MX2010005291A

MX2010005291A - Anticuerpos monoclonales que se unen a hgm-csf y composiciones medicas que comprenden los mismos.

Info

Publication number: MX2010005291A
Application number: MX2010005291A
Authority: MX
Inventors: Kenzo Takada; Kantou Nakajima; Barbara Kistler; John Park
Original assignee: Evec Inc
Priority date: 2007-11-13
Filing date: 2008-11-12
Publication date: 2010-11-12
Also published as: ES2401536T3; PT2215119E; US20140205611A1; PE20091420A1; EP2535353A1; HRP20130204T1; RU2013141223A; US8679502B2; DK2215119T3; EP2215119A1; KR20100102108A; AU2008321429A1; NZ597023A; MA31899B1; TW201206955A; NZ586027A; TWI434854B; EP2215119B1; ZA201003467B; CA2705539A1

Abstract

Se describen aquí anticuerpos monoclonales anti-hGM-CSF y fragmentos de unión de antígeno de esos anticuerpos, con mejor capacidad neutralizante para la actividad de hGM-CSF. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden ese anticuerpo o fragmentos de unión de antígeno. La presente invención es útil para el tratamiento de varias enfermedades que están asociadas con la expresión aberrante de hGM-CSF.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES QUE SE UNEN A HGM-CSF Y COMPOSICIONES MÉDICAS QUE COMPRENDEN LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con anticuerpos monoclonales que se unen al factor de estimulación de Colonia de Macrófago Granulocito humano (también denominado como "hGM-CSF") y neutraliza la actividad hGM-CSF, composiciones que incluyen uno o más de tales anticuerpos monoclonalés y métodos en los cuales se utilizan tales anticuerpos monoclonales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El factor de estimulación de Colonia de Macrófago Granulocito (GM-CSF) se identifica como un factor humoral que promueve la proliferación de células progenitoras macrofagas de granulocito y de granulocito de médula ósea y promueve la formación de colonias de macrófagos y granulocito in vitro.

El GM-CSF se conoce ahora por ser un factor estimulante para un amplio rango de tipos de células. Este induce la diferenciación y proliferación de céllulas sanguíneas de linaje macrófago granulocito, aumenta las funciones de las células que presentan antígeno, mantiene las funciones de las mismas clases de las células epiteliales e induce las funciones de macrófagos alveolares (por ejemplo, mejora el catabolismos de tensoactivos, la función bactericida, y la expresión del receptor Fe). The Cytokine Handbook, 4th edition, Thomson, A. et al. (eds ), Academic Press, 2003.

El GM-CSF se conoce por originar varias enfermedades, que incluye 1) enfermedades alérgicas tales como el asma, atopia, y polinosis, 2) rechazo a injerto, y enfermedad injerto versus anfitrión (GVHD), y 3) enfermedades autoinmunes, tales como artritis reumatoide.

Por ejemplo, el GM-CSF humano (hGM-CSF) se sobre expresa en pulmones de sujetos alérgicos en las articulaciones de pacientes con artritis reumatoide; el mARN hGM-CSF se sobre expresa en la piel de sujetos alérgicos. También se ha informado que la sobrevivencia de monocitos, que son células que inducen la inflamación en dermatitis atópica, se mejora por la producción GM-CSF. Bratton, D. L. et al., Granulocyte macrophage colony-stimulating factor contributes to enhanced monocyte survival in chronic atopic dermatitis. J. Clin. Invest., 95: 21 1-218, 1995.

Adicionalmente, se ha mostrado que GM-CSF estimula la proliferación de células leucémicas. Por lo tanto, el GM-CSF se considera que es un factor que origina leucemia.

Sería útil tener métodos para tratar enfermedades de afecciones originadas por el GM-CSF humano. Un método de terapia para tales enfermedades de afecciones es unir el hGM-CSF e inhibir su actividad biológica. Esto se puede hacer, por ejemplo, al administrar anticuerpos monocionales anti-hGM-CSF que tiene alta afinidad neutralizante contra el hGM-CSF pero no induce reacción inmunológica.

Sin embargo, los anticuerpos que inhiben el hGM-CSF reportados hasta la fecha no tienen suficiente actividad neutralizante contra el hGM-CSF. Adicionalmente, parece muy poco probable que actualmente los anticuerpos monocionales anti-hGM-CSF disponibles inducirían una respuesta no deseada en los receptores. El anticuerpo policlonal y anticuerpo monoclonal se derivan generalmente de animales experimentales, tales como ratones, conejos y caprinos. Sin embargo, los anticuerpos obtenidos tienen una característica de secuencia de la clase de animal utilizado para su producción. Si ellos se administran a los humanos, el sistema inmune humano puede reconocer los anticuerpos como extraños, y luego, se puede originar una respuesta de anticuerpo anti-animal del humano (esto es, el anticuerpo produce su propio anticuerpo).

Adicionalmente, la administración a largo plazo es necesaria para el tratamiento de tales enfermedades y pueden surgir problemas como un resultadp, tal como problemas de seguridad que se pueden originar por cantidades pequeñas de impurezas en las medicinas administradas. Los anticuerpos con mayor actividad neutralizante que aquellos disponibles actualmente serian valiosos como terapéuticos desde el punto de vista de la afectividad, seguridad, y costos médicos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se basa por lo menos en parte en el desarrollo por los inventores de ciertos anticuerpos G -CSF anti-humanos monoclonales que se caracterizan por su extremadamente alta actividad de neutralización hacia hGM-CSF. De forma sorprendente, la actividad neutralizante de estos anticuerpos es mayor de la esperada con base en sus afinidades de unión para hGM-CSF. Dos de estos anticuerpos anti-hGM-CSF monoclonales se denominan aquí como EV1018 y EV1019.

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos anti-hGM-CSF y fragmentos de los mismos que unen a y neutralizan hGM-CSF.

En una modalidad, se proporciona un anticuerpo monoclonal anti-hGMCSF aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo reconoce ELYK (SEQ ID NO: 2) y TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) en hGM-CSF, la secuencia de aminoácido que es como se establece en la SEQ ID NO: 1 . En una modalidad, el anticuerpo comprende: (a) una cadena pesada que comprende una secuencia que contiene VH-CRD1 de consenso, una secuencia que contiene VH-CRD2 de consenso, y una secuencia que contiene VH-CRD3 de consenso, en donde: (i) la secuencia que contiene VH-CRD1 de consenso es FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), en donde X1 es Y o H, y X2 es G o A, (i¡) la secuencia que contiene VH-CRD2 de consenso es X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 315), en donde cada Xn independientemente es cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X3 es L o V, X4 es T o I, X5 es Y o W, X6 es R o K, X7 es F o Y, y X8 es R o K, y (iii) la secuencia que contiene VH-CRD3 de consenso es EXnXgGXToXnXnDXp (SEQ ID NO: 316), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X9 es M o V, y X10 es A o G; y (b) una cadena ligera que comprende una secuencia que contiene VL-CDR1 de consenso, una secuencia que contiene VL-CDR2 de consenso, y una secuencia que contiene VL-CDR3 de consenso, en donde: (i) la secuencia que contiene VL-CDR1 de consenso es XnGNXnXnNIGSXn AVG (SEQ ID NO: 317), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, y Xn es H o Y, (ii) la secuencia que contiene VL-CDR2 de consenso es GX12SPXi3SG (SEQ ID NO: 318), en donde X12 es R o K, y X13 es A o P, y (iii) la secuencia que contiene V|_-CDR3 de consenso es ST DSXi4LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), en donde XM es R o S. y X15 es V o L; y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo une específicamente hGM-CSF.

En una modalidad, el anticuerpo comprende: (a) una cadena pesada que comprende VH-CDR1 , VH-CDR2 y VH-CDR3, en donde: (i) VH-CDR1 tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de SYGMN (SEQ ID NO: 10) y SHAMH (SEQ ID NO: 333), (ii) V¡-¡-CDR2 tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) y VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ib NO: 334), y (iii) VH-CDR3 tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) y EVWGGTCDS (SEQ ID NO: 335); y (b) una cadena ligera que comprende VL-CDR1 , VL-CDR2 y VL-CDR3, en donde: (i) VL-CDR1 tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) y SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330), (ii) VL-CDR2 tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de GRSjPPS (SEQ ID NO: 8) y GKSPAS (SEQ ID NO: 331 ), y (iii) VL-CDR3 tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de STWDSSLSAW (SEQ ID NO: 9) y STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332), y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo une específicamente hGM-CSF.

Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito anteriormente une a GM-CSF humano con un KD de menos de 400 p , más preferiblemente con un KD de menos de 160 pM.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito aquí neutraliza la actividad de hGM-CSF, de tal manera que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene un valor IC50 de menos de 100 pM (por ejemplo, menos de 30 pM, menos de 20 pM) como se determina en un ensayo de proliferación TF-1 en ED80 como se describe aquí.

En cualquiera de las modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una cadena pesada que es gamma 1 (??), gamma 2 (?2), gamma 3 (y3) o gamma 4 (y4). Una cadena pesada se puede seleccionar de la SEQ ID NOs: 10-33, 38-80, y 160-183 y 222-245.

En cualquiera de las modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una cadena ligera que es una cadena ligera lambda. En algunas modalidades, la cadena ligera lambda puede contener una o ambas de las siguientes sustituciones de aminoácidos: R100G y A153G, como se referencia a través de la secuencia natural. En una modalidad una cadena ligera se puede seleccionar de la SEQ ID NOs: 34-37 y 202-221. La cadena ligera puede ser una cadena ligera lambda o una cadena ligera kapa. En algunas modalidades, la cadena pesada es gamma 1 (y1 ), gamma 2 (?2), gamma 3 (Y3) o gamma 4 (?4) y la cadena ligera es una cadena ligera lambda. En cualquiera de las modalidades, la cadena pesada pueden contener una o más sustituciones de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de: Q3E, T97A, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164A, y L165A, como se referencia a través de la secuencia natural. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que contiene una o más sustituciones de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de: Q3E, T97A, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L 164 A, y L 165 A, y una cadena ligera que contiene una o ambas de las siguientes sustituciones de aminoácidos: R100G y A153G.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe aquí puede incluir una VH-CDR1 que tiene una secuencia de aminoácido SYGMH (SEQ ID NO: 4) o SHA H (SEQ ID NO: 333). El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe aquí puede incluir una VH-CDR2 que tiene una secuencia de aminoácido LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) o VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334). El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe aquí puede incluir una VH-CDR3 que tiene una secuencia de aminoácido ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) o EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335). El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe aquí puede incluir un V|_- CDR1 que tiene una secuencia de aminoácido IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) o SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330). El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe aquí puede incluir una VL-CDR2 que tiene una secuencia de aminoácido GRSPPS (SEQ ID NO: 8) o GKSPAS (SEQ ID NO: 331 ). El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe aquí puede incluir una VL-CDR3 que tiene una secuencia de aminoácido STWDSSLSAW (SEQ ID NO: 9) o STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332).

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que une específicamente hGM-CSF comprende 6 CDR diferentes, las secuencias de los cuales se establecen como la SEQ ID NOs: 4-9.

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que une específicamente hGM-CSF comprende 6 CDR diferentes, las secuencias de los cuales se establecen como la SEQ ID NOs: 330-335.

En cualquiera de las modalidades proporcionadas aquí, el anticuerpo puede incluir una cadena pesada que es gamma 1 (??), gamma 2 (?2), gamma 3 (Y3) O gamma 4 (?4), y una cadena ligera que es kappa o lambda.

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito aquí puede comprender adicionalmente una secuencia de señal, tal como aquellas mostradas en la SEQ ID NOs: 324, 325 y 326.

Las modalidades representan al tipo natura secuencia natural así como también sus variantes se incluyen en !a invención. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una cadena pesada que es la SEQ ID NO: 10 o una variante de la misma seleccionada de la SEQ ID NOs: 1 1-33, 38-80, y también comprende una cadena ligera que es la SEQ ID NO: 34 o una variante de la misma seleccionada de la SEQ ID NOs: 35-37. En algunas modalidades, la cadena pesada es la SEQ ID NO: 160 o una variante de la misma seleccionada de la SEQ ID NOs: 161-245, y la cadena ligera es la SEQ ID NO: 202 o una variante de la misma seleccionada de la SEQ ID NOs: 203-221.

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada, en donde la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada es la SEQ ID NO: 152 o una variante de la misma seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 153-158 y 159, y una región variable de cadena ligera, en donjde la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera es la SEQ ID NO: 184 o una variante de la misma seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 185-200 y 201.

En una modalidad, la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada es SEQ ID NO: 152. En una modalidad, la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera es la SEQ ID NO: 184. En una modalidad, la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada es la SEQ ID NO: 152, y en donde la secuencia de aminoácido de la región i variable de cadena ligera es la SEQ ID NO: 184. En una modalidad, el anticuerpo pertenece a la clase (subclase) IgGi(A).

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada, en donde la secuencia de aminoácido de !a región variable de cadena pesada es la SEQ !D NO: 348 o una variante de la misma seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 349-362 y 363, y una región variable de cadena ligera, en donde la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera es la SEQ ID NO: 364 o SEQ ID NO: 365.

En una modalidad, la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada es la SEQ ID NO: 348. En una modalidad, la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera es la SEQ ID NO: 364. En una modalidad, la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera es la SEQ ID NO: 365. En una modalidad, el anticuerpo pertenece a la clase (subclase) IgGi(A).

En una modalidad el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno capaz de unir a hGM-CSF (hGM-CSF) y neutralizar la bioactividad de hGM-CSF como se describe aquí se caracteriza porque tiene una región de determinación de complementariedad (CDR) representada por una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de la ß?? ID NOs: 4 a 9 y SEQ ID NOs: 330 a 335. En algunas modalidades, uno o más aminoácidos se pueden sustituir, eliminar, insertar o agregar en la CDR. El anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno como se describe aquí se puede caracterizar porque el anticuerpo monoclonal anti-hGM- CSF o su porción de unión a antígeno inhibe la proliferación de células TF-1 por aproximadamente 50% en la concentración de aproximadamente 14 pM, cuando se inducen las células TF-1 para proliferar por hGM-CSF. En algunas modalidades, el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno inhibe la proliferación de células dendríticas de sangre periférica.

En una modalidad el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno como se describe aquí tiene una alta afinidad para hGM-CSF con Valor KD de 4x 0"10 M o menos.

En algunas modalidades, el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno descrito aquí pertenece a la clase (subclase) lgG1 (?). En algunas modalidades, el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humano.

La invención incluye adicional ácido nucleicos y vectores que comprenden los mismos. En una modalidad, la invención es un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito aquí. En una modalidad el ácido nucleico es ADN. En una modalidad la invención es un vector que comprende un ADN que codifica un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito aquí.

La invención proporciona adicionalmente una célula anfitriona que comprende un vector de expresión que comprende un ADN vector de la invención.

La invención también contempla un equipo que comprende: (a) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención; y (b) uno o más recipientes que contienen el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

La invención en una modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención, para uso en medicina.

La invención proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo anti-hG -CSF o fragmento de! mismo que une a y neutraliza. hGM-CSF. Tal una composición puede ser una composición farmacéutica (por ejemplo, un medicamento) que comprende un anticuerpo anti-hGM-CSF y/o fragmentos de los mismos (o combinación de los mismos) y un portador farmacéuticamente aceptable. Se incluye el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las modalidades.

En modalidades adicionales, una composición comprende más de una clase de anticuerpos anti- GM-CSF, fragmentos, o combinación de los mismos, cada uno como se proporciona aquí. Por ejemplo, la composición puede comprender adicionalmente un segundo anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que une hGM-CSF, de tal manera que la composición comprende uno más de una clase/tipo (pluralidad) de anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos o combinación de los mismos, cada uno de los cuales de une a GM-CSF. En algunas modalidades, por lo menos uno de la pluralidad de anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos o combinación de los mismos que une el hGM-CSF es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: SEQ ID NOs: 10-80, 152-245, 320-323, y 348-365.

La invención también se dirige a composición medicinal adecuada para uso en el tratamiento una enfermedad originada por hGM-CSF que comprende: el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o la porción de unión a antigeno de acuerdo con una cualquiera de las modalidades aquí, y un portador farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de la enfermedad originada por una producción excesiva de hGM-CSF incluyen: (a) enfermedades alérgicas tales como asma, atopia, y polinosis (rinitis alérgica; rinitis polínica); (b) rechazo de injerto, enfermedad del injerto contra el anfitrión (GVHD); y (c) enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide.

Tales composiciones o composición de fármaco veterinario puede comprender múltiples clases de los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF o sus porciones de unión a antígeno específicas para un mismo antígeno particular, y un portador farmacéuticamente aceptable.

En algunas modalidades, la composición medicinal o la composición de fármaco veterinario que se caracterizada porque las múltiples clases de los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF o sus porciones de unión a antígeno comprenden dos o más tipos de anticuerpos o sus porciones de unión a antígeno, se pueden seleccionar de lo siguiente (a) y (b): (a) un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antigeno que tiene un CDR representado por una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NOs: 4 a 9, SEQ ID NOs: 330 a 335, SEQ ID NOs: 336 a 341 , o SEQ ID NOs: 342 a 347, y que es específica para el hGM-CSF, (b) un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno de (a) que tiene una secuencia de aminoácido en la que uno o más aminoácidos se sustituyen, eliminan, insertan, o adjuntan, y que es específico para hGM-CSF.

Tal composición medicinal o la composición de fármaco veterinario puede inhibir la proliferación de células TF-1 por 80% o más a una concentración de aproximadamente 55 pM, cuando se inducen las células TF-1 para proliferar por hGM-CSF.

El aspecto de la invención también contempla un equipo que comprende una cualquiera de las composiciones como se abarca aquí, y uno o más recipientes. En algunas modalidades, el equipo comprende adicionalmente una instrucción, en algunas modalidades, e! equipo comprende adicionalmente una etiqueta, una instrucción, o una etiqueta y una instrucción.

También se proporciona el uso del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito aquí, o la composición que comprende tal un anticuerpo o fragmento. Cualquier anticuerpo anti- hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo o composición como se describe aquí se puede utilizar para la fabricación o preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con la sobreexpresión de hGM-CSF en un sujeto, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo une el hGM-CSF y es capaz de neutralizar la actividad de hGM-CSF. En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste de: enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), asma, fibrosis quística, enfermedad del pulmón intersticial, rinitis, artritis y artropatías relacionadas, soriasis, leucemia mieloíde, esclerosis múltiple.

Para el uso como se describe, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se administra al sujeto en una dosis que no excede una dosis máxima tolerada, en donde la dosis máxima tolerada es aproximadamente 500 mg por dosis.

Un aspecto de la invención incluye el uso del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o la composición como se describe en cualquiera de las modalidades anteriores, para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con la sobreexpresión de hGM-CSF en un sujeto, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo une el hGM-CSF y es capaz de neutralizar la actividad de hGM-CSF. Por ejemplo, la enfermedad o trastorno puede ser enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), asma, fibrosis quística, enfermedad del pulmón intersticial, rinitis, artritis y artropatías relacionadas, soriasis, leucemia mieloide o esclerosis múltiple. Tal use incluye administrar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o la composición que comprende el mismo como se describe en la invención al sujeto en una dosis que no excede una dosis máxima tolerada, en donde la dosis máxima tolerada es aproximadamente 500 mg por dosis.

La invención también proporciona métodos para tratar un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno que se asocia con expresión aberrante de hGM-CSF utilizando un anticuerpo anti-hGM-CSF o fragmento del mismo. El método comprende administrar a un sujeto diagnosticado con o en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con expresión aberrante (por ejemplo, sobreexpresión) de hGM-CSF, una composición que comprende un anticuerpo anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo que neutraliza la actividad de hGM-CSF in vivo en una cantidad efectiva para obtener por lo menos un efecto terapéutico en el sujeto.

La invención también incluye un método para mejorar actividad neutralizante hGM-CSf mediada por anticuerpo anti-hGM-CSF, caracterizado porque las múltiples clases de los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF o sus porciones de unión a antígeno específicas para un mismo antígeno particular se administran simultáneamente. En algunas modalidades, dos o más tipos de anticuerpos o sus porciones de unión a antígeno se seleccionan de lo siguiente (a) y (b): (a) un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno que tiene un CDR representado por una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NOs: 4 a 9, SEQ ID NOs: 330 a 335, SEQ ID NOs: 336 a 341 , o SEQ ID NOs! 342 a 347, y que es específica para e! hGM-CSF; y (b) un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno de (a) que tiene una secuencia de aminoácido en la que uno o más aminoácidos se sustituyen, eliminan, insertan, o adjuntan, y que es específica para hGM-CSF.

El aspecto abarca métodos para mejorar la actividad caracterizado porque los dos o más tipos de anticuerpos o sus porciones de unión a antígeno inhiben la proliferación de células TF-1 por 80% o más a una concentración de aproximadamente 55 pM cada una, cuando se inducen las células TF-1 para proliferar por hGM-CSF.

La invención también proporciona un epítopo de hGM-CSF que se reconoce por los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos aquí. El epítopo de hGM- CSF en los polipéptidos se establece en la SEQ ID NOs: 2 y 3, en donde el epítopo se reconoce por el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente descripción, y en donde las secuencias de polipéptido representan un segménto discontinuo de hGM-CSF (con base en SEQ ID NO: 1). El epítopo es un segmento discontinuo de GM-CSF humano, en donde el epítopo comprende todo o una porción de residuos de aminoácido 77-80 del GM-CSF humano (SEQ ID NO: 1 ) y residuos de aminoácido 95-104 del GM-CSF humano (SEQ ID NO: 1), y se reconoce por un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende 6 CDR diferentes como se establece en la SEQ ID NOs: 4-9 o SEQ ID NOs: 330-335.

La invención también se proporciona para el uso de un epítopo de la invención. La invención también incluye métodos para explorar y/o identificar una molécula que une específicamente e! epítopo descrito aquí reconocido por los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados aquí. Algunas modalidades se relacionan con métodos para identificar una molécula que une el epítopo como se describe aquí, que comprendsen: (i) explorar una muestra biológica o una colección de péptido utilizando una sonda que comprende el epítopo; (ii) aislar una molécula que une específicamente la sonda; y (iii) identificar la molécula. La molécula que une el epítopo puede, por ejemplo, ser un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo. Algunas modalidades contemplan la sonda que comprende adicionalmente un marcador detectable. En algunas modalidades, el método incorpora la sonda que se inmoviliza.

También se proporcionan métodos o procesos para producir anticuerpos anti-hGM-CSF y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. La invención incluye métodos para producir un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo que une hGM-CSF, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende por lo menos una secuencia que contiene VH-CRD1 de consenso, una secuencia que contiene VH-CRD2 de consenso, una secuencia que contiene VH-CRD3 de consenso, una secuencia que contiene VL-CDR1 de consenso, una secuencia que contiene VL-CDR2 de consenso, y una secuencia que contiene VL-CDR3 consenso, en una célula anfitriona. El método incluye las etapas de: (i) obtener la célula anfitriona que comprende por lo menos una secuencia de ADN que codifica por lo menos la secuencia que contiene VH-CRD1 de consenso, la secuencia que contiene VH-CRD2 de consenso, la secuencia que contiene VH-CRD3 de consenso, la secuencia que contiene VL-CDR1 de consenso, !a secuencia que contiene VL-CDR2 de consenso, y la secuencia q e contiene VL-CDR3 de consenso, en donde: (a) la secuencia que contiene VH-CRD1 de consenso es FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), en donde ?? es Y o H, y X2 es G o A, (b) la secuencia que contiene VH-CRD2 de consenso es X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 31 5), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X3 es L o V, X4 es T o I, X5 es Y o W, X6 es R o K, X7 es F o Y, y X8 es R o K, (c) la secuencia que contiene VH-CRD3 de consenso es EXnX9GXioXnXnDXn (SEQ ID NO: 316), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X9 es M o V, y X10 es A o G, (d) la secuencia que contiene VL-CDR1 de consenso es XnGNXnXnNIGSX AVG (SEQ ID NO: 317), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, y Xn es H o Y, (e) la secuencia que contiene VL-CDR2 de consenso es GXi2SPXi3SG (SEQ ID NO: 31 8), en donde X12 es R o K, y X13 es A o P, y (f) la secuencia que contiene VL-CDR3 de consenso es STWDSX14LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), en donde X es R o S, y Xi5 es V o L; (ii) expresar el ADN en la célula anfitriona; y (iii) cultivar la célula anfitriona bajo condiciones adecuadas para expresión de ADN y producción del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

En algunas modalidades, por lo menos un ADN codifica una cadena pesada o una porción de la misma y una cadena ligera o una porción de la misma, en donde la cadena pesada o porción de la misma se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NOs: 10-33, 38-80, 152-183, 222-245, 348-362, y 363, y en donde !a cadena ligera o porción de !a misma tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 34-37, 184-221 , 364, y 365.

El proceso anterior puede comprender adicionalmente aislar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

El proceso anterior puede comprender adicionalmente preparar una composición que comprende dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y un portador farmacéuticamente aceptable.

También se proporcionan vectores que comprenden ADN que codifica por lo menos una porción de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos aquí. También se incluyen las células anfitrionas que expresan tal un vector. En algunas modalidades, un vector comprende ADN que codifica una VH-CDR1 , una VH-CDR2, y una VH-CDR3, en donde: VH-CDR1 es SYGMH (SEQ ID NO: 4) o SHAMH (SEQ ID NO: 333), VH-CDR2 es LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) o VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334), y VH-CDR3 es ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) o EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335).

En algunas modalidades, un vector comprende ADN que codifica una VL-CDR1 , a VL- CDR2, y una VL-CDR3, en donde VL-CDR1 es IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) o SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330), VL-CDR2 es GRSPPSG (SEQ ID NO: 8) o GKSPASG (SEQ ID NO: 331 ), y VL-CDR3 es STWDSSLSAW (SEQ ID NO: 9) o STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332).

En algunas modalidades de la invención, e! ADN aislado codifica un anticuerpo monoclonal anti-hGM- CSF o su porción de unión a antígeno capaz de unir un hGM-CSF y neutralizar la bioactividad de hGM-CSF, caracterizado porque el ADN aislado codifica una secuencia de aminoácido que comprende por lo menos una seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 4 a 9. En algunas modalidades, el ADN aislado codifica un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno capaz de unir un hGM-CSF y neutralizar la bioactividad de hGM-CSF, caracterizado porque el ADN aislado codifica una secuencia de aminoácido que comprende por lo menos una seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 330 a 335. El ADN aislado puede ser capaz de hibridar bajo condiciones rigurosas con el ADN descrito anteriormente. Los vectores que incorporan cualquier tal ADN, así como también células anfitrionas que expresan los vectores de expresión recombinante se incluyen en el aspecto de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra un diagrama de flujo de aislamiento de clones celulares que producen anticuerpo.

La figura 2 muestra un esquema de análisis de afinidad de anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF.

La figura 3 muestra evaluación del efecto inhibidor de anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF sobre la proliferación de células dendríticas d^ sangre periférica en la presencia de GM- CSF.

La figura 4 muestra evaluación del efecto inhibidor de anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF en la proliferación de células TF-1 en la presencia dé levadura hGM-CSF (Leukine).

La figura 5 muestra evaluación del efecto inhibidor de anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF en la proliferación de células TF-1 en la presenció de £. coli hGM-CSF (Peprotech).

La figura 6 muestra evaluación del efecto inhibidor del uso combinado de dos anticuerpos monoclonales anti-GM- CSF en la proliferación de células TF-1 en la presencia de levadura hGM-CSF (Leukine).

La figura 7 muestra evaluación del efecto inhibidor de uso combinado de dos anticuerpos monoclonales anti-GM- CSF en la proliferación de células TF-1 en la presencia de E. coli hGM-CSF (Peprotech).

Las figuras 8A y 8B son dos gráficas que representan inhibición dependiente de dosis de: GM-CSF humano (Fig. 8A) y de macaco GM-CSF (Fig. 8B).

La figura 9A es una gráfica en barras que representa actividad de mieloperoxidasa (MPO) medida en glóbulos de fluido bronco-alveolar (BALF) de ratones expuestos a humo de cigarrillo. -CS: Ratones tratados con vehículo (300 µ? de vehículo i.p. en el día 1 y 3, sin exposición al humo de cigarrillo. +CS, isotipo AB: Ratones tratados con 300 µ? de anticuerpo de isotipo i.p. en el día 1 y 3, expuestos al humo de cigarrillo. +CS, anti-GM-CSF AB: Ratones tratados con 300 µ? de anticuerpo anti- GM-CSF i.p. en el día 1 y 3, expuestos a humo de cigarrillo, n = 10 por grupo, media ± EEM, *p<0.05, ***p<0.001.

La figura 9B es un par de gráficos de barra que representa la determinación de citocina en sobrenadantes de BALF. Lado izquierdo: Determinación de niveles MCP-1. Lado derecho: Determinación de niveles MIP-1 a. -CS: Ratones tratados con vehículo (300 µ? vehículo i.p. en el día 1 y 3), sin exposición a! humo de cigarrillo. +CS, isotipo AB: Ratones tratados con 300 µ! de anticuerpo de isotipo i.p. en el día 1 y 3, expuestos al humo de cigarrillo. +CS, anti-GM-CSF AB: Ratones tratados con 300 µ? de anticuerpo anti-GM-CSF i.p. en el día 1 y 3, expuestos a humo de cigarrillo, n = 10 por grupo, media ± EEM, *p<0.05, *"p<0.001.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se describe aquí, se obtiene el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF a partir de una célula que produce anticuerpo derivada de la sangre de un paciente con proteinosis alveolar idiopática. En una modalidad el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno en la presente invención se obtienen a partir de una célula que produce anticuerpo derivada de la sangre del paciente con proteinosis alveolar idiopática. De acuerdo con lo anterior, el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo en una modalidad de la presente invención es un anticuerpo monoclonal completamente humano. Por lo tanto, se minimiza el riesgo de activar la inmunogenicidad, cuando la preparación de anticuerpo se administra a un cuerpo humano.

El problema de esta invención que resuelve lo anterior es como sigue: Esta invención se enfoca en proporcionar los anticuerpos monoclonales que unen GM-CSF y fragmentos de unión GM-CSF de los mismos que exhiben capacidad de neutralización mejorada o actividad contra hGM- CSF y composiciones que incluyen por lo menos una clase o tipo de tales anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos, así como también métodos para tratar condiciones o enfermedades asociadas con la sobreexpresión de hGM-CSF (niveles GM-CSF más altos en un individuo que sufre de una afección, enfermedad o trastorno que en un individuo que no sufre de la afección, enfermedad o trastorno).

El anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la presente descripción une específicamente a hGM-CSF, expresión aberrante de la que se puede originar varias enfermedades, y reduce o elimina (neutraliza) su bioactividad. Los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF exhiben actividad neutralizante (a hGM-CSF) que es mayor que aquel de los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF existentes anteriormente. En particular, los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF de la presente invención que son anticuerpos monoclonales humanos no tienen inmunogenicidad y no inducen inmunoreacción.

"Une específicamente" significa alta avidez y/o alta afinidad de unión de un anticuerpo a un polipéptido específico por ejemplo, epitopo de una proteína tal como una proteína GM-CSF humana. El anticuerpo que une al epitopo en este polipéptido específico es preferiblemente más fuerte que la unión de mismo anticuerpo a cualquier otro epitopo, particularmente aquellos que pueden estar presente en moléculas en asociación con, o en la misma muestra, como el polipéptido específico de interés por ejemplo, se une más fuertemente a fragmentos de epítopo de una proteína tal como GM-CSF de tal manera que al ajusfar las condiciones de unión el anticuerpo se une casi exclusivamente a un sitio de epítopo o fragmentos de una proteína deseada tal como un fragmento de epítopo expuesto por tratamiento de GM-CSF y no expuesto e factores relacionados de la misma subfamilia. Un anticuerpo aislado de la invención és preferiblemente inmunoreactivo con e inmunospecífico para especies específicas. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención que reconocen GM-CSF humano, pueden reconocer macaco GM-CSF y/o tití GM-CSF, pero generalmente no aquellos de una contraparte de murino. Se debe apreciar que los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se describe en este aspecto de la invención reconocen el epítopo del antígeno en una conformación natural, o sustancialmente cerca de su conformación natural de tal manera que el segmento discontinuo del antígeno que se pone cercanamente juntos dentro del contexto del antígeno completo (por ejemplo, hGM-CSF) como se observa en los estudios estructurales, formando cooperativamente por lo tanto un epítopo (por ejemplo, "bolsillos" en la superficie del antígeno) que se reconoce por los anticuerpos de la invención. Como tal, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se describe en este aspecto de la invención no tienen reactividad cruzada con la proteína que no es GM-CSF que contiene ambas secuencias de polipéptido que forman un epítopo como se describió anteriormente. Se debe apreciar que en el contexto de unión de antígeno-anticuerpo, la unión se considera "específica" en virtud de la naturaleza de la interacción. Como tal, "un anticuerpo que une GM-CSF" será construido para unir al antígeno (es decir, GM- CSF) con especificidad.

Como se utiliza aquí, un término "anticuerpo" indica una molécula de inmunoglobulina en la que 4 cadenas de polipéptido, 2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras se conectan interactivamente por un enlace disulfuro. Los anticuerpos monoclonales se pueden generar por tecnología monoclonal o recombinante. El arte se familiariza con la tecnología. Los términos "porción de unión a antígeno" y "fragmento de unión a antígeno" se utilizan intercambiablemente aquí y describen cualquier variante acortada del anticuerpo que preferiblemente exhibe la actividad de unión a antígeno específica a un antígeno (por ejemplo, hGM-CSF). En particular, un fragmento de la invención es un fragmento que une el hGM-CSF en el mismo epítopo como el anticuerpo monoclonal respectivo. Un fragmento puede ser, por ejemplo, un fragmento Fab o cualquier otro fragmento que exhibe las características descritas anteriormente. Adicionalmente, los fragmentos de anticuerpo incluyen adicionalmente anticuerpo monocatenario (scFV) en los cuales se incorporan región variable de anticuerpo y región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpo biespecífico, y anticuerpo multi-específico.

Como se utiliza aquí "bioactividad" es sinónimo de actividad biológica. Así, la "bioactividad de hGM-CSF" es la función biológica de hGM-CSF como se determina o se mide in vivo o en un ensayo basado célula, tal como aquellos descritos aquí. Más específicamente, la bioactividad de hGM-CSF se puede medir en un ensayo de proliferación celular. Se emplean las estirpes celulares apropiadas que se conocen responden a GM-CSF. Típicamente, para un sistema celular humano, la estirpe celular de eritroleucemia humana, TF-1 , se utiliza para llevar a cabo un ensayo de proliferación. La TF-1 es una estirpe celular establecida de un paciente con eritroleucemia. El ensayo es con base en la inhibición de proliferación celular estimulada GM-CSF de células TF-1 y se establece bien en la técnica. También pueden ser adecuadas otras estirpes celulares. Una persona medianamente experta en la técnica será capaz de adaptar sistemas o condiciones de ensayo apropiadas.

