JP4657219B2 - GlycoPEG化された顆粒球コロニー刺激因子 - Google Patents
GlycoPEG化された顆粒球コロニー刺激因子 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4657219B2 JP4657219B2 JP2006542886A JP2006542886A JP4657219B2 JP 4657219 B2 JP4657219 B2 JP 4657219B2 JP 2006542886 A JP2006542886 A JP 2006542886A JP 2006542886 A JP2006542886 A JP 2006542886A JP 4657219 B2 JP4657219 B2 JP 4657219B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- csf
- moiety
- peg
- sugar
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
本出願は、2003年12月3日出願の米国仮出願第60/526796号、2004年3月23日出願の米国仮出願第60/555813号、2004年5月11日出願の米国仮出願第60/570282号、2004年1月26日出願の米国仮出願第60/539387号、2004年7月29日出願の米国仮出願第60/592744号、2004年9月29日出願の米国仮出願第60/614518号、および2004年10月29日出願の米国仮出願第60/623387号に対する優先権を主張する。あらゆる目的のためにこれら各文献の全体を参照により本明細書に組み込む。
これまでに、1つまたは複数のポリエチレングリコール部分を用いて顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)の制御された修飾を行うと、対応する天然の(PEG化されていない)G−CSFに比べて改善された薬物動態学的諸特性を有する新規なG−CSF誘導体が与えられることが発見されている(図3)。さらに、GlycoPEG化されたG−CSFの薬理活性は、市販のモノPEG化されたフィルグラスチムとほぼ同じである(図4)。
PEG、ポリエチレングリコール;PPG、ポリプロピレングリコール;Ara、アラビノシル;Fru、フルクトシル;Fuc、フコシル;Gal、ガラクトシル;GalNAc、N−アセチルガラクトサミニル;Glc、グルコシル;GlcNAc、N−アセチルグルコサミニル;Man、マンノシル;ManAc、マンノサミニルアセタート;Xyl、キシロシル;NeuAc、シアリル(N−アセチルノイラミニル);M6P、マンノース−6−ホスファート;Sia、シアル酸、N−アセチルノイラミニル、ならびにそれらの誘導体および類似体。
別段の定めが無い限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、通常、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用する命名法、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、核酸化学、およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当技術分野で周知であり一般に使用されるものである。核酸およびペプチドの合成には標準技術が使用される。これらの技術および手順は、本明細書の全体を通じて提供される、当技術分野の従来の方法および様々な一般的参考文献(一般には、参照により本明細書に組み込むSambrook他、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL、第2版、(1989年)Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照のこと)に従って一般に実施される。本明細書で使用する命名法、ならびに後述する分析化学および有機合成における実験手順は、周知のものであり、当技術分野で一般に使用される。標準技術またはその改変法が、化学合成および化学的分析に使用される。
本発明は、G−CSF上のグリカン構造を修飾するための方法を包含する。G−CSFは、活性化T−細胞、マクロファージ、内皮細胞、および間質線維芽細胞によって産生されるサイトカインとして当技術分野で周知である。G−CSFは、主として骨髄に作用して炎症性白血球の産生を増大させ、さらに、炎症作用の間に消費される好中球の補充を開始させる内分泌ホルモンとしても作用する。G−CSFは、化学療法の後の骨髄置換においても臨床応用されている。
第1の態様では、本発明は、選択された修飾基とG−CSFペプチドとのコンジュゲートを提供する。
式中、記号a、b、c、d、およびsは、ゼロではない正の整数を表し、tは0または正の整数である。「作用物質」は、通常、水溶性の部分、例えば、PEG部分である。リンカーは、下記の多彩な結合基のうちの任意のものでよい。あるいは、リンカーは、一重結合または「ゼロ次の」リンカーでもよい。
式中、Dは、−OHおよびR1−L−HN−から選択されるメンバーであり、Gは、R1−L−および−C(O)(C1〜C6)アルキルから選択されるメンバーであり、R1は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基を含む部分から選択されるメンバーを含む部分であり、Lは、結合、置換もしくは非置換のアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、DがOHであるとき、GはR1−L−であり、Gが−C(O)(C1〜C6)アルキルであるとき、DはR1−L−HN−である。本明細書で示す修飾されたシアル酸構造において、COOHは、COO−および/またはその塩も示す。
式中、aは、0〜20の整数である。
式中、eおよびfは、1〜2500からそれぞれ独立に選択される整数であり、qは、1〜20の整数である。別の実施形態では、R1は、以下から選択されるメンバーである構造を有する。
式中、e、f、およびf’は、1〜2500からそれぞれ独立に選択される整数であり、qおよびq’は、1〜20からそれぞれ独立に選択される整数である。
式中、e、f、およびf’は、1〜2500からそれぞれ独立に選択される整数であり、q、q’、およびq’’は、1〜20からそれぞれ独立に選択される整数である。
式中、eおよびfは、1〜2500からそれぞれ独立に選択される整数である。
Galは、アミノ酸に結合しても、直接的または間接的に(例えば、グリコシル残基を介して)アミノ酸に結合しているグリコシル残基に結合してもよい。
GalNAcは、アミノ酸に結合しても、直接的または間接的に(例えば、グリコシル残基を介して)アミノ酸に結合しているグリコシル残基に結合してもよい。
式中、AAは前記ペプチドのアミノ酸残基であり、上記の構造体のそれぞれにおいて、DおよびGは、本明細書で記述するものである。
式中、a、b、c、d、i、r、s、t、およびuは、0および1からそれぞれ独立に選択される整数である。添字qは1である。添字e、f、g、およびhは、0〜6の整数からそれぞれ独立に選択される。添字j、k、l、およびmは、0〜100の整数からそれぞれ独立に選択される。添字v、w、x、およびyは、0および1からそれぞれ独立に選択され、v、w、x、およびyのうちの少なくとも1つが1である。記号AAは、G−CSFペプチドのアミノ酸残基を表す。
式中、Dは、−OHおよびR1−L−HN−から選択される。記号Gは、R1−L−または−C(O)(C1〜C6)アルキルを示す。R1は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基を含む部分を示す。Lは、結合、置換もしくは非置換のアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーである。通常、DがOHであるとき、GはR1−L−であり、Gが−C(O)(C1〜C6)アルキルであるとき、DはR1−L−NH−である。
式中、添字「s」は、0〜20の整数を示し、nは、1〜2500の整数である。好ましい実施形態では、sは1に等しく、m−PEG部分の分子量は約20kDである。
式中、Lは、シアル酸部分とPEG部分を連結する、置換もしくは非置換のアルキル、あるいは置換もしくは非置換のヘテロアルキルのリンカー部分である。
本発明は、修飾された糖、修飾された糖ヌクレオチド、および修飾された糖のコンジュゲートを提供する。本発明の修飾された糖化合物において、糖部分は、好ましくは、糖、デオキシ糖、アミノ糖、またはN−アシル糖である。「糖」という用語およびその同義語の「サッカリル」、「砂糖」、および「グリコシル」は、モノマー、ダイマー、オリゴマー、およびポリマーを指す。糖部分も、修飾基によって官能化される。修飾基は、通常、糖上のアミン、スルフヒドリル、またはヒドロキシル、例えば、第1級ヒドロキシル部分との結合を通じて、糖部分に結合されている。例示的な実施形態では、修飾基は、糖上のアミン部分を介して、例えば、アミンと修飾基の反応性誘導体との反応によって形成されるアミド、ウレタン、または尿素を介して結合されている。
式中、Gはグリコシル部分であり、Lは、結合またはリンカーであり、R1は修飾基である。例示的な結合は、グリコシル部分のNH2と、修飾基上の相補的に反応する基との間で形成されるものである。したがって、例示的な結合には、それだけには限らないが、NHR1、OR1、SR1などが含まれる。例えば、R1がカルボン酸部分を含むとき、この部分は、活性化され、グリコシル残基上のNH2部分と結合して、NHC(O)R1の構造を有する結合を生じることができる。同様に、OH基およびSH基は、それぞれ、対応するエーテル誘導体またはチオエーテル誘導体に変換され得る。
式中、R3〜R5、およびR7は、H、OH、C(O)CH3、NH、およびNHC(O)CH3からそれぞれ独立に選択されるメンバーである。R6は、前述したOR1、NHR1、またはNH−L−R1である。
式中、L−R1は、前述のとおりであり、L1−R1は、修飾基に結合したリンカーを表す。Lと同様に、L1で示される例示的なリンカー種には、結合、アルキルまたはヘテロアルキル部分が含まれる。これらの実施形態の例示的な修飾された糖ヌクレオチド化合物を、図1および図2に示す。
上式において、R1、L1、およびL2は、前述したとおりのものである。
式中、各基は、前述したとおりのものである。前述の修飾されたサッカリル部分は、2、3、4、または5位の炭素原子においても基質に結合され得ることが、当業者には理解されよう。
式中、R基および添字は、前述したとおりのものである。
式中、R基およびLは、前述した部分を表す。添字「y」は、0、1、または2である。
水溶性ポリマー
多くの水溶性ポリマーが当業者に公知であり、本発明を実施するのに有用である。水溶性ポリマーという用語は、糖(例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリシアル酸、ヘパラン、ヘパリンなど);ポリアミノ酸、例えば、ポリアスパラギン酸およびポリグルタミン酸;核酸;合成ポリマー(例えば、ポリアクリル酸、ポリエーテル、例えば、ポリエチレングリコール);ペプチド、タンパク質などの化学種を包含する。本発明は、任意の水溶性ポリマーを用いて実施してよく、唯一の制約は、そのポリマーが、コンジュゲートの残りの部分が結合され得る箇所を含んでいなければならないことである。
式中、R8は、H、OH、NH2、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、例えば、アセタール、OHC−、H2N−(CH2)q−、HS−(CH2)q、または−(CH2)qC(Y)Z1である。添字「e」は、1〜2500の整数を表す。添字b、d、およびqは、それぞれ独立に整数0〜20を表す。記号ZおよびZ1は、それぞれ独立に、OH、NH2、脱離基、例えば、イミダゾール、p−ニトロフェニル、HOBT、テトラゾール、ハライド、S−R9、活性化エステルのアルコール部分;−(CH2)pC(Y1)V、または−(CH2)pU(CH2)sC(Y1)Vを表す。記号Yは、H(2)、=O、=S、=N−R10を表す。記号X、Y、Y1、A1、およびUは、それぞれ独立に、O、S、N−R11部分を表す。記号Vは、OH、NH2、ハロゲン、S−R12、活性化エステルのアルコール成分、活性化アミドのアミン成分、糖ヌクレオチド、およびタンパク質を表す。添字p、q、s、およびvは、整数0〜20からそれぞれ独立に選択されるメンバーである。記号R9、R10、R11、およびR12は、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアリールをそれぞれ独立に表す。
式中、R8およびR8’は、R8に関して上記に定義した群からそれぞれ独立に選択されるメンバーである。A1およびA2は、A1に関して上記に定義した群からそれぞれ独立に選択されるメンバーである。添字e、f、o、およびqは、前述したとおりのものである。ZおよびYは、前述したとおりのものである。X1およびX1’は、S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH、およびNHC(O)O、OC(O)NHからそれぞれ独立に選択されるメンバーである。
式中、e、f、およびf’は、それぞれ独立に選択された1〜2500の整数であり、q、q’、およびq’’は、それぞれ独立に選択された1〜20の整数である。
ならびに、以下のものなどこれらの化学種のカルボナートおよび活性エステルを含む。
