была вызвана более высокими уровнями агрегатов антитела (примерно 7,6-10,3%) при добавлении детергентов. Без Tween 20 и Tween 80 агрегаты антител составляют примерно 5,2-6,4%. Хотя разница между ацетатом и гистидином в качестве буферной системы является незначительной, представляется, что гистидин, по меньшей мере, также хорош, как ацетат.

Эксперименты по замораживанию и оттаиванию демонстрируют, что, по меньшей мере, нет положительного эффекта детергентов на уровень мономеров антитела после пяти циклов замораживания и оттаивания. Однако мономер антитела является более стабильным при добавлении в композицию 6% (мас./об.) сорбита по сравнению с 6% (мас./об.) маннита. Когда добавлен маннит, мономер антитела в большей степени образует агрегаты после пяти циклов замораживания и оттаивания. HPLC-данные эксперимента по замораживанию и оттаиванию показали отсутствие различия между использованием ацетата и гистидина.

В заключение, предварительная композиция, содержащая 20 мМ гистидина, рН 6,0 и 6% (мас./об.) сорбита, представляется оптимальной для стабильности мономера антитела.

Пример 10. Оценка краткосрочной стабильности предварительной композиции, содержащей 20 мМ гистидина, 6% (мас./об.) D-сорбита.

На основании идентификации 20 мМ гистидина, рН 6,0 и 6% (мас./об.) сорбита как оптимальной предварительной композиции проводили тестирование краткосрочной стабильности для оценки этой предварительной композиции при более высоких концентрациях антитела.

Антитело было приготовлено в виде композиции в вышеуказанных растворах в концентрациях приблизительно 22, 36, 42, 83 и 118 мг/мл. Приготовленное антитело хранили при 5 и 25°С в течение периода времени вплоть до 4 недель. В моменты времени T0, Т14 и Т28 (сутки) образцы анализировали с помощью SE-HPLC.

Данные SE-HPLC ясно демонстрируют, что антитело стабильно в 20 мМ гистидине, рН 6,0, 6% (мас./об.) сорбита. Концентрация мономера антитела, определенная после 28 суток хранения при 5°С или 25°С, была всегда выше 97% за исключением самой высокой концентрации антитела (118 мг/мл), протестированной при 25°С, где концентрация мономера антитела была примерно 96,5%. Результаты показаны на фиг. 1.

Пример 11. Точный подбор конечных эксципиентов.

На основании данных, полученных в предыдущих экспериментах, сорбит и гистидин были выбраны для стабилизации антитела. На следующей стадии количество эксципиентов, а также значение рН были точно подобраны для концентраций антитела от 10 до 100 мг/мл с использованием Планирования эксперимента (DOE), включающего 3 центральные точки и приводящего к 30 отдельным прогонам. Рандомизированный экспериментальный план выполняли со следующими параметрами:

антитело: 10-55-100 мг/мл, рН: 5 -6-7, гистидин: 10-30-50 мМ, сорбит: 2-6-10% (мас./об.).

Чтобы обеспечить возможность краткосрочной оценки, образцы подвергали условиям ускоренной деградации при 50°С в течение 14 суток. Кроме того, проводили три цикла замораживания-оттаивания (-20°С) для имитации хранения антитела.

Результаты.

Определяли осмоляльность, чтобы обеспечить физиологические условия для композиции. Для внутривенного или подкожного применения антитела приемлемым диапазоном осмотического давления

- 40 032829 является 250-450 мОсмоль/кг. Как показано на фиг. 2, осмоляльность в основном контролируется количеством сорбита в композиции. Как низкие концентрации гистидина (10-50 мМ), так и само антитело оказывает лишь минимальное влияние на осмотическое давление.

Зависимость осмоляльности от концентрации сорбита и гистидина может быть изображена в виде контурной диаграммы. Это диаграмма показывает, что для поддерживания осмотического давления в физиологическом интервале необходима концентрация от 3 до 7% (мас./об.) сорбита. Полученные данные указывают оптимальную концентрацию сорбита, равную примерно 6%, приводящую к довольно высокому значению осмотического давления (>400 мОсмоль/кг). Так как некоторое уменьшение сорбита не влияет на стабильность антитела, концентрация сорбита может быть уменьшена до 5%, чтобы достичь осмотического давления примерно 350 мОсмоль/кг и в результате повысить удобство пациента.

На основе полученных данных оптимальная концентрация гистидина была установлена равной 30 мМ. В диапазоне концентрации гистидина от 10 до 50 мМ никакого влияния на агрегацию или фрагментацию, измеряемых с помощью HP-SEC, обнаружено не было.

Агрегация антитела зависит главным образом от концентрации. Повышенные концентрации антител приводят к более высокому уровню агрегации и повышенным значениям прозрачности во время замораживания/оттаивания и в условиях ускоренного температурного стресса. Кроме того, значение рН влияет на содержание мономера антитела. В то время как ускоренный стресс при рН<6 приводит к повышенной фрагментации антитела, оно не влияет на стабильность при замораживании/оттаивании, но все же наблюдается немного лучшая стабильность. При значениях рН>6 как для ускоренного температурного воздействия, так и для замораживания/оттаивания, пониженное содержание мономера может быть измерено с помощью HP-SEC и анализа прозрачности. Чтобы сбалансировать противоположные эффекты, значение рН 5,8 представляется наиболее подходящим для композиции антител.

Полученные результаты приводят к композиции со следующими параметрами:

антитело: 10 мг/мл-55 мг/мл-100 мг/мл,

D-сорбит: 5% (мас./об.),

L-гистидиновый буфер: 30 мМ (гидрохлорид моногидрат), pH: 5,8 (регулируется с помощью 2М гидроксида натрия).

Условия или параметры этой композиции также могут быть перенесены на композицию, имеющую более высокие концентрации антитела, как будет показано в следующих примерах.

Пример 12. Исследования стабильности.

а) Длительные исследования.

Исследование было рассчитано на период тестирования вплоть до 60 месяцев. В течение этого периода образцы антител хранили при 5±3°С в стеклянных флаконах DIN R2. Кроме того, ускоренное исследование при 25±2°С и исследование стресса при 40±2°С выполняли в стеклянных флаконах DIN R2 в течение вплоть до 12 и 6 месяцев соответственно. Тестирование выполняли, используя антитело в концентрации 106 мг/мл и 145 мг/мл в композиции с 30 мМ гистидина моногидрохлорида и 5% (мас./об.) сорбита при рН 5,8.