Los ensayos de proliferación TF-1 se llevan a cabo en la presencia de concentraciones variadas de GM-CSF humano recombinante natural (denominado como rhGM-CSF). Con base en estos datos, se pueden obtener curvas de dependencia de dosis. La concentración del GM-CSF que requiere eücitar 80% de !a respuesta máxima biológica para la proliferación en células TF-1 se define aquí como ED8o o ED80. Así, el ED80 representa "Dosis Efectiva a 80%" de la respuesta máxima. En forma similar, la concentración del GM-CSF requerido para dar una respuesta media máxima en un ensayo biológico se expresa como ED5o o ED50. Típicamente, el valor ED50 de GM-CSF se dice que es 0.02 - 1 ng/ml cuando se mide en un ensayo de proliferación celular utilizando la estirpe celular TF-1 dependiente de GM-CSF humano. Este o cualquier otros sistemas de ensayo similares se pueden utilizar para identificar o determinar la actividad de un inhibidor o antagonista para hGM-CSF. Por ejemplo, el sistema de ensayo de proliferación se puede utilizar para medir la capacidad de neutralización de un anticuerpo contra el hGM- CSF. Otros ejemplos de ensayos para medir un función GM-CSF biológica incluyen el ensayo de secreción IL-8 y la inducción de ensayo CD1 1 b/Mac1 de superficie.

Los términos "neutralización," "neutraliza," "neutralizar," y similares se refieren a la inhibición de una actividad biológica de un factor bioactivo, tal como hGM-CSF. Así, un anticuerpo contra hGM-CSF con capacidad neutralizante o actividad neutralizante significa que el anticuerpo es capaz de unir a y antagonizar o contrarrestar una actividad biológica del hGM-CSF en un sistema biológico, por ejemplo el efecto proliferativo de hGM-CSF en un sistema biológico, tal como en células TF-1 , sustancialmente inhibiendo por lo tanto o eliminado una actividad biológica de hGM-CSF.

Los términos tales como "efecto inhibidor," "inhibición," "capaz de inhibir," y "inhibición" significa supresión de 5 a 100% de la bioactividad o bioactividadés originadas por un antígeno objetivo, no limitadas por su origen. Para propósitos terapéuticos, idealmente, la inhibición de la bioactividad hGM-CSF debe estár entre 50% y 00%.

En general, el IC50 es una medida de la efectividad de un compuesto en la función biológica o bioquímica de inhibición. Esta medida cuantitativa indica cuánto fármaco particular u otro agente (inhibidor) se necesita para inhibir un proceso biológico dado (o componente de un proceso, es decir una enzima, célula, receptor de célula o microorganismo) por mitad. En otras palabras, es la concentración inhibidora (50%) máxima media (IC) de una sustancia (50% IC, o IC50). Se utiliza comúnmente como una medida de la potencia de fármaco antagonista en la investigación farmacológica. De acuerdo con las directrices adoptadas por la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos, el IC50 representa la concentración de un fármaco que se requiere durante 50% de inhibición in vitro.

De acuerdo con lo anterior, el IC50 de un anticuerpo neutralizante contra hGM-CSF se puede determinar al construir una curva de respuesta de dosis y examinar el efecto de concentraciones deferentes del anticuerpo neutralizante en invertir la actividad proliferativa de hGM-CSF. Los valores IC5o se pueden calcular paras un antagonista dado al determinar la concentración necesaria para inhibir la mitad de la respuesta biológica máxima del agonista.

De acuerdo con varias modalidades, el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene un valor IC50 de menos de 20 pM, menos de 25 pM, menos de 30 pM, menos de 40 pM, menos de 50 pM, menos de 60 pM, menos de 70 pM, menos de 80 pM, menos de 90 pM o menos de 00 pM, en cada caso como se determina en un ensayo de proliferación TF-1 en ED80. En modalidades específicas, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene un valor IC50 de menos de 20 pM, menos de 25 pM, menos de 30 pM o menos de 40 pM, como se determina en un ensayo de proliferación TF-1 en ED80.

Los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF en la presente descripción incluyen moléculas de inmunoglobulina que comprenden 2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras. Cada una de las cadenas pesadas incluyen una región variable de cadena pesada (abreviada adecuadamente a "HCVR" o "VH") y una región constante de cadena pesada (la región constante de cadena pesada tiene 3 dominios, que se abrevian a "CHL" "CH2," y "CH3"). Cada una de las cadenas ligeras incluyen una región variable de cadena ligera (abreviada adecuadamente a "LCVR" o "VL") y una región constante de cadena ligera (la región constante de cadena ligera tiene un dominio abreviado a "CL"). La HCVR y LCVR son particularmente importantes para la especificidad de unión del anticuerpo.

La secuencia de aminoácido de la región variable es la responsable de la mayoría de las interacciones entre el anticuerpo y antígeno. Por lo tanto, cuando un vector de expresión se construye que contiene una secuencia de región variable de un anticuerpo natural en una secuencia de estructura derivada de un anticuerpo diferente con una propiedad diferente, el vector resultante puede expresar el anticuerpo recombinante que imita una propiedad del anticuerpo natural. Por lo tanto, no es necesario para obtener una secuencia completa de un anticuerpo particular cuando la generación de un anticuerpo recombinante intacto tiene una propiedad de unión similar como el anticuerpo original. Una secuencia parcial de una cadena pesada y una cadena ligera que cubre la región variable puede algunas veces ser suficiente para alcanzar tal propósito.

El anticuerpo interactúa con el antígeno objetivo principalmente a través de los residuos de aminoácido de la LCVR y HCVR. Por lo tanto, las secuencias de aminoácido en las regiones variables son más diversas entre ¡os anticuerpos que aquellas externas a la región variable. La HCVR y LCVR se subdividen adicionalmente en la "región de estructura (FR)" relativamente estable y la "región determinante de complementariedad (CDR)" hipervariable. La HCVR y LCVR cada una consiste de 3 CDR y 4 FR, respectivamente. Su orden es FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, y FR4, del terminal amino al terminal carboxi.

La técnica es familiar con los métodos para determinar o predecir los residuos de aminoácido que correspondes a cada uno de los dominios estructurales e anticuerpo, que incluyen las regiones hipervariables, por ejemplo, CDR. Algunos de los métodos comúnmente utilizados incluyen Chotia, AbM y Kabat.

Generalmente, el anticuerpo se une a antígeno con una afinidad de por lo menos aproximadamente 1x10"7 M, y une a un cierto antígeno con alta afinidad por lo menos dos veces en comparación con antígenos no específicos (por ejemplo, BSA, caseína).

Un término "alta afinidad" a un cierto anticuerpo IgG significa que un anticuerpo tiene una afinidad de unión por lo menos aproximadamente 1x10'7 M, preferiblemente por lo menos aproximadamente 1 x 0"8 M, más preferiblemente por lo menos 1x10"9 M, y mucho más preferiblemente por lo menos 1x10"10 M.

La definición de "alta afinidad" es diferente entre diferentes isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, el isotipo IgM se define por tener una #alta afinidad," cuando tiene una afinidad de unión de por lo menos 1 x10"7 M.

Anticuerpos de la invención Como se describe aquí, la invención se relaciona con anticuerpos monoclona!es GM-CSF anti-humanos (anti-hGM- CSF) y fragmentos de los mismos con mayor capacidad neutralizante para hGM-CSF que para los anticuerpos monoclonales existentes (anticuerpos monoclonales disponibles actualmente) contra hGM-CSF. Un tipo o clase de los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF o fragmentos de los mismos descritos aquí se pueden utilizar o administrar.

Alternativamente, más de un tipo o clase de los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF se puede utilizar o administrar juntas. Los inventores encontraron que cuando más de una clase o tipo de los anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF se utilizan juntos, ellos proporcionan mayor actividad neutralizante (por ejemplo, actividad de inhibición de crecimiento celular más grande). Adicionalmente, uno o más tipos o clases de los anticuerpos monoclonales anti-hGM-CSF o fragmentos de los mismos se pueden utilizar o administrar en combinación con uno o más agentes de otros agentes terapéuticos que no es un anticuerpo, tal como una molécula pequeña, ARNi o péptido.

En un aspecto, se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen y se unen específicamente a hGM-CSF. De describen aquí anticuerpos monoclonales aislados anti- hGM-CSF y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que une a hGM-CSF (anticuerpos monoclonales anti-hGM-CSF que unen a hGM-CSF y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se une a hGM-CSF) y exhiben capacidad neutralizante o actividad neutralizante contra la bioactividad de hGM-CSF. En una modalidad anticuerpos monoclonales aislados anti- hGM-CSF y fragmentos de unión a antígeno de los mimos que une a hGM-CSF y exhiben capacidad neutralizante o actividad contra hGM-CSF, en donde el anticuerpo monoc!ona! y de unión a antígeno del mismo reconoce lo siguiente: ELYK (SEQ ID NO: 2) y TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) en hGM-CSF (SEQ ID NO: 1 ). Los anticuerpos monoclonales aislados anti- hGM-CSF y fragmentos de unión a antígeno del mismo que se unen a hGM-CSF, en donde el anticuerpo monoclonal y el fragmento de unión a antígeno del mismo reconoce lo siguiente: ELYK (SEQ ID NO: 2) y TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) en el hGM-CSF, exhiben capacidad neutralizante o actividad contra actividad de hGM-CSF y son útiles para tratar y prevenir enfermedades, afecciones y trastornos asociados con la sobreexpresión de hGM-CSF. Una modalidad específica es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que une a hGM-CSF, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno reconoce el siguiente epítopo discontinuo de hGM-CSF, como se define (SEQ ID NO: 1 ), correspondiente a aminoácidos: el ELYK (SEQ ID NO: 2) en la posición 77-80 en hGM-CSF y TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) en la posición 95-104 en hGM-CSF. Los anticuerpos monoclonales aislados anti- hGM-CSF y fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos aquí se unen específicamente a hGM-CSF. Ellos no tienen reactividad cruzada con una proteína que es una proteína diferente de GM-CSF.

Más específicamente, se describen aquí anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a hGM-CSF y tienen la capacidad de neutralizar la actividad biológica del hGM-CSF. Cuatro de tales anticuerpos descritos aquí se designan como EV 1018, EV1019, EV 1003 y EV 1007, como se resume en las Tablas 1 y 2 en los ejemplos. Así, el EV10188, EV1019, EV1003 y EV1007 unan a hGM-CSF y son capaces de neutralizar los efectos que promueven el crecimiento de hGM-CSF. Como se muestra en más detalle, los anticuerpos EV1018 y EV10 9 reconocen e! mismo o sustancialmente sobreponen el epítopo en la proteína hGM-CSF.

Más aceptada por la invención está un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno tiene una secuencia de aminoácido en la que uno o más aminoácidos se sustituye, elimina, inserta, o agrega en una región de determinación de complementariedad (CDR).

En un aspecto adicional, se proporciona un ácido desoxirribonuCleico aislado (ADN) que codifica un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno capaz de unir a hGM-CSF y neutralizar la bioactividad de hGM-CSF, caracterizado porque el ADN aislado codifica una secuencia de aminoácido que comprende por lo menos una seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 4-9.

Una modalidad de la presente invención se relaciona con un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o una porción de unión a antígeno capaz de unir a hGM-CSF (hGM-CSF) y neutralizar la bioactividad del hGM-CSF (hGM-CSF), caracterizado porque el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o la porción de unión a antígeno tiene una región de determinación de complementariedad (CDR) representada por, por lo menos una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 4 a 9.

Otra modalidad de la presente invención se relaciona con un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o una porción de unión a antígeno capaz de unir a hGM-CSF y neutralizar la bioactividad del hGM-CSF, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o la porción de unión a antígeno tiene una región de determinación de complementariedad (CDR) representada por, por lo menos una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 330-335.

En la presente invención, un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF que tiene una región de determinación de complementariedad (CDR) representada por una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 4 a 9, y, un anticuerpo monoclonal anti-hGM- CSF que tiene una región de determinación de complementariedad (CDR) representada por una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 330-335, se consideran como clases diferentes de anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF.

Un anticuerpo monoclonal o su porción de unión a antígeno en la que uno o más aminoácidos se eliminan, reemplazan, insertan o agregan en las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) se incluirán en la presente invención mientras que este se une específicamente a hGM-CSF y neutraliza su bioactividad.

La presente invención incluye el anticuerpo monoclonal o su porción de unión a antígeno capaz de unir a hGM-CSF y neutralizar la bioactividad del HGM-CSF, en donde el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión! a antígeno tiene un CDR seleccionado del grupo que consiste de: (a) una cadena ligera (cadena L) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 7, (b) una cadena ligera (cadena L) CDR2 que tiene una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 8, y (c) una cadena ligera (cadena L) CDR3 que tiene una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 9.

En la misma forma, !a presente invención incluye el anticuerpo monoclonal o su porción de unión a antígeno capaz de unir a hGM-CSF y neutralizar la bioactividad del hGM-CSF, en donde el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno tiene un CDR seleccionado del grupo que consiste de: (d) una cadena ligera (cadena L) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 330, (e) una cadena ligera (cadena L) CDR2 que tiene una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 331 , y (f) una cadena ligera (cadena L) CDR3 que tiene una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 332.

El siguiente anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno, cuando une específicamente al hGM-CSF y neutraliza su bioactividad, también se incorpora en la presente invención: el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno, en donde, la regióni de determinación de complementariedad de cadena ligera (CDR) descrita anteriormente se modifica por eliminación, remplazo, inserción o adición de uno o más aminoácidos.

La presente invención incluye un anticuerpo monoclonal anti- hGM-CSF o su porción de unión a antígeno capaz de unir a hGM-CSF y neutralizar la bioactividad del hGM-CSF, en donde el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno tiene un CDR seleccionado del grupo que consiste de: (a) una cadena pesada (cadena H) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4, (b) una cadena pesada (cadena H) CDR2 que tiene una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 5, y (c) una cadena pesada (cadena H) CDR3 que tiene una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 6.

En la misma forma, la presente invención incluye el anticuerpo monoclonal o su porción de unión a antígeno capaz de unir a hGM-CSF y neutralizar la bioactividad del hGM-CSF, en donde el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno tiene un CDR seleccionado del grupo que consiste de: (a) una cadena pesada (cadena H) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 333, (b) una cadena pesada (cadena H) CDR2 que tiene una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 334, y (c) una cadena pesada (cadena H) CDR3 que tiene una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 335.

El siguiente anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno, cuando une específicamente al hGM-CSF y neutraliza su bioactividad, también se incorpora en la presente invención: El anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno, en donde la cadena pesada región de determinación de complementariédad (CDR) descrita anteriormente se modifica por eliminación, reemplazo, inserción o adición de uno o más aminoácidos.

El epítopo GM-CSF También el sujeto aquí es un epítopo de hGM-CSF, que es un segmento discontinuo de GM-CSF humano, en donde el epítopo comprende los residuos de aminoácido 77-80 del GM-CSF humano (SEQ ID NO: 1 ) y residuos de aminoácido 95-104 del GM-CSF humano (SEQ ID NO: 1 ), y se define por las secuencias de polipéptido como se establece en la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, y se reconoce por un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende 6 CDR diferentes como se establece en la SEQ ID NOs: 4-9 o SEQ ID NOs: 330-335.

Como se describe en más detalle en los ejemplos, el epítopo de hGM-CSF reconocido por los anticuerpos monoclonales EV1018 y EV1019 se identifica por un estudio de mapeo de epítopo. Se encuentra que el EV 1018 y EV 1019 reconocen el mismo sitio (o sobreponen sustancialmente) del antígeno hGM-CSF, correspondiente a los residuos de aminoácido 77-80 y 95-104, como se determina de acuerdo con el No. de Acceso GenBank: NP 000749. Los estudios estructurales han indicado que mientras los dos segmentos son discontinuos en la secuencia primaria, los dos segmentos del polipéptido se ponen juntos cuando se plegan, formando cooperativamente un epítopo conformacional. Consistente con la observación de que ambos EV1018 y EV1019 reconocen el mismo o sustancialmente sobreponen el epítopo, los análisis de las secuencias CDR de EV1018 y EV1019 muestran similitudes sustanciales. En comparación con las secuencias de péptido de los CDR de estos dos anticuerpos, se obtienen las siguientes secuencias de consenso (por ejemplo, fórmulas), que representan los residuos sobrepuestos (por ejemplo, común) que comprenden cada uno de los CDR: Para VH-CDR1 : FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), en donde Xi es Y o H, y X2 es G o A; Para VH-CDR2: (SEQ ID NO: 315), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X3 es L o V, X es T o I, X5 es Y o W, X6 es R o K, X7 es F o Y, y X8 es R o K; Para VH-CDR3: EXnX9GXioXnXnDXn (SEQ ID NO: 316), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X9 es M o V, y X 0 es A o G; Para VL-CDR1 : XnGNXnXnNIGSXnAVG (SEQ ID NO: 317), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, y Xn es H o Y; Para VL-CDR2: GX12SPXi3SG (SEQ ID NO: 318), en donde X12 es R o K, y Xn es A o P; y Para VL-CDR3: STWDSX14LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), en donde X14 es R En cada una de las fórmulas de consenso, los residuos de aminoácido que comprenden un CDR correspondiente se muestran en forma de letra sencilla convencional. Se muestran los residuos idénticos que se comparten por EV1018 y EV 1019. De acuerdo con lo anterior, otra modalidad aquí es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que une a hGM-CSF y exhibe capacidad neutralizante o actividad contra hGM-CSF, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende (a) una cadena pesada o, en el caso de un fragmento de anticuerpo, una parte de una cadena pesada, que comprende (i) una secuencia que contiene VH-CRD1 de consenso FTFSX^MH (SEQ ID NO: 314), en donde es Y o H, y X2 es G o A, (ii) una secuencia que contiene VH-CRD2 de consenso XsX^XsHXnGXnXGKXrYADSVXsG (SEQ ID NO: 315), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X3 es L o V, X4 es T o I, X5 es Y o W, X6 es R o K, X7 es F o Y, y X8 es R o K, y (¡ii) una secuencia que contiene VH-CRD3 de consenso EXnXgGXioXnXnDXn (SEQ ID NO: 316), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X9 es M o V, y X10 es A o G; y (b) una cadena ligera o, en el caso de un fragmento de anticuerpo, una cadena ligera o una parte de la misma. Que comprende (i) una secuencia que contiene VL-CDR1 de consenso XnGNXnXnNIGSXiiAVG (SEQ ID NO: 317), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, y Xn es H o Y, (ii) una secuencia que contiene VL-CDR2 de consenso GX12SPX13SG (SEQ ID NO: 318), en donde X12 es R o K, y X13 es A o P, y (iii) una secuencias de consenso que contiene VL-CDR3 STWDSXi4LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), en donde Xi es R o S, y X15 es V o L; y en donde el anticuerpo o fragmentp del mismo reconoce ELYK (SEQ ID NO: 2) y TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) en hGM-CSF. En una modalidad específica, el anticuerpo monoclonal anti-hGM!-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo une a un epítopo discontinuo en lo siguiente: ELYK (SEQ ID NO: 2) y TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) en hGM-CSF (SEQ I D NO: 1).

Otra modalidad descrita aquí es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF aislado que une a hGM-CSF o un fragmento de unión a antígeno del mismo que une a hGM-CSF, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende (a) una cadena pesada o, en el caso de un fragmento de anticuerpo, una parte de una cadena pesada, que comprende (i) una secuencia que contiene VH-CDR1 de consenso FTFSX^MH (SEQ I D NO: 314), en donde Xi es Y o H, y X2 es G o A, (ii) una secuencia que contiene Vn-CRD2 de consenso X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ I D NO: 315), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X3 es L o V, X4 es T o I , X5 es Y o W, X6 es R o K, X7 es F o Y, y X8 es R o K, y (iii) una secuencia que contiene VH-CRD3 de consenso EXnXgGX-ioXnXnDXn (SEQ I D NO: 316), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X9 es M o V, y X10 es A o G; y (b) una cadena ligera o, en el caso de un fragmento de anticuerpo, una cadena ligera o una parte de la misma, que comprende (i) a secuencia que contiene VL-CDR1 de consenso XnGNXnXnNIGSX AVG (SEQ I D NO: 317), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, y X es H o Y, (ii) una secuencia que contiene VL-CDR2 de consenso GX12SPX13SG (SEQ I D NO: 318), en donde X12 es R o K, y X13 es A o P, y (iii) una secuencia que contiene VL-CDR3 de consenso STWDSXi4LSAVXi5 (SEQ ID NO: 319), en donde XH es R o S, y X15 es V o L; y en donde el anticuerpo o fragmento del mismo une a hGM-CSF con un KD de no más de 400 pM, en otra realización de menos de 160 pM, en donde el KD se determina de acuerdo con las técnicas descritas en el Ejemplo 11.

En otra realización, el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo se caracteriza porque el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF de unión a antígeno o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la proliferación de células dendríticas de sangre periférica. De acuerdo con lo anterior, una modalidad adicional es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF aislado que une a hGM-CSF o un fragmento de unión a antígeno del mismo que une a hGM-CSF, el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de! mismo comprende una cadena pesada o porción de la misma y una cadena ligera o porción de la misma. Una cadena pesada o, en el caso de un fragmento de anticuerpo, una parte de una cadena pesada, puede comprender VH-CDR1 , VH-CDR2 y VH-CDR3. En algunas modalidades, una secuencia de consenso se representa por la fórmula FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), en donde X1 es Y o H, y X2 es G o A, que comprende VH-CDR1. En forma . similar, la fórmula XaX-iXsHXnGXnXeKXrYADSVXsG (SEQ ID NO: 315), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X3 es L o V, X4 es T o I, X5 es Y o W, X6 es R o K, X7 es F o Y, y X8 es R o K, representa una secuencia de consenso que comprende VH-CDR2; y la fórmula EXnX9GXioXnXnDXn (SEQ ID NO: 316), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X9 es M o V, y X10 es A o G, representa una secuencia de consenso que comprende VH-CDR3. Una cadena ligera o, en el caso de un fragmento de anticuerpo, una cadena ligera o unaq parte de la misma, puede comprender VL-CDR1 , VL-CDR2 y VL-CDR3. En tal una modalidad, la fórmula XnGNXnXnNIGSXi 1AVG (SEQ ID NO: 317), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, y Xn es H 0 Y, representa una secuencia de consenso que comprende VL-CDR1 ¡ la fórmula GX12SPXi3SG (SEQ ID NO: 318), en donde Xi2 es R o K, y X13 es A o P, representa una secuencia de consenso que comprende VL-CDR2; y la fórmula STWDSXi LSAVXi5 (SEQ ID NO: 319), representa una secuencia de consenso que comprende VL-CDR3.

En cualquiera de las modalidades, el anticuerpo o fragmento del mismo neutraliza actividad hGM- CSF. En modalidades específicas, el anticuerpo monoclonal anti-hG -CSF o fragmento de! mismo neutraliza la actividad de hGM-CSF, de tal manera que el anticuerpo o fragmento tiene un valor IC50 en un ensayo de inhibición de proliferación de menos de 20 pM, menos de 30 pM, menos de 40 pM, menos de 50 pM, menos de 60 pM, menos de 70 pM, menos de 80 pM, menos de 90 pM o menos de 100 pM, en cada caso como se determina en un ensayo de proliferación TF-1 desarrollado en ED80 y como se describe en Ejemplo 12. En una modalidad específica, el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica tiene un valor IC50 que es menor de 40 pM o menos de 30 pM, como se determina en un dicho ensayo de proliferación TF-1 en ED80. En una modalidad específica, el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica tiene un valor IC50 que es menor de 25 pM o menos de 20 pM, como se determina en n dicho ensayo de proliferación TF- 1 en ED80. En una modalidad adicional, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la proliferación de células TF-1 por aproximadamente 50% en una concentración de aproximadamente 14 pM, cuando proliferan las células TF-1 mediante la inducción de hGM-CSF.

Como se demuestra en más detalle en los ejemplos, el EV1018 y EV1019 son ambos efectivos en neutralizar la bioactividad hGM-CSF. Ya que estos anticuerpos conforman sustancialmente el mismo epítopo conformacional como se describió anteriormente, es posible utilizar el epítopo para explorar moléculas adicionales que reconocen el epítopo, tal como anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos. De acuerdo con lo anterior, la invención también contempla explorar métodos, en donde e! epítopo de hGM-CSF, que se define por las secuencias de polipéptido como se establece en la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 y se reconoce por EV1018, EV1019 o una variante de la misma. Tal método comprende (i) explorar una muestra biológica o una colección de péptidos utilizando una sonda que comprende el epítopo; (ii) aislar una molécula que une específicamente la sonda; y (iii) identificar la molécula. En una modalidad, el método incluye adicionalmente la etapa para producir la molécula. En algunas modalidades, la molécula identificada utilizando el método es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos casos, la sonda puede comprender adicionalmente un marcador detectable, que incluye pero no se limita a, una etiqueta, tinte, oreja de afinidad, etc. De acuerdo con algunas modalidades, la sonda se puede inmovilizar, para propósitos de, por ejemplo, explorar para moléculas de unión. Los métodos de exploración están disponibles generalmente y son bien conocidos por el experto en la técnica.

En cualquiera de las modalidades descritas aquí, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede ser cualquier subtipo de inmunoglobulinas, tales como de la clase IgG, tales como Igd , lgG2, y lgG4. De acuerdo con lo anterior, en cualquiera de las modalidades descritas aquí, la cadena pesada puede ser, por ejemplo, de la clase gamma, tales como gamma 1 (??), gamma 2 (y2), gamma 3 (Y3) o gamma 4 (? ). En cualquiera de las modalidades descritas anteriormente, la cadena pesada se puede seleccionar de (los residuos de aminoácido de la cadena pesada se seleccionan de) el grupo que consiste de polipéptidos como se establece en la SEQ ID NOs: 10-33, 38-80 y 152-245, y 348-363. En algunas modalidades, se puede utilizar la porción de una cadena pesada, que incluye, regiones variables de una cadena pesada. Los ejemplos no limitantes de las regiones variables de una cadena pesada como se describe en la presente descripción se proporcionan en la SEQ ID NOs: 152-159 y 348-363.

En los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, la cadena ligera puede ser una cadena ligera lambda, o una parte de la misma, o una cadena ligera kapa, o una parte de la misma. En modalidades específicas, la cadena ligera lambda contiene una o ambas de las siguientes sustituciones de aminoácidos: R100G y A153G. (contiene la sustitución R100G, sustitución A153G, o la sustitución R100G y sustitución A153G). Se debe notar que las sustituciones en la secuencia de aminoácido de cadenas de anticuerpo se describen aquí como referencia a una secuencia de aminoácido de referencia apropiada, donde la designación de posición 100 y 153 en cualquier cadena ligera o fragmento del mismo estará de acuerdo con la invención se determina mediante comparación de la SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 34 como aquellas posiciones de aminoácido que corresponden a las posiciones de aminoácido en la SEQ ID NO: 35 en la que R se reemplaza por G y A by G, respectivamente, si se compara con la secuencia en la SEQ ID 34. Por ejemplo, en el caso anterior, en el que la cadena ligera lambda puede contener una o ambas de las sustituciones de aminoácido descritas, la secuencia de aminoácido de referencia es cadena ligera EV1018 (EV1018-wt-original; SEQ ID NO: 34). El R100G indica que el R (arginina) en la posición 100 en la cadena ligera EV 1018 se sustituye por G (glicina); el A153G indica que la A (alanina) en la posición 153 en la cadena ligera EV1018 se sustituya por G (glicina).

En modalidades específicas, la cadena ligera se selecciona del grupo qge consiste de poüpéptidos como se establece en (cuyos residuos de aminoácido se representan por) la SEQ ID NOs: 34-37 y 184-221 y 364-365. Ejemplos de regiones variables de una cadena ligera como se describe aquí se proporcionan en la SEQ ID NOs: 184-201 y 364-365.

Una cadena ligera puede comprender una o una combinación de dos o más de estas sustituciones de aminoácido, así como también otras que no comprometen sustancialmente la capacidad de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de unir hGM-CSF y neutralizar su actividad. En una modalidad la cadena ligera comprende una sustitución de aminoácido en cualquiera o ambas de la posición 100 y posición 153 de tal manera que la glucosilación no es posible en ninguna de estas posiciones.

La cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF que une a hGM- CSF o un fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una o más sustituciones de aminoácido, tales como T97A, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164 A, y L165 A. Se debe notar que las sustituciones en la secuencia de aminoácido de cadenas de anticuerpo se describen aquí como referencia a una secuencia de aminoácido de referencia apropiada y para la determinación de las posiciones el mismo principio aplicará como se describió anteriormente en el contexto con las sustituciones R100G y A153G. Por ejemplo, en el caso anterior, en el que la cadena pesada pueden contener una o más sustituciones de aminoácido como se describe, la secuencia de aminoácido de referencia es cadena pesada EV1018 (EV1018; SEQ ID NO: 10). Por ejemplo, el T97A indica que la T (treonina) en la posición 97 en la cadena pesada se sustituya por A (alanina); L 164 A indica que la L (leucina) en la posición 164 en la cadena pesada EV1018 se sustituya por A (alanina).

Una cadena pesada puede comprender una o una combinación de dos o más de estas sustituciones de aminoácido, así como también otros que no comprometen sustancialmente la capacidad de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo a unir el hGM-CSF y neutralizar su actividad. Los detalles adicionales con respecto a las de la presente invención se representan en lo siguiente: En una modalidad, la cadena pesada contiene uno o más, o una o una combinación de, sustituciones de aminoácido seleccionados del grupo que consiste de Q3E, T97A, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164A, y L 65 A. En una modalidad adicional, la cadena pesada contiene una o más sustituciones de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de Q3E, T97A, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164A, y L 165 A, y en donde la cadena ligera contiene una o ambas de las siguientes sustituciones de aminoácidos R100G y A153G.

Una modalidad adicional es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF que une a hGM-CSF o un fragmento de unión a antígeno del mismo que une a hGM- CSF, en donde la VH-CDR1 comprende los residuos de aminoácido SYGMH (SEQ ID NO: 4) o SHAMH (SEQ ID NO: 333).

Una modalidad adicional es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF que une a hGM-CSF o un fragmento de unión a antígeno del mismo que une a h'GM-CSF, en donde la VH-CDR2 comprende los residuos de aminoácido LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) o VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334).

Una modalidad adicional es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF que une a hGM-CSF o un fragmento de unión a antígeno del mismo que une a hGM-CSF, en donde la VH-CDR3 comprende los residuos de aminoácido ESMGA'INDN (SEQ ID NO: 6) o EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335).

Las modalidades adicionales de la presente invención son como sigue: Un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF que une a hGM-CSF o un fragmento de unión a antígeno del mismo que une a hGM-CSF, en donde la V|_-CDR1 comprende los residuos de aminoácido IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) o SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330); Un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF que une a hGM-CSF o un fragmento de unión a antígeno del mismo que une a hGM-CSF, en donde la VL-CDR2 comprende los residuos de aminoácido GRSPPS (SEQ ID NO: 8) o GKSPAS (SEQ ID NO: 331 ); y Un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF que une a hGM-CSF o un fragmento de unión a antígeno del mismo que une a hGM-CSF, en donde la VL-CDR3 comprende los residuos de aminoácido STWDSSLSAW (SEQ ID NO: 9) o STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332).

Las modalidades adicionales de la presente invención se relacionan, con un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF que une a hGM-CSF o un fragmento de unión a antígeno del mismo que une a hGM-CSF, que comprende adicionalmente una secuencia de señal.

La secuencia de señal puede ser cualquiera de una variedad de secuencias de señal conocidas por aquellos expertos en la técnica, tal como cualquier secuencia de señal que es útil para permitir o mejorar la expresión y/o pasaje del producto codificado de las células en que este se produce, que incluye pero no se limita a una secuencia de señal seleccionado del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 324, 325 y 326.

En todas las modalidades, e! anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF puede ser un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo monocatena o.

Actividad de unión de los anticuerpos En un aspecto e inesperadamente, como se muestra en los ejemplos de esta descripción, la afinidad de unión medida de los anticuerpos al antígeno (hGM-CSF) no se correlaciona linealmente con su capacidad neutralizante (por ejemplo, capacidad para neutralizar bioactividad hGM-CSF). Esta observación es contraria a la noción general que la mayor afinidad corresponde a mayor capacidad neutralizante. Por ejemplo, se encuentra que un anticuerpo descrito aquí, es decir un anticuerpo utilizando los CDR descritos aquí para reconocer el epítopo descrito aquí, por ejemplo el EV1018, muestra más de 100 veces mayor que la inhibición en el ensayo TF-1 que un anticuerpo de la técnica anterior como se muestra en Tabla 7, aunque la unión de afinidad es menos de 50% de aquel del anticuerpo de la técnica antecedente. Esto está en contraste con las enseñanzas de WO2006/122797, que muestra que entre mayor es la afinidad de un anticuerpo, mayor es la actividad en el ensayo TF-1.

Actividad neutralizante de los anticuerpos Las células mononucleares de sangre periférica y la estirpe celular de tumor TF-1 puede proliferar en respuesta a la estimulación hGM-CSF. La actividad neutralizante del anticuerpo monoclonal anti- hGM-CSF o fragmentó de unión a antígeno del mismo se confirma al medir el efecto inhibidor en su proliferación. Se conoce que los monocitos de sangre periférica y células TF-1 pueden proliferar, cuando se cultivan en la presencia de hGM-CSF. Tal proliferación se puede inhibir al agregar el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención en el sistema de cultivo, o al hacer reaccionar primero hGM-CSF con anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antigeno del mismo de la presente invención y luego agregarlo al sistema de cultivo. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención puede tener, como actividad neutralizante contra células TF-1 en las que la proliferación celular se induce por hGM-CSF, un índice citostático de 40-60% (aproximadamente 50%) comparado con el sujeto negativo (31 pg/ml de hlgG ) a una concentración de aproximadamente 2 ng/ml (aproximadamente 14 pM).

El anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo en la presente invención tiene capacidad neutralizante para el hGM- CSF, que es mayor que la del anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF existente. Por lo tanto, se espera que sea aplicable como agentes terapéuticos utilizados en pequeñas cantidades o dosis para el tratamiento de varias enfermedades originadas por hGM-CSF, tal como dermatitis alérgica, enfermedades autoinmunes, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), asma, fibrosis quística, enfermedad del pulmón intersticial, rinitis, artritis y artropatías relacionadas como artritis reumatoide, soriasis, leucemia mieloide, y esclerosis múltiple.

Composiciones terapéuticas, equipos y uso terapéutico Los anticuerpos a nti-h GM-CSF y fragmentos de unión a antígeno que se describen aquí son efectivos en neutralizar la actividad biológica de! hGM-CSF, y por lo tanto útiles para tratar una afección médica (por ejemplo, enfermedad o trastorno) que se asocia con (por ejemplo, originado por) la expresión aberrante de hGM-CSF en un sujeto. De acuerdo con lo anterior, tal uso terapéutico será abarcado por la presente invención.

La invención en ciertas modalidades proporciona métodos para tratar enfermedades o afecciones como se describe aquí, que comprende administrar a un paciente un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito aquí o una composición descrita aquí.

Como se utiliza aquí, el término "enfermedad o trastorno asociado con la sobreexpresión de hGM-CSF" generalmente se referirá a "una enfermedad originada por hGM-CSF." El término incluirá cualesquier enfermedades que originen y empeoren la patología, cuando un sujeto tiene GM-CSF. El término también incluye otras enfermedades que originan y empeoran la patofisiologíá. Se espera que la inhibición de la actividad biológica del GM-CSF pueda paliar los síntomas de la enfermedad asociados con GM-CSF elevado, y/o poder paliar el progreso de la enfermedad.