式中、XaはOまたはSであり、rは、1〜5の整数である。添字eおよびfは、1〜2500からそれぞれ独立に選択される整数である。
糖部分が水溶性ポリマーで修飾されている、水溶性ポリマーで修飾されたヌクレオチド糖種が、本発明において有用である。例示的な修飾された糖ヌクレオチドは、糖上のアミン部分を介して修飾されている糖基を有する。修飾された糖ヌクレオチド、例えば、糖ヌクレオチドのサッカリル−アミン誘導体も、本発明の方法において有用である。例えば、(修飾基の付いていない)サッカリルアミンをペプチド(または他の化学種)に酵素的に結合させ、続いて、その遊離なサッカリルアミン部分を所望の修飾基に結合させることができる。あるいは、修飾された糖ヌクレオチドが、基質、例えば、ペプチド、グリコペプチド、脂質、アグリコン、糖脂質などにあるサッカリル受容体に修飾された糖を転移させる酵素の基質として機能することもできる。
式中、X4は、結合またはOである。
式中、X4は、Oまたは結合である。
式中、X4は、結合またはOである。
別の実施形態では、前述のものと類似して、修飾された糖は、水溶性ポリマーではなく水不溶性ポリマーを含む。本発明のコンジュゲートは、1種または複数の水不溶性ポリマーを含んでもよい。本発明のこの実施形態は、制御された方式で治療ペプチドを送達するのに用いられるビヒクルとしてコンジュゲートを使用することによって例示される。高分子薬物の送達システムは、当技術分野で公知である。例えば、Dunn他編、POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS、ACS Symposium Series 469巻、American Chemical Society、ワシントン、D.C.1991年を参照のこと。実質上どの公知の薬物送達システムも本発明のコンジュゲートに適用可能であることが、当業者には理解されよう。
上述のコンジュゲートに加えて、本発明は、これらおよび他のコンジュゲートを調製するための方法も提供する。したがって、他の態様では、本発明は、選択された部分とG−CSFペプチドの間の共有結合性コンジュゲートを形成させる方法を提供する。さらに、本発明は、身体の特定の組織または領域に本発明のコンジュゲートを標的化させるための方法も提供する。
上述のコンジュゲートに加えて、本発明は、これらおよび他のコンジュゲートを調製するための方法も提供する。さらに、本発明は、ある疾患になる危険にさらされている被験者またはその疾患を罹患している被験者に本発明のコンジュゲートを投与することによって、疾患状態を予防、治癒、または改善する方法も提供する。
式中、Dは、−OHまたはR1−L−HN−である。記号Gは、R1−L−または−C(O)(C1〜C6)アルキルを示す。R1は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基を含む部分である。記号Lは、結合、置換もしくは非置換のアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアルキルから選択されるリンカーを表す。通常、DがOHであるとき、GはR1−L−であり、Gが−C(O)(C1〜C6)アルキルであるとき、DはR1−L−NH−である。本発明の方法は、(a)基質のG−CSFペプチドを、PEG−シアル酸供与体と、供与体に由来するPEG−シアル酸部分を基質G−CSFペプチドに転移させることができる酵素とに接触させる工程を含む。
転移に適した条件のもとで、G−CSFペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基上にPEG−シアル酸を転移させる酵素である。
アシル結合型コンジュゲートを形成する状況で前述した酵素の他に、他の酵素を利用する方法によって、コンジュゲートのグリコシル化パターンおよび出発基質(例えば、ペプチド、脂質)を加工し、トリミングし、さもなければ、修飾することができる。糖供与体を受容体に転移させる酵素を用いてペプチドおよび脂質を再構築する方法が、2003年4月17日公開のDeFreesのWO03/031464A2号で非常に詳細に考察されている。本発明の方法で有用な選択された酵素を簡単に要約して以下に示す。
グリコシルトランスフェラーゼは、タンパク質、グリコペプチド、脂質もしくは糖脂質、または、伸長中のオリゴ糖の非還元末端に、活性化された糖(供与体のNDP−糖またはNMP−糖)を段階的に付加させる触媒となる。N−結合型グリコペプチドは、トランスフェラーゼおよび脂質結合型オリゴ糖供与体Dol−PP−NAG2Glc3Man9によって、ひとまとめの転移とそれに続くコアのトリミングによって合成される。この場合、「コア」の糖の性質は、後続の付加物とはいくらか異なる。非常に多くのグリコシルトランスフェラーゼが、当技術分野では公知である。
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用するグリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼである。フコシルトランスフェラーゼは、当業者には公知である。例示的なフコシルトランスフェラーゼとしては、L−フコースをGDP−フコースから受容体糖のヒドロキシ位置に転移させる酵素が挙げられる。ヌクレオチドを含まない糖を受容体に転移させるフコシルトランスフェラーゼも、本発明において有用である。
実施形態の別の群では、グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼである。例示的なガラクトシルトランスフェラーゼとしては、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼが挙げられる(E.C.No.2.4.1.151、例えば、Dabkowski他、Transplant Proc.25:2921(1993年)およびYamamoto他、Nature345:229〜233頁(1990年)を参照のこと。ウシ由来(Genbank j04989、Joziasse他、J.Biol.Chem.264:14290〜14297頁(1989年))、マウス由来(GenBank m26925;Larsen他、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA86:8227〜8231頁(1989年))、ブタ由来(GenBank L36152;Strahan他、Immunogenetics 41:101〜105頁(1995年))。他の適切なα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼは、B血液型抗原の合成に関与しているものである(EC2.4.1.37、Yamamoto他、J.Biol.Chem.265:1146〜1151(1990年)(ヒト))。さらに別の例示的なガラクトシルトランスフェラーゼは、コアGal−T1である。
シアリルトランスフェラーゼは、組換え細胞および本発明の反応混合物で有用な別のタイプのグリコシルトランスフェラーゼである。組換型シアリルトランスフェラーゼを産生する細胞は、シアリルトランスフェラーゼに対するシアル酸供与体であるCMP−シアル酸も産生すると考えられる。発明で使用するのに適したシアリルトランスフェラーゼの例としては、ST3Gal III(例えば、ラットまたはヒトのST3Gal III)、ST3Gal IV、ST3Gal I、ST3Gal II、ST6Gal I、ST3Gal V、ST6Gal II、ST6GalNAc I、ST6GalNAc II、およびST6Gal NAcIIIが挙げられる(本明細書で使用するシアリルトランスフェラーゼの命名法は、Tsuji他、Glycobiology6:5〜14頁(1996年)で記載されているものである)。α(2,3)シアリルトランスフェラーゼ(EC2.4.99.6)と呼ばれる例示的なα(2,3)シアリルトランスフェラーゼは、2糖Galβ1→3Glcの非還元末端Galまたはグリコシドにシアル酸を転移させる。Van den Eijnden他、J.Biol.Chem.256:3159頁(1981年)、Weinstein他、J.Biol.Chem.257:13845頁(1982年)、およびWen他、J.Biol.Chem.267:21011頁(1992年)を参照のこと。別の例示的な2,3−シアリルトランスフェラーゼ(EC 2.4.99.4)は、2糖の非還元末端Galまたはグリコシドにシアル酸を転移させる。Rearick他、J.Biol.Chem.254:4444頁(1979年)およびGillespie他、J.Biol.Chem.267:21004頁(1992年)を参照のこと。別の例示的な酵素としては、Gal−β−1,4−GlcNAc α−2,6シアリルトランスフェラーゼが挙げられる(Kurosawa他、Eur.J.Biochem.219:375〜381頁(1994年)を参照のこと)。
1)Goochee他、Bio/Techology9:1347〜1355頁(1991年)
2)Yamamoto他、J.Biochem.120:104〜110頁(1996年)
3)Gilbert他、J.Biol.Chem.271:28271〜28276頁(1996年)
N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、本発明を実施する際、特に、ペプチドのO−結合型グリコシル化部位のアミノ酸にGalNAc部分を結合させるのに有用である。適切なN−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼとしては、それだけには限らないが、α(1,3)N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β(1,4)N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ(Nagata他、J.Biol.Chem.267:12082〜12089頁(1992年)およびSmith他、J.BiolChem.269:15162頁(1994年))、ならびにポリペプチドN−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ(Homa他、J.Biol.Chem.268:12609頁(1993年))が挙げられる。
別の実施形態では、本発明の方法で使用される酵素は、細胞結合型グリコシルトランスフェラーゼである。多くの可溶性グリコシルトランスフェラーゼが公知であるが(例えば、米国特許第5032519号を参照のこと)、グリコシルトランスフェラーゼは一般に、細胞と結合するとき、膜結合型である。これまで研究されている膜結合型酵素の多くは、内因性のタンパク質とみなされている。すなわち、それらは、超音波処理によっては膜から遊離されず、可溶化するために界面活性剤を必要とする。表面型のグリコシルトランスフェラーゼが、脊椎動物細胞および無脊椎動物細胞の表面で確認されており、これらの表面型トランスフェラーゼは生理的条件下で触媒活性を維持することも認識されている。しかし、細胞表面型グリコシルトランスフェラーゼのより知られている機能は、細胞間認識のためのものである(Roth、MOLECULAR APPROACHES to SUPRACELLULAR PHENOMENA、1990年)。
本発明は、例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸、カラギーナン、および関連化合物などの硫酸化多糖を含めて、硫酸化分子を含むペプチドを作製するための方法も提供する。適切なスルホトランスフェラーゼとしては、例えば、コンドロイチン−6−スルホトランスフェラーゼ(Fukuta他、J.Biol.Chem.270:18575〜18580頁(1995年)によって記載されているニワトリcDNA;GenBankアクセッション番号D49915)、グリコサミノグリカンN−アセチルグルコサミンN−デアセチラーゼ/N−スルホトランスフェラーゼ1(Dixon他、Genomics 26:239〜241頁(1995年);UL18918)、ならびにグリコサミノグリカンN−アセチルグルコサミンN−デアセチラーゼ/N−スルホトランスフェラーゼ2(Orellana他、J.Biol.Chem.269:2270〜2276頁(1994年)およびEriksson他、J.Biol.Chem.269:10438〜10443頁(1994年)で記載されているマウスcDNA;GenBankアクセッション番号U2304で記載されているヒトcDNA)が挙げられる。
本発明は、野生型グリコシダーゼおよび変異型グリコシダーゼの使用も包含する。変異型β−ガラクトシダーゼ酵素は、α−グリコシルフルオリドをガラクトシル受容体分子に結合させることによって二糖類の形成を触媒することが明らかにされている(Withers、2001年9月4日発行の米国特許第6284494号)。本発明において有用な他のグリコシダーゼとしては、例えば、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−アセチルグルコサミニダーゼ、β−N−アセチルガラクトサミニダーゼ、β−キシロシダーゼ、β−フコシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ、α−N−アセチルグルコサミニダーゼ、α−N−アセチルガラクトース−アミニダーゼ、α−キシロシダーゼ、α−フコシダーゼ、およびノイラミニダーゼ/シアリダーゼが挙げられる。