Измеряли следующие параметры: рН, осмотическое давление, концентрацию (OD280), процент мономеров, агрегатов и фрагментов с помощью SE-HPLC, эффективность (клеточный анализ). Результаты показаны в следующих ниже табл. 3-8.

Таблица 3

Исследование стабильности при 5±3°С (106 мг/мл антитела)

Время хранения	pH	Осмотическое давление	Концентрация (OD280)	Мономер (М) Агрегаты (А) Фрагменты (F) SE-HPLC	Эффективность (Клеточный анализ)
[Месяцы]	-	[мОсмоль/кг'1]	[мг/мл]	M/A/F [%]	Относительная эффективность (по сравнению с эталоном)
0	5,83	379	106,51	99,20	0,80	0	0,83
1	5,88	379	103,00	99,18	0,82	0	1,03
3	5,90	379	108,75	99,07	0,93	0	1,23
6	5,89	376	100,05	98,87	1,13	0	0,89
9	5,83	377	102,59	99,01	0,99	0	1,00
12	5,86	387	103,34	98,97	1,03	0	1,01
18	5,87	379	102,49	98,78	1,04	0,18	0,84
24	5,85	377	101,73	98,68	1,И	0,21	1,05
30	5,81	383	102,52	98,55	1,17	0,28	0,83
36	5,84	380	107,78	98,56	1,18	0,25	1,06
42	5,92	384	96,32	98,34	1,И	0,55	1,26
48	5,90	376	94,33	98,54	1,23	0,23	1,03
54	5,86	382	107,67	98,25	1,28	0,47	1,04
60	5,90	379	106,79	98,26	1,26	0,48	0,97

- 41 032829

Таблица 4

Исследование стабильности при 5±3°С (145 мг/мл антитела)

Время хранения	pH	Осмотическое давление	Концентрация (OD280)	Мономер (М) Агрегаты (А) Фрагменты (F) SE-HPLC	Эффективность (Клеточный анализ)
[Месяцы]	-	[мОсмоль/кг'1]	[мг-мл'1]	M/A/F [%]	Относительная эффективность (по сравнению с эталоном)
0	5,91	392	143,31	99,10	0,90	0	0,72
1	5,91	393	139,52	99,06	0,94	0	0,95
3	5,93	385	139,44	98,89	1Д1	0	1,06
6	5,90	381	145,66	98,79	1,21	0	0,81
9	5,87	383	144,12	98,86	1,14	0	1,07
12	5,89	388	140,52	98,80	1,20	0	1,13
18	5,90	387	143,66	98,62	1,22	0,16	1,09
24	5,85	385	137,07	98,45	1,38	0,17	0,83
30	5,84	387	131,98	98,30	1,42	0,28	0,87
36	5,88	384	148,55	98,35	1,39	0,26	0,99
42	5,94	383	134,11	98,17	1,33	0,50	0,97
48	5,94	385	125,09	98,23	1,50	0,26	1,03
54	5,90	394	150,81	97,94	1,57	0,49	1,04
60	5,90	386	147,01	97,94	1,53	0,53	0,82

Таблица 5

Исследование стабильности при 25±2°С (106 мг/мл антитела)

Время хранения	pH	Осмотическое давление	Концентрация (OD280)	Мономер (М) Агрегаты (А) Фрагменты (F) SE-HPLC	Эффективность (Клеточный анализ)
[Месяцы]	-	[мОсмоль/кг'1]	[мг-мл'1]	M/A/F [%]	Относительная эффективность (по сравнению с эталоном)
0	5,83	379	106,51	99,20	0,80	0	0,83
1	5,84	385	101,35	98,77	1,06	0,17	1,20
3	5,90	382	107,36	98,15	1,44	0,42	0,92
6	5,85	387	100,14	97,85	1,51	0,64	1,00
9	5,83	374	107,49	94,71	1,49	3,80	1,Ю
12	5,85	383	106,27	94,71	1,56	3,73	1,30

Таблица 6

Исследование стабильности при 25±2°С (145 мг/мл антитела)

Время хранения	pH	Осмотическое давление	Концентрация (OD280)	Мономер (М) Агрегаты (А) Фрагменты (F) SE-HPLC	Эффективность (Клеточный анализ)
[Месяцы]	-	[мОсмоль/кг'1]	[мг-мл'1]	M/A/F [%]	Относительная эффективность (по сравнению с эталоном)
0	5,91	392	143,31	99,10	0,90	0	0,72
1	5,90	384	142,84	98,49	1,19	0,31	0,95
3	5,93	386	147,84	98,12	1,50	0,37	1,04
6	5,88	383	134,73	97,62	1,78	0,60	0,78
9	5,91	387	144,59	94,46	1,85	3,69	0,97
12	5,87	387	143,12	94,36	1,90	3,74	1,23

- 42 032829

Таблица 7

Исследование стабильности при 40±2°С (106 мг/мл антитела)

Время хранения	pH	Осмотическое давление	Концентрация (OD280)	Мономер (М) Агрегаты (А) Фрагменты (F) SE-HPLC	Эффективность (Клеточный анализ)
[Месяц]	-	[мОсмоль/кг'1]	[мг-мл'1]	M/A/F [%]	Относительная эффективность (по сравнению с эталоном)
0	5,83	379	106,51	99,20	0,80	0	0,83
1	5,88	377	102,68	94,66	1,34	3,99	1,05
3	5,89	382	108,60	91,85	2,06	6,09	1,01
6	5,85	378	99,75	87,39	2,46	10,15	0,97

Таблица 8

Исследование стабильности при40±2°С (145 мг/мл антитело)

Время хранения	pH	Осмотическое давление	Концентрация (OD280)	Мономер (М) Агрегаты (А) Фрагменты (F) SE-HPLC	Эффективность (Клеточный анализ)
[Месяц]	-	[мОсмоль/кг'1]	[мг-мл'1]	M/A/F [%]	Относительная эффективность (по сравнению с эталоном)
0	5,91	392	143,31	99,10	0,90	0	0,72
1	5,92	388	136,96	94,96	1,69	3,35	0,77
3	5,91	386	143,07	92,02	2,40	5,58	0,87
6	5,88	388	137,11	86,56	3,33	10,11	0,94

б) Исследование в условиях ускорения/стресса.

