RU2517596C2 - МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С hGM-CSF, И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ КОМПОЗИЦИИ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ - Google Patents
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С hGM-CSF, И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ КОМПОЗИЦИИ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2517596C2 RU2517596C2 RU2010123693/10A RU2010123693A RU2517596C2 RU 2517596 C2 RU2517596 C2 RU 2517596C2 RU 2010123693/10 A RU2010123693/10 A RU 2010123693/10A RU 2010123693 A RU2010123693 A RU 2010123693A RU 2517596 C2 RU2517596 C2 RU 2517596C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- csf
- antibody
- hgm
- antigen binding
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims description 467
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 112
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 89
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 55
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 54
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 49
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims abstract description 35
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 6
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims description 495
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 claims description 494
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 430
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 429
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 429
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 379
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 112
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 60
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 27
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 18
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 claims description 16
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 14
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 13
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 12
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 claims description 11
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 208000036487 Arthropathies Diseases 0.000 claims description 8
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 claims description 8
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 8
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 8
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 claims description 8
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 claims description 8
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 7
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 claims description 6
- 206010006458 Bronchitis chronic Diseases 0.000 claims description 3
- 208000007451 chronic bronchitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000024716 acute asthma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000029771 childhood onset asthma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 79
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 23
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 159
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 159
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 142
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 104
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 88
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 80
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 71
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 57
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 54
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 42
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 40
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 35
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 20
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 20
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 19
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 19
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 17
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 17
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 17
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 16
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 16
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 15
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 15
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 13
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 13
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 9
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 9
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 9
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 8
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 8
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 8
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 7
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 101000746372 Mus musculus Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 7
- 102000003896 Myeloperoxidases Human genes 0.000 description 7
- 108090000235 Myeloperoxidases Proteins 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 7
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 7
- 102220326490 rs374058045 Human genes 0.000 description 7
- 102220006678 rs41306027 Human genes 0.000 description 7
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 102220535124 Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 1_N95Q_mutation Human genes 0.000 description 6
- 102220533724 Ribonuclease pancreatic_N95D_mutation Human genes 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 102220504159 Testis-specific XK-related protein, Y-linked 2_N93Q_mutation Human genes 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 238000003491 array Methods 0.000 description 6
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 6
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 6
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000000273 veterinary drug Substances 0.000 description 6
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 5
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 5
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 5
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 5
- 229940087875 leukine Drugs 0.000 description 5
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 108010038379 sargramostim Proteins 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 206010001881 Alveolar proteinosis Diseases 0.000 description 4
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 4
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 4
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 4
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 4
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 4
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 3
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 3
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 208000011623 Obstructive Lung disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 206010035742 Pneumonitis Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 2
- 201000009267 bronchiectasis Diseases 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 2
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 208000018459 dissociative disease Diseases 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[N+](C=2C=CC(I)=CC=2)=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=N1 JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXTIAFYTYOEQHV-UHFFFAOYSA-N 4-(4-amino-3-methoxyphenyl)-2-methoxyaniline;hydron;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=C([NH3+])C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C([NH3+])=CC=2)=C1 UXTIAFYTYOEQHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DOBIZWYVJFIYOV-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxynaphthalene-1,3-disulfonic acid Chemical compound C1=C(S(O)(=O)=O)C=C(S(O)(=O)=O)C2=CC(O)=CC=C21 DOBIZWYVJFIYOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000007075 ADULT syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 206010052613 Allergic bronchitis Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 206010001889 Alveolitis Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 108700012434 CCL3 Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000000013 Chemokine CCL3 Human genes 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 208000027932 Collagen disease Diseases 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 206010012434 Dermatitis allergic Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 201000003838 Idiopathic interstitial pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000018297 Immunoglobulin subtype Human genes 0.000 description 1
- 108050007411 Immunoglobulin subtype Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 241000442132 Lactarius lactarius Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 206010024119 Left ventricular failure Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053132 Lymphangiosis carcinomatosa Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 101710151805 Mitochondrial intermediate peptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000003009 OptEIA Human IL-8 ELISA Set Methods 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000015925 Proto-oncogene Mas Human genes 0.000 description 1
- 108050004181 Proto-oncogene Mas Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 206010038687 Respiratory distress Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010001 Silicosis Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000008236 biological pathway Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005208 blood dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000006189 buccal tablet Substances 0.000 description 1
- 229940046011 buccal tablet Drugs 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 102220358388 c.80G>A Human genes 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012897 dilution medium Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- -1 elixir Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 201000001155 extrinsic allergic alveolitis Diseases 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 239000005308 flint glass Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 244000000013 helminth Species 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 208000022098 hypersensitivity pneumonitis Diseases 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000005732 intercellular adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 229940023488 pill Drugs 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 108010054442 polyalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 229940071643 prefilled syringe Drugs 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000011809 primate model Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005892 protein maturation Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 102220330036 rs1555864368 Human genes 0.000 description 1
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 description 1
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- VIDRYROWYFWGSY-UHFFFAOYSA-N sotalol hydrochloride Chemical compound Cl.CC(C)NCC(O)C1=CC=C(NS(C)(=O)=O)C=C1 VIDRYROWYFWGSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/243—Colony Stimulating Factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
- A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Hematology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложены варианты выделенного моноклонального антитела, специфичного к hGM-CSF, где каждый вариант характеризуется тяжелой и легкой цепью. Каждый из вариантов характеризуется тем, что содержит по шесть соответствующих CDR. Описаны: фармацевтическая композиция, набор, представляющий собой лекарственное средство, основанные на использовании антитела. Раскрыты: кодирующая выделенная нуклеиновая кислота, экспрессионный вектор ее содержащий и клетка-хозяин, несущая вектор, используемые для получения антитела. Раскрыт способ получения антитела с использованием клетки. Предложенные изобретения могут найти применение для лечения заболевания или нарушения, связанного со сверхэкспрессией hGM-CSF. 7 н. и 18 з.п. ф-лы, 9 ил., 14 табл., 15 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, которые связываются с человеческим колониестимулирующим фактором гранулоцитов-макрофагов (обозначен также как «hGM-CSF») и нейтрализуют активность hGM-CSF, к композициям, которые содержат одно или несколько указанных моноклональных антител, и способам применения указанных моноклональных антител и композиций.
Предпосылки создания изобретения
Установлено, что колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF) представляет собой гуморальный фактор, который ускоряет пролиферацию находящихся в костном мозге клеток-предшественников гранулоцитов и макрофагов и ускоряет формирование колоний гранулоцитов и макрофагов in vitro.
В настоящее время известно, что GM-CSF представляет собой стимулирующий фактор в широком разнообразии типов клеток. Он индуцирует дифференцировку и пролиферацию линий гранулоцитов-макрофагов клеток крови, усиливает функции антигенпрезентирующих клеток, поддерживает функции некоторых типов эпителиальных клеток и индуцирует функции альвеолярных макрофагов (например, повышает катаболизм сурфактанта, бактерицидную функцию и экспрессию Fc-рецептора) (The Cytokine Handbook, 4-ое изд., под ред. Thomson А. и др., изд-во Academic Press, 2003). Известно, что GM-CSF вызывает различные болезни, включая: 1) аллергические заболевания, такие как астма, атопия и полиноз, 2) отторжение трансплантата и реакцию «трансплантат-против-хозяина» (GVHD) и 3) аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит.
Например, для человеческого GM-CSF (hGM-CSF) характерна сверхэкспрессия в легких страдающих аллергией индивидуумов и в суставах страдающих ревматоидным артритом пациентов; сверхэкспрессия мРНК hGM-CSF обнаружена в коже страдающих аллергией индивидуумов. Описано также, что выживаемость моноцитов, представляющих собой индуцирующие воспаление клетки при атопическом дерматите, повышается в результате производства GM-CSF (Bratton D.L. и др., Granulocyte macrophage colonystimulating factor contributes to enhanced monocyte survival in chronic atopic dermatitis. J. Clin. Invest., 95, 1995, cc.211-218).
Кроме того, установлено, что GM-CSF стимулирует пролиферацию лейкозных клеток. Таким образом, считается, что GM-CSF является фактором, вызывающим лейкоз.
Существует необходимость в разработке путей лечения заболеваний и состояний, обусловленных человеческим GM-CSF. Одним из путей терапии указанных заболеваний и состояний является связывание hGM-CSF и ингибирование его биологической активности. Для этой цели можно применять, например, моноклональные антитела к hGM-CSF, которые обладают повышенной аффинностью и достаточной нейтрализующей активностью в отношении hGM-CSF, но не индуцируют иммунологическую реакцию.
Однако описанные к настоящему времени ингибирующие антитела к hGM-CSF не обладают достаточной нейтрализующей активностью в отношении hGM-CSF. Кроме того, очень вероятно, что доступные в настоящее время моноклональные антитела к hGM-CSF могут индуцировать нежелательный иммунный ответ у реципиентов. Поликлональное антитело и моноклональное антитело, как правило, получают из экспериментальных животных, таких как мыши, кролики и козлы. Однако полученные таким путем антитела имеют последовательность, характерную для типа животных, используемых для их получения. Если их вводят людям, то иммунная система человека может распознавать антитела как чужеродные и это может приводить к человеческому гуморальному иммунному ответу на антитело животного происхождения (то есть такое антитело вызывает продуцирование собственных антител организма).
Кроме того, для лечения таких болезней необходимо длительное применение и в результате могут возникать проблемы, связанные с безопасностью, которые могут быть обусловлены небольшим количеством примесей вводимых лекарственных средств. Антитела с более высокой нейтрализующей активностью, чем доступные в настоящее время, могут быть более ценными в качестве терапевтических средств с позиций эффективности, безопасности и расходов на медицинское обслуживание.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится по меньшей мере частично к разработанным при создании изобретения конкретным моноклональным антителам к человеческому GM-CSF, которые отличаются их очень высокой нейтрализующей активностью в отношении hGM-CSF. При создании изобретения неожиданно было установлено, что нейтрализующая активность указанных антител выше, чем можно было бы ожидать на основе их аффинности к связыванию с hGM-CSF. Два из указанных моноклональных антител к hGM-CSF обозначены в настоящем описании как EV1018 и EV1019.
Одним из объектов изобретения являются антитела к hGM-CSF и их фрагменты, связывающие и нейтрализующие hGM-CSF.
Одним из вариантов осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент распознает ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 1. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит:
(а) тяжелую цепь, включающую консенсусную VH-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную VH-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную VH-CDR3-содержащую последовательность, в которых:
(I) консенсусная VH-CDR1-содержащая последовательность представляет собой FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), в которой X1 обозначает Y или Н и X2 обозначает G или А,
(II) консенсусная VH-CDR2-содержащая последовательность представляет собой X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 315), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х3 обозначает L или V, Х4 обозначает Т или I, Х5 обозначает Y или W, Х6 обозначает R или K, Х7 обозначает F или Y и X8 обозначает R или K, и
(III) консенсусная VH-CDR3-содержащая последовательность представляет собой EXnX9GX10XnXnDXn (SEQ ID NO: 316), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х9 обозначает М или V и Х10 обозначает А или G; и
(б) легкую цепь, включающую консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную VL-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную VL-CDR3-содержащую последовательность, в которых:
(I) консенсусная VL-CDR1-содержащая последовательность представляет собой XnGNXnXnNIGSX11AVG (SEQ ID NO: 317), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х11 обозначает Н или Y,
(II) консенсусная VL-CDR2-содержащая последовательность представляет собой GX12SPX13SG (SEQ ID NO: 318), в которой Х12 обозначает R или K и X13 обозначает А или Р, и
(III) консенсусная VL-CDR3-содержащая последовательность представляет собой STWDSX14LSAVX15 (SEQ ID NO:319), в которой Х14 обозначает R или S и X15 обозначает V или L;
и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с hGM-CSF.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело содержит:
(а) тяжелую цепь, включающую VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, в которых:
(I) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SYGMH (SEQ ID NO: 10) и SHAMH (SEQ ID NO: 333),
(II) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) и VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334), и
(III) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) и EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335); и
(б) легкую цепь, включающую VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, в которых:
(I) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) и SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330),
(II) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из GRSPPS (SEQ ID NO: 8) и GKSPAS (SEQ ID NO: 331), и
(III) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9) и STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332), и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с hGM-CSF.
Например, связывание описанного выше антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с человеческим GM-CSF характеризуется значением KD, составляющим менее 400 пМ, более предпочтительно значением KD, составляющим менее 160 пМ.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, нейтрализует активность hGM-CSF, при этом значение IC50 для антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет менее 100 пМ (например, менее 30 пМ, менее 20 пМ) при определении с помощью анализа пролиферации TF-1-клеток при концентрации, соответствующей ED80, согласно методу, представленному в настоящем описании.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать тяжелую цепь, представляющую собой цепь типа гамма 1 (γ1), гамма 2 (γ2), гамма 3 (γ3) или гамма 4 (γ4). Тяжелую цепь можно выбирать из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 10-33, 38-80 и 160-183 и 222-245.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать легкую цепь, представляющую собой легкую лямбда-цепь. В некоторых вариантах осуществления изобретения легкая лямбда-цепь может содержать одну или обе из следующих аминокислотных замен: R100G и A153G, которые обозначены относительно последовательности дикого типа. В одном из вариантов осуществления изобретения легкую цепь можно выбирать из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 34-37 и 202-221. Легкая цепь может представлять собой легкую лямбда-цепь или легкую каппа-цепь. В некоторых вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь представляет собой тяжелую цепь типа гамма 1 (γ1), гамма 2 (γ2), гамма 3 (γ3) или гамма 4 (γ4), а легкая цепь представляет собой легкую лямбда-цепь. В любом из вариантов осуществления изобретения тяжелая цепь может содержать одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, включающей: Q3E, Т97А, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164 и L165A, относительно последовательности дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, которая несет одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, включающей: Q3E, Т97А, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164A и L165A, а легкая цепь несет одну или обе следующие аминокислотные замены: R100G и A153G.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать VH-CDR1, который имеет аминокислотную последовательность SYGMH (SEQ ID NO: 4) или SHAMH (SEQ ID NO: 333). Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать VH-CDR2, который имеет аминокислотную последовательность LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO:5) или VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334). Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать VH-CDR3, который имеет аминокислотную последовательность ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) или EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335). Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать VL-CDR1, который имеет аминокислотную последовательность IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) или SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330). Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать VL-CDR2, который имеет аминокислотную последовательность GRSPPS (SEQ ID NO: 8) или GKSPAS (SEQ ID NO: 331). Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать VL-CDR3, который имеет аминокислотную последовательность STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9) или STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который специфически связывается с hGM-CSF, содержит 6 различных CDR, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 4-9.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который специфически связывается с hGM-CSF, содержит 6 различных CDR, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 330-335.
В любом из вариантов осуществления изобретения антитело может включать тяжелую цепь, представляющую собой цепь типа гамма 1 (γ1), гамма 2 (γ2), гамма 3 (γ3) или гамма 4 (γ4), и легкую цепь, представляющую собой каппа- или лямбда-цепь.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать дополнительно сигнальную последовательность, например, представленную в SEQ ID NO: 324, 325 и 326.
Под объем изобретения подпадают последовательности дикого типа, а также их варианты. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его фрагмент содержит тяжелую цепь, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 10, или ее вариант, выбранный из SEQ ID NO: 11-33, 38-80, и содержит также легкую цепь, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 34, или ее вариант, выбранный из SEQ ID NO: 35-37. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь имеет последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 160, или ее вариант, выбранный из SEQ ID NO: 161-245, а легкая цепь имеет последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 202, или ее вариант, выбранный из SEQ ID NO: 203-221.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 152, или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 153-158 и 159, и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 184, или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 185-200 и 201.
В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 152. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 184. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 152 и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 184. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело принадлежит к классу (подклассу) IgG1(λ).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 348, или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 349-362 и 363, и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 364 или SEQ ID NO: 365.
В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 348. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 364. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 365. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело принадлежит к классу (подклассу) IgG1(λ).
В одном из вариантов осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF (hGM-CSF) и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, как представлено в настоящем описании, отличается тем, что содержит гипервариабельный участок (CDR), который имеет одну или несколько аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9 и SEQ ID NO: 330-335. В некоторых вариантах осуществления изобретения можно в CDR заменять, изымать путем делеции, встраивать или добавлять одну или несколько аминокислот. Моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, представленное/представленный в настоящем описании, может отличаться тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок ингибирует пролиферацию клеток линии TF-1 примерно на 50% при использовании в концентрации примерно 14 пМ, когда пролиферацию клеток линии TF-1 индуцируют с помощью hGM-CSF. В некоторых вариантах осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок ингибирует пролиферацию дендритных клеток периферической крови.
В одном из вариантов осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, представленное/представленный в настоящем описании, обладает аффинностью к связыванию с hGM-CSF, для которой характерно значение KD 4×10-10 M или ниже.
В некоторых вариантах осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, представленное/представленный в настоящем описании, принадлежит к классу (подклассу) IgG1(λ). В некоторых вариантах осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF, предлагаемое в настоящем изобретении, представляет собой человеческое моноклональное антитело.
Изобретение относится также к нуклеиновым кислотам и векторам, содержащих их. Одним из вариантов осуществления изобретения является выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления изобретения нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. Одним из вариантов осуществления изобретения является вектор, содержащий ДНК, которая кодирует моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, представленное/представленный в настоящем описании.
Изобретение относится также к клетке-хозяину, содержащей экспрессионный вектор, который содержит ДНК-вектор, предлагаемый в изобретении.
Изобретение относится также к набору, содержащему: (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в изобретении; и (б) один или несколько контейнеров, содержащих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Одним из вариантов осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в изобретении, предназначенный/предназначенное для применения в медицине.
В изобретении предложены композиции, содержащие антитело к hGM-CSF или его фрагмент, которое/который связывается и нейтрализует hGM-CSF. Указанная композиция может представлять собой фармацевтическую композицию (например, лекарственное средство), которая содержит антитело к hGM-CSF и/или его фрагмент (или их комбинацию) и фармацевтически приемлемый носитель. Под объем изобретения подпадает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, указанное/указанный выше в любом из вариантов осуществления изобретения.
Согласно другим вариантам осуществления изобретения композиция содержит более одного вида антител к GM-CSF, их фрагментов или комбинаций, которые все представлены в настоящем описании. Например, композиция может включать также второе выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который связывается с hGM-CSF, в результате композиция содержит более одного (несколько) вида/типа антител, их антигенсвязывающих фрагментов или их комбинаций, которые все связываются с GM-CSF. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно из нескольких антител, их антигенсвязывающих фрагментов или их комбинаций, связывающихся с hGM-CSF, представляет собой полипептид, выбранный из группы, включающей: SEQ ID NO: 10-80, 152-245, 320-323 и 348-365.
Изобретение относится также к композиции медицинского назначения, пригодной для применения с целью лечения заболевания, которое вызывается hGM-CSF, содержащей: моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, указанное/указанный в любом варианте осуществления изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель. Примерами болезней, вызываемых избыточным производством hGM-CSF, являются: а) аллергические заболевания, такие как астма, атония и полиноз (аллергический ринит; сенная лихорадка); б) отторжение трансплантата и реакция «трансплантат-против-хозяина» (GVHD), и в) аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит.
Указанные композиции или ветеринарная лекарственная композиция может содержать целый ряд видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков, специфических для одного конкретного антигена, и фармацевтически приемлемый носитель.
В некоторых вариантах осуществления композиция медицинского назначения или ветеринарная лекарственная композиция отличается тем, что входящие в ее состав несколько видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков содержат два или большее количество типов антител или их антигенсвязывающих участков, можно выбирать из представленных ниже в подпунктах (а) и (б):
(а) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который содержит CDR, имеющий аминокислотную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 4-9, SEQ ID NO: 330-335, SEQ ID NO: 336-341 или SEQ ID NO: 342-347, и обладает специфичностью в отношении hGM-CSF,
(б) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, указанное/указанный в подпункте (а), имеющее/имеющий аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот заменена(ы), удалена(ы) в результате делении, встроена(ы) или присоединена(ы), и которое/который обладает специфичностью в отношении hGM-CSF.
Такая композиция медицинского назначения или ветеринарная лекарственная композиция может ингибировать пролиферацию клеток линии TF-1 на 80% или более при применении каждой из них в концентрации примерно 55 пМ, когда пролиферацию клеток линии TF-1 индуцируют с помощью hGM-CSF.
Одним из объектов изобретения является также набор, содержащий любую из композиций, представленных в настоящем описании, и один или несколько контейнеров. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор включает также инструкцию. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор включает также этикетку, инструкцию или включает и этикетку, и инструкцию.
Изобретение относится также к применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, представленного в настоящем описании, или композиции, которая содержит указанное антитело или фрагмент. Любое представленное в настоящем описании антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент или композицию можно применять для производства или получения лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного со сверхэкспрессией hGM-CSF у индивидуума, при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с hGM-CSF и обладает способностью нейтрализовать активность hGM-CSF. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание или нарушение выбирают из группы, включающей: хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), астму, муковисцидоз, интерстициальное легочное заболевание, ринит, артрит и родственные артропатии, псориаз, миелоидный лейкоз, рассеянный склероз.
Для применения согласно указанным показаниям антитело или антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму в дозе, не превышающей максимальную переносимую дозу, где максимальная переносимая доза составляет примерно 500 мг на дозу.
Одним из объектов изобретения является применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или композиции, представленных в любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения, для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного со сверхэкспрессией hGM-CSF у индивидуума, при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с hGM-CSF и обладает способностью нейтрализовать активность hGM-CSF. Например, заболевание или нарушение может представлять собой хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), астму, муковисцидоз, интерстициальное легочное заболевание, ринит, артрит и родственные артропатии, псориаз, миелоидный лейкоз или рассеянный склероз. Указанное применение предусматривает введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или содержащей его композиции, предлагаемых в изобретении, индивидууму, в дозе, не превышающей максимальную переносимую дозу, где максимальная переносимая доза составляет примерно 500 мг на дозу.
Изобретение относится также к способам лечения индивидуума, страдающего заболеванием или нарушением, которое ассоциировано с аномальной экспрессией hGM-CSF, с помощью антитела к hGM-CSF или его фрагмента. Способ заключается в том, что вводят индивидууму, у которого диагностировано или который имеет риск развития заболевания или нарушения, ассоциированного с аномальной экспрессией (например, сверхэкспрессией) hGM-CSF, композицию, которая содержит антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, нейтрализующее/нейтрализующий активность hGM-CSF in vivo, в количестве, достаточном для достижения по меньшей мере одного терапевтического действия на индивидуума.
Изобретение относится также к способу повышения опосредуемой антителом к hGM-CSF нейтрализующей активности в отношении hGM-CSF, отличающемуся тем, что вводят одновременно несколько видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков, специфических в отношении одного и того же конкретного антигена. В некоторых вариантах осуществления изобретения два или большее количество антител или их антигенсвязывающих участков выбирают из указанных в подпунктах (а) и (б):
(а) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который содержит CDR, имеющий аминокислотную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 4-9, SEQ ID NO: 330-335, SEQ ID NO: 336-341 или SEQ ID NO: 342-347, и обладает специфичностью в отношении hGM-CSF,
(б) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, указанное/указанный в подпункте (а), имеющее/имеющий аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот заменена(ы), удалена(ы) в результате делеции, встроена(ы) или присоединена(ы), и которое/который обладает специфичностью в отношении hGM-CSF.
Объектами изобретения являются способы повышения активности, отличающиеся тем, что два или несколько типов антител или их антигенсвязывающих участков ингибируют пролиферацию клеток линии TF-1 на 80% или более при использовании каждого из них в концентрации примерно 55 пМ, когда пролиферацию клеток линии TF-1 индуцируют с помощью hGM-CSF.
Изобретение относится также к эпитопу hGM-CSF, который распознается антителами и их антигенсвязывающими фрагментами, представленными в настоящем описании. Эпитоп hGM-CSF представляет собой полипептиды, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 2 и 3, где эпитоп распознается антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, представленным в настоящем описании, и где полипептидные последовательности представляют собой прерывистый сегмент hGM-CSF (представленный в SEQ ID NO: 1). Эпитоп представляет собой прерывистый сегмент человеческого GM-CSF, в котором эпитоп содержит все или часть аминокислотных остатков 77-80 человеческого GM-CSF (SEQ ID NO: 1) и аминокислотные остатки 95-104 человеческого GM-CSF (SEQ ID NO: 1), и распознается моноклональным антителом к hGM-CSF или его антигенсвязывающим фрагментом, содержим 6 различных CDR, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 4-9 или SEQ ID NO: 330-335.
Изобретение относится также к применению эпитопа, предлагаемого в изобретении. Изобретение относится также к способам скрининга и/или идентификации молекулы, специфически связывающейся с эпитопом, представленным в настоящем описании, который распознается антителами и антигенсвязывающими фрагментами, представленными в настоящем описании. Некоторыми вариантами осуществления изобретения являются способы идентификации молекулы, которая связывается с эпитопом, представленным в настоящем описании, заключающиеся в том, что (I) осуществляют скрининг биологического образца или пептидной библиотеки с помощью зонда, который содержит эпитоп; (II) выделяют молекулу, которая специфически связывается с зондом; и (III) идентифицируют молекулу. Молекула, которая связывается с эпитопом, может представлять собой, например, моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент. Некоторыми вариантами осуществления изобретения является зонд, включающий также выявляемый маркер. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что зонд является иммобилизованным.
Изобретение относится также к способам и процессам получения антител к hGM-CSF и их антигенсвязывающих фрагментов. Изобретение относится также к способам получения в клетке-хозяине моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента, которое/который связывается с hGM-CSF, в которых антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает по меньшей мере консенсусную VH-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную VH-CDR2-содержащую последовательность, консенсусную VH-CDR3-содержащую последовательность, консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную VL-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную VL-CDR3-содержащую последовательность. Способ заключается в том, что осуществляют стадии, на которых:
(I) получают клетку-хозяина, которая содержит по меньшей мере одну последовательность ДНК, кодирующую по меньшей мере консенсусную VH-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную VH-CDR2-содержащую последовательность, консенсусную VH-CDR3-содержащую последовательность, консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную VL-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную VL-CDR3-содержащую последовательность, где:
(а) консенсусная VH-CDR1-содержащая последовательность представляет собой FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), в которой X1 обозначает Y или Н и Х2 обозначает G или А,
(б) консенсусная VH-CDR2-содержащая последовательность представляет собой X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 315), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х3 обозначает L или V, Х4 обозначает Т или I, X5 обозначает Y или W, Х6 обозначает R или K, Х7 обозначает F или Y и X8 обозначает R или K, и
(в) консенсусная VH-CDR3-содержащая последовательность представляет собой EXnX9GX10XnXnDXn (SEQ ID NO: 316), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х9 обозначает М или V и Х10 обозначает А или G,
(г) консенсусная VL-CDR1-содержащая последовательность представляет собой XnGNXnXnNIGSX11AVG (SEQ ID NO: 317), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х11 обозначает Н или Y,
(д) консенсусная VL-CDR2-содержащая последовательность представляет собой GX12SPX13SG (SEQ ID NO: 318), в которой Х12 обозначает R или K и X13 обозначает А или Р, и
(е) консенсусная VL-CDR3-содержащая последовательность представляет собой STWDSX14LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), в которой Х14 обозначает R или S и X15 обозначает V или L;
(II) экспрессируют ДНК в клетке-хозяине; и
(III) культивируют клетку-хозяина в условиях, пригодных для экспрессии ДНК и производства антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна ДНК кодирует тяжелую цепь или ее участок и легкую цепь или ее участок, где тяжелую цепь или ее участок выбирают из группы, включающей: SEQ ID NO: 10-33, 38-80, 152-183, 222-245, 348-362 и 363, и легкую цепь или ее участок выбирают из группы, включающей: SEQ ID NO: 34-37, 184-221, 364 и 365.
Указанный выше процесс может включать также выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
Указанный выше процесс может включать также получение композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель.
Изобретение относится также к векторам, содержащим ДНК, которая кодирует по меньшей мере участок антител или их антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем описании. Под объем изобретения подпадает также клетки-хозяева, экспрессирующие вектор.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор содержит ДНК, кодирующую VH-CDR1, VH-CDR2 и а VH-CDR3, где:
VH-CDR1 представляет собой SYGMH (SEQ ID NO: 4) или SHAMH (SEQ ID NO: 333),
VH-CDR2 представляет собой LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) или VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334) и
VH-CDR3 представляет собой ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) или EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335).
В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор содержит ДНК, кодирующую VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где
VL-CDR1 представляет собой IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) или SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330),
VL-CDR2 представляет собой GRSPPSG (SEQ ID NO: 8) или GKSPASG (SEQ ID NO: 331) и
VL-CDR3 представляет собой STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9) или STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332).
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная ДНК кодирует моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, обладающее/обладающий способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, при этом выделенная ДНК кодирует аминокислотную последовательность, такую как по меньшей мере одна последовательность, выбранная из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная ДНК кодирует моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, обладающее/обладающий способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, при этом выделенная ДНК кодирует аминокислотную последовательность, такую как по меньшей мере одна последовательность, выбранная из группы, включающей SEQ ID NO: 330-335. Выделенная ДНК может обладать способностью гибридизоваться в строгих условиях с ДНК, описанной выше. Еще одним объектом изобретения являются векторы, включающие любую указанную ДНК, а также клетки-хозяева, которые экспрессируют рекомбинантный(ые) вектор(ы).
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг.1 - блок-схема выделения продуцирующих антитела клонов клеток;
на фиг.2 - схема анализа аффинности моноклональных антител к GM-CSF;
на фиг.3 - результаты оценки ингибирующего действия моноклональных антител к GM-CSF на пролиферацию дендритных клеток периферической крови в присутствии GM-CSF;
на фиг.4 - результаты оценки ингибирующего действия моноклональных антител к GM-CSF на пролиферацию клеток линии TF-1 в присутствии дрожжевого hGM-CSF (лейкин);
на фиг.5 - результаты оценки ингибирующего действия моноклональных антител к GM-CSF на пролиферацию клеток линии TF-1 в присутствии hGM-CSF из Е.coli (фирма Peprotech);
на фиг.6 - результаты оценки ингибирующего действия при совместном применении двух моноклональных антител к GM-CSF на пролиферацию клеток линии TF-1 в присутствии дрожжевого hGM-CSF (лейкин);
на фиг.7 - результаты оценки ингибирующего действия при совместном применении двух моноклональных антител к GM-CSF на пролиферацию клеток линии TF-1 в присутствии hGM-CSF из Е.coli (фирма Peprotech);
на фиг.8 - два графика, демонстрирующие ингибирование в зависимости от дозы в присутствии: человеческого GM-CSF (8А) и GM-CSF макака-резус (8Б);
на фиг.9А - столбиковая диаграмма, демонстрирующая активность миелопероксидазы (МРО), измеренную в дебрисе бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ) из организма мышей, подвергнутых воздействию сигаретного дыма, -CS: мышей обрабатывали наполнителем (300 мкл наполнителя i.p. в день 1 и 3 без воздействия сигаретного дыма. +CS, изотип AT: мышей обрабатывали i.p. 300 мкл антитела соответствующего изотипа в день 1 и 3, подвергали воздействию сигаретного дыма. +CS, антитело к GM-CSF: мышей обрабатывали i.p. 300 мкл антитела к GM-CSF в день 1 и 3, подвергали воздействию сигаретного дыма. n=10 на группу, среднее значение ± СКО, *p<0,05, ***p<0,001;
на фиг.9Б - пара столбиковых диаграмм, демонстрирующих результаты оценки цитокинов в супернатантах БАЛЖ. Слева: результаты определения уровней МСР-1. Справа: результаты определения уровней MIP-1α. -CS: мышей обрабатывали наполнителем (300 мкл наполнителя i.p. в день 1 и 3) без воздействия сигаретного дыма. +CS, изотип AT: мышей обрабатывали 300 мкл антитела соответствующего изотипа i.p. в день 1 и 3, подвергали воздействию сигаретного дыма. +CS, антитело к GM-CSF: мышей обрабатывали i.p. 300 мкл антитела к GM-CSF в день 1 и 3, подвергали воздействию сигаретного дыма. n=10 на группу, среднее значение ± СКО, *p<0,05, ***p<0,001.
Подробное описание изобретения
Как видно из настоящего описания, моноклональное антитело к hGM-CSF получали из антителопродуцирующих клеток, которые получали из крови пациента, страдающего идиопатическим альвеолярным протеинозом. В одном из вариантов осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, получают из антителопродуцирующих клеток, которые получали из крови пациента, страдающего идиопатическим альвеолярным протеинозом. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой полностью человеческое моноклональное антитело. По этой причине для него характерен минимальный риск инициации иммуногенности, когда препарат антитела вводят в организм человека.