本発明は、固体および/または可溶性の支持体上に固定化された酵素の使用も提供する。例示的な実施形態では、本発明の方法による完全なグリコシルリンカーを介してPEGに結合されているグリコシルトランスフェラーゼが提供される。PEG−リンカー−酵素コンジュゲートは、場合によっては、固体支持体に結合されている。本発明の方法において固体に支持された酵素を使用することにより、反応混合物の精密な検査および反応生成物の精製が簡易になり、また、酵素を容易に回収することも可能になる。グリコシルトランスフェラーゼコンジュゲートは、本発明の方法で利用される。酵素および支持体の他の組合せ物は、当業者には明らかであろう。
他の例示的な実施形態では、本発明の方法は、所望のグリコペプチドコンジュゲートの合成に関与している複数の酵素活性を有する融合タンパク質を利用する。融合ポリペプチドは、例えば、補助酵素の触媒活性ドメインに結合しているグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性ドメインから構成されるものでよい。補助酵素の触媒ドメインは、例えば、グリコシルトランスフェラーゼのための供与体であるヌクレオチド糖を形成する工程を触媒することができ、または、グリコシルトランスフェラーゼサイクルに関与している反応を触媒することができる。例えば、グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを、ヌクレオチド糖合成に関与している酵素をコードするポリヌクレオチドにインフレームで結合させることができる。得られた融合タンパクは、次に、ヌクレオチド糖の合成だけでなく、受容体分子への糖部分の転移も触媒することができる。融合タンパク質は、1つの発現可能なヌクレオチド配列に結合された2種以上のサイクル酵素になることができる。他の実施形態では、融合タンパク質は、2種以上のグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性ドメインを含む。例えば、5641668を参照のこと。本発明の修飾されたグリコペプチドは、様々な適切な融合タンパク質を利用することによって、容易に設計し製造することができる(例えば、1999年6月24日にWO99/31224号として公開されたPCT特許出願PCT/CA98/01180号を参照のこと)。
一般に、糖部分または糖部分−リンカーカセットと、PEGまたはPEG−リンカーカセット基は、反応性基の使用を通じて相互に結合され、それらは通常、結合プロセスによって、新しい有機官能基または非反応性化学種に変換される。糖の反応性官能基は、糖部分の任意の位置に位置する。本発明を実施する際に有用な反応性基および反応の種類は、通常、バイオコンジュゲート化学の分野で周知のものである。反応性の糖部分を用いて利用可能な反応の現時点で好ましい種類は、比較的緩和な条件下で進行する反応である。これらには、それだけには限らないが、求核置換反応(例えば、アミンおよびアルコールとハロゲン化アシル、活性エステルとの反応)、求電子置換反応(例えば、エナミン反応)、ならびに炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合への付加反応(例えば、マイケル反応、ディールス−アルダー反応)が含まれる。これらおよび他の有用な反応は、例えば、March、ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY、第3版、John Wiley&Sons、ニューヨーク、1985年;Hermanson、BIOCONJUGATE TECHNIQUES、Academic Press、サンディエゴ(San Diego)、1996年;およびFeeneyら、MODIFICATION OF PROTEINS;Advances in Chemistry Series、198巻、American Chemical Society、ワシントンD.C.、1982年で論じられている。
(a)それだけには限らないが、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、β−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、芳香族エステルを含めて、カルボキシル基および様々なその誘導体、
(b)例えば、エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換することができるヒドロキシル基、
(c)例えば、アミン、カルボキシラートアニオン、チオールアニオン、カルボアニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核基でハライドが後に置換され、それによって、ハロゲン原子の官能基位置に新しい基を共有結合させることができるハロアルキル基、
(d)ディールス−アルダー反応に参加することができる求ジエン体の基、例えば、マレイミド基、
(e)例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン、もしくはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介して、または、グリニャール付加やアルキルリチウム付加などの機序を介して、その後に誘導体化することが可能であるようなアルデヒド基またはケトン基、
(f)例えば、スルホンアミドを形成するために、その後でアミンと反応させるためのスルホニルハライド基、
(g)例えば、ジスルフィドに変換させ、またはハロゲン化アシルと反応させることができる、チオール基、
(h)例えば、アシル化、アルキル化、または酸化することができる、アミン基またはスルフヒドリル基、
(i)例えば、環化付加、アシル化、マイケル付加などを受けることができるアルケン、ならびに、
(j)例えば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応することができるエポキシド。
式中、Xは、−O−、−N(H)−、−S、−CH2−、およびN(R)2(各Rは、R1〜R5からそれぞれ独立に選択されるメンバーである)から好ましくは選択される、結合基である。記号Y、Z、A、およびBはそれぞれ、Xを確認するために前述した群から選択される基を示す。X、Y、Z、A、およびBは、それぞれ独立に選択され、したがって、同じものでも異なるものでもよい。記号R1、R2、R3、R4、およびR5は、H、PEG部分、治療効果のある部分、生体分子、またはその他の部分を表す。あるいは、これらの記号は、PEG部分、治療効果のある部分、生体分子、またはその他の部分に結合しているリンカーを表す。
本発明の方法で使用するための修飾された糖の調製は、糖残基にPEG部分を付加し、好ましくは、グリコシルトランスフェラーゼの基質となる安定な付加物を形成させることを含む。したがって、リンカー、例えば、PEGおよび糖を結合させるための架橋剤とPEGおよび糖の反応によって形成されるものを使用することが多くの場合好ましい。修飾基を糖部分に結合させるのに使用することができる例示的な二官能化合物としては、それだけには限らないが、二官能性ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステルなどが挙げられる。糖を他の分子に結合させるための一般的手法は、文献で公知である。例えば、Lee他、Biochemistry 28:1856頁(1989年);Bhatia他、Anal Biochem.178:408(1989年);Janda他、J.Am.Chem.Soc.112:8886頁(1990年)、およびBednarski他、WO92/18135を参照のこと。以下の考察では、反応性基は、新生の修飾された糖の糖部分上で好都合に処理される。考察の焦点は、例示を明確にするためのものである。この考察は、修飾基上の反応性基にも同様に関連していることが、当業者には理解されよう。
不溶性G−CSFのリフォールディング
細菌で発現される多くの組換えタンパク質は、細菌封入体中で不溶性の凝集体として発現される。封入体とは、細菌の細胞質および細胞周辺腔の双方に存在するタンパク質沈着物である(例えば、Clark、Cur.Op.Biotech.12:202〜207頁(2001年)を参照のこと)。組換えG−CSFタンパク質は細菌の封入体で発現される。また、活性なG−CSFタンパク質を作製するためにこれらのタンパク質をリフォールディングするための方法が、本明細書で提供される。
細菌細胞から活性G−CSFタンパク質を作製するために、G−CSFタンパク質を細菌の封入体で発現させ、細菌を回収、破砕し、封入体を単離および洗浄する。一実施形態では、洗浄を3回行う。すなわち、pH6.0〜9.0の緩衝液(1価の塩、例えば、塩化ナトリウム;非イオン性界面活性剤、例えば、TritonX−100;イオン性界面活性剤、例えば、デオキシコール酸ナトリウム;およびEDTA)で1回目の洗浄を行い、界面活性剤を含まない緩衝液中で2回目の洗浄を行い、H2O中で3回目の洗浄を行う。次に、封入体内部のタンパク質を可溶化する。変性剤、塩化グアニジアムもしくは尿素、極端なpH、界面活性剤、またはこれらの任意の組合せを用いて、可溶化を行うことができる。一実施形態では、5〜6Mの塩酸グアニジンまたは尿素が、GCSFを可溶化するのに使用される。別の実施形態では、DTTが加えられる。
別法として、上記の方法で作製した生成物を、精製せずに使用することもできる。しかし、通常は、生成物を回収することが好ましい。薄層もしくは厚層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または膜ろ過など、グリコシル化された糖を回収するための標準的な周知の技術を使用することができる。以下および本明細書に引用する文献で説明されているように、より好ましくは逆浸透膜による膜ろ過、または、1種もしくは2種のカラムクロマトグラフィー法を回収のために使用することが好ましい。例えば、分子量カットオフ値が約3000〜10,000の膜による膜ろ過を用いて、グリコシルトランスフェラーゼなどのタンパク質を除去することができる。次に、ナノろ過または逆浸透法を用いて、塩類の除去および/または糖生成物の精製を行うことができる(例えば、WO98/15581号を参照のこと)。ナノフィルター膜は、使用する膜に応じて、1価の塩類を通過させるが多価の塩類および約100〜約2000ダルトンより大きい非荷電の溶質は保持する、ある種類の逆浸透膜である。したがって、典型的な適用例では、本発明の方法によって調製される糖は膜内に保持され、混入している塩は通過すると考えられる。
別の態様では、本発明は、薬剤組成物を提供する。この薬剤組成物は、製薬上許容される希釈剤、ならびに非天然のPEG部分、治療効果のある部分、または生体分子とグリコシル化ペプチドおよび非グリコシル化ペプチドとの共有結合性コンジュゲートを含む。ポリマー、すなわち治療効果のある部分または生体分子は、G−CSFペプチドとポリマー、すなわち治療効果のある部分または生体分子の双方の間に介在し、かつそれらに共有結合している完全なグリコシル結合基を介してG−CSFペプチドに結合している。
a.アシアロ−顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)の調製
CHO細胞で産生されたG−CSFを50mM Tris、50mM Tris−HCl pH7.4、0.15M NaCl、5mMCaCl2中に2.5mg/mLで溶解させ、Centricon Plus20遠心ろ過機で500uLに濃縮する。その溶液を、300mU/mLのノイラミニダーゼII(ビブリオ コレラ(Vibrio cholerae))とともに、32℃で16時間インキュベートする。反応を観察するために、反応物を少量分取して適切な緩衝液で希釈し、ゲルIEFを実施する。次に、反応物を予め洗浄したN−(p−アミノフェニル)オキサミド酸−アガロースコンジュゲートに加え(反応体積800μL/mL)、洗浄したビーズを4℃で24時間、穏やかに回転させる。混合物を10,000rpmで遠心分離し、上清を集めた。Tris−EDTA緩衝液で3回、0.4mLのTris−EDTA緩衝液で1回、0.2mLのTris−EDTA緩衝液で1回、ビーズを洗浄し、上清をすべて集めてためる。上清を50mM Tris−HCl pH7.4、1M NaCl、0.05%NaN3に対して、次いで、50mM Tris−HCl pH7.4、1M NaCl、0.05%NaN3に対してさらに2回、4℃で透析する。次に、透析した溶液をCentricon Plus20遠心ろ過機を用いて濃縮し、−20℃で保管する。ゲルIEFのための条件は、Invitrogen社によって提供される手順および試薬に従って実施した。天然のG−CSFおよび脱シアル酸されたG−CSFを水に対して透析し、MALDI−TOF MSによって解析する。
脱シアル酸されたG−CSFを50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05% NaN3、pH7.2中に2.5mg/mLで溶解させた。その溶液を、1mMのCMP−シアル酸−PEGおよび0.1U/mLのST3Gal1とともに、32℃で2日間インキュベートする。シアル酸−PEGの組込みを観察するために、反応物の少量の分取物にCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加えた。PBS緩衝液(pH7.1)を用いてToso Haas G3000SW分析カラムでゲルろ過することにより、ペプチドに取り込まれた標識を遊離の標識から分離する。インライン蛍光検出器を用いてペプチド中への蛍光標識の取込みを定量する。2日後、PBS緩衝液(pH7.1)を用いてToso Haas G3000SW分離カラムを使用し、紫外線吸収に基づいて画分を回収して、反応混合物を精製する。Invitrogen社によって提供される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF解析を用いて、反応生成物を解析する。天然のG−CSFおよびPEG化G−CSFのサンプルを水に対して透析し、MALDI−TOF MSによって解析する。