Los términos "enfermedad," "trastorno," y "afección" se utilizan indistintamente aquí. Estos incluyen, pero no se limitan a: problemas respiratorios, enfermedades pulmonares obstructivas de diversos orígenes, enfisema pulmonar de diversos orígenes, enfermedades pulmonares restrictivas, enfermedades pulmonares intersticiales, enfermedad pulmonar intersticial, fibrosis quística, bronquitis de diversos orígenes, bronquiectasias, SDRA (síndrome de dificultad respiratoria del adulto) y todas las formas de edema pulmonar, enfermedades pulmonares obstructivas seleccionadas entre COPD (enfermedad pulmonar obstructiva crónica), asma, asma bronquítica, asma infantil, asma severa, ataques agudos de asma y bronquitis crónica, enfisema pulmonar, que tiene su origen en la COPD (enfermedad pulmonar obstructiva crónica) o deficiencia del inhibidor de a-proteinasa; enfermedades pulmonares restrictivas seleccionadas entre alveolitis alérgica, enfermedades pulmonares restrictivas provocadas por sustancias nocivas relacionadas con el trabajo, como asbestosis o silicosis y restricción originada por tumores de pulmón, tales como linfangiosis carcinomatosa, carcinoma broncoalveolar y linfomas, neumonía originada por infecciones, como por ejemplo infección por virus, bacterias, hongos, protozoos, helmintos y otros patógenos, neumonitis originada por diversos factores, tales como por ejemplo la aspiración y la insuficiencia de la parte izquierda del corazón, neumonitis inducida por radiación o fibrosis, colagenosis , tal como por ejemplo lupus eratoso, esclerodermia sistémica o sarcoidosis, granulomatosis, tales como por ejemplo la enfermedad de Boeck, neumonía idiopática intersticial o fibrosis pulmonar idiopática (FPI), mucoviscidosis, bronquitis originada por una infección bacteriana o vírica, bronquitis alérgica y bronquitis tóxica; bronquiectasias , edema pulmonar, por ejemplo, edema pulmonar tóxico después de la aspiración o inhalación de sustancias tóxicas y sustancias extrañas; rinitis, artritis y artropatías relacionadas, leucemia mieloide, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, glomerulonefritis y dermatitis atópica crónica.

Como se utiliza aquí, los términos "tratar," "trato," y "tratamiento" generalmente significan la administración de un terapéutico a un sujeto en un intento para obtener todos o cualquiera de los siguientes resultados: la reducción o alivio del progreso, severidad, y/o duración de una enfermedad, trastorno o afección asociada con la expresión aberrante y/o actividad de! GM-CSF humano o alivio de uno o más síntomas de los mismos que resultan de la administración de una o más terapias (por ejemplo, GM-CSF anticuerpos).

Como se utiliza aquí, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de una terapia (por ejemplo, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a GM-CSF humano), que es suficiente para reducir la severidad de un trastorno asociado con expresión aberrante y/o actividad del GM-CSF humano, reducir la duración de un trastorno asociado con expresión aberrante y/o actividad de GM-CSF humano, mejorar uno o más síntomas de un trastorno asociado con la expresión aberrante y/o actividad del GM-CSF humano, prevenir el avance de un trastorno asociado con expresión aberrante y/o actividad de GM-CSF humano, originar la regresión de un trastorno asociado con la expresión aberrante y/o actividad de GM-CSF humano, o potenciar o mejorar los efectos terapéuticos de otra terapia para un trastorno asociado con expresión aberrante y/o actividad de GM-CSF humano.

La cantidad de anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF administrado, tal como al administrar una composición descrita aquí, variará dependiendo de tales consideraciones como la afección, enfermedad o trastorno que se trata, la edad, género y estado de salud del sujeto (individuo) que recibe el tratamiento y la severidad de o el grado al cual la afección, enfermedad o trastorno que se trata ha progresado. La dosis apropiada se puede determinar empíricamente, utilizando métodos conocidos y con referencia a las necesidades del sujeto. Típicamente, el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno se administra al sujeto en una dosis que no excede 500 mg/dosis. Las dosis más pequeñas también se pueden administrar.

En otras modalidades, cualquiera de los anticuerpos anti-GM-CSF y fragmentos como se enumera anteriormente se pueden combinar, en algunas modalidades, 2, 3, 4, 5, ó más de estos anticuerpos anti- GM-CSF, fragmentos o combinación de los mismos pueden ser combinados.

En algunas modalidades, cualquiera de las modalidades descritas anteriormente se pueden combinar adicionalmente con uno o más de los anticuerpos anti-GM-CSF conocidos previamente, fragmentos, o combinación de los mismos.

Otra modalidad es una composición terapéutica que comprende un (uno, por lo menos un) anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito aquí. En una modalidad, una composición terapéutica comprende uno o más anticuerpos monoclonales anti-hGM- CSF o fragmento de unión a antígeno que reconoce lo siguiente ELYK (SEQ ID NO: 2) y TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) en hGM-CSF y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones terapéuticas pueden comprender cualquiera de los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno d¡el mismo descrito aquí, individualmente (una clase o tipo de anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo en una composición terapéutica) o en combinaciones, tales como combinaciones de dos o más clases o tipos de anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF; dos o más clases o tipos de fragmentos de unión a antígeno de los mismos; una o más clases o tipos de anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF y una o más clases o tipos de fragmentos de unión a antígeno de los mismos; una o más clases o tipos de anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF y dos o más clases o tipos de fragmentos de unión a antígeno de los mismos; o dos o más clases o tipos de anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF y una o más clases o tipos de fragmento de unión a antígenos de los mismos. Las modalidades especificas son composiciones terapéuticas que comprenden un (uno o más de uno) anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo que une a hGM-CSF y un portador farmacéuticamente aceptable, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende (a) una cadena pesada o, en el caso de un fragmento de anticuerpo, una parte de una cadena pesada, que comprende (i) una secuencia que contiene VH-CRD1 de consenso FTFSXiX2MH (SEQ ID NO: 314), en donde XÍ es Y o H, y X2 es G o A, (i¡) una secuencia que contiene VH-CRD2 de consenso X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ I D NO: 315), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X3 es L o V, X4 es T o I, X5 es Y o W, X6 es R o K, X7 es F o Y, y X8 es R o K, y (iii) una secuencia que contiene VH-CRD3 de consenso EXnX9GX10XnXnDXn (SEQ ID NO: 316), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, Xg es M o V, y X10 es A o G; y (b) una cadena ligera o, en el caso de un fragmento de anticuerpo, una cadena ligéra o una parte de la misma, que comprende (i) una secuencia que contiene VL-CDR1 de consenso XnGNXnXnNIGSXnAVG (SEQ ID NO: 317), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, y Xn es H o Y, (ii) una secuencia que contiene VL-CDR2 de consenso GX12SPXi3SG (SEQ ID NO: 318), en donde X12 es R o K, y X13 es A o P, y (iii) una secuencia que contiene VL-CDR3 de consenso STWDSX14LSAVXi5 (SEQ ID NO: 319), en donde X14 es R o S, y X15 es V o L, en donde el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento del mismo reconoce lo siguiente: ELYK (SEQ ID NO: 2) y TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) en hGM-CSF.

Aquí se describen composiciones que comprenden dos o más anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF que unen a hGM-CSF, dos o más fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se une a hGM-CSF o una combinación los mismos y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde uno o más anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF o uno o más fragmentos de unión a antígeno de los mismos reconocen el epítopo discontinuo ELYK (SEQ ID NO: 2) y TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) en hGM-CSF.

Una modalidad adicional descrita aquí es una composición que comprende dos o más anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF que se unen a hGM-CSF, dos o más fragmentos de unión a antígeno de los mismos o una combinación de los mismos y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde uno o más anticuerpos o uno o más fragmentos de unión a antígeno de os mismos comprenden (a) una cadena pesada o, en el caso de un fragmento de anticuerpo, una parte de una cadena pesada, que comprende (i) una secuencia que contiene VH-CRD1 de consenso FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), en donde X1 es Y o H, y X2 es G o A, (ii) una secuencia que contiene VH-CRD2 de consenso X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 315), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X3 es L o V, X4 es T o I, X5 es Y o W, X6 es R o K, X es F o Y, y X8 es R o K, y (iii) una secuencia VH-CDR3 de consenso que contiene la secuencia EXnX9GXi oXnXnDXn (SEQ ID NO: 316), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, Xg es M o V, y X10 es A o G¡ y (b) una cadena ligera o, en el caso de un fragmento de anticuerpo, una cadena ligera o una parte de la misma, que comprende (i) una secuencia que contiene VL-CDR1 de consenso XnGNXpXnNIGSXnAVG (SEQ ID NO: 317), en donde cada Xn independientemente es cualquier aminoácido de ocurrencia natural, y X es H o Y, (ti) una secuencia que contiene VL-CDR2 de consenso GX12SPX13SG (SEQ ID NO: 318), en donde X12 es R o K, y X13 es A o P, y (iii) uan secuencia que contiene VL- CDR3 de consenso STWDSX14LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), en donde X14 es R o S, y X15 es V o L, en donde el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento del mismo reconoce lo siguiente ELYK (SEQ ID NO: 2) y TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) en hGM-CSF.

La materia objeto adicional descrita aquí es una composición en donde por lo menos uno de los dos o más anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF que se unen a hGM-CSF comprenden un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 10-33, 38-80, 152- 183, 34-37, 184-221 , 222-245, 320-323 y 348-365. Se pueden incluir composiciones, en adición a uno o más anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF descritos aquí, otros anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF, tales como aquellos descritos previamente. Ver, por ejemplo, la Publicación Internacional de Solicitud PCT Número WO2006/122797; Publicación Internacional de Solicitud PCT Número WO 2007/092939; y Publicación Internacional de Solicitud PCT Número WO 2006/1 1353.

Equipos Los anticuerpos anti-hGM-CSF o fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se describe aquí, así como también la composición que comprende tales anticuerpos, se puede proporcionar como un equipo, que es así abarcado por la presente invención. Un equipo se puede proporcionar en una variedacJ dé i i formatos y en adición al medicamento (composición terapéutica), puede también incluir empaque y/o etiqueta de un fármaco o dispositivo usualmente que resulta de una orden de prescripción de un médico. Un equipo generalmente incluye un material de instrucción impreso para uso. En algunas modalidades, la composición formulada (por ejemplo, medicamento) se proporciona en uno o más recipientes. En algunas modalidades, un recipiente puede ser un dispositivo para dispensar e medicamento para la administración. Por ejemplo, el medicamento de la presente invención se puede pre medido (por ejemplo, en alícuotas) en un dispensador de único uso y proporcionar como un equipo. En algunos casos, el recipiente es una jeringa. La jeringa puede ser opcionalmente precargada. En algunos casos, se precarga el recipiente de uso único, se pre sella y se desecha. Dependiendo de las rutas y modos de administración para un medicamento particular, un equipo puede incluir componentes adecuados.

Medicamentos Como se utiliza aquí, un "portador aceptable para agente farmacéutico" incluye cualquier todo de la solución compatible fisiológicamente, medioj dé dispersión, agente de recubrimiento, agente antimicrobiano o agente antifúngicOi agente de ajuste osmótico, y retardante de absorción. Ejemplos del portador aceptable para agente farmacéutico incluyen una o múltiples clases de agentes tales como agua, solución de sal, salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol y etanol y combinaciones de los mismos. En muchos casos, el agente de ajuste osmótico tal como azúcar, polialcohol o cloruro de sodio se incluye preferiblemente en las composiciones. El polialcohol puede incluir manitol o sorbitol. Adicionalmente, el portador aceptable para agente farmacéutico puede incluir una pequeña cantidad de sustancias auxiliares tales como humectantes, emulsificadores, conservantes, y agentes de amortiguación. Las sustancias auxiliares pueden mejorar la conservación o efectividad en las composiciones de anticuerpo monoclonal anti-hGM- CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo.

Las composiciones medicinales adecuadas para la administración parenteral pueden incorporar el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antigeno de la presente invención. Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo se ajusta para la solución inyectable que contiene el anticuerpo en la cantidad de 0.1 -250 mg/mL, cuando se aplica una clase del anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo. Por otro lado, cuando las múltiples clases de los anticuerpos se mezclan y aplican, los anticuerpos se ajustan preferiblemente para la solución inactiva que contiene los anticuerpos en la cantidad de 0.001 -10 mg/mL. Adicionalmente, las múltiples clases de anticuerpos se pueden mezclar arbitrariamente en cualquier proporción.

Se puede preparar la solución inyectable formada en la dosificación líquida o liofilizada en frasco ámbar o sílice, ampolla, o jeringa precargada. Como un agente de amortiguación se puede utilizar L-histidina entre pH 15.0~7.0 (pH 6.0 es el mejor adecuado). La concentración de L-histidina de 5-10 mM puede ser la más adecuada. Otros agentes adecuados párale agente de amortiguación pueden ser succinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio, o fosfato de potasio, pero no se limitan a estos. Se puede aplicar el cloruro de sodio mal agente de amortiguamiento con el fin de remover la toxicidad en la solución en la concentración de 0-300 mM (con respecto a la dosificación formada en el líquido, 150 mM es la más adecuada). La forma de dosificación liofilizada puede incluir un crioprotector; principalmente sacarosa en la relación de 0-10% (la relación de 0.5-1.0% puede ser la más adecuada). Otros agentes adecuados para el crioprotector pueden ser trehalosa y lactosa. La forma de dosificación liofilizada pueden incluir expansor, principalmente incluye manitol en la relación de 1 -10% (la relación de 2-4% puede ser la más adecuada). Como un estabilizador, se puede aplicar principalmente L-metionina en la concentración de 1 -50 mM (5-10 mM puede ser la más adecuada) a ambas dosificaciones formadas en líquido o liofilizado. La glicina y arginina se incluyen en los otros expansores apropiados. Se puede incluir el Polisorbato 80 como un tensoactivo en la relación de 0-0.05% (la relación de 0.005-0.01% puede ser la más adecuada). Otros tensoactivos incluyen polisorbato 20 y tensoactivo BRIJ, pero no se limitan a estos.

Varias formas de dosificación son aplicables a las composiciones en la presente invención. Por ejemplo, las composiciones pueden tener las dosificaciones formadas en líquido semisólido y sólido. Se incluyen la solución (por ejemplo, solución inyectable o transfusión), líquido de dispersión, líquido de suspensión, comprimido, pildora, polvo, liposoma y supositorio. Preferiblemente, 5 la forma de dosificación depende del método de administración y el ejemplo terapéutico. Preferiblemente, las composiciones tienen las dosificaciones formadas en líquidos capaces de inyección y transfusión de fluido. Las composiciones pueden ser preferiblemente para la administración parenteral (por ejemplo, se pueden mostrar administración intravenosa, administración subcutánea, administración abdominal, y administración intramuscular). En la modalidad preferida, el anticuerpo se administra a través de solución de infusión intravenosa o inyección intravenosa. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se administra a través de inyección intramuscular o subcutánea.

Las composiciones para terapias de deben producir generalmente y almacenar bajo condición esterilizada y estable. Las composiciones se pueden prescribir en solución, microemulsión, líquido de dispersión, liposoma u otras estructuras adecuadas para la alta concentración de fármaco. La solución esterilizada capaz de inyección se prepara mediante os siguientes procedimientos. La cantidad requerida de compuestos activos (específicamente, anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo) se mezclan en un disolvente apropiado. Si es necesario, el uno o la combinación de los compuestos mencionados anteriormente se mezclan en un disolvente apropiado junto con los compuestos activos, y luego se esteriliza mediante filtración de tal manera que se prepara la solución. Generalmente, el medio de dispersión fundamental y el compuesto activos se mezclan en vehículo esterilizado que incluye otros compuestos requeridos del medio mencionado anteriormente. Cuando se utiliza polvo esterilizado liofilizado para preparar la solución inyectable esterilizada, se aplican preferiblemente el método de secado en vacío y de secado por rociado como los métodos de preparación. A través del 5 método de preparación, se obtienen cualesquier otras composiciones deseables a partir del polvo de ingrediente activo y la solución esterilizada aplicada para la filtración. La fluidez de la solución es apropiadamente sostenida por los siguientes medios. Los medios son, por ejemplo, aplicar material de recubrimiento tal como lecitina, mantener el tamaño de partícula requerido para el líquido de dispersión, y aplicar agente tensoactivo. Los retardantes de absorción farmacéutica tales como ácido monosteárico y gelatina se incluyen en las composiciones, por lo cual las composiciones inyectables se pueden adsorber en el cuerpo humano para una larga duración.

El anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención se puede administrar a través de los varios métodos conocidos en la técnica. Las rutes/métodos de administración tales como inyección subcutánea, inyección intravenosa, o transfusión de fluido se aplican preferiblemente en las varias terapias. Las rutas/métodos de administración dependen de los resultados esperados. Aquellos expertos en la técnica pueden entender que se incluyen implante, parche percutáneo y sistema de suministro de fármaco en las rutas/métodos de administración. En una modalidad, el anticuerpo tal como dosificación de liberación controlada, que puede controlar la liberación de los compuestos, también se aplica junto con los compuestos activos para la preparación. El polímero biocompatible tiene biodegradabilidad. La preparación puede incluir el polímero biocompatible tal como etileno vinil acetato, polianhídrido, ácido poliglicólico, colágeno, ésteres de poliortito, y polilactato. Se otorgan patentes a varios métodos para preparar estas dosificaciones, y son generalmente conocidos por aquellos expertos en la técnica.

En una modalidad, el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo readministra oralmente con, por ejemplo, el diluyente inactivo o portador comestible o adsorbible. Los compuestos (y si se desea, otros ingredientes) se pueden encapsular en cápsulas de gelatina dura o blanda, comprimir en un comprimido, o directamente mezclar en el alimento para le sujeto. En la administración oral aplicada en la terapia, los compuestos se pueden mezclar en el excipiente, y ser utilizados en la forma capaz de la ingestión, tal como comprimido, comprimido bucal, trocisco, cápsula, elixir, líquido de suspensión, jarabe, y oblato. Con el fin de administrar los compuestos de la presente invención por una ruta diferente a la ruta parenteral, es necesario cubrir los compuestos en materiales que prevengan su inactivación, y administrar los compuestos y los materiales al mismo tiempo.

Terapia de Combinación Es también posible incorporar complementariamente compuestos activos adicionales en las composiciones, en donde los compuestos adicionales no incluyen un anticuerpo contra un antígeno que no es GM-CSF. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antigeno del mismo en la presente invención se prescribe con una o más clases de otros agentes terapéuticos útiles para remediar las enfermedades asociadas con GM-CSF elevados, o se administra con otros agentes terapéuticos al mismo tiempo, cuando otros agentes terapéuticos no son anticuerpos contra una proteína diferente de GM-CSF. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención se prescribe con uno o más de otros anticuerpos anti-GM-CSF. La terapia de combinación tiene una ventaja que los agentes terapéuticos trabajen efectivamente en cantidades pequeñas. Los agentes terapéuticos permiten evitar la toxicidad o complicación, ambos de los cuales se pueden acompañar con varias monoterapias.

Como se utiliza aquí, "administrado al mismo tiempo" se interpretará ampliamente. Por ejemplo, cuando dos o más clases de anticuerpos monoclonales anti GM-CSF o fragmentos de unión a antígeno se administran a un paciente, cada uno o alguno de los anticuerpos o fragmentos de los mismos se pueden o no se pueden proporcionar como un medicamento único (por ejemplo, Composición), en algunas modalidades, un medicamento único (por ejemplo, Composición) comprende todas las diferentes clases de los anticuerpos monoclonales anti GM-CSF o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se administran al sujeto, de tal manera que los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se presentan simultáneamente al paciente como una mezcla. En algunas modalidades, sin embargo, dos o más medicamentos (por ejemplo, composiciones) que comprenden una o más clases de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se administran separadamente al sujeto. Cuando se administran "separadamente", los medicamentos se pueden administrar secuencialmente, por ejemplo, uno después del otro. Se elabora para ser administrado "al mismo tiempo" mientras que el efecto de un primer medicamento y que de los medicamentos posteriores (segundo, tercero, etc.) se sobreponen en tiempo y células/tejidos objetivos en el sujeto efectúan por lo tanto una respuesta terapéutica mejorada (por ejemplo, sinérgica).

Especialmente, cuando se aplican más de una clase de los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF de la presente invención, es posible proporcionar actividad que inhibe el crecimiento celular (bioactividad de neutralización) que es mucho mayor que aquella proporcionada por una clase de anticuerpo monoclonál en la composición médica. Por lo tanto, es posible proporcionar el agente terapéutico requerido en su cantidad más pequeña.

De acuerdo con lo anterior, se proporcionan métodos para mejorar la actividad, caracterizados porque dos o más clases de anticuerpos monoclonales anti GM-CSF se administran al mismo tiempo, o las composiciones medicinales o las composiciones de fármaco veterinarias caracterizadas porque se incluyen dos o más clases de anticuerpo monoclonál anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo, las dos o más clases de los anticuerpos se seleccionan de lo siguiente (a) y (b): (a) anticuerpo monoclonál anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo que tiene regiones de determinación de complementariedad (CDR) representadas por las secuencia de aminoácido de la SEQ ID NOs: 4 a 9, SEQ ID NOs: 330 a 335, SEQ ID NOs: 336 a 341 , o SEQ ID NOs: 342 a 347, y que es específico para el hGM-CSF, (b) anticuerpo monoclonál anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo de (a) que tienen una secuencia de aminoácido en la que uno o más aminoácidos se sustituyen, eliminan, insertan o agregan, y que es específico para hGM-CSF.

En la misma forma, la presente invención también incluye un método para mejorar la actividad caracterizada porque las múltiples clases diferentes (se describen como "clases múltiples" aquí) de los anticuerpos monoclonales anti-hGM-CSF de la invención se administran simultáneamente, o las composiciones medicinales o las composiciones de fármaco veterinarias que comprenden las múltiples clases de anticuerpos anti-hGM-CSF de la invención.

En cualquiera de las modalidades, la composición puede comprender una clase o tipo de anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF o fragmentos de unión a antígeno de estos que son capaces de neutralizar la actividad de hGM-CSF. Alternativamente, en cualquiera de las modalidades, la composición puede comprender dos o más clases o tipos de anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF o fragmentos de unión a antígeno de estos que son capaces de neutralizar la actividad hGM- CSF. Los anticuerpos monoclonales y/o fragmentos de los mismos en tales composiciones pueden incluir, en adición a uno o más anticuerpos o fragmentos de los mismos descritos aquí, anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF previamente descritos y/o fragmentos de los mismos. Los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y composiciones terapéuticas, composiciones medicinales y composiciones farmacéuticas que comprenden tales anticuerpos y/o fragmentos de unión a antígenos de los mismos se pueden utilizar para tratar o prevenir enfermedades, trastornos o afecciones originadas por hGM-CSF y/o asociadas con su sobreexpresión (relativa al nivel de expresión hGM-CSF en un control, tal como un individuo que no tiene la enfermedad, afección o trastorno).

Se consideran las composiciones medicinales que incluyen portadores farmacéuticamente aceptables e el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo por ser efectivas contra las enfermedades originadas por hGM-CSF. Las enfermedades originadas por la producción excesiva del hGM-CSF se pueden ilustrar tal como: (a) enfermedad alérgica tal como asma, atopia, y polinosis, (b) rechazo de injerto, enfermedad del injerto contra el anfitrión (GVHD) y (c) enfermedad autoinmune tal como artritis reumatoide.

Sin pretender estar limitado por cualquier mecanismo particular, se considera que la sobreexpresión de GM-CSF por lo menos en parte origina una disposición de enfermedades o trastornos tales como aquellos listados aquí. Sin embargo, es también posible que tales afecciones clínicas se pueden originar por el deterioro en otras rutas biológicas relacionadas, tales como regulación ascendente de los receptores correspondientes de) o mutaciones en una o más rutas efectoras. Así, "enfermedad o trastorno asociado con la sobreexpresión de hGM-CSF" incluirá tales afecciones que llevan a una respuesta equivalente como la sobreexpresión de hGM-CSF.

Elaboración/preparación En una modalidad la invención es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe aquí para uso en medicina.

El uso de un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se describe aquí, para la fabricación o preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con la sobreexpresión de hGM-CSF (niveles originados por GM-CSF, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo une el hGM-CSF y es capaz de neutralizar la actividad de hGM-CSF, es también una modalidad. Tales anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF y fragmentos de unión a antígenos de los mismos se pueden describir aquí.

El uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que reconoce ELYK (SEQ ID NO: 2) y TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) en hGM-CSF para la fabricación o preparación de un medicamento es una modalidad adicional.

Una modalidad adicional es el uso de los anticuerpos monoclonales anti-hGM-CSF y/o fragmentos de unión a antígeno de los mismos para la fabricación o preparación de un medicamento, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende (a) una cadena pesada o, en el caso de un fragmento de anticuerpo, una parte de una cadena pesada, que comprende (i) una secuencia que contiene VH-CDR1 - de consenso FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), en donde X, es Y o H, y X2 es G o A, (ii) una secuencia que contiene VH-CRD2 de consenso X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 315), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X3 es L o V, X4 es T o I, X5 es Y o W, X6 es R o K, X7 es F o Y, y X8 es R o K, y (iii) una secuencia que contiene VH-CRD3 de consenso EXnXgGXioXnXnDXn (SEQ ID NO: 316), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, Xg es M o V, y X10 es A o G; y (b) una cadena ligera o, en el caso de un fragmento de anticuerpo, una cadena ligera o una parte de la misma, que comprende (i) a secuencia que contiene V|_-CDR1 de consenso XnGNXnXpNIGSX AVG (SEQ ID NO: 317), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, y X es H o Y, (ii) una secuencia que contiene VL-CDR2 de consenso GX12SPX13SG (SEQ ID NO: 318), en donde X 2es R o K, y X 3 es A o P, y (¡ii) una secuencias de consenso que contiene VL-CDR3 STWDSX14LSAVXi5 (SEQ ID NO: 319), en donde X 4 es R o S, y X¡5 es V o L.

En un aspecto adicional, la invención proporciona anticuerpos anti-hGM- CSF aislados o fragmentos de unión a antígeno de tales anticuerpos que son útiles para la fabricación de medicamentos. Estos medicamentos son útiles para el tratamiento de una enfermedad, afección o trastorno asociado con expresión aberrante (por ejemplo, sobreexpresión) de hGM-CSF. Cualquiera de los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos aquí se puede utilizar para la fabricación de un medicamento para este propósito.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno reconocen el ELYK (SEQ ID NO: 2) y TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) en hGM-CSF.

En ciertas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende (a) una cadena pesada o, en el caso de un fragmento de anticuerpo, una parte de una cadena pesada, que comprende (i) una secuencia que contiene VH-CRD1 de consenso FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), en donde Xi es Y o H, y X2 es G o A, (ii) una secuencia que contiene VH-CRD2 de consenso X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 315), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X3 es L o V, X es T o I, X5 es Y o W, X6 es R o K, X7 es F o Y, y X8 es R o K, y (iii) una secuencia que contiene VH-CDR3- de consenso (SEQ ID NO: 316), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X9 es M o V, y X10 es A o G; y (b) una cadena ligera o, en el caso de un fragmento de anticuerpo, una cadena ligera o un parte de la misma, que comprende (i) una secuencia que contiene VL-CDR1 de consenso XnGNXpXnNIGSX AVG (SEQ ID NO: 317), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, y X es H o Y, (ii) una secuencia que contiene VL-CDR2 de consenso GX12SPX13SG (SEQ ID NO: 318), en donde X12 es R o K, y ??3 es A o P, y (ii¡) a consensus VL- CDR3-containing sequence STWDSXi4LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), en donde X14 es R o S, y X15 es V o L. En una modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo une a hGM-CSF con un KD de no más de 400 pM, en otra realización menos de aproximadamente 160 pM (tal como EV1018 o EV1019), por lo cual se determina el KD de acuerdo con las técnicas descritas en los ejemplos.

En otras modalidades, se puede combinar cualquiera de los anticuerpos anti-G -CSF y fragmentos como se enumeró anteriormente. En algunas modalidades, se pueden combinar 2, 3, 4, 5, o más de tales anticuerpos anti-GM-CSF, fragmentos o combinación de los mismos.

Producción de anticuerpos y fragmentos, de ADN y vectores Se describe adelante la producción del anticuerpo originador que reconoce el epítopo discontinuo proporcionado en la invención; sin embargo, no se debe interpretar por ser limitante al método particular. Las características descritas se pueden sustituir en el campo de la tecnología sin apartarse del alcance de la invención, el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF y su porción de unión a antígeno de la presente invención se derivan de la sangre obtenida de un paciente con proteinosis alveolar idiopática a través de las siguientes etapas: aislar un clon de célula para producir ql anticuerpo, seleccionar una célula positiva a anticuerpote la colección obtenida de las células que producen anticuerpo, y purificar el anticuerpo obtenido del sobrenadante de la célula positiva a anticuerpo mediante purificación de afinidad. 1 ) Separación del clon de célula que produce anticuerpo- completamente humano contra hGM- CSF.

Se aisla el linfocito B de la sangre de un paciente, que sufre de proteinosis alveolar idiomática (IPAP) y tiene alto el nivel de anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF en el suero sanguíneo. Luego, se induce el linfocito B para su proliferación. El método para inducir su proliferación es bien conocido. Como el ejemplo, un factor inducible de cáncer, el "virus Epstein-Barr" (descrito como EBV aquí adelante) se aplica en el método de transformación (D. Kozbor et al.) para la proliferación inducida. Más específicamente, el linfocito B se infecta con EBV, y se induce para su proliferación. Las células proliferadas se mantiene para una colección de las células que producen anticuerpo. 2) Aislamiento del anticuerpo monoclonal de la colección de las células que producen anticuerpo.

Utilizando el método conocido comúnmente aplicado en la producción de anticuerpos monoclonales, se selecciona una célula monoclonal a partir de las células proliferadas inducidas. De la colección de células que producen anticuerpos, se selecciona el linfocito con el fin de producir el anticuerpo que une a hGM-CSF. Más específicamente, se selecciona la población celular (clones) que producen anticuerpos que unen a hGM-CSF mediante el método de dilución limitada. Es preferible emplear ELISA utilizando anticuerpo hGM-CSF y de ratón anti- hlgG etiquetado para detectar una unión de fracción a hGM-CSF. La población celular (clones) que produce solo el anticuerpo deeado se obtiene al cultivar la célula positiva a anticuerpo seleccionada y explorarla repetidamente. Se ilustran las etapas hasta que "se aisla un clon de célula que produce anticuerpo" are en un diagrama de flujo mostrado en la Figura 1 . 3) Purificación por Afinidad utilizando Proteína A o Proteína G.

Cuando se purifica el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF, es posible cultivar la célula inmortalizada es una botella rodillo, matraz de agitación de 2 litros. U otros sistemas de cultivo. El sobrenadante se filtra y se concentra. Luego, la proteína se purifica mediante cromatografía de afinidad con Proteína A-Sefarosa o Proteína G-Sefarosa etc, (New Jersey, Piscataway, Pharmacia Corp.). Después del intercambio de la solución amortiguadora a PBS, la concentración de la proteína se mide mediante OD a 280nm, o preferiblemente mediante análisis de nefelómetro. El isotipo anticuerpo se examina por el método específico de antígeno método contra el antígeno isotipo.

El anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF obtenido es un anticuerpo humano completo producido a partir de linfocito B sensitizado en el cuerpo humano, por o cual el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF raramente muestra la inmunoreacción contra anticuerpo. Mientras que se clona la célula que produce anticuerpo, se infecte al linfocito B con virus EB, y se induce su proliferación mediante la actividad del virus EB. De acuerdo con lo anterior, se caracteriza porque se clona la célula que produce anticuerpo al aplicar la actividad del virus EB. El método del virus EB tiene una ventaja en la producción de un anticuerpo natural en un cuerpo humano, y en la obtención de un anticuerpo con alta afinidad. Por ejemplo, la afinidad del anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF es 10-100 veces más alta que un anticuerpo producido por ratón inmunizado artificialmente. Una colección incluye un grupo de linfocitos B proliferados por la infección por el virus EB. Es posible aislar un clon de célula que produce anticuerpo específico a partir de la colección y obtener un anticuerpo humano.

Como se mencionó anteriormente, las características descritas se pueden sustituir o convertir en el campo de la tecnología sin apartarse del alcance de la invención. Un ácido nucleico, un vector y una célula anfitriona pueden expresar anticuerpo recombinante o su porción de unión a antígeno en la presente invención. Esto también se incluye en la presente invención.

Mostradas en las tablas adelante están las variantes de cadena pesada y las variantes de cadena ligera de EV1018 y las variantes de cadena pesada y las variantes de cadena ligera de EV1019. Las tablas proporcionan, respectivamente, las variantes para las cadenas pesada y ligera de la EV 1018 y las variantes para las cadenas pesada y ligera de la EV 1019 y hacen posible identificar todas las combinaciones posibles de una cadena pesada y una ligera para cada uno de EV1018 y EV1019. Una persona medianamente experta en la técnica puede producir cualquiera de las combinaciones, utilizando métodos conocidos en la técnica y la información proporcionada aquí.

En un aspecto adicional, se describe aquí un proceso (método) para producir un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo. Típicamente, un método para producir un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende obtener o producir ADN que consiste esencialmente de ADN que codifica una inmunoglobulina que consiste de una cadena pesada y una cadena ligera o región Fab; insertar el ADN producido en un vector de expresión replicable en tal una forma que este se ligue operablemente a un promotor adecuado, produciendo por lo tanto un vector que comprende el ADN ligado operablemente a un promotor adecuado; introducir el vector en una célula anfitriona, produciendo por lo tanto una célula anfitriona que contiene el vector; cultivar la célula anfitriona bajo condiciones adecuadas para expresión del ADN y producción del péptido(s) codificado y el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno. El anticuerpo monoclonal anti- hGM-CSF resultante o fragmento de unión a antígeno se puede recuperar a partir de la célula anfitriona o cultivo anfitrión mediante métodos conocidos en la técnica.

Más específicamente, el proceso comprende producir por lo menos VH-CDR1 , VH-CDR2 y VH-CDR3, y VL-CDR1 , VL-CDR2 y VL-CDR3 en una célula anfitriona. El método comprende introducir en una célula anfitriona apropiada ADN que codifica el VH-CDR1 , VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1 , VL-CDR2 y VL-CDR3, mantener la célula anfitriona resultante (célula anfitriona que contiene ADN que codifca VH-CDR1 , VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1 , VL-CDR2, VL-CDR3) bajo condiciones apropiadas para la expresión del ADN (producción de los péptidos codificados), y formación/ensamble del anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno produciendo por lo tanto el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno. En modalidades específicas, el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye (a) una cadena pesada o, en el caso de un fragmento de anticuerpo, una parte de una cadena pesada, que comprende (i) una secuencia que contiene VH-CDR1 de consenso FTFSXiX2MH (SEQ ID NO: 314), en donde Xi es Y o H, y X2 es G o A, (ii) una secuencia que contiene VH-CRD2 de consenso X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 31 5), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X3 es L o V, X4 es T o I, X5 es Y o W, X6 es R o K, X7 es F o Y, y X8 es R o K, y (iii) una secuencia que contiene VH-CRD3 de consenso EXnX9GX10XnXnDXn (SEQ I D NO: 316), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X9 es M o V, y X10 es A o G; y (b) una cadena ligera o, en el caso de un fragmento de anticuerpo, una cadena ligera o una parte de la misma, que comprende (i) una secuencia que contiene V|_-CDR1 de consenso XnGNXnXnNIGSX AVG (SEQ ID NO: 317), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, y Xn es H o Y, (ii) una secuencia que contiene VL-CDR2 de consenso GX12SPX13SG (SEQ ID NO: 318), en donde X12 es R o K, y X13 es A o P, y (iii) una secuencia que contiene VL-CDR3 de consenso STWDSX14LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), en donde X14 es R o S, y X15 es V o L; y el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno producido une el hGM-CSF. El ADN que codifica VH-CDR1 , VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1 , VL- CDR2 y VL-CDR3 puede ser una unidad o múltiples unidades (por ejemplo, todos los componentes VHA/L se puede codificar por un ADN, algunos o todos los componentes se pueden codificar mediante ADN separado).