Чтобы продемонстрировать сопоставимость лекарственного вещества после масштабирования, проводили исследование стабильности в ускоренных условиях (25°С) и в условиях стресса (40°С) с использованием двух партий лекарственного вещества с концентрациями антитела 165 и 171 мг/мл, приготовленными в растворе 30 мМ гистидина, 5% сорбита, рН 5,8.

Измеряли следующие параметры: рН, осмотическое давление, концентрацию (OD280), процент мономеров, агрегатов и фрагментов с помощью SE-HPLC, эффективность (клеточный анализ). Результаты для концентрации антитела 171 мг/мл показаны в следующих ниже табл. 9 и 10.

Таблица 9

Исследование стабильности при 25±2°С (171 мг/мл антитела)

Время хранения	pH	Осмотическое давление	Концентрация (OD280)	Мономер (М) Агрегаты (А) Фрагменты (F) SE-HPLC	Эффективность (Клеточный анализ)
[Месяцы]	-	[мОсмоль/кг1]	[мг-мл'1]	M/A/F [%]	Относительная эффективность (по сравнению с эталоном)
0	5,7	-	169,00	>99,0	0,6	<1%	0,97
2	5,6	-	171,00	98,3	1,7	<1%	0,92
3	5,7	-	173,00	98,0	2,0	<1%	1,14

Таблица 10

Исследование стабильности при 40С±2°С (171 мг/мл антитела)

Время хранения	pH	Осмотическое давление	Концентрация (OD280)	Мономер (М) Агрегаты (А) Фрагменты (F) SE-HPLC	Эффективность (Клеточный анализ)
[Месяц]	-	[мОсмоль/кг'1]	[мг-мл'1]	M/A/F [%]	Относительная эффективность (по сравнению с эталоном)
0	5,7	-	169,0	>99,0	0,6	<1%	0,97
2	5,6	—	171,0	92,5	2,9	<5%	0,90
3	5,7	-	175,0	90,3	3,5	<7%	0,91

в) Исследования замораживания/оттаивания.

Стабильность при замораживании/оттаивании исследовали для концентраций антитела 106 и 145 мг/мл, приготовленного в виде композиции в растворе 30 мМ гистидина, рН 5,8 и 5% сорбита. Антитело замораживали при -80±10°С, по меньшей мере, в течение ночи. Оттаивание выполняли в течение >6 ч при комнатной температуре. Выполняли 0, 1, 3, 5, 7 и 10 циклов замораживания/оттаивания.

- 43 032829

Измеряли следующие параметры: рН, осмотическое давление, концентрацию (OD280), процент мономеров, агрегаты и фрагменты с помощью SE-HPLC, эффективность (клеточный анализ). Результаты показаны в следующих ниже табл. 11 и 12.

Таблица 11 Исследование стабильности при замораживании/оттаивании (F/T) при -80±10°С (106 мг/мл антитела)

Количество F/Т циклов	pH	Осмотическое давление	Концентрация (OD280)	Мономер (М) Агрегаты (А) Фрагменты (F) SE-HPLC	Эффективность (Клеточный анализ)
[No.]	-	[мОсмоль/кг'1]	[мг-мл'1]	M/A/F [%]	Относительная эффективность (по сравнению с эталоном)
Ох	5,86	373	99,07	99,05	0,95	0	0,84
1х	5,86	381	99,37	99,19	0,81	0	1,05
Зх	5,89	379	98,23	99,20	0,80	0	1,И
5х	5,87	380	99,69	99,15	0,85	0	1,15
7х	5,86	380	99,96	99,12	0,88	0	1,24
10х	5,87	378	98,94	99,08	0,92	0	0,83

Таблица 12 Исследование стабильности при замораживании/оттаивании при -80±10°С (145 мг/мл антитело)

Количество F/Т циклов	pH	Осмотическое давление	Концентрация (OD280)	Мономер (М) Агрегаты (А) Фрагменты (F) SE-HPLC	Эффективность (Клеточный анализ)
[No.]	-	[мОсмоль/кг1]	[мг-мл'1]	M/A/F [%]	Относительная эффективность (по сравнению с эталоном)
Ох	5.86	373	133,13	98,94	1,06	0	0,81
1х	5,90	379	132,98	99,11	0,89	0	1,16
Зх	5,89	380	134,56	99,09	0,91	0	1,04
5х	5,90	384	132,74	99,07	0,93	0	1,И
7х	5,90	383	134,54	99,03	0,97	0	1,04
10х	5,91	385	132,89	98,96	1,04	0	1,05

г) Вибростабильность.

Это исследование было инициировано, чтобы получить информацию о влиянии напряжения сдвига на антитело в процессе от заполнения до пациента (например, заполнение, упаковка, транспортировка). Для этого антитело в концентрации 106 и 145 мг/мл и приготовленное в виде композиции в растворе 30 мМ гистидина, рН 5,8 и 5% сорбита встряхивали на вертикальном шейкере в первичной упаковке (стеклянные флаконы DIN R2). Флаконы хранили при 5±3°С вплоть до 14 суток на шейкере в сравнении с контролем (хранили без встряхивания при 5±3°С). Сбор точек данных производили через 0, 1, 2, 3, 7 и 14 суток.

Измеряли следующие параметры: рН, осмотическое давление, концентрацию (OD280), процент мономеров, агрегатов и фрагментов с помощью SE-HPLC и эффективность (клеточный анализ). Результаты показаны в следующих ниже Табл. 13-16.

- 44 032829

Таблица 13 Исследование вибростабильности при 5±3°С (106 мг/мл антитела) при встряхивании

Время хранения	pH	Осмотическое давление	Концентрация (OD280)	Мономер (М) Агрегаты (А) Фрагменты (F) SE-HPLC	Эффективность (Клеточный анализ)
[сутки]	-	[мОсмоль/кг'1]	[мг-мл'1]	M/A/F [%]	Относительная эффективность (по сравнению с эталоном)
0	5,86	373	99,07	99,05	0,95	0	0,84
1	5,89	375	96,37	99,07	0,93	0	n.d.
2	5,92	376	99,84	99,04	0,96	0	n.d.
3	5,88	384	99,69	99,04	0,96	0	0,95
7	5,85	377	99,39	99,05	0,95	0	1,00
14	5,89	379	100,14	99,06	0,94	0	0,87

Таблица 14 Исследование вибростабильности при 5±3°С (106 мг/мл антитела) без встряхивания