α2,3−シアル酸付加O結合型グリカンを含有する、CHO細胞で産生されたG−CSFを、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN3、pH7.2中に2.5mg/mLで溶解させる。その溶液を、1mMのCMP−シアル酸−PEGおよび0.1U/mLのCST−IIとともに、32℃で2日間インキュベートする。シアル酸−PEGの組込みを観察するために、反応物の少量の分取物にCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加えた。PBS緩衝液(pH7.1)を用いてToso Haas G3000SW分析カラムでゲルろ過することにより、ペプチドに取り込まれた標識を遊離の標識から分離する。シアル酸−PEGの組込みを観察するために、反応物の少量の分取物にCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加えた。PBS緩衝液(pH7.1)を用いてToso Haas G3000SW分析カラムでゲルろ過することにより、ペプチドに取り込まれた標識を遊離の標識から分離する。インライン蛍光検出器を用いてペプチド中への蛍光標識の取込みを定量する。2日後、PBS緩衝液(pH7.1)を用いてToso Haas G3000SW分離カラムを使用し、紫外線吸収に基づいて画分を回収して、反応混合物を精製する。Invitrogen社によって提供される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF解析を用いて、反応生成物を解析する。天然のG−CSFおよびPEG化G−CSFのサンプルを水に対して透析し、MALDI−TOF MSによって解析する。
O結合型GalNacのみを含有するG−CSFを、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN3、pH7.2中に2.5mg/mLで溶解させる。その溶液を、1mMのCMP−シアル酸−PEGおよび0.1U/mLのST6GalNacIまたはIIとともに、32℃で2日間インキュベートする。シアル酸−PEGの組込みを観察するために、反応物の少量の分取物にCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加えた。PBS緩衝液(pH7.1)を用いてToso Haas G3000SW分析カラムでゲルろ過することにより、ペプチドに取り込まれた標識を遊離の標識から分離する。インライン蛍光検出器を用いてペプチド中への蛍光標識の取込みを定量する。2日後、PBS緩衝液(pH7.1)を用いてToso Haas G3000SW分離カラムを使用し、紫外線吸収に基づいて画分を回収して、反応混合物を精製する。Invitrogen社によって提供される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF解析を用いて、反応生成物を解析する。天然のG−CSFおよびPEG化G−CSFのサンプルを水に対して透析し、MALDI−TOF MSによって解析する。
・遠心分離によって細胞を回収し、上清を廃棄する。様々な培地上での増殖の結果を図9に示す。
・10mM Tris pH7.4、75mM NaCl、5mM EDTA(10ml/gで使用、溶解緩衝液)中に細胞沈殿物を再懸濁する。
・細胞を微細な流体にする(Microlluidize)(フレンチプレスも同様に使える)。
・5,000RPM、4℃で30分、遠心分離する。上清を廃棄する。
・沈殿物を溶解緩衝液中に再懸濁させ、上記と同じように遠心分離する。
・25mM Tris pH8、100mM NaCl、1% TX−100、1% NaDOC、5mM EDTA中でIBを洗浄する。ピペッティングおよびボルテックス処理によって、沈殿物を再懸濁させる。5,000RPM、4℃で15分、遠心分離する。この工程をもう1回繰り返す(合計2回洗浄)
・25mM Tris pH8、100mM NaCl、5mM EDTA中で沈殿物を2回洗浄して界面活性剤を除去する。上記と同じように遠心分離する。
・沈殿物をdH2O中に再懸濁して一定量にし、上記と同じように遠心分離する。沈殿物を−20℃で凍結する。
・ピペットを用いて、6M塩酸グアニジン、5mM EDTA、100mM NaCl、100mM Tris pH8、10mM DTT中に20mg/mlでIBを再懸濁し、続いて、室温で2〜4時間回転させる。
・14,000RPM、室温で1分間、可溶化したIBを遠心分離する。上清を取っておく。
・リフォールディング用緩衝液50mM MES pH6、240mM NaCl、10mMを用いて1:20の比で上清を希釈する。
・KCl、0.3mMラウリルマルトシド、0.055% PEG3350、1mM GSH、0.1M GSSG、0.5Mアルギニン。4℃で一晩、ローテーター上でリフォールディングさせる。
・リフォールディング物を透析用のピアススネークスキン(7kDa MWCO)に移す。透析緩衝液:20mM NaOAc pH4、50mM NaCl、0.005%Tween−80、0.1mM EDTA。少なくとも200倍を超える量に対して、4℃で合計3回透析する。
・透析後、0.45μMフィルターに物質を通す。
・透析緩衝液でSP−セファロースカラムを平衡化し、サンプルを添加する。透析緩衝液でカラムを洗浄し、最大1M NaClの塩勾配を有する透析緩衝液で溶出させる。タンパク質は、通常、300〜400mM NaClで溶出される。
・SDS−PAGEで物質を検査する(例えば、図10を参照のこと)。
以下の実施例は、各中間生成物が次の工程で使用される前に精製される、2つの連続した工程でのG−CSF−GalNAc−SA−PEGの調製を例示する。
UFフィルター(MWCO 5K)を用いた限外ろ過によって、容器に入れた緩衝液3.2mL中のG−CSF(960mcg)を濃縮し、次いで、1mLの25mM MES緩衝液(pH6.2、0.005%NaN3)に溶解した。次に、UDP−GalNAc(6mg、9.24mM)、GalNAc−T2(40μL、0.04U)、および100mM MnCl2(40μL、4mM)を加えて、得られた溶液を室温でインキュベートした。
タンパク質1mgを含有するG−CSF−GalNAc溶液を25mM MES緩衝液(pH6.2、0.005%NaN3)中に入れてバッファー交換し、CMP−SA−PEG(20KDa)(5mg、0.25umol)を加えた。溶解後、MnCl2(100mcL、100mM溶液)およびST6GalNAc−I(100mcL、マウス酵素)を加え、反応混合物を32℃で3日間、ゆっくりと揺り動かした。限外ろ過(MWCO 5K)によって反応混合物を濃縮し、25mM NaOAc(pH4.9)で1回バッファー交換し、次に、濃縮して全体積を1mLにした。次に、保持時間13〜18分のSP−sepharose(A:25mM NaOAc+0.005%tween−80 pH4.5;B:25mM NaOAc+0.005%tween−80 pH4.5+2M NaCl)、保持時間8.6分のSEC(スーパーデックス75;PBS−pH 7.2、0.005%Tween80)(スーパーデックス75、流速1ml/分)を用いて、生成物を精製した。所望の画分を回収し、濃縮して0.5mLにし、4℃で保管した。
以下の実施例は、酵素の同時付加を用いたワンポットでのG−CSF−GalNAc−SA−PEGの調製を例示する。
限外ろ過(MWCO 5K)によって、G−CSF(3.2mLの生成物調製緩衝液中に溶解した960μgのタンパク質)を0.5mlに濃縮し、25mM MES緩衝液(pH6.0、0.005%NaN3)で溶解して、全体積を約1mLにし、またはタンパク質濃度を1mg/mLにした。次に、UDP−GalNAc(6mg、9.21μmol)、GalNAc−T2(80μL、80mU)、CMP−SA−PEG(20KDa)(6mg、0,3μmol)、ならびにマウス酵素ST6GalNAc−I(120μL)および100mMMnCl2(50L)を加えた。32℃で48時間、溶液を揺り動かし、標準のクロマトグラフィー条件を用いてSP−sepharoseで精製した。合計0.5mgのタンパク質(A280)が得られ、または、全収率約50%であった。MALDIおよびSDS−PAGEの双方を用いた解析によって、生成物の構造を確認した。
14.4mgのG−CSFを濃縮して最終体積を3mLにし、25mM MES緩衝液(pH6.0、0.005%NaN3、0.004%Tween80)でバッファー交換し、また、体積を13mLに調整した。次に、UDP−GalNAc(90mg、150μモル)、GalNAc−T2(0.59U)、CMP−SA−PEG−20KDa(90mg)、ニワトリST6GalNAc−I(0.44U)、および100mM MnCl2(600mcL)を加えた。得られた混合物を室温で60時間放置した。次に、UF(MWCO 5K)および遠心分離によって、反応混合物を濃縮した。残留物(約2mL)を25mMNaOAc緩衝液(pH4.5)中に溶解させ、再度濃縮して最終体積を5mLにした。SP−sepharoseを約10〜23分、SEC(スーパーデックス75、17分、流速0.5ml/分)、さらにSEC(スーパーデックス200、23分、流速0.5ml/分)を用いてサンプルを精製して、3.6mg(全収率25%)のG−CSF−GalNAc−SA−PEG−20KDa(A280およびBCA法)を得た。
以下の実施例は、酵素の連続付加を用いてワンポットでG−CSF−GalNAc−Gal−SA−PEGを作製するための方法を例示する。
a.GalNAc−T2を用いた、G−CSFおよびUDP−GalNAcからのG−CSF−GalNAc(pH6.2)の調製
UFフィルター(MWCO 5K)を用いたutrafiltrationによって、容器に入れた緩衝液3.2mL中のG−CSF(960mcg)を濃縮し、次いで、1mLの25mM MES緩衝液(pH6.2、0.005%NaN3)に溶解した。次に、UDP−GalNAc(6mg、9.24mM)、GalNAc−T2(40μL、0.04U)、および100mM MnCl2(40μL、4mM)を加えて、得られた溶液を室温でインキュベートした。
UDP−ガラクトース(4mg、6.5μモル)、コア−1−Gal−T(320μL、160mU)、CMP−SA−PEG−20KDa(8mg、0.4μモル)、ST3Gal2(80μL、0.07mU)および100mM MnCl2(80μL)を、上記の工程aから得られる、25mM MES緩衝液(pH6.0)1.5ml中のG−CSF−GalNAcの粗製な反応混合物(1.5mg)に直接加えた。得られた混合物を32℃で60時間放置した反応混合物を遠心分離し、限外ろ過(MWCO 5K)によって0.2mLに濃縮し、次に、25mM NaOAc(pH4.5)で溶解して最終体積を1mLにした。SP−sepharose(保持時間10〜15分)を用いて生成物を精製し、スピンフィルター(MWCO 5K)を用いてピーク画分を濃縮し、さらにSEC(スーパーデックス75、保持時間10.2分)を用いて残留物を精製した。スピンフィルター(MWCO 5K)を用いて濃縮した後、PBS、2.5%マンニトール、0.005%ポリソルベート、pH6.5の調製緩衝液によって、タンパク質を1mLに希釈し、タンパク質濃度が1mL当たり850mcgのタンパク質となるように調製した(A280)。全収率は55%であった。
a.G−CSF.からの出発
限外ろ過(MWCO 5K)によって、G−CSF(960mcg、3.2ml)を濃縮し、25mM Mes緩衝液(pH6.0、0.005%NaN3)で溶解した。G−CSF溶液の全体積は約1mg/mlとした。UDP−GalNAc(6mg)、GalNAc−T2(80μL、〜80μU)、UDP−Gal(6mg)、コア1 GalT(160μL、80μU)、CMP−SA−PEG(20K)(6mg)、およびα2,3−(O)−シアリルトランスフェラーゼ(160μL、120μU)、100mM MnCl2(40μL)を加えた。得られた混合物を32℃で48時間インキュベートした 後述するように、IEXおよびSECを用いて精製を実施した。限外ろ過(MWCO 5K)によって、生成物を含有する得られた画分を濃縮し、緩衝液で体積を約1mLに調整した。タンパク質濃度は、A280により0.392mg/mlと測定され、G−CSFからの全収率は40%となった。
Claims (19)
- 以下の部分を含む顆粒球コロニー刺激因子ペプチド。
Gは、R1−L−および−C(O)(C1〜C6)アルキルから選択されるメンバーであり、
R 1 は、分枝状のポリエチレングリコール残基を含む部分であり、
Lは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
DがOHであるとき、GはR1−L−であり、Gが−C(O)(C1〜C6)アルキルであるとき、DはR1−L−NH−であり、
R 1 が以下の群から選択されるメンバーである構造を有する:
- L−R1が以下の式で表される、請求項1に記載のペプチド。
- 前記部分が以下の式で表される、請求項1に記載のG−CSFペプチド。