Por ejemplo, un primer ADN puede codificar una cadena pesada completa y un segundo ADN puede codificar una cadena ligera completa. La cadena pesada completa se puede seleccionar del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 10-33, 38-80 y 160-183; 222-245, 320 y 322 y la cadena ligera completa the complete se puede seleccionar del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 34- 37, 202-221 , 321 y 323. En una modalidad la cadena pesada completa se selecciona del grupo que consiste de la SEQ I D NOs: 10-33, 38-80 y 160-183; 222-245, 320 y 322 y la cadena ligera completa se selecciona del grupo que consiste de la SEQ I D NOs: 34-37, 202-221 , 321 y 323.

El proceso puede comprender adicionalmente aislar el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo.

También el objeto aquí es un vector que comprende ADN que codifica una VH-CDR1 , y/o una VH-CDR2, y/o una VH-CDR3. VH-CDR1 que es SYGMH (SEQ ID NO: 4) o SHAMH (SEQ ID NO: 333), VH-CDR2 es LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) o VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334), y VH-CDR3 es ESMGATNDN (SEQ ID NO: 6) o EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335).

También el objeto aquí es un vector que comprende ADN que codifica una VL-CDR1 , una VL- CDR2, y una VL-CDR3, en donde el VL-CDR1 es IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) o SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330), VL-CDR2 es GRSPPS (SEQ ID NO: 8) o GKSPAS (SEQ ID NO: 331 ), y VL-CDR3 es STWDSSLSAW (SEQ ID NO: 9) o STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332).

Por ejemplo, las secuencias líder de la cadena pesada y cadena ligera se dividen el proceso de maduración de proteína. Las secuencias líder divididas no tienen efecto sobre las propiedades del anticuerpo finales. Para complementar la secuencia eliminada, se integra el ADN clonado con el oligonucleótido sintético en el método de ligación o amplificación de PCR. Los términos "secuencia líder" y "secuencia de señal" se utilizan intercambiablemente aquí.

En un proceso alternativo, se sintetiza una región variable completa con un par de oligonucleótidos superpuestos cortos, y luego se amplifica el oligonucleótido resultante en un método de amplificación PCR, de tal manera que un clon artificial de una región variable se obtiene completamente.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con un ácido desoxirribonucleico aislado (ADN) que codifica el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo capaz de unir a hGM-CSF y neutralizar la bioactividad del hGM-CSF, en donde el ADN aislado comprende una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de aminoácido que comprende por lo menos una seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 4 a 9. Esta invención también incluye el ADN aislado en el que una secuencia de nucleótido codifica una secuencia de aminoácido que comprende por lo menos una seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 330 a 335.

Cuando un ácido desoxirribonucleico aislado (ADN) codifica el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo capaz de unir a hGM- CSF y neutralizar la bioactividad del hGM-CSF, luego el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo también se incorpora en la presente invención: el ADN aislado capaz de hibridar con el ADN descrito anteriormente bajo condición rigurosa. Luego del vector y de la célula anfitriona también se incorpora en la presente invención: 1 ) un vector que incorpora el ADN aislado 2) Una célula anfitriona integrada con el vector de expresión recombinante. Adicionalmente, es también posible obtener un anticuerpo específico al expresar un anticuerpo scFv diversificado (fragmento monocatenario de la región variable) preparado por mezcla artificial de los genes VH y VL como proteína de fusión de fago, utilizando un método de exhibición de fago desarrollado recientemente que utiliza la técnica de ingeniería genética para expresar un anticuerpo recombinante en la superficie de fago.

Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención se puede obtener mediante cualquier método conocido por el experto, por ejemplo la expresión recombinante de los fragmentos que se codifican por una forma del ADN truncada que codifica el anticuerpo, o por la degradación proteolitica de las cadenas de aminoácido del anticuerpo, por lo cual el trabajador experto aplica ensayos biológicos, por ejemplo como aquellos descritos aquí, para determinar cual de los fragmentos mantiene la función de unión a antígeno o actividad neutralizante.

Anticuerpos específicos de la invención La invención proporciona el anticuerpo EV 1018 en si mismo y numerosas variaciones (por ejemplo, variantes) del anticuerpo EV1018, como se resume en la Tabla A. En ciertas modalidades, una cadena pesada contiene una o más sustituciones de aminoácido relativas a la secuencia de cadena pesada natural. En algunas modalidades, una cadena ligera contiene una o más sustituciones de aminoácido relativas a la secuencia de cadena ligera EV 018 natural. En algunas modalidades, una cadena pesada y una cadena ligera cada una contiene una o más sustituciones de aminoácido.

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena ligera, EV1018-wt-original (SEQ ID NO: 34), y una de las siguientes variantes de cadena pesada: EV1018 (SEQ ID NO: 10), EV1018-wt-lgG1 KO (SEQ ID NO: 1 1 ), EV 018-T97A-lgG1 KO(SEQ ID NO: 12), EV1018-T97V-lgG1 KO(SEQ ID NO: 13), EV1018-N95D-lgG1 KO(SEQ ID NO: 14), EV1018-N95E lgG1 KO(SEQ ID NO: 15), EV1018-N95K IgGI KO (SEQ ID NO: 16), EV1018-N95Q IgGI KO (SEQ ID NO: 17), EV 018-N93Q-N95T IgGI KO (SEQ ID NO: 18), EV1018-wt lgG1 -BI (SEQ ID NO: 19), EV1018-T97A lgG1 -BI (SEQ ID NO: 20), EV1018-T97V lgG1 -BI (SEQ ID NO: 21 ), EV1018-N95D lgG1 -Bl (SEQ ID NO: 22), EV1018-N95E lgG1 -BI (SEQ ID NO: 23), EV1018-N95K lgG1 -BI (SEQ ID NO: 24), EV1018-N95Q lgG1 -BI (SEQ ID NO: 25), EV1018-N93Q-N95T lgG1 -BI (SEQ ID NO: 26), EV1018-T97A lgG1 - original-constante (SEQ ID NO: 27), EV1018-T97V lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 28), EV1018-N95D lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 29), EV1018-N95E lgG1 - original-constante (SEQ ID NO: 30), EV1018-N95K lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 31), EV1018-N95Q lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 32), EV1018-N93Q- N95T lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 33), EV1018-wt-lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 38), EV1018-T97 A-lgG1-KO-Q VQL (SEQ ID NO: 39), EV1018-T97V-lgG1-KO- QVQL (SEQ ID NO: 40), EV1018-N95D-lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 41), EV1018- N95E lgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 42), EV1018-N95K lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 43), EV1018-N95Q lgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 44), EV1018-N93Q-N95T lgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 45), EV1018-wt lgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO:46), EV1018-T97A lgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 47), EV1018-T97V lgG1 -QVQL-BI (SEQ ID NO: 48), EV1018-N95D lgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 49), EV1018-N95E lgG1- QVQL-BI (SEQ ID NO: 50), EV1018-N95K lgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 51 ), EV1018-N95Q lgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 52), EV1018-N93Q-N95T lgG1 -QVQL- Bl (SEQ ID NO: 53), EV1018-lgG2 (SEQ ID NO: 54), EV1018-wt-lgG2 (SEQ ID NO: 55), EV1018-T97A-lgG2 (SEQ ID NO: 56), EV1018-T97V-lgG2 (SEQ ID NO: 57), EV1018-N95D-lgG2 (SEQ ID NO: 58), EV1018-N95E-lgG2 (SEQ ID NO: 59), EV1018-N95K-lgG2 (SEQ ID NO: 60), EV1018-N95Q-lgG2 (SEQ ID NO: 61 ), EV1018-N93Q-N95T-lgG2 (SEQ ID NO: 62), EV1018-lgG4 (SEQ ID NO: 63), EV10 8-wt-lgG4 (SEQ ID NO: 64), EV10 8-T97A-lgG4 (SEQ ID NO: 65), EV10 8- T97V-lgG4 (SEQ ID NO: 66), EV1018-N95D-lgG4 (SEQ ID NO: 67), EV1018-N95E-lgG4 (SEQ ID NO: 68), EV1018-N95K-lgG4 (SEQ ID NO: 69), EV1018-N95Q-lgG4 (SEQ ID NO: 70), EV1018-N93Q-N95T-lgG4 (SEQ ID NO: 71 ), EV1018-lgG4-SP (SEQ ID NO: 72), EV1018-wt-lgG4-SP (SEQ ID NO: 73), EV1018-T97A-lgG4-SP (SEQ ID NO: 74), EV1018-T97V-lgG4-SP (SEQ ID NO: 75), EV1018-N95D-lgG4-SP (SEQ ID NO: 76), EV1018-N95E-lgG4-SP (SEQ ID NO: 77), EV1018-N95K-lgG4-SP (SEQ ID NO: 78), EV1018-N95Q-lgG4-SP (SEQ ID NO: 79) y EV1018-N93Q-N95T- lgG4-SP (SEQ ID NO: 80).

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena ligera, EV1018-wt-BI (SEQ ID NO: 35), y una de las siguientes variantes de cadena pesada: EV1018 (SEQ ID NO: 10), EV1018-wt-lgG1 KO (SEQ ID NO: 11 ), EV1018-T97 A-lgG1 KO (SEQ ID NO: 12), EV1018-T97V-lgG1 KO(SEQ ID NO: 13), EV1018-N95D-lgG1 KO (SEQ ID NO: 14), EV1018-N95E lgG1 KO(SEQ ID NO: 15), EV1018-N95K IgGI KO (SEQ ID NO: 16), EV1018-N95Q IgGI KO (SEQ ID NO: 17), EV1018-N93Q-N95T IgGI KO (SEQ ID NO: 18), EV1018-wt lgG1 -BI (SEQ ID NO: 19), EV1018-T97A lgG1 -BI (SEQ ID NO: 20), EV1018-T97V lgG1 -BI (SEQ ID NO: 21 ), EV1018-N95D lgG1-Bl (SEQ ID NO: 22), EV1018-N95E lgG1 -BI (SEQ ID NO: 23), EV1018-N95K lgG1 -BI (SEQ ID NO: 24), EV1018-N95Q lgG1 -BI (SEQ ID NO: 25), EV1018-N93Q-N95T lgG1 -BI (SEQ ID NO: 26), EV1018-T97A lgG1 - original-constante (SEQ ID NO: 27), EV1018-T97V lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 28), EV1018-N95D lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 29), EV1018-N95E lgG1-original-constante (SEQ ID NO: 30), EV1018-N95K lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 31 ), EV1018-N95Q lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 32), EV1018-N93Q- N95T lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 33), EV1018-wt-lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 38), EV1018-T97A-lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 39), EV1018-T97 V-lgG1 -KO- QVQL (SEQ ID NO: 40), EV1018-N95D-lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 41 ), EV1018- N95E lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 42), EV1018-N95K lgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 43), EV1018-N95Q lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 44), EV1018-N93Q-N95T lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 45), EV1018-wt lgG1 -QVQL-BI (SEQ ID NO:46), EV1018-T97A lgG1 -QVQL-BI (SEQ ID NO: 47), EV1018-T97V lgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 48), EV1018-N95D lgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 49), EV1018-N95E lgG1- QVQL-BI (SEQ ID NO: 50), EV1018-N95K lgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 51), EV1018-N95Q lgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 52), EV1018-N93Q-N95T lgG1-QVQL- Bl (SEQ ID NO: 53), EV1018-lgG2 (SEQ ID NO: 54), EV1018-wt-lgG2 (SEQ ID NO: 55), EV1018-T97A-lgG2 (SEQ ID NO: 56), EV1018-T97V-lgG2 (SEQ ID NO: 57), EV1018-N95D-lgG2 (SEQ ID NO: 58), EV1018-N95E-lgG2 (SEQ ID NO: 59), EV1018-N95K-lgG2 (SEQ ID NO: 60), EV1018-N95Q-lgG2 (SEQ ID NO: 61), EV1018-N93Q-N95T-lgG2 (SEQ ID NO: 62), EV1018-lgG4 (SEQ ID NO: 63), EV1018-wt-lgG4 (SEQ ID NO: 64), EV 018-T97A-lgG4 (SEQ ID NO: 65), EV1018- T97V-lgG4 (SEQ ID NO: 66), EV1018-N95D-lgG4 (SEQ ID NO: 67), EV1018-N95E-lgG4 (SEQ ID NO: 68). EV1018-N95K-lgG4 (SEQ ID NO: 69), EV1018-N95Q-lgG4 (SEQ ID NO: 70), EV1018-N93Q-N95T-lgG4 (SEQ ID NO: 71 ), EV1018-lgG4-SP (SEQ ID NO: 72), EV1018-wt-lgG4-SP (SEQ ID NO: 73), EV1018-T97A-lgG4-SP (SEQ ID NO: 74), EV1018-T97V-lgG4-SP (SEQ ID NO: 75), EV1018-N95D-lgG4-SP (SEQ ID NO: 76), EV1018-N95E-lgG4-SP (SEQ ID NO: 77), EV1018-N95K-lgG4-SP (SEQ ID NO: 78), EV1018-N95Q-lgG4-SP (SEQ ID NO: 79) y EV1018-N93Q-N95T- lgG4-SP (SEQ ID NO: 80).

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena ligera, EV1018-wt-BI2 (Gl) (SEQ ID NO: 36), y una de las siguientes variantes de cadena pesada: EV1018 (SEQ ID NO: 10), EV1018-wt-lgG1 KO (SEQ ID NO: 1 1), EV1018-T97A-lgG1 KO (SEQ ID NO: 12), EV1018-T97 V-lgG1 KO (SEQ ID NO: 13), EV1018-N95D-lgG1 KO (SEQ ID NO: 14), EV1018-N95E lgG1 KO(SEQ ID NO: 15), EV1018-N95K IgGI KO (SEQ ID NO: 16), EV1018-N95Q IgGI KO (SEQ ID NO: 17), EV1018-N93Q-N95T IgGI KO (SEQ ID NO: 18), EV 1018-wt lgG1 -BI (SEQ ID NO: 19), EV1018-T97A lgG1 -BI (SEQ ID NO: 20), EV1018-T97V lgG1 -BI (SEQ ID NO: 21 ), EV1018-N95D lgG1-Bl (SEQ ID NO: 22), EV1018-N95E lgG1 -BI (SEQ ID NO: 23), EV1018-N95K lgG1 -BI (SEQ ID NO: 24), EV1018-N95Q lgG1 -BI (SEQ ID NO: 25), EV1018-N93Q-N95T lgG1 -BI (SEQ ID NO: 26), EV1018-T97A lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 27), EV1018-T97V lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 28), EV1018-N95D lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 29), EV1018-N95E l:gG1 -original-constante (SEQ ID NO: 30), EV1018-N95K lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 31 ), EV1018-N95Q lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 32), EV1018-N93Q- N95T lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 33), EV1018-wt-lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 38), EV1018-T97 A-lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 39), EV 018-T97V-lgG1 -KO- QVQL (SEQ ID NO: 40), EV1018-N95D-lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 41 ), EV1018- N95E lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 42), EV1018-N95K lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 43), EV1018-N95Q lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 44), EV1018-N93Q-N95T lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 45), EV1018-wt lgG1 -QVQL-BI (SEQ ID NO:46), EV 1018-T97 A IgG 1 -QVQL-BI (SEQ ID NO: 47), EV 1018-T97 V IgG 1 -QVQL-BI (SEQ ID NO: 48), EV1018-N95D lgG1 -QVQL-BI (SEQ ID NO: 49), EV10 8-N95E lgG1- QVQL-BI (SEQ ID NO: 50), EV1018-N95K lgG1 -QVQL-BI (SEQ ID NO: 51 ), EV1018-N95Q lgG1 -QVQL-BI (SEQ ID NO: 52), EV1018-N93Q-N95T lgG1 -QVQL- Bl (SEQ ID NO: 53), EV1018-lgG2 (SEQ ID NO: 54), EV 018-wt-lgG2 (SEQ ID NO: 55), EV1018-T97A-lgG2 (SEQ ID NO: 56), EV1018-T97V-lgG2 (SEQ ID NO: 57), EV1I018-N95D-lgG2 (SEQ ID NO: 58), EV1018-N95E-lgG2 (SEQ ID NO: 59), EV1Í018-N95K-lgG2 (SEQ ID NO: 60), EV1018-N95Q-lgG2 (SEQ ID NO: 61 ), EV1|018-N93Q-N95T-lgG2 (SEQ ID NO: 62), EV1018-lgG4 (SEQ ID NO: 63), EV1018^wt- lgG4 (SEQ ID NO: 64), EV1018-T97A-lgG4 (SEQ ID NO: 65), EV1018- T97V-lgG4 (SEQ ID NO: 66), EV1018-N95D-lgG4 (SEQ ID NO: 67), EV1018-N95E-lgG4 (SEQ ID NO: 68), EV1018-N95K-lgG4 (SEQ ID NO: 69), EV1018-N95Q-lgG4 (SEQ ID NO: 70), EV1018-N93Q-N95T-lgG4 (SEQ ID NO: 71), EV1018-lgG4-SP (SEQ ID NO: 72), EV1018-wt-lgG4-SP (SEQ ID NO: 73), EV1018-T97A-lgG4-SP (SEQ ID NO: 74), EV1018-T97V-lgG4-SP (SEQ ID NO: 75), EV1018-N95D-lgG4-SP (SEQ ID NO: 76), EV1018-N95E-lgG4-SP (SEQ ID NO: 77), EV1018-N95K-lgG4-SP (SEQ ID NO: 78), EV1018-N95Q-lgG4-SP (SEQ ID NO: 79) y EV 018-N93Q-N95T- lgG4-SP (SEQ ID NO: 80).

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena ligera, EV1018-wt-original-constante (SEQ ID NO: 37), y una de las siguientes vanantes de cadena pesada: EV1018 (SEQ ID NO: 10), EV1018-wt-lgG1 KO (SEQ ID NO: 1 1 ), EV1018-T97A-lgG1 KO (SEQ ID NO: 12), EV1018-T97V-lgG1 KO (SEQ ID NO: 13), EV1018-N95D-lgG1 KO (SEQ ID NO: 14), EV1018-N95E IgGI KO (SEQ ID NO: 15), EV1018-N95K IgGI KO (SEQ ID NO: 16), EV1018-N95Q IgGI KO (SEQ ID NO: 17), EV1018-N93Q-N95T IgGI KO (SEQ ID NO: 18), EV1018-wt lgG1- Bl (SEQ ID NO: 19), EV1018-T97A lgG1 -BI (SEQ ID NO: 20), EV1018-T97V lgG1- Bl (SEQ ID NO: 21 ), EV1018-N95D lgG1-BI (SEQ ID NO: 22), EV1018-N95E lgG1- Bl (SEQ ID NO: 23), EV1018-N95K lgG1 -BI (SEQ ID NO: 24), EV1018-N95Q lgG1- Bl (SEQ ID NO: 25), EV1018-N93Q-N95T lgG1 -BI (SEQ ID NO: 26), EV1018-T97A lgG1 -original-constante (SEQ ID NO. 27), EV1018-T97V lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 28), EV1018-N95D lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 29), EV1018-N95E lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 30), EV1018-N95K lgG1 -original-constante (SEQ ID NO. 31 ), EV1018-N95Q lgG1 -original-constante (SEQ ID NO. 32), EV1018-N93Q- N95T lgG -original-constante (SEQ ID NO: 33), EV1018-wt-lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 38), EV1018-T97A-lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 39), EV1018-T97 V-lgG1 -KO- QVQL (SEQ ID NO: 40), EV1018-N95D-lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 41 ), EV1018- N95E lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 42), EV1018-N95K lgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 43), EV1018-N95Q lgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 44), EV1018-N93Q-N95T lgG1 -KO-QVQL (SEQ ID NO: 45), EV1018-wt lgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO:46), EV1018-T97A lgG1 -QVQL-BI (SEQ ID NO: 47), EV1018-T97V lgG1 -QVQL-BI (SEQ ID NO: 48), EV1018-N95D lgG1 -QVQL-BI (SEQ ID NO: 49), EV1018-N95E lgG1- QVQL-BI (SEQ ID NO: 50), EV1018-N95K lgG1 -QVQL-BI (SEQ ID NO: 51 ), EV1018-N95Q lgG1 -QVQL-BI (SEQ ID NO: 52), EV 018-N93Q-N95T lgG1 -QVQL- Bi (SEQ ID NO: 53), EV1018-lgG2 (SEQ ID NO: 54), EV1018-wt-lgG2 (SEQ ID NO: 55), EV1018-T97A-lgG2 (SEQ ID NO: 56), EV1018-T97V-lgG2 (SEQ ID NO: 57), EV1018-N95D-lgG2 (SEQ ID NO: 58), EV1018-N95E-lgG2 (SEQ ID NO: 59), EV1018-N95K-lgG2 (SEQ ID NO: 60), EV1018-N95Q-lgG2 (SEQ ID NO: 61 ), EV1018-N93Q-N95T-lgG2 (SEQ ID NO: 62), EV1018-lgG4 (SEQ ID NO: 63), EV1018-wt-lgG4 (SEQ ID NO: 64), EV1018-T97A-lgG4 (SEQ ID NO: 65), EV1018-T97V-lgG4 (SEQ ID NO: 66), EV1018-N95D-lgG4 (SEQ ID NO: 67), EV1018-N95E-lgG4 (SEQ ID NO: 68), EV1018-N95K-lgG4 (SEQ ID NO: 69), EV1018-N95Q-lgG4 (SEQ ID NO: 70), EV1018-N93Q-N95T-lgG4 (SEQ ID NO: 71 ), EV1018-lgG4-SP (SEQ ID NO: 72), EV1018-wt-lgG4-SP (SEQ ID NO: 73), EV10 8-T97A-lgG4-SP (SEQ ID NO: 74), EV1018-T97V-lgG4-SP (SEQ ID NO: 75), EV1018-N95D-lgG4-SP (SEQ ID NO: 76), EV1018-N95E-lgG4-SP (SEQ ID NO: 77), EV1018-N95K-lgG4-SP (SEQ ID NO: 78), EV1018-N95Q-lgG4-SP (SEQ ID NO: 79) y EV1018-N93Q-N95T- lgG4-SP (SEQ ID NO: 80).

La invención proporciona numerosos anticuerpos EV1019 en si mismos y variaciones del anticuerpo EV 1019 como se resumen en la Tabla B. En ciertas modalidades, una cadena pesada contiene una o más sustituciones de aminoácido relativas a la secuencia de cadena pesada natural. En algunas modalidades, una cadena ligera contiene una o más sustituciones de aminoácido relativas a la secuencia de cadena ligera EV1019 natural. En algunas modalidades, una cadena pesada y una cadena ligera pueden contener una o más sustituciones de aminoácido.

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV 1019 (SEQ ID NO: 160), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019- wt-BI (SEQ ID NO: 203),, EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-orlginal- constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 21 3), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-wt-lgG1 -Bl (SEQ ID NO: 161 ), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019- wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt- original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S- BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), ÉV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-wt-lgG1 KO (SEQ ID NO: 162), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt- original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S- BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 2 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV10 9-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105G (SEQ ID NO: 163), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV 1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV 1019- wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-or¡ginal- constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27 A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105G-lgG1 -Bl (SEQ ID NO: 164), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV 019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105G- IgGI KO (SEQ ID NO: 165), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105S (SEQ ID NO: 166), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019- wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-original- constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV101Í9-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105S-lgG1 -Bl (SEQ ID NO: 167), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV10 9-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105S-IgGI KO (SEQ ID NO: 168), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV10 9-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV10 9-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV10 9-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105A (SEQ ID NO: 169), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV 1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV 1019- wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-original- constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105A-lgG1-Bl (SEQ ID NO: 170), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105A-IgGI KO (SEQ ID NO: 171), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO. 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105Q (SEQ ID NO: 172), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019- wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-original- constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105Q-lgG1- Bl (SEQ ID NO: 173), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105Q-IgGI KO (SEQ ID NO: 174), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV10 9-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105T (SEQ ID NO: 175), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019- wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV 019-wt-original- constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV 019-C105T-lgG1 -Bl (SEQ ID NO: 176), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105T-IgGI KO (SEQ ID NO: 177), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV10 9-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO. 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV10 9-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105M (SEQ ID NO: 178), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt- original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO:: 206), EV1019-N25S- BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019- N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105M-lgG1 -Bl (SEQ ID NO: 179), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105M-IgGI KO (SEQ ID NO: 180), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV10 9-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV 019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV 019-C105L (SEQ ID NO: 181 ), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV 1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV 1019- wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-original- constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105L-lgG1 -Bl (SEQ ID NO: 182), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV 019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019- N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105L-IgGI KO (SEQ ID NO: 183), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ¡D NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV10 9-lgG2 (SEQ ID NO: 222), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019- wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-original- constante (SEQ ID NO: 205), EV1019- N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-wt-lgG4 (SEQ ID NO: 223), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt- original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S- BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-wt-lgG4SP (SEQ ID NO: 224), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019- wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt- original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S- BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV 019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV 019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105G-lgG2 (SEQ ID NO: 225), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO. 204), EV 019-wt- original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S- BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105G-lgG4 (SEQ ID NO: 226), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-orig¡nal (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt- original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S- BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV 019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ l|D NO: 216), EV 019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105G-lgG4SP (SEQ ID NO: 227), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV10 9-C105S!-lgG2 (SEQ ID NO: 228), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt- original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S- BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV 1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105S-lgG4 (SEQ ID NO: 229), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt- original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S- BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105S-lgG4SP (SEQ ID NO: 230), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV 0 9-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105A-lgG2 (SEQ ID NO: 231 ), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt- original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S- BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 21 5), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV 019-C105A-lgG4 (SEQ ID NO: 232), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt- original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S- BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105A-lgG4SP (SEQ ID NO: 233), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-or¡ginal (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105Q-lgG2 (SEQ ID NO: 234), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt- original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S- BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105Q-lgG4 (SEQ ID NO: 235), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019- t-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt- original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S- BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 2 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID Np: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105Q-lgG4SP (SEQ ID NO: 236), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ). En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C 05T-lgG2 (SEQ ID NO: 237), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S- BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105T-lgG4 (SEQ ID NO: 238), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt- original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S- BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105T-lgG4SP (SEQ ID NO: 239), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019- t-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV10 9-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105M-lgG2 (SEQ ID NO: 240), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105M-lgG4 (SEQ ID NO: 241 ), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV 019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105M-lgG4SP (SEQ ID NO: 242), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV 019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C 05L-lgG2 (SEQ ID NO: 243), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV 0 9-wt- original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S- BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV10 9-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1 ), EV1019- N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV 1019-C 105L-lgG4 (SEQ ID NO: 244), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV 019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt- original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S- BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211 ), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019- N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019- S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la cadena pesada, EV1019-C105L-lgG4SP (SEQ ID NO: 245), y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-wt-original (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019- wt-original-constante (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019- N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 21 1), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019- S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) y EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221 ).

Adicionalmente, una región variable de una cadena pesada y una región variable de una cadena ligera se puede combinar para producir un fragmento Fab que une un antígeno. Tal combinación que retiene la misma o equivalente afinidad de antígeno es útil para producir varias versiones del fragmento de unión a antígeno, tal como fragmento variable monocatenario (scFv). An scFv es una fusión de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas, ligadas junto con un ligador corto (usualmente serina, glicina), y se conocen bien en la técnica.

De acuerdo con lo anterior, una región variable de cadena pesada EV 1018 se puede combinar con una región variable de cadena ligera EV1018. En algunas modalidades, la región variable de la cadena pesada y/o la cadena ligera puede ser una variante que contiene una o más alteraciones de aminoácido cuando se compara con al secuencia tipo natural de la cadena. En forma similar, una región variable de cadena pesada EV1019 se puede combinar con una región variable de cadena ligera EV1019. En algunas modalidades, la región variable de la cadena pesada y/o la cadena ligera puede ser una variante que contiene una o más alteraciones de aminoácido cuando se compara con la secuencia tipo natural de la cadena.

En algunas modalidades, una cualquiera de las siguientes regiones variables de cadena pesada 1018 (por ejemplo, tipo natural y variantes de la misma) se pueden combinar con la región variable de cadena ligera EV1018-VL-wt-original (SEQ ID NO: 364) para formar un fragmento de unión a antígeno que une hGM-CSF: EV1018-VH (SEQ ID NO: 348), EV1018-VH-wt (SEQ ID NO: 349), EV1018-VH-T97A (SEQ ID NO: 350), EV1018-VH-T97V (SEQ ID NO: 351 ), EV1018-VH-N95D (SEQ ID NO: 352), EV1018-VH-N95E (SEQ ID NO: 353), EV 018-VH-N95K (SEQ ID NO: 354), EV10 8-VH-N95Q (SEQ ID NO: 355), EV1018-VH-N93Q-N95T (SEQ ID NO: 356), EV1018-VH-T97A lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 357), EV1018-VH-T97V lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 358), EV1018-VH-N95D lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 359), EV1018-VH-N95E lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 360), EV10 8-VH-N95K lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 361 ), EV1018-VH-N95Q lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 362), y EV1018-VH-N93Q-N95T lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 363).

En algunas modalidades, una cualquiera de las siguientes regiones variables de cadena pesada 1018 (por ejemplo, tipo natural y variantes de la misma ) se pueden combinar con la región variable de cadena ligera, EV1018-VL-wt-BI (SEQ ID NO: 365) para formar un fragmento de unión a antígeno que une hGM-CSF: EV1018-VH (SEQ ID NO: 348), EV1018-VH-wt (SEQ ID NO: 349), EV1018-VH-T97A (SEQ ID NO: 350), EV1018-VH-T97V (SEQ ID NO: 351 ), EV1018-VH-N95D (SEQ ID NO: 352), EV1018-VH-N95E (SEQ ID NO: 353), EV1018-VH-N95K (SEQ ID NO: 354), EV1018-VH-N95Q (SEQ ID NO: 355), EV1018-VH-N93Q-N95T (SEQ ID NO: 356), EV1018-VH-T97A lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 357), EV1018-VH-T97V lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 358), EV1018-VH-N95D lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 359), EV1018-VH-N95E lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 360), EV1018-VH-N95K lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 361), EV1018-VH-N95Q lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 362), y EV1018-VH-N93Q-N95T lgG1 -original-constante (SEQ ID NO: 363).

En forma similar, en algunas modalidades, un fragmento de unión a antígeno de EV1019 comprende la región variable de cadena pesada, EV 1019-VH-wt (SEQ ID NO: 152) y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV 019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191 ), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ IlD NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO: 197), EV10 9-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV 019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201 ).

En algunas modalidades, un fragmento de unión a antígeno de EV 1019 comprende la región variable de cadena pesada, EV1019-VH-C105G (SEQ ID NO: 153) y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019- VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191 ), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201 ).

En algunas modalidades, un fragmento de unión a antígeno de EV1019 comprende la región variable de cadena pesada, EV1019- VH-C105 S (SEQ ID NO: 154) y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191 ), EV10 9-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO: 197), EV10 9-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV 019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201 ).

En algunas modalidades, un fragmento de unión a antígeno de EV1019 comprende la región variable de cadena pesada, EV1019- VH-C105 A (SEQ ID NO: 155) y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV 0 9-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191 ), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201).

En algunas modalidades, un fragmento de unión a antígeno de EV 1019 comprende la región variable de cadena pesada, EV1019-VH-C105T (SEQ ID NO: 156) y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019- VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191 ), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV10 9-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO: 197), EV1019- VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV10 9-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201 ).

En algunas modalidades, un fragmento de unión a antígeno de EV1019 comprende la región variable de cadena pesada, EV 1019- VH-C 105M (SEQ ID NO: 157) y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191 ), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV 019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV10 9-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201).

En algunas modalidades, un fragmento de unión a antígeno de EV1019 comprende la región variable de cadena pesada, EV1019-VH-C105Q (SEQ ID NO: 158) y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV 019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191 ), EV 019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV10 9-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV10 9-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201 ).

En algunas modalidades, un fragmento de unión a antígeno de EV1019 comprende la región variable de cadena pesada, EV1019-VH-C 05L (SEQ ID NO: 159) y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV 019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191 ), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO: 197), EV 019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201 ).

Variaciones dentro de la invención La presente invención incluye anticuerpos anti-hGM-CSF de longitud completa o sus porciones de unión a antígeno, o porciones de anticuerpos anti-hGM-CSF, cuando dos o más clases de ellos se administran al mismo tiempo. Por lo tanto, también se incluyen anticuerpo biespecífico multi-específico que reconoce el hGM-CSF en la presente invención.

Las variaciones del anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno se explican en la anterior descripción, pero las características descritas se pueden sustituir o convertir en el campo tecnológico sin que se aparte del alcance de la invención.

A saber, en el alcance de la presente invención, los siguientes anticuerpos o sus porciones de unión a antígeno se incluyen: (I) el anticuerpo de longitud completa y su porción de unión a antígeno (II) una porción del anticuerpo, y (III) el anticuerpo monoclonal humano recombinante, monoclonal anticuerpo(que incluye anticuerpo quimérico y anticuerpo humanizado), o su porción de unión a antígeno capaz de unir específicamente a hGM-CSF y neutralizar su bioactividad, en donde el anticuerpo monoclonal humano recombinante se obtiene mediante cualquier técnica conocida, con base en las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NOs: 4-9 y 330-335, SEQ ID NO: 364 y 0 365, y SEQ ID NO: 348-363, SEQ ID NO: 184-201 y SEQ ID NO: 152-159, que representa la región variable y CDR.

Cuando un anticuerpo específico o su porción de unión a antígeno producidos por el método anterior se aplica con base en por lo menos una secuencia de aminoácido seleccionada de cada grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 4-9, o 330-335 descritas aquí, el anticuerpo o su porción de unión a antígeno también se incorpora en la presente invención.

Listado de las variantes anticuerpo Las Tablas proporcionadas adelante suministran listados de cadenas de anticuerpo y fragmentos útiles para los anticuerpos EV1018 y EV1019, respectivamente.

Tabla A: Lista de Vanantes de Cadena Pesada y Cadena Ligera y Regiones variables para el Anticuerpo EV1018.