Задача, поставленная при создании изобретения, решается следующим образом. Настоящее изобретение относится к GM-CSF-связывающим моноклональным антителам и GM-CSF-связывающим их фрагментам, которые отличаются повышенной нейтрализующей способностью или активностью в отношении hGM-CSF, и композициям, включающим по меньшей мере один вид или тип указанных моноклональных антител или их фрагментов, а также способам лечения состояний или заболеваний, ассоциированных со сверхэкспрессией hGM-CSF (уровни hGM-CSF выше в организме индивидуума, страдающего состоянием, заболеванием или нарушением, чем у индивидуума, который не страдает указанным состоянием, заболеванием или нарушением).
Моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, специфически связывается с hGM-CSF, аномальная экспрессия которого может вызывать различные заболевания, и снижает или элиминирует (нейтрализует) его биологическую активность. Моноклональное антитело к hGM-CSF обладает нейтрализующей активностью (в отношении hGM-CSF) более высокой по сравнению с активностью ранее описанных моноклональных антител к hGM-CSF. В частности, моноклональные антитела к hGM-CSF, предлагаемые в настоящем изобретении, представляют собой человеческие моноклональные антитела, не обладающие иммуногенностью и не индуцирующие иммунологическую реакцию.
Под понятием «специфически связывается» подразумевается высокая авидность и/или высокая аффинность связывания антитела со специфическим полипептидом, например, эпитопом белка, такого как человеческий белок GM-CSF. Связывание антитела с эпитопом в специфическом полипептиде предпочтительно является более сильным по сравнению со связыванием этого же антитела с любым другим эпитопом, прежде всего теми, которые могут присутствовать в молекулах в ассоциации с конкретным представляющим интерес полипептидом или в том же образце, что и конкретный представляющий интерес полипептид, например, связывание является более сильным с несущими эпитоп фрагментами белка, такого как GM-CSF, при этом в результате регулирования условий связывания антитело связывается практически исключительно с эпитопным сайтом или фрагментами требуемого белка, такого как несущий эпитоп фрагмент, подвергнутый обработке GM-CSF и не подвергнутый обработке родственными факторами этого же подсемейства. Выделенное антитело, предлагаемое в изобретении, предпочтительно обладает иммунореактивностью с конкретными видами и иммуноспецифичностью в отношении конкретных видов. Например, антитела, предлагаемые в изобретении, распознают человеческий GM-CSF, могут распознавать GM-CSF макака-резус и/или GM-CSF обезьян-игрунок (мармозетки), но, как правило, не связываются с его мышиной копией. Следует иметь в виду, что согласно этому объекту изобретения антитела и их антигенсвязывающие фрагменты распознают эпитоп антигена в его нативной конформации или в достаточно близкой к его нативной конформации, например, прерывистый сегмент антигена, находящийся в непосредственной близости в контексте всего антигена (например, hGM-CSF), что установлено при изучении структуры, образуя тем самым в совокупности эпитоп (например, «карман» на поверхности антигена), который распознается антителами, предлагаемыми в изобретении. Согласно этому объекту изобретения сами по себе антитела или их антигенсвязывающие фрагменты не дают перекрестную реакцию с белком, не представляющим собой GM-CSF, который содержит обе полипептидные последовательности, которые формируют описанный выше эпитоп. Должно быть очевидно, что в контексте связывания антитело-антиген «специфичность» связывания определяется природой взаимодействия. Таким образом, «антитело, которое связывается с GM-CSF» следует конструировать так, чтобы оно специфически связывалось с антигеном (т.е. GM-CSF).
В контексте настоящего описания понятие «антитело» относится к молекуле иммуноглобулина, в которой 4 полипептидных цепи, т.е. 2 тяжелых цепи и 2 легких цепи, соединены с помощью дисульфидного мостика. Моноклональные антитела можно создавать с помощью моноклональной или рекомбинантной технологии. В данной области известны указанные технологии. Понятия «антигенсвязывающий участок» и «антигенсвязывающий фрагмент» применяют взаимозаменяемо в контексте настоящего описания, и они означают любой укороченный вариант антитела, который предпочтительно характеризуется активностью связывания с конкретным антигеном (например, hGM-CSF). В частности, фрагмент, предлагаемый в изобретении, представляет собой фрагмент, который связывается с тем же самым эпитопом hGM-CSF, что и соответствующее моноклональное антитело. Фрагмент может представлять собой, например, Fab-фрагмент или любой другой фрагмент, обладающий указанными выше характеристиками. Кроме того, фрагменты антитела включают также одноцепочечное антитело (scFV), в которое включены вариабельная область антитела и гипервариабельный участок (CDR), биспецифическое антитело и мультиспецифическое антитело.
В контексте настоящего описания понятие «биоактивность» является синонимом понятия «биологическая активность». Так, «биоактивность hGM-CSF» представляет собой биологическую функцию hGM-CSF, которую определяют или измеряют in vivo или с помощью клеточного анализа, например, представленного в настоящем описании. Более конкретно, биоактивность hGM-CSF можно оценивать с помощью анализа клеточной пролиферации. Применяют соответствующие клеточные линии, для которых известно, что они реагируют на GM-CSF. Как правило, в качестве системы человеческих клеток при осуществлении анализа пролиферации применяют линию клеток человеческого эритролейкоза TF-1. TF-1 представляет собой линию клеток, для создания которой использовали клетки страдающего эритролейкозом пациента. Анализ основан на ингибировании стимулированной GM-CSF пролиферации клеток TF-1 и хорошо известен в данной области. Можно применять также другие линии клеток. Обычный специалист в данной области может адаптировать соответствующий анализ в зависимости от применяемых систем или условий.
Анализы пролиферации TF-1 осуществляют в присутствии взятых в различных концентрациях человеческого GM-CSF дикого типа или рекомбинантного (обозначен как rhGM-CSF). На основе этих данных можно получать кривые дозовой зависимости. Концентрацию GM-CSF, необходимую для получения биологического ответа в виде пролиферации TF-1-клеток, составляющего 80% от максимального, в контексте настоящего описания обозначают как ED80 или ED80. Таким образом, ED80 обозначает «дозу, эффективность которой составляет 80%» от максимального ответа. Аналогично этому, концентрацию GM-CSF, необходимую для получения ответа, составляющего половину от максимального, в биологическом анализе обозначают как ED50 или ED50. Как правило, значение ED50 для GM-CSF составляет 0,02-1 нг/мл при оценке с помощью анализа клеточной пролиферации с использованием зависящей от человеческого GM-CSF клеточной линии TF-1.
Указанная или любые другие аналогичные системы анализа можно применять для идентификации или определения активности ингибитора или антагониста hGM-CSF. Например, можно применять систему для анализа пролиферации для оценки нейтрализующей способности антитела в отношении hGM-CSF. Другие примеры анализов, предназначенных для оценки биологической функции GM-CSF, включают анализ секреции IL-8 и анализ индукции поверхностного CD11b/Mac1.
Понятия «нейтрализация», «нейтрализует», «нейтрализующий» и т.п. относятся к ингибированию биологической активности биоактивного фактора, такого как hGM-CSF. Таким образом, антитело к hGM-CSF, обладающее нейтрализующей способностью или нейтрализующей активностью, означает антитело, которое обладает способностью связываться и оказывать антагонистическое действие или противодействовать биологической активности hGM-CSF в биологической системе, например, пролиферативной активности hGM-CSF в биологической системе, такой как TF-1-клетки, существенно ингибируя или элиминируя тем самым биологическую активность hGM-CSF.
Такие понятия как «ингибирующее действие» «способность ингибировать» и «ингибирование» означает подавление на 5-100% биоактивности или видов биоактивности, обусловленных антигеном-мишенью, вне зависимости от его происхождения. Для терапевтических целей в идеальном случае ингибирование биоактивности hGM-CSF должно находиться на уровне 50-100%.
В целом, значение IC50 является мерой эффективности соединения в отношении ингибирования биологической или биохимической функции. Количественная мера означает количество конкретного лекарственного средства или другого агента (ингибитора), необходимое для ингибирования наполовину конкретного биологического процесса (или компонента процесса, т.е. фермента, клетки, клеточного рецептора или микроорганизма). Другими словами оно означает концентрацию, при использовании которой ингибирование составляет половину от максимального (50%) (IC) для указанной субстанции (50% IC или IC50). Эту величину обычно применяют в качестве меры антагонистической активности лекарственного средства в фармакологическом исследовании. Согласно руководству, принятому Департаментом по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и лекарственных средств Соединенных Штатов, величина IC50 обозначает концентрацию лекарственного средства, которая необходима для 50%-ного ингибирования in vitro.
Таким образом, значение IC50 нейтрализующего антитела к hGM-CSF можно определять, строя кривую дозовой зависимости и оценивая воздействие различных концентраций нейтрализующего антитела на снижение пролиферативной активности hGM-CSF. Значения IC50 можно рассчитывать для конкретного антагониста, определяя концентрацию, необходимую для ингибирования наполовину от максимального биологического ответа агониста.
Согласно различным вариантам осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуются значением IC50, составляющим менее 20, менее 25, менее 30, менее 40, менее 50, менее 60, менее 70, менее 80, менее 90 или менее 100 пМ, в каждом случае при определении на основе анализа пролиферации TF-1 при ED80 (концентрация, соответствующая ED80). В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуются значением IC50, составляющим менее 20, менее 25, менее 30 или менее 40 пМ, при определении на основе анализа пролиферации TF-1 при ED80.
Моноклональные антитела к hGM-CSF, представленные в настоящем описании, включают иммуноглобулиновые молекулы, содержащие 2 тяжелые цепи и 2 легкие цепи. Каждая из тяжелых цепей включает вариабельную область тяжелой цепи (можно применять сокращение «HCVR» или «VH») и константную область тяжелой цепи (константная область тяжелой цепи содержит 3 домена, которые сокращенно обозначают как «СН1», «СН2» и «СН3»). Каждая из легких цепей включает вариабельную область легкой цепи (можно применять сокращение «LCVR» или «VL») и константную область легкой цепи (константная область тяжелой цепи содержит 1 домен, который сокращенно обозначают как «CL»). HCVR и LCVR наиболее важны для специфичности связывания антитела.
Аминокислотная последовательность вариабельной области ответственна в основном за взаимодействие между антителом и антигеном. Поэтому, когда конструируют экспрессионный вектор, который содержит последовательность вариабельной области, выведенную из встречающегося в естественных условиях антитела, в каркасной последовательности, выведенной из другого антитела с другим свойством, образовавшийся вектор может экспрессировать рекомбинантное антитело, которое имитирует свойство встречающегося в естественных условиях антитела. Таким образом, не является необходимым получать полную последовательность конкретного антитела, когда создают интактное рекомбинантное антитело, обладающее способностью к связыванию, аналогичной способности исходного антитела. Иногда для достижения этой цели может оказаться достаточным создавать частичную последовательность тяжелой цепи и легкой цепи, которая перекрывает вариабельную область.
Антитело взаимодействует с антигеном-мишенью главным образом через аминокислотные остатки LCVR и HCVR. Поэтому аминокислотные последовательности вариабельных областей характеризуются большим разнообразием среди антител, чем последовательности, расположенные вне вариабельной области. HCVR и LCVR подразделяют также на основе относительно стабильного «каркасного участка (FR)» и «гипервариабельного участка (CDR)». Каждая HCVR и LCVR состоит из 3 CDR и 4 FR соответственно. Они расположены в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4, в направлении от аминоконца к карбоксиконцу.
В данной области известны методы определения или предсказания аминокислотных остатков, которые соответствуют каждому из структурных доменов антитела, включая гипервариабельные участки, например, CDR. К таким общепринятым методам относятся в частности методы Chothia, AbM и Kabat.
Как правило, аффинность к связыванию антитела составляет по меньшей мере примерно 1×10-7 М, а связывание с высокой аффинностью с определенным антигеном превышает по меньшей мере в 2 раза связывание с неспецифическими антигенами (например, БСА, казеин).
Понятие «высокая аффинность» касательно определенных антител типа IgG означает, что аффинность к связыванию антитела составляет по меньшей мере примерно 1×10-7 M, предпочтительно по меньшей мере примерно 1×10-8 M, более предпочтительно по меньшей мере примерно 1×10-9 М и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 1×10-10 М.
Понятие «высокая аффинность» изменяется в зависимости от изотипов антител. Например, считается, что антитело изотипа IgM обладает высокой аффинностью», когда аффинность к связыванию составляет по меньшей мере least 1×10-7 M.
Антитела, предлагаемые в изобретении
Согласно настоящему описанию изобретение относится к моноклональным антителам к человеческому GM-CSF (анти-hGM-CSF) и их фрагментам, которые обладают более высоким нейтрализующим действием в отношении hGM-CSF, чем известные моноклональные антитела (доступные в настоящее время моноклональные антитела) к hGM-CSF. Можно применять или использовать для введения моноклональные антитела к hGM-CSF или их фрагменты одного типа или вида.
В альтернативном варианте можно применять или вводить совместно более одного типа или вида моноклональных антител к hGM-CSF. При создании изобретения было установлено, что, когда используют совместно более одного вида или типа моноклональных антител к GM-CSF, то они проявляют более высокое нейтрализующее действие (например, более высокую ингибирующую рост клеток активность). Кроме того, один или несколько типов или видов моноклональных антител к hGM-CSF или их фрагментов можно применять или использовать для введения в сочетании с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, которые не представляют собой антитела, такими как малая молекула, агент для РНКi или пептид.
Одним из объектов изобретения являются выделенные моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые распознают и специфически связываются с hGM-CSF. Изобретение относится к выделенным моноклональным антителам к hGM-CSF и их антигенсвязывающих фрагментам, которые связываются с hGM-CSF (моноклональные антитела к hGM-CSF, которые связываются с hGM-CSF, и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с hGM-CSF), и обладают нейтрализующим действием или нейтрализующей активностью в отношении биологической активности hGM-CSF. Одним из вариантов осуществления изобретения являются выделенные моноклональные антитела к hGM-CSF и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с hGM-CSF и обладают нейтрализующей способностью или активностью в отношении hGM-CSF-активности, где моноклональное антитело и его антигенсвязывающий фрагмент распознают следующие последовательности: ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF (SEQ ID NO: 1). Выделенные моноклональные антитела к hGM-CSF и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с hGM-CSF, где моноклональное антитело и его антигенсвязывающий фрагмент распознают следующие последовательности: ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF, обладают нейтрализующей способностью или активностью в отношении hGM-CSF и пригодны для лечения и предупреждения заболевания, состояний и нарушений, ассоциированных со сверхэкспрессией hGM-CSF. Конкретным вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который связывается с hGM-CSF, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент распознает следующий прерывистый эпитоп hGM-CSF, представленный в (SEQ ID NO: 1), который соответствует аминокислотам: ELYK (SEQ ID NO: 2) в положении 77-80 в hGM-CSF и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в положении 95-104 в hGM-CSF. Представленные в настоящем описании выделенные моноклональные антитела к hGM-CSF и их антигенсвязывающие фрагменты специфически связываются с hGM-CSF. Они не дают перекрестную реакцию с белком, представляющим собой белок, который отличен от GM-CSF.
Более конкретно в настоящем описании представлены моноклональные антитела, которые специфически связываются с hGM-CSF и обладают способность нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF. Четыре таких антитела, представленных в настоящем описании, обозначены как EV1018, EV1019, EV1003 и EV1007, данные о которых обобщены в таблицах 1 и 2 и в примерах. Так, EV1018, EV1019, EV1003 и EV1007 связываются с hGM-CSF и обладают способностью нейтрализовать усиливающие рост клеток действия hGM-CSF. Как будет описано более подробно ниже, антитела EV1018 и EV1019 распознают один и тот же или практически полностью перекрывающий эпитоп в белке hGM-CSF.
Кроме того, изобретение относится к моноклональному антителу к hGM-CSF или его антигенсвязывающему участку, которое/который отличается тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок имеет аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот заменена(ы), удалена(ы) в результате делеции, встроена(ы) или добавлена(ы) в гипервариабельный участок (CDR).
Следующим объектом изобретения является выделенная дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), кодирующая моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, отличающаяся тем, что выделенная ДНК кодирует аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9.
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF (hGM-CSF) и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF (hGM-CSF), отличающиеся тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок содержит гипервариабельный участок (CDR), который имеет по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9.
Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, отличающиеся тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок содержит гипервариабельный участок (CDR), который имеет по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 330-335.
Согласно настоящему изобретению моноклональное антитело к hGM-CSF, которое содержит гипервариабельный участок (CDR), имеющий одну или несколько аминокислотную(ых) последовательность(ей), выбранную(ых) из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9, и моноклональное антитело к hGM-CSF которое содержит гипервариабельный участок (CDR), имеющий одну или несколько аминокислотную(ых) последовательность(ей), выбранную(ых) из группы, включающей SEQ ID NO: 330-335, рассматриваются как различные виды моноклональных антител к hGM-CSF.
Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, в котором одна или несколько аминокислот заменена(ы), удалена(ы) в результате делении, встроена(ы) или добавлена(ы) в гипервариабельные участки (CDR), подпадает под объем настоящего изобретения, если оно/он специфически связывается с hGM-CSF и нейтрализует его биологическую активность.
Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, где моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок содержит CDR, выбранный из группы, включающей:
(а) CDR1 легкой цепи (L-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7,
(б) CDR2 легкой цепи (L-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и
(в) CDR3 легкой цепи (L-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.
Аналогично этому настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, где моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок содержит CDR, выбранный из группы, включающей:
(г) CDR1 легкой цепи (L-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 330,
(д) CDR2 легкой цепи (L-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 331, и
(е) CDR3 легкой цепи (L-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 332.
Под объем изобретения подпадает также следующее моноклональное антитело к hGM-CSF или антигенсвязывающий участок, если оно/он связывается специфически с hGM-CSF и нейтрализует его биологическую активность: моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, в котором описанный выше гипервариабельный участок (CDR) легкой цепи модифицирован путем делеции, замены, инсерции или добавления одной или нескольких аминокислот.
Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, где моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок содержит CDR, выбранный из группы, включающей:
(а) CDR1 тяжелой цепи (Н-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4,
(б) CDR2 тяжелой цепи (Н-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и
(в) CDR3 тяжелой цепи (Н-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
Аналогично этому настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, где моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок содержит CDR, выбранный из группы, включающей:
(а) CDR1 тяжелой цепи (Н-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 333,
(б) CDR2 тяжелой цепи (Н-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334, и
(в) CDR3 тяжелой цепи (Н-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 335.
Под объем изобретения подпадает также следующее моноклональное антитело к hGM-CSF или антигенсвязывающий участок, если оно/он связывается специфически с hGM-CSF и нейтрализует его биологическую активность: моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, в котором описанный выше гипервариабельный участок (CDR) легкой цепи модифицирован путем делеции, замены, инсерции или добавления одной или нескольких аминокислот.
Эпитоп GM-CSF
Еще одним объектом изобретения является эпитоп hGM-CSF, представляющий собой прерывистый сегмент человеческого GM-CSF, где эпитоп содержит аминокислотные остатки 77-80 человеческого GM-CSF (SEQ ID NO: 1) и аминокислотные остатки 95-104 человеческого GM-CSF (SEQ ID NO: 1), и описывается полипептидными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, и распознается моноклональным антителом к hGM-CSF или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащим 6 различных CDR, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 4-9 или SEQ ID NO: 330-335.
Как более подробно описано в примерах, эпитоп hGM-CSF, распознаваемый моноклональными антителами EV1018 и EV1019, был идентифицирован с помощью метода эпитопного картирования. Установлено, что и EV1018, и EV1019 распознают один и тот же (или практически перекрывающий его) сайт антигена hGM-CSF, которому соответствуют аминокислотные остатки 77-80 и 95-104, находящие в GenBank под регистрационным номером: NP_000749. Изучение структуры позволило установить, что хотя два сегмента являются несмежными в первичной последовательности, два сегмента полипептида расположены близко друг к другу при укладке полипептида, формируя вместе конформационный эпитоп. В соответствии с данными о том, что оба антитела EV1018 и EV1019 распознают один и тот же или практически перекрывающий эпитоп, анализ последовательностей CDR EV1018 и EV1019 продемонстрировал, что они являются практически подобными. Сравнение пептидных последовательностей CDR этих двух антител, позволило получить следующие консенсусные последовательности (например, формулы), представляющие собой перекрывающиеся (например, общие) остатки, которые содержатся в каждом из CDR:
для VH-CDR1: FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), где X1 обозначает Y или Н и Х2 обозначает G или А;
для VH-CDR2: X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 315), где Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х3 обозначает L или V, Х4 обозначает Т или I, X5 обозначает Y или W, Х6 обозначает R или K, Х7 обозначает F или Y и X8 обозначает R или K;
для VH-CDR3: EXnX9GX10XnXnDXn (SEQ ID NO: 316), где Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х9 обозначает М или V и Х10 обозначает А или G;
для VL-CDR1: XnGNXnXnNIGSX11AVG (SEQ ID NO: 317), где Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х11 обозначает Н или Y;
для VL-CDR2: GX12SPX13SG (SEQ ID NO: 318), где Х12 обозначает R или K и Х13 обозначает А или Р; и
для VL-CDR3: STWDSX14LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), где Х14 обозначает R или S и X15 обозначает V или L.
В каждой из консенсусных формул аминокислотные остатки, содержащиеся в соответствующем CDR, представлены в общепринятом однобуквенном формате. Представлены идентичные остатки, содержащиеся как в EV1018, так и BEV1019.
Таким образом, следующим вариантом осуществления является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающийся фрагмент, которое/который связывается с hGM-CSF и обладает нейтрализующей способностью или активностью в отношении hGM-CSF, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (а) тяжелую цепь или в случае фрагмента антитела часть тяжелой цепи, которая содержит (I) консенсусную VH-CDR1-содержащую последовательность FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), в которой X1 обозначает Y или Н и Х2 обозначает G или А, (II) консенсусную VH-CDR2-содержащую последовательность X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 315), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х3 обозначает L или V, Х4 обозначает Т или I, X5 обозначает Y или W, Х6 обозначает R или K, Х7 обозначает F или Y и X8 обозначает R или K; и (III) консенсусную VH-CDR3-содержащую последовательность EXnX9GX10XnXnDXn (SEQ ID NO: 316), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х9 обозначает М или V и Х10 обозначает А или G; и (б) легкую цепь или в случае фрагмента антитела часть легкой цепи, которая содержит (I) консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность XnGNXnXnNIGSX11AVG (SEQ ID NO: 317), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х11 обозначает Н или Y; (II) консенсусную VL-CDR2-содержащую последовательность GX12SPX13SG (SEQ ID NO: 318), в которой Х12 обозначает R или K и Х13 обозначает А или Р;, и (III) консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность STWDSX14LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), в которой X14 обозначает R или S и X15 обозначает V или L; и где антитело или его фрагмент распознает ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF. В конкретном варианте осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент связывается со следующим прерывистым эпитопом: ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF (SEQ ID NO: 1).
Следующим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с hGM-CSF, где антитело или его фрагмент включает (а) тяжелую цепь или в случае фрагмента антитела часть тяжелой цепи, которая содержит (I) консенсусную VH-CDR1-содержащую последовательность FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), в которой X1 обозначает Y или Н и Х2 обозначает G или А, (II) консенсусную VH-CDR2-содержащую последовательность X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 315), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х3 обозначает L или V, Х4 обозначает Т или I, Х5 обозначает Y или W, Х6 обозначает R или K, Х7 обозначает F или Y и X8 обозначает R или K; и (III) консенсусную VH-CDR3-содержащую последовательность EXnX9GX10XnXnDXn (SEQ ID NO: 316), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х9 обозначает М или V и Х10 обозначает А или G; и (б) легкую цепь или в случае фрагмента антитела часть легкой цепи, которая содержит (I) консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность XnGNXnXnNIGSX11AVG (SEQ ID NO: 317), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х11 обозначает Н или Y; (II) консенсусную VL-CDR2-содержащую последовательность GX12SPX13SG (SEQ ID NO: 318), в которой Х12 обозначает R или K и Х13 обозначает A или P; и (III) консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность STWDSX14LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), в которой X14 обозначает R или S и X15 обозначает V или L; и где связывание антитела или его фрагмента с hGM-CSF характеризуется значением KD, которое не превышает 400 пМ, в другом варианте осуществления изобретения составляет менее 160 пМ, при этом значение KD определяют согласно методикам, описанным в примере 11.
В другом варианте осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент отличается тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует пролиферацию дендритных клеток периферической крови. Таким образом, следующим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с hGM-CSF, где моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь или ее часть и легкую цепь или ее часть. Тяжелая цепь или в случае фрагмента антитела часть тяжелой цепи может содержать VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3. В некоторых вариантах осуществления изобретения консенсусная последовательность представлена формулой FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), в которой X1 обозначает Y или Н и Х2 обозначает G или А, которая содержит VH-CDR1. Аналогично этому формула X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 315), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х3 обозначает L или V, Х4 обозначает Т или I, X5 обозначает Y или W, Х6 обозначает R или K, Х7 обозначает F или Y и X8 обозначает R или K, представляет собой консенсусную последовательность которая содержит VH-CDR2; и формула EXnX9GX10XnXnDXn (SEQ ID NO: 316), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х9 обозначает М или V и Х10 обозначает А или G, представляет собой консенсусную последовательность, которая содержит VH-CDR3. Легкая цепь или в случае фрагмента антитела часть легкой цепи может содержать VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3. В указанном варианте осуществления изобретения формула XnGNXnXnNIGSX11AVG (SEQ ID NO: 317), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х11 обозначает Н или Y, представляет собой консенсусную последовательность, которая содержит VL-CDR1; формула GX12SPX13SG (SEQ ID NO: 318), в которой Х12 обозначает R или K и X13 обозначает А или Р, представляет собой консенсусную последовательность, которая содержит VL-CDR2; и формула STWDSX14LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), представляет собой консенсусную последовательность, которая содержит VL-CDR3.
В любом из вариантов осуществления изобретения антитело или его фрагмент нейтрализует активность hGM-CSF. В конкретных вариантах осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его фрагмент нейтрализует активность hGM-CSF, при этом значение IC50 для антитела или фрагмента в анализе ингибирования пролиферации составляет менее чем 20, менее чем 30, менее чем 40, менее чем 50, менее чем 60, менее чем 70, менее чем 80, менее чем 90 или менее чем 100 пМ, в каждом случае при определении с помощью анализа пролиферации TF-1 при ED80, согласно методу, описанному в примере 12. В конкретном варианте осуществления изобретения значение IC50 для моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента, предлагаемого в изобретении, составляет менее чем 40 или менее чем 30 пМ, при определении с помощью анализа пролиферации TF-1 при ED80. В конкретном варианте осуществления изобретения значение IC50 для моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента, предлагаемого в изобретении, составляет менее чем 25 или менее чем 20 пМ, при определении с помощью анализа пролиферации TF-1 при ED80. Согласно еще одному варианту осуществления моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в изобретении, отличается тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует пролиферацию TF-1-клеток примерно на 50% при использовании в концентрации примерно 14 пМ, когда пролиферация TF-1-клеток индуцируется hGM-CSF.
Как продемонстрировано более подробно в примерах, и EV1018, и EV1019 обладают эффективностью в отношении нейтрализации биологической активности hGM-CSF. Поскольку эти антитела распознают практически одинаковый конформационный эпитоп, как указано выше, то можно применять эпитоп для скрининга дополнительных молекул, которые распознают эпитоп, таких как моноклональные антитела или их фрагменты. Таким образом, изобретение относится также к способам скрининга, при которых применяют эпитоп hGM-CSF, который определен полипептидными последовательностями, представленным в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 и который распознается антителами EV1018, EV1019 или их вариантами. Указанный способ заключается в том, что (I) осуществляют скрининг биологического образца или пептидной библиотеки с использованием зонда, который содержит эпитоп; (II) выделяют молекулу, которая специфически связывается с зондом; и (III) идентифицируют молекулу. В одном из вариантов осуществления изобретения способ дополнительно включает стадию, на которой получают молекулу. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекула, идентифицированная с помощью способа, представляет собой моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых случаях зонд может содержать также выявляемый маркер, представляющий собой (но, не ограничиваясь только ими) метку, краситель, аффинную метку и т.д. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения зонд может быть иммобилизованным для целей, например, скрининга связывающих молекул. Методы скрининга в целом являются доступными и хорошо известными специалистам в данной области.
В любом из указанных вариантов осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой любой подтип иммуноглобулинов, такой как класс IgG, например, IgG1, IgG2 и IgG4. Таким образом, в любом из указанных вариантов осуществления изобретения тяжелая цепь может представлять собой, например, цепь гамма-класса, такую как гамма 1 (γ1), гамма 2 (γ2), гамма 3 (γ3) или гамма 4 (γ4). В любом из указанных вариантов осуществления изобретения тяжелую цепь можно выбирать (аминокислотные остатки тяжелой цепи выбирать из) группы, включающей полипептиды, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 10-33, 38-80 и 152-245 и 348-363. В некоторых вариантах осуществления изобретения можно применять часть тяжелой цепи, включая вариабельные области тяжелой цепи. Примеры вариабельных областей тяжелой цепи представлены (но, не ограничиваясь только ими) в настоящем описании в SEQ ID NO: 152-159 и 348-363.
В моноклональных антителах к hGM-CSF и их антигенсвязывающих фрагментах легкая цепь может представлять собой легкую лямбда-цепь или ее часть или легкую каппа-цепь или ее часть. В конкретных вариантах осуществления изобретения легкая лямбда-цепь содержит одну или обе указанные аминокислотные замены: R100G и A153G (содержит замену R100G, замену A153G или и замену R100G, и замену A153G). Следует отметить, что замены в аминокислотной последовательности цепей антитела представлены в настоящем описании со ссылкой на соответствующую аминокислотную референс-последовательность, при этом обозначение положения 100 и 153 в любой легкой цепи или ее фрагменте согласно изобретению должно определяться путем сравнения с SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 34, как аминокислотные положения, соответствующие аминокислотным положениям в SEQ ID NO: 35, в которых аминокислота R заменена на G и аминокислота А замена на G соответственно, если сравнивать с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 34. Например, в вышеописанном случае, в котором легкая лямбда-цепь может содержать одну или обе аминокислотные замены, аминокислотой референс-последовательностью является последовательность легкой цепи EV1018 (EV1018-wt-исходная; SEQ ID NO: 34). R100G означает, что R (аргинин) в положении 100 в легкой цепи EV1018 заменен на G (глицин); A153G означает, что А (аланин) в положении 153 в легкой цепи EV1018 заменен на G (глицин).
В конкретных вариантах осуществления изобретения легкую цепь выбирают из группы, включающей полипептиды, которые представлены (аминокислотные остатки которых представлены в) SEQ ID NO: 34-37 и 184-221 и 364-365. Примеры вариабельных областей легких цепей в контексте настоящего описания представлены в SEQ ID NO: 184-201 и 364-365.
Легкая цепь может нести одну или комбинацию, включающую две или большее количество этих аминокислотных замен, а также другие замены, которые не существенно влияют на способность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента связываться с hGM-CSF и нейтрализовать его активность. В одном из вариантов осуществления изобретения легкая цепь содержит аминокислотную замену либо в одном, либо в обоих положениях, таких как положение 100 и положение 153, в результате чего гликозилирование не возможно в одном из них или в обоих положениях.
Тяжелая цепь моноклонального антитела к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающего фрагмента может содержать одну или несколько аминокислотных замен, таких как Т97А, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164A и L165A. Следует отметить, что замены в аминокислотной последовательности цепей антитела представлены в настоящем описании путем сравнения с соответствующей аминокислотной референс-последовательностью, и к определению положений следует применять такие же принципы, которые описаны выше применительно к заменам R100G и A153G. Например, в вышеописанном случае, в котором тяжелая цепь может содержать одну или несколько указанных выше аминокислотных замен, аминокислотная референс-последовательность представляет собой последовательность тяжелой цепи EV1018 (EV1018; SEQ ID NO: 10). Например, Т97А означает, что Т (треонин) в положении 97 в тяжелой цепи EV1018 заменен на А (аланин); L164A означает, что L (лейцин) в положении 164 в тяжелой цепи EV1018 заменен на А (аланин).
Тяжелая цепь может нести одну или комбинацию, включающую две или большее количество этих аминокислотных замен, а также другие замены, которые не существенно влияют на способность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента связываться с hGM-CSF и нейтрализовать его активность.