- 前記部分が以下の式で表される、請求項1に記載のG−CSFペプチド。
- 前記部分が以下の式で表される、請求項1に記載のG−CSFペプチド。
- 前記アミノ酸残基が、セリンまたはトレオニンから選択されるメンバーである、請求項5に記載のG−CSFペプチド。
- 配列番号:1に記載のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のG−CSFペプチド。
- 前記アミノ酸残基が、配列番号:1の133位のトレオニンである、請求項7に記載のG−CSFペプチド。
- 配列番号:1および配列番号:2から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のペプチド。
- 前記部分が以下の式で表される、請求項1に記載のG−CSFペプチド。
qは1であり、
e、f、g、およびhは、0〜6の整数からそれぞれ独立に選択されるメンバーであり、
j、k、l、およびmは、0〜100の整数からそれぞれ独立に選択されるメンバーであり、
v、w、x、およびyは、0および1からそれぞれ独立に選択され、v、w、x、およびyのうちの少なくとも1つが1であり、
AAは、前記G−CSFペプチドのアミノ酸残基であり、
Sia−(R)は、以下の式で表される。
Gは、R1−L−および−C(O)(C1〜C6)アルキルから選択されるメンバーであり、
R 1 は、分枝状のポリエチレングリコール残基を含む部分であり、
Lは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
DがOHであるとき、GはR1−L−であり、Gが−C(O)(C1〜C6)アルキルであるとき、DはR1−L−NH−である。) - 前記アミノ酸残基がアスパラギン残基である、請求項10に記載のペプチド。
- 生理活性を有する顆粒球コロニー刺激因子ペプチドである、請求項1に記載のペプチド。
- 以下の部分を含むG−CSFペプチドコンジュゲートを作製する方法であって、
Gは、R1−L−および−C(O)(C1〜C6)アルキルから選択されるメンバーであり、
R 1 は、分枝状のポリエチレングリコール残基を含む部分であり、
Lは、結合、置換もしくは非置換のアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
DがOHであるとき、GはR1−L−であり、Gが−C(O)(C1〜C6)アルキルであるとき、DはR1−L−NH−であり、
R 1 が以下から選択されるメンバーである構造を有する:
(a)転移に適した条件のもとで、基質のG−CSFペプチドを、以下の式で表されるPEG−シアル酸供与体部分と、
- L−R1が以下の式で表される、請求項13に記載の方法。
- 前記工程(a)の前に、
(b)適切な宿主中で前記基質顆粒球コロニー刺激因子ペプチドを発現させる工程、をさらに含む、請求項13に記載の方法。 - 前記宿主が昆虫細胞および哺乳動物細胞から選択される、請求項15に記載の方法。
- 哺乳動物における炎症性白血球産生を刺激する医薬を製造するための、請求項1に記載のペプチドの使用。
- 感染症治療剤を製造するための、請求項1に記載のペプチドの使用。
- 請求項1に記載の顆粒球コロニー刺激因子ペプチド、および製薬上許容される担体を含む医薬製剤。
Applications Claiming Priority (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US52679603P | 2003-12-03 | 2003-12-03 | |
US53938704P | 2004-01-26 | 2004-01-26 | |
US55581304P | 2004-03-23 | 2004-03-23 | |
US57028204P | 2004-05-11 | 2004-05-11 | |
US59274404P | 2004-07-29 | 2004-07-29 | |
US61451804P | 2004-09-29 | 2004-09-29 | |
US62338704P | 2004-10-29 | 2004-10-29 | |
PCT/US2004/041004 WO2005055946A2 (en) | 2003-12-03 | 2004-12-03 | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007513189A JP2007513189A (ja) | 2007-05-24 |
JP4657219B2 true JP4657219B2 (ja) | 2011-03-23 |
Family
ID=34682465
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006542886A Expired - Fee Related JP4657219B2 (ja) | 2003-12-03 | 2004-12-03 | GlycoPEG化された顆粒球コロニー刺激因子 |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20070254836A1 (ja) |
EP (1) | EP1694274B1 (ja) |
JP (1) | JP4657219B2 (ja) |
KR (1) | KR101237884B1 (ja) |
CN (1) | CN1897812B (ja) |
AU (1) | AU2004296855B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0417342A (ja) |
CA (1) | CA2549409C (ja) |
ES (1) | ES2422187T3 (ja) |
HK (1) | HK1089685A1 (ja) |
IL (1) | IL175954A (ja) |
MX (1) | MXPA06006029A (ja) |
NZ (1) | NZ547554A (ja) |
WO (1) | WO2005055946A2 (ja) |
ZA (1) | ZA200604555B (ja) |
Families Citing this family (55)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7214660B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
US8008252B2 (en) | 2001-10-10 | 2011-08-30 | Novo Nordisk A/S | Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII |
US7795210B2 (en) | 2001-10-10 | 2010-09-14 | Novo Nordisk A/S | Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
US7157277B2 (en) | 2001-11-28 | 2007-01-02 | Neose Technologies, Inc. | Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII |
AU2004236174B2 (en) | 2001-10-10 | 2011-06-02 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
DE60336555D1 (de) | 2002-06-21 | 2011-05-12 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Pegylierte glykoformen von faktor vii |
CA2519092C (en) | 2003-03-14 | 2014-08-05 | Neose Technologies, Inc. | Branched water-soluble polymers and their conjugates |
US8791070B2 (en) | 2003-04-09 | 2014-07-29 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
ES2380093T3 (es) | 2003-05-09 | 2012-05-08 | Biogenerix Ag | Composiciones y métodos para la preparación de mutantes de glucosilación de la hormona del crecimiento humana |
WO2005012484A2 (en) | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Neose Technologies, Inc. | Antibody-toxin conjugates |
US8633157B2 (en) | 2003-11-24 | 2014-01-21 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin |
US7842661B2 (en) | 2003-11-24 | 2010-11-30 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin formulations |
US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
US20060040856A1 (en) | 2003-12-03 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor IX |
US7956032B2 (en) | 2003-12-03 | 2011-06-07 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
CN101072789B (zh) | 2004-01-08 | 2013-05-15 | 生物种属学股份公司 | 肽的o-连接的糖基化 |
WO2006010143A2 (en) | 2004-07-13 | 2006-01-26 | Neose Technologies, Inc. | Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1] |
EP1799249A2 (en) | 2004-09-10 | 2007-06-27 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated interferon alpha |
EP1814573B1 (en) | 2004-10-29 | 2016-03-09 | ratiopharm GmbH | Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf) |
ES2449195T3 (es) * | 2005-01-10 | 2014-03-18 | Ratiopharm Gmbh | Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado |
US9187546B2 (en) | 2005-04-08 | 2015-11-17 | Novo Nordisk A/S | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
US20080255026A1 (en) | 2005-05-25 | 2008-10-16 | Glycopegylated Factor 1X | Glycopegylated Factor Ix |
MX2008002395A (es) * | 2005-08-19 | 2008-03-18 | Neose Technologies Inc | Factor vii y factor viia glicopegilados. |
US20070105755A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
WO2007055789A2 (en) | 2005-10-31 | 2007-05-18 | Neose Technologies, Inc. | Expression of soluble therapeutic proteins |
US20090048440A1 (en) | 2005-11-03 | 2009-02-19 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide Sugar Purification Using Membranes |
US20080274958A1 (en) | 2006-07-21 | 2008-11-06 | Neose Technologies, Inc. | Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences |
US8394921B2 (en) | 2006-07-25 | 2013-03-12 | Lipoxen Technologies Limited | N-terminal derivatisation of proteins with polysaccharides |
JP2010505874A (ja) | 2006-10-03 | 2010-02-25 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | ポリペプチドコンジュゲートの精製方法 |