Время хранения	pH	Осмотическое давление	Концентрация (OD280)	Мономер (М) Агрегаты (А) Фрагменты (F) SE-HPLC	Эффективность (Клеточный анализ)
[сутки]	-	[мОсмоль/кг'1]	[мг-мл'1]	M/A/F [%]	Относительная эффективность (по сравнению с эталоном)
0	5,86	373	99,07	99,05	0,95	0	0,84
1	5,93	380	96,54	99,09	0,91	0	n.d.
2	5,94	379	99,60	99,08	0,92	0	n.d.
3	5,86	378	98,98	99,05	0,95	0	0,98
7	5,85	378	98,79	99,02	0,98	0	1,04
14	5,92	384	99,43	99,08	0,92	0	1,13

Таблица 15 Исследование вибростабильности при 5±3°С (145 мг/мл антитела) при встряхивании

Время хранения	pH	Осмотическое давление	Концентрация (OD280)	Мономер (М) Агрегаты (А) Фрагменты (F) SE-HPLC	Эффективность (Клеточный анализ)
[сутки]	-	[мОсмоль/кг'1]	[мг-мл'1]	M/A/F [%]	Относительная эффективность (по сравнению с эталоном)
0	5,96	382	133,13	98,94	1,06	0	0,81
1	5,92	381	132,32	98,97	1,03	0	n.d.
2	5,94	385	135,31	98,93	1,07	0	n.d.
3	5,89	384	133,54	98,91	1,09	0	0,89
7	5,85	382	132,17	99,01	0,99	0	1,19
14	5,90	384	134,88	98,95	1,05	0	0,98

- 45 032829

Таблица 16 Исследование вибростабильности при 5±3°С (145 мг/мл антитело) без встряхивания

Время хранения	pH	Осмотическое давление	Концентрация (OD280)	Мономер (М) Агрегаты (А) Фрагменты (F) SE-HPLC	Эффективность (Клеточный анализ)
[сутки]	-	[мОсмоль/кг'1]	[мг-мл'1]	M/A/F [%]	Относительная эффективность (по сравнению с эталоном)
0	5,96	382	133,13	98,94	1,06	0	0,81
1	5,92	382	132,70	98,98	1,02	0	n.d.
2	5,95	383	137,85	98,98	1,02	0	n.d.
3	5,89	385	138,28	98,93	1,07	0	0,71
7	5,88	380	133,11	98,93	1,07	0	1,16
14	5,90	387	135,40	98,93	1,07	0	0,79

д) Результаты и заключение.

Длительное исследование стабильности, включающие условия ускорения и стресса, проводили в течение вплоть до 60 месяцев для антитела с концентрацией примерно 106 и примерно 145 мг/мл. Дополнительные исследования стабильности в условиях ускорения и стресса также были выполнены для антитела с концентрацией вплоть до примерно 171 мг/мл.

В течение 60 месяцев образцы, которые хранили при 5±3°С для обеих концентраций, показали менее 2% агрегации и имели такую же эффективность, что и контроль. Через 12 месяцев хранения в условиях ускорения (25±2°С) обе концентрации (106 и 145 мг/мл) показали менее 2% агрегации и имели такую же эффективность, что и контроль. Через 6 месяцев хранения в условиях стресса (40±2°С) обе концентрации показали менее 5% агрегации и имели приблизительно такую же эффективность, что и контроль.

Данные дополнительных исследований при ускорении/стрессе продемонстрировали стабильность в течение 3 месяцев и 1 месяца при 25 и 40°С соответственно. Это означает, что стабильность при 2-8°С может, как ожидается, быть сравнимой с полученной для концентраций антитела 106 и 145 мг/мл, как описано выше.

Кроме того, антитело является стабильным в течение по меньшей мере 10 циклов замораживания/оттаивания при -80±10°С для обеих тестируемых концентраций антитела: примерно 106 и примерно 145 мг/мл.

Наконец, исследование вибростабильности выполняли в течение периода времени 14 суток на вертикальном шейкере при 5±3°С по сравнению с контролем без встряхивания. Во время этого периода никаких отклонений показателей, оценивающих рН, осмотическое давление, деградацию, агрегацию, фрагментацию, концентрацию или эффективность, не обнаруживалось. Встряхивание, по-видимому, не оказывает никакого влияния на стабильность антитела.

На основании вышеуказанных данных время хранения, составляющее по меньшей мере 60 месяцев, может быть предложено для концентраций вплоть до примерно 171 мг/мл при 5±3°С.

Пример 13. Оценка вязкости.

Вязкость определяется с помощью реометра. Реометр используется для тех жидкостей, которые не могут быть охарактеризованы одним значением вязкости и, следовательно, требуют определения и измерения большего числа параметров, чем в случае вискозиметра.

Для некоторых жидкостей вязкость является постоянной в широком диапазоне скоростей сдвига (ньютоновские жидкости). Жидкости без постоянной вязкости (неньютоновские жидкости), не могут быть описаны одним числом. Неньютоновские жидкости демонстрируют ряд различных корреляций между напряжением сдвига и скоростью сдвига. Таким образом, вязкость зависит от температуры, а также от скорости сдвига для неньютоновских жидкостей. Вязкость указана в (мПа-с) при определенной температуре и определенной скорости сдвига γ [1/с].

Вязкость композиции, содержащей примерно 150 мг/мл антитела, ниже 12 мПа-с при скорости сдвига от примерно 50 до примерно 1000 [1/с] при температуре 20°С.

Вязкость композиции, содержащей примерно 150 мг/мл антитела, ниже 20 мПа-с при скорости сдвига от примерно 50 до примерно 1000 [1/с] при температуре 5°С.