Variantes de Cadena Pesada EV1018 Variantes de Cadena Liner a EV1018 EV1018-N93Q-N95T IflGI- O-QVQL SEQ ID O:45 EV1018-wt lgG1-QVQL-BI SEO. ID NO:46 EV1018-T97A lgG1-QVQLrBI SEQ ID NO:47 EV1018-T97V lgG1-QVQL-BI SEQ ID OI48 EV101&-N9SD lqGI-QVQL-01 SEQ ID NO:49 EV1018-N95E lgG1-QVQL-BI SEQ ID NO:50 EV1018-N95K lgG1-QVQL-BI SEQ ID NO:51 EV1018-N95Q IgG -QVQL-BI SEQ ID NO:52 EV1018-N93Q-N95T IflGI-QVQL-BI SEQ 10 10:53 EV1018-lgG2 SEQ ID NO:S4 EV1018-wt-lqG2 SEQ ID NO:55 EV1018-T97A-lgG2 SEQ ID NO:56 EV1018-T97V-lgG2 SEQ ID NO:57 EV1018-N95D-lgG2 SEQ ID NO:58 EV1018- 95E-lgG2 SEQ ID NO:59 EV1018-N95K-lgG2 SEQ ID NO:60 EV1018-N95Q-lgG2 SEQ ID NO:61 EV1018-N93Q-N95T-lqG2 SEQ ID NO:62 EV1018- gG SEQ ID NO:63 EV1018-wWgG4 SEQ ID NO:64 EV101B-T97A-lgG4 SEQ ID NO:65 EV1018-T97V-lgG4 SEQ ID NO:66 EV1018-N95D-lgG4 SEQ ID NO:67 EV1018-N95E-lgG4 SEQ ID NO:68 EV1018-N95K-lgG4 SEQ ID NO:69 EV1018-N95Q-lgG4 SEQ ID NO:70 EV1018-N93Q-N95T-lgG4 SEQ ID NO:71 EV1018-lgG4-SP SEQ ID NO:72 EV1018-wt-lgG4-SP SEQ ID NO:73 EV1018-T97A-lqG4-SP SEQ ID NO:74 EV1018-T97V-lgG4-SP SEQ ID NO:75 EV 018-N95D-lgG4-SP SEQ ID NO:76 EV1018-N95E-lgG4-SP SEQ ID NO:77 EV101 «-N<KK-lflG- SP SEQ ID NO-7B EV1018-N95Q-lqG4-SP SEQ ID NO:79 EV1018-N93Q-Ñ95T-lgG4-SP SEQ ID NO:80 EV1018 SEQ ID NO:81 EV1018-wt-lqG1KO SEQ ID NO:82 EV1018-T97A-lgG1KO SEQ ID NO:83 EV1018-T97V-lgG1KO SEQ ID NO:84 EV1018-N95D-lgG1KO SEQ ID NO:85 EV1018-N95E IgGIKO SEQ ID NO:86 EV1018-N95K IgGIKO SEQ ID NO:87 EV1018-N95O IgGIKO SEQ ID NO:88 EV1018-N93Q- 95T IqGIKO SEQ ID NO:89 EV1018- l lgG1-BI SEQ ID NO:90 EV1018-T97A lgG1-8l SEQ ID NO.91 EV1018-T97V lgG1-BI SEQ ID NO:92 EV1018-N95D IgGI-BI SEQ ID N0.93 EV 018-N95E IgGI-BI SEQ ID NO:94 EV1018-N95K IgGI-BI SEQ ID NO:95 EV1018-N95Q IgGI-BI SEQ ID NO:96 EV1018-N93Q-N95T IgGI-BI SEQ ID NO:97 EV1018-T97A lgG1 -original- constante SEQ ID NO:98 EV1018-T97V lgG1 -original-constante SEQ ID NO:99 EV1018-N95D IqGl -original-constante SEQ ID NO: 100 EV1018-N95E IgGI-original-constarrte SEQ ID NO:101 EV1018-N95K lgG1 -original-constarte SEQ ID NO: 102 EV1018-N95Q lgG1 -original-constante SEQ ID NO:103 EV1018-N93Q-N95T tgGI-original- SEQ ID NO: 104 constante EV1018-wl-!gGl -KO-QVQL SEQ ID NO.109 EV1018-T97A-lgG1-KO-QVQL SEQ ID NO: 110 constante Tabla B: Lista de Variantes de Cadena Pesada y Cadena Ligera y Regiones Variables para el Anticuerpo EV1019.

Variantes de Cadena Pesada EV1019 Variantes de Cadena Ligera EV1019 EV1019-VH-W1 SEQ I0 NO:152 EV1019-VL-W1 SEQ ID ??: ß4 EV1019-VH-C105G SEQ ID NO: 53 EV1019-VL-BI SEQ ID NO. 85 EV1019-VH-C105S SEQ ID NO:154 EV1019A0.-N25S SEQ ID NO:186 EV1019-VH-C105A SEQ ID NO:155 EV1019-VL-BI-N25S SEQ ID NO:187 EV1019-VH-C105T SEQ ID NO:156 EV1019-VL-N25G SEQ ID NO:188! EV1019-VH-C105M SEQ ID N0:157 EV1019-VL-8t-N25G SEQ ID NO:189 EV1019-VH-C105Q SEQ ID NO: 156 EV1019-VL-N25T SEQ ID NO: 90 EV1019-VH-C105L SEQ ID NO:159 EV1019-VL-8I-N25T SEQ ID NO:19 EV1019 SEQ ID NO: 160 EV1019-VL-N25R SEQ ID NO: 192 EV1018-Wt-lgG1-BI SEQ ID N0:161 EV1019-VL-BI-N25R SEQ ID NO: 193 EV1019- t-lqG1KO SEQ ID NO:162 EV1019-VI-N25Q SEQ ID NO.19 EV1019-C1O5G SEQ ID 0:163 ???019-??-?µ 25? SEQ ID NQ:195 EV1019-C105G-»gG1-BI SEQ ID NO:164 EV1019-VL-S27N SEQ ID NO:196 EV1019-C1O5G-lgG1 KO SEQ ID NO: 165 EV1019-VL-BI-S27N SEQ 10 N0:197 EV1019-C105S SEQ ID O:166 EV1019-VL-S27G SEQ ID NO: 198 EV1019-ClO5S-leG1-6l SEQ ID NO: 167 EV1019-VL-BI-S27G SEQ ID N0:199 EV1019-C1O5S-lqG1KO SEQ ID NO:168 EV1019-VL-S27A SEQ ID NO:200 EV1019-C105A SEQ ID NO: 169 EV1019-VI-BI-S27A SEQ ID NQ:201 eV1019-C1O5A-lflGl-BI SEQ ÍD NO:170 EV1Q19-wt-oríQinal SEQ ID NO:202 EV1019-C105A-lgG1 KO SEQ ID O.-171 EV1019-wt-BI SEQ ID NO:203 EV1019-C105Q SEQ ID NO:172 EV1019-W1-BI2 SEQ ID NO-204 EV1019-C105Q-lqG1-BI SEQ ID NO:173 EV1019- wt -original- constante SEQ ID NO:205 EV1019-C105Q-lgG1KO SEQ ID NO:1 4 EV1019-N25S SEQ ID NO_208 EV1019-C105T SEQ ID NO: 175 EV1019-N25S-8I2 SEQ ID NO:207 EV1019-C 105T-lgG1 -ß? SEQ 10 NO: 176 EV1019-N25G SEQ ID NO:208 EV1019-C105T-lflG1KO SEQ 10 NO:177 EV1019-N25G-BI2 SEQ ID NO:209 EV1019-C105M SEQ 10 NO:178 . EV1019-N25T SEQ ID NO:210 EV1019-C105M-lgG1-BI SEQ ID NO: 179 EV1019-N25T-BI2 SEQ ID N0211 EV1019-C105 -lqG1KO SEQ ID NO: 180 EV1019-N25R SEQ ID O:212 EV1019-C105L SEQ ID NO:181 EV1019-N25R-BI2 SEQ ID N0 213 EV1019-C105L-lgG1-BI SEQ ID NO.-182- EV1019-N25Q SEQ ID NO :214 EV1019-C105L-lqG1KO SEQ ID N0.183 EV1019-N25Q-BI2 SEQ 10 N0215 EV1019-lflG2 SEQ ID NO:222 EV1019-S27N SEQ ID NO:216 EV1019-wt-lflG4 SEQ ID N0.223 EV101 -S27N-BI2 SEQ ID NO:217 EV1019-wt-toG4SP SEQ ID NO:224 EV1019-S27G SEQ ID N0218 EV1019-C105G-lgG2 SEQ ID NO:225 EV1019-S27G-6I2 SEQ IDiNO:219 EV1019-C105G-I9G4 SEO ID NO:226 EV1019-S27A SEQ ID. 0220 EV1019-C105G-(gG4SP SEQ ID NO-227 EV1019-S27A-BI2 SEQ ID NO:221 EV1019-C105S-lflG2 SEQ ID NO:228 EV10l9-vrt-original SEQ ID NO 270 EV1019-C105S-lgG4 SEQ ID NO:229 EV 019-wt-BI SEQ ID N0:271 EV1019-C105S-lqG4SP SEQ ID NO:230 EV 019-wt-BI2 SEQ ID N0372 EV1019-C105A-lgG2 SEQ 10 NO:231 EV1019-wl-orifl¡nal- constante SEQ 1D N0 273 EV1019-ClO5A-lgG4 SEQ ID NO:232 EV1019-N25S SEQ ID NO:274 EV101 S-C 105A-lgG4SP SEQ ID NO:233 EV1019-N25S-BI2 SEQ ID, NO:275 EV1019-C105Q-lgG2 SEQ ID NO:234 EV1019-N25G SEQ ID NO;2,76 EV1019-C105Q-lgG4 SEQ ID NO:235 EV1019-N25G-BI2 SEQ ID N0:27Í7 EV1019-C105Q-lgG4SP SEQ ID NO:236 EV1019-N25T SEQ ID: N0:278 EV1019-C105T-lgG2 SEQ 10 NO:237 EV1019-N25T-BI2 SEQ ID ÑO:279 EV1019-CtOST-lgG4 SEQ ID NO:238 EV1019-N25R SEQ ID NO 280 EV1019-C105T-lgG4SP SEQ ID NO:239 EV1019-NZ5R-BI2 SEQ 10 NO:281 EV1019-C10S -lgG2 SEQ ID NO:240 EV1019-N25Q SEQ I0 N0282 EV1019-Cl05M-lgG4 SEQ ID NO:241 EV1019-N25Q-BI2 SEQ ID N0:283 EV1019-C105M-lgG4SP SEQ ID NO:242 EV 019-S27N SEQ ID N0284 EV1019-C105L-lgG2 SEQ ID NO:243 EV1019-S27N-BI2 SEQ ID NO:285 EV1019-C105L-lgG4 SEQ ID N0.244 EV1019-S27G SEQ ID NQÍ288 EV1019-C105L-lgG4SP SEQ ID NO:245 EV1019-S27G-BI2 SEQ ID NO:287 EV1019 SEQ ID N0.246 EV1019-S27A SEQ ID(NO¾88 EV1019-wl-lgG1-BI SEQ ID NO:247 EV1019-S27A-BI2 SEQ ID !NO:289 Varías modalidades de la presente invención Se describen en más detalle las siguientes modalidades de la invención.

La descripción de las modalidades se organiza en una forma conocida de la redacción de la reivindicación de patente debido a que esta parece ser útil para ejemplificar en la especificación las enseñanzas de las que se confiere el alcance de la protección que se puede derivar de esta solicitud de patente. 1. Una modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo reconoce ELYK (SEQ ID NO: 2) y TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) en hGM-CSF (SEQ ID NO: 1). 2. Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, caracterizada porque dicho anticuerpo comprende: (a) una cadena pesada que comprende una secuencia que contiene VH-CRD1 de consenso, una secuencia que contiene VH-CRD2 de consenso, y una secuencia que contiene VH-CRD3 de consenso, en donde: (i) la secuencia que contiene VH-CRD1 de consenso es FTFSXiX2MH (SEQ ID NO: 314), en donde Xi es Y o H, y X2 es G o A, (ii) la secuencia que contiene VH-CRD2 de consenso es X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 315), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X3 es L o V, X4 es T o I, X5 es Y o W, X6 es R o K, X7 es F o Y, y X8 es R o K, y (iii) la secuencia que contiene VH-CRD3 de consenso es EXnX9GX10XnXnDXn (SEQ ID NO: 316), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, Xg es M o V, y Xio es A o G; y (b) una cadena ligera que comprende una secuencia que contiene VL- CDR1 de consenso, una secuencia que contiene VL-CDR2 de consenso, y una secuencia que contiene VL-CDR3 de consenso, en donde: (i) la secuencia que contiene VL-CDR1 de consenso es XnGNXnXnNIGSXiiAVG (SEQ ID NO: 317), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, y Xn es H o Y, (ii) la secuencia que contiene VL-CDR2 de consenso es GX12SPX13SG (SEQ ID NO: 318), en donde X12 es R o K, y X13 es A o P, y (ii¡) la secuencia que contiene VL-CDR3 de consenso es ST DSX14LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), en donde X es R o S, y X15 es V o L.

En una modalidad adicional el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de la modalidad 1 ó 2 une específicamente el hGM-CSF, preferiblemente con un KD de menos de 450 pM. 3. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo la modalidad 1 ó 2 que en adición a las características proporcionadas bajo la modalidad 1 ó 2, une a GM-CSF humano con un KD de menos de 400 pM. 4. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo la modalidad 3, en donde el KD es menor de 160 pM. 5. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1-4, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno allí neutraliza la actividad de hGM-CSF, de tal manera que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene un valor IC50 de menos de 100 pM como se determina en un ensayo de proliferación TF-1 en ED80. 6. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo la modalidad 5, en donde el valor ICso es menor de 40 pM o menos de 30 pM o menos de 25pM. Los anticuerpos preferidos adicionales o fragmento de unión a antígeno de los mismos de la invención tienen valores IC50 de menos de 20 pM, menos de 25pM, menos de 3OpM o menos de 40 pM, como se determina en un ensayo de proliferación TF-1 en ED80. 7. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo la modalidad 5, en donde el valor IC50 es menor de 20 pM. 8. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1 -7, en donde la cadena pesada se selecciona del grupo que consiste de gamma 1 (??), gamma 2 (?2), gamma 3 (?3), y gamma 4 (?4). 9. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1 -8, en donde la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 10-33, 38-80, 160-183, 222-244, y 245. 10. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1 -9, en donde la cadena ligera es una cadena ligera lambda. 1 1. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en la modalidad 10, en donde la cadena ligera lambda comprende por lo menos una o ambas de las siguientes sustituciones de aminoácidos: R100G o A153G. 12. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1 -1 1 , en donde la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 34-37, 202-220, y 221 . 13. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1 -9, en dd;rjidé la cadena ligera es una cadena ligera kapa. 14. Otra modalidad es un anticuerpo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1-13, en donde la cadena pesada se selecciona del grupo que consiste de gamma 1 (??), gamma 2 (?2), gamma 3 (?3), y gamma 4 (?4), y en donde la cadena ligera es una cadena ligera lambda. 15. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1 -13, en donde la cadena pesada comprende una o más sustituciones de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de Q3E, T97A, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164A, y L165A. 16. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1 -15, en donde la VH-CDR1 comprende la secuencia de aminoácido SYGMH (SEQ ID NO: 4) o SHAMH (SEQ ID NO: 333). 17. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1 -16, en donde la VH-CDR2 comprende la secuencia de aminoácido LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) o VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334). 18. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1 -17, en donde la VH-CDR3 comprende la secuencia de aminoácido ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) o EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335). 19. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1 -18, en donde la VL-CDR1 comprende la secuencia de aminoácido IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) o SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330). 20. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1-19, en donde |a VL-CDR2 comprende la secuencia de aminoácido GRSPPS (SEQ ID NO: 8) o GKSPAS (SEQ ID NO: 331). 21. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1-20, en donde la VL-CDR3 comprende los residuos de aminoácido STWDSSLSAW (SEQ ID NO: 9) o STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332). 22. Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende 6 CDR diferentes, en donde las secuencias de los 6 CDR son SEQ ID NOs: 4-9. En una modalidad adicional el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de la modalidad 22 une específicamente hGM-CSF, preferiblemente con un KD de menos de 450 pM, preferiblemente 400 pM o 160 pM. 22A. Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo la modalidad 1 , en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo cualquiera de i las modalidades 2-22. 23. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo la modalidad 22, en donde dicho anticuerpo comprende (i) una cadena pesada o fragmento del mismo seleccionado del gnjpo que consiste de gamma 1 (yi), gamma 2 (Y2) , gamma 3 (Y3), y gamma 4 (?4), y ¡(ii) una cadena ligera que es una cadena ligera kapa. 24. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo la modalidad 22, en donde dicho anticuerpo comprende (i) una cadena pesada o fragmento del mismo seleccionado del grupo que consiste de gamma 1 (??), gamma 2 (?2), gamma 3 (Y3), y gamma 4 (?4), y (ii) una cadena ligera que es una cadena ligera lambda. 25. Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que une específicamente hGM-CSF, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende 6 CDR diferentes, en donde las secuencias de los 6 CDR son SEQ ID NOs: 330-335. 26. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo la modalidad 25, en donde dicho anticuerpo comprende (i) una cadena pesada o fragmento del mismo seleccionado del grupo que consiste de gamma 1 (??), gamma 2 (?2), gamma 3 (?3), y gamma 4 (?4), y (ii) una cadena ligera que es una cadena ligera kapa. 27. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo el modalidad 25, en donde dicho anticuerpo comprende (i) una cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de gamma 1 (??), gamma 2 (?2), gamma 3 (?3), y gamma 4 (?4), y (ii) una cadena ligera que es una cadena ligera lambda. 28. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1 -27, que comprende adicionalmente una secuencia de señal. 29. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo la modalidad 28, en donde la secuencia de señal se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NOs: 324, 325 y 326. 30. Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, dicho anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de cadena pesada y una cadena ligera que tiene una secuencia de cadena ligera, en donde la secuencia de cadena pesada es la SEQ ID NO: 10 ó una variante de la misma seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 1 1 -33, 38-79, y 80, y en donde la secuencia de cadena ligera es la SEQ ID NO: 34. 31 . Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, dicho anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de cadena pesada y una cadena ligera que tiene una secuencia de cadena ligera, en donde la secuencia de cadena pesada es la SEQ ID NO: 10 o una variante de la misma seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 1 1 -33, 38-79, y 80, y en donde la secuencia de cadena ligera es la SEQ ID NO: 35. 32. Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, dicho anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de cadena pesada y una cadena ligera que tiene una secuencia de cadena ligera, en donde la secuencia de cadena pesada es la SEQ ID NO: 10 ó una variante de la misma seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 1 1 -33, 38-79, y 80, y en donde la secuencia de cadena ligera es la SEQ ID NO: 36. 33. Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, dicho anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de cadena pesada y una cadena ligera que tiene una secuencia de cadena ligera, en donde la secuencia de cadena pesada es la SEQ ID NO: 10 o una variante de la misma seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 1 1 -33, 38-79, y 80, y en donde la secuencia de cadena ligera es la SEQ ID NO: 37. 34. Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, dicho anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de cadena pesada y una cadena ligera que tiene una secuencia de cadena ligera, en donde la secuencia de cadena pesada es la SEQ ID NO: 160 ó una vanante de la misma seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 161 -244 y 245, y en donde la secuencia de cadena ligera es la SEQ ID NO: 202 ó una variante de la misma seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 203-220 y 221. 35. Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada, en donde la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena' pesada es la SEQ ID NO: 152 o una variante de la misma seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 153-158 y 159, y una región variable de cadena ligera, en donde la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera es la SEQ ID NO: 184 o una variante de la misma seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 185-200 y 201. 36. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo la modalidad 35, en donde la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada es la SEQ ID NO: 152. 37. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo la modalidad 35, en donde la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera es la SEQ ID NO: 184. 38. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo la modalidad 35, en donde la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada es la SEQ ID NO: 152, y en donde la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera es la SEQ ID NO: 184. 39. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del í mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 35-38, en donde dicho anticuerpo pertenece a la clase (subclase) IgGi(A). 40. Otra modalidad es un anticuerpo monocional anti-hGM-CSF aisiado o fragmento de unión a antígeno del mismo, dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada, en donde la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada es la SEQ ID NO: 348 o una variante de la misma seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 349-362 y 363, y una región variable de cadena ligera, en donde la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera es la SEQ ID NO: 364 o SEQ ID NO: 365. 41. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo la modalidad 40, en donde la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada es la SEQ ID NO: 348. 42. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo la modalidad 40, en donde la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera es la SEQ ID NO: 364. 43. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo la modalidad 40, en donde la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera es la SEQ ID NO: 365. 44. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 40-43, en donde dicho anticuerpo pertenece a la clase (subclase) IgG^A). 45. Otra modalidad es un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo monoclonal anti- hGM-CSF o fragmento de unión a antigeno del mismo como se describe bajo las modalidades 1-44. 46. Otra modalidad es un ácido nucleico como se describe bajo la modalidad 45, en donde el ácido nucleico es ADN. 47. Otra modalidad es un vector que comprende el ADN como se describe bajo la modalidad 46. 48. Otra modalidad es una célula anfitriona que comprende el vector como se describe bajo la modalidad 47, en donde el vector es un vector de expresión. 49. Otra modalidad es un equipo que comprende: (a) el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1 -44; y (b) uno o más recipientes que contienen el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo. 50. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1-44, para uso en medicina. 51. Otra modalidad es una composición que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1 -44, y un portador farmacéuticamente aceptable. 52. Otra modalidad es una composición como se describe en la modalidad 51 , que comprende adicionalmente un segundo anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que une hGM-CSF, de tal manera que la composición comprende una pluralidad de dichos anticuerpos, una pluralidad de dicho fragmentos de unión a antígeno, o por lo menos un dicho anticuerpo y por lo menos un dicho fragmento de unión a antígeno, cada uno de los cuales de une a hGM-CSF. 53. Otra modalidad es una composición como se describe en la modalidad 52, en donde por lo menos uno de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos es un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 10- 80, 152-245, 320-323, 348-364, y 365. 54. Otra modalidad es un equipo que comprende la composición como se describe bajo cualquiera de las modalidades 51-53, y uno o más recipientes qüe contienen la composición. 55. Otra modalidad es un equipo como se describe bajo el modalidad 49 o modalidad 54, que comprende adicionalmente una instrucción. 56. Otra modalidad es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o la composición como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1 -44 y 51-54, para la fabricación o preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con la sobreexpresión de hGM-CSF en un sujeto, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo une el hGM-CSF y es capaz de neutralizar la actividad hGM- CSF. 57. Otra modalidad es un uso como se describe bajo el modalidad 56, en donde la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), asma, fibrosis quística, enfermedad del pulmón intersticial, rinitis, artritis y artropatías relacionadas, soriasis, leucemia mieloide, y esclerosis múltiple. 58. Otra modalidad es un uso como se describe bajo el modalidad 56 ó 57, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se administra al sujeto en una dosis que no excede 500 mg. 59. Otra modalidad es a uso del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o la composición como se describe bajo cualquiera de las modalidades 1 -44 y 51-53, para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con la sobreexpresión de hGM-CSF en un sujeto, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo une el hGM-CSF y es capaz de neutralizar la actividad de hGM-CSF. 60. Otra modalidad es un uso como se describe bajo el modalidad 59, en donde la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), asma, fibrosis quística, enfermedad del pulmón intersticial, rinitis, artritis y artropatías relacionadas, soriasis, leucemia mieloide, y esclerosis múltiple. 61 . Otra modalidad es un uso como se describe bajo el modalidad 59 ó 60, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se administra al sujeto en una dosis que no excede 500 mg. 62. Otra modalidad es un epítopo de hGM-CSF en los polipéptidos como se establece en la SEQ ID NOs: 2 y 3, en donde el epítopo se reconoce por el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe bajo el moalidad 22 ó 25, y en donde las secuencias de polipéptido representan un segmento discontinuo de hGM-CSF (SEQ ID NO: 1 ). 63. Otra modalidad es un epítopo que es un segmento discontinuo de: GM- CSF humano, en donde el epítopo comprende los residuos de aminoácido 77-80 de G -CSF humano (SEQ ID NO: 1) y residuos de aminoácido 95-104 del GM-CSF humano (SEQ ID NO: 1 ), y se reconoce por un anticuerpo monoclonal anti-hG -CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende 6 CDR diferentes como se establece en la SEQ ID NOs: 4-9 o SEQ ID NOs: 330-335. 64. Otra modalidad es un método para producir un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo que une hGM-CSF, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende por lo menos una secuencia que contiene Vh-CDR1 de consenso, una secuencia que contiene VH-CRD2 de consenso, una secuencia que contiene VH-CRD3 de consenso, una secuencia que contiene V|_-CDR1 de consenso, una secuencia que contiene VL-CDR2 de consenso, y una secuencias de consenso que contiene VL-CDR3, en una célula anfitriona, el método comprende: (i) obtener la célula anfitriona que comprende por lo menos una secuencia de ADN que codifica por lo menos la secuencia que contiene VH-CRD1 de consenso, la secuencia que contiene VH-CRD2 de consenso, la secuencia que contiene VH-CRD3 de consenso, la secuencia que contiene VL-CDR1 de consenso, la secuencia que contiene VL-CDR2 de consenso, y la secuencia que contiene VL-CDR3 de consenso, en donde: (a) la secuencia que contiene VH-CRD1 de consenso es FTFSXiX2MH (SEQ ID NO: 314), en donde X1 es Y o H, y X2 es G o A, (b) la secuencia que contiene VH-CRD2 de consenso es X3X4X5HXnGXnX6KX7YADS X8G (SEQ ID NO: 315), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, X3 es L o V, X4 es T o I, X5 es Y o W, X6 es R o K, X7 es F o Y, y X8 es R o K, (c) la secuencia que contiene VH-CRD3 de consenso es EXnXgGXioXnXnDXn (SEQ ID NO: 316), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, Xg es M o V, y X10 es A o G, (d) la secuencia que contiene VL-CDR1 de consenso es XnGNXnXnNIGSX AVG (SEQ ID NO: 317), en donde cada Xn es independientemente cualquier aminoácido de ocurrencia natural, y X es H o Y, (e) la secuencia que contiene VL-CDR2 de consenso es GX12SPXBSG (SEQ ID NO: 318), en donde Xi2 es R o K, y ?? 3 es A o P, y (f) la secuencia que contiene VL-CDR3 de consenso es STWDSXi4LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), en donde X14 es R o S, y Xi5 es V o L; y (ii) cultivar la célula anfitriona bajo condiciones adecuadas para expresión de dicho ADN y producción del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. 65. Otra modalidad es un método como se describe bajo la moalidad 64, en donde el por lo menos un ADN codifica una cadena pesada o porción de la misma y una cadena ligera o porción de la misma, en donde la cadena pesada o porción de la misma tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 10-33, 38-80, 152-183, 222-245, 348-362, y 363, y en donde la cadena ligera o porción de la misma tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 34-37, 184-221 , 364, y 365. 66. Otra modalidad es un método como se describe bajo la modalidad 64 ó 65, que comprende adicionalmente aislar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. 67. Otra modalidad es un método como se describe bajo cualquiera de las modalidades 64-66, que comprende adicionalmente preparar una composición que comprende dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y un portador farmacéuticamente aceptable. 68. Otra modalidad es un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica una VH-CDR1 , una VH-CDR2, y una VH-CDR3, en donde: VH-CDR1 es SYGMH (SEQ ID NO: 4) o SHAMH (SEQ ID NO: 333), VH-CDR2 es LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) o VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334), y VH-CDR3 es ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) o EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335). 69. Otra modalidad es un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica una VL-CDR1 , una V|.-CDR2, y una VL-CDR3, en donde.

VL-CDR1 es IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) o SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330); VL-CDR2 es GRSPPSG (SEQ ID NO: 8) o GKSPASG (SEQ ID NO: 331 ); y VL-CDR3 es STWDSSLSAW (SEQ ID NO: 9) o STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332). 70. Otra modalidad es un método para identificar una molécula que üne el epítopo como se describe bajo la modalidad 62 ó 63, que comprende (i) poner en contacto una muestra biológica o una colección de péptido con una sonda que comprende el epítopo; (ii) aislar una molécula que une específicamente la sonda; y (iii) identificar la molécula. 71. Otra modalidad es un método como se describe bajo la modalidad 70, que comprende adicionalmente: (iv) producir la molécula de (iii). 72. Otra modalidad es un método como se describe bajo la modalidad 70 ó 71 , en donde la molécula es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo. 73. Otra modalidad es un método como se describe bajo cualquiera de las modalidades 70-72, en donde la sonda comprende adicionalmente un marcador detectable. 74. Otra modalidad es un método como se describe bajo cualquiera de las modalidades 70-73, en donde se inmoviliza la sonda. 75. Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno capaz de unir a hGM-CSF (hGM-CSF) y neutralizar la bioactividad de hGM-CSF (hGM-CSF), caracterizado porque el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno tiene una región de determinación de complementariedad (CDR) representada por una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 4 a 9. 76. Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno capaz de unir a hGM-CSF y neutralizar la bioactividad de hGM-CSF, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o la porción de unión a antígeno tiene una región de determinación de complementariedad (CDR) representada por una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 330 a 335. 77. Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno como se describe bajo la modalidad 75 ó 76, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno tiene una secuencia de aminoácido en la que uno o más aminoácidos se sustituyen, eliminan, insertan o agregan en la región de determinación de complementariedad (CDR). 78. Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno como se describe bajo la modalidad 75 a la 77, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porció;n de unión a antígeno inhibe la proliferación de células TF-1 por aproximadamente 50% en la concentración de aproximadamente 14 pM, cuando proliferan las células TF-1 mediante la inducción de hGM-CSF. 79. Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno como se describe bajo la modalidad 78, caracterizada porque the anti- hGM-CSF monoclonal anticuerpo o su porción de unión a antígeno inhibe la proliferación de células dendríticas de sangre periférica. 80. Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno como se describe bajo la moalidad 78, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal anti- hGM-CSF o su porción de unión a antígeno tiene una alta afinidad para hGM-CSF con valor KD de 4x10"10 M o menos. 81 . Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno como se describe bajo la modalidad 75 a la 80, caracterizado porque el anticuerpo pertenece a clase (subclase) lgG1 (?). 82. Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno como se describe bajo la modalidad 75 a la 81 , caracterizado porque el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF es un anticuerpo monoclonal humano. 83. Otra modalidad es una composición medicinal para una enfermedad originada por hGM-CSF que comprende: el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o la porción de unión a antígeno como se describe bajo la modalidad 75 a la 82, y un portador farmacéuticamente aceptable. 84. Otra modalidad es una composición medicinal como se describe bajo la modalidad 83, caracterizada porque la enfermedad originada por una producción excesiva de hGM-CSF es una cualquiera seleccionada del grupo que consiste de: (a) enfermedades alérgicas tales como asma, atopia, y polinosis, (b) rechazo de injerto, enfermedad del injerto contra el anfitrión (GVHD), y (c) enfermedades autoinmunes taies como artritis reumatoide. 85. Otra modalidad es un ácido desoxirribonucleico aislado (ADN) que codifica un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno capaz de unir a hGM-CSF y neutralizar la bioactividad de hGM-CSF, caracterizado porque el ADN aislado codifica una secuencia de aminoácido que comprende por lo menos una seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 4 a 9. 86. Otra modalidad es un ADN aislado que codifica un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno capaz de unir a hGM-CSF y neutralizar la bioactividad de hGM-CSF, caracterizado porque el ADN aislado codifica una secuencia de aminoácido que comprende por lo menos una seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 330 a 335. 87. Otra modalidad es un ADN aislado capaz de hibridar bajo condiciones rigurosas con el ADN como se describe bajo la modalidad 85 ó 86. 88. Otra modalidad es un vector caracterizado porque el ADN aislado como se describe bajo cualquiera de las modalidades 85 a 87 se incorpora aquí. 89. Otra modalidad es una célula anfitriona caracterizada porque se introduce aquí el vector de expresión recombinante como se describe bajo la modalidad 88. 90. Otra modalidad es un método para mejorar la actividad, caracterizado porque las múltiples clases de los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF o sus porciones de unión a antígeno específicas para un mismo antígeno particular se administran simultáneamente. 91 . Otra modalidad es un método para mejorar la actividad como se describe bajo la modalidad 90, caracterizada porque las múltiples clases de los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF o sus porciones de unión a antígeno comprenden dos o más tipos de anticuerpos o sus porciones de unión a antígeno seleccionados de los siguientes (a) y (b X): (a) un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno que tiene una región de determinación de complementariedad (CDR) representada por una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NOs: 4 a 9, SEQ ID NOs: 330 a 335, SEQ ID NOs: 336 a 341 , o SEQ ID NOs: 342 a 347, y que es específica para el hGM-CSF, (b) un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno de (a) que tiene una secuencia de aminoácido en la que uno o más aminoácidos se sustituyen, eliminan, insertan o agregan, y que es específica para hGM-CSF. 92. Otra modalidad es un método para mejorar la actividad como se describe bajo la modalidad 91 , caracterizada porque los dos o más tipos de anticuerpos o sus porciones de unión a antígeno inhiben la proliferación de células TF-1 por 80% o más a una concentración de aproximadamente 55 pM cada una, cuando proliferan las células TF-1 mediante la inducción de hGM-CSF. 93. Otra modalidad es una composición medicinal o composición de fármaco veterinario que comprende: múltiples clases de los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF o sus porciones de unión a antígeno específicas para un mismo antígeno particular, y un portador farmacéuticamente aceptable. 94. Otra modalidad es una composición medicinal o la composición de fármaco veterinario como se describe bajo la modalidad 93, caracterizada porque las múltiples clases de los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF o sus porciones de unión a antígeno comprenden dos o más tipos de anticuerpos o sus porciones de unión a antígeno seleccionados de los siguientes (a) y (b): (a) un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno que tiene una región de determinación de complementariedad (CDR) representada por una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NOs: 4 a 9, SEQ ID NOs: 330 a 335, SEQ ID NOs: 336 a 341 , o SEQ ID NOs: 342 a 347, y que es específica para el hGM-CSF, (b) un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o su porción de unión a antígeno de (a) que tiene una secuencia de aminoácido en la que uno o más aminoácidos se sustituyen, eliminan, insertan o agregan, y que es específica para hGM-CSF. 95. Otra modalidad es una composición medicinal o la composición de fármaco veterinario como se describe bajo la modalidad 94, caracterizada porque los dos o más tipos de anticuerpos o sus porciones de unión a antígeno inhiben la proliferación de células TF-1 por 80% o más a una concentración de aproximadamente 55 pM cada una, cuando las células TF-1 se proliferan mediante la inducción de hGM-CSF.

Aquí adelante, ejemplos de la presente invención será descrita mas específicamente, pero los ejemplos no limitan el alcance de la presente invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Aislamiento de clones de células que producen anticuerpos completamente humanos contra hGM- CSF (hGM-CSF).

La Fig. 1 muestra un diagrama de flujo del aislamiento de clones de células que producen anticuerpos. Se aislan linfocitos B de la sangre donante, cuyo suero tiene títulos de anticuerpo monoclonal anti- GM-CSF altos, se infectan con EBV. Las células proliferadas luego de infección con EBV se utilizan con colecciones para células que producen anticuerpos.

Las células de la colección de células que producen anticuerpos se dispersan en placas de 96-pozos y se cultivan durante 3 a 4 semanas. El sobrenadante de cultivo de cada pozo se selecciona para la presencia de anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF. La selección se lleva a cabo mediante ELISA utilizando placas de 96 pozos cubiertas con hGM-CSF recombinante (rhGM-CSF). Las células en los pozos positivos para producción de anticuerpo se siembra en placas de 96 pozos nuevas y se cultiva durante 3 a 4 semanas, y luego el sobrenadante de cultivo de cada pozo se somete a la segunda selección para la presencia de anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF. Las células en los pozos positivos para la producción de anticuerpo se someten a un cultivo de dilución limitante en las placas de 96 pozos durante 3 a 5 semanas. Después, el sobrenadante de cultivo de cada pozo se examina para la presencia del anticuerpo, y los clones de células que producen anticuerpo se obtienen finalmente a partir de los pozos de las placas en 1 célula por pozo.

Ejemplo 2. Identificación de isotipos y subclases de anticuerpos.

Identificamos el isotipo y la subclase de los anticuerpos producidos por tres clones de células que producen anticuerpos, EV1007, EV1018 y EV1019 (Tabla 1 ). La identificación se hace por ELISA, que es esencialmente igual que aquel utilizado para la selección de producción de anticuerpo en sobrenadante de cultivos, utilizado los sobrenadante de cultivo como el primer anticuerpo y los anticuerpos específicos de isotipo y subtipo como el segundo anticuerpo.

La Tabla 1 muestra el nombre de los anticuerpos y sus subclases para anticuerpos monoclonales para los tres anticuerpos monoclonales anti-hGM-CSF y anticuerpo monoclonal J 1 58 4C obtenido nuevamente (denominados como EV1003), que se reporta en la publicación PCT International WO 07/049472.