Ниже изложены дополнительные детали, касающиеся вариантов осуществления настоящего изобретения:
В одном из вариантов осуществления изобретения тяжелая цепь содержит одну или несколько или одну или комбинацию аминокислотных замен, выбранных из группы, включающей Q3E, Т97А, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164A и L165A. В другом варианте осуществления изобретения тяжелая цепь содержит одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, включающей Q3E, Т97А, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164A и L165A, и при этом легкая цепь содержит одну или обе следующие аминокислотные замены: R100G и A153G.
Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с hGM-CSF, в которых VH-CDR1 содержит аминокислотные остатки SYGMH (SEQ ID NO: 4) или SHAMH (SEQ ID NO: 333).
Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с hGM-CSF, в которых VH-CDR2 содержит аминокислотные остатки LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) или VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334).
Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с hGM-CSF, в которых VH-CDR3 содержит аминокислотные остатки ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) или EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335).
Ниже представлены другие варианты осуществления настоящего изобретения:
моноклональное антитело к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с hGM-CSF, в которых VL-CDR1 содержит аминокислотные остатки IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) или SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330);
моноклональное антитело к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с hGM-CSF, в которых VL-CDR2 содержит аминокислотные остатки GRSPPS (SEQ ID NO: 8) или GKSPAS (SEQ ID NO: 331); и
моноклональное антитело к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с hGM-CSF, в которых VL-CDR3 содержит аминокислотные остатки STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9) или STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332).
Следующими вариантами осуществления настоящего изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с hGM-CSF, дополнительное содержащие сигнальную последовательность.
Сигнальная последовательность может представлять собой любую из множества сигнальных последовательностей, известных специалистам в данной области, таких как сигнальная последовательность, которая пригодна для обеспечения или повышения экспрессии и/или транспорта кодируемого продукта из клетки, в которой он продуцируется, включая (но, не ограничиваясь только ими) сигнальную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 324, 325 и 326.
Во всех вариантах осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF может представлять собой человеческое антитело, гуманизированное антитело или одноцепочечное антитело.
Связывающая активность антител
При создании изобретения неожиданно было установлено, и это является одним из объектов изобретения и описано ниже в примерах, что измеренная аффинность к связыванию антител с антигеном (hGM-CSF) не коррелирует линейно с их нейтрализующей способностью (например, способностью нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF). Эта результаты противоречат общепринятому положению о том, что более высокая аффинность соответствует более высокой нейтрализующей способности. Например, установлено, что антитело, представленное в настоящем описании, т.е. антитело, в котором используются представленные в настоящем описании CDR для распознавания эпитопа, представленного в настоящем описании, например EV1018, характеризуется более чем в 100 раз более высокой способностью к ингибированию при анализе с использованием TF-1-клеток по сравнению с известным в данной области антителом, представленным в таблице 7, в то время как аффинность к связыванию у него составляет менее 50% от аффинности к связыванию известного в данной области антитела. Это противоречит данным, представленным в WO 2006/122797, в которой продемонстрировано, что более высокая аффинность антитела сопровождается более высокой активностью в анализе с использованием TF-1-клеток.
Нейтрализующая активность антител
У мононуклеарных клеток периферической крови человека и опухолевых клеток линии TF-1 может происходить пролиферация в ответ на стимуляцию hGM-CSF. Нейтрализующую активность моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента подтверждают, оценивая ингибирующее действие на пролиферацию. Известно, что у моноцитов периферической крови человека и клеток линии TF-1 может иметь место пролиферация при их культивировании в присутствии hGM-CSF. Указанную пролиферацию можно ингибировать, добавляя моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающих фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, в культуральную систему, или путем первоначального взаимодействия hGM-CSF с моноклональным антителом к hGM-CSF или его антигенсвязывающим фрагментом, предлагаемым в настоящем изобретении, и последующего добавления смеси в культуральную систему. Например, моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающих фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, может обладать нейтрализующей активностью в отношении TF-1-клеток, пролиферация которых индуцируется hGM-CSF, при этом уровень цитостатического действия составляет 40-60% (примерно 50%) по сравнению с применяемым в качестве отрицательно контроля вариантом (обработанным 31 пг/мл hIgG) при концентрации примерно 2 нг/мл (примерно 14 пМ).
Моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, обладает нейтрализующей способностью в отношении hGM-CSF, превышающей способность известного моноклонального антитела к hGM-CSF. Поэтому их, вероятно, можно применять в качестве терапевтических агентов, используемых в меньших количествах или дозах, для лечения различных заболеваний, которые обусловлены hGM-CSF, таких как аллергический дерматит, аутоиммунные заболевания, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), астма, муковисцидоз, интерстициальное легочное заболевание, ринит, артрит и родственные артропатии типа ревматоидного артрита, псориаз, миелоидный лейкоз и рассеянный склероз.
Терапевтические композиции, наборы и терапевтическое применение
Антитела к hGM-CSF и их антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, обладают эффективностью, такой как способность нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, и поэтому их можно применять для лечения медицинского состояния (например, заболевания или нарушения), которое ассоциировано (например, вызывается) аномальной экспрессией hGM-CSF у индивидуума. Таким образом, указанное терапевтическое применение подпадает под объем настоящего изобретения.
Некоторыми вариантами осуществления изобретения являются способы лечения заболеваний или состояний, которые указаны в настоящем описании, заключающиеся в том, что вводят пациенту антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, или композицию, представленную в настоящем описании.
В контексте настоящего описания понятие «заболевание или нарушение, ассоциированное со сверхэкспрессией hGM-CSF», как правило, относится к «заболеванию, вызываемому hGM-CSF». Под понятие подпадают любые заболевания, которые обусловливают патологию и является причиной ее ухудшения, когда у пациента присутствует GM-CSF. Под понятие подпадают также другие заболевания, которые обусловливают патофизиологическое состояние и вызывают его ухудшение. Ожидается, что ингибирование биологической активности GM-CSF может временно облегчать симптомы заболевания, ассоциированные с повышенным уровнем GM-CSF, и/или временно замедлять развитие заболевания.
Понятия «заболевание (болезнь)», «нарушение» и «состояние» в контексте настоящего описания применяют взаимозаменяемо. Они включают (но, не ограничиваясь только ими): респираторные синдромы, обструктивные легочные заболевания различной этиологии, эмфизему легких различного происхождения, облитерирующие заболевания легких, интерстициальные легочные заболевания, интерстициальную болезнь легких, муковисцидоз, бронхит различной этиологии, бронхоэктаз, РДСВ (респираторный дистресс-синдром взрослых) и все формы отека легких; обструктивные легочные заболевания, выбранные из группы, включающей ХОЗЛ (хроническое обструктивное заболевание легких), астму, бронхиальную астму, педиатрическую астму, серьезную астму, острый приступ астмы и хронический бронхит; эмфизему легких, обусловленную ХОЗЛ (хроническое обструктивное заболевание легких) или дефицитом ингибитора α1-протеиазы; облитерирующие заболевания легких, выбранные из группы, включающей аллергический альвеолит, облитерирующие заболевания легких, инициируемые связанными с условиями труда токсическими субстанциями, таких как асбетоз или силикоз, и рестрикцию, вызываемую опухолями легких, такие как лимфангиоз (Lymphangiosis carcinomatosa), бронхоальвеолярная карцинома и лимфомы; пневмонию, вызываемую инфекциями, такими, например, как заражение вирусами, бактериями, грибами, простейшими, гельминтами или другими патогенами, пневмонит, вызываемый различными факторами, такими, например, как аспирация и недостаточность левого отдела сердца, индуцируемый радиацией пневмонит или фиброз, коллагеноз, такой, например, как красная волчанка, системная склеродермия или саркоидоз, грануломатозы, такие, например, как болезнь Бека, идиопатическая интерстициальная пневмония или идиопатический пневмосклероз (IPF); муковисцидоз, бронхит, вызываемый бактериальной или вирусной инфекцией, аллергический бронхит и токсический бронхит; бронхоэктаз; отек легких, например, токсический отек легких после аспирации или вдыхания токсических субстанций и инородных субстанций; ринит, артрит и родственные артропатии, псориаз, миелоидный лейкоз, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, гломерулонефрит и хронический атопический дерматит.
В контексте настоящего описания понятия «лечить», «обработка» и «лечение» означают в целом введение терапевтического средства индивидууму с целью получения всех или некоторых из следующих результатов: снижение или облегчение прогрессирования, серьезности и/или продолжительности заболевания, нарушения или состояния, ассоциированного с аномальной экспрессией и/или активностью человеческого GM-CSF, или облегчение одного или нескольких их симптомов в результате введения одного или нескольких терапевтических средств (например, антител к GM-CSF).
В контексте настоящего описания понятие «терапевтически эффективное количество» означает количество терапевтического средства (например, антитела, которое иммуноспецифически связывается с человеческим GM-CSF), которое является достаточным для снижения серьезности нарушения, ассоциированного с аномальной экспрессией и/или активностью человеческого GM-CSF, снижения продолжительности нарушения, ассоциированного с аномальной экспрессией и/или активностью человеческого GM-CSF, облегчения одного или нескольких симптомов нарушения, ассоциированного с аномальной экспрессией и/или активностью человеческого GM-CSF, предупреждение развития нарушения, ассоциированного с аномальной экспрессией и/или активностью человеческого GM-CSF, обусловливание регресса нарушения, ассоциированного с аномальной экспрессией и/или активностью человеческого GM-CSF, или усиление или улучшение терапевтического(их) действия(ий) другой терапии в отношении нарушения, ассоциированного с аномальной экспрессией и/или активностью человеческого GM-CSF.
Количество вводимого моноклонального антитела к hGM-CSF, например, путем введения композиции, представленной в настоящем описании, может варьироваться в зависимости от таких условий, как состояние, заболевание или нарушение, подлежащее лечению, возраст, пол и состояние здоровья субъекта(индивидуума), получающего лечение, и серьезности и степени прогрессирования состояния, заболевания или нарушения, подлежащего лечению. Соответствующую дозу можно определять эмпирически, используя известные методы и с учетом потребностей индивидуума. Как правило, моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму в дозе, не превышающей 500 мг/дозу. Можно применять также более низкие дозы.
В других вариантах осуществления изобретения можно объединять любые антитела к GM-CSF и их фрагменты, указанные выше. В некоторых вариантах осуществления изобретения можно объединять 2, 3, 4, 5 или большее количество указанных антител к GM-CSF, их фрагментов или комбинаций.
В некоторых вариантах осуществления изобретения любые описанные выше варианты можно объединять дополнительно с одним или несколькими ранее описанными антителами к GM-CSF, их фрагментами или комбинациями.
Следующим вариантом осуществления изобретения является терапевтическая композиция, содержащая (одно, по меньшей мере одно) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления изобретения терапевтическая композиция содержит одно или несколько моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих фрагментов, которые распознают следующие последовательности: ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF, и фармацевтически приемлемый носитель. Терапевтические композиции могут содержать любое из моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем описании, индивидуально (один вид или тип моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента в терапевтической композиции) или в сочетании, например в виде комбинаций двух или большего количества видов или типов моноклональных антител к hGM-CSF; два или большее количество видов или типов их антигенсвязывающих фрагментов; один или несколько видов или типов моноклональных антител к hGM-CSF и один или несколько видов или типов их антигенсвязывающих фрагментов; один или несколько видов или типов моноклональных антител к hGM-CSF и два или большее количество видов или типов их антигенсвязывающих фрагментов; два или большее количество видов или типов моноклональных антител к hGM-CSF и один или несколько видов или типов их антигенсвязывающих фрагментов.
Специфическими вариантами осуществления изобретения являются терапевтические композиции, содержащие (одно или более одного) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который связывается с hGM-CSF, и фармацевтически приемлемый носитель, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее/содержащий (а) тяжелую цепь или в случае фрагмента антитела часть тяжелой цепи, которая содержит (I) консенсусную VH-CDR1-содержащую последовательность FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), в которой X1 обозначает Y или Н и Х2 обозначает G или А, (II) консенсусную VH-CDR2-содержащую последовательность X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 315), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х3 обозначает L или V, Х4 обозначает Т или I, X5 обозначает Y или W, Х6 обозначает R или K, Х7 обозначает F или Y и X8 обозначает R или K; и (III) консенсусную VH-CDR3-содержащую последовательность EXnX9GX10XnXnDXn (SEQ ID NO:316), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х9 обозначает М или V и Х10 обозначает А или G; и (б) легкую цепь или в случае фрагмента антитела часть легкой цепи, которая содержит (I) консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность XnGNXnXnNIGSX11AVG (SEQ ID NO: 317), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х11 обозначает Н или Y; (II) консенсусную VL-CDR2-содержащую последовательность GX12SPX13SG (SEQ ID NO: 318), в которой X12 обозначает R или K и Х13 обозначает А или Р;, и (III) консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность STWDSX14LSAVX15 (SEQ ID NO:319), в которой X14 обозначает R или S и X15 обозначает V или L; где моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент распознает следующие последовательности: ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF.
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим два или большее количество моноклональных антител к hGM-CSF, которые связываются с hGM-CSF, два или большее количество их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с hGM-CSF, или их комбинацию и фармацевтически приемлемый носитель, где одно или несколько моноклональных антител к hGM-CSF, которые связываются с hGM-CSF, или один или несколько их антигенсвязывающих фрагментов распознают прерывистый эпитоп ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является композиция, содержащая два или большее количество моноклональных антител к hGM-CSF, которые связываются с hGM-CSF, два или большее количество их антигенсвязывающих фрагментов, или их комбинацию и фармацевтически приемлемый носитель, где одно или несколько антител или их антигенсвязывающих фрагментов содержит (а) тяжелую цепь или в случае фрагмента антитела часть тяжелой цепи, которая содержит (I) консенсусную VH-CDR1-содержащую последовательность FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), в которой X1 обозначает Y или Н и Х2 обозначает G или А, (II) консенсусную VH-CDR2-содержащую последовательность X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO:315), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х3 обозначает L или V, Х4 обозначает Т или I, X5 обозначает Y или W, Х6 обозначает R или K, Х7 обозначает F или Y и X8 обозначает R или K; и (III) консенсусную VH-CDR3-содержащую последовательность EXnX9GX10XnXnDXn (SEQ ID NO: 316), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х9 обозначает М или V и Х10 обозначает А или G; и (б) легкую цепь или в случае фрагмента антитела часть легкой цепи, которая содержит (I) консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность XnGNXnXnNIGSX11AVG (SEQ ID NO: 317), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х11 обозначает Н или Y; (II) консенсусную VL-CDR2-содержащую последовательность GX12SPX13SG (SEQ ID NO: 318), в которой X12 обозначает R или K и Х13 обозначает А или Р; и (III) консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность STWDSX14LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), в которой X14 обозначает R или S и X15 обозначает V или L; где моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент распознает следующие последовательности: ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF.
Другим объектом изобретения является композиция, в которой по меньшей мере одно из двух или большего количества моноклональных антител к hGM-CSF, которые связываются с hGM-CSF, содержит полипептид, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 10-33, 38-80, 152-183, 34-37, 184-221, 222-245, 320-323 и 348-365. Композиции могут включать помимо одного или нескольких моноклональных антител к hGM-CSF, представленных в настоящем описании, другие ранее описанные моноклональные антитела к hGM-CSF (см., например, публикацию РСТ международной заявки на патент WO 2006/122797; публикацию РСТ международной заявки на патент WO 2007/092939; и публикацию РСТ международной заявки на патент WO 2006/11353).
Наборы
Антитела к hGM-CSF или их антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, а также композиция, содержащая такие антитела, может иметь форму набора, который подпадает под объем настоящего изобретения. Набор может иметь различные форматы и помимо лекарственного средства (терапевтическая композиция) может включать также упаковку и/или этикетку лекарственного средства или устройства, как правило, отвечающую предписанию лечащего врача. Набор, как правило, включает напечатанную инструкцию по применению. В некоторых вариантах осуществления изобретения приготовленная в виде препаративной формы композиция (например, лекарственное средство) находится в одном или нескольких контейнерах. В некоторых вариантах осуществления изобретения контейнер может представлять собой устройство, применяемое для дозирования лекарственного средства при введении. Например, лекарственное средство, предлагаемое в настоящем изобретении, может быть предварительно отмерено (например, разделено на аликвоты) в одноразовое дозирующее устройство и представлено в виде набора. В некоторых случаях контейнер представляет собой шприц. Шприц необязательно может быть предварительно заполнен. В некоторых случаях одноразовый контейнер является предварительно заполненным, предварительно запечатанным и может быть сменным.
В зависимости от путей введения и механизмов введения конкретного лекарственного средства набор может включать соответствующие компоненты.
Лекарственные средства
В контексте настоящего описания «носитель, пригодный для фармацевтического агента» включает любой или все физиологически совместимые растворы, дисперсионные среды, средства для нанесения покрытия, антимикробные средства или противогрибковые средства, агенты для регуляции осмотического давления и замедлители абсорбции. Например, носители, пригодные для фармацевтического агента, могут включать один или несколько типов агентов, таких как вода, солевой раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, декстроза, глицерин и этанол и их комбинации. Во многих случаях предпочтительно включают в композиции агент для регуляции осмотического давления, такой как сахар, многоатомный спирт или хлорид натрия. Многоатомные спирты могут представлять собой маннит или сорбит. Кроме того, носитель, пригодный для фармацевтического агента, может включать небольшое количество вспомогательных субстанций, таких как увлажнитель, эмульгатор, консервант и забуферивающий агент. Вспомогательные субстанции могут повышать сохранность или эффективность композиций моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента.
Композиции медицинского назначения, пригодные для парентерального введения, могут включать моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении. Предпочтительно моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент применяют в виде инъецируемого раствора, содержащего антитело в количестве 0,1~250 мг/мл, когда применяют один вид моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента. С другой стороны, когда смешивают и применяют несколько видов антител, антитела предпочтительно применяют в виде инъецируемого раствора, содержащего антитела в количестве 0,001~10 мг/мл. Кроме того, несколько антител можно произвольно смешивать в любом соотношении.
Инъецируемый раствор в виде жидкой или лиофилизированной дозы может находиться во флаконе, ампуле из стекла типа «Флинт» или фармацевтического стекла желтого цвета или в предварительно заполненном шприце. В качестве забуферивающего агента можно применять L-гистидин при значении pH 15,0~7,0 (наиболее пригодным является значение pH 6,0). Наиболее предпочтительно применять L-гистидин в концентрации 5-10 мМ. Другие пригодные в качестве забуферивающих агенты могут представлять собой (но, не ограничиваясь только ими) сукцинат натрия, цитрат натрия, фосфат натрия или фосфат калия. К забуферивающему агенту для элиминации токсичности раствора можно добавлять хлорид натрия в концентрации 0~300 мМ (в зависимости от лекарственной формы в виде жидкости, наиболее предпочтительно 150 мМ). Лиофилизированная лекарственная форма может включать криопротектант; главным образом сахарозу, в количестве 0~10% (наиболее предпочтительное количество может составлять 0,5~1,0%). Другими веществами, пригодными в качестве криопротектантов, могут являться трегалоза и лактоза. Лиофилизированная лекарственная форма может включать наполнитель, главным образом маннит в количестве 1~10% (наиболее предпочтительным может являться количество 2~4%). В качестве стабилизатора в лекарственных формах, как в виде жидкости, так и лиофилизата, можно применять главным образом L-метионин в концентрации 1~50 мМ (наиболее предпочтительной может являться концентрация 5~10 мМ). Другими приемлемыми наполнителями являются глицин и аргинин. Можно включать полисорбат 80 в качестве поверхностно-активного вещества в количестве 0~0,05% (наиболее предпочтительное количество может составлять 0,005~0,01%). К другим пригодным поверхностно-активным веществам относятся (но, не ограничиваясь только ими) полисорбат 20 и BRIJ.
Композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в виде различных лекарственных форм. Например, композиция может находиться в лекарственной форме в виде жидкости, полутвердого или твердого продукта. К ним относятся раствор (например, применяемый путем инъекции или трансфузии раствор), дисперсионная жидкость, суспензионная жидкость, таблетка, пилюля, порошок, липосома и суппозиторий. Предпочтительно вид лекарственной формы зависит, например, от пути введения и терапевтического назначения. Предпочтительно композиции, имеющие лекарственную форму в виде жидкости, можно применять путем инъекции и трансфузии жидкости. Композиции можно предпочтительно применять для парентерального введения (например, их можно применять для внутривенного введения, подкожного введения, абдоминального введения и внутривенного введения). В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело вводят путем внутривенной инфузии раствора или внутривенной инъекции. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело вводят путем внутримышечной инъекции или подкожной инъекции.
Композиции, предназначенные для терапевтического применения, как правило, получают и хранят в стерильных и стабильных условиях. Композиции могут иметь форму раствора, микроэмульсии, дисперсионной жидкости, липосомы или других структур, которые пригодны для включения лекарственного средства в высокой концентрации. Стерилизованный раствор, предназначенный для инъекции, приготавливают с помощью следующих процедур. Необходимое количество действующих веществ (в частности, моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента) смешивают в соответствующем растворителе. При необходимости одно или комбинацию вышеуказанных соединений смешивают в соответствующем растворителе вместе с действующими веществами, а затем стерилизуют фильтрацией, получая раствор. Как правило, основную дисперсионную среду и действующие вещества смешивают в стерилизованном наполнителе, включающем другие требуемые соединения из вышеуказанной среды. Когда стерилизованный лиофилизированный порошок применяют для получения стерилизованного инъецируемого раствора, то в качестве предпочтительных методов получения используют вакуумную сушку и сушку распылением. С помощью метода приготовления получают любые другие требуемые композиции из порошка действующего вещества и стерилизованного раствора, применяемого для фильтрации. Текучесть раствора на соответствующем уровне поддерживают следующими путями. Эти пути включают, например, нанесение материала для покрытия, такого как лецитин, сохранение частиц размера, требуемого для дисперсионной жидкости, и нанесение поверхностно-активного вещества. В композиции включают фармацевтические замедлители абсорбции, такие как моностеариновая кислота и желатин, в результате чего инъецируемые композиции могут абсорбироваться в организме человека в течение более длительного срока.
Моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, можно вводить с помощью различных методов, известных в данной области. Для различных терапий предпочтительно применяют такие пути/методы введения, как подкожная инъекция, внутривенная инъекция или трансфузия жидкости. Выбор путей/методов введения зависит от ожидаемых результатов. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что имплантат, чрескожный пластырь и система для введения лекарственного средства подпадают под понятие пути/методы введения. В одном из вариантов осуществления изобретения приготавливают также препарат антитела в сочетании с действующими веществами в виде лекарственной формы с контролируемым высвобождением, которая может контролировать высвобождение соединений. Биосовместимый полимер представляет собой биоразложимый полимер. Препарат может включать биосовместимый полимер, такой как этиленвинилацетат, полиангидрид, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортотиоэфиры и полилактат. Различные методы получения указанных лекарственных форм заявлены в патентах и хорошо известны специалистам в данной области.
В одном из вариантов осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент вводят орально в сочетании, например, с неактивным разбавителем или съедобным и абсорбируемым носителем. Соединения (и при необходимости другие ингредиенты) можно включать также в твердую или мягкую желатиновую капсулу, прессовать с получением таблетки или непосредственно смешивать в пище для индивидуума. При терапии, предусматривающей оральное введение, соединения можно смешивать с эксципиентом и применять в форме, предназначенной для приема внутрь, такой как таблетка, трансбуккальная таблетка, троше (пастилка), капсула, эликсир, суспензионная жидкость, сироп и облатка. Для введения соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, путем, отличным от парентерального пути, необходимо наносить на соединение материалы, предупреждающие его инактивацию, и одновременно вводить соединения и указанные материалы.
Комбинированная терапия
Предусматривается также включение в композиции дополнительных действующих веществ, при этом дополнительные действующие вещества не представляют собой антитело к антигену, который не представляет собой GM-CSF. В одном из вариантов осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, предписываются в сочетании с одним или несколькими видами других терапевтических средств, которые можно применять для лечения болезней, ассоциированных с повышенными уровнями GM-CSF, или вводят в сочетании с другими терапевтическими средствами одновременно, при этом другие терапевтические средства не представляют собой антитела к белку, отличному от GM-CSF. Например, моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, предписываются в сочетании с одним или несколькими другими антителами к GM-CSF. Преимуществом комбинированной терапии является то, что в этом случае терапевтические средства оказывают эффективное действие при их применении в малых количествах. Тем самым удается избежать токсичности или осложнений, которые могут быть связаны с терапевтическими средствами, характерных для различных монотерапий.
В контексте настоящего описания понятие «введение в одно и тоже время, одновременно» следует рассматривать в широком смысле. Например, когда два или большее количество видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих фрагментов вводят пациенту, то каждое/каждый или некоторые из антител или их фрагментов может представлять собой индивидуальное лекарственное средство (композицию), но может и не являться индивидуальным лекарственным средством. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуальное лекарственное средство (например, композиция) содержит все из различных видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих фрагментов, которые вводят индивидууму, в результате чего антитела или их антигенсвязывающие фрагменты одновременно присутствуют в организме пациента в виде смеси. Однако в некоторых вариантах осуществления изобретения два или большее количество лекарственных средств (например, композиций), которые содержат один или несколько видов антител или их антигенсвязывающих фрагментов, вводят индивидууму по отдельности. При введении «по отдельности» лекарственные средства можно вводить последовательно, например, одно после другого. Такое введение можно рассматривать как «одновременное», если действие первого лекарственного средства и действие вводимого(ых) позднее лекарственного(ых) средства(в) (второго, третьего) перекрываются во времени и в клетке/ткани-мишени в организме индивидуума, оказывая тем самым влияние на эффективность и повышая (например, синергетически) результат терапии.
В частности, когда применяют более одного вида моноклональных антител к hGM-CSF, предлагаемых в настоящем изобретении, то можно обеспечивать ингибирующую клеточный рост активность (нейтрализующая биологическая активность), существенно превышающую активность, полученную при использовании одного типа моноклональных антител в композиции медицинского назначения. Таким образом, можно применять требуемое терапевтическое средство в более низком количестве.
Таким образом, изобретение относится к способам повышения активности, отличающимся тем, что вводят одновременно два или большее количество видов моноклональных антитело к hGM-CSF или композиции медицинского назначения или ветеринарные лекарственные композиции, в состав которых входит два или большее количество видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих фрагментов, при этом два или большее количество видов антител выбирают из указанных ниже в подпунктах (а) и (б):
(а) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который имеет гипервариабельный участок (CDR), содержащий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4-9, SEQ ID NO: 330-335, SEQ ID NO: 336-341 или SEQ ID NO: 342-347, и является специфическим в отношении hGM-CSF,
(б) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, указанное/указанный в подпункте (а), которое/который имеет аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот замена(ы), удалена(ы) в результате делеции, встроена(ы) или добавлена(ы), и является специфическим в отношении hGM-CSF.
Аналогично этому, настоящее изобретение относится также к способу повышения активности, отличающемуся тем, что одновременно вводят несколько различных видов (далее в контексте настоящего описания обозначено как «множество (несколько) видов») моноклональных антител к hGM-CSF, предлагаемых в изобретении, или композиции медицинского назначения или ветеринарные лекарственные композиции, в состав которых входит несколько видов моноклональных антител к hGM-CSF, предлагаемых в изобретении.
В любых вариантах осуществления изобретения композиция может содержать один вид или тип моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих фрагментов, которые обладают способностью нейтрализовать активность hGM-CSF. В альтернативном варианте в любых вариантах осуществления изобретения композиция может содержать два или большее количество видов или типов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих фрагментов, которые обладают способностью нейтрализовать активность hGM-CSF. Моноклональные антитела и/или и фрагменты, входящие в композицию, могут представлять собой помимо одного или несколько антител или их фрагментов, представленных в настоящем описании, ранее описанные моноклональные антитела к hGM-CSF и/или их фрагменты. Моноклональные антитела к hGM-CSF и их антигенсвязывающие фрагменты и терапевтические композиции, композиции медицинского назначения и фармацевтические композиции, которые содержат указанные антитела и/или их антигенсвязывающие фрагменты, можно применять для лечения или предупреждения заболеваний, нарушений или состояний, вызываемых hGM-CSF и/или ассоциированных с его сверхэкспрессией (относительно уровня экспрессии hGM-CSF в контроле, например, в организме индивидуума(ов), который(ые) не имеет(ют) заболевания, состояния или нарушения).
Считается, что композиции медицинского назначения, включающие носители, фармацевтически приемлемые для моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента, должны обладать эффективностью в отношении заболеваний, вызываемых hGM-CSF. Приведенными в качестве иллюстрации примерами заболеваний, вызываемых избыточным производством hGM-CSF, являются
(а) аллергическое заболевание, такое как астма, атония и полиноз,
(б) отторжение трансплантата, реакция «трансплантат-против-хозяина» (GVHD) и
(в) аутоиммунное заболевание, такое как ревматоидный артрит.
Не ограничиваясь каким-либо конкретным механизмом, можно предположить, что сверхэкспрессия GM-CSF по меньшей мере частично вызывает группу болезней или нарушений, которые перечислены в настоящем описании. Однако можно предположить также, что указанные клинические состояния могут вызываться также нарушением другого(их) родственного(ых) биологического(их) пути(ей), таких как позитивная (повышающая) регуляция соответствующего(их) рецептора(ов) или мутации в одном или нескольких эффекторных путях. Таким образом, понятие «заболевание или нарушение, ассоциированное со сверхэкспрессией hGM-CSF» должно включать такие состояния, которые приводят к результату, эквивалентному полученному при сверхэкспрессии hGM-CSF.
Производство/получение
Одним из вариантов осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, предназначенное/предназначенный для применения в медицине.
Вариантом осуществления изобретения является также применение моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента, представленного в настоящем описании, для производства или получения лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного со сверхэкспрессией hGM-CSF (уровнем GM-CSF), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с hGM-CSF и обладает способностью нейтрализовать активность hGM-CSF. Указанные моноклональные антитела к hGM-CSF или их антигенсвязывающие фрагменты могут представлять собой любые варианты, представленные в настоящем описании.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, распознающего ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF, для производства или получения лекарственного средства.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является применение моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих фрагментов для производства или получения лекарственного средства, где антитело или его фрагмент включает (а) тяжелую цепь или в случае фрагмента антитела часть тяжелой цепи, которая содержит (I) консенсусную VH-CDR1-содержащую последовательность FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), в которой X1 обозначает Y или Н и Х2 обозначает G или А, (II) консенсусную VH-CDR2-содержащую последовательность X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 315), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х3 обозначает L или V, Х4 обозначает Т или I, Х5 обозначает Y или W, Х6 обозначает R или K, Х7 обозначает F или Y и X8 обозначает R или K; и (III) консенсусную VH-CDR3-содержащую последовательность EXnX9GX10XnXnDXn (SEQ ID NO: 316), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х9 обозначает М или V и Х10 обозначает А или G; и (б) легкую цепь или в случае фрагмента антитела часть легкой цепи, которая содержит (I) консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность XnGNXnXnNIGSX11AVG (SEQ ID NO: 317), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х11 обозначает Н или Y; (II) консенсусную VL-CDR2-содержащую последовательность GX12SPX13SG (SEQ ID NO: 318), в которой X12 обозначает R или K и Х13 обозначает А или Р; и (III) консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность STWDSX14LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), в которой X14 обозначает R или S и X15 обозначает V или L.
Следующим объектом изобретения являются выделенные антитела к hGM-CSF или антигенсвязывающие фрагменты указанных антител, которые можно применять для производства лекарственных средств. Эти лекарственные средства можно применять для лечения заболевания, состояния или нарушения, ассоциированного с аномальной экспрессией (например, сверхэкспрессией) hGM-CSF. Любое из моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем описании, можно применять для производства лекарственного средства, предназначенного для указанной цели.
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты распознают ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF.