- 46 032829

	ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>	Amgen Research (Munich) GmbH; Takeda GmbH
<120> <130>	Жидкая композиция, содержащая соединение, нейтрализующее GM-CSF MIM14487PCT
<150> <151>	US61/720,892 2012-10-31
<150> <151>	EP12199191.3 2012-12-21
<160>	56
<170>	PatentIn version 3.5
<210> <211> <212> <213>	1 10 PRT искусственная последовательность

<220> <223>	CDR-H3 7A-701
<400>	1

Ser Gly Leu Ile Ala Asn His Met Thr Pro

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	2 10 PRT искусственная последовательность

<220> <223>	CDR-H3 7B1-502
<400>	2

Thr Thr Leu Ile Ser Val Tyr Phe Asp Tyr

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	3 10 PRT искусственная последовательность

<220> <223>	CDR-H3 L38-A1
<400>	3

Ser Gly Leu Ile Phe Asp Tyr Trp Leu Asp

1	5 10
<210>	4

- 47 032829

<211> <212> <213>

10 PRT искусственная последовательность

<220> <223>	CDR-H3 L38-A12
<400>	4

Ser Gly Leu Ile Ile Asp Ala Leu Ser Pro

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	5 10 PRT искусственная последовательность

<220> <223>	CDR-H3 L38-G7
<400>	5

Thr Ser Leu Met Ser Ile Tyr Phe Asp Tyr

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	6 10 PRT искусственная последовательность

<220> <223>	CDR-H3 L39-D11
<400>	6

Ser Gly Leu Leu Phe Leu Tyr Phe Asp Tyr

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	7 10 PRT искусственная последовательность

<220> <223>	CDR-H3 E1-37-E7
<400>	7

Ser Gly Leu Ile Asn Leu Gly Met His Pro

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	8 10 PRT искусственная последовательность

<220> <223>

CDR-H3 M1_3-82

- 48 032829 <400>8

Ser Gly Leu Ile Phe Asp Ala Leu Arg Asp

510 <210>9 <211> 10 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> CDR-H3 Ln4p-23 <400> 9

Ser Gly Leu Ile Phe Asp Lys Leu Thr Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> CDR-H3 Ln4p-28 <400> 10

Ser Gly Leu Ile Asn Leu His Phe Asp Thr 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> CDR-H3 Ln4p-50 <400> 11

Ser Thr His Phe Ser Ala Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> CDR-H3 Ln4p-65 <400>12

Ser Gly Leu Ile Met Asp Lys Leu Asp Asn 1 510 <210>13

- 49 032829

<211> <212> <213>

10 PRT искусственная последовательность

<220> <223>	CDR-H3 Ln4p-90
<400>	13

Ser Gly Leu Ile Ile Asp Asn Leu Asn Pro

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	14 5 PRT искусственная последовательность

<220> <223>	CDR-H1 7B1-502
<400>	14

Asp Tyr Leu Leu His

1	5
<210> <211> <212> <213>	15 17 PRT искусственная последовательность

<220> <223>	CDR-H2 7B1-502
<400>	15

Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 Gly

5 10 15

<210> <211> <212> <213>

16 11 PRT искусственная последовательность

<220> <223>	CDR-L1 5-306
<400>	16

Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg Asn Ile Leu Asn

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	17 7 PRT искусственная последовательность

<220>

- 50 032829 <223> CDR-L2 5-306 <400>17

Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser <210> 18 <211>9 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> CDR-L3 5-306 <400>18

Gln Gln Ser Tyr Ser Met Pro Arg Thr <210>19 <211>107 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> VL 5-306* L-вариант <400> 19

Asp

Ile

Gln

Met

Thr

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser

Val

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Ala

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Asn

Ile

Arg

Asn

Ile

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Arg

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Gln

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Gln

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Asn

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Tyr

Ser

Met

Pro

Arg

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

<210> 20 <211> 119 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> VH с CDR-H3 = 7A-701 <400> 20

Glu

Val

Gln

Leu

Leu

Glu

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

- 51 032829

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Ala

Asn

His

Met

Thr

Pro

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210> 21 <211> 119 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> VH с CDR-H3 = 7B1-502* <400> 21

Gln

Val

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr

Arg

Thr

Thr

Leu

Ile

Ser

Val

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210> 22 <211> 119 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> VH с CDR-H3 = 3077* <400> 22

Gln

Val

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

- 52 032829

Thr Arg Ser Gly Leu Ile Ala Val Tyr Phe Asp

Tyr Trp Gly Gln Gly

110

100

105

Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 <210> 23 <211> 119 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> VH с CDR-H3 = L38-A1 <400> 23

Glu

Val

Gln

Leu

Leu

Glu

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Phe

Asp

Tyr

Trp

Leu

Asp

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210> 24 <211> 119 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> VH с CDR-H3 = L38-A12 <400> 24

Glu

Val

Gln

Leu

Leu

Glu

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Ile

Asp

Ala

Leu

Ser

Pro

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210> 25

- 53 032829 <211> 119 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> VH с CDR-H3 = L38-G7 <400> 25

Glu

Val

Gln

Leu

Leu

Glu

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr

Arg

Thr

Ser

Leu

Met

Ser

Ile

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210> 26 <211> 119 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> VH с CDR-H3 = L39-D11 <400> 26

Glu

Val

Gln

Leu

Leu

Glu

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr

Arg

Ser

Gly

Leu

Leu

Phe

Leu

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210> 27 <211> 119 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> VH с CDR-H3 = E1-37-E7

- 54 032829 <400> 27

Glu

Val

Gln

Leu

Leu

Glu

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Asn

Leu

Gly

Met

His

Pro

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210> 28 <211> 119 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> VH с CDR-H3 = M1_3-82 <400>28

Glu

Val

Gln

Leu

Leu

Glu

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Phe

Asp

Ala

Leu

Arg

Asp

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210>29 <211>119 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> VH с CDR-H3 = Ln4p-23 <400> 29

Glu

Val

Gln

Leu

Leu

Glu

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

- 55 032829

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Phe

Asp

Lys

Leu

Thr

Ser

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210> 30 <211> 119 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> VH с CDR-H3 = Ln4p-28 <400>30

Glu

Val

Gln

Leu

Leu

Glu

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Asn

Leu

His

Phe

Asp

Thr

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210>31 <211>119 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> VH с CDR-H3 = Ln4p-50 <400> 31

Glu

Val

Gln

Leu

Leu

Glu

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

- 56 032829

Thr Arg Ser Thr His Phe Ser Ala Tyr Phe Asp

100

Tyr Trp Gly Gln Gly

110

105

Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 <210> 32 <211> 119 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> VH с CDR-H3 = Ln4p-65 <400>32

Glu

Val

Gln

Leu

Leu

Glu

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Met

Asp

Lys

Leu

Asp

Asn

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210>33 <211>119 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> VH с CDR-H3 = Ln4p-90 <400> 33

Glu

Val

Gln

Leu

Leu

Glu

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Ile

Asp

Asn

Leu

Asn

Pro

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210> 34

- 57 032829 <211> 214 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> легкая цепь 5-306* L-вариант <400>34