LT2068907T (lt) * | 2006-10-04 | 2018-01-10 | Novo Nordisk A/S | Glicerolio sujungti pegilinti sacharidai ir glikopeptidai |
KR101079993B1 (ko) * | 2006-11-17 | 2011-11-04 | 동아제약주식회사 | 폴리에틸렌글리콜 과립구 콜로니 자극인자 접합체 |
EP2144923B1 (en) * | 2007-04-03 | 2013-02-13 | BioGeneriX AG | Methods of treatment using glycopegylated g-csf |
JP5876649B2 (ja) | 2007-06-12 | 2016-03-02 | ラツィオファルム ゲーエムベーハーratiopharm GmbH | ヌクレオチド糖の改良製造法 |
EP2197919B1 (en) | 2007-08-27 | 2014-04-09 | ratiopharm GmbH | Liquid formulation of g-csf conjugate |
US8207112B2 (en) * | 2007-08-29 | 2012-06-26 | Biogenerix Ag | Liquid formulation of G-CSF conjugate |
CN104072613A (zh) | 2007-11-13 | 2014-10-01 | Evec股份有限公司 | 与hGM-CSF结合的单克隆抗体及包含它的药物组合物 |
JP5358840B2 (ja) * | 2007-11-24 | 2013-12-04 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Gfp(緑色蛍光蛋白質)の機能賦活・回復方法 |
ES2523030T3 (es) * | 2008-02-18 | 2014-11-20 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | Un conjugado del G-CSF modificado por un polímero hidrosoluble |
AU2009219232B2 (en) | 2008-02-27 | 2014-02-27 | Novo Nordisk A/S | Conjugated Factor VIII molecules |
RU2409669C9 (ru) | 2008-08-18 | 2012-05-27 | ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент" ("Scientific Future Management", "SFM") | Способ иммобилизации биологически активного вещества (бав) на носитель (варианты) и конъюгат бав-носитель, полученный данными способами |
AU2009283678B2 (en) * | 2008-08-19 | 2014-01-16 | Glytech, Inc. | Glycoprotein production method and screening method |
GB0912485D0 (en) | 2009-07-17 | 2009-08-26 | Polytherics Ltd | Improved conjugation method |
NZ623810A (en) | 2009-07-27 | 2015-10-30 | Lipoxen Technologies Ltd | Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins |
GB2472303A (en) | 2009-07-27 | 2011-02-02 | Baxter Int | Blood coagulation-protein conjugates |
SG187171A1 (en) | 2010-07-30 | 2013-02-28 | Baxter Int | Nucleophilic catalysts for oxime linkage |
EP2415779B1 (en) * | 2010-08-02 | 2015-01-21 | ratiopharm GmbH | Method of producing and purifying an active soluble sialyltransferase |
EA032056B1 (ru) | 2010-12-22 | 2019-04-30 | Баксалта Инкорпорейтид | Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты, способы получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты (варианты) |
WO2012166622A1 (en) | 2011-05-27 | 2012-12-06 | Baxter International Inc. | Therapeutic proteins with increased half-life and methods of preparing same |
JP6240599B2 (ja) | 2011-07-19 | 2017-11-29 | セルモザイク, インコーポレイテッド | 新規の架橋試薬、高分子、治療用コンジュゲートおよびその合成法 |
AU2013204754C1 (en) | 2012-05-16 | 2018-10-11 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage |
TW201519900A (zh) * | 2013-04-28 | 2015-06-01 | Bayer Healthcare Llc | 用於誘導對凝血因子蛋白之免疫耐受性的組成物及方法 |
WO2015130963A2 (en) | 2014-02-27 | 2015-09-03 | Xenetic Biosciences, Inc. | Compositions and methods for administering insulin or insulin-like protein to the brain |
CN107949565A (zh) * | 2015-06-11 | 2018-04-20 | 安姆生物制药有限责任公司 | 聚乙二醇化粒细胞集落刺激因子(gcsf) |
BR112018011259A2 (pt) | 2015-12-03 | 2018-11-21 | Baxalta GmbH | ?fator viii, composição farmacêutica, e, método para tratamento de um defeito hemorrágico em um mamífero? |
Family Cites Families (94)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CH596313A5 (ja) * | 1975-05-30 | 1978-03-15 | Battelle Memorial Institute | |
US4385260A (en) * | 1975-09-09 | 1983-05-24 | Beckman Instruments, Inc. | Bargraph display |
US4414147A (en) * | 1981-04-17 | 1983-11-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons |
US4438253A (en) * | 1982-11-12 | 1984-03-20 | American Cyanamid Company | Poly(glycolic acid)/poly(alkylene glycol) block copolymers and method of manufacturing the same |
US4496689A (en) * | 1983-12-27 | 1985-01-29 | Miles Laboratories, Inc. | Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer |
US4565653A (en) * | 1984-03-30 | 1986-01-21 | Pfizer Inc. | Acyltripeptide immunostimulants |
JPS6238172A (ja) * | 1985-08-12 | 1987-02-19 | 株式会社 高研 | 抗血栓性医用材料の製造方法 |
US4925796A (en) * | 1986-03-07 | 1990-05-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for enhancing glycoprotein stability |
IL82834A (en) * | 1987-06-09 | 1990-11-05 | Yissum Res Dev Co | Biodegradable polymeric materials based on polyether glycols,processes for the preparation thereof and surgical artiicles made therefrom |
US5104651A (en) * | 1988-12-16 | 1992-04-14 | Amgen Inc. | Stabilized hydrophobic protein formulations of g-csf |
US5194376A (en) * | 1989-02-28 | 1993-03-16 | University Of Ottawa | Baculovirus expression system capable of producing foreign gene proteins at high levels |
US5182107A (en) * | 1989-09-07 | 1993-01-26 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates |
DE4009630C2 (de) * | 1990-03-26 | 1995-09-28 | Reinhard Prof Dr Dr Brossmer | CMP-aktivierte fluoreszierende Sialinsäuren sowie Verfahren zu ihrer Herstellung |
US5951972A (en) * | 1990-05-04 | 1999-09-14 | American Cyanamid Company | Stabilization of somatotropins and other proteins by modification of cysteine residues |
US5410016A (en) * | 1990-10-15 | 1995-04-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Photopolymerizable biodegradable hydrogels as tissue contacting materials and controlled-release carriers |
US5281698A (en) * | 1991-07-23 | 1994-01-25 | Cetus Oncology Corporation | Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation |
US5858751A (en) * | 1992-03-09 | 1999-01-12 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for producing sialyltransferases |
US6037452A (en) * | 1992-04-10 | 2000-03-14 | Alpha Therapeutic Corporation | Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate |
US5614184A (en) * | 1992-07-28 | 1997-03-25 | New England Deaconess Hospital | Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them |
US5202413A (en) * | 1993-02-16 | 1993-04-13 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Alternating (ABA)N polylactide block copolymers |
US5621039A (en) * | 1993-06-08 | 1997-04-15 | Hallahan; Terrence W. | Factor IX- polymeric conjugates |