В некоторых вариантах осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает (а) тяжелую цепь или в случае фрагмента антитела часть тяжелой цепи, которая содержит (I) консенсусную VH-CDR1-содержащую последовательность FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), в которой X1 обозначает Y или Н и Х2 обозначает G или А, (II) консенсусную VH-CDR2-содержащую последовательность X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 315), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х3 обозначает L или V Х4 обозначает Т или I, Х5 обозначает Y или W, Х6 обозначает R или K, Х7 обозначает F или Y и X8 обозначает R или K; и (III) консенсусную VH-CDR3-содержащую последовательность EXnX9GX10XnXnDXn (SEQ ID NO: 316), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х9 обозначает М или V и Х10 обозначает А или G; и (б) легкую цепь или в случае фрагмента антитела часть легкой цепи, которая содержит (I) консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность XnGNXnXnNIGSX11AVG (SEQ ID NO: 317), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х11 обозначает Н или Y; (II) консенсусную VL-CDR2-содержащую последовательность GX12SPX13SG (SEQ ID NO: 318), в которой Х12 обозначает R или K и Х13 обозначает А или P; и (III) консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность STWDSX14LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), в которой Х14 обозначает R или S и X15 обозначает V или L. В одном из вариантов осуществления изобретения связывание антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с hGM-CSF характеризуется значением KD, не превышающим 400 пМ, в другом варианте осуществления изобретения KD не превышает примерно 160 пМ (как в случае EV1018 или EV1019), где значение KD определяют согласно методам, описанным в примерах.
В других вариантах осуществления изобретения можно объединять любые антитела к GM-CSF и их фрагменты, перечисленные выше. В некоторых вариантах осуществления изобретения можно объединять 2, 3, 4, 5 или большее количество указанных антител к GM-CSF, их фрагментов или комбинаций.
Получение антител и их фрагментов, ДНК и векторов
Ниже описано получение исходных антител, которые распознают прерывистый эпитоп, предлагаемый в изобретении; однако изобретение не ограничено каким-либо конкретным способом. Описанные отличительные признаки, касающиеся технологии, можно изменять без отклонения от сущности изобретения.
Моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, получали из крови пациента, страдающего идиопатическим альвеолярным протеинозом, используя следующие стадии: выделение клона клеток для получения антитела скрининг антителопозитивных клеток из полученной библиотеки антителопродуцирующих клеток и очистка полученного антитела от супернатанта антителопозитивных клеток в помощью аффинной очистки.
1) Выделение клона клеток, продуцирующего полностью человеческие антитела к hGM-CSF
В-лимфоциты выделяют из крови пациента, страдающего идиопатическим альвеолярным протеинозом (IPAP) и имеющего высокий уровень моноклонального антитела к hGM-CSF в сыворотке крови. Затем, индуцируют пролиферацию В-лимфоцитов. Метод индукции пролиферации хорошо известен. Например, в методе трансформации (D. Kozbor и др.) для индукции пролиферации применяют индуцирующий рак фактор, «вирус Эпштейна-Барра» (далее обозначен как EBV). Более конкретно, В-лимфоциты заражают EBV и индуцируют их пролиферацию. Пролиферирующие клетки поддерживают для получения библиотеки антителопродуцирующих клеток.
2) Выделение моноклонального антитела из библиотеки антителопродуцирующих клеток
С помощью известного метода, общепринятого для получения моноклональных антител, выделяют моноклональную клетку из популяции клеток с индуцированной пролиферацией.
Из библиотеки антителопродуцирующих клеток выделяют лимфоцит с целью получения антитела, которое связывается с hGM-CSF. Более конкретно, популяцию клеток (клоны), продуцирующую антитело, которое связывается с hGM-CSF, отбирают с помощью метода лимитирующих разведении. Предпочтительно применять ELISA, для осуществления которого используют hGM-CSF и мышиное антитело к hIgG, меченое для выявления фракции, связывающейся с hGM-CSF. Популяцию клеток (клоны), продуцирующую только требуемое антитело, получают культивированием отобранных антителопозитивных клеток и их повторного скрининга. Стадии, предшествующие «выделению антителопродуцирующего клеточного клона», проиллюстрированы на блок-схеме, представленной на фиг.1.
3) Аффинная очистка с использованием белка А или белка G
Для очистки моноклонального антитела к hGM-CSF можно культивировать отобранную иммортализованную клетку в роллер-флаконе, 2-литровой вращающейся колбе или в других системах для культивирования. Супернатант фильтруют и концентрируют. Затем белок очищают аффинной хроматографией на белок А-сефарозе или белок G-сефарозе и т.д. (фирма Pharmacia Corp., шт. Нью-Джерси, Пискатавей). После замены забуферивающего раствора на ЗФР концентрацию белка измеряют путем определения ОП при 280 нм или предпочтительно с помощью нефелометрического анализа. Изотип антитела оценивают с помощью антигенспецифического метода в отношении изотипа антигена.
Полученное моноклональное антитело к hGM-CSF представляет собой полностью человеческое антитело, продуцируемое В-лимфоцитом, сенсибилизированным в организме человека, поэтому моноклональное антитело к hGM-CSF редко дает иммунореакцию против антитела. При клонировании антителопродуцирующей клетки В-лимфоцит заражают вирусом ЕВ и индуцируют их пролиферацию посредством активности вируса ЕВ. Таким образом, отличительным признаком изобретения является то, что антителопродуцирующую клетку клонируют с использованием активности вируса ЕВ. Метод, основанный на применении вируса ЕВ, обладает преимуществом при получении встречающегося в естественных условиях антитела в человеческом организме и при получении антитела, обладающего высокой аффинностью. Например, аффинность моноклонального антитела к hGM-CSF в 10-100 раз выше аффинности антитела, полученного с использованием искусственно иммунизированной мыши. Библиотека включает группу В-лимфоцитов, пролиферация которых стимулирована заражением вирусом ЕВ. Можно выделять специфический антителопродуцирующий клеточный клон из библиотеки и получать человеческое антитело.
Как отмечалось выше, описанные отличительные особенности можно заменять или преобразовывать согласно технологии, известной в данной области, без отклонения от сущности изобретения. Согласно изобретению нуклеиновая кислота, вектор и клетка-хозяин может экспрессировать рекомбинантное антитело или его антигенсвязывающий участок. Они также подпадают под объем настоящего изобретения.
Ниже в таблицах представлены варианты тяжелой цепи и варианты легкой цепи антитела EV1018 и варианты тяжелой цепи и варианты легкой цепи антитела EV1019. В таблицах представлены соответственно варианты тяжелой и легкой цепей EV1018 и варианты тяжелой и легкой цепей EV1019, и это позволяет идентифицировать все возможные комбинации тяжелой и легкой цепей и для EV1018, и для EV1019. Обычный специалист в данной области может получать все комбинации с помощью методов, известных в данной области, и информации, представленной в настоящем описании.
Следующим объектом изобретения является процесс (способ) получения моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента. Как правило, способ получения моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента заключается в том, что получают или продуцируют ДНК, которая состоит в основном из ДНК, кодирующей иммуноглобулин, который состоит из тяжелой цепи и легкой цепи, или Fab-фрагмент; встраивают полученную ДНК в реплицируемый экспрессионный вектор так, чтобы она была функционально связана с приемлемым промотором, получая вектор, который содержит ДНК, функционально связанную с приемлемым промотором; интродуцируют вектор в клетку-хозяина, получая клетку-хозяина, которая содержит вектор; культивируют клетку-хозяина в условиях, пригодных для экспрессии ДНК, и получают кодируемый(ые) пептид(ы) и моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент. Полученное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент можно выделять из клетки-хозяина или культуры клетки-хозяина методами, известными в данной области.
Более конкретно, способ заключается в том, что получают по меньшей мере VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 и VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3 в клетке-хозяине. Способ заключается в том, что интродуцируют в соответствующую клетку-хозяина ДНК, кодирующую VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, поддерживают образовавшуюся клетку-хозяина (клетку-хозяина, содержащую ДНК, которая кодирует VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3) в условиях, пригодных для экспрессии ДНК (производство кодируемых пептидов), и конструируют/осуществляют сборку моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента, получая тем самым моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент. В конкретных вариантах осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент включает (а) тяжелую цепь или в случае фрагмента антитела часть тяжелой цепи, которая содержит (I) консенсусную VH-CDR1-содержащую последовательность FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), в которой X1 обозначает Y или Н и Х2 обозначает G или А, (II) консенсусную VH-CDR2-содержащую последовательность X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 315), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х3 обозначает L или V, Х4 обозначает Т или I, X5 обозначает Y или W, Х6 обозначает R или K, Х7 обозначает F или Y и X8 обозначает R или K; и (III) консенсусную VH-CDR3-содержащую последовательность EXnX9GX10XnXnDXn (SEQ ID NO: 316), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х9 обозначает М или V и Х10 обозначает А или G; и (б) легкую цепь или в случае фрагмента антитела часть легкой цепи, которая содержит (I) консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность XnGNXnXnNIGSX11AVG (SEQ ID NO: 317), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х11 обозначает Н или Y; (II) консенсусную VL-CDR2-содержащую последовательность GX12SPX13SG (SEQ ID NO:318), в которой Х12 обозначает R или K и Х13 обозначает А или P; и (III) консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность STWDSX14LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), в которой X14 обозначает R или S и X15 обозначает V или L; и полученное моноклональное антитело к hGM-CSF или полученный его антигенсвязывающий фрагмент связывается с hGM-CSF. ДНК, кодирующая VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, может кодировать один или несколько компонентов (например, все компоненты VH/VL могут кодироваться одной ДНК, некоторые или все компоненты могут кодироваться различными ДНК).
Например, первая ДНК может кодировать полную тяжелую цепь, а вторая ДНК может кодировать полную легкую цепь. Полную тяжелую цепь можно выбирать из группы, включающей SEQ ID NO: 10-33, 38-80 и 160-183; 222-245, 320 и 322, а полную легкую цепь можно выбирать из группы, включающей SEQ ID NO: 34-37, 202-221, 321 и 323. В одном из вариантов осуществления изобретения полную тяжелую цепь выбирают из группы, включающей SEQ ID NO: 10-33, 38-80 и 160-183; 222-245, 320 и 322, полную легкую цепь выбирают из группы, включающей SEQ ID NO: 34-37, 202-221, 321 и 323.
Способ может дополнительно предусматривать выделение моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента.
Объектом изобретения является также вектор, содержащий ДНК, которая кодирует VH-CDR1 и/или VH-CDR2, и/или VH-CDR3. VH-CDR1 имеет последовательность SYGMH (SEQ ID NO: 4) или SHAMH (SEQ ID NO: 333), VH-CDR2 имеет последовательность LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) или VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334) и VH-CDR3 имеет последовательность ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) или EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335).
Объектом изобретения является также вектор, содержащий ДНК, которая кодирует VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где VL-CDR1 имеет последовательность IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) или SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330), VL-CDR2 имеет последовательность GRSPPS (SEQ ID NO:8) или GKSPAS (SEQ ID NO: 331) и VL-CDR3 имеет последовательность STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9) или STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332).
Например, в процессе созревания белка отщепляют лидерные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи. Отщепленные лидерные последовательности не оказывают влияния на конечные свойства антитела. Для восполнения удаленной в результате делеции последовательности клонированную кДНК интегрируют с синтетическим олигонуклеотидом с помощью метода лигирования или ПЦР-амплификации. Понятия «лидерная последовательность» и «сигнальная последовательность» в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо.
В альтернативном процессе синтезируют полную вариабельную область с парой коротких перекрывающихся олигонуклеотидов, а затем образовавшийся олигонуклеотид амплифицируют с помощью ПЦР-амплификации, в результате чего получают полный искусственный клон вариабельной области.
Другим объектом настоящего изобретения является выделенная дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), кодирующая моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, обладающее/обладающий способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, где выделенная ДНК содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9. Настоящее изобретение относится также к выделенной ДНК, в которой нуклеотидная последовательность кодирует аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 330-335.
Когда выделенная дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) кодирует моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, обладающее/обладающий способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, под объем настоящего изобретения подпадает также следующая нуклеиновая кислота, кодирующая моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент:
выделенная ДНК, обладающая способностью гибридизоваться с описанной выше ДНК в строгих условиях.
Под объем настоящего изобретения подпадают также указанные ниже вектор и клетка-хозяин:
1) вектор, включающий выделенную ДНК,
2) клетка-хозяин, в которую интегрирован рекомбинантный экспрессионный вектор.
Кроме того, можно также получать специфическое антитело путем экспрессии диверсифицированного scFv- (одноцепочечный фрагмент вариабельной области) антитела, полученного в виде слитого с фагом белка с помощью искусственной перестановки генов VH и VL, используя разработанный в последние годы метод фагового дисплея, в котором применяют метод генной инженерии для экспрессии рекомбинантного антитела на поверхности фага.
Фрагмент антитела, предлагаемого в изобретении, можно получать с помощью любого метода, известного специалисту в данной области, например, путем рекомбинатной экспрессии фрагментов, которые кодируются укороченными формами ДНК, кодирующей антитело, или путем протеолитического расщепления аминокислотных цепей антитела, при этом специалист в данной области для решения вопроса о том, какой из фрагментов сохраняет антигенсвязывающую функцию или нейтрализующую активность, может применять стандартные биологические анализы, например, представленные в настоящем описании.
Конкретные антитела, предлагаемые в изобретении
Изобретение относится к самому антителу EV1018 и многочисленным вариациям (например, вариантам) антитела EV1018, сведения о которых обобщены в таблице А. В некоторых вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь содержит одну или несколько аминокислотных замен относительно последовательности тяжелой цепи дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения легкая цепь содержит одну или несколько аминокислотных замен относительно последовательности легкой цепи дикого типа EV1018. В некоторых вариантах осуществления изобретения и тяжелая цепь, и легкая цепь содержит одну или несколько аминокислотных замен.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь исходного антитела (EV1018-wt-исходная) (SEQ ID NO: 34) и один из следующих вариантов тяжелой цепи: EV1018 (SEQ ID NO: 10), EV1018-wt-IgG1KO (SEQ ID NO: 11), EV1018-T97A-IgG1KO (SEQ ID NO: 12), EV1018-T97V-IgG1KO (SEQ ID NO: 13), EV1018-N95D-IgG1KO (SEQ ID NO: 14), EV1018-N95E IgG1KO (SEQ ID NO: 15), EV1018-N95K IgG1KO (SEQ ID NO: 16), EV1018-N95Q IgG1KO (SEQ ID NO: 17), EV1018-N93Q-N95T IgG1KO (SEQ ID NO: 18), EV1018-wt IgG1-BI (SEQ ID NO: 19), EV1018-T97A IgG1-BI (SEQ ID NO: 20), EV1018-T97V IgG1-BI (SEQ ID NO: 21), EV1018-N95D IgG1-BI (SEQ ID NO: 22), EV1018-N95E IgG1-BI (SEQ ID NO: 23), EV1018-N95K IgG1-BI (SEQ ID NO: 24), EV1018-N95Q IgG1-BI (SEQ ID NO: 25), EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI (SEQ ID NO: 26), EV1018-T97A IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 27), EV1018-T97V IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 28), EV1018-N95D IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 29), EV1018-N95E IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 30), EV1018-N95K IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 31), EV1018-N95Q IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 32), EV1018-N93Q-N95T IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 33), EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 38), EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 39), EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 40), EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 41), EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 42), EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 43), EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 44), EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 45), EV1018-wt IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 46), EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 47), EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 48), EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 49), EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 50), EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 51), EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 52), EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 53), EV1018-IgG2 (SEQ ID NO: 54), EV1018-wt-IgG2 (SEQ ID NO: 55), EV1018-T97A-IgG2 (SEQ ID NO: 56), EV1018-T97V-IgG2 (SEQ ID NO: 57), EV1018-N95D-IgG2 (SEQ ID NO: 58), EV1018-N95E-IgG2 (SEQ ID NO: 59), EV1018-N95K-IgG2 (SEQ ID NO: 60), EV1018-N95Q-IgG2 (SEQ ID NO: 61), EV1018-N93Q-N95T-IgG2 (SEQ ID NO: 62), EV1018-IgG4 (SEQ ID NO: 63), EV1018-wt-IgG4 (SEQ ID NO: 64), EV1018-T97A-IgG4 (SEQ ID NO: 65), EV1018-T97V-IgG4 (SEQ ID NO: 66), EV1018-N95D-IgG4 (SEQ ID NO: 67), EV1018-N95E-IgG4 (SEQ ID NO: 68), EV1018-N95K-IgG4 (SEQ ID NO: 69), EV1018-N95Q-IgG4 (SEQ ID NO: 70), EV1018-N93Q-N95T-IgG4 (SEQ ID NO: 71), EV1018-IgG4-SP (SEQ ID NO: 72), EV1018-wt-IgG4-SP (SEQ ID NO: 73), EV1018-T97A-IgG4-SP (SEQ ID NO: 74), EV1018-T97V-IgG4-SP (SEQ ID NO:75), EV1018-N95D-IgG4-SP (SEQ ID NO:76), EV1018-N95E-IgG4-SP (SEQ ID NO: 77), EV1018-N95K-IgG4-SP (SEQ ID NO: 78), EV1018-N95Q-IgG4-SP (SEQ ID NO: 79) и EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP (SEQ ID NO: 80).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь EV1018-wt-BI (SEQ ID NO: 35) и один из следующих вариантов тяжелой цепи: EV1018 (SEQ ID NO: 10), EV1018-wt-IgG1KO (SEQ ID NO: 11), EV1018-T97A-IgG1KO (SEQ ID NO: 12), EV1018-T97V-IgG1KO (SEQ ID NO: 13), EV1018-N95D-IgG1KO (SEQ ID NO: 14), EV1018-N95E IgG1KO (SEQ ID NO: 15), EV1018-N95K IgG1KO (SEQ ID NO: 16), EV1018-N95Q IgG1KO (SEQ ID NO: 17), EV1018-N93Q-N95T IgG1KO (SEQ ID NO: 18), EV1018-wt IgG1-BI (SEQ ID NO: 19), EV1018-T97A IgG1-BI (SEQ ID NO: 20), EV1018-T97V IgG1-BI (SEQ ID NO: 21), EV1018-N95D IgG1-BI (SEQ ID NO: 22), EV1018-N95E IgG1-BI (SEQ ID NO: 23), EV1018-N95K IgG1-BI (SEQ ID NO: 24), EV1018-N95Q IgG1-BI (SEQ ID NO: 25), EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI (SEQ ID NO: 26), EV1018-T97A IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 27), EV1018-T97V IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 28), EV1018-N95D IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 29), EV1018-N95E IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 30), EV1018-N95K IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 31), EV1018-N95Q IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 32), EV1018-N93Q-N95T IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 33), EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 38), EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 39), EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 40), EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 41), EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 42), EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 43), EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 44), EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 45), EV1018-wt IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 46), EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 47), EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 48), EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 49), EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 50), EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 51), EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 52), EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 53), EV1018-IgG2 (SEQ ID NO: 54), EV1018-wt-IgG2 (SEQ ID NO: 55), EV1018-T97A-IgG2 (SEQ ID NO: 56), EV1018-T97V-IgG2 (SEQ ID NO: 57), EV1018-N95D-IgG2 (SEQ ID NO: 58), EV1018-N95E-IgG2 (SEQ ID NO: 59), EV1018-N95K-IgG2 (SEQ ID NO: 60), EV1018-N95Q-IgG2 (SEQ ID NO: 61), EV1018-N93Q-N95T-IgG2 (SEQ ID NO: 62), EV1018-IgG4 (SEQ ID NO: 63), EV1018-wt-IgG4 (SEQ ID NO: 64), EV1018-T97A-IgG4 (SEQ ID NO: 65), EV1018-T97V-IgG4 (SEQ ID NO: 66), EV1018-N95D-IgG4 (SEQ ID NO: 67), EV1018-N95E-IgG4 (SEQ ID NO: 68), EV1018-N95K-IgG4 (SEQ ID NO: 69), EV1018-N95Q-IgG4 (SEQ ID NO: 70), EV1018-N93Q-N95T-IgG4 (SEQ ID NO: 71), EV1018-IgG4-SP (SEQ ID NO: 72), EV1018-wt-IgG4-SP (SEQ ID NO: 73), EV1018-T97A-IgG4-SP (SEQ ID NO: 74), EV1018-T97V-IgG4-SP (SEQ ID NO: 75), EV1018-N95D-IgG4-SP (SEQ ID NO: 76), EV1018-N95E-IgG4-SP (SEQ ID NO: 77), EV1018-N95K-IgG4-SP (SEQ ID NO: 78), EV1018-N95Q-IgG4-SP (SEQ ID NO: 79) и EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP (SEQ ID NO: 80).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь EV1018-wt-BI2 (SEQ ID NO: 36) и один из следующих вариантов тяжелой цепи: EV1018 (SEQ ID NO: 10), EV1018-wt-IgG1KO (SEQ ID NO: 11), EV1018-T97A-IgG1KO (SEQ ID NO: 12), EV1018-T97V-IgG1KO (SEQ ID NO: 13), EV1018-N95D-IgG1KO (SEQ ID NO: 14), EV1018-N95E IgG1KO (SEQ ID NO: 15), EV1018-N95K IgG1KO (SEQ ID NO: 16), EV1018-N95Q IgG1KO (SEQ ID NO: 17), EV1018-N93Q-N95T IgG1KO (SEQ ID NO: 18), EV1018-wt IgG1-BI (SEQ ID NO: 19), EV1018-T97A IgG1-BI (SEQ ID NO: 20), EV1018-T97V IgG1-BI (SEQ ID NO: 21), EV1018-N95D IgG1-BI (SEQ ID NO: 22), EV1018-N95E IgG1-BI (SEQ ID NO: 23), EV1018-N95K IgG1-BI (SEQ ID NO: 24), EV1018-N95Q IgG1-BI (SEQ ID NO: 25), EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI (SEQ ID NO: 26), EV1018-T97A IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 27), EV1018-T97V IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 28), EV1018-N95D IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 29), EV1018-N95E IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 30), EV1018-N95K IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 31), EV1018-N95Q IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 32), EV1018-N93Q-N95T IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 33), EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 38), EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 39), EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 40), EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 41), EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 42), EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 43), EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 44), EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 45), EV1018-wt IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 46), EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 47), EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 48), EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 49), EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 50), EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 51), EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 52), EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 53), EV1018-IgG2 (SEQ ID NO: 54), EV1018-wt-IgG2 (SEQ ID NO: 55), EV1018-T97A-IgG2 (SEQ ID NO: 56), EV1018-T97V-IgG2 (SEQ ID NO: 57), EV1018-N95D-IgG2 (SEQ ID NO: 58), EV1018-N95E-IgG2 (SEQ ID NO: 59), EV1018-N95K-IgG2 (SEQ ID NO: 60), EV1018-N95Q-IgG2 (SEQ ID NO: 61), EV1018-N93Q-N95T-IgG2 (SEQ ID NO: 62), EV1018-IgG4 (SEQ ID NO: 63), EV1018-wt-IgG4 (SEQ ID NO: 64), EV1018-T97A-IgG4 (SEQ ID NO: 65), EV1018-T97V-IgG4 (SEQ ID NO: 66), EV1018-N95D-IgG4 (SEQ ID NO: 67), EV1018-N95E-IgG4 (SEQ ID NO: 68), EV1018-N95K-IgG4 (SEQ ID NO: 69), EV1018-N95Q-IgG4 (SEQ ID NO: 70), EV1018-N93Q-N95T-IgG4 (SEQ ID NO: 71), EV1018-IgG4-SP (SEQ ID NO: 72), EV1018-wt-IgG4-SP (SEQ ID NO: 73), EV1018-T97A-IgG4-SP (SEQ ID NO: 74), EV1018-T97V-IgG4-SP (SEQ ID NO: 75), EV1018-N95D-IgG4-SP (SEQ ID NO: 76), EV1018-N95E-IgG4-SP (SEQ ID NO: 77), EV1018-N95K-IgG4-SP (SEQ ID NO: 78), EV1018-N95Q-IgG4-SP (SEQ ID NO: 79) и EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP (SEQ ID NO: 80).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь EV1018-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 37) и один из следующих вариантов тяжелой цепи: EV1018 (SEQ ID NO: 10), EV1018-wt-IgG1KO (SEQ ID NO: 11), EV1018-T97A-IgG1KO (SEQ ID NO: 12), EV1018-T97V-IgG1KO (SEQ ID NO: 13), EV1018-N95D-IgG1KO (SEQ ID NO: 14), EV1018-N95E IgG1KO (SEQ ID NO: 15), EV1018-N95K IgG1KO (SEQ ID NO: 16), EV1018-N95Q IgG1KO (SEQ ID NO: 17), EV1018-N93Q-N95T IgG1KO (SEQ ID NO: 18), EV1018-wt IgG1-BI (SEQ ID NO: 19), EV1018-T97A IgG1-BI (SEQ ID NO: 20), EV1018-T97V IgG1-BI (SEQ ID NO: 21), EV1018-N95D IgG1-BI (SEQ ID NO: 22), EV1018-N95E IgG1-BI (SEQ ID NO: 23), EV1018-N95K IgG1-BI (SEQ ID NO: 24), EV1018-N95Q IgG1-BI (SEQ ID NO: 25), EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI (SEQ ID NO: 26), EV1018-T97A IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 27), EV1018-T97V IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 28), EV1018-N95D IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 29), EV1018-N95E IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 30), EV1018-N95K IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 31), EV1018-N95Q IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 32), EV1018-N93Q-N95T IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 33), EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 38), EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 39), EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 40), EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 41), EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 42), EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 43), EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 44), EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 45), EV1018-wt IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 46), EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 47), EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 48), EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 49), EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 50), EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 51), EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 52), EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 53), EV1018-IgG2 (SEQ ID NO: 54), EV1018-wt-IgG2 (SEQ ID NO: 55), EV1018-T97A-IgG2 (SEQ ID NO: 56), EV1018-T97V-IgG2 (SEQ ID NO: 57), EV1018-N95D-IgG2 (SEQ ID NO: 58), EV1018-N95E-IgG2 (SEQ ID NO: 59), EV1018-N95K-IgG2 (SEQ ID NO: 60), EV1018-N95Q-IgG2 (SEQ ID NO: 61), EV1018-N93Q-N95T-IgG2 (SEQ ID NO: 62), EV1018-IgG4 (SEQ ID NO: 63), EV1018-wt-IgG4 (SEQ ID NO: 64), EV1018-T97A-IgG4 (SEQ ID NO: 65), EV1018-T97V-IgG4 (SEQ ID NO: 66), EV1018-N95D-IgG4 (SEQ ID NO: 67), EV1018-N95E-IgG4 (SEQ ID NO: 68), EV1018-N95K-IgG4 (SEQ ID NO: 69), EV1018-N95Q-IgG4 (SEQ ID NO: 70), EV1018-N93Q-N95T-IgG4 (SEQ ID NO: 71), EV1018-IgG4-SP (SEQ ID NO: 72), EV1018-wt-IgG4-SP (SEQ ID NO: 73), EV1018-T97A-IgG4-SP (SEQ ID NO: 74), EV1018-T97V-IgG4-SP (SEQ ID NO: 75), EV1018-N95D-IgG4-SP (SEQ ID NO: 76), EV1018-N95E-IgG4-SP (SEQ ID NO: 77), EV1018-N95K-IgG4-SP (SEQ ID NO: 78), EV1018-N95Q-IgG4-SP (SEQ ID NO: 79) и EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP (SEQ ID NO: 80).
Изобретение относится к самому антителу EV1019 и многочисленным вариациям антитела EV1018, сведения о которых обобщены в таблице Б. В некоторых вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь содержит одну или несколько аминокислотных замен относительно последовательности тяжелой цепи дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения легкая цепь содержит одну или несколько аминокислотных замен относительно последовательности легкой цепи дикого типа EV1019. В некоторых вариантах осуществления изобретения и тяжелая цепь, и легкая цепь содержит одну или несколько аминокислотных замен.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019 (SEQ ID NO: 160) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-wt-IgG1-BI (SEQ ID NO: 161) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-wt-IgG1KO (SEQ ID NO: 162) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105G (SEQ ID NO: 163) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105G-IgG1-BI (SEQ ID NO: 164) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO:212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105G-IgG1KO (SEQ ID NO: 165) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105S (SEQ ID NO: 166) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105S-IgG1-BI (SEQ ID NO: 167) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105S-IgG1KO (SEQ ID NO: 168) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105A (SEQ ID NO: 169) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105A-IgG1-BI (SEQ ID NO: 170) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105A-IgG1KO (SEQ ID NO: 171) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105Q (SEQ ID NO: 172) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105Q-IgG1-BI (SEQ ID NO: 173) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105Q-IgG1KO (SEQ ID NO: 174) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105T (SEQ ID NO: 175) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210),EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105T-IgG1-BI (SEQ ID NO: 176) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105T-IgG1KO (SEQ ID NO: 177) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105M (SEQ ID NO: 178) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105M-IgG1-BI (SEQ ID NO: 179) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205). EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105M-IgG1KO (SEQ ID NO: 180) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105L (SEQ ID NO: 181) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO:221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105L-IgG1-BI (SEQ ID NO: 182) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105L-IgG1KO (SEQ ID NO: 183) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-IgG2 (SEQ ID NO: 222) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-wt-IgG4 (SEQ ID NO: 223) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211). EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-wt-IgG4SP (SEQ ID NO: 224) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105G-IgG2 (SEQ ID NO: 225) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105G-IgG4 (SEQ ID NO: 226) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218). EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105G-IgG4SP (SEQ ID NO: 227) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105S-IgG2 (SEQ ID NO: 228) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105S-IgG4 (SEQ ID NO: 229) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105S-IgG4SP (SEQ ID NO: 230) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105A-IgG2 (SEQ ID NO: 231) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105A-IgG4 (SEQ ID NO: 232) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218). EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105A-IgG4SP (SEQ ID NO: 233) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105Q-IgG2 (SEQ ID NO: 234) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105Q-IgG4 (SEQ ID NO: 235) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105Q-IgG4SP (SEQ ID NO: 236) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105T-IgG2 (SEQ ID NO: 237) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105T-IgG4 (SEQ ID NO: 238) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105T-IgG4SP (SEQ ID NO: 239) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105M-IgG2 (SEQ ID NO: 240) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105M-IgG4 (SEQ ID NO: 241) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105M-IgG4SP (SEQ ID NO: 242) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105L-IgG2 (SEQ ID NO: 243) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105L-IgG4 (SEQ ID NO: 244) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105L-IgG4SP (SEQ ID NO: 245) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).
Кроме того, вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи можно объединять с получением Fab-фрагмента, который связывается с антигеном. Указанную комбинацию, которая сохраняет такую же или эквивалентную аффинность к связыванию антигена, можно применять для получения различных версий антигенсвязывающего фрагмента, такого как одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). scFv представляет собой слияние вариабельных областей тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, которые сцеплены друг с другом с помощью короткого (как правило, серинового, глицинового) линкера, и хорошо известны в данной области.
Таким образом, вариабельную область тяжелой цепи EV1018 можно объединять с вариабельной областью легкой цепи EV1018. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельная область тяжелой цепи и/или легкой цепи может представлять собой вариант, который содержит одно или несколько изменений аминокислот по сравнению с последовательностью цепи дикого типа. Аналогично этому, вариабельную область тяжелой цепи EV1019 можно объединять с вариабельной областью легкой цепи EV1019. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельная область тяжелой цепи и/или легкой цепи может представлять собой вариант, который содержит одно или несколько изменений аминокислот по сравнению с последовательностью цепи дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения любую из 1018 вариабельных областей тяжелой цепи (например, дикого типа и ее варианты) можно объединять с вариабельной областью легкой цепи EV1018-VL-wt-исходная (SEQ ID NO: 364) с получением антигенсвязывающего фрагмента которые связывается с hGM-CSF: EV1018-VH (SEQ ID NO: 348), EV1018-VH-wt (SEQ ID NO: 349), EV1018-VH-T97A (SEQ ID NO: 350), EV1018-VH-T97V (SEQ ID NO: 351), EV1018-VH-N95D (SEQ ID NO: 352), EV1018-VH-N95E (SEQ ID NO: 353), EV1018-VH-N95K (SEQ ID NO: 354), EV1018-VH-N95Q (SEQ ID NO: 355), EV1018-VH-N93Q-N95T (SEQ ID NO: 356), EV1018-VH-T97A IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 357), EV1018-VH-T97V IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 358), EV1018-VH-N95D IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 359), EV1018-VH-N95E IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 360), EV1018-VH-N95K IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 361), EV1018-VH-N95Q IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 362) и EV1018-VH-N93Q-N95T IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 363).
В некоторых вариантах осуществления изобретения любую из 1018 вариабельных областей тяжелой цепи (например, дикого типа и ее варианты) можно объединять с вариабельной областью легкой цепи EV1018-VL-wt-BI (SEQ ID NO: 365) с получением антигенсвязывающего фрагмента которые связывается с hGM-CSF: EV1018-VH (SEQ ID NO: 348), EV1018-VH-wt (SEQ ID NO: 349), EV1018-VH-T97A (SEQ ID NO: 350), EV1018-VH-T97V (SEQ ID NO: 351), EV1018-VH-N95D (SEQ ID NO: 352), EV1018-VH-N95E (SEQ ID NO: 353), EV1018-VH-N95K (SEQ ID NO: 354), EV1018-VH-N95Q (SEQ ID NO: 355), EV1018-VH-N93Q-N95T (SEQ ID NO: 356), EV1018-VH-T97A IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 357), EV1018-VH-T97V IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 358), EV1018-VH-N95D IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 359), EV1018-VH-N95E IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 360), EV1018-VH-N95K IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 361), EV1018-VH-N95Q IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 362) и EV1018-VH-N93Q-N95T IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 363).