Asp

Ile

Gln Met

Thr

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser

Val

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Ala

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Asn

Ile

Arg

Asn

Ile

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Arg

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Gln

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Gln

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Asn

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Tyr

Ser

Met

Pro

Arg

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

100

105

110

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gln

Leu

Lys

Ser

Gly

115

120

125

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

130

135

140

Lys

Val

Gln

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gln

Ser

Gly

Asn

Ser

Gln

145

150

155

160

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gln

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

165

170

175

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

180

185

190

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gln

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

195

200

205

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210>35 <211>449 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> тяжелая цепь с CDR-H3 = 7B1-502* <400> 35

Gln

Val

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr

Arg

Thr

Thr

Leu

Ile

Ser

Val

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

- 58 032829

Thr

Met

Val 115

Thr

Val

Ser

Ser

Ala 120

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro 125

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

130

135

140

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

145

150

155

160

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

165

170

175

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

180

185

190

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

195

200

205

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

210

215

220

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

225

230

235

240

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

245

250

255

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

260

265

270

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

275

280

285

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

290

295

300

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

305

310

315

320

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

325

330

335

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

340

345

350

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

355

360

365

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

370

375

380

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

385

390

395

400

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

405

410

415

Ser

Arg

Trp

Gln

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

420

425

430

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

435

440

445

Lys

<210> 36 <211> 449 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> тяжелая цепь с CDR-H3 =7A-701* <400> 36

Gln

Val

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

- 59 032829

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Ala

Asn

His

Met

Thr

Pro

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

115

120

125

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

130

135

140

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

145

150

155

160

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

165

170

175

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

180

185

190

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

195

200

205

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

210

215

220

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

225

230

235

240

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

245

250

255

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

260

265

270

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

275

280

285

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

290

295

300

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

305

310

315

320

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

325

330

335

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

340

345

350

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

355

360

365

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

370

375

380

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

385

390

395

400

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

405

410

415

Ser

Arg

Trp

Gln

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

420

425

430

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

435 440 445

Lys

<210>	37
<211>	449
<212>	PRT
<213>	искусственная последовательность
<220>
<223>	тяжелая цепь с CDR-H3 = L38-A1*
<400>	37

- 60 032829

Gln 1

Val

Gln

Leu Val 5

Gln

Ser

Gly Ala

Glu Val 10

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Phe

Asp

Tyr

Trp

Leu

Asp

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

115

120

125

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

130

135

140

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

145

150

155

160

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

165

170

175

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

180

185

190

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

195

200

205

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

210

215

220

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

225

230

235

240

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

245

250

255

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

260

265

270

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

275

280

285

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

290

295

300

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

305

310

315

320

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

325

330

335

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

340

345

350

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

355

360

365

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

370

375

380

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

385

390

395

400

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

405

410

415

Ser

Arg

Trp

Gln

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

420

425

430

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

435

440

445

Lys

<210> 38 <211> 449 <212> PRT

- 61 032829 <213> искусственная последовательность <220>

<223> тяжелая цепь с CDR-H3 = L38-A12* <400> 38

Gln 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Ile

Asp

Ala

Leu

Ser

Pro

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

115

120

125

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

130

135

140

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

145

150

155

160

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

165

170

175

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

180

185

190

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

195

200

205

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

210

215

220

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

225

230

235

240

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

245

250

255

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

260

265

270

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

275

280

285

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

290

295

300

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

305

310

315

320

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

325

330

335

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

340

345

350

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

355

360

365

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

370

375

380

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

385

390

395

400

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

405

410

415

Ser

Arg

Trp

Gln

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

420

425

430

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

435

440

445

- 62 032829

Lys <210> 39 <211> 449 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> тяжелая цепь с CDR-H3 = L38-G7* <400> 39

Gln Val 1

Gln

Leu

Val 5

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr

Arg

Thr

Ser

Leu

Met

Ser

Ile

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

115

120

125

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

130

135

140

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

145

150

155

160

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

165

170

175

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

180

185

190

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

195

200

205

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

210

215

220

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

225

230

235

240

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

245

250

255

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

260

265

270

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

275

280

285

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

290

295

300

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

305

310

315

320

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

325

330

335

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

340

345

350

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

355

360

365

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

370

375

380

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

- 63 032829

385

390

395

400

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

405

410

415

Ser

Arg

Trp

Gln

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

420

425

430

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

435 440 445

Lys <210> 40 <211> 449 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> тяжелая цепь с CDR-H3 = L39-D11* <400> 40

Gln 1

Val

Gln

Leu Val 5

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr

Arg

Ser

Gly

Leu

Leu

Phe

Leu

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

115

120

125

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

130

135

140

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

145

150

155

160

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

165

170

175

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

180

185

190

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

195

200

205

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

210

215

220

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

225

230

235

240

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

245

250

255

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

260

265

270

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

275

280

285

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

290

295

300

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

305

310

315

320

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

325

330

335

- 64 032829

Thr

Ile

Ser

Lys 340

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro 345

Arg

Glu

Pro

Gln

Val 350

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

355

360

365

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

370

375

380

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

385

390

395

400

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

405

410

415

Ser

Arg

Trp

Gln

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

420

425

430

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

435

440

445

Lys

<210> 41 <211> 449 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> тяжелая цепь с CDR-H3 = E1-37-E7* <400> 41

Gln 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu Val 10

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Asn

Leu

Gly

Met

His

Pro

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

115

120

125

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

130

135

140

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

145

150

155

160

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

165

170

175

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

180

185

190

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

195

200

205

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

210

215

220

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

225

230

235

240

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

245

250

255

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

260

265

270

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

- 65 032829

275

280

285

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

290

295

300

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

305

310

315

320

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

325

330

335

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

340

345

350

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

355

360

365

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

370

375

380

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

385

390

395

400

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

405

410

415

Ser

Arg

Trp

Gln

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

420

425

430

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

435

440

445

Lys

<210>

42

<211>

449

<212>

PRT

<213>

искусственная последовательность

<220>

<223>

тяжелая цепь

с CDR-H3

! = M1_3-

-82*

<400>

42

Gln

Val

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Phe

Asp

Ala

Leu

Arg

Asp

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

115

120

125

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

130

135

140

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

145

150

155

160

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

165

170

175

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

180

185

190

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

195

200

205

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

210

215

220

- 66 032829

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

225

230

235

240

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

245

250

255

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

260

265

270

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

275

280

285

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

290

295

300

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

305

310

315

320

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

325

330

335

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

340

345

350

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

355

360

365

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

370

375

380

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

385

390

395

400

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

405

410

415

Ser

Arg

Trp

Gln

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

420

425

430

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

435

440

445

Lys

<210> 43 <211> 449 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> тяжелая цепь с CDR-H3 = Ln4p-23* <400> 43