Tabla 1 Ejemplo 3. Clonación de los genes de anticuerpo a partir de células que producen anticuerpo.

Se clonan genes de anticuerpo a partir de células que produce anticuerpo. El ARN total que extraen de las células que producen anticuerpos, y cADN se sintetiza al utilizar cebador oligo-dT y transcriptasa inversa.

Al utilizar el cADN como una plantilla, los genes que codifican los anticuerpos humanos se amplifican por PCR. Los cebadores se designan basados en las bases de datos de secuencias de ADN de los genes de anticuerpo de tal manera que al extremo 5' contiene el sitio de iniciación de transcripción y el extremo 3' contiene el sitio de terminación de traducción.

Ejemplo 4. Determinación de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos basados en ¡as secuencias de nucleótidos.

El cADN de los genes de anticuerpo [EV1007, EV1018 y EV1019, cada uno consiste de genes de cadena pesada (H) y cadena ligera (L)) se clonan en vectores de plásmido, y se analizan sus secuencias de nucleótidos mediante un secuenciador (ABI). Se determinan sus secuencias de aminoácidos con base en las secuencias de nucleótidos obtenidas. Para el análisis de las regiones que determinan complementariedad (CDRs) de los anticuerpos (EV 1007, EV1018, EV1019 y EV1003), se utiliza un método Kabat. Las secuencias CDR de los cuatros anticuerpos se indican mediante la SEQ ID NOs: 4 a 9 y 330 a 347. Específicamente, CDR1 cadena L, CDR2 cadena L, CDR3 cadena L, CDR1 cadena H, CDR2 cadena H, CDR3 cadena H de EV1018 se establecen en la SEQ ID NOs: 4 a 9, respectivamente. CDR1 cadena L, CDR2 cadena L, CDR3 cadena L, CDR1 cadena H, CDR2 cadena H, y CDR3 cadena H de EV1019 ¡se establecen en la SEQ ID NOs: 330 a 335, respectivamente CDR1 cadena L, CDR2 cadena L, CDR3 cadena L, CDR1 cadena H, CDR2 cadena H, CDR3 cadena H de EV1003 están SEQ ID NOs: 336 a 341 , respectivamente. CDR1 cadena L, CDR2 cadena L, CDR3 cadena L, CDR1 cadena H, CDR2 cadena H, y CDR3 cadena H de EV1007 están SEQ ID NOs: 342 a 347, respectivamente.

Ejemplo 5. Confirmación de los genes de anticuerpo obtenidos que codifican anticuerpos monoclonales anti-hGM-CSF.

Los genes que codifican los tres anticuerpos (cada uno consiste de cadenas H y L) se insertan en vectores de expresión. Los plásmidos que codifican los genes de cadena L y H de cada anticuerpo se transfectan transitoriamente en células 293T utilizando reactivo Lipofectamine y Plus (Invitrogen) y se prueban para expresión de anticuerpo transitorio.

Dos días después de la transfección, los sobrenadante de cultivo celular que contienen los anticuerpos secretados se recolectan. Los anticuerpos monoclonal anti-GM-CSF e IgG humano en los sobrenadantes de cultivo se detectan mediante ELISA para confirmar la expresión transitoria de los anticuerpos humanos y los anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF.

Ejemplo 6. Establecimiento de células transfectantes CHO estables que expresan anticuerpos monoclonales anti-hGM- CSF.

Los vectores de expresión que codifican los anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF se transfectan en células CHO-K1 como se describió anteriormente. Dos días después de transfección, se siembran las células en placas de 96-pozos y se cultiva en medio de selección que contiene un marcador de selección apropiado para aproximadamente dos semanas. El sobrenadante de cultivo de cada pozo se detecta para anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF mediante ELISA. Células sencillas en los pozos positivos para expresión en anticuerpo se colocan en pozos de placas de 96-pozos. Las células de clones sencillos se hacen crecer clones de células sencilla en medio selectivo que se detecta para la expresión de anticuerpo monoclonal de anti-GM- CSF y los clones de las células que expresan establemente el anticuerpo monoclonal anti-GM-CSF se obtienen.

Ejemplo 7. Purificación de anticuerpos.

Se cultivan clones de células CHO en forma estable que expresan los anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF en un medio libre de suero. Después del periodo de expresión respectivo, se recolectan los sobrenadantes de cultivo y los anticuerpos se aislan a través de cromatografía de afinidad utilizando una columna pre- empacada HiTrap rProtein A FF (Amersham) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se confirman los anticuerpos purificados por tener una actividad de unión al hGM-CSF mediante ELISA y por consistir de aproximadamente 50 kDa de cadena H y de aproximadamente 25 kDa de cadena L de anticuerpo mediante SDS-PAGE.

Ejemplo 8 análisis de afinidad de anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF Para calcular las constantes de afinidad para la unión del hGM-CSF recombinante a anticuerpos monoclonales anti-hGM-CSF, se desarrolla resonancia de pasmón de superficie (SPR) sobre un Biacore System™ (Figura 2).

En el método para analizar la interacción entre los anticuerpos y antígenos, se capturan anticuerpos purificados en un chip de sensor a través de interacción con proteína G inmovilizada a la superficie del chip sensor, y luego se inyectan antígenos recombinantes al chip sensor. Se utilizan anticuerpos purificados y se utiliza hGM-CSF recombinante como un antígeno. Las constantes de disociación en equilibrio (KD) para hGM-CSF derivadas de levadura (Leukine Berlex) y de E. coli (Prepotech) cin anticuerpos monoclonales anti-hGM-CSF se muestran en la tabla 2.

Tabla 2 En este ensayo, los vaiores KD para ievadura GM-CSF (Leukine) fueron 1.2 x 10"9 M para EV1007, 2.3 x 10"10 M para EV1018, y 3.6 x 10"10 M para EV1019. El valor KD para el anticuerpo monoclonal EV 1003 que se ha generado previamente fue 2.3 x 10~10 M.

El valor KD para E. coli (Prepotech) fue de 9.3 x 10"10 M para EV1007, .5 x l O-10 M para EV1018, 1 .5 x 10"10 M para EV1019, y 9.5 x 10"1 1 M para EV1003. Todos los cuatro anticuerpos monoclonales hGM-CSF generados se unen al hGM-CSF recombinante con alta afinidad.

Ejemplo 9. Efecto inhibidor de anticuerpos monoclonales de anti- hGM-CSF en proliferación de células dendríticas desangre periférica.

Se tienen 5 x 105 células dendríticas (CD) que contienen CD plasmacitoide y CD mieloide obtenidos de 7 x 107 células mononucleares humanas utilizando el kit de aislamiento celular dendrítico sanguíneo II humano (Miltenyi Biotech).

El CD obtenido se suspende en medio RPMI 1640 (Gibco) complementado con 10% FCS, rhGM-CSF (1 ng/mL, Peprotech), TNF-a (10 ng/mL) y anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF (1 pg/mL), se siembra placas de fondo plano de 96-pozos en una concentración de 2 x 104 células/pozo y se incuba durante 10 djías;.

El anticuerpo policlonal anti-GM-CSF (anti-GM-CSF pAbs, R&D) (1 gVmL) y el anticuerpo monoclonal citomegalovirus anti-humano de humano (hlgG) (1 pg/mL), que se ha generado, se utiliza como controles. El resultado se muestra en la figura 3.

Como se ve en la figura 3, EVI 003, EVI 018, y EVI 019 inhiben la proliferación dependiente de GM-CSF-del CD. En contraste, el EV 1007 no muestra inhibición. Por otra parte, el pAb anti- GM-CSF inhibe la proliferación dependiente de GM-CSF-del CD, pero el hlgG no lo hace.

El EV 003, EVIOI 8, y EV 019 pueden bloquear la proliferación dependiente de GM-CSF del CD en forma independiente.

Ejemplo 10. Evaluación de la potencia neutralizante de anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF utilizando células TF-1.

Probamos la capacidad neutralizante de los anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF purificados (EV1007, EV1018, y EV1019) y EV1003, que se generan previamente utilizando células TF-1 , que proliferan dependientes de! la presencia del hGM-CSF, como se muestra en las figuras 4 y 5.

Los anticuerpos purificados se pre incuban con hGM-CSF recombinánte y la mezcla se agrega al cultivo celular TF-1. Después de 2 días de cultivo, el estatus proliferativo de las células TF-1 se determina mediante un ensayo colorimétrico. El anticuerpo posee actividad neutralizante de GM-CSF que puede bloquear la actividad GM-CSF recombinánte agregada, lo que resulta en la inhibición de crecimiento de células TF-1 dependientes del GM-CSF.

Las figuras 4 y 5 muestran los efectos inhibidores (actividad neutralizante) de los anticuerpos en la proliferación de las células TF-1 estimuladas por hGM-CSF de levadura (Leukine) y E. coli hGM-CSF (Preprotech), respectivamente.

Se evalúa cada anticuerpo de forma independiente por su efecto inhibidor y se utiliza anti-GM-CSF pAB y hlgG como controles como se describe en el ejemplo 9.

Los anticuerpos con dilución en serie de cuatro veces en un rango de concentración de 2 pg/mL a 31 pg/mL se ensayan. Se utiliza una concentración final de 0.5 ng/mL rhGM-CSF para todas las pruebas. Después de 40 h de incubación, se estima la viabilidad celular TF-1 mediante intensidad de color de A450/ref. A495 utilizando un Equipo de Conteo Celular (WST-1 ensayo, DOJIN).

En el eje Y de las figuras 4 y 5, la viabilidad de la célula TF-1 con hlgG de control en 31 pg/mL se fija en 100%, y la viabilidad de las células TF-1 rhGM-CSF se fija en 0%. Los anticuerpos probados se ubican al fondo de las figuras y sus concentraciones se indican en el lado derecho de las figuras.

Levadura rhGM-CSF (Leukine) en una concentración de 0.5 ng/mL se utiliza para estimular la proliferación de células TF-1 y los resultados de la capacidad neutralizante de cada anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF se muestran en la figura 4. Aunque el hlgG como control negativo exhibe una inhibición no especifica de crecimiento celular en una alta concentración de 2pg/mL, esta no muestra inhibición en una concentración de menos de 2pg/mL. Los anticuerpos monoclonales anti-hGM-CSF (anti-GM-CSF pAbs) muestran inhibición de crecimiento celular dependiente de las concentraciones de anticuerpo a 125 ng/mL o más de 125 ng/mL.

Entre los cuerpos monoclonales purificados, el EV1003 inhibe el crecimiento de células TF1 al 60% del control positivo en una concentración de 31 ng/mL, y se observa inhibición del crecimiento dependiente de ¡la concentración a 31 ng/mL o más de 31 ng/mL. El EV1018 y EV1019 muestran aproximadamente 50% de inhibición en concentraciones de 0.5 ng/mL o más de 0.5 ng/mL y 2 ng/mL o más de 2 ng/mL, respectivamente. Se confirma que el EV1018 y el EV10 9 tienen actividad neutralizante extremadamente alta para hGM-CSF. El EV1007 muestra claramente inhibición de crecimiento celular en concentraciones de 0.5 pg/mL o más de 0.5 pg/mL, lo que indica que su capacidad neutralizante fue muy baja.

E. coii rhGM-CSF (Peprotech) en una concentración de 0.5 ng/mL se utiliza para estimular la proliferación de células TF-1 y los resultados de cada anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF se muestran en la figura 5. En este ensayo, el hlgG como control negativo exhibe una inhibición no específica de crecimiento celular a una alta concentración de 2 pg/mL, pero esta no muestra inhibición a menos de 2 pg/mL de concentración. Los anticuerpos policlonales anti-hGM-CSF (anti-GM-CSF pAbs) muestra inhibición de crecimiento celular independiente de las concentraciones de anticuerpo a 31 ng/mL o más de 31 ng/mL.

Entre los anticuerpos monoclonales purificados, el EV1003 muestra clara mención de la proliferación de las células TF1 en una concentración dependiente de la forma a 31 ng/mL o más de 31 ng/mL. El EV 018 y el EV 1019 muestran más del 50% de inhibición en concentraciones de 0.5 ng/mL o más de 0.5 ng/mL y 2 ng/mL o más de 2 ng/mL, respectivamente. Se confirma que las actividades neutralizantes del EV1018 y el EV1019 fueron extremadamente altas.

El EV1007 muestra claramente inhibición de crecimiento celular en una concentración de 0.5 pg/mL o más de 0.5 pg/mL, lo que indica que su capacidad neutralizante fue muy baja comparada con el EV1018 y el EV1019.

La actividad neutralizante de los dos anticuerpos se evalúa (figuras 6 y 7). Se enumeran cinco combinaciones de anticuerpos mezclados en la tabla periódica.

Tabla 3 Las soluciones de prueba para cada anticuerpo se preparan mediante dilución en serie de 4 veces en un rango de concentración de 4 pg/mL a 62pg/mL, y se mezclan dos anticuerpo de la misma concentración (la concentración final se muestra en las figuras 6 y 7). La viabilidad de la célula TF-1 se estima por la intensidad del color del A450/ref. A495 utilizando un Equipo de Conteo Celular (ensayo WST-1 , DOJIN).

En el eje Y las figuras 6 y 7, la viabilidad de las células TF-1 con control hlgG a 31 pg/mL se fija en 100%, y la viabilidad de las células TF-1 sin rh-GM-CSF se fija en 0% como se muestra en las figuras 4 y 5. Los resultados de la viabilidad de las células TF1 con el control hlgG a 31 pg/mL se muestra en las figuras 4 y 5, pero no en las figuras 6 y 7. Las combinaciones de anticuerpos mezclados se indican en el fondo de las figuras y sus concentraciones se indiican en el lado derecho de las figuras.

Entre estas combinaciones, los efectos inhibidores de Mix-2: EV1007+1007, Mix-3: EV1003+1018, y Mix-4: EV1003+1019 se incrementan extremadamente en comparación con único uso de cada anticuerpo. Como se ve en la figura 6, el Mix-4: EV1003+1019 inhibe el crecimiento de las células TF1 al 10% del control positivo en cada concentración de anticuerpo de 8 ng/mL (aproximadamente 55 pM).

Como se muestra en la figura 4 el Ev 003 solo no muestra inhibición de la proliferación de células TF1 en una concentración de 8 ng/mL y el EV1019 solo muestra únicamente 50% de inhibición en una concentración de 8 ng/mL. Estos resultados indican que la combinación de los dos anticuerpos exhibe actividades neutralizantes extremadamente altas.

Aunque el efecto inhibidor del EV1007 en un único uso es muy baja, el Mix-2: EV1003+1007 inhibe el crecimiento de las células TF1 del control positivo en cada concentración de anticuerpo de 8 ng/mL (aproximadamente 55 pM), como se muestra en la figura 6 y 7.

Como se muestra en la figura 7, cuando se utiliza el E. coli rhGM-CSF (Peprotec) para estimular la proliferación de células TF1 , se inhibe casi completamente el crecimiento celular mediante Mix-2: EV1003+1007, Mix-3: EV1003+1018, y Mix-4: EV1003+1019 en cada concentración de 31 ng/mL o más de 31 ng/mL. Se confirma que la adición combinada de los anticuerpos exhibe una actividad neutralizante extremadamente fuerte.

De otras parte, el efecto inhibidor del Mix-5: EV1018+1019, se incrementa en una concentración dependiente de la forma comparado con los anticuerpos en una único uso como se muestra en las figuras 4 y 5, sin embargo, el efecto incrementado fue inferior del Mix-2 a 4.

En el caso del Mix-5: EV1018+1019, cuyo efecto de mezcla no fue destacado, las curvas de dependencia de dosis (patrón de efecto neutralizante) de ambos anticuerpos de un único uso fue similar.

Como se muestra en las figuras 4 y 5, entre 4 anticuerpos (EV1003, EV1007, EV1018, y EV1019), el EV1003 muestra la inhibición más fuerte en único uso en una concentración de 2 pg/ml, pero aún en esta alta concentración, aproximadamente 20% de las células restantes. En contraste, Mix-2, Mix-3, y Mix-4 inhiben casi completamente el crecimiento celular en un rango de concentración de 31 a 125 ng/mL. Se indica que estas tres combinaciones (Mix-2, Mix-3, y Mix-4) presentan actividades neutralizantes extremadamente altas.

El uso combinado de anticuerpo monocionai anti-GM-CSF (EV1003) y el anti cuerpo anti-CMV (hlgG), Mix-1 , no mejora el efecto inhibidor de los anticuerpos comparados con sus usos únicos.

Entre los tres anticuerpos obtenidos en Ika presente invención, dos anticuerpos (EV1018 y EV1019) muestran actividades neutralizantes extremadamente altas en uso único y en uso combinado. Entre las combinaciones de los anticuerpos enumerados en la tabla 3 se muestran ciertas combinaciones presentan una actividad neutralizante mayor que un efecto aditivo de ambos anticuerpos.

Los anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF generados anteriormente o sus porciones de unión a antlgenos son capaces de unirse específicamente al hGM-CSF que origina varias enfermedades, y ese indicador (neutraliza) los antibióticos del hGM-CSF. así, los anticuerpos o sus porciones de unión a antígenos tienen mayor actividad neutralizante contra hGM-CSF que anticuerpos monoclonales anti-hGM-CSF que se han hecho hasta ahora (actualmente disponibles). Los anticuerpos o sus porciones de unión a antígeno no muestran inmunogenicidad y no inducen respuesta inmune debido a que ellos son anticuerpos monoclonales humanos.

Adicionalmente, un uso combinado simultaneo de los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF o sus porciones de unión a antígeno exhiben un efecto inhibidor extremadamente mayor sobre el crecimiento celular (es decir actividad neutralizante) comparado con su uso único.

Considerando estas propiedades, los anticuerpos monoclonales anti- hGM-CSF o sus porciones de unión a antígenos descritas en la presente invención serian efectivas en bajas dosis como agentes terapéuticos o profilácticos para enfermedades asociadas con GM-CSF elevado, que incluye pero se limita a enfermedades alérgicas tal como asma, COPD, fibrosis quística, enfermedad de pulmón, rinitis, atopia, y polinesis, rechazo de injerto, enfermedad injerto vs anfitrión, (GVHD), artritis y artrosis relacionadas, soriasis, leucemia mieloide, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer y artritis reumatoide.

Ejemplo 11. Definición de afinidad de anticuerpos monoclonales de anti-GM-CFS en h GM-CFS de Biacore.

Se utilizan chips anti humanos de ratón de Biacore (GE Healthcare) para inmovilizar cada uno de los anticuerpos y el GM-CFS soluble purificado disponible comercialmente (Biomol) se le permite unirse. El hGM-CFS utilizado en estos experimentos es igual que aquel utilizado en los bioensayos descritos adelante. Se determinan las afinidades de unión utilizando el software Biacore y los resultados se resumen en la tabla 4.

Tabla 4 El EV1018 tiene una mayor afinidad de unión que el EV1019, y una afinidad de unión mucho mayor que el EV1003. Todas las variantes de EV1018 tienen afinidades de unión iguales que aquellas del tipo EV1018.

Reactividad cruzada con GM-CSF de otras especies (Macaco, ratón, tití) La secuencia GM-CSF de Macaco está presente en las bases de datos públicas (por ejemplo, número de acceso GenBank NP_001028121 ) y se utiliza para diseñar un clon de expresión como una proteína de fusión Fe. Se introducen los sitios de división de proteasa para permitir la liberación de la proteína GM-CSF de Macaco no etiquetada. La proteína resultante procesa la excelente actividad biológica (ver siguiente sección) y se reconoce por todos los anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF (EV1018, EV1019, EV1003) en Western Blots (datos no mostrados). Las mediciones Biacore (utilizando la misma configuración descrita en 1.1 anterior) se desarrollan y los resultados se dan en la tabla 5.

Tabla 5. Estudios de unión de anticuerpo monoclonal anti-GM-CSF y GM-CSF de Macaco.

Anticuerpo Ka Kd KD EV1003 5.39x10s ± 0.06 3.56X10"" * 0.04 661 ± 14 pM EV1019 Lote 1 2.91 x10b ± 0.23 2.14x10"" + 0.01 739 ± 57 pM EV1019 Lote 2 3.04x10s ± 0. 13 1.65x10"* ± 0.17 543 ± 34 pM EV1018 5.56X10b ± 0.52 2.1 1 X10"" ± 0.06 381 ± 16 pM En todos los casos la radioactividad cruzada con GM-CSF de Macaco es Excelente (todos los anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF reconocen la proteína GM-CSF de Macaco como un factor de 2 a 3 menos que el hGM-CSF). De la misma manera los monos Macaco proporcionan un excelente modelo de primates no humanos para el desarrollo de dichos anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF descritos.

Las mediciones con GM-CSF de ratón (PeproTech y Biomol; por ejemplo, número de acceso GenBank NP 034099) se desarrollan y los resultados se resumen en la tabla 6.

Tabla 6. Estudios de unión de anticuerpo monocionai anti-GM-CSF y GM-CSF monoclonal de ratón.

En todos los casos, la reactividad cruzada con GM-CSF de ratón es muy pobre. Estos datos proporcionan una base para los experimentos que ayudan en la identificación del epítopo hGM-CSF el anticuerpo monoclonal GM-CSF que los une, en donde los híbridos de proteína GM-CSF entre humanos y ratones se ha estabilizado.

Un clon de expresión GM-CSF de tití (por ejemplo, número de acceso GenBank No. B0KWQ4 con metionina en la posición 53 y prolina en la posición 109) similar al clon de expresión GM-CSF de macaco descrito anteriormente se genera. La proteína purificada se utiliza para mediciones Biacore y los resultadds se resumen en la tabla 7.

Tabla 7. Estudios de unión de anticuerpo monoclonal anti-GM-CSF GIVI-CSF de tití La reactividad cruzada con GM-CSF de tití es significativa. Todos los anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF reconocen la proteína GM-CSF de tití con un factor de aproximadamente de 18 a 19 veces menos que el hGM-CSF. Como en el caso de los monos macacos, los titís proporcionan un excelente modelo animal para el desarrollo de dichos anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF descritos.

Ejemplo 12. Actividad biológica: neutralización de bioactividad GM-CSF.

Ensayo de proliferación TF-1 (humano, macaco, tití GM-CSF) La proliferación de la estirpe de células humanas TF-1 es dependiente de factores de crecimiento. La estirpe de estas células se conoce en la técnica como una base excelente para estudios sobre el efecto biológico de los factores de crecimiento.

Utilizamos aquí GM-CSF recombinante (rhGM-CSF) de para diferentes especies tal como (i) hGM-CSF recombinante (rhGM-CSF) de hGM-CSF expresado en E. coli (Fa. Biomol #2514) al utilizar técnicas estándar bien conocidas en el arte o (ii) GM-CSF de macaco recombinante (rrGM-CSF) de GM-CSF de macaco (por ejemplo, número de acceso GenBank NP_001028121 ) o (ii) 55 GM-CSF de tití recombinante (rmGM-CSF) de GM-CSF de tití (por ejemplo, número de acceso GenBank No.BoKWQ4 con Metionina en la posición 53 y Prolina en la posición 109) ambos expresados en HEK 293 utilizando técnicas estándar bien conocidas en el arte.

Se hacen crecer células TF-1 en medio de cultivo celular (RPMI 1640 (Cat. 31870 Fa. Gibco), 1 x glutamax 100x (Cat. 35050-038 Fa. Gibco), 1 mM de Pirovato de Sodio 100mM (Cat. 1 1360-039 Fa. Gibco)), 10mM Hepes 1 M (Cat. 15690-056 Fa. Gibco), 10% FCS (Cat.10500-064 Fa. Gibco), 2ng/ml rGM-CSF, (Cat.200-005L Fa. ReliaTech GmbH). Las células se lavan 3 veces con PBS y se siembran en placas de 96-pozos (Cat.167008 Fa. Nunc) en medios de ensayo (medio de cultivo celular sin rGM-CSF) en una concentración de 1 E5 célula/ml. La solución de anticuerpo y la solución de GM-CSF se diluyen en medio de dilución (medio de cultivo celular sin FCS y sin rGM-CSF) y se agregan en un volumen de 10µ?, respectivamente. Las células se incuban durante 3 días a 37°C y 5% de CO2 en cámara humidificada la viabilidad celular se mide mediante la adición de 20 µ? MTS y mención de densidad óptica en 492 nm, de acuerdo con las instrucciones del equipo (ensayo de proliferación celular de una solución Acuosa 96, Fa. Promega, Cat. No. G3581 ). Se hacen crecer células TF-1 de control negativo en Medio de Cultivo Celular que no contiene rGM-CSF. Se hacen crecer células TF-I de control positivo en Medio Celular que contienen rGM-CSF en concentración ED80.

Antes de probar la actividad neutralizante de los anticuerpos el ED80 para simulación de proliferación con humanos, macacos y tití GM-CSF se determina (Tabla 8). El GM-CSF de humano y macaco es capaz de estimular la proliferación TF-I muy eficazmente (ED80 [humano]: 1 -5 ng/ml; ED8o[macaco]: 7 ng/ml), sin embargo el GM-CSF de tití es un estimulador bastante ineficaz de proliferación TF-I. Por lo tanto, la estirpe de células humanas TF-I son apropiadas para probar la actividad neutralizante contra el GM-CSF humano y Macaco, sin embargo no es apropiado para probar GM-CSF derivado de tití.

Tabla 8. ED80 para GM-CSF de humano, macaco y tití en ensayo de proliferación TF-1 .

La determinación IC50 de los anticuerpos desarrollados bajo concentraciones ED80.

En el eje y de las Figuras 8 A y 8B, la viabilidad de las células TF-1 del control positivo se establece en 100%, y la viabilidad de célula TF-1 del control negativo se establece en 0%.

También se utiliza un anticuerpo con actividad neutralizante conocida, anticuerpo anti- hGM-CSF lgG2a de rata disponible comercialmente (BVD2-23B6, Fa.BD Pharmingen #554501 ) (Tabla 9). El isotipo de anticuerpo de control de rata lgG2a (R35-95, Fa. BD #554687) no muestra inhibición de la proliferación celular (datos no mostrados).

El EV1018 y EV1019 tienen una excelente actividad neutralizante del GM-CSF recombinante humano. El EV1018 excede la actividad neutralizante del BVD2-23B6.

La cadena pesada de EV1018 contiene naturalmente un sitio de N- glucosilación dentro de la estructura 3. Esto se muestra en, por ejemplo, la SEQ ID NO: 10, que corresponde a los residuos 95-97. Por lo tanto, las variantes de la EV1018 de cadena pesada se generan y examinan por su actividad neutralizante. Como se proporciona en la Tabla 9, el resultado indica que la bioactividad del EV1018 se mantiene luego de la remoción del sitio de glucosilación ligado a N en la estructura 3 de la cadena pesada. La Tabla 9 muestra valores IC50 para dos de las variantes de secuencia de sitio de glucosilación (EV1018 variante 1 y 2), designada como N95K y T97A, respectivamente, según se compara con WT EV 1018 de cadena pesada que contiene el sitio de N-glucosilación. Los valores IC50 para cada uno de los IgG purificados se determinan en el ensayo TF-1 esencialmente como se describe. Los experimentos con variantes EV1018 adicionales producen resultados similares comparables con aquellos delEV1018.

Tabla 9. Comparación de IC50 en el ensayo de proliferación TF-1.

Se dan los resultados en ng/ml y en pM (asumiendo un peso molecular de 150 kDa para los anticuerpos).

En los experimentos que utilizan anticuerpos monoclonales GM-CSF de macaco recombinantes EV1018, EV1019 y EV1003 tienen una actividad neutralizante mucho mayor que el BVD2- 23 B6 derivado de rata. Sin embargo, en ambos tipos de experimentos el EV1018 es significativamente superior sobre todos los anticuerpos probados. Todas las variantes de EV1018 neutralizan igualmente la actividad del tipo natural EV10 8. en el experimento establecido que da los resultados mostrados en la Tabla 9, el uso del BVD2-21 C1 1 lgG2a GM-CSF anti-humano de rata disponible comercialmente (Fa. BD, #554503) no es posible, bajo las concentraciones ED80 dadas, es decir, una dosis de 1 .5 ng/ml rGM-CSF, no se pueden obtener resultados confiables. Para medir anticuerpo 21 C 1 , se necesitan dosis de rGM-CSF menores como se muestra en la Tabla 0 adelante.

La comparación de la eficacia de los anticuerpos en diferentes laboratorios no es posible al comparar simplemente los valores IC50, debido a que los valores IC50 son fuertemente dependientes de Is condiciones de ensayo, como por ejemplo la cantidad de estímulo utilizado. Una comparación mucho más confiable es posible al comparar la relación del por ejemplo, los valores IC50, obtenidos en un ensayo TF-1 como se describió anteriormente pero con diferentes dosis de rGM-CSF según se indica, entre un anticuerpo estándar y el anticuerpo de interés. Por ejemplo, la WO2006/122797 (Tabla 8 páginas 56 y 57) describe su mejor anticuerpo que es 35 veces mejor que el anticuerpo disponible comercial GM-CSF anti-humano de rata, clon BVD2-21 C1 1 . La relación entre los IC50 entre el anticuerpo monoclonal anti-human-GM-CSF, clon BVD2-21 C1 1 y EV1018 es 413. Por lo tanto, con base en la comparación con un estándar comercial, la actividad neutralizante del EV 1018 es aproximadamente diez veces mayor Como se muestra en la Tabla 10. ES sorprendente que la WO2006/122797 enseñe a aquellos expertos en la técnica que la actividad neutralizante de un anti£líe¼pro monoclonal anti-GM-CSF se correlaciona fuertemente con su afinidad de unión al GM-CSF (WO2006/122797, mejorando la afinidad de unión mostrada en la Tabla 4 en la página 50 que se correlaciona con la potencia neutralizante mejorada correspondiente mostrada en las tablas 6 y 7 en las páginas 52-54). Comparando la afinidad de unión del MOR04357 (WO2006/122797, tabla 4, página 50: se realiza la afinidad de unión es 7 pM para MOR04357-Fab) con la afinidad de unión EV1018. Nos damos cuenta que el EV 018 se une aproximadamente 16 veces menos al GM-CSF que MOR04357. Sin embargo, la actividad neutralizante dei EV1018 es 10 veces mayor, comparado con el MOR04357, lo que indica, que la actividad neutralizante no se correlaciona necesariamente con la afinidad de unión al GM-CSF.

Tabla 10. Actividad de neutralización relativas en ensayo TF-I del EV1018 y un anticuerpo de la técnica anterior.

Línea 1 y 2: datos de la WO2006/122797, tabla 8 páginas 56 y 57, línea 3 y 4: datos propios.

Ensayo de secreción IL-8 en células U937 (GM-CSF humano macaco) El IL-8 es una citocina proinflmatoria. Es un factor crucial para la inflamación de neutrófilos y está involucrado en la mayoría de reacciones inflamatorias. Las células objetivo de la actividad GM-CSF son células de linaje de células mieloides. La estirpe de células premonocíticas U937 es de origen mieloide y secretan la citocina proinflmatoria IL-8 luego de la estimulación con GM-CSF.

Se hace crecer U937 (ATCC: CRL-1593.2) en medio de cultivo celular (RPMI 1640 (Cat.31870 Fa. Gibco), IX Glutamax 10Ox (Cat.35050-038 Fa. Gibco), 10% de FCS (Cat.10500-064 Fa. Gibco), 1 % PenStrep). 100 µ? de suspensión celular en 1 E5 células/mi se siembran y se agregan 10 µ? de solución de anticuerpo y 10 µ? de solución GM-CSF. Las células se incuban durante 24 horas a 37° C y 5% de CO2 en una cámara humidificada. Se determinan los niveles de citocina IL-utilizando el equipo OptEIA Human IL-8 Elisa (Fa.BD Bioscience, Cat. No. 555244).

El control negativo son células U937 que crecen en el medio de cultivo celular sin agregar anticuerpo y sin agregar GM-CSF, y control positivo son células U937 que crecen en un medio de cultivo celular que contiene rGM-CSF en ED80 sin la adición de solución anticuerpo. Se determina la concentración ED80 para GM-CSF humano y macaco (Tabla 9) y se utiliza esta concentración para determinar IC50 para diferentes anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF (Tabla 11).

Tabla 11. Determinación de ED80 en la secreción IL-8 en U937 GM-CSF ED80 Humano (derivado de E. coli, Fa. Biomol # 2514) 1.2 ng/ml Macaco (derivado de células HEK, en domésticos) 5.0 ng/ml Tabla 12. Comparación de IC50 en ensayo de secreción IL-8 U937. Los resultados se dan en ng/ml y en pM (asumiendo un peso molecular de 150 kDa para los anticuerpos).

En este ensayo celular, todos los tres anticuerpos neutralizan muy eficientemente el GM- CSF humano, así como el GM-CSF de macaco. El EV1018 tiene una mayor actividad neutralizante que el EV10 9, y una capacidad neutralizante mucho mayor que el EV 1003. Todas las variantes de EV1018 presentan actividad neutralizante igual a aquella del EV1018 tipo natural.

Ejemplo 13. Inducción de CD11b/Mac1 de superficie.

Los granulocitos son una subpoblación de linaje mieloide y son células objetivo de actividad biológica GM-CSF. A pesar de otras funciones efectoras, el GM-CSF induce la adhesión de la molécula CD1 b/Mac1 sobre la superficife de los granulocitos. La inducción del CD11b/Mac1 sobre la superficie de las células del linaje de células mieloide es una etapa esencial de la migración celular de la sangre periférica en tejido inflamado. Los pacientes con enfermedades inflamatorias de las vías respiratorias crónicas como COPD y asma tienen números elevados de granulocitos en esputo y fluido de lavado broncoalveolar. Por lo tanto, la eficacia de los anticuerpos anti- GM-CSF se prueba en inducción mediada por GM-CSF del marcador de adhesión CD1 1 b/Mac1 en Granulocitos principales. 80 µ? de sangre periférica que inhibe la coagulación de donantes saludables se incuba durante 15 min a 37° C con anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF o anticuerpo de isotipo (IgG humano, # 1-251 ; Fa. Sigma- Aldrich) (control positivo) preincubado durante 20 min con rhGM-CSF (30 pM de concentración final) (Fa Biomol, #2514). El control negativo es la incubación de la coagulación de la sangre inhibida durante 15 min a 37° C con anticuerpo de isotipo preincubado con PBS, 01 % de BSA durante 20 min.

Para cuantificación de expresión CD1 1 b/Mac1 , anti- anticuerpo CD1 1 b etiquetado con ficoeritrina (Fa: Pharmingen; Cat: 333142) se utiliza de acuerdo con instrucciones del proveedor. En resumen, se agrega 20 µ? de solución de anticuerpo ant¡-CD1 1 b a las células, se incuba durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Se lisan eritrocitos (glóbulos rojos) al agregar 2 mi de solución de lisis (Fa: BD¡ Cat 349202) y se incuban durante 10 min adicional a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de dos etapas de lavado con PBS, 0.1 % de BSA, se suspenden los glóbulos blancos en 500 µ? de Cellfix (Fa: BD; Cat 340181 ). Para análisis, se utiliza un citómetro de flujo LSRII y software DIVA6.1.1 para analizar FACS (ambos Fa. BD). La población de células de granulocitos se coloca sobre una gráfica de puntos utilizando dispersión delantera y hacia los lados y se fija al 100%. Se utiliza 30 pM de rhGM-CSF para estirnuljar el CD1 1 b/Mac1 en la superficie de granulocitos. 67 pM de EV1018 es suficiente para bloquear completamente el GM-CSF inducido por CD1 1 b/Mac1.

Estos datos indican que el EV1018 neutraliza eficazmente la actividad biológica GM-CSF en un contexto significativamente alto para procesos inflamatorios que involucran números incrementados de granulocitos, como COPD y asma.

Ejemplo 14. Inflamación pulmonar después de exposición a humo de cigarrillo en ratones C57B 6J.

El humo de los cigarrillos es el factor más crucial para el desarrollo del COPD. La exposición al humo del cigarrillo a largo plazo de las especies animales como ratas y ratones origina muchas lecciones anatómicas patofisiologicalmente importantes comparables con las enfermedades humanas (Fujita y Nakanishi 2007). Un parámetro importante del COPD es la bronquitis crónica que incluye números incrementados de neutrófilos y macrófagos en el pulmón. Para probar que el GM-CSF tiene un papel importante para el influjo de células inducidas por el humo n el pulmón, los anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF se utilizan en un modelo de humo de cigarrillo a largo plazo en los ratones.

Se exponen ratones (cepa C57BL/6J, 18-23g) al humo del cigarrillo durante 4 días. Se exponen ratones a 6 cigarrillos en al día 1 y 2, a 8 cigarrillos en el día 3, y a10 cigarrillos en el día 4. La exposición de cada cigarrillo dura 16 min seguido por una exposición de 8 min de aire fresco. Cada segundo cigarnlló tiene una interrupción adicional de 24 min con exposición de aire fresco. Los ratones sin exposición al humo del cigarrillo sirven como un control negativo.

El GM-CSF lgG2a anti ratón de rata, 300 pg (clon MPI-22E9, Fa. eBioScienses, #16-7331 ) o anticuerpo de isotipo apropiado, 300 pg (lgG2a de rata, Fa. eBioSciences, # 16- 4321 ) o vehículo 300 pl (PBS, 10 mM NaCI) se administra intraperitonealmente (i.p.) 2 horas antes de protocolo para fumar en el día 1 y en el día 3. 18h después de la última exposición se sacrifican los animales y se lavan los pulmones con 2 x 0.8 mi de solución Hankscon EDTA. Se separa el fluido del lavado Bronco-alveolar (BALF) mediante centrifugación en un glóbulo celular y sobrenadante. La actividad mieloperoxidasa (MPO) en el glóbulo se determina como un parámetro para el influjo de células mieloides. 500 pl de muestras de fluido de lavado se centrifugan a 485 x g, 4°C durante 10 min. El glóbulo se re suspende en 200 pl de bromuro de hexadecil-trimetil -amonio (HTAB) 0.5%. Se transfieren 50 pl de suspensiones a una placa de microtitulo de 96-pozos. 250µ? of solución de sustrato (50 mM KH2P04, 5 mM Na2HPO4, 0.2 mg/ml de diclorohidrato de O-dianisidina, 0.2 µ?/ml H202) se agregan a cada pozo para empezar la reacción enzimática. La extinción a 450 nm se determina durante 90 seg. La actividad Mieloperoxidasa (MPO) se calcula durante el equilibrio dinámico de la reacción enzimática. La actividad se da como unidades de mili-actividad por min (mAU/min).

La citocina MCP-I y MIP-I a se determinan en los sobrenadantes BALF mediante detección de analito múltiple en un clitómetro de flujo (LSR II , Becton Dickinson). El ensayo se desarrolla de acuerdo con las instrucciones de Bender MedSystems (Flow Cytomix). En resumen, se mezcla 25 pl del sobrenadante de BALF con 25 µ? de amortiguador de ensayo Ix (Basic Kit BMS8440FF), 25 µ? de mezcla de glóbulo (mezcla MCP-I y equipos MIP-la Simplex, BMS8600¡5FF, BMS86013FF) y 50 µ? de mezcla de conjugado de Biotin- (incluida los equipos Simplex) y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente sobre un agitador de micro placa a 500 rpm. Se agrega Después de lavar 2 veces con amortiguador de ensayo, se resuelven los glóbulos en 100 µ? de Amortiguador de Ensayo y 50 µ? de solución Streptavidina-PE (incluida en el equipo básico). Se incuban glóbulos durante 1 hora a temperatura ambientes sobre un agitador de micro placa a 500 rpm. Los glóbulos se lavan con amortiguado de ensayo dos veces. Los glóbulos se resuelven en 500 µ? de amortiguador de ensayo y se analizan mediante citometría de Flujo utilizando el software FlowCytomix Pro 2.2 suministrado por Bender MedSystems. Para cuantificación de una dilución serial de un estándar (incluido en los equipos Simplex) se preparan de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Bender MedSystems). Se determinan las concentraciones de citocina basado en los estándares.

Luego de pre tratamiento de los ratones con anticuerpos anti -GM-CSF, la actividad MPO se reduce aproximadamente a 25 % (FIG 9A). Consistente con los resultados, las citocinas MCP-I y MIP-la se reduce aproximadamente 18 % y 23%, respectivamente (FIG 9B).

Los resultados mostrados la FIG 9A y FIG 9B demuestran que el GM-CSF tiene un papel importante en la inflamación inducida por el humo del cigarrillo y que la neutralización del GM-CSF puede reducir significativamente la inflamación celular y la citocinas inflamatorias inducidas por la exposición al humo del cigarrillo a largo plazo en los ratones.

Ejemplo 15. Mapeo de Epítopo h GM-CSF.

Las disposiciones de péptido que contienen péptidos GM-CSF de ratón, humano, macaco, y titi se prueban para ver si la secuencia lineal particular en GM-CSF se puede identificar como el epítopo reconocido por los anticuerpos en cuestión.

Se prueban los siguientes anticuerpos: BIBH1 (un anticuerpo de control negativo IgGI humanizado relevante que reconoce FAP (ver US20030103968 Uso de anticuerpo específico FAP alfa BIBHIen el tratamiento del cáncer (http://www.asco. org/ASCO/Abstracts+&+Virtual+Meeting/Abstracts?&vmview=ab st_d etail_view&conflD=10&abstractlD=1028), EV1018, EV1019 y EV1003.

Los resultados de los ensayos de péptidos indican que ninguna unión específica por encima de ios niveles se ven con ei anticuerpo de control negativo, aunque el GM-CSF inmovilizado y los controles IgG humano positivos dan señales robustas. En razón a que el GM-CSF plegado apropiadamente se reconoce pero ninguno de los péptidos derivados GM-CSF, concluimos que los anticuerpos anti-GM-CSF probados reconocen un epítopo específico de conformación o no lineal. Esto está en contraste con varios otros anticuerpos anti-GM-CSF conocidos en la bibliografía (por ejemplo, WO2007/092939). Se emplea el siguiente método: Se sintetizan ensayos habituales y se imprimen en porta objetos de vidrio en JPT (Berlín, Alemania). Se bloquean los ensayos con PBS + 1 % BSA + 0.1 % Tween 20 durante 3 h a temperatura ambiente con agitación gentil. Se diluyen los anticuerpos a 5 pg/ml en amortiguador de sonda (5% Glicerol PBS, 5 mM MgCI2, 0.5 mM DTT, 0.05% Tritón X-100, 1 % BSA) y se incuban en ensayos a 4°C de 1 a 2 horas. Luego se lavan los ensayos con amortiguador de sonda tres veces (1 minuto en cada lavado de hielo) y se incuba con IgG anti- humano de cabrá etiquetado Cy 5 (0.5 pg/ml) durante 1 hora a 4°C. Ellos se lavan de nuevo como se hizo anteriormente, se secan mediante centrifugación (800 x g) y se explora en un escáner de microensayo Perkin-Elmer ProScan PMT constante con el grupo de filtro Cy5.

También se desarrolla mapeo de Epitopo a través de remplazo ortólogo.

Debido a que los anticuerpos probados reconocen un epitopo discontinuo o conformacional, uno solo puede determinar el epitopo respectivo en el contexto del GM-CSF plegado apropiadamente. Como se muestra en los resultados Biacore descritos anteriormente, los anticuerpos en cuestión se unen solo débilmente, y no para nada, al GM-CSF de ratón. Por lo tanto, designamos versiones quiméricas del GM-CSF en ¡a que las regiones seleccionadas de GM-CSF humano se remplazan por la secuencia de ratón correspondiente. En razón a que el GM-CSF humano y de ratón poseen presumiblemente tres estructuras dimensionales pero solo 73% de identidad, las proteínas quimérica pueden retener el GM-CSF apropiado plegado, en oposición a los métodos de exploración de alanina (remplazo con estiramiento de polialanina), que puede aceptar el plegado de la proteina. Las quimeras en la que le epitopo, o partes del mismo, se remplazan con secuencias de ratón no debe ligarse más al anticuerpo en cuestión (o mostrar unión reducida). El mapeo de las secuencias regresa a la estructura 3 dimensional del GM-CSF humana conocida que le permite a uno reconstruir la ubicación espacial de los aminoácidos que comprenden el epitopo. Los aminoácidos que se conservan entre el GM-CSF humano y de ratón no se puede analizar con este método.

Se diseñan 1 1 quimeras diferentes en las que siete secuencias de péptido lineales se reemplazan individualmente y en combinación. Para cada quimera, se indican aminoácidos GM-CSF de ratón en negrilla. Los sitios de glicosilación religados Predichos que difieren entre las quimeras se subrayan. Cada quimera expresa en células HEK 293 como una proteína de fusión Fe de conejo para permitir la purificación y cuantificación a través de la porción Fe de conejo. Un huésped Western blot de control con las proteínas de fusión que utiliza un anticuerpo contra Fe de conejo muestra y cantidades idénticas de las varias proteínas de fusión quiméricas GM-CSF se cargan en los geles. Los cambios de movilidad entre las diferentes quimeras se debe a diferencia en la glicosilación entre el GM-CSF humano y de ratón.

Un Western blot de las quimeras GM-CSF con EV 1003 muestra que las quimeras 3, 6, 9 y 10 muestra poco o ninguna unión. La quimera 9 es una combinación de las quimeras 3 y 6 aunque la quimera 10 es una combinación de las quimeras 2 y 6. Por lo tanto, todas las quimeras que contienen aminoácidos de ratón en aquella posiciones representadas por las quimeras 3 y 6 o combinaciones que contienen una o ambas de estas regiones no se reconocen más por EV 1003. Estas representan por lo tanto el epítopo EV1003. El mapeo espacial de las quimeras 3 y 6 en la estructura de cristal 3 dimensional del GM-CSF muestran que estas quimeras que son adyacentes una a la otra enfrentan la molécula GM-CSF, en una concordancia excelente con estos hallazgos. Estas superficies representan el epítopo discontinuo reconocido por EV 1003.

Un Western blot de las quimeras GM-CSF con E V 1019 muestra que las quimeras 4, 5 y 1 1 muestran unión débil aunque la quimera 8 no muestra casi unión. La quimera 1 1 es una combinación de las quimeras 1 y 5 aunque la quimera 8 es una combinación de las quimeras 4 y 5. Por lo tanto, todas las quimeras que contienen aminoácidos de ratón en aquellas posiciones representadas por las quimeras 4 ó 5 muestran unión débil a EV 1019. La quimera 8, que contiene la combinación de aminoácidos de ratón en aquellas posiciones representadas por las quimeras 4 y 5 no se reconocen más p;or * EV1019. Por lo tanto, la combinación de las quimeras 4 y 5 representan el epítopo EV1019. El mapeo espacial de las quimeras 4 y 5 en la estructura 3 dimensional de GM-CSF muestran que estas quimeras descansan adyacentes una a la otra sobre una cara de las moléculas GM-CSF, en excelente concordancia con estos hallazgos. Estas superficies representan el epítopo discontinuo reconocido por EV1019. Debido a que ambas regiones son necesarias para unión de alta afinidad de EV 019, el epítopo discontinuo debe estar compuesto de los aminoácidos de las variantes 4 y 5 que descansan cercanos una a la otro y en o cerca de la superficie (y por lo tanto afecta los residuos de aminoácidos expuestos a la superficie) de GM-CSF. Existen aminoácidos 60 - 63 (ELYK) y 78 - 87 (TMMASHYKQH) (SEQ ID NO: 3), respectivamente. Una contribución del aminoácido 76 (P) puede ser posible. A diferencia de los aminoácidos 68 - 69 (SL) en la quimera 4 que tienen un papel significativo en la unión de epítopo, debido a la gran distancia de la interfaz entre las quimeras 4 y 5 involucradas, sin embargo, no se puede descartar completamente.

Un Western blot de las quimeras GM-CSF con EV 1018 muestra que las quimeras 4, 5 y 1 1 muestran unión débil aunque la quimera 8 no muestra casi unión. La quimera 1 1 es una combinación de las quimeras 1 y 5 aunque la quimera 8 es una combinación de las quimeras 4 y 5. Por lo tanto, todas las quimeras que contienen aminoácidos de ratón en aquellas posiciones representadas por las quimeras 4 ó 5 muestran unión débil al EV1018. La posiciones representadas por las quimeras 4 y 5 no se reconoce más p;or EV1018. Por lo tanto, la combinación de las quimeras 4 y 5 representa el epítopo EV1018. El mapeo espacial de las quimeras 4 y 5 en la estructura de cristal 3 dimensional de GM-CSF muestran que estas quimeras descansan adyacentes una a la otra sobre una cara de la GM-CSF, en excelente concordancia con estos hallazgos. Estas superficies representan el epítopo discontinuo reconocido por EV1018. Debido a que ambas regiones son necesaria para la alta afinidad de unión del EV1018, el epítopo discontinuo debe estar compuesto de los aminoácidos de las variantes 4 y 5 que descansan cercanos una a la otra y en o cerca de la superficie (y por lo tanto afectan los residuos de aminoácidos expuestos a la superficie) de GM-CSF. Estos son aminoácidos "ELYK" y "TMMASHYKQH," respectivamente. Estos resultados indican que EV 1018 y EV 1019 reconocen el mismo epítopo discontinuo de la molécula GM-CSF, aunque EV 1003 reconoce un epítopo de la molécula GM-CSF que es distinta del epítopo reconocido por EV1018 y EV1019.

LISTA DE SECUENCIAS hGM-CSF de Longitud completa MWI^SLLLIiGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHTO^ PTCLCTRLELYKC 3LRGSLTKiKGPLTM^^ DCWEPVQE (SEQ ID NO: 1) Epítopo discontinuo para EV1018 & EVIO19 >Residuos 77-80 ELYK (SEQ ID NO: 2) Residuos 95-104 TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) EV1018 CDRs >EV1018 HC CDR1 SYGMH (SEQ ID NO: 4) >EV1018 HC CDR2 LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) >EV1018 HC CDR3 ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) >EV1018 LC CDR1 IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) >EV1018 LC CDR2 GRSPPS (SEQ ID NO: 8) >EV1018 LC CDR3 STWDSSLSAW (SEQ ID NO: 9) Cadenas Pesadas EV1018 Sin Secuencia de Señal glucosilación dentro de la estructura 3. Esto se muestra en, por ejemplo, la SEQ ID NO: 10, que corresponde a los residuos 95-97. Por lo tanto, las variantes de la EV1018 de cadena pesada se generan y examinan por su actividad neutralizante. Como se proporciona en la Tabla 9, el resultado indica que la bioactividad del EV1018 se mantiene luego de la remoción del sitio de glucosilación ligado a N en la estructura 3 de la cadena pesada. La Tabla 9 muestra valores IC50 para dos de las variantes de secuencia de sitio de glucosilación (EV1018 variante 1 y 2i), designada como N95K y T97A, respectivamente, según se compara con WT EV 1018 de cadena pesada que contiene el sitio de N-glucosilación. Los valores IC50 para cada uno de los IgG purificados se determinan en el ensayo TF-1 esencialmente como se describe. Los experimentos con variantes EV1018 adicionales producen resultados similares comparables con aquellos delEV1018.

Tabla 9. Comparación de IC50 en el ensayo de proliferación TF-1.

Se dan los resultados en ng/ml y en pM (asumiendo un peso molecular de 150 kDa para los anticuerpos). >BV1018 QVQLVESGGGMVQP^PLRI^CVASGFTFSSYGMHWRQ TISRDNiaWTLYXQMTSLRAEDTAV^^ SGGTAAl/3CLVKDYPPEPVTVSVmSGALTSGVHTFPAVIX3SSG^ HKPSOTKVDK VEPKSOJKIOTCPPOTAPELUXJPSVPLFPP P D L^ EV FNWYV-XSVEVHNAK KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD^ K JPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVB ESNGQPEN YK TPPVLDSDGSFFLY SKLTVD SRWOJGNVFSCSVMHEALHNHYTQ SLSLSPGK (SEO ID NO: 10) >EVX018- t IgGIKO QVELVESGGGMVQPGMPLRLSCVASGFTFSSYGmWVRQAPGKGLEWVAliTYHHGNRKFYADSVRGRF TISRDNSNNTLYLQM SLRAEDTAVYFCARESMGAIliD WGQGTLVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ^ H PSNT VDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP P DTLJVIISRTPEVTCVVVDVSHEDP EV FNVTYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYR WS VLTVLHQDWLNG KE Y C KV SNKAL P AP I E TIS A GQPREPQVYTLPPSRDELTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NY TTPPVLDSDGSFFLY S LTVDKSRWQOGNVFSCSVMHEALHNHYTQ SLSLS PGK (SEQ ID NO: 11) >EV1018-T97A IgGlKO QVELVESGGGWQPGMPLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWALTYHHG RKFYADSVRGRF TISRDNSNNALYl^MTSLRAEDTAVYFCARESMGAIOT^ SGGTAAIX-O^VKDYFPEPVWSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV VPSSSLGTQTYICNV HKPSOTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV CVVVDVSHEDP EV F YVDGVEVHNAKT PREEQTOSTYRWSVLTVLHQDWI^GKEYKC VSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC VKGFYPSDIAVEWESNGQPEN YKTTPPVLDSDGSFFLY SKJjTVDK£R OX3TVFSCSTOHEAljH HYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 12) >EV1018-T97V IgGLKO Q\ SL·VESGGG^WQPGMPL l,SCVASGF FSSYGMHWV QAPGKGLEWAl,TYHHG ?KFYADSTOGRF TIS DNSN VLYLQMTSLRABDTAVYFCARESMGAINDNWGQGT!JVIVSSASTKGPSVFPI-APSSKST SGGTAAIXSCLVKDYFPEPVTVSVf SGAJ-TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSOT VD RVEPKSCD TOTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPSVTnmTJVSHEDP EVKFhWYVTXSVEVKNA TKPREEQYNSTYRWSVLW^ GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY TTPPVLDSDGSFFLY SKLTVD SRW(3QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 13) >EV1018-N£»5D IgGIKO QVELVESGGGMVQPGMPLRLSCVASGPTPSSYGMHWVRQAPG GLEWVALTYHHGNRKFYADSVRGRP TISRDNSDNTLYLQOTSLRAEOT^ SGGTAAI^CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV^ HKPSNTKVDKRVEPKSOTKTHTCPPCPAPE^ EVKFNWYVDGVTEVHNAKTKPREEQYNSTTRWSVLTV^ 5 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES SKLTVDKSRWQQG VFSCSVMHEALHNHYTQ SLSLSPGK (SEQ ID NO: 14) QVELVESGGG VQPG PLRLSCVASGFTFSSYG HVAmQAPGKGLE VAiTYHHG RKFYADSVRGRF TISP-DNSENTLYLQWTSI-RAEDTAVYFCytflESMG^ SGGTAAIiGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL^ HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPFJU-GGPSVFLFPPKPK^ j Q EVKFNWWDGVEVH AKTKPREEQY STYR SVLTVLHQ SKA KGQPREPQVYTLPPSRDELT NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN^KTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVD SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 15) >EV1018-N95K IgGlKO QVELVESGGGMVQPGMPLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAP TISRDNSra^LYIjQMTSLRAEDTAVYFCARESMGAI^N G^TLVIVSSASTKGPSVFPIAPSSKST 15 SGGTAALGCLV DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVXiQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQT IC VN HKPS^?'KVDKR EPKSCDK HTCPPCPAPEAAGGPS FLFPPKPKDTLMIS PF?; OA?m SHEDP EVKFNWYVDGVEVH AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN ALPAPIEKTISKA KGQPREPQWTLPPSPJDELT NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESKGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGUVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 16) Q >EV1018-N95Q IgGlKO QVELVESGGGMVQPGMPLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPG GLEWVALTYHHGNRKFYADSVRGRF TISRDNSgNTLYLQ TSLRAEDTAVYFCARESMGAI D GQGTLVIVSSASTKGPSVFPLAPSS ST SGGTAALGCLVKDYFPEPV VSW SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS\Am/PSSSLGTQTYICNVN H PSGG VDKR EPKSCD THTCPPCPAPEAAGGPS FLFPPKP-aDTL·MIS TPE C V DVSHEDP EV FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWS LTVLHQDWLNGKEY CKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV GFYPSDIAVEWESNGQPEN YKTTPPVLDSDGSFFLY SKXTVDKSRWOJGNrVFSCSV HEALH HYTQKSLSLSPG 5 (SEQ ID NO: 17) J-BV10Í8-N93Q-N95T IgGI O QVSIAESiKXSmKJIHSMP UiSCVASGF^ TISIUDQS OTLYI JOTSLRAEDTAVYPCARE S<3GTAAIiGCIiVKDYFPEPV VSWHSG^ H PSHTKTOKRVEP SCDKTH PPCPAPI-.UWGGPSVFLFP'PKP EV IWPnn iVEVHNA- TK I^EQYNST^ XGQPI^PQVYTLPPSR-SI-IiTKNQVSI- CJ-V GFYPSDIAVEWESNE^ -S KIJTVDICS R WQQG V FSCS VMREALHNMYITQKS-JSLS PG (SEQ XD NO: 18) >EV1018-wt IgGl-BI QVELVESG^MVQPGMPLRISCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGJLO^^ TIS DNSinTOLYl/JWSLRAEOTAVYFCA ESHGAI DNW SGOTAALGCL KDYFPEPVTVSVWSGAi rSGVHTFPAA^ HKPSrrKVDKHVEPKSCDKTHTCPPCPAPEtJ MPSVFLFPPKPiayrLMI S TPEVTCV DVSHEDP GQPRE QVYTT,PPSRDEI TKNQVSi rCTAn<GF^ SKLTVOKS RMOOCMVPSCS VMHE*LH_^TQKSLSLS PSK {SEQ ID NO: 19) EV1Q18-T97A IgGl-BI QVELVESGGGMVQPGMPIjRlSCVASGFTFSSYGMHWVTtQA GTO TISRDNSNNA^YI-QMTSL A-SDTA YFCARESMGAIITONW^^ HKPSNTICVOKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL1.MPSVFLF PKPKDT EVXFNWYVIXJVEVH AXTKPREEQYTJSTYTi^ GQP EPQVYTL PSRDEíi TCNQVSLTCUVKGFÍPSDIAVEWESNGQPI-Ní^K TPPVLOSCGSFFLV SKLTVDKSRKQQGNVFSCSVMHELALH HYTQKSLSLSPGK <SEQ ID MO: 20) »EV1.018-T97V IgGl-SI QVILVESGGGMVQPG PLRiSCVASGF FSSYGMHWV^^ TISRDNSUNVLYI )^rSLRA£DTAVYFCAR^ SGGTAAIXKH-VKDYFPEPVTVSWNSGAI/rSGVHTFPATC^ HKPS n' VDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELIXKSPSVFXFPPKPKDTLMTSRTPEWTCVVVDVSHBDP EV F fWYVDGVE!VHNA TKP EEOYNSTYRWS VL VLHQD LNGKEY CKVSNKAl-??? 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LTYHHGNRK YADSVRGRFTISRDNSDOT^ SASTKGPSWPl^PSSKSTSGGTAALGCLVTOYFPEPVTVS VVTVPSSSI^ QTYICVlffiKPSOTKVDKRVEPKSCDK^^ ISRTPE\TTCVVVDVSHEDPEVKFN YVIX»VEVHNAKTKPREEQY STYR 5 CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE N YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGWFSCSVMHEALHl^fHYTQKSL (SEQ ID NO: 93) >EV1018-N95E IgGl-BI MGWSCIIL·FLVATATG HSQVELVESGGMVQPGMPLRLSCVASGFTFSSYG^PÍWVRQAPGKGL·EWVA LTYHHGlTOK YADSVRGRFTISRÜNSEimiYLQ TSLRAEDTAVYFCARESMGA l 0 SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS NSGAIjTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLX3TQTYICNVimKPSNTKV^ ISRTPEV CVWDVSHEDPEVKF-WYVDGVEVHA-TKPREEQ CKVSNALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSPJDELTKNQVSLTCLVXGFYPSDIAVE ESNGQPE N YKTTPPVLDSTCSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY Q SLS {SEQ ID NO: 94) l5 >EV1018-N95K IgGl-BI MGWSCIILFLVATATGVHSQVELVESGGGMVQPGMPLRLSCVASGFTFSSYGMHVRQAPG GLEWVA LTYHHGNRKFYADSVRGRFTISPJ^NSKOTLYLQM SLRAEDTAVYFCTU^SMGAIITO WGQGTLVIVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAIX3CLVKDYFPEPVTVSVÍNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSIXSTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK^ ISRTPEV CWVDVSHEDPETVKFlWYVIXIiVEVHNAKT PREEQY^ CKVSNKALPAPIEKTIS AKGQPREPQVYTLPPSRDELTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE N YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK-SRWO GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 0 (SEQ ID NO: 95) >EV1018-N95Q IgGl-BI MGWSCIILFLVATATGVHSQVELVESGGGMVQPGMPLRLSCVASGPTPSSYGMHWRQAPG GLEWVA LTYHHGNRKFYADSVRGRFTISPJDNSQOTLYL^MTSLRAEOTAVYFCARESMGAITOWGQGTLVIVS SASTKGPSVFPLAPSS STSGGTAAIJCLV DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYICNVIW PSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP DTLM ^ ISRTPEVTCVVVDVSHErDPEVKFWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN^ CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS WQQGtAiFSCSVMHEALHl^ (SEQ ID NO: 96) >EV1018-N93Q-N95T IgGl-BI MG SCIILFLVATATGVHSQVBLVESGGGMVQPG PLRLSCVASGF FSSYG HWRQAPGKGLEWA LTYHHGNRKFYADSWGRFTISRDQSTNTLY^ SASTKGPSVFPIJ^PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYIQTVWHKPSOTKVDKIIVEPKSCDKTOT ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVIX3VEVHNA CKVSNK1ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE N YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWO^G VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 97} ? >EV1018-T97A IgGl-original-constant MGWSCIILFLVATATCVHSQVQLVESGGG^QPGMPLRLSCTASGFTFSSYGm VRQAPGKGLEWA LTYHHGNRKFYADSVRGRFTISRDNSNNALYliQMTSLI^ SAST GPSVFPIL-APSSKSTSGGTAALGCLV DYFPEPVT^'SWNSCALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYIOWNHKPSNTKVDKKVE ISRTPEW?CWVDVSHEDPEVKFNWYVTX5VEVHNA CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE 15 NNYK TPPVLDSIX3SFFLYSKLTVOKSRWQQGOT (SEQ ID NO: 98) >EV1018-T97V IgGl-original -constant MGWSCirLFLVATATGVHSQVQLVESGGGWQPGMPLRLSCVASGFTFSSYG HWVRQAPGKGLEVfVA LTYHHGNRKFYADSVRGRFTISRDNSNNVLY ÍMTSL SASTKGPSVFPI-APSSKSTSGGTAALGCLV DYFPEPVTVSW SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSjS ?0 VVTVPSSSLGTQTYICNVNKKPSOTKOT ISRTPEV CVVVDVSHEDPEVKFTIVrY\T3GVEV¾NAKTKPREEQYNSTYRW CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTWKSRWQQGtTVFSCSWrfEALHNHYTQKSLSLSPGK {SEQ ID NO: 99) >EV1018-N95D IgGl-original -cor.stant MG SCIILFLVATATGVHSQVQLVESG-? VQPGMPLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKG1¿.EW^A 25 LTYHHGmKFYADSVRGRFTISRDNSDOTLYLQ TSLRAEDTAVYFCARESMGAIND WGQG LVIVS SASTKGPSWPIJU?SSKSTSGGTAALGCLVKDYFP VVTVPSSSIiGTVrYICNV-fflKPSOTKVDKKV^ ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVIXJVEVHNAKTOT CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV GFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD SR QQG VFSCSVMHEAIJÍNHY^ (SEQ ID NO: 100) >EV1018-N95E IgGl-original-constant MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVESGGGWQPG PLRLSCVASGFTFSSYGMH VRQAPGKGLEWVA LTYHHGNR FYADSVRGRFTISRDNSE TLYLQMTSLRAEDTAVYFCARE?MGAINDNWGQGTLVIVS SASTKGPSVFP1APSSKSTSGGTAAI.GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL0SSGLYSLSS VVTVPSSSL£TQTYIOJVNHKPSOT ISRTPEV C^AA^VSHEDPEVKFNWYV8VETVHNAK KPREE CKVSNKALPAPIE TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVÜKSRWQO^^FSCSV HEALHNHY^ (SEQ ID NO: 101) >EV1018-N95K IgGl-original -constant GWSCI ILFLVATATGVHSQVQLVESGGGMVQPGMPLRLSCVASGFTFSSYG HWVRQAPGKGLEVAA LTYHHGNR FYADSVRGRFTISRDNSK TLYLQMTSLRAEDTAVYFCARES GAINDNWGQ SASTKGPSVFPMPSSKSTSGGTAmiGCLVTOYFPEPVlVS NSGA TSGVHTFPAV JSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELIX^PSVFLFP ISRTPEVTCVVVDVSHEDFEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST^ CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNY TTPPVLDSTCSFFLYSKLTVDKSRWQQCaWFSC^ (SEQ ID NO: 102) >EV1018-N95Q IgGl-original -constant MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVESGGGMVQPGMPLRLSCVASGFTFSSYGMHVA/RQAPGKGLEWVA LTYHHG^ FYADSVRGRFTISRDNSQNTLYI-Q TSLRAEDTAVYFC^VRESMGAINDNWGQGTLVIVS SASTKGPSVFPl^PSS STSGGTAALGCLV DYFPEPV VSWNSGALTSGVHTFPAVIiQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICrVNHKPSTTKVDKKVEP SCD THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP PKDTLM ISRTPEV C^AAnDVSHEDPEVKFíWYVDGVEVH A TKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIE TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPP LDS DG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 103) >EV1018-N93Q-N95T IgGl-origina1-constant MCTSCIILFIJVATATGVHSQVQLVESGG^^ LTYHHGITO FYADSVRGRPTISRDQSTNTLY JMTSLRAEDTAVYFC-Ai^S SASTKGPSVPPIAPSSKSTSGGTAALGOJVKDYFPEPVTVS SGALTSGVHTFPAVLQSS VV VPSSSLGTOI iammKPS TKVDKKVEPKSCD HTCPPC ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF^IWYVIXSVEVHNAKTKPREE CKVSNKALPAPIEKTISKAKG JPREPQVYTLPPSRDE^TKNQVSLTCliVKGFY NNYKT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH HYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 104) Cadenas Ligera EV1018 Sin Secuencia de Señal >EV1018-wt-original ^WTPLLLQLLTLCSGSWAQSALTQETSVSGTVGQKVTLSCIGNN NIGSHAVGWYQQISRGAPKMVL FGRSPPSGVPDRFSGSKSGTTASL11SGLQPEDEADYYCSTWDSSLSAVVFGGGTKLTVLRQPKAAPS VTLFPPSSEE1_<3ANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPS QSNN YAASSYLSLTP EQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 105) >EV1018-wt-BI MGWSCI ILFLVATATGVHSQSALTQETSVSGTVGQKVTLSCIGNNNNIGSHAVGWYQQISRGAPKMVL FGRSPPSGVPDRFSGSKSGTTASLI ISGLQPEDELADYYCSTWDSSLSAWFSGGTKLTVLGQPKAAPS V LFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKGDSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTP EQWKSHRSYSCQVTHEGSTVE TVAPTECS (SEQ ID NO: 106) >EV1018- t-BI2 (Gl) MGWSCIILFLVATATGVHSQSALTQETSVSGTVGQKVTLSCIGNNNNIGSHAVGWYQQISRGAPKMVL FGRSPPSGVPDRFSGSKSGTTASLIISGLQPEDEADYYCSTWDSSLSAVVFGGGTKL.TVl,OQPKAAPS VTLFPPSSEE½AN ATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNN YAASSYLSLTP EQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 107) >EV1018-wt-origina1-constant MGWSCI ILFLVATATGVHSQSALTQETSVSGTVGQKVTLSCIGNNNNIGSHAVGWYQQISRGAPKMVL FGRSPPSGVPDRFSGSKSGTTASLIISGLQPEDEADYYCSTWDSSLSAWFGGGTKLTVLRQPKAAPS VTLFPPSSBELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTT SKQSNNKYAASSYL.SLTP EQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 108) Cadenas Pesada EV1018 Sin Secuencia de Señal >EV1018-wt-IgGl -KO-QVQL MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVESGGG yQPGMPLRLSC^ASGFTFSSYGMHWVmQAPGKGLEW LTYHHG RKFYADSVRGRFTISRDNSNN LYLQ TSLRAEDTAVYFCARESMGAI DNWGQGTLVIVS SAST GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA LQSSGLYSLSS VVTVPSSSL^TQTYICNVNHKPSOTKVDKX^ ISRTPEOTC^AATOVSHEDPEVKFiaWYAnXSVEV/HN^ CKVSNKALPAPIE TIS AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NITYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ^^ (SEQ ID NO: 109} >EV1018-T97A- IgGl -KO-QVQL MGWSCI ILFLVAiA GVHSQVQ VKSG-ÜMVQPGMPL LSCVASÜFTFSSYGMH VRQAPG GLEWVA LTYHHG^KFYADSVRGRFTISRDNSi ALYLQMTSLPJVEDTAVYFI^^^ SAST GPSVFPIJ^PSS STSGGTAAI^CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICnWHKPSNTKVDK¾VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP^ ISRTPEVTCWTOVSHEDPEV FWYVDGVEVH AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYK C VSN ALPAPIE TIS AKGQPREPQVYTLPPSRDELTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NOTKTTPPVLDSIXSSFFLYSKLTVDKSRWC^NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG {SEQ ID NO: 110) >EV1018 -T97V- IgGl -KO-QVQL MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVESGGGMVQPGMPLRLSCVASGFTFSSYGMHWRQAPGKGLEWVA LTYHHGNRKFYADSVRGRFTISRDNSNNVTjYLQMTSLRAEDTAVYFCARESMGAINDNWGQGTLVIVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGXTTAAIXSCLVKDYFPEPV VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSI^TQTYIC VNHKPSOT VDKRVEPKSOÍ THTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP PKDTLM ISRTPEV CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ C VSNKALPAPIE TIS AKGQPREPQVYTLPPSRDELTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE j^^KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWC^NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 111) >EV1018 -N95D- IgGl -KO-QVQL MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVESGGGWQPG PL LSCVASGFTFSSYG HWVRQAPGKGLEWVA LTYHHGNRKFYADSVRGRFTISRDNSDNTLYLQ TSLRAED AVYFCARESMGAINDNWGQGTLVIVS SASTKGPSVFPIAPSSKSTSG«TAAIX3CIiVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSOT ISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR^ CKVSNKALPAPIEKTISKAKGÍPREPQVYTLPPSRDELT NNYK1TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ^3NVF (SEQ ID NO: 112) >EV1018-N95E IgGl-KO-QVQL.

GWSCIILFLVATATGVHSQVQLVESGGGKVQPGMPLIÜ..SC^^ LTYHHG RKFYADSVRGRFTISRDNSETTLY JMTSLRAEDTAVYFCARES GAI DNWGQGTLVIVS SASTKGPSVFPI^SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP\rrvSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSI^TQTYIOJV HKPSOTK^ ' ^ ISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWWDGVEVHNAKTKPREBQY^ CK SMKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKCTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 113) >EV1018-N95K IgGl-KO-QVQL MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVESGGGWQPGMPLRLSCTASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA 15 LTYHHGNRKFYADSVRGRFTISRDNSKOTLYLQ TSLRAEDTAVYFCARESMGAIND WGQGTLVIVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAliGCLVKDYFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSIXSTQTYICNVníKPSNT VDKRVEPKLSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP ISRTPEV CVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH A T PREEQYNSTYRWSVLWLHQDWlo GKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKiTVDKS WQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 114) 0 >EV1018-N95Q IgGl-KO-QVQL MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVESGGGMVQPGMPLRLSCVASGFTFSSYGMH VRQAPGKGLEWVA LTYHHGNRKFYADSVRGRF ISRDNSQNTLYLQMTSLRAEDTAVYFCARESMGAINDNWGQG LV,IVS SASTKGPSVFPIAPSSKSTSGGTAAJ-GCLVK YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS'LSS VVIVPSSSLGTQTYICimraKPSOTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVT nATOVSHEDPEVKFTWYVDGVEVimAKTKPREEQYNSTYR SVLWLHQDWL G EYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPÉ 5 NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQOGWFSCSVMHEALHNHYTQ SLSLSPGK (SEQ ID NO: 115) >EV1018-N93Q-N9ST IgGl-KO-QVQL MGWSCIILFLVATATCVHSQVQLVESGGGMVQPGM^ L YHHGNRKFYADSVRGRFTISIUDQSTOTLYLCOTSLRAEDTAWFCARESMGAINDNWGOGTLVIVS SASTKGPSVFPI-APSSi^TSGGTAAIiGQjVKDYFPEPVT^SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS 5 VVIVPSSSI-GTQTYICNViraKPSOT ISRTPBVTCVVVDVSHEDPEV FNVJYVIXJVEVHNAKTKPREEQYHSI RW CKVS KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDS-XSSFFLYSIOiTVDKSRWQ^ (SEQ ID NO: 116) >EV1018-wt IgGl-QVQL-BI j Q MGWSCIILFLVATATCVHSQVQLVESGGGWQPG PLRLSCVASGFTFSSYG HWVRQAPGKGLEWVA LTYHHGNRKFYADSVRGRFTISRDNSNNTLYLQMTSLRAEDTAVYFCARES GAINDNWGQGTLVIVS SASTKGPSVFPI-APSSKSTSGGTAALGCLVroYFPEPVT SWNSGAiTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS WTVPSSSI^TQTYICNWHKPSOTKVD RVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP DTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH AKTKPREEQYNSTYRWSVLWLHQDW CKVSN ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE ?«KTTPPVLDSDGSFFLYSKL^ DKS WQQGNVFSCSVMHE L·HNH? QKSL·SLSPGK (SEQ ID NO: 117) >EV1018-T97A IgGl-QVQL-BI MGWSCI ILFLVATATGVHSQVQLVESGGGMVQPGMPLRIJSCVASGF FSSYGMHWVRQAPG GLEWVA LTYHHGNRKFYADSVRGRFTISRDNStR^LYLQMTSL SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAIIGCLVIOJYFPEPV VSWNSGAIJTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLG QTYICNV HKPS TKVDKRVEP^ ISRTPEV CVVVDVSHEDPEVKFWYVDGVEVH AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYK 0 C VSNKALPAPIEKTIS AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD SRWQQGWFSC^ (SEQ ID NO: 118) >EV1018-T97V IgGl-QVQL-BI MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVESGGG VQPGMPLRLSCVASGFTFSSYG HVAfRQAPGKGLEWVA LTYHHGNRKFYADSVRGRFTISRDNSNlV YLQM^ 5 SASTKGPSVFPLAPSS STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYICNWriKPSiTCKVDK*^ ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVIXWEVHNAKTK^ C VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS DELTNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE N YKTTPPVLDSDGSFFTJYSKLTVDKSRWQI^^ (SEQ ID NO: 119) >EV1018-N95D IgGl-QVQL-BI MGWSCIIL·FLVATATGVHSQVQL·VESGGGMVQPGM L LSCVASQFTFSSYG^1HWVRQAPGKGLEWVA LTYHHG^KFYADSWGRFTISRDNSDNTLY JMTSL 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Señal >EV1019-VL-wt QPALTQEASVSGTVGQTVTLLCSGNSSNIGSYAVGWYQQISRGAPKIWFGKSPASGIPDRFSGSKSG TTASLLVSGLQPEDEADYYCSTWDSRLSAVLFGGGTKLTVLR (SEQ ID NO: 184) >EV1019-VL-BI QPALTQEASVSGTVGQTVTLLCSGNSSNIGSYAVGWYQQISRGAPKIWFG SPASGIPDRFSGSKSG T ASLLVSGLQPEDEADYYCST DSRLSAVLFGGGT LTVLG (SEQ ID NO: 185) >EV1019-VL,-N2SS QPALTQEASVSGTVGQTVTLLCSGSSSNIGSYAVGWYQQISRGAPKI FG SPASGIPD FSÜSKSG TTASLLVSGLQPEDEADYYCSTWDSRLSAVLFGGGTKLTVLR (SEQ ID NO: 186) >EV1019-VL-BI-N25S QPALTQEASVSGTVGQTVTLLCSGSSSN^ TTASLLVSGLQPEDEAJDYYCSTWDSRLSAVLFGGGT LTVLG (SEQ ID NO: 187) >EV1019-VL-N25G QPALTQEASVSGTVGQTVTLLCSGQSSNIGSYAVGWYQQISRGAPKIWFG SPASGIPDRFSGSKSG T ASLLVSGLQPEDEADYYCSTWDSRLSAVLFGGGTKLTVLR (SEQ ID NO: 188) >EV1019-VL-BI-N25G QPALTQBASVSG VGQ V LLCSGGSSNIGSYAVGWYQQISRGAPKIVVFGKSPASGIPDRFSGSKSG TTASLLVSGLQPEDEADYYCSTWDSRLSAVLFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 189) >EV1019-VL-N2ST QPALTQEASVSGTVGQTVTLLCSGTSSNIGSYAVGWYQQISRGAPKIWFGKSPASGIPDRFSGSKSG TTASLLVSGLQPEDEADYYCST DS LSAVLFGGGTKLTVLR (SEQ ID- NO: 1-90) >EV1019-VL-BI-N25T QPALTQEAS SGTVGQTVTLLCSGTSSNIGSYA GWYQQISRGAPKIWFG SPASGIPDRFSGSKSG TTASLLVSGLQPEDEADYYCSTWDSRLSAVLFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 191) >EV1019-VL-N25R QPALTQEASVSG VGQTVTLLCSGRSSNIGS AVGWYQQISRGAPKIWFGKSPASGIPDRFSGSKSG TTASLLVSGLQPEDEADYYCSTWDSRLSAVLFGGGTKLTVLR (SEQ ID NO: 192) >EV1019-VL-BI-N25R QPALTQEASVSGTVGQTV LLCSGRSSNIGSYAVGWYQQISRGAPKI FGKSPASGIPDRFSGSKSG TTASLLVSGLQPEDF-ADYYCSTWDSRLSAVXiFGGGTKLTVIiG (SEQ ID NO: 193) 219 >EV1019-VL-N2'SQ QPALTQEASVSGTVG< niiLCSGQSSNIGSYAVGWYQQISRGAPKIVVPGKSPASGIPDRPSGSKSG TTASLLVSGLQPEDEADYYCSTWDSRLSAVLFGGGTKLTVLR (SEQ ID NO: 194) >EV1019-VL-BI-N25Q QPALTQEASVSGTVGQTVTLLCSGQSSNIGSYAVGVryQQISRGAPKIVVFGKSPASGIPDRFSGSKSG TTASLLVSGLQPEDEADYYCSTWDSRLSAVLFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 195) >EV1019-VL-S27N QPALTQEASVSGTVGQTVTLLCSGNSN IGSYAVGWYQQISRGAPKIWFGKSPASGIPDRFSGSKSG TTASLLVSGLQPEDEADYYCSTWDSRLSAVLFGGGTKLTVLR (SEQ ID NO: 196) >EV1019-VL-BI-S27N QPALTQEASVSGTVGQTVTLLCSGNSNNIGSYAVGWYQQISRGAPKIVVFGKSPASGIPDRFSGS SG 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Sin Secuencia de Señal >EV1019-wt-original 5 QPALTQEASVSGTVGQTVTLLCSG SSNIGSYAVGWYQQISRGAPKIVVFGKSPASGIPDRFSGSICSG TTASLLVSGLQPEDEADYYCSTWDSRLSAVLFGGGT LTVLRQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLV CLISDFYPGAVTVAWADSSPVKAGVETTTPSKQS NKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGfST VEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 202) >EV1019-wt-BI j QPALTQEASVSGTVGQTVTLLCSGNSSNIGSYAVGWYQQISRGAP I FGKSPASGIPDRFSGSKSG TTASLLVSGLQPEDEADYYCSTWDSRLSAVLF<XX3TKLTV^ CLISDFYPGAV VAW GDSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYL.SLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGST VEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 203) >EV1019-wt-BI2 QPALTQEASVSGTVGQTA LLGSGNSSNIGSYAVGWYQQISRGAPKI VFGKSPASGIPDRFSGSKSG ' ^ TTASLLVSGLQPEDEADYYCST DSPXSAVLFGGGTKLWU¾PKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLV CLISDFYPGAVTVAWKADSSPV AGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGS VEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 204) >EV1019-wc.-original-constant QPALTQEASVSGTVGQTVTLLCSGNSSNIGSYAVG YQQISRGAPKIWFGKSPASGIPDRFSGSKSG 0 TTASLLVSGLQPEDEADYYCSTWDSRLSAVLFGGGT10,TVLRQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLV CLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGST 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Señal >EV1019-IgG2 SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL^^ HKPS TKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPK^^ NWYVIXJVEVHNAJCTKPREEQFWSTFRWSV^^ REPQVYTLPPSREFJiTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQG^FSCSVMHEAliHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 222) >EV1019-wt-IgG4 QAQL ESGGGWKPGGSLRLSCISSKFTFSSHAMHWVRQAPG GLEWVA IWHDGS KYYADS KGRF SVSRDNSKOTLFUJMDSLRAEDTAWFCGKEW^ SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT TYTC VD HKPSOTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFliGGPSVFLFPPKPKDTLM^ FNWYVDGVEVHNAKT PREEQFNSTYRWSVLTVIxHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEK IS AKGQ PREPQV TLPPSQEEMT QVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNY TTPPVLDSDGSFFLYSRL TVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH HYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 223) >EV1019-wt-IgG4SP QAQLVESGGGVVKPGGSLRLSCISSKFTFSSHAMHWVRQAPG GLE VAVIWHDGSKKYYADSVKGRF SVSRDNSKOTLFLQMDSLRAEDTAVYFCG E VGGTCDSWGOGTLVIVSSASTKGPSVFPLAP SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ^ HKPS K^TOKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPP P DTLMISRTPErvrrCVVVDVSQEDPEVQ F VT!fVnDGVEVH 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AKGQPREPQVYTL PSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN Y KT PPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG VFSCSVMHEALH^ (SEQ ID NO: 297) >EV1019-C105S-IgG SP MGWSCIILFLVATATGVHSQAQLVESGGGVV PGGSLRLSCISSKFTFSSHAMHWVRQAPGKGLEWVA VIWHDGSKKYYADSVKGRFSVSRDNSKOTLFLQ DSLRAEDTAVYFOS SASTKGPSVFPIAPCSRSTSESTAAIiGCLVKDYFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSIXJTKTY CNVDHKPSOTKVDKRV^ TPEVTCVWDVSQEDPEVQFNW TD SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN Y KTTPPVLDSDGSFFLYSRL VDKSR QEGNVFSCSV HEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 298) >EV1019- C105A-IgG2 MEFGLSWVFIJUU L.RGVQCQAQLVESGGGWKPGGSLRLSCISSKFTFSSHAMHVAmQA VIVmiX5SK YYADSVKGRFSVSRDNSKNTLF½MDSLRAEDTAVYFCGKEWVGGTADSWGQGTLVIVS SASTKGPSVFPI^PCSRSTSESTAALGCXVKDYFPEPVTVSVmSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVWPSSNFGTQTCTOWDHKPSNTKVDK^ PEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTO NKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQV^TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYK TTPP LDSIXSSFFLYSKLTVDKSRWOOX^FSCSVMHEALHNHYTQ SLSLSPG (SEQ ID NO: 299) >EV1019-C105A- IgG4 MGWSCIILFLVATATCVHSQAQLVESGGGWKPGGSLRLSCISSKFTFSSHAMHWVRQAPGKGLEWA VIWHDGSKKYYADSVKGRFSVSRDNSfCNTLFLQMDSLRAEDTAVYFCG EWVGGTADS GQGTLVIVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSS JTKTYTCNVDH PSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKP DTLMISR TPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAiT PREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPSSIEK ISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGtWFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 300) >EV10l9-C105A-IgG4SP MGWSCIILFLVATATGVHSOAQLVESGGG^ VITODGSKKYYADSWGRFSVSRDNSKOTLFI^ DSLRA^ SASTKGPSVFPI-APCSRSTSESTAAIXSCLVKDYFPEPVI SW SGAIJTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTKTCTCimiHKPSOT TPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNVTfVDGVEVHNAl rKPREEQF^ SIWGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 301) >EV1019-C105Q- IgG2 MEFOLSWFLAAIJLRGVQCQAQLVESGGGWKPGGSLRLSC^^ VIVmDGS KYYADSVKGRFSVSRDNS m'LFLQmSLRAEDTAVYFCGKEWVGGTQDSWGQGTIiVIVS SASTKGPSVFPLAPCS STSESTAAI SCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSNFGTQTYTC VDHKPSOT WKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL ISRT PEV VWDVSHEDPEVQFNVTYVDGVEVHNA TKPREEQFNST^ NKGLPAPIEKTISKTKGJPREPQ^TLPPSREEKTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN YK TTPP LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWO3GOTFSCSVMHEALH HYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 302) >EV1019-C105Q-IgG MGWSCIILFLVATATCVHSQAQLVESGGGWKPGGSLRLSCISS FTFSSHAMHWVRQAPG GLE VA VIWHDGSKKYYADSVKGRFSVSRDNS NTLFLQMDSLRAEDTAVYFCG EWVGGTQDSWGQGTLVIVS SASTKGPSVFPIAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS 'VVTVPSSSLGTKTYTCroVDHKPSNTiC^ TPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWVDGVEVHNAKTKPREEQl^STYR SVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGWFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 303) EV1019-C105Q-IgG4SP WGHSCIILFLVATATGVHSQAQLVESGGGVV PGGSLRLSCISSKFTFSSHAMHWVRQAPG GLEWVA VIWHISSK^YADSVKGRFSVSRDNS OTLFI^ DSLRAEDTAVYFCGKEWGGTQDSWGQGTLVIVS SAST GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS TVPSSSIXST TYTCtTVDHKPSNTKVDK VES YGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEV VVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE^ SNKGLPSSIBK ISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM K.NQVSLTCLV GFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSRIiTVDKSRWQEGlWFSCSVMHEA (SBQ ID NO: 304) >EV1019-C105T-IgG2 5 MEFGLSWFLAALLRGVQCQAQLVESGGG KPGGSLR^ VIWHIXJSKKYYADSVKGRFSVSRDNSKN LFLQMDSLRAE^ SASTKGPSVFPI-APCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPV^ VVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSOTKTO PFOTCVVVDVSHEDPEVQF^YVTCVEVHNAK KPPJEEQFWSTFRW NKGLPAPIEKTISK KGQPREPQVYTLPPSREEMT KQVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYK TTPPMLDSDGSFFLYSKIJ WKSRWQQG VFSCSVMHEALH HY QKSLSLSPGK 10 (SEQ ID NO: 305} >EV1019-C105T-IgG4 G SC11LFLVATATGVHSQAQLVESGGGWKPGGSLRLSCISSKFTFSSHAMH VRQAPGKGLE VA VIWKIX3SKKYYADSVKGRFSVSRDNSKrrLFLQMDSLR^ SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAI/5CLVKDYFPEPVTVSVWSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTCPSSSI^TKT TCimiHKPSOTiaroK^ j TPEVTOTVVDVSQEDPEVQFNVmnDGVEVHN^ SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVY LPPSQEEMT QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN Y KTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVB SRWQEGNVFSCSVMHFJUJiNHYTQ SLSLSliGK (SEQ ID NO: 306) >EV1019-C105T-IgG4SP MGWSCIILFLVATATGVHSQAQLVESGGGWKPGGSLRLSCISSKFTFSSHAMHWVRQAPGKGLEW A VIWHDGSKKYYADSVKGRFSVSRDNSKOTL^ ^ SAST GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSOTKVDKRVES YGPPCPPCPAPEFI _GPSVFLFPPKPKX)TLMISR T EV CVVVDVSQEDPEVQFNVTYVDGVEVH AKTKPR SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK QVSLTCL-V GFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG VFSCSVMHEALm>IHYTQ SLSLSLGK (SEQ ID NO: 307) 5 >EV1019-C10SM-IgG2 46 MEFOLSWVFLAALLRCTQeQAQL^ VIWHDGSKKYYADSVKGRFSVSRDNSKNTLFLQ^S^ SASTKGPSVPPI-APCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLySLSS VVTVPSSNFGTOT^ CJIVDHKPSNTKVD TVERKCOTE PEVTCVVTOVSHEDPEVQF WYVDGVEVH AKTKPRE N GLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEM KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPOTJDSDGSFFLYSlOiTVDKSRWQ^GNVFSCSV^ (SEQ ID NO: 308) >EV1019-C105 -IgG4 MGWSCIILFLVATATGVHSQAQLVESGGG PGGSLRLSCISSKFTFSSHA HWVRQAPGKGLEWVA VIWHTCSK YYADSVKGRFSVSRDNSKOTLFTL^MDSLRAEDTAVYFCG-EWVGGT^ SASTKGPSVFPIJ\PCSRSTSESTAALGCLV DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVWPSSSIJGTKTYTCNVDKKPSOTKVDKRV^ TPEVTC\mraVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE SN GLPSSIEKTISKAKGQPREPQ\m?LPPSQEEWTK-SlQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSIXSSFFLYSRLTVDKSRWQEG VFSCSVMHEALHNHYTO SLSLSLGK (SEQ ID NO: 309) >EV1019-C105M-IgG4SP MGWSCIILFLVATATGVHSQAQLVESGGGWKPGGSLRLSCISSKFTFSSHAMH RQAPG GLEWVA VIWHDGSKKYYADSVKGRFSVSRDNS OTLFLQ.DSLRAEDTAVYFCG EWVGGTMDSWGQGTLVIVS SASTKGPSVFPlJVPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVliQSSGLYSLSS WTOPSSSLGTKTYTCIWDHKPS TKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL ISR TPEVTCVVATOVSQEDPEVQFTSWYVTCVEVHNACT SNKGLPSSIEKTISKAKG PREPQVYTLPPSQEE TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPE Y KTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGWFSCSV HEAliH HYTQ SLSLSLGK (SEQ ID NO: 310) >EV1019-C105L-IgG2 MEFGLSWVFLAALLRGVQCQAQLVESGGGVV PGGSLRLSCISSKFTFSSHA HWVRQAPGKGLEWVA VIV^GSKKYYADSV GRFSVSRDNSK TLF½HDSLRAEDTAVYFCGKEWVGGTLDSWGQGTLVIVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS, VV VPSSNFGTQTYTCNVDHKPSTTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYV]X^E\mNAKTKPREEQ NKGLPAPIEKTISKTKGOPREPQVYTLPPSREEMTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPE NYK TTPP LDSIX5SFFLYS LTVDKSRW0)GNVFSCSW1HF^LHÍIHYTQKSLSLSPG 247 (SEQ ID NO: 311) >EV1019-C105L- IgG MGWSCIILFLVATATCVHSQAQLVESGGG VIWHTCSKKYYADSVKGRFSVS DNSKOTLPLQMDSL AEDTAW ; SASTKGPSVFPIiAPCSRSTSESTAALGCLVIttYFPEPVW^ VVTVPSSSI¿3TKTYTOIVDHKPS TI^ TPEVTCVVVDVSQEDPF^QFNWYVDGVEV^ SIWGLPSSIE TISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEfTTK QVSL CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENOT KTTPPVlJDSDGSFFLYSW-T\nDKSRWQEGNVFSCSVMHE (SEQ XD NO: 312) >EV1019-C105L-IgG4SP MGWSCIILFLVATATGVHSQAQLVESGGGW PGGSLRLSCISS FTFSSHAMHWVRQAPGKGLEWVA VIWHDGSKKYYADSVKG FSVSRDNSKNTLFLQMDSL AEOTAVYFCGKEWCX3TLDSWGCCTLVTVS SAST GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCljVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS TVPSSSI^TKTYTCNVDHKPSNTI<^KRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKP DTL ISR TPEWCAAA/DVSQEDPEVQFTTfrTYVTJGVE^ SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGIWFSCSVMHEALH HYTQKSLSLSLGK .(SEQ ID NO: 313) Secuencias de conceso de EV1018 Y EV1019 >VH-CDR1 FTFSX1X2MH ( SEQ ID NO : 314 ) >VH-CDR2 X3X4X5HXnGXnX6 X7YADSVX8G cada Xn es independientemente un aminoácido de ocurrencia natural, X3 es L o V, X4 es T o I, X5 es Y o W, X6 es R o K, X7 es F o Y, y X8 es R o K (SEQ IDNO: 315) >VH-CDR3EXnX9GX10XnXnDXn cada Xn es independientemente un aminoácido de ocurrencia natural, Xg esiyi (SEQ ID NO: 316) >VL-CDR1 XnGNXpXnNIGSXhAVG cada Xn es independientemente un aminoácido de ocurrencia natural, y X es H o Y (SEQ ID NO: 317) >VL-CDR2 GXi2SPX13SG Xi2esRoK, yX13esAoP (SEQ ID NO: 318) >VL-CDR3 STWDSX14LSAVX15 es R o S, yXi5esVoL (SEQ ID NO: 319) Secuencias EV1003 y EV1007 >Cadena Pesada EV1u03(lgG1) MDWTWRILF ^TGARSLVQLVQSEAEVÍ^^ SIOTASGKTKFSTKFQDRLTLSSNTSATTVYilDLSGLTLDDTALYYCZARDRFQNIMATILDVWGQGTL VTVSSACTKGPSVFP]LAPSSKSTSGGTAAIXX^V^ SLSSVVTVPSSSLGTCT*IC VNHKPSOT DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF YVDGVEVHNAKTKPREEQY STYRW KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN 5 C2PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG^ (SEQ ID NO: 320) > Cadena ligera EV1003 (kappa) METPAQLLFLLLLWLPGTTGDIVLTQSPGTLSLSPGERVTVSCRASHRVSSNYLAWYQQRPGQSPRLL FIFPPSDEQLK_SGTASWCLL1WFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKH VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 10 (SEQ TD NO- 321) > Cadena Pesada EV1007 (lgG1) MDWTWRILFLVAAATGAPSQVHLVQSGSEL KPGASVKVSC ASGYSFSRYGIKWVRQAPGQGLEWMG WI TRSGVPAYAQGFTGRFVFSLDTS DTAFLEISSLKTEDTGIYYCATRPPRFYDKTEY EDGFDV GRGTLVTVSSASTKGPSVFPI-APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVWSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSL·SSVV^ PSSSLGTQ^?IC^WNHKPSm DKKVEPK^ j ? PPK_PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHÉDPEVKF W^ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK QVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKIi VDKSRWQO^ (SEQ ID NO: 322) > Cadena ligera EV1007 (Lambda) MAGFPLLLTLLTHCAGSWAQSVLTQPPSASGTPGQSVNISCSGSSSNIGNSYVYWYQQLPGTAPKLLI YRNNRRPSGVPDRFSGS SDTSASI^ISGLRSEDEADYYCAT DDSLSGRLFGGGTKLTVLGQPKAAP 20 SVTLFPPSSEELQAjNKATLVCLISDFYPGAATTVA ADGSPV AGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLT PEQ KSHRSYSCQVTHEGSTVEMTVAPTECS (SEQ ID NO: 323) Secuencias de Señal y Secuencia Adicional >EV1018 5 MEFGLIVWFLVTLLRGVQC (SEQ ID NO: 324) >EV1018-wt lgGIKO MGWSCI ILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 325) >EV1018 wt-original MAWTPLLLQLLTLCSGSWA (SEQ ID NO: 326) TGTSSDVENYNLVS (SEQ ID NO: 327) EGSKRPS (SEQ ID NO: 328) CSYAGSSVW (SEQ ID NO: 329) SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330) GKSPAS (SEQ ID NO: 331 ) STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332) SHAMH (SEQ ID NO: 333) VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334) EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335) SGSSSNIGNSYVY (SEQ ID NO: 336) RNNRRPS (SEQ ID NO: 337) ATWDDSLSGRL (SEQ ID NO: 338) RYGIK (SEQ ID NO: 339) WINTRSGVPAYAQGFTG (SEQ ID NO: 340) RPPRFYDKTEYWEDGFDV (SEQ ID NO: 341 ) RASHRVSSNYLA (SEQ ID NO: 342) GASNRAT (SEQ ID NO: 343) QQYASSPVT (SEQ ID NO: 344) TFALH (SEQ ID NO: 345) SINTASGKTKFSTKFQD (SEQ ID NO: 346) DRFQNIMATILDV (SEQ ID NO: 347) Región Variable de cadena Pesada EV1018 >EV1018-VH QVQLVESGGGMVQPG PLRiSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVALTYHHGNR PYADSVRGRP TrSRDNSNOTLYl 3^fGSLRAED A^G FCAJ^ESMGAIND^mGIQGTLVI SS (SEQ ID NO: 348) >EV1018-VH-wt QVELVESGGGMVQPGMPLRLSCVASGFTFSSYGMHWRQAPGKGLEWVALTYHHGNRKFYADSVRGRF ISRDNSNNTLYLQMTSLRAEDTAVYFCARESMGAI DNWGQGTLVIVSS (SEQ ID NO: 349) >EV1018-VH-T97A QVSLVESCXXaMVQPGMPIiRLSCVASGFTFSSYG TISRDNStWALYI^MTSLRAEDTAVYFCARESMGAIrotWGC^TLVIVSS (SEQ ID NO: 350) >EV1018-VH-T97V QVELVESGGG VQPGMPLRLSC^ASGFTFSSYGMH VRQAPG GLEVfVALTYHHGNRKFYADSVRGRF TISRDNSN VLYLQMTSLRAEDTAVYFCARESMGAI D WGQGTLVIVSS (SEQ ID NO: 351) >EV1018-VH-N9SD QVELVESGGGMVQPGMPLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWALTYHHGKR FYADSVRGRF TISRDNSDTTLY JMTSLRAEDTAVYFCARESMGAIND HGQGTLVIVSS (SEQ ID NO: 352) >EV1018-VH-N95E QVELVESGGGWQPGMPLR^SCVASGFTFSSYGMHWRQAPGKGLEWAL YHHGNRKFYADSVRGRF TISRDNSENTLYLQMTSLRAEDTAVYFCARESMGAINDNWGQGTL I SS (SEQ ID NO: 353) >EV1018-VH-N95K QVELVESGGG VQPGMPLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVALTYKHGNRKFYADSVRGRF TrSRDNSK TLYLQMTSLRAEDTAVYFCARES GAINDNWGQGTLVIVSS (SEQ ID NO: 354) >EV1018-VH-N95Q QVBLVESGGGWQPG PLRLSCVASGFTFSSYGMHWRQAPG GLEWVAXiTYHHG RKFYADSVRGRF TISRDNSQNTLYLQMTSLRAEDTAVYFCARES GAINDNWGQGTLVIVSS (SEQ ID NO: 355) >EV1018-VH-N93Q-N95T QVELVESGGGlVQPGMPLRIiSCVASGF FSSYGMH VRQAPG GLEWVALTYHHGNR FYADSVRGRF TISRI^STOTLYLQMTSLRAEDTAVYFCARESMGAINDN GQGTLVI SS (SEQ ID NO: 356) >EV1018-VH-T97A IgGl -original-constant QVQLVESGGG VQPGMPLRLS(_VASGFTFSSYGMHWVRQAPG GLEVfVALTYHHGNR FYADSVRGRF TISRDNSNNALYLQMTSLRAEDTAVYFCARESMGAINDN GQGTLVIVSS 54 (SEQ ID NO: 357) >EV1018-VH-T97V IgGl-original-constant QVQLVESGGGMVQPGMPLIUJSCVASGFTFSSYGMHW TISPJ:NSNNVLY } TSLRA£DTAVYFCARESM^ (SEQ ID NO: 358) >EV1018 -VH-N95D IgGl-original-constant QVQLVESGGGWQPGMPLRLSCVASGFTFSSYGMHVTVRQAPG GLEWVALTYHHGNRKFYADSVRGRF TISRDNSDNTLYLQMTSLRAEDTAVYFCARESMGAIND WGOGTLVIVSS (SEQ ID NO: 359) >EV1018-VH-N95E IgGl -original-constant QVQLVESGGGOTQPG PLRLSCVA5GFTFSSYGMHWRQATOKGLEWVALTYHHGNRKFYADSVRGRF TISRDNSENTLYLQMTSLRAEDTAVYFCARES GATNDWGQGTLVIVSS (SEQ ID NO: 360) >EV1018-VH-N95K IgGl-original -constant QVQLVESGGG VQPGMPLRLSCVASGF FSSyGMHWRQAPGKGLEWALTYHHGNRKFYADSVRGRF TISRDNS JTLYLQMTSLRAEDTAVYFCARES GAINDNWGQGTLVIVS5 (SEQ ID NO: 361) >EV1018-VH-N95Q IgGl-original -constant QVQLVESGGGWQPGMPLRI-SC^ASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVALT^mHGNRKFYADSVRGRF TISRDNSQNTLYLQMTSLRAEDTAVYFCARESMGAINDNWGQGTLVIVSS (SEQ ID NO: 362) >EV1018-VH-N93Q-N95T IgGl-original-constant QVQLVESGGGMVQPGMPLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVALTYHKGNRKFYADSVRGRF TISRDQSTNTLYI-QMTSLRAEDTAVYFCA ESMGAINÜNWGQGTLVIVSS (SEQ ID NO: 363) Región Variable de Cadena Ligera EV1018 >EVloi8-VL-w -original QSALTQETSVSGTVGQKVTLSCIGNNNNIGSHAVGWYQQISRGAPKMVLFGRSPPSGVPDRFSGSKSG TTASLIISGLQPEDEADYYCSTWDSSLSAWFGGGTKLTVLR (SEQ ID NO: 364) >BVl0l8-VL-wt-BI QSALTQETSVSGWGQKVTLSCIGN^ TTASLIISGLQPEDEADYYCSTWDSSLSAWFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 365)

Claims

256 REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, dicho anticuerpo comprende: (a) una cadena pesadajqu'e comprende una secuencia que contiene VH-CDR1 , una secuencia que contiene VH-CDR2, y una secuencia que contiene VH-CDR3, en donde: (i) la secuencia que contiene VH-CDR1 es SYGMH (SEQ ID NO: 4), (ii) la secuencia que contiene VH-CDR2 es LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5), y (iii) la secuencia que contiene VH-CDR3 es ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6); y (b) una cadena ligera que comprende una secuencia que contiene V[_-CDR1 , una secuencia que contiene VL-CDR2, y secuencia que contiene V|_-CDR3, en donde: (i) la secuencia que contiene VL-CDR1 es IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7), (ii) la secuencia que contiene VL-CDR2 es GRSPPS (SEQ ID NO: 8), y (iii) la secuencia que contiene VL-CDR3 es STWDSSLSAW (SEQ ID NO: 9).

2. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica en la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo une a GM-CSF humano con un KD de menos de 400 pM.

3. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica en la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo neutraliza la actividad de hGM-CSF, de tal manera que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene un valor IC50 de menos de 100 pM como se determina en un ensayo de proliferación TF-1 en ED80.

4. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica en la reivindicación 1 ó 2, en donde la cadena pesada se selecciona del 257 grupo que consiste de gamma 1 (?1 ), gamma 2 (?2), gamma 3 (?3), y gamma 4 (Y4).

5. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica en la reivindicación 4, en donde la cadena pesada es gamma 1 (?1 ).

6. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:46, o de la SEQ ID NO:51.

7. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en donde la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 46, o de la SEQ ID NO:51.

8. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 7, en donde la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:51.

9. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácido SEQ ID NO:36.

10. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la secuencia de región variable de cadena pesada es la SEQ ID NO:348 ó es la SEQ ID NO:361 , y en donde la secuencia de región variable de cadena ligera es la SEQ ID NO:365.

1 1 . Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1Q, en donde la secuencia de región variable de cadena pesada es la SEQ ID NO:61 .

12. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo 258 con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la secuencia de cadena pesada es la SEQ ID NO: 46 o es la SEQ ID NO: 51 , y en donde la secuencia de cadena ligera es la SEQ ID NO: 36.

13. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la secuencia de cadena pesada es la SEQ ID NO: 51.

14. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y un portador farmacéuticamente aceptable.

15. Equipo que comprende: (a) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y (b) uno o más recipientes que contienen el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

16. Ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

17. Ácido nucleico aislado de la reivindicación 16, en donde el ácido nucleico es un ADN.

18. Vector que comprende el ADN de la reivindicación 17.

19. Célula anfitriona que comprende el vector de la reivindicación 18, en donde el vector es un vector de expresión.

20. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 14, para uso como un medicamento. 259

21. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 14, para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con la sobreexpresion de hGM-CSF en un sujeto.

22. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica en la reivindicación 21 , en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se administra al sujeto en una dosis que no excede 500 mg.

23. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica en la reivindicación 21 ó 22, en donde la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), asma, asma bronquial, asma pediátrica, asma severa, ataques de asma aguda, fibrosis quística, enfermedad del pulmón intersticial, rinitis, artritis y artropatías relacionadas, artritis reumatoide, soriasis, leucemia mieloide, y esclerosis múltiple.

24. Método para producir un anticuerpo monoclonal anti-hGM-CSF o fragmento de unión a antígeno del mismo que une hGM-CSF, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende por lo menos una secuencia que contiene VH-CDR1 , una secuencia que contiene VH-CDR2, una secuencia que contiene VH-CDR3, una secuencia que contiene VL-CDR1 , una secuencia que contiene VL-CDR2, y secuencia que contiene VL-CDR3, en una célula anfitriona, el método comprende: (i) obtener la célula anfitriona que comprende por lo menos una secuencia de ADN que codifica por lo menos la secuencia que contiene VH-CDRa, la secuencia que contiene VH-CDR2, la secuencia que contiene VH-CDR3, la secuencia que contiene VL-CDR1 , la 260 ' secuencia que contiene V|_-CDR2, y la secuencia que contiene VL-CDR3, en donde: (a) la secuencia que contiene VH-CDR1 es SYGMH (SEQ ID NO: 4), (b) la secuencia que contiene VH-CDR2 es LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5), (c) la secuencia que contiene VH-CDR3 es ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6), (d) la secuencia que contiene VL-CDR1 es IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7), (e) la secuencia que contiene VL-CDR2 es GRSPPS (SEQ ID NO: 8), y (f) la secuencia que contiene VL-CDR3 es STWDSSLSAW (SEQ ID NO: 9); y (ii) cultivar la célula anfitriona bajo condiciones adécuadas para expresión de ADN y producción del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.