Аналогично этому, согласно некоторым вариантам осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент EV1019 содержит вариабельную область тяжелой цепи EV1019-VH-wt (SEQ ID NO: 152) и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, включающей: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N (SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент EV1019 содержит вариабельную область тяжелой цепи EV1019-VH-C105G (SEQ ID NO: 153) и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, включающей: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N (SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент EV1019 содержит вариабельную область тяжелой цепи EV1019-VH-C105S (SEQ ID NO: 154) и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, включающей: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N (SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент EV1019 содержит вариабельную область тяжелой цепи EV1019-VH-С105А (SEQ ID NO: 155) и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, включающей: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N (SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент EV1019 содержит вариабельную область тяжелой цепи EV1019-VH-С105Т (SEQ ID NO: 156) и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, включающей: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N (SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент EV1019 содержит вариабельную область тяжелой цепи EV1019-VH-С105М (SEQ ID NO: 157) и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, включающей: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N (SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент EV1019 содержит вариабельную область тяжелой цепи EV1019-VH-C105Q (SEQ ID NO: 158) и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, включающей: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N (SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент EV1019 содержит вариабельную область тяжелой цепи EV1019-VH-C105L (SEQ ID NO: 159) и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, включающей: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N (SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201).
Вариации, предлагаемые в изобретении
Настоящее изобретение относится к полноразмерным антителам к hGM-CSF и их антигенсвязывающим участкам или участкам антител к hGM-CSF, когда два или несколько их видов вводят одновременно. Таким образом, под объем изобретения подпадает также биспецифическое антитело и мультиспецифическое антитело, которое распознает hGM-CSF.
Вариации моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего участка представлены выше в настоящем описании, но описанные отличительные особенности можно заменять или преобразовывать согласно технологии, известной в данной области, без отклонения от сущности изобретения.
Так, под объем настоящего изобретения подпадают следующие антитела или их антигенсвязывающие участки:
(I) полноразмерное антитело и его антигенсвязывающий участок,
(II) участок антитела и
(III) рекомбинантное человеческое моноклональное антитело, моноклональное антитело (включая химерное антитело и гуманизированное антитело) или его антигенсвязывающий участок, обладающее/обладающий способностью специфически связываться с hGM-CSF и нейтрализовать его биологическую активность, где рекомбинантное человеческое моноклональное антитело получают любым хорошо известным методом на основе аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4-9 и 330-335, SEQ ID NO: 364 и 365, и SEQ ID NO: 348-363, SEQ ID NO: 184-201 и SEQ ID NO: 152-159, которые представляют собой последовательности вариабельной области и CDR.
Когда применяют конкретное антитело или его антигенсвязывающий участок, полученное/полученный с помощью описанного выше способа, основой которого является по меньшей мере одна аминокислотная последовательность, выбранная из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9 или 330-335, которые представлены в настоящем описании, то такое антитело или его антигенсвязывающий участок также подпадает под объем настоящего изобретения.
Перечень вариантов антител
Ниже в таблицах представлены перечни пригодных цепей и фрагментов антител EV1018 и EV1019 соответственно.
Таблица А: | |||
Перечень вариантов тяжелой цепи и легкой цепи и вариабельных областей антитела EV1018 | |||
Варианты тяжелой цепи EV1018 | Варианты легкой цепи EV1018 | ||
EV1018 | SEQ ID NO: 10 | EV1018-wt-исходная | SEQ ID NO: 34 |
EV1018-wt-IgG1KO | SEQ ID NO: 11 | EV1018-wt-BI | SEQ ID NO: 35 |
Варианты тяжелой цепи EV1018 | Варианты легкой цепи EV1018 | ||
EV1018-T97A-IgG1KO | SEQ ID NO: 12 | EV1018-wt-BI2 (G1) | SEQ ID NO: 36 |
EV1018-T97V-IgG1KO | SEQ ID NO: 13 | EV1018-wt-исходная-константная | SEQ ID NO: 37 |
EV1018-N95D-IgG1KO | SEQ ID NO: 14 | EV1018-VL-wt-исходная | SEQ ID NO: 364 |
EV1018-N95E IgG1KO | SEQ ID NO: 15 | EV1018-VL-wt-BI | SEQ ID NO: 365 |
EV1018-N95K IgG1KO | SEQ ID NO: 16 | ||
EV1018-N95Q IgG1KO | SEQ ID NO: 17 | ||
EV1018-N93Q-N95T IgG1KO | SEQ ID NO: 18 | ||
EV1018-wt IgG1-BI | SEQ ID NO: 19 | ||
EV1018-T97A IgG1-BI | SEQ ID NO: 20 | ||
EV1018-T97V IgG1-BI | SEQ ID NO: 21 | ||
EV1018-N95D IgG1-BI | SEQ ID NO: 22 | ||
EV1018-N95E IgG1-BI | SEQ ID NO: 23 | ||
EV1018-N95K IgG1-BI | SEQ ID NO: 24 | ||
EV1018-N95Q IgG1-BI | SEQ ID NO: 25 | ||
EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI | SEQ ID NO: 26 | ||
EV1018-T97A IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 27 | ||
EV1018-T97V IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 28 | ||
EV1018-N95D IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 29 | ||
EV1018-N95E IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 30 | ||
EV1018-N95K IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 31 | ||
EV1018-N95Q IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO:32 | ||
EV1018-N93Q-N95T IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO:33 | ||
EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL | SEQ ID NO: 38 | ||
EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL | SEQ ID NO: 39 | ||
EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL | SEQ ID NO: 40 | ||
EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL | SEQ ID NO: 41 | ||
EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL | SEQ ID NO: 42 | ||
EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL | SEQ ID NO: 43 |
Варианты тяжелой цепи EV1018 | Варианты легкой цепи EV1018 | ||
EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL | SEQ ID NO: 44 | ||
EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL | SEQ ID NO: 45 | ||
EV1018-wt IgG1-QVQL-BI | SEQ ID NO: 46 | ||
EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI | SEQ ID NO: 47 | ||
EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI | SEQ ID NO: 48 | ||
EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI | SEQ ID NO: 49 | ||
EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI | SEQ ID NO: 50 | ||
EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI | SEQ ID NO: 51 | ||
EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI | SEQ ID NO: 52 | ||
EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI | SEQ ID NO: 53 | ||
EV1018-IgG2 | SEQ ID NO: 54 | ||
EV1018-wt-IgG2 | SEQ ID NO: 55 | ||
EV1018-T97A-IgG2 | SEQ ID NO: 56 | ||
EV1018-T97V-IgG2 | SEQ ID NO: 57 | ||
EV1018-N95D-IgG2 | SEQ ID NO: 58 | ||
EV1018-N95E-IgG2 | SEQ ID NO: 59 | ||
EV1018-N95K-IgG2 | SEQ ID NO: 60 | ||
EV1018-N95Q-IgG2 | SEQ ID NO: 61 | ||
EV1018-N93Q-N95T-IgG2 | SEQ ID NO: 62 | ||
EV1018-IgG4 | SEQ ID NO: 63 | ||
EV1018-wt-IgG4 | SEQ ID NO: 64 | ||
EV1018-T97A-IgG4 | SEQ ID NO: 65 | ||
EV1018-T97V-IgG4 | SEQ ID NO:66 | ||
EV1018-N95D-IgG4 | SEQ ID NO: 67 | ||
EV1018-N95E-IgG4 | SEQ ID NO: 68 | ||
EV1018-N95K-IgG4 | SEQ ID NO: 69 | ||
EV1018-N95Q-IgG4 | SEQ ID NO: 70 | ||
EV1018-N93Q-N95T-IgG4 | SEQ ID NO: 71 |
Варианты тяжелой цепи EV 1018 | Варианты легкой цепи EV1018 | ||
EV1018-IgG4-SP | SEQ ID NO: 72 | ||
EV1018-wt-IgG4-SP | SEQ ID NO: 73 | ||
EV1018-T97A-IgG4-SP | SEQ ID NO: 74 | ||
EV1018-T97V-IgG4-SP | SEQ ID NO: 75 | ||
EV1018-N95D-IgG4-SP | SEQ ID NO: 76 | ||
EV1018-N95E-IgG4-SP | SEQ ID NO: 77 | ||
EV1018-N95K-IgG4-SP | SEQ ID NO: 78 | ||
EV1018-N95Q-IgG4-SP | SEQ ID NO: 79 | ||
EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP | SEQ ID NO: 80 | ||
EV1018 | SEQ ID NO: 81 | ||
EV1018-wt-IgG1KO | SEQ ID NO: 82 | ||
EV1018-T97A-IgG1KO | SEQ ID NO: 83 | ||
EV1018-T97V-IgG1KO | SEQ ID NO: 84 | ||
EV1018-N95D-IgG1KO | SEQ ID NO: 85 | ||
EV1018-N95E IgG1KO | SEQ ID NO: 86 | ||
EV1018-N95K IgG1KO | SEQ ID NO: 87 | ||
EV1018-N95Q IgG1KO | SEQ ID NO: 88 | ||
EV1018-N93Q-N95T IgG1KO | SEQ ID NO: 89 | ||
EV1018-wt IgG1-BI | SEQ ID NO:90 | ||
EV1018-T97A IgG1-BI | SEQ ID NO: 91 | ||
EV1018-T97V IgG1-BI | SEQ ID NO: 92 | ||
EV1018-N95D IgG1-BI | SEQ ID NO: 93 | ||
EV1018-N95E IgG1-BI | SEQ ID NO:94 | ||
EV1018-N95K IgG1-BI | SEQ ID NO: 95 | ||
EV1018-N95Q IgG1-BI | SEQ ID NO: 96 | ||
EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI | SEQ ID NO: 97 | ||
EV1018-T97A IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 98 | ||
EV1018-T97V IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 99 |
Варианты тяжелой цепи EV1018 | Варианты легкой цепи EV1018 | ||
EV1018-N95D IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 100 | ||
EV1018-N95E IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 101 | ||
EV1018-N95K IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 102 | ||
EV1018-N95Q IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 103 | ||
EV1018-N93Q-N95T IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 104 | ||
EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL | SEQ ID NO: 109 | ||
EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL | SEQ ID NO: 110 | ||
EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL | SEQ ID NO: 111 | ||
EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL | SEQ ID NO: 112 | ||
EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL | SEQ ID NO: 113 | ||
EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL | SEQ ID NO: 114 | ||
EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL | SEQ ID NO: 115 | ||
EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL | SEQ ID NO: 116 | ||
EV1018-wt IgG1-QVQL-BI | SEQ ID NO: 117 | ||
EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI | SEQ ID NO: 118 | ||
EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI | SEQ ID NO: 119 | ||
EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI | SEQ ID NO: 120 | ||
EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI | SEQ ID NO: 121 | ||
EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI | SEQ ID NO: 122 | ||
EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI | SEQ ID NO: 123 | ||
EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI | SEQ ID NO: 124 | ||
EV1018-IgG2 | SEQ ID NO: 125 | ||
EV1018-wt-IgG2 | SEQ ID NO: 126 | ||
EV1018-T97A-IgG2 | SEQ ID NO: 127 | ||
EV1018-T97V-IgG2 | SEQ ID NO: 128 | ||
EV1018-N95D-IgG2 | SEQ ID NO: 129 | ||
EV1018-N95E-IgG2 | SEQ ID NO: 130 | ||
EV1018-N95K-IgG2 | SEQ ID NO: 131 |
Варианты тяжелой цепи EV1018 | Варианты легкой цепи EV1018 | ||
EV1018-N95Q-IgG2 | SEQ ID NO: 132 | ||
EV1018-N93Q-N95T-IgG2 | SEQ ID NO: 133 | ||
EV1018-IgG4 | SEQ ID NO: 134 | ||
EV1018-wt-IgG4 | SEQ ID NO: 135 | ||
EV1018-T97A-IgG4 | SEQ ID NO: 136 | ||
EV1018-T97V-IgG4 | SEQ ID NO: 137 | ||
EV1018-N95D-IgG4 | SEQ ID NO: 138 | ||
EV1018-N95E-IgG4 | SEQ ID NO: 139 | ||
EV1018-N95K-IgG4 | SEQ ID NO: 140 | ||
EV1018-N95Q-IgG4 | SEQ ID NO: 141 | ||
EV1018-N93Q-N95T-IgG4 | SEQ ID NO: 142 | ||
EV1018-IgG4-SP | SEQ ID NO: 143 | ||
EV1018-wt-IgG4-SP | SEQ ID NO: 144 | ||
EV1018-T97A-IgG4-SP | SEQ ID NO: 145 | ||
EV1018-T97V-IgG4-SP | SEQ ID NO: 146 | ||
EV1018-N95D-IgG4-SP | SEQ ID NO: 147 | ||
EV1018-N95E-IgG4-SP | SEQ ID NO: 148 | ||
EV1018-N95K-IgG4-SP | SEQ ID NO: 149 | ||
EV1018-N95Q-IgG4-SP | SEQ ID NO: 150 | ||
EV1018-N93Q-N95T-IgG4-S | SEQ ID NO: 151 | ||
EV1018-VH | SEQ ID NO: 348 | ||
EV1018-VH-wt | SEQ ID NO: 349 | ||
EV1018-VH-T97A | SEQ ID NO: 350 | ||
EV1018-VH-T97V | SEQ ID NO: 351 | ||
EV1018-VH-N95D | SEQ ID NO: 352 | ||
EV1018-VH-N95E | SEQ ID NO: 353 | ||
EV1018-VH-N95K | SEQ ID NO: 354 | ||
EV1018-VH-N95Q | SEQ ID NO: 355 |
Варианты тяжелой цепи EV1018 | Варианты легкой цепи EV1018 | ||||
EV1018-VH-N93Q-N95T | SEQ ID NO: 356 | ||||
EV1018-VH-T97A IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 357 | ||||
EV1018-VH-T97V IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 358 | ||||
EV1018-VH-N95D IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 359 | ||||
EV1018-VH-N95E IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 360 | ||||
EV1018-VH-N95K IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 361 | ||||
EV1018-VH-N95Q IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 362 | ||||
EV1018-VH-N93Q-N95T IgG1-исходная-константная | SEQ ID NO: 363 | ||||
Таблица Б: | |||||
Перечень вариантов тяжелой цепи и легкой цепи и вариабельных областей антитела EV1019 | |||||
Варианты тяжелой цепи EV1019 | Варианты легкой цепи EV1019 | ||||
EV1019-VH-wt | SEQ ID NO: 152 | EV1019-VL-wt | SEQ ID NO: 184 | ||
EV1019-VH-C105G | SEQ ID NO: 153 | EV1019-VL-BI | SEQ ID NO: 185 | ||
EV1019-VH-C105S | SEQ ID NO: 154 | EV1019-VL-N25S | SEQ ID NO: 186 | ||
EV1019-VH-C105A | SEQ ID NO: 155 | EV1019-VL-BI-N25S | SEQ ID NO: 187 | ||
EV1019-VH-C105T | SEQ ID NO: 156 | EV1019-VL-N25G | SEQ ID NO: 188 | ||
EV1019-VH-C105M | SEQ ID NO: 157 | EV1019-VL-BI-N25G | SEQ ID NO: 189 | ||
EV1019-VH-C105Q | SEQ ID NO: 158 | EV1019-VL-N25T | SEQ ID NO: 190 | ||
EV1019-VH-C105L | SEQ ID NO: 159 | EV1019-VL-BI-N25T | SEQ ID NO: 191 | ||
EV1019 | SEQ ID NO: 160 | EV1019-VL-N25R | SEQ ID NO: 192 | ||
EV1019-wt-IgG1-BI | SEQ ID NO: 161 | EV1019-VL-BI-N25R | SEQ ID NO: 193 | ||
EV1019-wt-IgG1KO | SEQ ID NO: 162 | EV1019-VL-N25Q | SEQ ID NO: 194 | ||
EV1019-C105G | SEQ ID NO: 163 | EV1019-VL-BI-N25Q | SEQ ID NO: 195 | ||
EV1019-C105G-IgG1-BI | SEQ ID NO: 164 | EV1019-VL-S27N | SEQ ID NO: 196 | ||
EV1019-C105G-IgG1KO | SEQ ID NO: 165 | EV1019-VL-BI-S27N | SEQ ID NO: 197 | ||
EV1019-C105S | SEQ ID NO: 166 | EV1019-VL-S27G | SEQ ID NO: 198 | ||
EV1019-C105S-IgG1-BI | SEQ ID NO: 167 | EV1019-VL-BI-S27G | SEQ ID NO: 199 | ||
EV1019-C105S-IgG1KO | SEQ ID NO: 168 | EV1019-VL-S27A | SEQ ID NO: 200 |
Варианты тяжелой цепи EV1019 | Варианты легкой цепи EV1019 | ||
EV1019-C105A | SEQ ID NO: 169 | EV1019-VL-BI-S27A | SEQ ID NO: 201 |
EV1019-C105A-IgG1-BI | SEQ ID NO: 170 | EV1019-wt-исходная | SEQ ID NO: 202 |
EV1019-C105A-IgG1KO | SEQ ID NO: 171 | EV1019-wt-BI | SEQ ID NO: 203 |
EV1019-C105Q | SEQ ID NO: 172 | EV1019-wt-BI2 | SEQ ID NO: 204 |
EV1019-C105Q-IgG1-BI | SEQ ID NO: 173 | EV1019-wt-исходная-константная | SEQ ID NO: 205 |
EV1019-C105Q-IgG1KO | SEQ ID NO: 174 | EV1019-N25S | SEQ ID NO: 206 |
EV1019-C105T | SEQ ID NO: 175 | EV1019-N25S-BI2 | SEQ ID NO: 207 |
EV1019-C105T-IgG1-BI | SEQ ID NO: 176 | EV1019-N25G | SEQ ID NO: 208 |
EV1019-C105T-IgG1KO | SEQ ID NO: 177 | EV1019-N25G-BI2 | SEQ ID NO: 209 |
EV1019-C105M | SEQ ID NO: 178 | EV1019-N25T | SEQ ID NO: 210 |
EV1019-C105M-IgG1-BI | SEQ ID NO: 179 | EV1019-N25T-BI2 | SEQ ID NO: 211 |
EV1019-C105M-IgG1KO | SEQ ID NO: 180 | EV1019-N25R | SEQ ID NO: 212 |
EV1019-C105L | SEQ ID NO: 181 | EV1019-N25R-BI2 | SEQ ID NO: 213 |
EV1019-C105L-IgG1-BI | SEQ ID NO: 182 | EV1019-N25Q | SEQ ID NO: 214 |
EV1019-C105L-IgG1KO | SEQ ID NO: 183 | EV1019-N25Q-BI2 | SEQ ID NO: 215 |
EV1019-IgG2 | SEQ ID NO: 222 | EV1019-S27N | SEQ ID NO: 216 |
EV1019-wt-IgG4 | SEQ ID NO: 223 | EV1019-S27N-BI2 | SEQ ID NO: 217 |
EV1019-wt-IgG4SP | SEQ ID NO: 224 | EV1019-S27G | SEQ ID NO: 218 |
EV1019-C105G-IgG2 | SEQ ID NO: 225 | EV1019-S27G-BI2 | SEQ ID NO: 219 |
EV1019-C105G-IgG4 | SEQ ID NO: 226 | EV1019-S27A | SEQ ID NO: 220 |
EV1019-C105G-IgG4SP | SEQ ID NO: 227 | EV1019-S27A-BI2 | SEQ ID NO: 221 |
EV1019-C105S-IgG2 | SEQ ID NO: 228 | EV1019-wt-исходная | SEQ ID NO: 270 |
EV1019-C105S-IgG4 | SEQ ID NO: 229 | EV1019-wt-BI | SEQ ID NO: 271 |
EV1019-C105S-IgG4SP | SEQ ID NO: 230 | EV1019-wt-BI2 | SEQ ID NO: 272 |
EV1019-C105A-IgG2 | SEQ ID NO: 231 | EV1019-wt-исходная-константная | SEQ ID NO: 273 |
EV1019-C105A-IgG4 | SEQ ID NO: 232 | EV1019-N25S | SEQ ID NO: 274 |
EV1019-C105A-IgG4SP | SEQ ID NO: 233 | EV1019-N25S-BI2 | SEQ ID NO: 275 |
EV1019-C105Q-IgG2 | SEQ ID NO: 234 | EV1019-N25G | SEQ ID NO: 276 |
Варианты тяжелой цепи EV1019 | Варианты легкой цепи EV1019 | ||
EV1019-C105Q-IgG4 | SEQ ID NO: 235 | EV1019-N25G-BI2 | SEQ ID NO: 277 |
EV1019-C105Q-IgG4SP | SEQ ID NO: 236 | EV1019-N25T | SEQ ID NO: 278 |
EV1019-C105T-IgG2 | SEQ ID NO: 237 | EV1019-N25T-BI2 | SEQ ID NO: 279 |
EV1019-C105T-IgG4 | SEQ ID NO: 238 | EV1019-N25R | SEQ ID NO: 280 |
EV1019-C105T-IgG4SP | SEQ ID NO: 239 | EV1019-N25R-BI2 | SEQ ID NO: 281 |
EV1019-C105M-IgG2 | SEQ ID NO: 240 | EV1019-N25Q | SEQ ID NO: 282 |
EV1019-C105M-IgG4 | SEQ ID NO: 241 | EV1019-N25Q-BI2 | SEQ ID NO: 283 |
EV1019-C105M-IgG4SP | SEQ ID NO: 242 | EV1019-S27N | SEQ ID NO: 284 |
EV1019-C105L-IgG2 | SEQ ID NO: 243 | EV1019-S27N-BI2 | SEQ ID NO: 285 |
EV1019-C105L-IgG4 | SEQ ID NO: 244 | EV1019-S27G | SEQ ID NO: 286 |
EV1019-C105L-IgG4SP | SEQ ID NO: 245 | EV1019-S27G-BI2 | SEQ ID NO: 287 |
EV1019 | SEQ ID NO: 246 | EV1019-S27A | SEQ ID NO: 288 |
EV1019-wt-IgG1-BI | SEQ ID NO: 247 | EV1019-S27A-BI2 | SEQ ID NO: 289 |
EV1019-wt-IgG1KO | SEQ ID NO: 248 | ||
EV1019-C105G | SEQ ID NO: 249 | ||
EV1019-C105G-IgG1-BI | SEQ ID NO: 250 | ||
EV1019-C105G-IgG1KO | SEQ ID NO: 251 | ||
EV1019-C105S | SEQ ID NO: 252 | ||
EV1019-C105S-IgG1-BI | SEQ ID NO: 253 | ||
EV1019-C105S-IgG1KO | SEQ ID NO: 254 | ||
EV1019-C105A | SEQ ID NO: 255 | ||
EV1019-C105A-IgG1-BI | SEQ ID NO: 256 | ||
EV1019-C105A-IgG1KO | SEQ ID NO: 257 | ||
EV1019-C105Q | SEQ ID NO: 258 | ||
EV1019-C105Q-IgG1-BI | SEQ ID NO: 259 | ||
EV1019-C105Q-IgG1KO | SEQ ID NO: 260 | ||
EV1019-C105T | SEQ ID NO: 261 | ||
EV1019-C105T-IgG1-BI | SEQ ID NO: 262 |
Варианты тяжелой цепи EV1019 | Варианты легкой цепи EV1019 | ||
EV1019-C105T-IgG1KO | SEQ ID NO: 263 | ||
EV1019-C105M | SEQ ID NO: 264 | ||
EV1019-C105M-IgG1-BI | SEQ ID NO: 265 | ||
EV1019-C105M-IgG1KO | SEQ ID NO: 266 | ||
EV1019-C105L | SEQ ID NO: 267 | ||
EV1019-C105L-IgG1-BI | SEQ ID NO: 278 | ||
EV1019-C105L-IgG1KO | SEQ ID NO: 269 | ||
EV1019-IgG2 | SEQ ID NO: 290 | ||
EV1019-wt-IgG4 | SEQ ID NO: 291 | ||
EV1019-wt-IgG4SP | SEQ ID NO: 292 | ||
EV1019-C105G-IgG2 | SEQ ID NO: 293 | ||
EV1019-C105G-IgG4 | SEQ ID NO: 294 | ||
EV1019-C105G-IgG4SP | SEQ ID NO: 295 | ||
EV1019-C105S-IgG2 | SEQ ID NO: 296 | ||
EV1019-C105S-IgG4 | SEQ ID NO: 297 | ||
EV1019-C105S-IgG4SP | SEQ ID NO: 298 | ||
EV1019-C105A-IgG2 | SEQ ID NO: 299 | ||
EV1019-C105A-IgG4 | SEQ ID NO: 300 | ||
EV1019-C105A-IgG4SP | SEQ ID NO: 301 | ||
EV1019-C105Q-IgG2 | SEQ ID NO: 302 | ||
EV1019-C105Q-IgG4 | SEQ ID NO: 303 | ||
EV1019-C105Q-IgG4SP | SEQ ID NO: 304 | ||
EV1019-C105T-IgG2 | SEQ ID NO: 305 | ||
EV1019-C105T-IgG4 | SEQ ID NO: 306 | ||
EV1019-C105T-IgG4SP | SEQ ID NO: 307 | ||
EV1019-C105M-IgG2 | SEQ ID NO: 308 | ||
EV1019-C105M-IgG4 | SEQ ID NO: 309 | ||
EV1019-C105M-IgG4SP | SEQ ID NO: 310 |
Варианты тяжелой цепи EV1019 | Варианты легкой цепи EV1019 | ||
EV1019-C105L-IgG2 | SEQ ID NO: 311 | ||
EV1019-C105L-IgG4 | SEQ ID NO: 312 | ||
EV1019-C105L-IgG4SP | SEQ ID NO: 313 |
Различные варианты осуществления настоящего изобретения
Ниже более подробно описаны варианты осуществления изобретения. Описание вариантов осуществления изобретения дано в той форме, в которой они были представлены при составлении формулы изобретения, поскольку, по-видимому, целесообразно проиллюстрировать в описании сущность изобретения, определяющую охраняемый объем, на который претендует данная заявка на патент.
Пункт 1. Одним из вариантов осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент распознает ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF (SEQ ID NO: 1).
Пункт 2. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, отличающееся/отличающийся тем, что антитело содержит:
(а) тяжелую цепь, включающую консенсусную VH-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную VH-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную VH-CDR3-содержащую последовательность, в которых:
(I) консенсусная VH-CDR1-содержащая последовательность представляет собой FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), в которой X1 обозначает Y или Н и Х2 обозначает G или А,
(II) консенсусная VH-CDR2-содержащая последовательность представляет собой X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 315), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х3 обозначает L или V, Х4 обозначает Т или I, Х5 обозначает Y или W, X6 обозначает R или K, Х7 обозначает F или Y и X8 обозначает R или K, и
(III) консенсусная VH-CDR3-содержащая последовательность представляет собой EXnX9GX10XnXnDXn (SEQ ID NO: 316), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х9 обозначает М или V и Х10 обозначает А или G; и
(б) легкую цепь, включающую консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную VL-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную VL-CDR3-содержащую последовательность, в которых:
(I) консенсусная VL-CDR1-содержащая последовательность представляет собой XnGNXnXnNIGSX11AVG (SEQ ID NO: 317), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х11 обозначает Н или Y,
(II) консенсусная VL-CDR2-содержащая последовательность представляет собой GX12SPX13SG (SEQ ID NO: 318), в которой Х12 обозначает R или K и X13 обозначает А или Р, и
(III) консенсусная VL-CDR3-содержащая последовательность представляет собой STWDSX14LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), в которой Х14 обозначает R или S и X15 обозначает V или L. В другом варианте осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2 специфически связывается с hGM-CSF, что предпочтительно характеризуется значением KD, составляющим менее 450 пМ.
Пункт 3. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, которое/который в дополнение к отличительным признакам, представленным в п.1 или 2, связывается с человеческим GM-CSF, что характеризуется значением KD, составляющим менее 400 пМ.
Пункт 4. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.3, где значение KD составляет менее 160 пМ.
Пункт 5. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-4, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент нейтрализует активность hGM-CSF, при этом значение IC50 для антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет менее 100 пМ при определении с помощью анализа пролиферации TF-1-клеток при ED80.
Пункт 6. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, где значение IC50 составляет 40 или менее 30 или менее 25 пМ. Для других предпочтительных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, предлагаемых в изобретении, значения IC50 составляют менее 20, менее 25, менее 30 или менее 40 пМ при определении с помощью анализа пролиферации TF-1-клеток при ED80.
Пункт 7. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, где значение IC50 составляет менее 20 пМ.
Пункт 8. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-7, в котором тяжелая цепь выбрана из группы, включающей гамма 1 (γ1), гамма 2 (γ2), гамма 3 (γ3) и гамма 4 (γ4).
Пункт 9. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-8, в котором тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 10-33, 38-80, 160-183, 222-244 и 245.
Пункт 10. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-9, в котором легкая цепь представляет собой легкую лямбда-цепь.
Пункт 11. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.10, в котором легкая лямбда-цепь содержит по меньшей мере одну или обе следующие аминокислотные замены: R100G или A153G.
Пункт 12. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-11, в котором легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 34-37, 202-220 и 221.
Пункт 13. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-9, в котором легкая цепь представляет собой легкую каппа-цепь.
Пункт 14. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-13, в котором тяжелая цепь выбрана из группы, включающей гамма 1 (γ1), гамма 2 (γ2), гамма 3 (γ3) и гамма 4 (γ4), и в котором легкая цепь представляет собой легкую лямбда-цепь.
Пункт 15. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-13, в котором тяжелая цепь содержит одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, включающей Q3E, Т97А, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164A и L165A.
Пункт 16. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-15, в котором VH-CDR1 содержит аминокислотную последовательность SYGMH (SEQ ID NO: 4) или SHAMH (SEQ ID NO: 333).
Пункт 17. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-16, в котором VH-CDR2 содержит аминокислотную последовательность LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) или VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334).
Пункт 18. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-17, в котором VH-CDR3 содержит аминокислотную последовательность ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) или EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335).
Пункт 19. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-18, в котором VL-CDR1 содержит аминокислотную последовательность IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) или SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330).
Пункт 20. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-19, в котором VL-CDR2 содержит аминокислотную последовательность GRSPPS (SEQ ID NO: 8) или GKSPAS (SEQ ID NO: 331).
Пункт 21. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-20, в котором VL-CDR3 содержит аминокислотные остатки STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9) или STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332).
Пункт 22. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит 6 различных CDR, где последовательности 6 CDR представлены в SEQ ID NO: 4-9. В другом варианте осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.22 специфически связывается с hGM-CSF, что предпочтительно характеризуется значением KD, составляющим менее чем 450, предпочтительно 400 или 160 пМ.
Пункт 22А. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, в сочетании с выделенным моноклональным антителом к hGM-CSF или его антигенсвязывающим фрагментом по п.п.2-22.
Пункт 23. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.22, где антитело содержит (I) тяжелую цепь или ее фрагмент, выбранную/выбранный из группы, включающей гамма 1 (γ1), гамма 2 (γ2), гамма 3 (γ3) и гамма 4 (γ4), и (II) легкую цепь, представляющую собой легкую каппа-цепь.
Пункт 24. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.22, где антитело содержит (I) тяжелую цепь или ее фрагмент, выбранную/выбранный из группы, включающей гамма 1 (γ1), гамма 2 (γ2), гамма 3 (γ3) и гамма 4 (γ4), и (II) легкую цепь, представляющую собой легкую лямбда-цепь.
Пункт 25. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который специфически связывается с hGM-CSF, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит 6 различных CDR, где последовательности указанных 6 CDR представлены в SEQ ID NO: 330-335.
Пункт 26. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.25, где антитело содержит (I) тяжелую цепь или ее фрагмент, выбранную/выбранный из группы, включающей гамма 1 (γ1), гамма 2 (γ2), гамма 3 (γ3) и гамма 4 (γ4), и (II) легкую цепь, представляющую собой легкую каппа-цепь.
Пункт 27. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.25, где антитело содержит (I) тяжелую цепь или ее фрагмент, выбранную/выбранный из группы, включающей гамма 1 (γ1), гамма 2 (γ2), гамма 3 (γ3) и гамма 4 (γ4), и (II) легкую цепь, представляющую собой легкую лямбда-цепь.
Пункт 28. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-27, дополнительно содержащее/содержащий сигнальную последовательность.
Пункт 29. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по 28, где сигнальная последовательность выбрана из группы, включающей: SEQ ID NO: 324, 325 и 326.
Пункт 30. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит тяжелую цепь, имеющую конкретную последовательность тяжелой цепи, и легкую цепь, имеющую конкретную последовательность легкой цепи, где последовательность тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 10 или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 11-33, 38-79 и 80, и где последовательность легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 34.
Пункт 31. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит тяжелую цепь, имеющую конкретную последовательность тяжелой цепи, и легкую цепь, имеющую конкретную последовательность легкой цепи, где последовательность тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 10 или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 11-33, 38-79 и 80, и где последовательность легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 35.
Пункт 32. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит тяжелую цепь, имеющую конкретную последовательность тяжелой цепи, и легкую цепь, имеющую конкретную последовательность легкой цепи, где последовательность тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 10 или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 11-33, 38-79 и 80, и где последовательность легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 36.
Пункт 33. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит тяжелую цепь, имеющую конкретную последовательность тяжелой цепи, и легкую цепь, имеющую конкретную последовательность легкой цепи, где последовательность тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 10 или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 11-33, 38-79 и 80, и где последовательность легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 37.
Пункт 34. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит тяжелую цепь, имеющую конкретную последовательность тяжелой цепи, и легкую цепь, имеющую конкретную последовательность легкой цепи, где последовательность тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 160 или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 161-244 и 245, и где последовательность легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 202 или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 203-220 и 221.
Пункт 35. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, где аминокислотная область вариабельной области тяжелой цепи, представляет собой SEQ ID NO: 152 или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 153-158 и 159, и вариабельную область легкой цепи, где аминокислотная область вариабельной области легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 184 или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 185-200 и 201.
Пункт 36. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.35, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 152.
Пункт 37. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.35, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 184.
Пункт 38. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.35, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 152, и где аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 184.
Пункт 39. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.35-38, где антитело принадлежит к классу (подклассу) IgG1(λ).
Пункт 40. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 348 или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 349-362 и 363, и вариабельную область легкой цепи, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 364 или SEQ ID NO: 365.
Пункт 41. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.40, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 348.
Пункт 42. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.40, где аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 364.
Пункт 43. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.40, где аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 365.
Пункт 44. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.40-43, где антитело принадлежит к классу (подклассу) IgG1(λ).
Пункт 45. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент по п.п.1-44.
Пункт 46. Другим вариантом осуществления изобретения является нуклеиновая кислота по п.45, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.
Пункт 47. Другим вариантом осуществления изобретения является вектор, содержащий ДНК по п.46.
Пункт 48. Другим вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяин, содержащая вектор по п.47, где вектор представляет собой экспрессионный вектор.
Пункт 49. Другим вариантом осуществления изобретения является набор, который содержит: (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-44; и (б) один или несколько контейнеров, содержащий(их) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Пункт 50. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-44, предназначенное/предназначенный для применения в медицине.
Пункт 51. Другим вариантом осуществления изобретения является композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-44 и фармацевтически приемлемый носитель.
Пункт 52. Другим вариантом осуществления изобретения является композиция по п.51, дополнительно содержащая второе выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который связывается с hGM-CSF, при этом композиция содержит несколько указанных антител, несколько их антигенсвязывающих фрагментов или по меньшей мере одно антитело и по меньшей мере один антигенсвязывающий фрагмент, каждое/каждый из которых связывается с hGM-CSF.
Пункт 53. Другим вариантом осуществления изобретения является композиция по п.52, в которой по меньшей мере одно из антител или их антигенсвязывающих фрагментов представляет собой полипептид, который имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 10-80, 152-245, 320-323, 348-364 и 365.
Пункт 54. Другим вариантом осуществления изобретения является набор, который содержит: композицию по одному из п.п.51-53 и один или несколько контейнеров, содержащий(их) композицию.
Пункт 55. Другим вариантом осуществления изобретения является набор по п.49 или п.54, дополнительно содержащий инструкцию.
Пункт 56. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или композиция по одному из п.п.1-44 и 51-54, предназначенные для производства или приготовления лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного со сверхэкспрессией hGM-CSF, у индивидуума, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с hGM-CSF и обладает способность нейтрализовать активность hGM-CSF.
Пункт 57. Другим вариантом осуществления изобретения является применение по п.56, где заболевание или нарушение выбрано из группы, включающей: хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), астму, муковисцидоз, интерстициальное легочное заболевание, ринит, артрит и родственные артропатии, псориаз, миелоидный лейкоз и рассеянный склероз.
Пункт 58. Другим вариантом осуществления изобретения является применение по п.56 или 57, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму в дозе, не превышающей 500 мг.
Пункт 59. Другим вариантом осуществления изобретения является применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или композиции по одному из п.п.1-44 и 51-53 для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного со сверхэкпрессией hGM-CSF, у индивидуума, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с hGM-CSF и обладает способностью нейтрализовать активность hGM-CSF.
Пункт 60. Другим вариантом осуществления изобретения является применение по п.59, где заболевание или нарушение выбрано из группы, включающей: хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), астму, муковисцидоз, интерстициальное легочное заболевание, ринит, артрит и родственные артропатии, псориаз, миелоидный лейкоз и рассеянный склероз.
Пункт 61. Другим вариантом осуществления изобретения является применение по п.59 или 60, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму в дозе, не превышающей 500 мг.
Пункт 62. Другим вариантом осуществления изобретения является эпитоп hGM-CSF в полипептидах, последовательность которых представлена в SEQ ID NO: 2 и 3, где эпитоп распознается антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по п.22 или 25 и где полипептидные последовательности представляют собой прерывистый сегмент hGM-CSF (SEQ ID NO: 1).
Пункт 63. Другим вариантом осуществления изобретения является эпитоп, представляющий собой прерывистый сегмент человеческого GM-CSF, где эпитоп содержит аминокислотные остатки 77-80 человеческого GM-CSF (SEQ ID NO: 1) и аминокислотные остатки 95-104 человеческого GM-CSF (SEQ ID NO: 1) и распознается моноклональным антителом к hGM-CSF или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащим 6 различных CDR, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 4-9 или SEQ ID NO: 330-335.
Пункт 64. Другим вариантом осуществления изобретения является способ получения в клетке-хозяине моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента, которое/который связывается с hGM-CSF, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере консенсусную VH-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную VH-CDR2-содержащую последовательность, консенсусную VH-CDR3-содержащую последовательность, консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную VL-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную VL-CDR3-содержащую последовательность, заключающийся в том, что:
(I) получают клетку-хозяина, которая содержит по меньшей мере одну последовательность ДНК, кодирующую по меньшей мере консенсусную VH-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную VH-CDR2-содержащую последовательность, консенсусную VH-CDR3-содержащую последовательность, консенсусную VL-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную VL-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную VL-CDR3-содержащую последовательность, где:
(а) консенсусная VH-CDR1-содержащая последовательность представляет собой FTFSX1X2MH (SEQ ID NO: 314), в которой X1 обозначает Y или Н и X2 обозначает G или А,
(б) консенсусная VH-CDR2-содержащая последовательность представляет собой X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G (SEQ ID NO: 315), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х3 обозначает L или V, Х4 обозначает Т или I, X5 обозначает Y или W, Х6 обозначает R или K, Х7 обозначает F или Y и X8 обозначает R или K, и
(в) консенсусная VH-CDR3-содержащая последовательность представляет собой EXnX9GX10XnXnDXn (SEQ ID NO: 316), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х9 обозначает М или V и Х10 обозначает А или G,
(г) консенсусная VL-CDR1-содержащая последовательность представляет собой XnGNXnXnNIGSX11AVG (SEQ ID NO: 317), в которой Xn каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х11 обозначает Н или Y,
(д) консенсусная VL-CDR2-содержащая последовательность представляет собой GX12SPX13SG (SEQ ID NO: 318), в которой Х12 обозначает R или K и X13 обозначает А или Р, и
(е) консенсусная VL-CDR3-содержащая последовательность представляет собой STWDSX14LSAVX15 (SEQ ID NO: 319), в которой Х14 обозначает R или S и X15 обозначает V или L; и
(II) культивируют клетку-хозяина в условиях, пригодных для экспрессии ДНК и производства антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
Пункт 65. Другим вариантом осуществления изобретения является способ по п.64, в котором по меньшей мере одна ДНК кодирует тяжелую цепь или ее часть и легкую цепь или ее часть, где тяжелая цепь или ее часть имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 10-33, 38-80, 152-183, 222-245, 348-362 и 363, и где легкая цепь или ее часть имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 34-37, 184-221, 364 и 365.
Пункт 66. Другим вариантом осуществления изобретения является способ по п.64 или 65, дополнительной заключающийся в том, что выделяют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Пункт 67. Другим вариантом осуществления изобретения является способ по одному из п.п.64-66, дополнительной заключающийся в том, что получают композицию, которая содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель.
Пункт 68. Другим вариантом осуществления изобретения является вектор, содержащий последовательность ДНК, которая кодирует VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, где:
VH-CDR1 представляет собой SYGMH (SEQ ID NO: 4) или SHAMH (SEQ ID NO: 333),
VH-CDR2 представляет собой LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) или VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334) и
VH-CDR3 представляет собой ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) или EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335).
Пункт 69. Другим вариантом осуществления изобретения является вектор, содержащий последовательность ДНК, которая кодирует VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где:
VL-CDR1 представляет собой IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) или SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330),
VL-CDR2 представляет собой GRSPPSG (SEQ ID NO: 8) или GKSPASG (SEQ ID NO: 331) и
VL-CDR3 представляет собой STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9) или STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332).
Пункт 70. Другим вариантом осуществления изобретения является способ идентификации молекулы, которая связывается с эпитопом по п.62 или 63, заключающийся в том, что
(I) приводят к контакт биологический образец или пептидную библиотеку с зондом, который содержит эпитоп;
(II) выделяют молекулу, которая специфически связывается с зондом; и
(III) идентифицируют молекулу.
Пункт 71. Другим вариантом осуществления изобретения является способ по п.70, дополнительно заключающийся в том, что
(IV) получают молекулу, указанную в подпункте (III).
Пункт 72. Другим вариантом осуществления изобретения является способ по п.70 или 71, в котором молекула представляет собой моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент.
Пункт 73. Другим вариантом осуществления изобретения является способ по одному из п.п.70-72, в котором зонд дополнительно содержит выявляемый маркер.
Пункт 74. Другим вариантом осуществления изобретения является способ по одному из п.п.70-73, в котором зонд является иммобилизованным.
Пункт 75. Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF (hGM-CSF) и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF (hGM-CSF), отличающееся/отличающийся тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок имеет гипервариабельный участок (CDR), одна или несколько аминокислотных последовательностей которого выбраны из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9.
Пункт 76. Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, отличающееся/отличающийся тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок имеет гипервариабельный участок (CDR), аминокислотные последовательности которого выбраны из группы, включающей SEQ ID NO: 330-335.
Пункт 77. Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок по п.75 или п.76, отличающееся/отличающийся тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок имеет аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот заменена(ы), удалена(ы) в результате делеции, встроена(ы) или добавлена(ы) в гипервариабельный участок (CDR).
Пункт 78. Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок по п.п.75-77, отличающееся/отличающийся тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок ингибирует пролиферацию TF-1-клеток примерно на 50% при использовании в концентрации примерно 14 пМ, когда пролиферацию TF-1-клеток индуцируют hGM-CSF.
Пункт 79. Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок по п.78, отличающееся/отличающийся тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок ингибирует пролиферацию дендритных клеток периферической крови.
Пункт 80. Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок по п.78, отличающееся/отличающийся тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок имеет высокую аффинность к hGM-CSF, что характеризуется значением KD, составляющим 4×10-10 M или ниже.
Пункт 81. Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок по п.п.75-80, отличающееся/отличающийся тем, что антитело принадлежит к классу (подклассу) IgG1(λ).
Пункт 82. Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок по п.78, отличающееся/отличающийся тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF представляет собой человеческое моноклональное антитело.
Пункт 83. Другим вариантом осуществления изобретения является композиция медицинского назначения, предназначенная для лечения заболевания, которое вызывается hGM-CSF, содержащая моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок по п.п.75-82 и фармацевтически приемлемый носитель.
Пункт 84. Другим вариантом осуществления изобретения является композиция медицинского назначения по п.83, отличающая тем что заболевание, которое вызывается избыточным производством hGM-CSF, представляет собой любое заболевание, выбранное из группы, включающей:
(а) аллергические заболевания, такие как астма, атопия и полиноз,
(б) отторжение трансплантата, реакция «трансплантат-против-хозяина» (GVHD) и
(в) аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит.
Пункт 85. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенная дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), которая кодирует моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, отличающаяся тем, что выделенная ДНК кодирует аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9.
Пункт 86. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенная ДНК, которая кодирует моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, отличающаяся тем, что выделенная ДНК кодирует аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 330-335.
Пункт 87. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенная ДНК, которая обладает способностью гибридизоваться в строгих условиях с ДНК по п.85 или п.86.
Пункт 88. Другим вариантом осуществления изобретения является вектор, отличающийся тем, что в него встроена выделенная ДНК по одному из п.п.85-87.
Пункт 89. Другим вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяин, отличающаяся тем, что в нее интродуцирован рекомбинантный экспрессионный вектор по п.88.
Пункт 90. Другим вариантом осуществления изобретения является способ повышения активности, отличающийся тем, что вводят одновременно несколько видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков, специфических в отношении одного и того же конкретного антигена.
Пункт 91. Другим вариантом осуществления изобретения является способ повышения активности по п.90, отличающийся тем, что два или большее количество видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков содержат два или большее количество типов антител или их антигенсвязывающих участков, которые выбирают из указанных ниже в подпунктах (а) и (б):
(а) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который имеет гипервариабельный участок (CDR), аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 4-9, SEQ ID NO: 330-335, SEQ ID NO: 336-341 или SEQ ID NO: 342-347, и обладает специфичностью в отношении hGM-CSF,
(б) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, указанное/указанный в подпункте (а), которое/который имеет аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот заменена(ы), удалена(ы) в результате делеции, встроена(ы) или добавлена(ы), и обладает специфичностью в отношении hGM-CSF.
Пункт 92. Другим вариантом осуществления изобретения является способ повышения активности по п.91, отличающийся тем, что два или несколько типов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков ингибируют пролиферацию TF-1-клеток на 80% или более при использовании каждого в концентрации примерно 55 пМ, когда пролиферация TF-1-клеток индуцирована hGM-CSF.
Пункт 93. Другим вариантом осуществления изобретения является композиция медицинского назначения или ветеринарная лекарственная композиция, содержащая: несколько видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков, специфических в отношении одного и того же конкретного антигена, и фармацевтически приемлемый носитель.
Пункт 94. Другим вариантом осуществления изобретения является композиция медицинского назначения или ветеринарная лекарственная композиция по п.93, отличающаяся тем, что несколько видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков содержат два или большее количество типов антител или их антигенсвязывающих участков, которые выбирают из указанных ниже в подпунктах (а) и (б):
(а) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который имеет гипервариабельный участок (CDR), аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 4-9, SEQ ID NO: 330-335, SEQ ID NO: 336-341 или SEQ ID NO: 342-347, и обладает специфичностью в отношении hGM-CSF,
(б) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, указанное/указанный в подпункте (а), которое/который имеет аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот заменена(ы), удалена(ы) в результате делеции, встроена(ы) или добавлена(ы), и обладает специфичностью в отношении hGM-CSF.
Пункт 95. Другим вариантом осуществления изобретения является композиция медицинского назначения или ветеринарная лекарственная композиция по п.94, отличающаяся тем, что несколько типов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков ингибируют пролиферацию TF-1-клеток на 80% или более при использовании каждого в концентрации примерно 55 пМ, когда пролиферация TF-1-клеток индуцирована hGM-CSF.
Ниже настоящее изобретение более подробно описано с помощью примеров, которые не ограничивают объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Выделение клеточных клонов, продуцирующих полностью человеческие антитела к hGM-CSF (hGM-CSF)
На фиг.1 приведена блок-схема выделения антителопродуцирующих клеточных клонов. В-лимфоциты выделяли из крови доноров, в сыворотке которых присутствовали высокие титры моноклонального антитела к GM-CSF, после чего их заражали EBV. Пролиферирующие клетки, инфицированные EBV, использовали в качестве библиотеки антителопродуцирующих клеток.
Клетки из библиотеки антителопродуцирующих клеток вносили в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 3-4 недель. Супернатант культуры из каждой лунки подвергали скринингу в отношении присутствия моноклонального антитела к hGM-CSF. Скрининг осуществляли с помощью ELISA, используя 96-луночные планшеты, сенсибилизированные рекомбинантным hGM-CSF (rhGM-CSF). Клетки в лунках, позитивных в отношении производства антитела, высевали в новые 96-луночные планшеты и культивировали в течение 3-4 недель, а затем супернатант культуры из каждой лунки подвергали второму раунду скрининга в отношении присутствия моноклонального антитела к hGM-CSF. Клетки в лунках, позитивных в отношении производства антитела, культивировали в 96-луночных планшетах с использованием лимитирующих разведении культуры в течение 3-5 недель. Затем супернатант культуры из каждой лунки анализировали в отношении присутствия антитела и, наконец, получали антителопродуцирующие клеточные клоны из лунок, засеянных из расчета 1 клетка на лунку.
Пример 2. Идентификация изотипа и подкласса антител
При создании антитела идентифицировали изотип и подкласс антител, продуцируемых тремя антителопродуцирующими клеточными клонами EV1007, EV1018 и EV1019 (таблица 1). Идентификацию осуществляли с помощью ELISA, практически таким же методом, который применяли для скрининга производства антител в супернатантах культур с использованием супернатантов культур в качестве первого антитела и специфических для изотипа и подтипа антител в качестве второго антитела.
В таблице 1 представлены названия вновь полученных трех моноклональных антител к hGM-CSF и их подклассов и моноклонального антитела J158 4С (обозначенного далее в контексте настоящего описания как EV1003), которое описано в публикации международной заявки РСТ WO 07/049472.
Таблица 1 | |
Антитело | Подкласс |
EV1007 | IgG1 λ |
EV1018 | IgG1 λ |
EV1019 | IgG1 λ |
EV1003 | IgG1 λ |
Пример 3. Клонирование генов антител из антителопродуцирующих клеток
Гены антител клонировали из антителопродуцирующих клеток. Общую РНК экстрагировали из антителопродуцирующих клеток и ее кДНК синтезировали с помощью олиго-(дТ) праймера и обратной транскриптазы. С использованием кДНК в качестве матрицы амплифицировали гены, кодирующие синтетические антитела, с помощью ПЦР. Праймеры создавали на основе баз данных последовательностей ДНК генов антител так, чтобы 5′-конец содержал сайт инициации транскрипции, а 3′-конец содержал сайт терминации трансляции.
Пример 4. Определение аминокислотных последовательностей антител на основе нуклеотидных последовательностей
Клонировали кДНК генов антител [EV1007, EV1018 и EV1019, каждый включал гены тяжелой (Н) цепи и легкой (L) цепи] в плазмидных векторах и их нуклеотидные последовательности анализировали с помощью секвенатора (фирма ABI). Аминокислотные последовательности определяли на основе полученных нуклеотидых последовательностей. Для анализа гипервариабельных участков (CDR) антител (EV1007, EV1018, EV1019 и EV1003) использовали метод Кэбота. Последовательности CDR четырех антител представлены в SEQ ID NO: 4-9 и 330-347. В частности, последовательности CDR1 L-цепи, CDR2 L-цепи, CDR3 L-цепи, CDR1 Н-цепи, CDR2 Н-цепи и CDR3 Н-цепи EV1018 представлены в SEQ ID NO: 4-9 соответственно. CDR1 L-цепи, CDR2 L-цепи, CDR3 L-цепи, CDR1 Н-цепи, CDR2 Н-цепи и CDR3 Н-цепи EV1019 представлены в SEQ ID NO: 330-335 соответственно. CDR1 L-цепи, CDR2 L-цепи, CDR3 L-цепи, CDR1 Н-цепи, CDR2 Н-цепи и CDR3 Н-цепи EV1003 представлены в SEQ ID NO: 336-341 соответственно. CDR1 L-цепи, CDR2 L-цепи, CDR3 L-цепи, CDR1 Н-цепи, CDR2 Н-цепи и CDR3 Н-цепи EV1007 представлены в SEQ ID NO: 342-347 соответственно.
Пример 5. Подтверждение полученных генов антител, кодирующих моноклональные антитела к hGM-CSF
Гены, кодирующие три антитела (каждое состоящее из Н- и L-цепей), встраивали в экспрессионные векторы. Плазмидами, кодирующими гены L- и Н-цепи каждого антитела, кратковременно трансфектировали клетки линии 293Т, используя липофектамин и реагент Plus (фирма Invitrogen) и оценивали в отношении кратковременной экспрессии антител.
Через 2 дня после трансфекции собирали супернатанты клеточных культур, содержащие секретируемые антитела. Человеческий IgG и моноклональное антитело к GM-CSF в супернатантах культур выявляли с помощью ELISA для подтверждения кратковременной экспрессии человеческих антител и моноклональных антител к GM-CSF.
Пример 6. Создание стабильно трансфектированных СНО-клеток, экспрессирующих моноклональные антитела к hGM-CSF
Экспрессионными векторами, кодирующими моноклональные антитела к GM-CSF, трансфектировали СНО-K1-клетки согласно описанному выше методу. Через 2 дня после трансфекции клетки высевали в 96-луночный планшет и культивировали в селекционной среде, содержащей соответствующий маркер для селекции, в течение примерно 2 недель. Супернатант культуры каждой лунки подвергали скринингу в отношении моноклонального антитела к hGM-CSF с помощью ELISA. Одиночные клетки в лунках, позитивных в отношении экспрессии антитела, высевали в лунки 96-луночного планшета. Клоны одиночных клеток, выращенные в селективной среде, подвергали скринингу в отношении экспрессии моноклонального антитела к GM-CSF и получали клеточные клоны, стабильно экспрессирующие моноклональное антитело к GM-CSF.
Пример 7. Очистка антител
Клоны СНО-клеток, стабильно экспрессирующие моноклональные антитела к GM-CSF, культивировали в бессывороточной среде. После соответствующего периода экспрессии собирали супернатанты культуры и антитела выделяли с помощью аффинной хроматографии, используя колонку, предварительно заполненную HiTrap рекомбинантным белком A FF (фирма Amersham), согласно инструкции производителя. Подтверждали у очищенных антител способность связываться с hGM-CSF с помощью ELISA и подтверждали наличие у антитела Н-цепи с молекулярной массой примерно 50 кДа и L-цепи с молекулярной массой примерно 25 кДа с помощью ДСН-ПААГ.
Пример 8. Анализ аффинности моноклональных антител к GM-CSF
Для расчета констант аффинности, характеризующих связывание рекомбинантного hGM-CSF с моноклональными антителами к hGM-CSF, применяли метод резонанса поверхностного плазмона (SPR) с использованием Biacore System™ (фиг.2).
При осуществлении метода анализа взаимодействия между антителами и антигенами очищенные антитела иммобилизовывали на сенсорном чипе посредством взаимодействия с белком G, иммобилизованным на поверхности сенсорного чипа, а затем рекомбинантные антигены инъецировали в сенсорный чип. Применяли очищенные антитела и рекомбинантный hGM-CSF в качестве антигена.
Константы равновесия реакции диссоциации (KD), характеризующие связывание рекомбинантного hGM-CSF, полученного из дрожжей (фирма Leukine Berlex) и из Е.coli (фирма Peprotech), с моноклональными антителами hGM-CSF, представлены в таблице 2.
Таблица 2 | ||
Антитело | Константы равновесия реакции диссоциации (KD (М)) | |
Фирма Leukine | Фирма Peprotech | |
EV1007 | 1,2×10-9 | 9,3×10-10 |
EV1018 | 2,3×10-10 | 1,5×10-10 |
EV1019 | 3,6×10-10 | 1,5×10-10 |
EV1003 | 2,3×10-10 | 9,5×10-11 |
С помощью этого анализа установлено, что значения KD для GM-CSF из дрожжей (фирма Leukine) составляло 1,2×10-9 М для EV1007, 2,3×10-10 M для EV1018 и 3,6×10-10 M для EV1019. Значение KD для моноклонального антитела EV1003, созданного ранее, составляло 2,3×10-10 M.
Значение KD для GM-CSF из Е.coli (фирма Peprotech) составляло 9,3×10-10 М для EV1007, 1,5×10-10 М для EV1018, 1,5×10-10 M для EV1019 и 9,5×10-11 М для EV1003. Все четыре созданных моноклональных антитела к hGM-CSF связывались с рекомбинантными hGM-CSF с высокой аффинностью.
Пример 9. Ингибирующее воздействие моноклональных антител к GM-CSF на пролиферацию дендритных клеток периферической крови
5×105 дендритных клеток (DC), в состав которых входили плазмацитоидные DC и миелоидные DC, получали из 7×107 человеческих мононуклеарных клеток с помощью набора для выделения дендритных клеток из крови человека (Blood Dendritic Cell Isolation Kit II Human) (фирма Miltenyi Biotech).
Полученные DC суспендировали в среде RPMI 1640 (фирма Gibco), дополненной 10% FCS, rhGM-CSF (1 нг/мл, фирма Peprotech), TNF-α (10 нг/мл) и моноклональными антителами к GM-CSF (1 мкг/мл), высеянными в 96-луночные плоскодонные планшеты в концентрации 2×104 клеток/лунку, и инкубировали в течение 10 дней.
Поликлональное антитело к GM-CSF (ПАт к GM-CSF, фирма R&D) (1 мкг/мл) и человеческое антитело к человеческому цитомегаловирусу (hIgG) (1 мкг/мл), которое получали при создании изобретения, применяли в качестве контролей. Результаты представлены на фиг.3.
Как видно из фиг.3, антитела EV1003, EV1018 и EV1019 ингибировали GM-CSF-зависимую пролиферацию DC. В отличие от этого при использовании EV1007 не обнаружено ингибирования. С другой стороны, ПАт к GM-CSF ингибировало GM-CSF-зависимую пролиферацию DC, а hIgG не обладало таким действием.
EV1003, EV1018 и EV1019 обладали способностью независимо блокировать GM-CSF-зависимую пролиферацию DC.
Пример 10. Оценка нейтрализующей способности моноклональных антител к GM-CSF с использованием TF-1-клеток
При создании изобретения оценивали нейтрализующую способность очищенных моноклональных антител к hGM-CSF (EV1007, EV1018 и EV1019) и антитела EV1003, которое было создано ранее, с использованием TF-1-клеток, пролиферация которых зависит от присутствия hGM-CSF, результаты представлены на фиг.4 и 5.
Очищенные антитела предварительно инкубировали с рекомбинантным hGM-CSF и смесь добавляли в культуру TF-1-клеток. После культивирования в течение 2 дней определяли статус пролиферации TF-1-клеток с помощью колориметрического анализа. Антитело, обладающее GM-CSF-нейтрализующей активностью, может блокировать активность добавленного рекомбинантного GM-CSF, что приводит к ингибированию GM-CSF-зависимого роста TF-1-клеток.
На фиг.4 и 5 продемонстрировано ингибирующее действие (нейтрализующая активность) антител на пролиферацию TF-1-клеток, стимулированную дрожжевым hGM-CSF (фирма Leukine) и hGM-CSF из Е.coli (фирма Peprotech) соответственно.
Ингибирующее действие каждого антитела исследовали независимо и ПАт к GM-CSF и hIgG использовали в качестве контролей, как описано в примере 9.
Для оценки антител осуществляли их четырехкратные серийные разведения с получением концентраций от 2 мкг/мл до 31 пг/мл. Во всех опытах в качестве конечной применяли концентрацию 0,5 нг/мл rhGM-CSF. После инкубации в течение 40 ч оценивали жизнеспособность TF-1-клеток по интенсивности цвета при А450/относительно А495 с помощью набора для подсчета клеток (Cell Counting Kit) (WST-1-анализ, фирма DOJIN).
На y-оси на фиг.4 и 5 жизнеспособность TF-1-клеток при использовании контрольного антитела hIgG в концентрации 31 пг/мл принимали за 100%, а жизнеспособность TF-1-клеток в отсутствии rhGM-CSF принимали за 0%. Тестируемые антитела перечислены под чертежами и их концентрации указаны справа на чертежах.
Дрожжевой rhGM-CSF (фирма Leukine) в концентрации 0,5 нг/мл использовали для стимуляции пролиферации TF-1-клеток и полученные данные о нейтрализующей способности каждого моноклонального антитела к hGM-CSF представлены на фиг.4. В то время как для применяемого в качестве отрицательного контроля hIgG при высокой концентрации 2 мкг/мл обнаружено неспецифическое ингибирование клеточного роста, никакого ингибирующего действия не выявлено при его применении в концентрации ниже 2 мкг/мл. Для поликлонального антитела к hGM-CSF (ПАт к GM-CSF) обнаружена зависящая от концентраций антитела ингибирующая активность в отношении роста клеток при применении в концентрации 125 нг/мл или превышающей 125 нг/мл.
При оценке ряда очищенных моноклональных антител установлено, что EV1003 ингибировало рост TF1-клеток на уровне вплоть до 60% от положительного контроля при концентрации 31 нг/мл, и зависящее от концентрации ингибирование роста обнаружено при его применении в концентрации 31 нг/мл или превышающей 31 нг/мл. Для EV1018 и EV1019 обнаружено примерно 50%-ное ингибирование при концентрациях 0,5 нг/мл или превышающей 0,5 нг/мл и 2 нг/мл или превышающей 2 нг/мл соответственно. Подтверждено, что EV1018 и EV1019 обладали очень высокой нейтрализующей активностью в отношении hGM-CSF. При применении EV1007 обнаружено заметное ингибирование клеточного роста при концентрациях 0,5 мкг/мл или превышающей 0,5 мкг/мл, что свидетельствует о его очень низкой нейтрализующей способности.
rhGM-CSF E.coli (фирма Peprotech) в концентрации 0,5 нг/мл применяли для стимуляции пролиферации TF-1-клеток и результаты, демонстрирующие нейтрализующую способность каждого моноклонального антитела к hGM-CSF, представлены на фиг.5. В этом анализе для hIgG, применяемого в качестве отрицательного контроля, обнаружено неспецифическое ингибирование клеточного роста в высокой концентрации 2 мкг/мл, и не обнаружено ингибирования при использовании в концентрации ниже 2 мкг/мл. Для поликлональных антител к hGM-CSF (ПАт к GM-CSF) обнаружена зависящая от концентрации антитела ингибирущая активность при применении в концентрации 31 нг/мл или превышающей 31 нг/мл.
При оценке ряда очищенных моноклональных антител установлено, что EV1003 заметно ингибировало рост TF1-клеток в зависимости от концентрации при использовании в концентрации 31 нг/мл или превышающей 31 нг/мл. Для EV1018 и EV1019 обнаружено примерно 50%-ное ингибирование при концентрациях 0,5 нг/мл или превышающих 0,5 нг/мл и 2 нг/мл или превышающих 2 нг/мл соответственно. Подтверждено, что EV1018 и EV1019 обладали очень высокой нейтрализующей активностью в отношении hGM-CSF.
При применении EV1007 обнаружено заметное ингибирование клеточного роста при концентрациях 0,5 мкг/мл или превышающих 0,5 мкг/мл, что свидетельствует о его очень низкой нейтрализующей способности по сравнению с EV1018 и EV1019.
Проводили оценку нейтрализующей активности комбинации двух антител (фиг.6 и 7). В таблице 3 представлены смесей, представляющих собой комбинации антител.
Таблица 3 | |
Смесь - 1 | EV1003+hIgG |
Смесь - 2 | EV1003+EV1007 |
Смесь - 3 | EV1003+EV1018 |
Смесь - 4 | EV1003+EV1019 |
Смесь - 5 | EV1018+EV1019 |
Тестируемые растворы каждого антитела приготавливали путем серийного четырехкратного разведения с получением концентраций от 4 мкг/мл до 62 пг/мл, и два антитела в одной и той же концентрации смешивали (конечная концентрация представлена на фиг.6 и 7). Жизнеспособность TF-1-клеток оценивали по интенсивности цвета при А450/относительно А495 с помощью набора для подсчета клеток (Cell Counting Kit) (WST-1-анализ, фирма DOJIN).