Gln

Val

Gln

Leu

Val

Gln Ser

Gly Ala Glu Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Phe

Asp

Lys

Leu

Thr

Ser

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

115

120

125

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

130

135

140

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

145

150

155

160

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

- 67 032829

165

170

175

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

180

185

190

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

195

200

205

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

210

215

220

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

225

230

235

240

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

245

250

255

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

260

265

270

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

275

280

285

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

290

295

300

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

305

310

315

320

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

325

330

335

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

340

345

350

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

355

360

365

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

370

375

380

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

385

390

395

400

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

405

410

415

Ser

Arg

Trp

Gln

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

420

425

430

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

435

440

445

Lys

<210>

44

<211>

449

<212>

PRT

<213>

искусственная последовательность

<220>

<223>

тяжелая цепь

с CDR-H3

= Ln4p-

-28*

<400>

44

Gln Val

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Asn

Leu

His

Phe

Asp

Thr

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

- 68 032829

Thr

Met

Val 115

Thr

Val

Ser

Ser

Ala 120

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro 125

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

130

135

140

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

145

150

155

160

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

165

170

175

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

180

185

190

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

195

200

205

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

210

215

220

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

225

230

235

240

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

245

250

255

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

260

265

270

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

275

280

285

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

290

295

300

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

305

310

315

320

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

325

330

335

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

340

345

350

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

355

360

365

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

370

375

380

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

385

390

395

400

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

405

410

415

Ser

Arg

Trp

Gln

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

420

425

430

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

435

440

445

Lys

<210> 45 <211> 449 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> тяжелая цепь с CDR-H3 = Ln4p-50* <400> 45

Gln

Val

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

- 69 032829

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr

Arg

Ser

Thr

His

Phe

Ser

Ala

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

115

120

125

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

130

135

140

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

145

150

155

160

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

165

170

175

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

180

185

190

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

195

200

205

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

210

215

220

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

225

230

235

240

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

245

250

255

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

260

265

270

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

275

280

285

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

290

295

300

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

305

310

315

320

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

325

330

335

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

340

345

350

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

355

360

365

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

370

375

380

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

385

390

395

400

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

405

410

415

Ser

Arg

Trp

Gln

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

420

425

430

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

435 440 445

Lys

<210>	46
<211>	449
<212>	PRT
<213>	искусственная	последовательность
<220>
<223>	тяжелая цепь	с CDR-H3 = Ln4p-65*
<400>	46

- 70 032829

Gln 1

Val

Gln

Leu Val 5

Gln

Ser

Gly Ala

Glu Val 10

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Met

Asp

Lys

Leu

Asp

Asn

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

115

120

125

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

130

135

140

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

145

150

155

160

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

165

170

175

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

180

185

190

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

195

200

205

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

210

215

220

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

225

230

235

240

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

245

250

255

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

260

265

270

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

275

280

285

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

290

295

300

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

305

310

315

320

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

325

330

335

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

340

345

350

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

355

360

365

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

370

375

380

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

385

390

395

400

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

405

410

415

Ser

Arg

Trp

Gln

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

420

425

430

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

435

440

445

Lys

<210> 47 <211> 449 <212> PRT

- 71 032829 <213> искусственная последовательность <220>

<223> тяжелая цепь с CDR-H3 = Ln4p-90* <400> 47

Gln 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Ile

Asp

Asn

Leu

Asn

Pro

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

115

120

125

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

130

135

140

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

145

150

155

160

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

165

170

175

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

180

185

190

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

195

200

205

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

210

215

220

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

225

230

235

240

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

245

250

255

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

260

265

270

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

275

280

285

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

290

295

300

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

305

310

315

320

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

325

330

335

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

340

345

350

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

355

360

365

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

370

375

380

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

385

390

395

400

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

405

410

415

Ser

Arg

Trp

Gln

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

420

425

430

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

435

440

445

- 72 032829

Lys <210> 48 <211> 449 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> тяжелая цепь с CDR-H3 = 3077* <400> 48

Gln Val 1

Gln

Leu

Val 5

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Ala

Val

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

115

120

125

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

130

135

140

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

145

150

155

160

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

165

170

175

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

180

185

190

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

195

200

205

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

210

215

220

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

225

230

235

240

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

245

250

255

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

260

265

270

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

275

280

285

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

290

295

300

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

305

310

315

320

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

325

330

335

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

340

345

350

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

355

360

365

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

370

375

380

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

- 73 032829

385

390

395

400

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

405

410

415

Ser

Arg

Trp

Gln

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

420

425

430

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

435

440

445

Lys <210>49 <211>127 <212> PRT <213> GM-CSF человека <400> 49

Ala

Pro

Ala

Arg

Ser

Pro

Ser

Pro

Ser

Thr

Gln

Pro

Trp

Glu

His

Val

1

5

10

15

Asn

Ala

Ile

Gln

Glu

Ala

Arg

Arg

Leu

Leu

Asn

Leu

Ser

Arg

Asp

Thr

20

25

30

Ala

Ala

Glu

Met

Asn

Glu

Thr

Val

Glu

Val

Ile

Ser

Glu

Met

Phe

Asp

35

40

45

Leu

Gln

Glu

Pro

Thr

Cys

Leu

Gln

Thr

Arg

Leu

Glu

Leu

Tyr

Lys

Gln

50

55

60

Gly

Leu

Arg

Gly

Ser

Leu

Thr

Lys

Leu

Lys

Gly

Pro

Leu

Thr

Met

Met

65

70

75

80

Ala

Ser

His

Tyr

Lys

Gln

His

Cys

Pro

Pro

Thr

Pro

Glu

Thr

Ser

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Gln

Ile

Ile

Thr

Phe

Glu

Ser

Phe

Lys

Glu

Asn

Leu

Lys

Asp

100

105

110

Phe

Leu

Leu

Val

Ile

Pro

Phe

Asp

Cys

Trp

Glu

Pro

Val

Gln

Glu

115

120

125

<210>50 <211>127 <212> PRT <213> GM-CSF макаки <400> 50

Ala 1

Pro

Ala

Arg

Ser 5

Pro

Ser

Pro

Gly

Thr 10

Gln

Pro

Trp

Glu

His 15

Val

Asn

Ala

Ile

Gln

Glu

Ala

Arg

Arg

Leu

Leu

Asn

Leu

Ser

Arg

Asp

Thr

20

25

30

Ala

Ala

Glu

Met

Asn

Lys

Thr

Val

Glu

Val

Val

Ser

Glu

Met

Phe

Asp

35

40

45

Leu

Gln

Glu

Pro

Ser

Cys

Leu

Gln

Thr

Arg

Leu

Glu

Leu

Tyr

Lys

Gln

50

55

60

Gly

Leu

Gln

Gly

Ser

Leu

Thr

Lys

Leu

Lys

Gly

Pro

Leu

Thr

Met

Met

65

70

75

80

Ala

Ser

His

Tyr

Lys

Gln

His

Cys

Pro

Pro

Thr

Pro

Glu

Thr

Ser

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Gln

Ile

Ile

Thr

Phe

Gln

Ser

Phe

Lys

Glu

Asn

Leu

Lys

Asp

100

105

110

Phe

Leu

Leu

Val

Ile

Pro

Phe

Asp

Cys

Trp

Glu

Pro

Val

Gln

Glu

115

120

125

<210>51 <211>127

- 74 032829 <212> PRT <213> GM-CSF гиббона <400> 51

Ala 1

Pro

Ser

Arg

Ser 5

Pro

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Gln

Pro

Trp

Glu

His 15

Val

Asn

Ala

Ile

Gln

Glu

Ala

Arg

Arg

Leu

Leu

Asn

Leu

Ser

Arg

Asp

Thr

20

25

30

Ala

Ala

Glu

Ile

Asn

Glu

Thr

Val

Glu

Val

Val

Ser

Glu

Met

Phe

Asp

35

40

45

Leu

Gln

Glu

Pro

Thr

Cys

Leu

Gln

Thr

Arg

Leu

Glu

Leu

Tyr

Lys

Gln

50

55

60

Gly

Leu

Arg

Gly

Ser

Leu

Thr

Lys

Leu

Lys

Gly

Pro

Leu

Thr

Met

Met

65

70

75

80

Ala

Ser

His

Tyr

Lys

Gln

His

Cys

Pro

Pro

Thr

Pro

Glu

Thr

Ser

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Gln

Ile

Ile

Ile

Phe

Glu

Ser

Phe

Lys

Glu

Asn

Leu

Lys

Asp

100

105

110

Phe

Leu

Leu

Val

Ile

Pro

Phe

Asp

Cys

Trp

Glu

Pro

Val

Gln

Gly

115

120

125

<210> 52 <211> 119 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> VH с CDR-H3 7B1-502 <400> 52

Glu

Val

Gln

Leu

Leu

Glu

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr

Arg

Thr

Thr

Leu

Ile

Ser

Val

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210>	53
<211>	119
<212>	PRT
<213>	искусственная последовательность
<220> <223>	VH с	CDR-H3 3077
<400>	53
Glu Val	Gln	Leu Leu Glu	Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys	Pro Gly Ala
1		5	10	15

- 75 032829

Ser

Val

Lys

Val 20

Ser

Cys

Lys

Ala

Phe 25

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr 30

Asp

Tyr

Leu

Leu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Gly

Trp

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr

Arg

Ser

Gly

Leu

Ile

Ala

Val

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210> 54 <211> 107 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> VL 5-306 <400> 54

Glu

Leu

Val

Met

Thr

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser

Val

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Ala

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Asn

Ile

Arg

Asn

Ile

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Arg

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Gln

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Gln

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Asn

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Tyr

Ser

Met

Pro

Arg

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

<210> 55 <211> 107 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> VL 5-306* V-вариант <400> 55

Asp 1

Ile

Gln Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Val

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Ala

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Asn

Ile

Arg

Asn

Ile

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Arg

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Gln

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Gln

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Asn

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Tyr

Ser

Met

Pro

Arg

- 76 032829

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100

105 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> CDR-H3 3077 <400> 56

Ser Gly Leu Ile Ala Val Tyr Phe Asp Tyr

Claims (13)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1) от примерно 100 до примерно 180 мг/мл антитела или его функционального фрагмента, связывающихся с GM-CSF,

1) человеческое моноклональное антитело или его функциональный фрагмент, связывающиеся с GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), содержащие в вариабельной области легкой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и содержащие в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 1-13 и 56, в концентрации по меньшей мере 100 мг/мл и менее чем 200 мг/мл,

1. Водная композиция, содержащая:

2) примерно 5% (мас./об.) сорбита,

2. Композиция по п.1, где модификатор тоничности представляет собой сорбит и буфер представляет собой гистидиновый буфер.

2) модификатор тоничности, выбранный из маннита, сорбита, сахарозы и/или трегалозы, присутствующий в концентрации от примерно 3 до примерно 7% (мас./об.), и

3) примерно 30 мМ L-гистидина и

3. Композиция по п.1 или 2, которая не содержит поверхностно-активных веществ или дополнительных аминокислот.

3) буфер, выбранный из гистидинового, ацетатного и/или цитратного буфера, присутствующий в концентрации от примерно 10 до примерно 50 мМ, где рН составляет от примерно 5 до примерно 7.

4) имеет рН примерно 5,8.

4. Композиция по любому из пп.1-3, которая содержит:

5. Композиция по п.4, которая содержит примерно 150 мг/мл антитела или его функционального фрагмента, связывающихся с GM-CSF.

6. Композиция по любому из пп.1-5, где указанное антитело или его функциональный фрагмент содержит в вариабельной области легкой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и содержит в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

7. Композиция по любому из пп.1-6, где антитело или его функциональный фрагмент содержит в вариабельной области легкой цепи аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 19, 54 и 55, и в вариабельной области тяжелой цепи аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 20-33, 52 и 53.

8. Композиция по любому из пп.1-7, где антитело или его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 34 и аминокислотную последователь

- 77 032829 ность тяжелой цепи SEQ ID NO: 35.

9. Композиция по любому из пп.1-8, которая стабильна в течение по меньшей мере 24 месяцев при примерно 2-8°С или по меньшей мере 28 суток при комнатной температуре.

10. Композиция по любому из пп.1-9, которая предназначена для внутривенного и/или подкожного введения.

11. Композиция по любому из пп.1-10 для применения в лечении воспалительных и аутоиммунных расстройств.

12. Композиция по п.11, где расстройства выбраны из аллергических, псориатических, артритических и астматических расстройств.

13. Набор для лечения воспалительных и аутоиммунных расстройств, содержащий композицию по любому из пп.1-12 и контейнер, подходящий для хранения композиции.