US5605793A (en) * | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
US5492841A (en) * | 1994-02-18 | 1996-02-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Quaternary ammonium immunogenic conjugates and immunoassay reagents |
US5629384A (en) * | 1994-05-17 | 1997-05-13 | Consiglio Nazionale Delle Ricerche | Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces |
US5545553A (en) * | 1994-09-26 | 1996-08-13 | The Rockefeller University | Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them |
US5932462A (en) * | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
US5728554A (en) * | 1995-04-11 | 1998-03-17 | Cytel Corporation | Enzymatic synthesis of glycosidic linkages |
US5876980A (en) * | 1995-04-11 | 1999-03-02 | Cytel Corporation | Enzymatic synthesis of oligosaccharides |
US6030815A (en) * | 1995-04-11 | 2000-02-29 | Neose Technologies, Inc. | Enzymatic synthesis of oligosaccharides |
US6015555A (en) * | 1995-05-19 | 2000-01-18 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates |
US5858752A (en) * | 1995-06-07 | 1999-01-12 | The General Hospital Corporation | Fucosyltransferase genes and uses thereof |
PT1568772E (pt) * | 1995-09-21 | 2010-04-14 | Genentech Inc | Variantes da hormona do crescimento humana |
US5716812A (en) * | 1995-12-12 | 1998-02-10 | The University Of British Columbia | Methods and compositions for synthesis of oligosaccharides, and the products formed thereby |
ATE380820T1 (de) * | 1996-03-08 | 2007-12-15 | Univ Michigan | Murine alpha(1,3)-fucosyltransferase (fuc-tvii) |
US6183738B1 (en) * | 1997-05-12 | 2001-02-06 | Phoenix Pharamacologics, Inc. | Modified arginine deiminase |
US20030027257A1 (en) * | 1997-08-21 | 2003-02-06 | University Technologies International, Inc. | Sequences for improving the efficiency of secretion of non-secreted protein from mammalian and insect cells |
EP0924298A1 (en) * | 1997-12-18 | 1999-06-23 | Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) | Protein expression in baculovirus vector expression systems |
EP1411075B1 (en) * | 1998-03-12 | 2008-07-02 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Method for preparing polymer conjugates |
CA2324616A1 (en) * | 1998-03-25 | 1999-09-30 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Trimeric antigenic o-linked glycopeptide conjugates, methods of preparation and uses thereof |
DE19852729A1 (de) * | 1998-11-16 | 2000-05-18 | Werner Reutter | Rekombinante Glycoproteine, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende Arzneimittel und ihre Verwendung |
US6716626B1 (en) * | 1999-11-18 | 2004-04-06 | Chiron Corporation | Human FGF-21 nucleic acids |
US6348558B1 (en) * | 1999-12-10 | 2002-02-19 | Shearwater Corporation | Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom |
AU781729B2 (en) * | 1999-12-22 | 2005-06-09 | Nektar Therapeutics | Method for the preparation of 1-benzotriazolyl carbonate esters of poly(ethylene glycol) |
US6555660B2 (en) * | 2000-01-10 | 2003-04-29 | Maxygen Holdings Ltd. | G-CSF conjugates |
US6646110B2 (en) * | 2000-01-10 | 2003-11-11 | Maxygen Holdings Ltd. | G-CSF polypeptides and conjugates |
ATE329925T1 (de) * | 2000-03-16 | 2006-07-15 | Univ California | Chemoselektive anknüpfung durch verwendung eines phosphins |
CA2407707A1 (en) * | 2000-05-12 | 2001-11-22 | Neose Technologies, Inc. | In vitro fucosylation recombinant glycopeptides |
EP1311285B2 (en) * | 2000-05-15 | 2017-04-12 | F. Hoffmann-La Roche AG | Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivative |
CN1318443C (zh) * | 2000-05-16 | 2007-05-30 | 博尔德生物技术公司 | 含游离半胱氨酸残基的蛋白重折叠的方法 |
US20020142964A1 (en) * | 2000-11-02 | 2002-10-03 | Nissen Torben Lauesgaard | Single-chain polypeptides |
US6531121B2 (en) * | 2000-12-29 | 2003-03-11 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs |
ATE468862T1 (de) * | 2001-07-11 | 2010-06-15 | Maxygen Inc | G-csf konjugate |
US7297511B2 (en) * | 2001-10-10 | 2007-11-20 | Neose Technologies, Inc. | Interferon alpha: remodeling and glycoconjugation of interferon alpha |
US7157277B2 (en) * | 2001-11-28 | 2007-01-02 | Neose Technologies, Inc. | Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII |
US7265084B2 (en) * | 2001-10-10 | 2007-09-04 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
US8008252B2 (en) * | 2001-10-10 | 2011-08-30 | Novo Nordisk A/S | Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII |
US7173003B2 (en) * | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
US7399613B2 (en) * | 2001-10-10 | 2008-07-15 | Neose Technologies, Inc. | Sialic acid nucleotide sugars |
AU2002360264B2 (en) * | 2001-10-10 | 2009-03-19 | Novo Nordisk A/S | Remodeling and glycoconjugation of peptides |
US7179617B2 (en) * | 2001-10-10 | 2007-02-20 | Neose Technologies, Inc. | Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX |
US7125843B2 (en) * | 2001-10-19 | 2006-10-24 | Neose Technologies, Inc. | Glycoconjugates including more than one peptide |
AU2004236174B2 (en) * | 2001-10-10 | 2011-06-02 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7696163B2 (en) * | 2001-10-10 | 2010-04-13 | Novo Nordisk A/S | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
US7795210B2 (en) * | 2001-10-10 | 2010-09-14 | Novo Nordisk A/S | Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7214660B2 (en) * | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
US7473680B2 (en) * | 2001-11-28 | 2009-01-06 | Neose Technologies, Inc. | Remodeling and glycoconjugation of peptides |
CA2468230A1 (en) * | 2001-11-28 | 2003-06-05 | Neose Technologies, Inc. | Glycopeptide remodeling using amidases |
US20060035224A1 (en) * | 2002-03-21 | 2006-02-16 | Johansen Jack T | Purification methods for oligonucleotides and their analogs |
ATE365794T1 (de) * | 2002-11-08 | 2007-07-15 | Glycozym Aps | Verfahren zur identifizierung von die funktionen von polypeptid-galnac-transferasen modulierenden agentien, solche agentien umfassende pharmazeutische zusammensetzungen und verwendung solcher agentien zur herstellung von arzneimitteln |