На y-оси на фиг.6 и 7 жизнеспособность TF-1-клеток при использовании контрольного антитела hIgG в концентрации 31 пг/мл принимали за 100%, а жизнеспособность TF-1-клеток в отсутствии rhGM-CSF принимали за 0%, аналогично указанному на фиг.4 и 5. Результаты, полученные при оценке жизнеспособности TF1-клеток при применении контрольного антитела hIgG в концентрации 31 пг/мл, представлены на фиг.4 и 5, но не представлены на фиг.6 и 7. Комбинации смешиваемых антител представлены под чертежами и их концентрации указаны справа на чертежах.
Из изученных комбинаций ингибирующее действие смеси - 2: EV1003+1007, смеси - 3: EV1003+1018 и смеси - 4: EV1003+1019 резко повышалось по сравнению с индивидуальным применением каждого антитела. Например, как видно из фиг.6, смесь - 4: EV1003+1019 ингибировала рост TF1-клеток в меньшей на 10% степени, чем положительный контроль, при применении каждого антитела в концентрации 8 нг/мл (примерно 55 пМ).
Как видно из фиг.4, EV1003 при его индивидуальном применении в концентрации 8 нг/мл не ингибировало TF1-клеточную пролиферацию, EV1019 при его индивидуальном применении в концентрация 8 нг/мл вызывало лишь 50%-ное ингибирование. Эти результаты свидетельствуют о том, что комбинация двух антител обладает очень высокой нейтрализующей активностью.
В то время как ингибирующее действие EV1007 при его индивидуальном применении было очень низким, смесь - 2: EV1003+1007 ингибировала рост TF1-клеток в меньшей на 10% ниже степени, чем положительный контроль, при применении каждого антитела в концентрации 8 нг/мл (примерно 55 пМ), как видно из фиг.6 и 7.
Как показано на фиг.7, когда для стимуляции пролиферации TF-1-клеток применяли rhGM-CSF из Е.coli (фирма Peprotech), рост клеток практически полностью ингибировался смесью - 2: EV1003+1007, смесью - 3: EV1003+1018 и смесью - 4: EV1003+1019 при применении каждого антитела в концентрации 31 нг/мл или превышающей 31 нг/мл. Подтверждено, что при применении антител в виде комбинаций они обладали очень сильной нейтрализующей активностью.
С другой стороны, ингибирующее действие смеси - 5: EV1018+1019 повышалось в зависимости от концентрации по сравнению с индивидуальным применением антител, что продемонстрировано на фиг.4 и 5, однако уровень повышения оказалось ниже, чем при применении смесей - 2-4.
В случае смеси - 5: EV1018+1019, действие которой было не столь значительным, кривые дозовой зависимости (уровень нейтрализующего действия) для обоих антител при их индивидуальном применении оказались сходными.
Как видно из фиг.4 и 5, из четырех антител (EV1003, EV1007, EV1018 и EV1019) EV1003 характеризуется наиболее сильным ингибирующим действием при его индивидуальном применении в концентрации 2 мкг/мл, но даже при использовании в указанной высокой концентрации, примерно 20% клеток сохранялись. В противоположность этому, смесь - 2, смесь - 3 и смесь - 4 ингибировали клеточный рост практически полностью при применении в концентрации от 31 до 125 нг/мл. Это свидетельствует о том, что указанные три комбинации (смесь - 2, смесь - 3 и смесь - 4) обладают очень высокой нейтрализующей активностью.
Совместное применение моноклонального антитела к GM-CSF (EV1003) и антитела к CMV (hIgG) (смесь - 1), не привело к повышению ингибирующего действия антител по сравнению с их индивидуальным применением.
Из трех антител, полученных при создании настоящего изобретения, два антитела (EV1018 и EV1019) продемонстрировали очень высокую нейтрализующую активность при их индивидуальном применении и применении в виде комбинации. Из изученных комбинаций антител, перечисленных в таблице 3, некоторые комбинации обладали более высокой нейтрализующей активностью, превышающей аддитивное действие обоих антител.
Моноклональные антитела к GM-CSF, создание которых описано выше, и их антигенсвязывающие участки обладают способностью связываться с hGM-CSF, который является причинным фактором различных заболеваний, и инактивировать (нейтрализовать) биологическую активность hGM-CSF. Таким образом, антитела или их антигенсвязывающие участки обладают более высокой нейтрализующей активностью в отношении hGM-CSF, чем ранее созданные (доступные в настоящее время) моноклональные антитела к hGM-CSF. Антитела или их антигенсвязывающие участки не обладают иммуногенностью и не индуцируют иммунный ответ, поскольку они представляют собой человеческие моноклональные антитела.
Кроме того, одновременное применение в виде смесей моноклональных антител к GM-CSF или их антигенсвязывающих участков обусловливает очень высокое ингибирующее действие в отношении клеточного роста (т.е. нейтрализующая активность) по сравнению с их индивидуальным применением.
С учетом указанных свойств моноклональные антитела к hGM-CSF или их антигенсвязывающие участки, представленные в настоящем описании, могут обладать эффективностью в низких дозах в качестве профилактических или терапевтических средств в отношении заболеваний, которые ассоциированы с повышенным уровнем GM-CSF, включая (но, не ограничиваясь только ими) аллергические заболевания, такие как астма, ХОЗЛ, муковисцидоз, интерстициальное легочное заболевание, ринит, атопия и полиноз, отторжение трансплантата, реакция «трансплантат-против-хозяина», артрит и родственные артропатии, псориаз, миелоидный лейкоз, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера и ревматоидный артрит.
Пример 11. Оценка аффинности моноклональных антител к GM-CSF с помощью Biacore-анализа в присутствии GM-CSF
Применяли Biacore-чипы, обработанные мышиным античеловеческим антителом (фирма GE Healthcare), для иммобилизации каждого антитела и давали связываться с растворимым поступающим в продажу очищенным GM-CSF (фирма Biomol). В этих экспериментах использовали hGM-CSF таким же образом, как представлено в описанных ниже биологических анализах. Аффинность к связыванию определяли с помощью программы Biacore, результаты обобщены в таблице 4.
Таблица 4 | |||
Антитело | ka | kd | KD |
EV1003 | 1,05×106±0,01 | 2,15×10-4±0,01 | 203±2 пМ |
EV1019 | 8,13×105±0,19 | 1,21×10-4±0,01 | 152±1 пМ |
EV1018 | 1,11×106±0,03 | 1,44×10-4±0,37 | 112±6 пМ |
EV1018 обладало более высокой аффинностью к связыванию, чем EV1019, и существенно более высокой аффинностью к связыванию, чем EV1003. Все варианты EV1018 обладали аффинностью к связыванию, равной аффинности EV1018 дикого типа.
Кросс-реактивность с GM-CSF из других видов (макак-резус, мышь, обезьяна-игрунка)
Последовательность GM-CSF макака-резус представлена в публичных базах данных (например, GenBank, регистрационный № NP_001028121) и ее применяли для создания экспрессируемого клона, такого как слитый белок Fc. Интродуцировали сайты, расщепляемые протеазами, что позволяет высвобождаться немеченому белку GM-CSF макака-резус. Образовавшийся белок обладал очень высокой биологической активностью (см. следующий раздел), и он распознавался всеми моноклональными антителами к GM-CSF (EV 1018, EV1019, EV1003) при анализе методом вестерн-блоттинга (данные не представлены). Осуществляли оценку с помощью Biacore-анализа (используя такую же схему, что и описанная выше в разделе 1.1), полученные результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5. | |||
Оценка связывания GM-CSF макака-резус и моноклональных антител к GM-CSF | |||
Антитело | ka | kd | KD |
EV1003 | 5,39×105±0,06 | 3,56×10-4±0,04 | 661±14 пМ |
EV1019, партия 1 | 2,91×105±0,23 | 2,14×10-4±0,01 | 739±57 пМ |
EV1019, партия 2 | 3,04×105±0,13 | 1,65×10-4±0,17 | 543±34 пМ |
EV1018 | 5,56×105±0,52 | 2,11×10-4±0,06 | 381±16 пМ |
Во всех вариантах кросс-реактивность с GM-CSF макака-резус оказалась очень высокой (все моноклональные антитела к GM-CSF распознавали белок GM-CSF макака-резус всего лишь примерно в 2-3 раза хуже, чем hGM-CSF). Таким образом, макак-резус является очень хорошей моделью примата кроме человека для создания описанных моноклональных антител к GM-CSF.
Осуществляли анализы с использованием мышиного GM-CSF (фирмы PeproTech и Biomol; например, GenBank, регистрационный № NP_034099) и полученные результаты обобщены в таблице 6.
Таблица 6. | |||
Оценка связывания мышиного GM-CSF и моноклональных антител к GM-CSF | |||
Антитело | ka | kd | KD |
EV1003 | Н/о | Н/о | Н/о |
EV1019 | 1,1×105±0,1 | 6×10-3±2 | 62±27 нМ |
EV1018 | 1,9×105±0,2 | 3,4×10-2±1,7 | 193±60 нМ |
Во всех вариантах кросс-реактивность с мышиным GM-CSF оказалась очень низкой. Эти данные являются основой для экспериментов, целью которых является идентификация эпитопа hGM-CSF, с которым связываются моноклональные антитела к GM-CSF, в которых создавали белок GM-CSF, являющийся гибридом мышиного и человеческого GM-CSF.
Создавали экспрессионный клон GM-CSF обезьяны-игрунки (например, GenBank, регистрационный № B0KWQ4, несущий метионин в положении 53 и пролин в положении 109) подобно созданию описанного выше экспрессионного клона GM-CSF макака-резус. Очищенный белок применяли для Biacore-анализов и полученные результаты обобщены в таблице 7.
Таблица 7. | |||
Оценка связывания GM-CSF обезьяны-игрунки и моноклональных антител к GM-CSF | |||
Антитело | ka | kd | KD |
EV1003 | Н/о | Н/о | Н/о |
EV1019 | 2,1×105±0,1 | 2,14×10-4±0,01 | 1,4±0,1 нМ |
EV1018 | 3,64×105±0,01 | 7,6×10-4±0,3 | 2,1±0,1 нМ |
Кросс-реактивность с GM-CSF обезьяны-игрунки является значительной. Все моноклональные антитела к GM-CSF распознавали белок GM-CSF обезьяны-игрунки примерно в 18-19 раз хуже, чем hGM-CSF. Также как и в случае макака-резус обезьяны-игрунки являются очень хорошими животными-моделями для создания описанных моноклональных антител к GM-CSF.
Пример 12. Биологическая активность: нейтрализация биоактивности GM-CSF
Анализ пролиферации TF-1 (GM-CSF человека, макака-резус, обезьяна-игрунка)
Пролиферация человеческих TF-1-клеток зависит от факторов роста. Эта линия клеток рассматривается в данной области, как очень хорошая основа для изучения биологического действия факторов роста.
При создании изобретения применяли рекомбинантный GM-CSF (rGM-CSF) различных видов, такой как (I) рекомбинантный hGM-CSF (rhGM-CSF) из hGM-CSF, экспрессируемого в Е.coli (фирма Biomol, №2514), с помощью стандартных методов, хорошо известных в данной области, или (II) рекомбинантный GM-CSF макака-резус (rrGM-CSF) из GM-CSF макака-резус (например, GenBank, регистрационный №. NP_001028121), или (III) рекомбинантный GM-CSF обезьяны-игрунки (rmGM-CSF) из GM-CSF обезьяны-игрунки (например, GenBank, регистрационный №. B0KWQ4, несущий метионин в положении 53 и пролин в положении 109), оба экспрессировали в клетках линии HEK 293 с помощью стандартных методов, хорошо известных в данной области.
TF-1-клетки выращивали в среде для культуры клеток RPMI 1640 (каталожный №31870, фирма Gibco), 1× глутамакс 100× (каталожный №35050-038, фирма Gibco), 1 мМ пируват натрия, 100 мМ (каталожный №11360-039, фирма Gibco)), 10 мМ Hepes, 1M (каталожный №15690-056, фирма Gibco), 10% FCS (каталожный №10500-064, фирма Gibco), 2 нг/мл rGM-CSF, (каталожный №200-005b, фирма ReliaTech GmbH). Клетки отмывали трижды ЗФР и высевали в 96-луночные планшеты (каталожный №167008, фирма Nunc) в среду для анализа (среда для культуры клеток без rGM-CSF) в концентрации 1×105 клеток/мл. Раствор антитела и раствор GM-CSF разводили средой для разведения (среда для культуры клеток без FCS и без rGM-CSF) и добавляли в объеме 10 мкл соответственно. Клетки инкубировали в течение 3 дней при 37°С и 5% CO2 в увлажняющей камере. Оценивали жизнеспособность клеток, добавляя 20 мкл MTS, и оценивали оптическую плотность при 492 нм согласно прилагаемой к набору инструкции (CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, фирма Promega, каталожный № G3581). В качестве отрицательного контроля использовали TF-1-клетки, выращенные в среде для культуры клеток, не содержащей rGM-CSF. В качестве положительного контроля использовали TF-1-клетки, выращенные в среде для культуры клеток, содержащей rGM-CSF в концентрации, соответствующей ED80.
До оценки нейтрализующей активности антител определяли значения ED80, характеризующие стимуляцию пролиферации, с использованием GM-CSF человека, макака-резус и обезьяны-игрунки (таблица 8). GM-CSF человека и макака-резус обладали способностью очень эффективно стимулировать пролиферацию TF-1 (ED80[человек]: 1,5 нг/мл; ED80[макак-резус]: 7 нг/мл), однако GM-CSF обезьяны-игрунки оказался весьма неэффективным стимулятором пролиферации TF-1. Таким образом, человеческую клеточную линию TF-1 можно применять для оценки нейтрализующей активности в отношении GM-CSF человека и макака-резус, однако она является непригодной для оценки GM-CSF, полученного из организма обезьян-игрунок.
Таблица 8. | ||
Значения ED80 для GM-CSF человека, макака-резус и обезьяны-игрунки в анализе пролиферации TF-1 | ||
Вид | GM-CSF | ED80 |
Человек | rhGM-CSF (из Е.coli) | 1,5 нг/мл |
Макак-резус | rrGM-CSF (из HEK-клеток) | 7 нг/мл |
Игрунка | rmGM-CSF (из HEK-клеток) | 1 мкг/мл |
Значения IC50 антител определяли при концентрациях, соответствующих ED80.
На фиг.8А и 8Б на y-оси жизнеспособность TF-1-клеток в положительном контроле принимали за 100%, а жизнеспособность TF-1-клеток в отрицательном контроле принимали за 0%.
Применяли также антитело с известной нейтрализующей активностью, такое как поступающее в продажу крысиное антитело к hGM-CSF изотипа IgG2a (BVD2-23B6, фирма BD Pharmingen, №554501) (таблица 9). Для применяемого в качестве контроля изотипа крысиного IgG2a (R35-95, фирма BD, №554687) не обнаружено способности ингибировать пролиферацию клеток (данные не представлены).
Установлено, что EV1018 и EV1019 обладали очень высокой нейтрализующей активностью в отношении человеческого рекомбинантного GM-CSF. Антитело EV1018 превышало по нейтрализующей активности BVD2-23В6.
Тяжелая цепь EV1018 в естественных условиях содержит сайт N-гликозилирования внутри каркасного участка 3. Например, в последовательности SEQ ID NO: 10 он соответствует остаткам 95-97. Далее создавали варианты тяжелой цепи EV1018 и оценивали их нейтрализующую активность. Как видно из таблицы 9, полученные результаты свидетельствуют о том, что биологическая активность EV1018 сохранялась после удаления N-связанного сайта гликозилирования в каркасном участке 3 тяжелой цепи. В таблице 9 представлены значения IC50 для двух вариантов последовательностей без сайта гликозилирования (EV1018 вариант 1 и 2), обозначенных как N95K и Т97 соответственно, в сравнении с EV1018, имеющим тяжелую цепь дикого типа, содержащую сайт N-гликозилирования. Значение IC50 для каждого очищенного IgG определяли с помощью TF-1-анализа, в целом, как описано выше. Результаты, полученные в экспериментах, проведенных с другими вариантами EV1018, сопоставимы с результатами, полученными с использованием EV1018.
Таблица 9. | ||
Сравнение значений IC50 в анализе пролиферации TF-1-клеток. Результаты представлены в нг/мл и в пМ (принимая, что молекулярная масса антител составляет 150 кДа) | ||
Антитело | IC50 в отношений UGM-CSF | IC50 в отношении GM-CSF макака-резус |
EV1018 | 2,3 нг/мл | 1,7 нг/мл |
легкая цепь SEQ ID NO: 34 | 15 пМ | 11 пМ |
тяжелая цепь SEQ ID NO: 10 | ||
EV1019 | 5,7 нг/мл | 2,8 нг/мл |
легкая цепь SEQ ID NO: 202 | 38 пМ | 19 пМ |
тяжелая цепь SEQ ID NO: 160 |
EV1003 | 71,1 нг/мл | 6,6 нг/мл |
легкая цепь SEQ ID NO: 321 | 474 пМ | 44 пМ |
тяжелая цепь SEQ ID NO: 320 | ||
BVD2-23B6 | 5,3 нг/мл 35 пМ | 38 нг/мл 253 пМ |
EV1018 вариант 1 | 32 пМ | |
легкая цепь SEQ ID NO: 35 | ||
тяжелая цепь SEQ ID NO: 11 | ||
EV1018 вариант 2 | 33,3 пМ | |
легкая цепь SEQ ID NO: 35 | ||
тяжелая цепь SEQ ID NO: 16 |
В экспериментах с использованием рекомбинантного GM-CSF макака-резус установлено, что моноклональные антитела EV1018, EV1019 и EV1003 обладали существенно более высокой нейтрализующей активностью, чем крысиное антитело BVD2-23B6. Однако в обоих типах экспериментов EV1018 значительно превышало по активности все изученные антитела. Все варианты EV1018 обладали такой же нейтрализующей активностью, что и EV1018 дикого типа.
В серии экспериментов, результаты которых представлены в таблице 9, применение поступающего в продажу крысиного антитела к человеческому GM-CSF изотипа IgG2a BVD2-21C11 (фирма BD, №554503) оказалось невозможным, поскольку при применении rGM-CSF в концентрациях, соответствующих ED80, т.е. в дозе 1,5 нг/мл, не были получены значимые результаты. Для изучения антитела 21С11 необходимы более низкие дозы rGM-CSF, представленные ниже в таблице 10.
Сравнение эффективности антител в различных лабораториях невозможно осуществлять только на основе сравнения значений IC50, поскольку значения IC50 в значительной степени зависят от условий проведения анализа, например, от количества используемого стимула. Более надежное сравнение можно проводить на основе сопоставления соотношений, например, значений IC50, полученных в описанном выше анализе на TF-1-клетках, но с применением различных указанных доз rGM-CSF, между стандартным антителом и представляющим интерес антителом. Например, в WO 2006/122797 (таблица 8, сс.56 и 57) описано, что наиболее эффективное из указанных в этом документе антител в 35 раз превышает по активности поступающее в продажу крысиное антитело к человеческому GM-CSF, клон BVD2-21C11. Соотношение значений IC50 между поступающим в продажу моноклональным антителом к человеческому GM-CSF, клон BVD2-21C11 и EV1018 составляет 413. Таким образом, по сравнению с поступающим в продажу стандартом нейтрализующая активность EV1018 примерно в 10 раз выше, что видно из данных, представленных в таблице 10. Это является неожиданным, поскольку как описано в WO 2006/122797 и является известным в данной области, нейтрализующая активность моноклонального антитела к GM-CSF значительно коррелирует с его аффинностью к связыванию с GM-CSF (WO 2006/122797, данные о повышенной аффинности к связыванию представлены в таблице 4 на с.50 коррелируют с повышенной нейтрализующей способностью, данные о которой представлены в таблицах 6 и 7 на сс.52-54).
Сравнивая аффинность к связыванию MOR04357 (WO 2006/122797, таблица 4, с.50: аффинность к связыванию составляет 7 пМ для MOR-04357-Fab) с аффинностью к связыванию EV1018, при создании изобретения установлено, что EV1018 связывается с GM-CSF примерно в 16 менее эффективно, чем MOR04357. Однако нейтрализующая активность EV1018 в 10 раз выше, чем у MOR04357, что свидетельствует о том, что нейтрализующая активность не обязательно коррелирует с аффинностью к связыванию с GM-CSF.
Таблица 10. | ||||
Относительные нейтрализующие активности, полученные в анализах на TF-1-клетках, EV1018 и известного из прототипа антитела Строки 1 и 2: данные из WO 2006/122797, таблица 8, сс.56 и 57, строки 3 и 4: данные, полученные при создании настоящего изобретения | ||||
TF-1-анализ hGM-CSF (E.coli) [пМ] | Условия анализа, конечная концентрация GM-CSF | Соотношение: референс-антитело и представляющее интерес антитело | ||
1 | Референс-Ат BVD2-21C11 | 1668 | 0,25 нг/мл | |
2 | MOR04357(IgG1) | 48 | 0,25 нг/мл | 35 |
3 | Референс-Ат BVD2-21C11 (фирма BD, №554503) | 8260 | 1,0 нг/мл | |
4 | EV1018 | 20 | 1,0 нг/мл | 413 |
Анализ секреции IL-8 на Ц937-клетках (GM-CSF человека и макака-резус)
IL-8 представляет собой провоспалительный цитокин. Он является имеющим решающее значение фактором при связанном с нейтрофилами воспалении и принимает участие в большинстве воспалительных реакций. Клетками-мишенями активности GM-CSF являются клетки миелоидной клеточной линии. Клеточная линия премоноцитов U937 представляет собой линию миелоидного происхождения и секретирует провоспалительный цитокин IL-8 после стимуляции GM-CSF.
U937 (АТСС: CRL-1593.2) выращивали в среде для культуры клеток (RPMI 1640 (каталожный №31870, фирма Gibco), 1× глутамакс 100× (каталожный №35050-038, фирма Gibco), 10% FCS (каталожный №10500-064, фирма Gibco), 1% PenStrep (пенициллин/стрептомицин)). Высевали 100 мкл клеточной суспензиии, содержащей 1×105 клеток/мл, и добавляли 10 мкл раствора антитела и 10 мкл раствора GM-CSF. Клетки инкубировали в течение 24 ч при 37°С и 5% CO2 в увлажняющей камере. Уровни цитокина IL-8 определяли с помощью набора OptEIA Human IL-8 Elisa Set (фирма BD Bioscience, каталожный №555244).
В качестве отрицательного контроля использовали U937-клетки, выращенные в среде для культуры клеток без антител и без GM-CSF, а в качестве положительного контроля использовали U937-клетки, выращенные в среде для культуры клеток, содержащей rGM-CSF в концентрации, соответствующей ED80, без добавления раствора антитела. Определяли концентрацию, соответствующую ED80, для GM-CSF человека и макака-резус (таблица 9) и эту концентрацию использовали для определения значений IC50 для различных моноклональных антител к GM-CSF (таблица 11).
Таблица 11. | |
Определение значений ED80, характеризующих секрецию IL-8 в U937-клетках | |
GM-CSF | ED80 |
Человеческий (из Е.coli, | 1,2 нг/мл |
фирма Biomol, №2514) | |||
Макак-резус (из HEK-клеток, получено при создании изобретения) | 5,0 нг/мл | ||
Таблица 12. | |||
Сравнение значений IC50 в анализе секреции IL-8 на U937-клетках. Результаты представлены в нг/мл и в пМ (принимая, что молекулярная масса антител составляет 150 кДа) | |||
Антитело | IC50 в отношении hGM-CSF | IC50 в отношении GM-CSF макака-резус | |
EV1018 | 0,9 нг/мл 6 пМ | 0,8 нг/мл 5,6 пМ | |
EV1019 | 4,7 нг/мл 31,3 пМ | 2,4 нг/мл 16 пМ | |
EV1003 | 14,6 нг/мл 97,3 пМ | 1,7 нг/мл 11,5 пМ | |
BVD2-23B6 | 3,5 нг/мл 23,3 пМ | 45 нг/мл 300 пМ |
При оценке с помощью этого клеточного анализа установлено, что все три антитела обладали очень высокой нейтрализующей активностью в отношении человеческого GM-CSF, а также GM-CSF макака-резус. EV1018 обладало более высокой нейтрализующей активностью, чем EV1019, и существенно более высокой нейтрализующей способностью, чем EV1003. Для всех вариантов EV1018 обнаружена нейтрализующая активность того же уровня, что и активность EV1018 дикого типа.
Пример 13. Индукция поверхностных молекул CD11b/Mac1.
Гранулоциты представляют собой подпопуляцию клеток миелоидной линии, и они представляют собой клетки-мишени биологической активности GM-CSF. Помимо других эффекторных функцией GM-CSF индуцирует адгезионную молекулу (маркер межклеточной адгезии) CD11b/Мас1 на поверхности гранулоцитов. Индукция CD11b/Mac1 на поверхности клеток миелоидной клеточной линии представляет собой имеющую решающее значение стадию в миграции клеток из периферической крови к воспаленной ткани. У пациентов, страдающих хроническим воспалительным заболеванием дыхательных путей, таких как ХОЗЛ и астма, присутствуют повышенные количества гранулоцитов в мокроте и жидкости бронхоальвеолярного лаважа. Поэтому эффективность антител к GM-CSF оценивали путем определения опосредуемой GM-CSF индукции маркера адгезии CD11b/Mac1 на первичных человеческих гранулоцитах.
80 мкл периферической крови, взятой от здоровых доноров, со сниженной свертываемостью инкубировали в течение 15 мин при 37°C с моноклональными антителами к GM-CSF или применяемым в качестве контроля изотипа антителом (человеческий IgG, № I-2511; фирма Sigma-Aldrich) (положительный контроль), предварительно инкубированными в течение 20 мин с rhGM-CSF (конечная концентрация 30 пМ) (фирма Biomol, №2514). Для создания отрицательного контроля инкубировали кровь со сниженной свертываемостью в течение 15 мин при 37°C с применяемым в качестве контроля изотипа антителом, предварительно инкубированным с ЗФР, 0,1% БСА в течение 20 мин.
Для количественной оценки экспрессии CD11b/Мас1 применяли антитело к CD11b, меченное фикоэритином (фирма Pharmingen; каталожный №333142), согласно инструкциям поставщика. В целом, метод состоял в следующем: 20 мкл раствора антитела к CD11b добавляли к клеткам, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Эритроциты (красные клетки крови) лизировали, добавляя 2 мл раствора для лизиса (фирма BD; каталожный №349202), и инкубировали в течение еще 10 мин при комнатной температуре в темноте. После двух стадий отмывки ЗФР, 0,1% БСА лейкоциты суспендировали в 500 мкл Cellfix (фирма BD; каталожный №340181). Для анализа применяли проточный цитометр LSRII и программу DIVA6.1.1 для анализа результатов, полученных с помощью FACS (оба фирмы BD). Выделяли гейт популяции клеток гранулоцитов на точечной диаграмме с использованием прямого и бокового светорассеяния и принимали за 100%. Использовали 30 пМ rhGM-CSF для стимуляции CD11b/Мас1 на поверхности гранулоцитов. Установлено, что применение EV1018 в концентрации 67 пМ достаточно для полной блокады индукции CD11b/Мас1 GM-CSF.
Эти результаты свидетельствуют о том, что EV1018 эффективно нейтрализует биологическую активность GM-CSF в контексте, очень важном для воспалительных процессов, включающих повышенные количества гранулоцитов, типа ХОЗЛ и астмы.
Пример 14. Легочное воспаление после воздействия сигаретного дыма на мышей линии C57BL/6J
Сигаретный дым является фактором, имеющим решающее значение для развития ХОЗЛ. Продолжительное воздействие сигаретного дыма на животных различных видов, например, на крыс и мышей, вызывает патофизиологически значимые анатомические повреждения, сопоставимые с заболеванием у человека (Fujita и Nakanishi 2007). Одним из важных проявлений ХОЗЛ является хронический бронхит, характеризующийся повышенным количеством нейтрофилов и макрофагов в легком. Для доказательства того, что GM-CSF играет имеющую решающее значение роль в индуцируемом курением притоке клеток в легкое, проводили исследование с применением моноклональных антител к GM-CSF на созданной на мышах модели долговременного воздействия сигаретного дыма.
Мышей (линия C57BL/6J, вес 18-23 г) подвергали воздействию сигаретного дыма в течение 4 дней. Мышей подвергали воздействию 6 сигарет в день 1 и 2, 8 сигарет в день 3 и 10 сигарет в день 4. Животных подвергали воздействию дыма от каждой сигареты в течение 16 мин, после чего их обрабатывали в течение 8 мин свежим воздухом. После каждой второй сигареты делали дополнительный перерыв на 24 мин, при этом проводили обработку свежим воздухом. Мыши, которых не подвергали воздействию сигаретного дыма, служили в качестве отрицательного контроля.
Животным вводили внутрибрюшинно (i.p.) крысиное антитело к мышиному GM-CSF изотипа IgG2a, 300 мкг (клон MPI-22E9, фирма eBioScienses, №16-7331) или антитело соответствующего изотипа, 300 мкг (крысиный IgG2a, фирма eBioSciences, №16-4321), или наполнитель, 300 мкл (ЗФР, 10 мМ NaCl) за 2 ч до начала протокола обработки сигаретным дымом в день 1 и в день 3. Через 18 ч после последней экспозиции животных умерщвляли и легкие промывали, используя 2×0,8 мл раствора Хэнкса с ЭДТК. Бронхоальвеолярную лаважную жидкость (БАЛЖ) разделяли центрифугированием на клеточный дебрис и супернатант. Определяли миелопероксидазную (МРО) активность в дебрисе в качестве параметра, характеризующего приток миелоидных клеток. По 500 мкл образцов лаважной жидкости центрифугировали при 485 × g, при 4°С в течение 10 мин. Дебрис ресуспендировали в 200 мкл 0,5-ного бромида гексадецилтриметиламмония (НТАВ). По 50 мкл суспензий переносили в 96-луночный титрационный микропланшет. В каждую лунку добавляли по 250 мкл раствора субстрата (50 мМ KH2PO4, 5 мМ Na2HPO4, 0,2 мг/мл дигидрохлорида о-дианизидина, 0,2 мкл/мл H2O2) для инициации ферментативной реакции. Определяли экстинкцию при длине волны 450 нм в течение 90 с. Миелопероксидазную (МРО) активность рассчитывали в течение стационарной стадии ферментативной реакции. Активность выражали в миллиединицах активности в мин (мAU/мин).
Цитокины МСР-1 и MIP-1 α определяли в супернатантах БАЛЖ путем многократного исследования аналита на проточном цитометре (тип LSR II, фирма Becton Dickinson). Анализ осуществляли согласно инструкциям фирмы Bender MedSystems (Flow Cytomix). В целом, метод состоял в следующем 25 мкл супернатанта БАЛЖ смешивали с 25 мкл 1 × буфера для анализа (набор Basic Kit BMS8440FF), 25 мкл смеси гранул (смесь МСР-1 и MIP-1a Simplex Kits, BMS86005FF, BMS86013FF) и 50 мкл смеси биотин-конъюгат (входит в наборы Simplex Kits) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре на шейкере для микропланшетов при 500 об/мин. После двукратной отмывки буфером для анализа гранулы повторно растворяли в 100 мкл буфера для анализа и добавляли 50 мкл раствора стрептавидин-РЕ (фосфатидилэтаноламин, входит в набор Basic Kit). Гранулы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере для микропланшетов при 500 об/мин. Гранулы отмывали дважды буфером для анализа. Гранулы повторно растворяли в 500 мкл буфера для анализа и анализировали с помощью проточной цитометрии, используя программу FlowCytomix Pro 2.2 фирмы Bender MedSystems. Для количественной оценки готовили серийные разведения стандарта (входит в состав наборов Simplex Kits) согласно инструкциям поставщика (фирма Bender MedSystems). Концентрации цитокинов определяли на основе стандартов.
После предварительной обработки мышей антителом к GM-CSF активность МРО снижалась примерно на 25% (фиг.9А). С этими результатами согласуются данные о том, что уровень цитокинов МСР-1 и MIP-1a снижался примерно на 18% и 23% соответственно (фиг.9Б).
Результаты, представленные на фиг.9А и фиг.9Б, демонстрируют, что GM-CSF играет решающую роль в индуцированном сигаретным дымом воспалении и что нейтрализация GM-CSF может существенно снижать клеточную инфильтрацию и уровень воспалительных цитокинов, которые индуцируются при продолжительным воздействии сигаретного дыма на мышей.
Пример 15. Картирование эпитопов hGM-CSF
Оценивали пептидные массивы, содержащие пептиды GM-CSF мыши, человека, макака-резус и обезьяны-игрунки, с целью идентификации конкретной(ых) линейной(ых) последовательности(ей) в GM-CSF в качестве эпитопа, распознаваемого рассматриваемыми антителами.
Оценивали следующие антитела: BIBH1 (неродственное гуманизированное антитело изотипа IgG1, распознающее FAP, в качестве отрицательного контроля (см. US 20030103968, озаглавленный «Use of FAP alpha specific antibody BIBH1 in the treatment of cancer» («Применение специфического в отношении FAP альфа антитела BIBH1 для лечения рака»)) (http://www.asco.org/ASCO/Abstracts+&+Virtual+Meeting/Abstracts?&vmview=abst_detail_view&confID=10&abstractID=1028), а также антитела EV1018, EV1019 и EV1003.
Результаты, полученные с использованием пептидных массивов, свидетельствуют о том, что не выявлено специфическое связывание, превышающее уровни, обнаруженные при использовании антитела, которое применяли в качестве отрицательного контроля, в то время как иммобилизованный GM-CSF и применяемый в качестве положительного контроля человеческий IgG давали сильный сигнал. Исходя из того, что распознавался правильно уложенный GM-CSF, но не распознавался ни один из выведенных из GM-CSF пептидов, при создании изобретения было высказано предположение о том, что тестируемые антитела к GM-CSF распознают нелинейный(ые) или специфический(ие) для конформации эпитоп(ы). Это противоречит данным, полученным для некоторых других описанных в литературе антител к GM-CSF (например, описанным в WO 2007/092939).
Применяли следующий метод:
Синтезировали на заказ массивы, которые были помещены на стеклянные слайды на фирме JPT (Берлин, Германия). Массивы блокировали с помощью ЗФР+1% БСА+0,1% Твин 20 в течение 3 ч при комнатной температуре при осторожном встряхивании. Антитела разводили до концентрации 5 мкг/мл в буфере для зондирования (ЗФР, 5 мМ MgCl2, 0,5 мМ ДТТ, 0,05% Тритон Х-100, 5% глицерина, 1% БСА) и инкубировали с массивами при 4°С в течение 1-2 ч. Затем массивы отмывали трижды буфером для зондирования (каждый раз по 1 мин на льду) и затем инкубировали с меченным с помощью Су5 козьим античеловеческим IgG (0,5 мкг/мл) в течение 1 ч при 4°С. Их вновь промывали согласно описанному выше методу, сушили центрифугированием (800 × g) и сканировали с использованием сканера для микромассивов типа Perkin-Elmer Proscan, снабженным постоянным фотоумножителем (РМТ) с набором фильтров для Су5.
Осуществляли также эпитопное картирование путем замены ортологов. Поскольку тестируемые антитела распознают конформационный или прерывистый эпитоп, то соответствующий эпитоп можно определять только в контексте правильно уложенного GM-CSF. Как видно из результатов, полученных с помощью описанного выше Biacore-анализа, рассматриваемые антитела связываются лишь очень слабо, если связывание вообще имеет место, с мышиным GM-CSF. Поэтому при создании изобретения создавали химерные версии GM-CSF, в которых отобранные области человеческого GM-CSF заменяли соответствующей мышиной последовательностью. Поскольку человеческий и мышиный GM-CSF, вероятно, обладают сходными трехмерными структурами, но идентичными только на 73%, химерные белки должны сохранять правильную укладку GM-CSF, что отличает этот метод от сканирования аланином (замена на полиаланиновые участки), который может влиять на укладку белка. Химеры, в которых эпитоп или его часть заменены на мышиные последовательности, должны терять свою способность связываться с рассматриваемым антителом (или связываться в меньшей степени). Повторное картирование последовательностей на известной трехмерной структуре человеческого GM-CSF, позволяет реконструировать пространственную локализацию аминокислот, из которых состоит эпитоп. Аминокислоты, являющиеся консервативными для человеческого и мышиного GM-CSF, нельзя анализировать этим методом.
Были созданы 11 различных химер, в которых 7 линейных пептидных последовательностей были заменены индивидуально и в сочетании. В каждой химере аминокислоты мышиного GM-CSF обозначены жирным шрифтом. Предсказанные сайты N-связанного гликозилирования, которые являются разными в различных химерах, подчеркнуты. Каждую химеру экспрессировали в НЕК 293-клетках в виде кроличьего Fc-связанного белка, что позволяет осуществлять очистку и количественное определение по кроличьему Fc-фрагменту. Контрольный вестерн-блотттинг со слитыми белками, для которого использовали антитело к кроличьему Fc, продемонстрировал, что в гели внесено идентичное количество различных химерных белков GM-CSF. Сдвиг подвижности между различными химерами являлся результатом различий в гликозилировании между человеческим и мышиным GM-CSF.
Вестерн-блоттинг химер GM-CSF с использованием EV1003 позволил установить, что для химер 3, 6, 9 и 10 характерно небольшое связывание или отсутствие связывания. Химера 9 представляет собой комбинацию химер 3 и 6, а химера 10 представляет собой комбинацию химер 2 и 6. Таким образом, все химеры, содержащие мышиные аминокислоты в положениях, в которых они присутствуют в химерах 3 и 6 или в комбинациях, содержащих одну или обе эти области, перестают распознаваться EV1003. Таким образом, они представляют собой эпитоп EV1003. Пространственное картирование химер 3 и 6 на 3-мерной кристаллической структуре GM-CSF продемонстрировало, что эти химеры расположены по соседству друг с другом на поверхности молекулы GM-CSF, что очень хорошо согласуется с этими результатами. Указанная поверхность представляет собой прерывистый эпитоп, распознаваемый EV1003.
Вестерн-блоттинг химер GM-CSF с использованием EV1019 позволил установить, что для химер 4, 5 и 11 характерно слабое связывание, в то время как для химеры 8 продемонстрировано практически полное отсутствие связывания. Химера 11 представляет собой комбинацию химер 1 и 5, а химера 8 представляет собой комбинацию химер 4 и 5. Таким образом, все химеры, содержащие мышиные аминокислоты в положениях, в которых они присутствуют в химерах 4 и 5, характеризуются слабым связыванием с EV1019. Химера 8, которая содержит комбинацию мышиных аминокислот в положениях в которых они присутствуют в химерах 4 или 5, перестает распознаваться EV1019. Таким образом, комбинация химер 4 и 5 представляет собой эпитоп EV1019. Пространственное картирование химер 4 и 5 на 3-мерной кристаллической структуре GM-CSF продемонстрировало, что эти химеры расположены по соседству друг с другом на поверхности молекулы GM-CSF, что очень хорошо согласуется с этими результатами. Указанная поверхность представляет собой прерывистый эпитоп, распознаваемый EV1019. Поскольку обе области необходимы для высокоаффинного связывания EV1019, то прерывистый эпитоп должен состоять из аминокислот, которые представлены в вариантах 4 и 5, которые лежат в непосредственной близости друг к другу и находятся на одной или близкой поверхности (и поэтому затрагивают «выставленные» на поверхности аминокислотные остатки) GM-CSF. Эти аминокислоты представляют собой 60-63 (ELYK) и 78-87 (TMMASHYKQH) (SEQ ID NO:3) соответственно. Возможно участие в этом также аминокислоты 76 (Р). Маловероятно, что аминокислоты 68-69 (SL) в химере 4 играют важную роль в связывании эпитопа из-за большого расстояния от поверхности раздела между химерми 4 и 5, однако это нельзя полностью исключать.
Вестерн-блоттинг химер GM-CSF с использованием EV1018 позволил установить, что для химер 4, 5 и 11 характерно слабое связывание, в то время как для химеры 8 продемонстрировано практически полное отсутствие связывания. Химера 11 представляет собой комбинацию химер 1 и 5, а химера 8 представляет собой комбинацию химер 4 и 5. Таким образом, все химеры, содержащие мышиные аминокислоты в положениях, в которых они присутствуют в химерах 4 или 5, характеризуются слабым связыванием с EV1018. Химера 8, которая содержит комбинацию мышиных аминокислот в положениях, в которых они присутствуют в химерах 4 или 5, перестает распознаваться EV1018. Таким образом, комбинация химер 4 и 5 представляет собой эпитоп EV1018. Пространственное картирование химер 4 и 5 на 3-мерной кристаллической структуре GM-CSF продемонстрировало, что эти химеры расположены по соседству друг с другом на поверхности молекулы GM-CSF, что очень хорошо согласуется с этими результатами. Указанная поверхность представляет собой прерывистый эпитоп, распознаваемый EV1018. Поскольку обе области необходимы для высокоаффинного связывания EV1018, прерывистый эпитоп должен состоять из аминокислот, которые представлены в вариантах 4 и 5, которые лежат в непосредственной близости друг к другу и находятся на одной или близкой поверхности (и поэтому затрагивают «выставленные» на поверхности аминокислотные остатки) GM-CSF. Эти аминокислоты представляют собой «ELYK» и «TMMASHYKQH» соответственно.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что EV1018 и EV1019 распознают один и тот же прерывистый эпитоп молекулы GM-CSF, a EV1003 распознает эпитоп в молекуле GM-CSF, отличный от эпитопа, распознаваемого EV1018 и EV1019.
Claims (26)
1. Выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат:
(а) тяжелую цепь, включающую VH-CDR1-содержащую последовательность, VH-CDR2-содержащую последовательность и VH-CDR3-содержащую последовательность, в которых:
(I) VH-CDR1-содержащая последовательность представляет собой SYGMH (SEQ ID NO:4),
(II) VH-CDR2-содержащая последовательность представляет собой LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5), и
(III) VH-CDR3-содержащая последовательность представляет собой ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6); и
(б) легкую цепь, включающую VL-CDR1-содержащую последовательность, VL-CDR2-содержащую последовательность и VL-CDR3-содержащую последовательность, в которых:
(I) VL-CDR1-содержащая последовательность представляет собой IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7),
(II) VL-CDR2-содержащая последовательность представляет собой GRSPPS (SEQ ID NO: 8) и
(III) VL-CDR3-содержащая последовательность представляет собой STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9).
(а) тяжелую цепь, включающую VH-CDR1-содержащую последовательность, VH-CDR2-содержащую последовательность и VH-CDR3-содержащую последовательность, в которых:
(I) VH-CDR1-содержащая последовательность представляет собой SYGMH (SEQ ID NO:4),
(II) VH-CDR2-содержащая последовательность представляет собой LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5), и
(III) VH-CDR3-содержащая последовательность представляет собой ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6); и
(б) легкую цепь, включающую VL-CDR1-содержащую последовательность, VL-CDR2-содержащую последовательность и VL-CDR3-содержащую последовательность, в которых:
(I) VL-CDR1-содержащая последовательность представляет собой IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7),
(II) VL-CDR2-содержащая последовательность представляет собой GRSPPS (SEQ ID NO: 8) и
(III) VL-CDR3-содержащая последовательность представляет собой STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9).
2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где связывание антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с человеческим GM-CSF характеризуется значением KD, составляющим менее 400 пМ.
3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент нейтрализует активность hGM-CSF, при этом значение IC50 для антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет менее 100 пМ при определении с помощью анализа пролиферации TF-1-клеток при концентрации, соответствующей ED80.
4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, тяжелая цепь которого выбрана из группы, включающей гамма 1 (γ1), гамма 2 (γ2), гамма 3 (γ3) и гамма 4 (γ4).
5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.4, где тяжелая цепь представляет собой гамма 1-цепь (γ1).
6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.4, где легкая цепь представляет собой легкую лямбда-цепь.
7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из пп.1-6, где тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 51.
8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.7, где тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51.
9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из пп.1-8, где легкая цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36.
10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пп.1-6, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 348 или SEQ ID NO: 361, и где последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 365.
11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.10, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 361.
12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из пп.1-6, где последовательность тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 51, и где последовательность легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 36.
13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где последовательность тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 51.
14. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или нарушения, связанных со сверхэкспрессией hGM-CSF, содержащая терапевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по одному из пп.1-13 и фармацевтически приемлемый носитель.
15. Фармацевтическая композиция по п.14, предназначенная для применения в качестве лекарственного средства.
16. Фармацевтическая композиция по п.14, предназначенная для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного со сверхэкспрессией hGM-CSF у индивидуума.
17. Набор, представляющий собой лекарственное средство для лечения заболевания или нарушения, связанных со сверхэкспрессией hGM-CSF, который содержит: (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из пп.1-13 и (б) один или несколько контейнеров, содержащий(их) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
18. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из пп.1-13.
19. Выделенная нуклеиновая кислота по п.16, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.
20. Экспрессионный вектор, содержащий ДНК по п.19.
21. Клетка-хозяин для экспрессии моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-13, содержащая вектор по п.20, где вектор представляет собой экспрессионный вектор.
22. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из пп.1-13, предназначенные для применения в качестве лекарственного средства.
23. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из пп.1-13, предназначенные для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного со сверхэкспрессией hGM-CSF у индивидуума.
24. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.23, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму в дозе, не превышающей 500 мг.
25. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.23 или 24, где заболевание или нарушение выбрано из группы, включающей хроническое обструктивное заболевание легких ХОЗЛ, астму, бронхиальную астму, педиатрическую астму, серьезную астму, острые приступы астмы и хронический бронхит; муковисцидоз, интерстициальное легочное заболевание, ринит, артрит и родственные артропатии, ревматоидный атрит, псориаз, миелоидный лейкоз и рассеянный склероз.
26. Способ получения моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента по п.1, которое/который связывается с hGM-CSF, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере VH-CDR1-содержащую последовательность, VH-CDR2-содержащую последовательность, VH-CDR3-содержащую последовательность, VL-CDR1-содержащую последовательность, VL-CDR2-содержащую последовательность и VL-CDR3-содержащую последовательность, в клетке-хозяине, заключающийся в том, что:
(I) получают клетку-хозяина, содержащую по меньшей мере одну последовательность ДНК, которая кодирует по меньшей мере VH-CDR1-содержащую последовательность, VH-CDR2-содержащую последовательность, VH-CDR3-содержащую последовательность, VL-CDR1-содержащую последовательность, VL-CDR2-содержащую последовательность и VL-CDR3-содержащую последовательность, в которых:
VH-CDR1-содержащая последовательность представляет собой SYGMH (SEQ ID NO: 4),
VH-CDR2-содержащая последовательность представляет собой LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5),
VH-CDR3-содержащая последовательность представляет собой ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6),
VL-CDR1-содержащая последовательность представляет собой IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7).
VL-CDR2-содержащая последовательность представляет собой GRSPPS (SEQ ID NO: 8) и
VL-CDR3-содержащая последовательность представляет собой STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9); и
(II) культивируют клетку-хозяина в условиях, пригодных для экспрессии ДНК, и получают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
(I) получают клетку-хозяина, содержащую по меньшей мере одну последовательность ДНК, которая кодирует по меньшей мере VH-CDR1-содержащую последовательность, VH-CDR2-содержащую последовательность, VH-CDR3-содержащую последовательность, VL-CDR1-содержащую последовательность, VL-CDR2-содержащую последовательность и VL-CDR3-содержащую последовательность, в которых:
VH-CDR1-содержащая последовательность представляет собой SYGMH (SEQ ID NO: 4),
VH-CDR2-содержащая последовательность представляет собой LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5),
VH-CDR3-содержащая последовательность представляет собой ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6),
VL-CDR1-содержащая последовательность представляет собой IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7).
VL-CDR2-содержащая последовательность представляет собой GRSPPS (SEQ ID NO: 8) и
VL-CDR3-содержащая последовательность представляет собой STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9); и
(II) культивируют клетку-хозяина в условиях, пригодных для экспрессии ДНК, и получают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007-294945 | 2007-11-13 | ||
JP2007294945 | 2007-11-13 | ||
JPPCT/JP2008/052471 | 2008-02-14 | ||
JP2008052471 | 2008-02-14 | ||
PCT/US2008/012680 WO2009064399A1 (en) | 2007-11-13 | 2008-11-12 | Monoclonal antibodies that bind to hgm-csf and medical compositions comprising same |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013141223/10A Division RU2013141223A (ru) | 2007-11-13 | 2013-09-09 | МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С hGM-CSF, И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ КОМПОЗИЦИИ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2010123693A RU2010123693A (ru) | 2011-12-20 |
RU2517596C2 true RU2517596C2 (ru) | 2014-05-27 |
Family
ID=40329216
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2010123693/10A RU2517596C2 (ru) | 2007-11-13 | 2008-11-12 | МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С hGM-CSF, И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ КОМПОЗИЦИИ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ |
RU2013141223/10A RU2013141223A (ru) | 2007-11-13 | 2013-09-09 | МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С hGM-CSF, И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ КОМПОЗИЦИИ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013141223/10A RU2013141223A (ru) | 2007-11-13 | 2013-09-09 | МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С hGM-CSF, И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ КОМПОЗИЦИИ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ |
Country Status (32)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8679502B2 (ru) |
EP (3) | EP2535353A1 (ru) |
KR (1) | KR20100102108A (ru) |
CN (2) | CN101970489B (ru) |
AR (1) | AR069290A1 (ru) |
AU (1) | AU2008321429A1 (ru) |
BR (1) | BRPI0820530A2 (ru) |
CA (1) | CA2705539A1 (ru) |
CL (1) | CL2008003361A1 (ru) |
CO (1) | CO6382188A2 (ru) |
DK (1) | DK2215119T3 (ru) |
EC (1) | ECSP10010251A (ru) |
ES (1) | ES2401536T3 (ru) |
HK (1) | HK1146729A1 (ru) |
HR (1) | HRP20130204T1 (ru) |
IL (1) | IL205576A0 (ru) |
MA (1) | MA31899B1 (ru) |
ME (1) | ME01005B (ru) |
MX (1) | MX2010005291A (ru) |
NZ (2) | NZ586027A (ru) |
PE (1) | PE20091420A1 (ru) |
PL (1) | PL2215119T3 (ru) |
PT (1) | PT2215119E (ru) |
RS (1) | RS52713B (ru) |
RU (2) | RU2517596C2 (ru) |
SG (1) | SG176499A1 (ru) |
SI (1) | SI2215119T1 (ru) |
TN (1) | TN2010000210A1 (ru) |
TW (2) | TW201206955A (ru) |
UY (1) | UY31466A1 (ru) |
WO (1) | WO2009064399A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201003467B (ru) |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7407955B2 (en) | 2002-08-21 | 2008-08-05 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg | 8-[3-amino-piperidin-1-yl]-xanthines, the preparation thereof and their use as pharmaceutical compositions |
DE102005035891A1 (de) | 2005-07-30 | 2007-02-08 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg | 8-(3-Amino-piperidin-1-yl)-xanthine, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel |
PE20110235A1 (es) | 2006-05-04 | 2011-04-14 | Boehringer Ingelheim Int | Combinaciones farmaceuticas que comprenden linagliptina y metmorfina |
EP2160407A4 (en) * | 2007-05-23 | 2011-07-27 | Crc For Asthma And Airways Ltd | NEUTRALIZING ANTIBODIES |
EP2217626A4 (en) * | 2007-11-12 | 2011-06-22 | Crc For Asthma And Airways Ltd | EPITOP FOR NEUTRALIZING ANTIBODIES |
SI2215119T1 (sl) | 2007-11-13 | 2013-04-30 | Evec Inc. | Monoklonska protitelesa, ki se veĹľejo na hGM-CSF, in medicinski sestavki, ki jih obsegajo |
AR071175A1 (es) | 2008-04-03 | 2010-06-02 | Boehringer Ingelheim Int | Composicion farmaceutica que comprende un inhibidor de la dipeptidil-peptidasa-4 (dpp4) y un farmaco acompanante |
UY32030A (es) | 2008-08-06 | 2010-03-26 | Boehringer Ingelheim Int | "tratamiento para diabetes en pacientes inapropiados para terapia con metformina" |
RU2011113823A (ru) | 2008-09-10 | 2012-10-20 | БЕРИНГЕР ИНГЕЛЬХАЙМ ИНТЕРНАЦИОНАЛЬ ГмбХ (DE) | Комбинированная терапия, предназначенная для лечения диабета и связанных с ним состояний |
RU2630969C2 (ru) | 2008-12-22 | 2017-09-15 | Де Юниверсити Оф Мельбурн | Лечение боли |
ES2886063T3 (es) * | 2008-12-22 | 2021-12-16 | Univ Melbourne | Tratamiento de la artrosis |
EP3725325B1 (en) | 2010-06-24 | 2023-05-31 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Diabetes therapy |
US9034883B2 (en) | 2010-11-15 | 2015-05-19 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Vasoprotective and cardioprotective antidiabetic therapy |
AU2012280267B2 (en) | 2011-07-06 | 2016-04-21 | Morphosys Ag | Therapeutic combinations of anti-cd20 and anti-gm-csf antibodies and uses thereof |
EP3345923A1 (en) | 2012-09-20 | 2018-07-11 | MorphoSys AG | Treatment for rheumatoid arthritis with anti-gm-csf antibody |
WO2014068029A1 (en) | 2012-10-31 | 2014-05-08 | Takeda Gmbh | Lyophilized formulation comprising gm-csf neutralizing compound |
AR093297A1 (es) * | 2012-10-31 | 2015-05-27 | Amgen Res (Munich) Gmbh | Formulacion liquida que comprende un compuesto neutralizante de gm-csf |
US20160024200A1 (en) * | 2013-03-14 | 2016-01-28 | John Schrader | Human monoclonal antibodies that neutralize bioactivity of granulocyte macrophage colony-stimulating factor and methods and uses thereof |
WO2015028657A1 (en) | 2013-08-30 | 2015-03-05 | Takeda Gmbh | Antibodies neutralizing gm-csf for use in the treatment of rheumatoid arthritis or as analgesics |
JP6769879B2 (ja) | 2014-05-07 | 2020-10-14 | タケダ・ゲー・エム・ベー・ハーTakeda GmbH | Gm−csf中和化合物を含む液体製剤 |
AU2017328383B2 (en) | 2016-09-19 | 2022-10-27 | I-Mab Biopharma (Hangzhou) Co., Ltd. | Anti-GM-CSF antibodies and uses thereof |
KR20200092301A (ko) | 2017-06-25 | 2020-08-03 | 시스트이뮨, 인코포레이티드 | 다중-특이적 항체 및 이를 제조하는 방법 및 이의 용도 |
WO2019129211A1 (en) * | 2017-12-28 | 2019-07-04 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Antibodies and variants thereof against pd-l1 |
EP3623382A1 (en) * | 2018-09-14 | 2020-03-18 | Universität Zürich | Ligands to gm-csf or gm-csf-receptor for use in leukemia in a patient having undergone allo-hct |
US11655293B2 (en) * | 2018-02-22 | 2023-05-23 | Universitat Zurich | Ligands to GM-CSF or GM-CSF-receptor for use in leukemia in a patient having undergone allo-HCT |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006111353A2 (en) * | 2005-04-18 | 2006-10-26 | Micromet Ag | Antibody neutralizers of human granulocyte macrophage colony stimulating factor |
WO2006122797A2 (en) * | 2005-05-18 | 2006-11-23 | Morphosys Ag | Anti-gm-csf antibodies and uses therefor |
WO2007092939A2 (en) * | 2006-02-08 | 2007-08-16 | Morphotek, Inc. | Antigenic gm-csf peptides and antibodies to gm-csf |
Family Cites Families (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8624899D0 (en) * | 1986-10-17 | 1986-11-19 | Sandoz Ltd | Monoclonal antibodies |
EP0347057A1 (en) * | 1988-05-31 | 1989-12-20 | Schering Biotech Corporation | Method of treating myeloid leukemias |
ZA905480B (en) | 1989-07-14 | 1991-03-27 | Schering Corp | Antagonists of gm-csf derived from the carboxyl terminus |
GB8925590D0 (en) * | 1989-11-13 | 1990-01-04 | Central Blood Lab Authority | Monoclonal antibodies |
US6713610B1 (en) | 1990-01-12 | 2004-03-30 | Raju Kucherlapati | Human antibodies derived from immunized xenomice |
AU8910891A (en) | 1990-11-20 | 1992-06-11 | National Heart & Lung Institute, The | Treatment of lung diseases |
CA2060741A1 (en) | 1991-02-11 | 1992-08-12 | Robert S. Greenfield | Gm-csf inhibiting oligopeptides |
US5833987A (en) * | 1995-06-07 | 1998-11-10 | Trustees Of Dartmouth College | Treatment of T cell mediated autoimmune disorders |
BR9606706A (pt) * | 1995-10-16 | 1999-04-06 | Unilever Nv | Análogo de fragmento de anticorpo biespecífico ou bivalente uso processo para produzir o mesmo |
US5662138A (en) | 1996-06-12 | 1997-09-02 | Wang; Wen-Hsing | Drop head structure |
US7455836B2 (en) | 2000-05-08 | 2008-11-25 | The University Of Melbourne | Method of treatment and agents useful for same |
EP2281843B1 (en) | 2000-06-16 | 2016-10-12 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies that immunospecifically bind to BLyS |
CA2422730A1 (en) | 2000-09-19 | 2002-03-28 | Microbia, Inc. | Modulation of secondary metabolite production by zinc binuclear cluster proteins |
PE20021080A1 (es) | 2001-04-12 | 2003-02-12 | Boehringer Ingelheim Int | Un anticuerpo especifico fapo bibh1 en el tratamiento del cancer |
US7084257B2 (en) | 2001-10-05 | 2006-08-01 | Amgen Inc. | Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity |
WO2003040341A2 (en) | 2001-11-07 | 2003-05-15 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Anti-hepatitis a virus antibodies |
WO2003068920A2 (en) | 2002-02-13 | 2003-08-21 | Ludwig Institute For Cancer Research | Humanized gm-csf antibodies |
US7193069B2 (en) | 2002-03-22 | 2007-03-20 | Research Association For Biotechnology | Full-length cDNA |
US7361740B2 (en) | 2002-10-15 | 2008-04-22 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
AR045563A1 (es) | 2003-09-10 | 2005-11-02 | Warner Lambert Co | Anticuerpos dirigidos a m-csf |
UA89364C2 (en) | 2003-12-03 | 2010-01-25 | Биодженерикс Аг | Granulocyte colony stimulating factor peptide conjugate (g-csf) |
US20070254836A1 (en) | 2003-12-03 | 2007-11-01 | Defrees Shawn | Glycopegylated Granulocyte Colony Stimulating Factor |
ATE435238T1 (de) | 2004-05-05 | 2009-07-15 | Micromet Ag | Herstellung eines einkettigen fv antikörperfragments |
WO2006011353A1 (ja) | 2004-07-30 | 2006-02-02 | Thk Co., Ltd. | ねじ溝加工方法 |
JP4736037B2 (ja) | 2005-10-26 | 2011-07-27 | 株式会社イーベック | ヒトgm−csfに結合するヒトのモノクローナル抗体並びにその抗原結合部分 |
US8398972B2 (en) | 2006-11-21 | 2013-03-19 | Kalobios Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating dementia using a GM-CSF antagonist |
MX2009005398A (es) | 2006-11-21 | 2009-08-20 | Kalobios Pharmaceuticals Inc | Metodos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias cronicas usando antagonista de gm-csf. |
TW200918553A (en) | 2007-09-18 | 2009-05-01 | Amgen Inc | Human GM-CSF antigen binding proteins |
SI2215119T1 (sl) | 2007-11-13 | 2013-04-30 | Evec Inc. | Monoklonska protitelesa, ki se veĹľejo na hGM-CSF, in medicinski sestavki, ki jih obsegajo |
-
2008
- 2008-11-12 SI SI200830911T patent/SI2215119T1/sl unknown
- 2008-11-12 TW TW100141459A patent/TW201206955A/zh unknown
- 2008-11-12 CN CN200880124664.1A patent/CN101970489B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-11-12 CN CN201410203384.7A patent/CN104072613A/zh active Pending
- 2008-11-12 WO PCT/US2008/012680 patent/WO2009064399A1/en active Application Filing
- 2008-11-12 SG SG2011085453A patent/SG176499A1/en unknown
- 2008-11-12 MX MX2010005291A patent/MX2010005291A/es active IP Right Grant
- 2008-11-12 CA CA2705539A patent/CA2705539A1/en not_active Abandoned
- 2008-11-12 BR BRPI0820530-2A patent/BRPI0820530A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-11-12 EP EP12181684A patent/EP2535353A1/en not_active Withdrawn
- 2008-11-12 AR ARP080104932A patent/AR069290A1/es active Pending
- 2008-11-12 DK DK08848696.4T patent/DK2215119T3/da active
- 2008-11-12 PE PE2008001912A patent/PE20091420A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-11-12 PL PL08848696T patent/PL2215119T3/pl unknown
- 2008-11-12 US US12/681,396 patent/US8679502B2/en active Active
- 2008-11-12 RS RS20130035A patent/RS52713B/en unknown
- 2008-11-12 PT PT88486964T patent/PT2215119E/pt unknown
- 2008-11-12 ME MEP-2010-89A patent/ME01005B/me unknown
- 2008-11-12 ES ES08848696T patent/ES2401536T3/es active Active
- 2008-11-12 EP EP08848696A patent/EP2215119B1/en active Active
- 2008-11-12 CL CL2008003361A patent/CL2008003361A1/es unknown
- 2008-11-12 UY UY31466A patent/UY31466A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-11-12 EP EP12192975A patent/EP2559706A1/en not_active Withdrawn
- 2008-11-12 TW TW097143709A patent/TWI434854B/zh not_active IP Right Cessation
- 2008-11-12 KR KR1020107012568A patent/KR20100102108A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-11-12 NZ NZ586027A patent/NZ586027A/en not_active IP Right Cessation
- 2008-11-12 NZ NZ597023A patent/NZ597023A/xx not_active IP Right Cessation
- 2008-11-12 AU AU2008321429A patent/AU2008321429A1/en not_active Abandoned
- 2008-11-12 RU RU2010123693/10A patent/RU2517596C2/ru not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-05-06 IL IL205576A patent/IL205576A0/en unknown
- 2010-05-12 TN TN2010000210A patent/TN2010000210A1/fr unknown
- 2010-05-17 ZA ZA2010/03467A patent/ZA201003467B/en unknown
- 2010-06-03 MA MA32889A patent/MA31899B1/fr unknown
- 2010-06-11 CO CO10070935A patent/CO6382188A2/es active IP Right Grant
- 2010-06-14 EC EC2010010251A patent/ECSP10010251A/es unknown
-
2011
- 2011-01-27 HK HK11100827.6A patent/HK1146729A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-03-08 HR HRP20130204AT patent/HRP20130204T1/hr unknown
- 2013-09-09 RU RU2013141223/10A patent/RU2013141223A/ru not_active Application Discontinuation
-
2014
- 2014-01-28 US US14/166,803 patent/US20140205611A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006111353A2 (en) * | 2005-04-18 | 2006-10-26 | Micromet Ag | Antibody neutralizers of human granulocyte macrophage colony stimulating factor |
WO2006122797A2 (en) * | 2005-05-18 | 2006-11-23 | Morphosys Ag | Anti-gm-csf antibodies and uses therefor |
WO2007092939A2 (en) * | 2006-02-08 | 2007-08-16 | Morphotek, Inc. | Antigenic gm-csf peptides and antibodies to gm-csf |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
КОЗЛОВ В.А. "Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор: физиологическая активность, патофизиологические и терапевтические проблемы". Цитокины и воспаление, 2004, т.3, * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2517596C2 (ru) | МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С hGM-CSF, И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ КОМПОЗИЦИИ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ | |
US10287348B2 (en) | Antigen binding proteins capable of binding thymic stromal lymphopoietin | |
US8454956B2 (en) | Methods for treating rheumatoid arthritis and osteoporosis with anti-IL-20 antibodies | |
TW200902547A (en) | Potent, stable and non-immunosuppressive anti-CD4 antibodies | |
KR101691534B1 (ko) | 류마티스 관절염 및 골다공증 치료용 il-20 길항제의 용도 | |
AU2014277673A1 (en) | Antigen Binding Proteins Capable of Binding Thymic Stromal Lymphopoietin | |
CN110818793A (zh) | 抗IL-1β的抗体、其药物组合物及其用途 | |
US11891441B2 (en) | Human interleukin-4 receptor alpha antibodies | |
JP5476310B2 (ja) | hGM−CSFに結合するモノクローナル抗体および前記抗体を含む医薬組成物 | |
JP6014706B2 (ja) | hGM−CSFに結合するモノクローナル抗体および前記抗体を含む医薬組成物 | |
JP2012105657A (ja) | hGM−CSFに結合するモノクローナル抗体および前記抗体を含む医薬組成物 | |
AU2013203909A8 (en) | Monoclonal antibodies that bind to hGM-CSF and medical compositions comprising same | |
JP2023527916A (ja) | アゴニスト抗cd40抗体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20141113 |