US20050064540A1 (en) * | 2002-11-27 | 2005-03-24 | Defrees Shawn Ph.D | Glycoprotein remodeling using endoglycanases |
CA2519092C (en) * | 2003-03-14 | 2014-08-05 | Neose Technologies, Inc. | Branched water-soluble polymers and their conjugates |
EP1613261A4 (en) * | 2003-04-09 | 2011-01-26 | Novo Nordisk As | INTRA-CELLULAR FORMATION OF PEPTIDE CONJUGATES |
ES2380093T3 (es) * | 2003-05-09 | 2012-05-08 | Biogenerix Ag | Composiciones y métodos para la preparación de mutantes de glucosilación de la hormona del crecimiento humana |
WO2005012484A2 (en) * | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Neose Technologies, Inc. | Antibody-toxin conjugates |
US20060198819A1 (en) * | 2003-08-08 | 2006-09-07 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Use of galactose oxidase for selective chemical conjugation of protractor molecules to proteins of therapeutic interest |
US8633157B2 (en) * | 2003-11-24 | 2014-01-21 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin |
US7956032B2 (en) * | 2003-12-03 | 2011-06-07 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
US20080015142A1 (en) * | 2003-12-03 | 2008-01-17 | Defrees Shawn | Glycopegylated Follicle Stimulating Hormone |
CN101072789B (zh) * | 2004-01-08 | 2013-05-15 | 生物种属学股份公司 | 肽的o-连接的糖基化 |
US20060024286A1 (en) * | 2004-08-02 | 2006-02-02 | Paul Glidden | Variants of tRNA synthetase fragments and uses thereof |
EP1799249A2 (en) * | 2004-09-10 | 2007-06-27 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated interferon alpha |
US20080108557A1 (en) * | 2004-09-29 | 2008-05-08 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Modified Proteins |
WO2006066258A2 (en) * | 2004-12-17 | 2006-06-22 | Neose Technologies, Inc. | Lipoconjugation of peptides |
EP1838332A1 (en) * | 2005-01-06 | 2007-10-03 | Neose Technologies, Inc. | Glycoconjugation using saccharyl fragments |
US9187546B2 (en) * | 2005-04-08 | 2015-11-17 | Novo Nordisk A/S | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
US20080255026A1 (en) * | 2005-05-25 | 2008-10-16 | Glycopegylated Factor 1X | Glycopegylated Factor Ix |
US20070105755A1 (en) * | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
EP1926817A2 (en) * | 2005-09-14 | 2008-06-04 | Novo Nordisk Health Care AG | Human coagulation factor vii polypeptides |
US20090048440A1 (en) * | 2005-11-03 | 2009-02-19 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide Sugar Purification Using Membranes |
ITMI20061624A1 (it) * | 2006-08-11 | 2008-02-12 | Bioker Srl | Mono-coniugati sito-specifici di g-csf |
WO2008025856A2 (en) * | 2006-09-01 | 2008-03-06 | Novo Nordisk Health Care Ag | Modified glycoproteins |
JP2010505874A (ja) * | 2006-10-03 | 2010-02-25 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | ポリペプチドコンジュゲートの精製方法 |
LT2068907T (lt) * | 2006-10-04 | 2018-01-10 | Novo Nordisk A/S | Glicerolio sujungti pegilinti sacharidai ir glikopeptidai |
US20090053167A1 (en) * | 2007-05-14 | 2009-02-26 | Neose Technologies, Inc. | C-, S- and N-glycosylation of peptides |
-
2004
- 2004-12-03 AU AU2004296855A patent/AU2004296855B2/en not_active Ceased
- 2004-12-03 WO PCT/US2004/041004 patent/WO2005055946A2/en active Application Filing
- 2004-12-03 BR BRPI0417342-2A patent/BRPI0417342A/pt not_active Application Discontinuation
- 2004-12-03 NZ NZ547554A patent/NZ547554A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-12-03 KR KR1020067010813A patent/KR101237884B1/ko active Protection Beyond IP Right Term
- 2004-12-03 ES ES04813334T patent/ES2422187T3/es active Active
- 2004-12-03 JP JP2006542886A patent/JP4657219B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-12-03 CA CA2549409A patent/CA2549409C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-12-03 EP EP04813334.2A patent/EP1694274B1/en active Active
- 2004-12-03 MX MXPA06006029A patent/MXPA06006029A/es active IP Right Grant
- 2004-12-03 US US10/579,620 patent/US20070254836A1/en not_active Abandoned
- 2004-12-03 CN CN2004800358957A patent/CN1897812B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-05-25 IL IL175954A patent/IL175954A/en active IP Right Grant
- 2006-06-02 ZA ZA2006/04555A patent/ZA200604555B/en unknown
- 2006-10-03 HK HK06110922.6A patent/HK1089685A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2004296855B2 (en) | 2011-01-06 |
EP1694274A2 (en) | 2006-08-30 |
KR20070001890A (ko) | 2007-01-04 |
CA2549409C (en) | 2013-10-29 |
NZ547554A (en) | 2009-09-25 |
WO2005055946A2 (en) | 2005-06-23 |
HK1089685A1 (en) | 2006-12-08 |
IL175954A0 (en) | 2006-10-05 |
ZA200604555B (en) | 2007-09-26 |
MXPA06006029A (es) | 2006-08-23 |
IL175954A (en) | 2014-06-30 |
KR101237884B1 (ko) | 2013-02-27 |
US20070254836A1 (en) | 2007-11-01 |
EP1694274B1 (en) | 2013-04-24 |
JP2007513189A (ja) | 2007-05-24 |
CA2549409A1 (en) | 2005-06-23 |
ES2422187T3 (es) | 2013-09-09 |
CN1897812A (zh) | 2007-01-17 |
WO2005055946A3 (en) | 2006-03-30 |
AU2004296855A1 (en) | 2005-06-23 |
EP1694274A4 (en) | 2009-10-21 |
CN1897812B (zh) | 2011-08-17 |
BRPI0417342A (pt) | 2007-04-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4657219B2 (ja) | GlycoPEG化された顆粒球コロニー刺激因子 | |
JP5922065B2 (ja) | グリコpeg化g−csfを用いた治療方法 | |
KR101209111B1 (ko) | 글리코페질화 인자 나인 | |
KR101439880B1 (ko) | 펩티드의 오-결합형 글리코실화 | |
JP4719686B2 (ja) | GlycoPEG化エリスロポエチン | |
US20150111245A1 (en) | Glycopegylated follicle stimulating hormone | |
US20080318850A1 (en) | Glycopegylated Factor Ix | |
JP2009501127A (ja) | 糖peg化顆粒球コロニー刺激因子 | |
RU2400490C2 (ru) | Гликопэгилированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20071010 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20090422 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100715 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101014 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20101129 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101221 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140107 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4657219 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |