TWI434854B - 結合ｈＧＭ－ＣＳＦ的單株抗體以及包含其之醫學組成物 - Google Patents
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Description
本發明係關於結合人類顆粒性白血球-巨噬細胞集落刺激因子(亦稱為「hGM-CSF」)且中和hGM-CSF活性之單株抗體、包括一或更多上述單株抗體之組合物以及應用上述單株抗體與組合物的方法。
將可在試管內促進骨髓顆粒性白血球與巨噬細胞之遠祖細胞增殖且促進顆粒性白血球與巨噬細胞集落形成之體液因子界定為顆粒性白血球-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
當前已知GM-CSF為廣泛細胞類型的刺激因子。其引誘顆粒性白血球-巨噬細胞世系血球細胞的分化與增殖、提高抗原呈現細胞的功能、維持某些類型之上皮細胞的功能且引發肺泡巨噬細胞的功能(諸如，提高介面活性物質的分解作用、殺菌功能與Fc受體呈現)(The Cytokine Handbook，第4版，Thomson,A.等人(編輯)，Academic Press,2003)。
已知GM-CSF可造成不同疾病，包括1)過敏性疾病，諸如氣喘、異位性皮膚炎(atopy)與花粉熱、2)移植排斥與移植物對抗宿主疾病(GVHD)及3)自體免疫疾病，例如類風濕性關節炎。
例如，人類GM-CSF(hGM-CSF)係過度表現於過敏性受試者的肺與類風濕性關節炎患者的關節中；hGM-CSF mRNA係過度表現於過敏性受試者的皮膚中。亦已經有報導指出GM-CSF產物可提高單核白血球(異位性皮膚炎中導致發炎的細胞)的存活(Bratton,D.L.等人，Granulocyte macrophage colony-stimulating factor contributes to enhanced monocyte survival in chronic atopic dermatitis. J. Clin. Invest.,95：211-218,1995)。
此外，已經顯示出GM-CSF刺激白血病細胞的增殖。因此，GM-CSF被視為導致白血病的因子。
具有治療人類GM-CSF導致之疾病與症狀的方法係有用的。一種治療上述疾病與症狀之方法係結合hGM-CSF並抑制其生物活性。這可藉由例如施加抗-hGM-CSF單株抗體加以完成，抗-hGM-CSF單株抗體針對hGM-CSF具有高度親合力與足夠的中和活性但不會引發免疫反應。
然而，目前揭露之hGM-CSF-抑制抗體並無針對hGM-CSF的足夠中和活性。再者，現有的抗-hGM-CSF單株抗體非常有可能在受者中引發不欲之免疫反應。
此外，治療上述疾病需要長時間的施藥而可能引發問題，例如施加藥物中之少量雜質可能引起的安全問題。由效力、安全與醫學費用的觀點來看，比現有那些抗體具有較大中和活性的抗體係有用於治療。
本發明至少部分係基於發明者發現某些抗-人類GM-CSF單株抗體之特徵為其針對hGM-CSF非常高的中和活性。出乎意料地，這些抗體的中和活性係高於根據其對hGM-CSF之結合親合力所預測者。這些抗-hGM-CSF單株抗體的其中兩個在此稱為EV1018與EV1019。
一態樣中，本發明提供結合並中和hGM-CSF之抗-hGM-CSF抗體與其之片段。
一實施例中，提供單離的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，其中抗體或其之抗原結合片段辨別hGM-CSF(其之胺基酸序列於序列編號：1中提出)中的ELYK(序列編號：2)與TMMASHYKQH(序列編號：3)。一實施例中，抗體包括：
(a)重鏈，其包括含有VH
-CDR1之共有序列、含有VH
-CDR2之共有序列及含有VH
-CDR3之共有序列，其中：
(i)含有VH
-CDR1之共有序列為FTFS(Y/H)(G/A)MH(序列編號：314)，
(ii)含有VH
-CDR2之共有序列為(L/V)(T/I)(Y/W)HXGX(R/K)K(F/Y)YADSV(R/K)G(序列編號：315)，及
(iii)含有VH
-CDR3之共有序列為EX(M/V)G(A/G)XXDX(序列編號：316)；及
(b)輕鏈，其包括含有VL
-CDR1之共有序列、含有VL
-CDR2之共有序列及含有VL
-CDR3之共有序列，其中：
(i)含有VL
-CDR1之共有序列為XGNXXNIGS(H/Y)AVG(序列編號：317)，
(ii)含有VL
-CDR2之共有序列為G(R/K)SP(A/P)SG(序列編號：318)，及
(iii)含有VL
-CDR3之共有序列為STWDS(R/S)LSAV(V/L)(序列編號：319)，
且抗體或其之抗原結合片段專一性結合hGM-CSF。
一實施例中，提供單離的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，其中抗體或其之抗原結合片段辨別hGM-CSF(其之胺基酸序列於序列編號：1中提出)中的ELYK(序列編號：2)與TMMASHYKQH(序列編號：3)。
一實施例中，抗體包括：
(a)重鏈，其包括VH
-CDR1、VH
-CDR2與VH
-CDR3，其中：
(i)VH
-CDR1的胺基酸序列係選自SYGMH(序列編號：10)與SHAMH(序列編號：333)，
(ii)VH
-CDR2的胺基酸序列係選自LTYHHGNRKFYADSVRG(序列編號：5)與VIWHDGSKKYYADSVKG(序列編號：334)，及
(iii)VH
-CDR3的胺基酸序列係選自ESMGAINDN(序列編號：6)與EWVGGTCDS(序列編號：335)；及
(b)輕鏈，其包括VL
-CDR1、VL
-CDR2與VL
-CDR3，其中：
(i)VL
-CDR1的胺基酸序列係選自IGNNNNIGSHAVG(序列編號：7)與SGNSSNIGSYAVG(序列編號：330)，
(ii)VL
-CDR2的胺基酸序列係選自GRSPPS(序列編號：8)與GKSPAS(序列編號：331)，及
(iii)VL
-CDR3的胺基酸序列係選自STWDSSLSAVV(序列編號：9)與STWDSRLSAVL(序列編號：332)，
且抗體或其之抗原結合片段專一性結合hGM-CSF。
例如，上述之抗體或其之抗原結合片段以小於400pM的KD
、更佳為小於160pM的KD
結合人類GM-CSF。
本文所述之抗體或其之抗原結合片段中和hGM-CSF活性，以致抗體或其之抗原結合片段的IC50值小於100pM(諸如，小於30pM、小於20pM)，由本文所述在ED80下的TF-1增殖試驗所確定。
任一實施例中，抗體或其之抗原結合片段可包括γ1
、γ2
、γ3
或γ4
的重鏈。重鏈可選自序列編號：10-33、38-80、160-183與222-245。
任一實施例中，抗體或其之抗原結合片段可包括λ輕鏈的輕鏈。某些實施例中，λ輕鏈可包括一或兩者參照野生型序列的下列胺基酸取代：R100G與A153G。一實施例中，輕鏈可選自序列編號：34-37與202-221。輕鏈可為λ輕鏈或κ輕鏈。某些實施例中，重鏈係γ1
、γ2
、γ3
或γ4
而輕鏈係λ輕鏈。任一實施例中，重鏈可包含一或更多參照野生型序列選自下列所構成之群組的胺基酸取代：T97A、T97V、N95D、N95E、N95K、N95Q、N93Q/N95T、K144R、L164A、L165A與K144R。某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈，其含有一或更多選自下列所構成之群組的胺基酸取代：T97A、T97V、N95D、N95E、N95K、N95Q、N93Q/N95T、K144R、L164A、L165A與K144R；及輕鏈，其含有一或兩者下列胺基酸取代：R100G與A153G。
本文所述之抗體或其之抗原結合片段可包括VH
-CDR1，其之胺基酸序列為SYGMH(序列編號：4)或SHAMH(序列編號：333)。本文所述之抗體或其之抗原結合片段可包括VH
-CDR2，其之胺基酸序列為LTYHHGNRKFYADSVRG(序列編號：5)或VIWHDGSKKYYADSVKG(序列編號：334)。本文所述之抗體或其之抗原結合片段可包括VH
-CDR3，其之胺基酸序列為ESMGAINDN(序列編號：6)或EWVGGTCDS(序列編號：335)。本文所述之抗體或其之抗原結合片段可包括VL
-CDR1，其之胺基酸序列為IGNNNNIGSHAVG(序列編號：7)或SGNSSNIGSYAVG(序列編號：330)。本文所述之抗體或其之抗原結合片段可包括VL
-CDR2，其之胺基酸序列為GRSPPS(序列編號：8)或GKSPAS(序列編號：331)。本文所述之抗體或其之抗原結合片段可包括VL
-CDR3，其之胺基酸序列為STWDSSLSAVV(序列編號：9)或STWDSRLSAVL(序列編號：332)。
某些實施例中，專一性結合hGM-CSF之抗體或其之抗原結合片段包括6個不同CDR，其之序列係於序列編號：4-9中提出。
某些實施例中，專一性結合hGM-CSF之抗體或其之抗原結合片段包括6個不同CDR，其之序列係於序列編號：330-335中提出。
本文所提供的任一實施例中，抗體可包括γl
、γ2
、γ3
或γ4
的重鏈及κ或λ的輕鏈。
某些實施例中，本文所述之抗體或抗原結合片段可更包括信號序列，諸如序列編號：324、325與326中顯示的那些序列。
有關野生型與其變型之實施例係包含於本發明中。某些實施例中，抗體或其之片段包括重鏈，其係序列編號：10或選自序列編號：11-33、38-80之變體；並亦包括輕鏈，其係序列編號：34或選自序列編號：35-37之變體。某些實施例中，重鏈係序列編號：160或選自序列編號：161-245之變體；而輕鏈係序列編號：202或選自序列編號：203-221之變體。
某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈變異區與輕鏈變異區，其中重鏈變異區係序列編號：152或其之變體(諸如，序列編號：153-159)，而輕鏈變異區係序列編號：184或其之變體(諸如，序列編號：185-201)。
某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈變異區與輕鏈變異區，其中重鏈變異區係序列編號：348或其之變體(諸如，序列編號：349-363)，而輕鏈變異區係序列編號：348。
本文揭露之能夠結合hGM-CSF(hGM-CSF)與中和hGM-CSF之生物活性的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分的特徵在於其之互補決定區(CDR)係一或更多選自序列編號：4-9與序列編號：330-335所構成之群組的胺基酸序列。某些實施例中，可在CDR中取代、刪除、插入或附加一或更多胺基酸。本文所述之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分的特徵在於當hGM-CSF引發TF-1細胞增殖時，抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分在約14pM的濃度下抑制約50%的TF-1細胞增殖。某些實施例中，抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分抑制周圍血液樹突細胞的增殖。
一實施例中，本文所述之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分具有針對hGM-CSF的高度親合力，其之KD
值係4x10-10
M或更小。
某些實施例中，本文所述之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分屬於IgG1
(λ)類型(亞型)。某些實施例中，本發明之抗-hGM-CSF單株抗體係人類單株抗體。
本發明亦思及套組，其包括：(a)本發明之抗體或其之抗原結合片段；及(b)一或更多包含抗體或其之抗原結合片段的容器。
本發明提供之組合物包括結合並中和hGM-CSF之抗-hGM-CSF抗體或其之片段。上述組合物可為藥學組合物(例如，藥劑)，其包括抗-hGM-CSF抗體與/或其之片段(或上述之組合)及藥學可接受載體。包括任何上述實施例的抗體或其之抗原結合片段。
進一步實施例中，組合物包括超過一種本文提供之各個抗-GM-CSF抗體、片段或上述之組合。例如，組合物可進一步包括結合hGM-CSF的第二單離抗體或其之抗原結合片段，以致組合物包括超過一種/類型(複數個)結合GM-CSF之各個抗體、其之抗原結合片段或上述之組合。某些實施例中，複數個結合hGM-CSF之抗體、其之抗原結合片段或上述之組合的至少一者係選自序列編號：10-80、152-245、320-323與348-365所構成之群組的聚胜肽。
本發明亦關於適合用於治療hGM-CSF導致之疾病的醫藥組合物，其包括：根據本文任何一個實施例之抗-hGM-CSF單株抗體或抗原結合部分及藥學可接受載體。過度產生hGM-CSF導致之疾病的實例包括：(a)過敏疾病，諸如氣喘、異位性皮膚炎與花粉熱(過敏性鼻炎；乾草熱)；(b)移植排斥，移植物對抗宿主疾病(GVHD)；及(c)自體免疫疾病，例如類風濕性關節炎。
上述之組合物或獸醫藥物組合物可包括複數種專一於相同特定抗原的抗-hGM-CSF單株抗體或其抗原結合部分及藥學可接受載體。
某些實施例中，醫藥組合物或獸醫藥物組合物的特徵在於複數種抗-hGM-CSF單株抗體或其抗原結合部分包括二或更多類型的抗體或其抗原結合部分，其可選自下列(a)與(b)：
(a)抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其之CDR係由序列編號：4-9、序列編號：330-335、序列編號：336-341或序列編號：342-347的胺基酸序列所代表，且其專一於hGM-CSF，
(b)(a)的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其之胺基酸序列中有一或更多胺基酸被取代、刪除、插入或附加，且其專一於hGM-CSF。
當hGM-CSF引發TF-1細胞增殖時，上述之醫藥組合物或獸醫藥物組合物可各自在約55pM的濃度下抑制約80%的TF-1細胞增殖。
本發明之態樣亦思及套組，其包括本文包含之任何一種組合物及一或更多容器。某些實施例中，套組更包括操作指南。某些實施例中，套組更包括標籤、操作指南或標籤與操作指南兩者。
亦提供本文所述之抗體或其之抗原結合片段或包含上述抗體或片段之組合物的應用。本文所述之任一抗-hGM-CSF抗體或其之抗原結合片段或組合物可用來製造或製備於患者中治療與hGM-CSF過度表現相關之疾病或異常的藥劑，其中抗體或其之抗原結合片段結合hGM-CSF並能夠中和hGM-CSF活性。某些實施例中，疾病或異常係選自下列所構成之群組：慢性阻塞性肺病(COPD)、氣喘、囊狀纖維化症(cystic fibrosis)、間質性肺病(interstitial lung disease)、鼻炎、關節炎與相關之關節病、牛皮癬、骨髓性白血病、多發性硬化症。
為了上述之應用，以不超過最大容忍劑量的劑量將抗體或抗原結合片段施加至患者，其中最大容忍劑量係約每劑500mg。
本發明之態樣包括上方任一實施例所述之抗體或其之抗原結合片段或組合物的應用，用於治療患者中與hGM-CSF過度表現相關之疾病或異常，其中抗體或其之抗原結合片段結合hGM-CSF並能夠中和hGM-CSF活性。例如，疾病或異常可為慢性阻塞性肺病(COPD)、氣喘、囊狀纖維化症、間質性肺病、鼻炎、關節炎與相關之關節病、牛皮癬、骨髓性白血病或多發性硬化症。上述應用包括以不超過最大容忍劑量的劑量將本發明所述之抗體或其之抗原結合片段或包含抗體或其之抗原結合片段之組合物施加至患者，其中最大容忍劑量係約每劑500mg。
本發明亦提供利用抗-hGM-CSF抗體或其之片段治療具有疾病或異常(與hGM-CSF異常表現相關)之患者的方法。方法包括對診斷有或有機率罹患與hGM-CSF異常表現(例如，過度表現)相關之疾病或異常的患者施加一有效劑量之組合物以得到患者中的至少一治療效果，組合物包含可活體內中和hGM-CSF活性的抗-hGM-CSF抗體或其之抗原結合片段。
本發明亦包括提高抗-hGM-CSF抗體介導之hGM-CSF-中和活性的方法，其特徵在於同時施加專一於相同特定抗原之複數種抗-hGM-CSF單株抗體或其抗原結合部分。某些實施例中，兩個或更多類型的抗體或其抗原結合部分係選自下列(a)與(b)：
(a)抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其之CDR係由序列編號：4-9、序列編號：330-335、序列編號：336-341或序列編號：342-347的胺基酸序列所代表，其專一於hGM-CSF；及
(b)(a)的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其胺基酸序列中有一或更多胺基酸被取代、刪除、插入或附加，其專一於hGM-CSF。
包含提高活性方法之態樣的特徵在於當hGM-CSF引發TF-1細胞增殖時，兩個或更多類型的抗體或其抗原結合部分各自以約55pM的濃度抑制約80%的TF-1細胞增殖。
本發明亦提供本文所述之抗體與其之抗原結合片段所辨別之hGM-CSF的表位。hGM-CSF之表位的聚胜肽係於序列編號：2與3中提出，其中表位由根據本揭露之抗體或其之抗原結合片段所辨別，且其中聚胜肽序列呈現hGM-CSF的間斷片段(根據序列編號：1)。表位係人類GM-CSF的間斷片段，其中表位包括所有或一部分的人類GM-CSF(序列編號：1)胺基酸殘基77-80與人類GM-CSF(序列編號：1)胺基酸殘基95-104，且其由包括六個不同CDR(如序列編號：4-9或序列編號：330-335所示)之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段所辨別。
本發明亦提供本發明之表位的應用。本發明亦包括篩選與/或辨別專一性結合本文所述之表位(由本文提供之抗體與其之抗原結合片段所辨別)的分子。與本文所述辨別結合表位之分子的方法相關之某些實施例包括：(i)利用包含表位之探針篩選生物樣本或胜肽庫；(ii)單離專一性結合探針的分子；及(iii)辨別分子。例如，結合表位之分子可為抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段。某些實施例思及探針更包括可偵測的標記。某些實施例中，方法包括固定的探針。
亦提供產生抗-hGM-CSF抗體與其之抗原結合片段的方法或處理。本發明包括在宿主細胞內產生結合hGM-CSF之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段的方法，其中抗體或其之抗原結合片段包括至少一含有VH
-CDR1之共有序列、含有VH
-CDR2之共有序列、含有VH
-CDR3之共有序列、含有VL
-CDR1之共有序列、含有VL
-CDR2之共有序列及含有VL
-CDR3之共有序列。方法包括下列步驟：
(i)取得包含編碼至少一含有VH
-CDR1之共有序列、含有VH
-CDR2之共有序列、含有VH
-CDR3之共有序列、含有VL
-CDR1之共有序列、含有VL
-CDR2之共有序列與含有VL
-CDR3之共有序列的至少一DNA序列之宿主細胞；
(ii)在宿主細胞中表現DNA，其中：
含有VH
-CDR1之共有序列為FTFS(Y/H)(G/A)MH(序列編號：314)、
含有VH
-CDR2之共有序列為(L/V)(T/I)(Y/W)HXGX(R/K)K(F/Y)YADSV(R/K)G(序列編號：315)、
含有VH
-CDR3之共有序列為EX(M/V)G(A/G)XXDX(序列編號：316)、
含有VL
-CDR1之共有序列為XGNXXNIGS(H/Y)AVG(序列編號：317)、
含有VL
-CDR2之共有序列為G(R/K)SP(A/P)SG(序列編號：318)及
含有VL
-CDR3之共有序列為STWDS(R/S)LSAV(V/L)(序列編號：319)；及
(iii)在適合DNA表現與抗體或其之抗原結合片段產生的條件下培養宿主細胞。
某些實施例中，至少一DNA編碼重鏈或其之部分及輕鏈或其之部分，其中重鏈或其之部分係選自序列編號：10-33、38-80、348-363、152-183與222-245所構成之群組；而其中輕鏈或其之部分係選自序列編號：34-37、364、365與184-221所構成之群組。
上方處理更包括單離抗體或其之抗原結合片段。
上方處理更包括製備包含上述抗體或其之抗原結合片段及藥學可接受載體之組合物。
亦提供包含編碼本文所述之抗體或其之抗原結合片段的至少一部分之DNA的載體。亦包括表現上述載體的宿主細胞。
某些實施例中，載體包括編碼VH
-CDR1、VH
-CDR2及VH
-CDR3之DNA，其中：
VH
-CDR1係SYGMH(序列編號：4)或SHAMH(序列編號：333)、
VH
-CDR2係LTYHHGNRKFYADSVRG(序列編號：5)或VIWHDGSKKYYADSVKG(序列編號：334)及
VH
-CDR3係ESMGAINDN(序列編號：6)或EWVGGTCDS(序列編號：335)。
某些實施例中，載體包括編碼VL
-CDR1、VL
-CDR2及VL
-CDR3之DNA，其中
VL
-CDR1係IGNNNNIGSHAVG(序列編號：7)或SGNSSNIGSYAVG(序列編號：330)、
VL
-CDR2係GRSPPSG(序列編號：8)或GKSPASG(序列編號：331)及
VL
-CDR3係STWDSSLSAVV(序列編號：9)或STWDSRLSAVL(序列編號：332)。
本發明某些實施例中，編碼能夠結合hGM-CSF並中和hGM-CSF之生物活性之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分的單離DNA之特徵在於單離DNA編碼包括至少一選自序列編號：4-9所構成之群組的胺基酸序列。
某些實施例中，編碼能夠結合hGM-CSF並中和hGM-CSF之生物活性之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分的單離DNA之特徵在於單離DNA編碼包括至少一選自序列編號：330-335所構成之群組的胺基酸序列。單離DNA能夠在嚴格條件下與上述DNA雜合。本發明之態樣包括包含任一上述DNA之載體以及表現重組表現載體之宿主細胞。
多株抗體與單株抗體通常係衍生自實驗動物，諸如小鼠、兔子與山羊。然而，取得之抗體具有其之生產所用之動物類型的序列特徵。若將其施加至人類，人類免疫系統會將抗體辨別為外來物，並接著引發人類抗-動物抗體反應(即，抗體產生其本生的抗體)。
如本文所述，從衍生自原發性肺泡蛋白沉著症(idiopathic alveolar proteionosis)病患之血液的抗體產生細胞取得抗-hGM-CSF單株抗體。從衍生自原發性肺泡蛋白沉著症病患之血液的抗體產生細胞取得本發明中之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分。因此，本發明中之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段係完全的人類單株抗體。因此，其在抗體製備物施加至人體時使促發免疫原性(immunogenicity)的可能性最小。
本發明即將解決的問題如下：本發明著重在提供GM-CSF-結合單株抗體與其之GM-CSF-結合片段，其針對hGM-CSF呈現改進的中和能力或活性；及組合物，其包括至少一種類或類型的上述單株抗體或其之片段；以及治療與hGM-CSF過度表現(比起沒有罹患症狀、疾病或異常之個體，hGM-CSF水平在罹患症狀、疾病或異常之個體中較高)相關之症狀或疾病的方法。
本揭露描述之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段專一性結合hGM-CSF(其之異常表現會導致不同疾病)並減少或排除(中和)其之生物活性。抗-hGM-CSF單株抗體呈現中和活性(針對hGM-CSF)，其係高於以前存在之抗-hGM-CSF單株抗體的中和活性。明確地說，本發明之抗-hGM-CSF單株抗體係不具有免疫原性且不引發免疫反應的人類單株抗體。
「專一性結合」意指抗體的高度結合力(avidity)與/或高度親合力結合特定聚胜肽，例如蛋白(例如，人類GM-CSF蛋白)的表位。抗體結合至此特定聚胜肽上的表位較佳係強於相同抗體結合至任一其他表位(特別是關注之特定聚胜肽有關之分子中或相同樣本中存在的那些表位)，例如更強地結合蛋白(例如，GM-CSF)之表位片段，以致調整結合條件可讓抗體幾乎專門地結合至所欲蛋白之表位位置或片段，例如GM-CSF處理而暴露但在相同亞型之相關因子上沒有暴露的表位片段。本發明之單離抗體較佳係免疫反應且免疫專一於特定物種。例如，本發明之抗體辨別人類GM-CSF但不辨別鼠科對應物。應當理解本發明此態樣所述之抗體與其之抗原結合片段辨別天然結構或實質相近於其天然結構的抗原表位，以致讓抗原的間斷片段於整體抗原(例如，hGM-CSF)中相當接近(如結構研究中所發現)，藉此共同形成本發明抗體辨別之表位(例如，抗原表面上的「袋」)。因此，本發明此態樣中描述之抗體或其之抗原結合片段不與非GM-CSF(含有上述形成表位之兩者聚胜肽序列)蛋白交互作用。應當理解抗體-抗原結合的含義中，藉由交互作用性質的結合視為「專一性」。因此，「結合GM-CSF的抗體」應理解成以專一性結合抗原(即，GM-CSF)。
本文所用之詞彙「抗體」意指其中4個聚胜肽鏈(2個重鏈與2個輕鏈)藉由雙硫鍵交互連結的免疫球蛋白。可藉由單株或重組技術來產生單株抗體。該領域熟悉該項技術。本文交替應用詞彙「抗原結合部分」與「抗原結合片段」來描述較佳對抗原(例如，hGM-CSF)呈現專一性抗原結合活性的抗體任何縮短變形。明確地說，本發明之片段係與各個單株抗體結合相同表位來結合hGM-CSF的片段。例如，片段可為Fab片段或任何呈現上述特徵的其他片段。此外，抗體片段更包括單鏈抗體(scFV)，其中包括抗體變異區與互補決定區(CDR)；雙專一性抗體與多專一性抗體。
本文所用之「生物活性」與生物的活性同義。因此，「hGM-CSF的生物活性」係活體內或細胞式試驗(例如，本文所述之那些試驗)中確定或測量之hGM-CSF的生物功能。更明確地說，可在細胞增殖試驗中測量的hGM-CSF生物活性。應用已知對GM-CSF反應的適當細胞株。一般針對人類細胞系統而言，人類紅白血病細胞株TF-1係用來執行增殖試驗。TF-1係由具有紅白血病之患者建立的細胞株。試驗係基於GM-CSF刺激之TF-1細胞增殖的抑制且技術建立相當完善。其他細胞株亦適合。熟悉技術之人士可以採用適當的試驗系統或條件。
在不同濃度的野生型重組人類GM-CSF(稱為rhGM-CSF)存在下執行TF-1增殖試驗。根據這些數據，可得到劑量依賴性曲線。引出TF-1細胞中增殖之最大生物反應的80%所需之GM-CSF濃度在此界定成ED80
或ED80。因此，ED80代表最大反應「80%的有效劑量」。相似地，在生物試驗中帶來最大反應的一半所需之GM-CSF濃度係表示成ED50
或ED50。一般而言，GM-CSF的ED50值在利用人類生長因子-依賴性TF-1細胞株之細胞增殖試驗中測量為0.02-0.2ng/ml。
此或任何其他相似試驗系統可用來辨別或確定hGM-CSF抑制劑或擷抗劑的活性。例如，增殖試驗系統可用來測量抗體針對hGM-CSF的中和能力。測量生物GM-CSF功能之試驗的其他實例包括IL-8分泌試驗與表面CD11b/Macl誘導試驗。
詞彙「中和」、「中和化」等代表生物活性因子(例如，hGM-CSF)之生物活性的抑制。因此，針對hGM-CSF且具有中和能力或中和活性之抗體意指抗體能結合並對抗或抵銷hGM-CSF在生物系統(例如，TF-1細胞)中的增殖效應，藉此實質抑制或排除hGM-CSF的生物活性。
諸如「抑制效應」、「抑制」、「能夠抑制」與「抑制作用」等詞意指目標抗原導致之生物活性5-100%的抑制，不限於其之來源。為了治療目的，hGM-CSF生物活性的理想抑制應介於50%與100%之間。
一般而言，IC50
係化合物抑制生物或生化功能效力的測量。此定量測量指出需要多少量的特定藥物或其他試劑(抑制劑)來抑制一半的已知生物處理(或處理的部分，即酵素、細胞、細胞受體或微生物)。換句話說，其係物質最大抑制濃度(IC)的一半(50%)(50% IC或IC50
)。在藥物學研究中其通常當作擷抗藥物效力的測量。根據美國食品藥物管理局採用的指導方針，IC50
代表試管內50%抑制所需的藥物濃度。
因此，可藉由構築劑量依賴性曲線來測定針對hGM-CSF之中和抗體的IC50
並檢驗不同濃度的中和抗體顛倒hGM-CSF增殖能力的效應。可藉由確定抑制促效劑最大生物反應一半所需的濃度來計算已知擷抗劑的IC50
值。
根據不同實施例，抗-hGM-CSF單株抗體或其抗原結合片段之IC50值低於20pM、低於30pM、低於40pM、低於50pM、低於60pM、低於70pM、低於80pM、低於90pM或低於100pM，各個實例在ED80下增殖試驗中確定。特定實施例中，抗體或其之抗原結合片段之IC50值低於20pM或低於30pM，在ED80下TF-1增殖試驗中確定。
本揭露中之抗-hGM-CSF單株抗體包括免疫球蛋白分子，其包括2個重鏈與2個輕鏈。各個重鏈包括重鏈變異區(適當地縮寫成「HCVR」或「VH
」)與重鏈恆定區(重鏈恆定區具有3個區塊，縮寫成「CH1」、「CH2」與「CH3」)。各個輕鏈包括輕鏈變異區(適當地縮寫成「LCVR」或「VL
」)與輕鏈恆定區(輕鏈恆定區具有1個區塊，縮寫成「CL
」)。HCVR與LCVR對抗體的結合專一性特別重要。
變異區的胺基酸序列負責大部分抗體與抗原間之交互作用。因此，當表現載體構築成包含變異區序列(衍生自天然抗體)於框架序列(衍生自具有不同特性之不同抗體)中時，得到之載體可表現模擬天然抗體特性的重組抗體。因此，在產生完整重組抗體(具有與原本抗體相似的結合特性)時不必得到特定抗體的完整序列。覆蓋變異區之重鏈與輕鏈的部分序列有時足以達成此項目的。
抗體與目標抗原交互作用主要係透過LCVR與HCVR的胺基酸殘基。因此，變異區中胺基酸序列較抗體中變異區外的那些序列多變。HCVR與LCVR進一步區分成相對穩定的「框架區(FR)」與高度變化的「互補決定區(CDR)」。HCVR與LCVR各自分別由3個CDR與4個FR所構成。其順序由胺基端至羧基端為FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3與FR4。
領域中熟悉確定或預測對應各個抗體結構區塊(包括高度可變區，例如CDR)胺基酸殘基的方法。某些時常應用的方法包括Chothia、AbM與Kabat。
一般而言，抗體以至少約1x10-7
M的親合性結合抗原，並以相對非專一性抗原(諸如，BSA、酪蛋白)至少兩倍的高度親合性結合特定抗原。
針對某些IgG抗體的辭彙「高度親合力」意指抗體之結合親合力至少約1x10-7
M、較佳係至少約1x10-8
M、更佳係至少1x10-9
M且更佳係至少1x10-10
M。
不同抗體亞型之「高度親合力」的定義不同。例如，當IgM亞型之結合親合力至少1x10-7
M的時候，其被界定成具有「高度親合力」。
如本文所述，本發明關於抗-人類GM-CSF(抗-hGM-CSF)單株抗體與其之片段，其對hGM-CSF之中和能力高於現存單株抗體(高於目前可取得的單株抗體)針對hGM-CSF之能力。可應用或施加本文所述之一類型或種類的抗-hGM-CSF單株抗體或其之片段。
或者，可一起應用或施加超過一種類型或種類的抗-hGM-CSF單株抗體。發明者發現當一起應用超過一種類型或種類的單株抗體時，其提供較高的中和活性(例如，較高的細胞生長抑制能力)。再者，可搭配除了抗-hGM-CSF或其之片段以外的一或多種類型或種類之抗-GM-CSF單株抗體或片段與/或非抗體的治療劑(諸如，小分子、RNAi或胜肽)來應用或施加一或多種類型或種類的抗-hGM-CSF單株抗體或其之片段。
一態樣中，提供辨別與專一性結合hGM-CSF之單離單株抗體或其之抗原結合片段。本文描述的是結合hGM-CSF且呈現針對hGM-CSF生物活性之中和能力或中和活性的單離抗-hGM-CSF單株抗體與其之抗原結合片段(結合hGM-CSF之抗-hGM-CSF單株抗體，與結合hGM-CSF之其抗原結合片段)。另一實施例係結合hGM-CSF並呈現針對hGM-CSF之中和能力或活性的單離抗-hGM-CSF單株抗體與其之抗原結合片段，其中單株抗體與其之抗原結合片段辨別下列：hGM-CSF(序列編號：1)中的ELYK(序列編號：2)與TMMASHYKQH(序列編號：3)。結合hGM-CSF之單離抗-hGM-CSF單株抗體與其之抗原結合片段呈現針對hGM-CSF活性的中和能力或活性且可用來治療與預防與hGM-CSF過度表現相關之疾病、症狀與異常，其中單株抗體與其之抗原結合片段辨別下列：hGM-CSF中的ELYK(序列編號：2)與TMMASHYKQH(序列編號：3)。特定實施例係結合hGM-CSF的單離抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，其中抗體或抗原結合片段辨別序列編號：1所界定之hGM-CSF的下列間斷表位(相對胺基酸)：hGM-CSF中位置77-80的ELYK(序列編號：2)與hGM-CSF中位置95-104的TMMASHYKQH(序列編號：3)。本文所述之單離抗-hGM-CSF單株抗體與其之抗原結合片段專一性結合hGM-CSF。其不與GM-CSF以外之蛋白交互作用。
更明確地說，本文所述係專一性結合hGM-CSF且具有中和hGM-CSF生物活性之能力的單株抗體。將四個本文上述之抗體標為EV1018、EV1019、EV1003與EV1007，如實施例中表1與2中所概述。因此，EV1018、EV1019、EV1003與EV1007結合hGM-CSF並能夠中和hGM-CSF之生長促進效應。更詳細地描述，EV1018與EV1019抗體辨別hGM-CSF蛋白上相同或實質重疊表位。
本發明進一步包括抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其特徵在於抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分之胺基酸序列，其中互補決定區(CDR)中有一或更多胺基酸被取代、刪除、插入或附加。
進一步態樣中，單離的去氧核糖核酸(DNA)編碼能夠結合hGM-CSF並中和hGM-CSF生物活性之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其特徵在於單離的DNA編碼之胺基酸序列包括選自序列編號：4-9所構成之群組的至少一者。
本發明之一實施例係關於能夠結合hGM-CSF(hGM-CSF)且中和hGM-CSF(hGM-CSF)生物活性之抗-hGM-CSF單株抗體或抗原結合部分，其特徵在於抗-hGM-CSF單株抗體或抗原結合部分之互補決定區(CDR)係由至少一選自序列編號：4-9所構成之群組的胺基酸序列所代表。
本發明另一實施例係關於能夠結合hGM-CSF並中和hGM-CSF生物活性之抗-hGM-CSF單株抗體或抗原結合部分，其特徵在於抗-hGM-CSF單株抗體或抗原結合部分之互補決定區(CDR)係由至少一選自序列編號：330-335所構成之群組的胺基酸序列所代表。
本發明中，互補決定區(CDR)由一或更多選自序列編號：4-9所構成之群組的胺基酸序列所代表之抗-hGM-CSF單株抗體、及互補決定區(CDR)由一或更多選自序列編號：330-335所構成之群組的胺基酸序列所代表之抗-hGM-CSF單株抗體被視為不同類型的抗-hGM-CSF單株抗體。
本發明將包括互補決定區(CDR)中有一或更多胺基酸被刪除、取代、插入或附加之單株抗體或其之抗原結合部分，只要其專一性結合並中和hGM-CSF之生物活性。
本發明包括能夠結合hGM-CSF並中和hGM-CSF生物活性之單株抗體或其之抗原結合部分，其中抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分的CDR區塊係選自下列所構成之群組：
(a)輕鏈(L鏈)CDR1區塊，其之胺基酸序列為序列編號：7，
(b)輕鏈(L鏈)CDR2區塊，其之胺基酸序列為序列編號：8，
(c)輕鏈(L鏈)CDR3區塊，其之胺基酸序列為序列編號：9。
相同的方式，本發明包括能夠結合hGM-CSF並中和hGM-CSF生物活性之單株抗體或其之抗原結合部分，其中抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分的CDR區塊係選自下列所構成之群組：
(d)輕鏈(L鏈)CDR1區塊，其之胺基酸序列為序列編號：330，
(e)輕鏈(L鏈)CDR2區塊，其之胺基酸序列為序列編號：331，
(f)輕鏈(L鏈)CDR3區塊，其之胺基酸序列為序列編號：332。
當下列抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分專一性結合且中和hGM-CSF生物活性時，其亦包括於本發明中：抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其中上述互補決定區(CDR)的輕鏈係藉由刪除、取代、插入或附加一或更多胺基酸加以修飾。
本發明包括能夠結合hGM-CSF並中和hGM-CSF生物活性之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其中抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分的CDR區塊係選自下列所構成之群組：
(a)重鏈(H鏈)CDR1區塊，其之胺基酸序列為序列編號：4，
(b)重鏈(H鏈)CDR2區塊，其之胺基酸序列為序列編號：5，
(c)重鏈(H鏈)CDR3區塊，其之胺基酸序列為序列編號：6。
相同的方式，本發明包括能夠結合hGM-CSF並中和hGM-CSF生物活性之單株抗體或其之抗原結合部分，其中抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分的CDR區塊係選自下列所構成之群組：
(a)重鏈(H鏈)CDR1區塊，其之胺基酸序列為序列編號：333，
(b)重鏈(H鏈)CDR2區塊，其之胺基酸序列為序列編號：334，
(c)重鏈(H鏈)CDR3區塊，其之胺基酸序列為序列編號：335。
當下列抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分專一性結合且中和hGM-CSF生物活性時，其亦包括於本發明中：抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其中上述互補決定區(CDR)的重鏈係藉由刪除、取代、插入或附加一或更多胺基酸加以修飾。
hGM-CSF的表位也是本文的主題，其係人類GM-CSF的間斷片段，其中表位包括人類GM-CSF(序列編號：1)之胺基酸殘基77-80與人類GM-CSF(序列編號：1)之胺基酸殘基95-104，且由序列編號：2與序列編號：3提出的聚胜肽序列所界定，表位係由抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段所辨別，抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段包括序列編號：4-9或序列編號：330-335提出的6個不同CDR。
更詳細地於實施例中描述，藉由表位定位研究來確認單株抗體EV1018與EV1019所辨別的hGM-CSF表位。已經發現EV1018與EV1019兩者辨別hGM-CSF抗原的相同(或實質重疊)位置，對應於根據GenBank登錄號：NP_000749所確定之胺基酸殘基77-80與95-104。結構研究已經指出雖然兩個片段在一級序列中係間斷的，但聚胜肽的兩個片段在在摺疊時相當接近而共同形成構造上的表位。跟EV1018與EV1019兩者辨別相同或實質重疊表位的發現一致，EV1018與EV1019之CDR序列的分析顯示實質相似性。比較這兩個抗體之CDR的胜肽序列而取得下列共有序列(例如，式)，代表包含各個CDR之重疊(例如，相同)殘基：關於VH
-CDR1：FTFS(Y/H)(G/A)MH(序列編號：314)；關於VH
-CDR2(L/V)(T/I)(Y/W)HXGX(R/K)K(F/Y)YADSV(R/K)G(序列編號：315)；關於VH
-CDR3：EX(M/V)G(A/G)XXDX(序列編號：316)；及關於VL
-CDR1：XGNXXNIGS(H/Y)AVG(序列編號：317)；關於VL
-CDR2：G(R/K)SP(A/P)SG(序列編號：318)；及關於VL
-CDR3：STWDS(R/S)LSAV(V/L)(序列編號：319)。
各個共有式中，以傳統單字母方式顯示包含對應CDR之胺基酸殘基。顯示EV1018與EV1019兩者共有的相同殘基。此外，以括號中利用斜線符號的來顯示兩個抗體之間不同的殘基。
因此，本文另一實施例係結合hGM-CSF並呈現針對hGM-CSF之中和能力或活性的單離抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，其中抗體或其之抗原結合片段包括(a)重鏈或重鏈的部分(如果係抗體片段)，其包括VH
-CDR1、VH
-CDR2與VH
-CDR3，其中式FTFS(Y/H)(G/A)MH(序列編號：314)代表包含VH
-CDR1之共有序列；式(L/V)(T/I)(Y/W)HXGX(R/K)K(F/Y)YADSV(R/K)G(序列編號：315)代表包含VH
-CDR2之共有序列；及式EX(M/V)G(A/G)XXDX(序列編號：316)代表包含VH
-CDR3之共有序列；及(b)輕鏈或輕鏈的部分(如果係抗體片段)，其包括VL
-CDR1、VL
-CDR2與VL
-CDR3，其中式XGNXXNIGS(H/Y)AVG(序列編號：317)代表包含VL
-CDR1之共有序列；式G(R/K)SP(A/P)SG(序列編號：318)代表包含VL
-CDR2之共有序列；及式STWDS(R/S)LSAV(V/L)(序列編號：319)代表包含VL
-CDR3之共有序列；且其中抗體或其之片段辨別hGM-CSF中的ELYK(序列編號：2)與TMMASHYKQH(序列編號：3)。特定實施例中，抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段結合下列的間斷表位：hGM-CSF中的ELYK(序列編號：2)與TMMASHYKQH(序列編號：3)。
本文所述之另一實施例係結合hGM-CSF的單離抗-hGM-CSF單株抗體或結合hGM-CSF的其之抗原結合片段，其中抗體或其之片段包括(a)重鏈或重鏈的部分(如果係抗體片段)，其包括VH
-CDR1、VH
-CDR2與VH-CDR3，其中VH
-CDR1包括FTFS(Y/H)(G/A)MH(序列編號：314)；VH
-CDR2包括(L/V)(T/I)(Y/W)HXGX(R/K)K(F/Y)YADSV(R/K)G(序列編號：315)；及VH
-CDR3包括EX(M/V)G(A/G)XXDX(序列編號：316)；及(b)輕鏈或輕鏈的部分(如果係抗體片段)，其包括VL
-CDR1、VL
-CDR2與VL
-CDR3，其中VL
-CDR1包括XGNXXNIGS(H/Y)AVG(序列編號：317)；VL
-CDR2包括G(R/K)SP(A/P)SG(序列編號：318)；及VL
-CDR3包括STWDS(R/S)LSAV(V/L)(序列編號：319)，且其中抗體或其之片段以不超過400pM的KD
結合hGM-CSF，另一實施例中KD
係低於160pM，根據實施例11描述的技術藉此確定KD
。
另一實施例中，抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段的特徵在於抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段抑制周圍血液樹突細胞的增殖。因此，進一步實施例係結合hGM-CSF的單離抗-hGM-CSF單株抗體或結合hGM-CSF的其之抗原結合片段，抗-hGM-CSF單株抗體或其之片段包括重鏈或其之部分與輕鏈或其之部分。重鏈或重鏈的部分(如果係抗體片段)可包括VH
-CDR1、VH
-CDR2與VH
-CDR3。某些實施例中，共有序列係由式FTFS(Y/H)(G/A)MH(序列編號：314)所代表，其包含VH
-CDR1。相似地，式(L/V)(T/I)(Y/W)HXGX(R/K)K(F/Y)YADSV(R/K)G(序列編號：315)代表包含VH
-CDR2之共有序列；而式EX(M/V)G(A/G)XXDX(序列編號：316)代表包含VH
-CDR3之共有序列。輕鏈或輕鏈的部分(如果係抗體片段)可包括VL
-CDR1、VL
-CDR2與VL
-CDR3。上述實施例中，式XGNXXNIGS(H/Y)AVG(序列編號：317)代表包含VL
-CDR1之共有序列；式G(R/K)SP(A/P)SG(序列編號：318)代表包含VL
-CDR2之共有序列；而式STWDS(R/S)LSAV(V/L)(序列編號：319)代表包含VL
-CDR3之共有序列。
任一實施例中，抗體或其之片段中和hGM-CSF活性。特定實施例中，抗-hGM-CSF單株抗體或其之片段中和hGM-CSF活性，以致抗體或片段在增殖抑制試驗中的IC50值小於20pM、小於30pM、小於40pM、小於50pM、小於60pM、小於70pM、小於80pM、小於90pM或小於100pM，各個實例係在ED80下執行TF-1增殖試驗(如實施例12所述)來確定。特定實施例中，所請之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段的IC50值係低於20pM，如上述在ED80下TF-1增殖試驗中確定。進一步實施例中，本發明提供之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段的特徵在於，當hGM-CSF引發TF-1細胞增殖時，抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段在約14pM的濃度下抑制約50%的TF-1細胞增殖。
更詳細地驗證於實施例中，EV1018與EV1019兩者有效地中和hGM-CSF生物活性。因為上述這些抗體實質共有相同的構造表位，有可能利用表位來篩選辨別表位的額外分子，例如單株抗體或其之片段。因此，本發明亦思及篩選方法，其中hGM-CSF的表位係由序列編號：2與序列編號：3所提出之聚胜肽序列所界定，且由EV1018、EV1019或上述之變體所辨別。上述方法包括(i)利用包括表位之探針篩選生物樣本或胜肽庫；(ii)單離專一性結合探針的分子；及(iii)辨別分子。某些實施例中，利用方法辨別之分子係抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段。某些實例中，探針更包括可偵測標記，包括(但不限於)、標記、色素、親合性標籤等。根據某些實施例，可固定探針以例如篩選結合分子。熟悉技術人士習知且可一般地取得篩選方法。
上述任一實施例中，抗體或其之抗原結合片段可為免疫球蛋白任一亞型，例如IgG類型的IgG1
、IgG2
與IgG4
。因此上述任一實施例中，例如重鏈可為γ類型，諸如γ1
、γ2
、γ3
或γ4
。上述任一實施例中，重鏈可選自(重鏈之胺基酸殘基可選自)下列所構成之群組：序列編號：10-33、38-80、152-245與348-363提出之聚胜肽。某些實施例中，可應用重鏈的部分，包括重鏈的變異區。本揭露描述之重鏈變異區的非限制實例係提供於序列編號：152-159與348-363。
抗-hGM-CSF單株抗體與其之抗原結合片段中，輕鏈可為λ輕鏈或K輕鏈或上述之一部分。特定實施例中，例如申請專利範圍第7項所述之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，λ輕鏈包含一或兩者下列胺基酸取代：R100G與A153G。(包含R100G取代、A153G取代或R100G與A153G取代兩者)。應當注意本文所述之抗體鏈之胺基酸序列中的取代係藉由參照適當參考胺基酸序列加以描述，藉此任一輕鏈或其之片段中位置100與153的指定應根據本發明藉由比較序列編號：35與序列編號：34而加以確定，因為若與序列編號：34的序列相比這些對應序列編號：35胺基酸位置之胺基酸位置中R係由G且A係由G分別取代。例如，上方實例中，λ輕鏈可包含一或兩者上述之胺基酸取代，參考胺基酸序列係EV1018輕鏈(EV1018-野生型-原始；序列編號：34)。R100G代表EV1018輕鏈中位置100處的R(精胺酸)由G(甘胺酸)所取代；A153G代表EV1018輕鏈中位置153處的A(丙胺酸)由G(甘胺酸)所取代。
特定實施例中，諸如申請專利範圍第2-8項任一項所述之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，輕鏈係選自下列所構成之群組：序列編號：34-37、184-221與364-365提出之聚胜肽(其之胺基酸殘基)。本文所述之輕鏈變異區的實例係提供於序列編號：184-201與364-365。
結合hGM-CSF之抗-hGM-CSF單株抗體的重鏈或其之抗原結合片段可包括一或更多胺基酸取代，諸如T97A、T97V、N95D、N95E、N95K、N95Q、N93Q/N95T、K144R、L164A、L165A與K144R。應當注意本文所述之抗體鏈的胺基酸序列之取代係參照適當的參考胺基酸序列，且為了確定位置應當應用上述R100G與A153G取代中的相同原則。例如，上方實例中，重鏈可包含一或更多所述之胺基酸取代，參考胺基酸序列為EV1018重鏈(EV1018；序列編號：10)。例如，T97A表示EV1018重鏈中位置97處的T(蘇胺酸)由A(丙胺酸)所取代；L164A表示EV1018重鏈中位置164處的L(白胺酸)由A(丙胺酸)所取代。
重鏈可包括一或者二或更多這些胺基酸取代之組合以及其他不實質危及抗體或其之抗原結合片段結合且中和hGM-CSF活性之能力的取代。
本發明更詳細的實施例係列舉於下：一實施例中，抗-hGM-CSF單株抗體或其之片段如同申請專利範圍第2項所請求般，其中重鏈包括一或更多選自下列所構成之群組的胺基酸取代或者其之一或組合：T97A、T97V、N95D、N95E、N95K、N95Q、N93Q/N95T、K144R、L164A、L165A與K144R。進一步實施例中，抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段如同申請專利範圍第2項所請求般，其中重鏈包括一或更多選自下列所構成之群組的胺基酸取代：T97A、T97V、N95D、N95E、N95K、N95Q、N93Q/N95T、K144R、L164A、L165A與K144R，且其中輕鏈包含一或兩者下列胺基酸取代R100G與A153G。
進一步實施例係結合hGM-CSF的抗-hGM-CSF單株抗體或結合hGM-CSF的其之抗原結合片段，例如申請專利範圍第2-12項任一項所請求般，其中VH
-CDR1包括胺基酸殘基SYGMH(序列編號：4)或SHAMH(序列編號：333)。
結合hGM-CSF的抗-hGM-CSF單株抗體或結合hGM-CSF的其之抗原結合片段，例如申請專利範圍第2-13項任一項所請求般，其中VH
-CDR2包括胺基酸殘基LTYHHGNRKFYADSVRG(序列編號：5)或VIWHDGSKKYYADSVKG(序列編號：334)係本文所述之進一步實施例。
結合hGM-CSF的抗-hGM-CSF單株抗體或結合hGM-CSF的其之抗原結合片段，例如申請專利範圍第2-14項任一項所請求般，其中VH
-CDR3包括胺基酸殘基ESMGAINDN(序列編號：6)或EWVGGTCDS(序列編號：335)亦為本文所述之實施例。
本發明進一步實施例係如下：結合hGM-CSF的抗-hGM-CSF單株抗體或結合hGM-CSF的其之抗原結合片段，例如申請專利範圍第2-15項任一項所請求般，其中VL
-CDR1包括胺基酸殘基IGNNNNIGSHAVG(序列編號：7)或SGNSSNIGSYAVG(序列編號：330)；結合hGM-CSF的抗-hGM-CSF單株抗體或結合hGM-CSF的其之抗原結合片段，例如申請專利範圍第2-16項任一項所請求般，其中VL
。CDR2包括胺基酸殘基GRSPPS(序列編號：8)或GKSPAS(序列編號：331)；及結合hGM-CSF的抗-hGM-CSF單株抗體或結合hGM-CSF的其之抗原結合片段，例如申請專利範圍第2-17項任一項所請求般，其中VL
-CDR3包括胺基酸殘基STWDSSLSAVV(序列編號：9)或STWDSRLSAVL(序列編號：332)。
本發明額外實施例係關於結合hGM-CSF的抗-hGM-CSF單株抗體或結合hGM-CSF的其之抗原結合片段，如申請專利範圍第2-20項任一項所請求般，更包括信號序列。
信號序列可為多種熟悉技術人士習知的信號序列，例如用於允許或提高表現與/或傳送編碼產物離開細胞(產生信號之地)的任何信號序列，包括(但不限於)選自下列所構成之群組的信號序列：序列編號：324、325與326。
所有實施例中，抗-hGM-CSF單株抗體可為人類抗體、人類化抗體或單鏈抗體。例如，抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段可如同申請專利範圍第1-20項任一項所請求般，其中抗體係人類抗體、人類化抗體或單鏈抗體。
出乎意料地，如本揭露之實施例中所示，各個這些抗體針對抗原(hGM-CSF)所測得之結合親合力並未與其之中和能力(例如，中和hGM-CSF生物活性的能力)線性相關。此發現與較高的親合力對應較高的中和能力這種普遍想法相反。如表7所示，發現到本發明之抗體(即，利用本文所述之CDR來辨別本文所述之表位的抗體，例如EV1018)在TF-1試驗中顯示的抑制超出先前技術抗體100倍，但結合親合力係低於先前技術抗體的50%。這與WO2006/122797的教示相反，其顯示較高抗體親合力具有TF-1試驗中較高的活性。
人類周圍血液單核細胞與腫瘤細胞株TF-1可回應hGM-CSF刺激而增殖。藉由測量對其增殖的抑制效應來確認抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段的中和活性。已知在hGM-CSF存在下培養時，人類周圍血液單核白血球與TF-1細胞會增殖。可藉由將本發明之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段加入培養系統，或者藉由首先將hGM-CSF與本發明之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段反應接著將其加入培養系統來抑制上述增殖。例如，本發明之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段在約2ng/ml(約14pM)的濃度下，相對於陰性患者(31pg/ml的hIgG)可具有40-60%(約50%)的細胞靜止率作為hGM-CSF引發細胞增殖中針對TF-1細胞的中和活性。
本發明中之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段具有針對hGM-CSF的中和能力，其高於現存抗-hGM-CSF單株抗體。因此，預期可以較少數量或劑量將其當作治療劑來治療hGM-CSF引起的不同疾病，諸如過敏性皮膚炎、自體免疫疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、氣喘、囊狀纖維化症、間質性肺病、鼻炎、關節炎與相關之關節病、類風濕性關節炎、牛皮癬、骨髓性白血病、多發性硬化症。
本文揭露之抗-hGM-CSF抗體與抗原結合片段有效於中和hGM-CSF的生物活性，並因此用來治療個體中與hGM-CSF異常表現相關(例如，其所引發)之醫學症狀(例如，疾病或異常)。因此，上述治療應用應包含於本發明中。
本文所用之詞彙「與hGM-CSF過度表現相關之疾病或異常」應通常代表「hGM-CSF導致的疾病」。詞彙應包括個體具有GM-CSF時任何導致或加劇病狀的疾病。詞彙亦包括其他導致或加劇病生理學的疾病。預期抑制GM-CSF的生物活性可減緩GM-CSF導致的疾病症狀與/或可減緩疾病進展。本文交替應用詞彙「疾病」、「異常」與「症狀」。這些包括(但不限於)：呼吸疾病、不同起因的阻塞性肺病、不同起因的肺氣腫、限制性肺病、間質性肺部疾病、間質性肺病、囊狀纖維化症、不同起因的支氣管炎、支氣管擴張、ARDS(成人呼吸窘迫症候群)與所有形式的肺水腫；阻塞性肺病，其選自COPD(慢性阻塞性肺病)、氣喘、支氣管氣喘、小兒氣喘、嚴重型氣喘、急性氣喘發作與慢性支氣管炎之中；肺氣腫，其之起因在於COPD(慢性阻塞性肺病)或α1-蛋白酶抑制物不足；限制性肺病，其選自過敏性肺泡炎、工作相關有毒物質引發的限制性肺病(諸如，石棉沈著症或矽肺病)與肺癌引起的限制(諸如，入侵轉移性淋巴瘤(lymphangiosis carcinomatosa)、支氣管肺泡細胞癌與淋巴瘤)；感染引起的肺炎(諸如，病毒、細菌、真菌、原生動物、蛔蟲或其他病原體感染)、不同因子引起的肺炎(例如，呼吸與左心臟不足症)、輻射引起的肺炎或纖維化、膠原化症(collagenoses)(例如，紅斑性狼瘡)、全身硬皮症或類肉瘤(sarcoidosis)、肉芽腫(例如，伯克氏症(Boeck'sdisease)、原發性間質性肺炎或原發性肺纖維化症(IPF)；粘液粘稠病(mucoviscidosis)、細菌或病毒感染引起的支氣管炎、過敏性支氣管炎與毒性支氣管炎；支氣管擴張；肺水腫，例如呼吸或吸入毒性物質與外來物質之後的毒性肺水腫；鼻炎、關節炎與相關之關節病、牛皮癬、骨髓性白血病、多發性硬化症、阿滋海默症、腎絲球腎炎與慢性異位性皮膚炎。
本文所用之詞彙「治療」通常意指對個體施加治療以取得所有或任一下列結果：減緩或改善與人類GM-CSF異常表現與/或活性相關之疾病、異常或症狀的進展、嚴重性與/或周期、或改善一或多個起因於施加一或多個治療(例如，GM-CSF抗體)的其之症候。
本文所用之詞彙「治療有效劑量」意指治療(例如，免疫專一性結合人類GM-CSF的抗體)的劑量足以減少與人類GM-CSF異常表現與/或活性相關之異常的嚴重性、減少與人類GM-CSF異常表現與/或活性相關之異常的持續時間、改善與人類GM-CSF異常表現與/或活性相關之異常的一或多個徵候、預防與人類GM-CSF異常表現與/或活性相關之異常的進展、造成與人類GM-CSF異常表現與/或活性相關之異常的復原或提高或改善另一治療的治療效應。
施加之抗-hGM-CSF單株抗體的數量(例如，藉由施加本文所述之組合物)將取決於下列原因而有所變化：即將治療的症狀、疾病或異常；接受治療之受試者(個體)的年紀、性別與健康狀態；與即將治療之症狀、疾病或異常的嚴重性或其之進展程度。利用習知方法並參照受試者需求可實驗性地決定適當劑量。一般而言，以不超過500mg/劑的劑量將抗-hGM-CSF單株抗體或抗原結合片段施加至受試者。亦可施加較小劑量。
其他實施例中，可結合上列的任一抗體與片段。某些實施例中，可結合2、3、4、5或更多上述抗體、片段或上述之組合。
某些實施例中，可將上述任一實施例進一步結合一或更多先前已知的抗-GM-CSF抗體、片段或上述之組合。
另一實施例係包括(一，至少一)本文所述之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段的治療組合物。一實施例中，治療組合物包括一或更多抗-hGM-CSF單株抗體或抗原結合片段(辨別下列hGM-CSF中的ELYK(序列編號：2)與TMMASHYKQH(序列編號：3))與藥學可接受載體。治療組合物可包括任一本文所述之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，個別地(治療組合物中一種類型或種類的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段)或組合地，諸如二或更多種類或類型之抗-hGM-CSF單株抗體的組合；二或更多種類或類型之其抗原結合片段的組合；一或更多種類或類型之抗-hGM-CSF單株抗體與二或更多種類或類型之其抗原結合片段的組合；或者二或更多種類或類型之抗-hGM-CSF單株抗體與一或更多種類或類型之其抗原結合片段的組合。
特定實施例係包括(一或超過一)結合hGM-CSF之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段與藥學可接受載體的治療組合物，抗體或其之抗原結合片段包括(a)重鏈或重鏈的部分(如果係抗體片段)，其包括VH
-CDR1、VH
-CDR2與VH
-CDR3，其中式FTFS(Y/H)(G/A)MH(序列編號：314)代表包含VH
-CDR1之共有序列；其中式(L/V)(T/I)(Y/W)HXGX(R/K)K(F/Y)YADSV(R/K)G(序列編號：315)代表包含VH
-CDR2之共有序列；而其中式EX(M/V)G(A/G)XXDX(序列編號：316)代表包含VH
-CDR3之共有序列；及(b)輕鏈或輕鏈的部分(如果係抗體片段)，其包括VL
-CDR1、VL
-CDR2與VL
-CDR3，其中式XGNXXNIGS(H/Y)AVG(序列編號：317)代表包含VL
-CDR1之共有序列；其中式G(R/K)SP(A/P)SG(序列編號：318)代表包含VL
-CDR2之共有序列；而其中式STWDS(R/S)LSAV(V/L)(序列編號：319)代表包含VL
-CDR3之共有序列，其中抗-hGM-CSF單株抗體或其之片段辨別下列hGM-CSF中的ELYK(序列編號：2)與TMMASHYKQH(序列編號：3)。
本文所述之組合物包括二或更多結合hGM-CSF的抗-hGM-CSF單株抗體、二或更多結合hGM-CSF的其之抗原結合片段或上述之組合；與藥學可接受載體，其中一或更多抗-hGM-CSF單株抗體或一或更多其之抗原結合片段辨別hGM-CSF中的間斷表位ELYK(序列編號：2)與TMMASHYKQH(序列編號：3)。
本文所述之進一步實施例的組合物包括二或更多結合hGM-CSF的抗-hGM-CSF單株抗體、二或更多其之抗原結合片段、或上述之組合；與藥學可接受載體，其中一或更多抗體或一或更多其之抗原結合片段包括(a)重鏈，其包括VH
-CDR1、VH
-CDR2與VH
-CDR3，其中式FTFS(Y/H)(G/A)MH(序列編號：314)代表包含VH
-CDR1之共有序列；其中式(L/V)(T/I)(Y/W)HXGX(R/K)K(F/Y)YADSV(R/K)G(序列編號：315)代表包含VH
-CDR2之共有序列；而其中式EX(M/V)G(A/G)XXDX(序列編號：316)代表包含VH
-CDR3之共有序列；及(b)輕鏈或輕鏈的部分(如果係抗體片段)，其包括VL
-CDR1、VL
-CDR2與VL
-CDR3，其中式XGNXXNIGS(H/Y)AVG(序列編號：317)代表包含VL
-CDR1之共有序列；其中式G(R/K)SP(A/P)SG(序列編號：318)代表包含VL
-CDR2之共有序列；而其中式STWDS(R/S)LSAV(V/L)(序列編號：319)代表包含VL
-CDR3之共有序列，其中抗-hGM-CSF單株抗體或其之片段辨別下列hGM-CSF中的ELYK(序列編號：2)與TMMASHYKQH(序列編號：3)。
本文所述之進一步主題係申請專利範圍第26或27項之組合物，其中二或更多結合hGM-CSF之抗-hGM-CSF單株抗體的至少一者之聚胜肽係選自下列所構成之群組：序列編號：10-33、38-80、152-183、34-37、184-221、222-245、320-323與348-365。除了一或更多本文所述之抗-hGM-CSF單株抗體之外，組合物可包括其他抗-hGM-CSF單株抗體，例如先前描述之那些抗體。(參見，諸如PCT申請國際公開案WO2006/122797 A2(Morphosys)；PCT申請國際公開案WO 2007/092939 A2(Morphotek)；及PCT申請國際公開案WO 2006/11353 A2))。
可將本文揭露之抗-hGM-CSF抗體或其之抗原結合片段以及包括上述抗體之組合物提供成套組，其因此包含於本發明中。可將套組提供成不同型式，且除了藥劑(治療組合物)之外，套組亦可包括藥物或手段(通常來自醫生的處方籤)的包裝與/或標籤。套組通常包括印好的操作指南資料。某些實施例中，將配方組合物(例如，藥劑)提供於一或更多容器。某些實施例中，容器可為用於配置施加之藥劑的裝置。例如，可將本發明之藥劑預先測量(例如，分配)於單一使用分配者並提供成套組。某些實例中，容器係注射器。可選擇性預先充填注射器。某些實例中，單一應用容器係預先充填、預先密封與拋棄型的。取決於特定藥劑的施加路徑與施加模式，套組可包括適當的成分。
本文所用之「藥劑可接受載體」包括任一或全部的生理相容溶液、分配媒介、塗覆劑、抗微生物劑或抗真菌劑、滲壓調整劑與吸收延緩劑。藥劑可接受載體的實例包括一或複數種試劑，諸如水、鹽水溶液、磷酸鹽緩衝液、葡萄糖、甘油、乙醇與上述之組合。許多實例中，組合物較佳包括有滲壓調整劑，諸如糖、多元醇或氯化鈉。多元醇可包括甘露醇或山梨醇。再者，藥劑可接受載體可包括少量的輔助物質，諸如濕潤劑、乳化劑、防腐劑與緩衝劑。輔助物質可提高抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段之組合物中的保存或效力。
適於非腸胃施加的醫藥組合物可包括本發明之抗-hGM-CSF單株抗體或抗原結合片段。當施加一種類型之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段時，較佳係將抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段調節成注射溶液中之抗體含量為0.1~250mg/m1。另一方面，當混合與應用複數種類型之抗體時，較佳係將抗體調節成注射溶液中之抗體含量為0.001~10mg/mL。再者，可任意地以其任何比例混合複數種類型的抗體。
可在火石或琥珀瓶、安瓿或預填注射器中製備注射溶液成液體或凍乾劑。可在pH15.0~7.0(pH6.0係最適合)之間應用L-組胺酸作為緩衝劑。最合適的L-組胺酸濃度係5-10mM。適合作為緩衝劑的其他試劑可為(但不限於)琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀。可將0~300mM濃度(就形成為液體的劑量而言，最適合的係150mM)的氯化鈉施加至緩衝劑以移除溶液中的毒性。凍乾劑型可包括冷凍保護劑；主要係0~10%比例(最適合的比例係0.5~1.0%)的蔗糖。適合作為冷凍保護劑的其他試劑可為漏蘆糖與乳糖。凍乾劑型可包括膨脹劑，主要係包括1~10%比例(最適合的比例係2~4%)的甘露醇。作為穩定劑，可將濃度1~50mM(最適合的係5~10mM)的主要L-甲硫胺酸施加至液體或凍乾劑兩者。其他適當膨脹劑中包括甘胺酸與精胺酸。可包括比例0~0.05%(最適合的比例係0.005~0.01%)的聚山梨醇酯(polysorbate)80作為介面活性劑。其他介面活性劑包括(但不限於)聚山梨醇酯20與BRIJ介面活性劑。
許多劑型可應用於本發明之組合物。例如，組合物之劑型應有液體、半固體與固體。包括有溶液(諸如，注射或灌注溶液)、分散液、懸浮液、藥片、藥丸、藥粉、脂質體與栓劑。劑型較佳係取決於施加方法與治療實例。組合物之劑型較佳係能夠注射的液體與灌注液。例如，組合物可包括其他應用至人類被動免疫作用的抗體。組合物較佳係用於非腸胃施加(諸如，顯示有靜脈內施加、皮下施加、腹部施加與肌肉內施加)。較佳實施例中，透過靜脈內灌注溶液或靜脈內注射來施加抗體。另一較佳實施例中，透過肌肉內注射或皮下注射來施加抗體。
通常應在無菌且穩定狀態下產生與存放治療組合物。可將組合物指定成適合高藥物濃度的溶液、微乳液、分散亦、脂質體或其他結構。藉由下列步驟配置能夠注射的無菌溶液。將所需數量的活性化合物(明確地說，抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段)混合於適當溶劑中。若有需要，將一或上述化合物之組合與活性化合物一起混合於適當溶劑中，接著藉由過濾來消毒以便製備溶液。一般而言，將基本分散媒介與活性化合物混合於包括其他所需化合物(來自上述媒介)的無菌容器中。當應用無菌凍乾粉來製備無菌注射溶液時，較佳係應用真空乾燥與噴霧乾燥法作為製備方法。透過製備方法，可自活性成分粉與用於過濾之無菌溶液取得任何其他所欲組合物。藉由下列手段適當地維持溶液的流動性。手段例如應用塗覆材料(例如，卵磷脂)、維持分散液所需之微粒尺寸並應用介面活性劑。組合物包括藥學吸收延遲劑(諸如，單硬脂酸與明膠)，藉此可讓人體長時間吸收注射組合物。
可透過技術習知之不同方法施加本發明之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段。諸如皮下注射、靜脈內注射或液體灌注之施加路徑/方法較佳係應用於不同治療中。施加路徑/方法取決於預期之結果。熟悉技術人士可理解施加路徑/方法包括植入、經皮貼片與藥物輸送系統。一實施例中，亦與製備活性化合物一起應用抗體(例如，控制釋放之藥劑，其可控制化合物的釋放)。生物相容之聚合物係生物可分解的。製備物可包括生物相容聚合物，諸如乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸脂(polyortito ester)與聚乳酸(polylactate)。製備這些藥劑的不同方法準以專利，且為熟悉技術之人士所習知。
一實施例中，口服施加抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段與例如非活性稀釋劑或食用與吸收載體。亦可將化合物(與其他成分，若想要的話)裝入硬或軟的明膠膠囊中、壓縮於藥片中或直接混合於受試者的食物中。用於治療的口服中，可將化合物與賦形劑混合並以能夠攝取的形式應用，諸如藥片、口頰錠、片劑(troche)、膠囊、酏劑(elixir)、懸浮液、藥漿與藥圓(oblate)。為了藉由非腸胃途徑以外之途徑施加本發明之化合物，必須將化合物塗覆在避免其喪失活性的材料中，並同時施加化合物與材料。
有可能在組合物中額外地包括額外活性化合物，其中額外活性化合物不包括針對非GM-CSF之抗原的抗體。一實施例中，將本發明中之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段與一或更多種類用於治療GM-CSFQ引之疾病的其他治療劑一起給藥或與其他治療劑同時施加，其中其他治療劑不是針對非GM-CSF之蛋白的抗體。例如，將本發明之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段與一或更多其他抗-GM-CSF抗體一起給藥。組合式治療的優點在於少量治療劑的有效作用。治療劑能夠避免毒性或併發症，兩者可伴隨不同的單一治療出現。
應廣泛地解釋本文所用之「同時施加」。例如，當將二或更多種類的抗-GM-CSF單株抗體或抗原結合片段施加至患者時，可將或不可將各個或某些抗體或其之片段提供成單一藥劑(例如，組合物)。某些實施例中，單一藥劑(例如，組合物)包括施加至受試者所有不同種類的抗-GM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，以致抗體或其之抗原結合片段以混合物同時呈現給患者。然而某些實施例中，將包括一或更多種類之抗體或抗原結合片段的二或更多藥劑(例如，組合物)分別地施加至受試者。當「分別地」施加時，可依序施加藥劑，例如一個接著一個。只要第一藥劑的效應與後繼藥劑(第二、第三等)的效應在時間上與受試者之目標細胞/組織內重疊而藉此招致增加(例如，協同)的治療結果的話，則將其理解成「同時」施加。
特別是當應用超過一種類型之本發明的抗-hGM-CSF單株抗體時，有可能提供遠高於醫藥組合物中一種類型之單株抗體所能提供的細胞成長抑制活性(中和生物活性)。因此，有可能以較小數量來提供所需的治療劑。
因此提供提高活性的方法，其特徵在於同時施加2或更多種類的抗-GM-CSF單株抗體，或者醫藥組合物或獸醫藥學組合物之特徵在於包括2或更多種類的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，2或更多種類的抗體選自下列(a)與(b)：
(a)抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，其之互補決定區(CDR)由序列編號：4-9、序列編號：330-335、序列編號：336-341或序列編號：342-347的胺基酸序列所代表，且其係專一於hGM-CSF，
(b)(a)的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，其之胺基酸序列中有一或更多肽基酸被取代、刪除、插入或附加，且其係專一於hGM-CSF。
相同的方式，本發明亦包括提高活性之方法，其之特徵在於同時施加複數種不同種類(此後稱為複數種)的本發明之抗-hGM-CSF單株抗體，或者醫藥組合物或獸醫藥學組合物包括複數種本發明之抗-hGM-CSF抗體。
任一實施例中，組合物可包括一類型或種類能夠中和hGM-CSF活性的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段。或者任一實施例中，組合物可包括二或更多類型或種類能夠中和hGM-CSF活性的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段。除了本文揭露之一或更多抗體或其之片段以外，上述組合物中的單株抗體與/或其之片段可包括先前揭露之抗-hGM-CSF單株抗體與/或其之片段。抗-hGM-CSF單株抗體與其之抗原結合片段、與包含上述抗體與/或其之抗原結合片段的治療組合物、醫藥組合物與藥學組合物可用來治療或預防hGM-CSF引起與/或與其過度表現(相對於對照組(例如，不具有疾病、症狀或異常的受試者)中的hGM-CSF表現水平)相關之疾病、異常或症狀。本文交替地應用詞彙疾病、異常與症狀。這些包括(但不限於)：呼吸疾病、不同起因的阻塞性肺病、不同起因的肺氣腫、限制性肺病、間質性肺部疾病、間質性肺病、囊狀纖維化症、不同起因的支氣管炎、支氣管擴張、ARDS(成人呼吸窘迫症候群)與所有形式的肺水腫；阻塞性肺病，選自COPD(慢性阻塞性肺病)、氣喘、支氣管氣喘、小兒氣喘、嚴重型氣喘、急性氣喘發作與慢性支氣管炎之中；肺氣腫，其之起因於COPD(慢性阻塞性肺病)或α1-蛋白酶抑制物不足；限制性肺病，其選自過敏性肺泡炎、工作相關有毒物質引發的限制性肺病(諸如，石棉沈著症或矽肺病)與肺癌引起的限制(諸如，入侵轉移性淋巴瘤、支氣管肺泡細胞癌與淋巴瘤)；感染引起的肺炎(諸如，病毒、細菌、真菌、原生動物、蛔蟲或其他病原體感染)、不同因子引起的肺炎(例如，呼吸與左心臟不足症)、輻射引起的肺炎或纖維化、膠原化症(例如，紅斑性狼瘡)、全身硬皮症或類肉瘤、肉芽腫(例如，伯克氏症、原發性間質性肺炎或原發性肺纖維化症(IPF)；粘液粘稠病、細菌或病毒感染引起的支氣管炎、過敏性支氣管炎與毒性支氣管炎；支氣管擴張；肺水腫，例如呼吸或吸入毒性物質與外來物質之後的毒性肺水腫；鼻炎、關節炎與相關之關節病、牛皮癬、骨髓性白血病、多發性硬化症、阿滋海默症、腎絲球腎炎與慢性異位性皮膚炎。
在抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段中包括藥學可接受載體之醫藥組合物被視為可有效對抗hGM-CSF引起的疾病。hGM-CSF過度表現引起的疾病可描述如下
(a)過敏性疾病，諸如氣喘、異位性皮膚炎與花粉熱，
(b)移植排斥，移植物對抗宿主疾病(GVHD)及
(c)自體免疫疾病，例如類風濕性關節炎。
不預期受限於任一特定機制，咸信GM-CSF過度表現至少部分地引起大量例如本文所列之那些疾病或異常。然而，亦有可能上述臨床症狀係由其他相關生物途徑受損而引起的，諸如，對應受體的正向調節(up-regulation)或一或更多受動途徑中的突變。因此，「與hGM-CSF過度表現相關之疾病或異常」應包括上述導致與hGM-CSF過度表現等效結果的症狀。
應用抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段(例如，本文所述者)製造或製備治療hGM-CSF過度表現(GM-CSF引起的水平)相關之疾病或異常的藥劑亦是實施例，其中抗體或其之抗原結合片段結合hGM-CSF並能夠中和hGM-CSF活性。上述抗-hGM-CSF單株抗體與其之抗原結合片段可為本文所述之任一者，諸如申請專利範圍第1-22項任一者所述。
應用辨別hGM-CSF中的ELYK(序列編號：2)與TMMASHYKQH(序列編號：3)之抗體或其之抗原結合片段來製造或製備藥劑係進一步的實施例。
進一步實施例係應用抗-hGM-CSF單株抗體與/或其之抗原結合片段來製造或製備藥劑，其中抗體或其之片段包括(a)重鏈，其包括VH
-CDR1、VH
-CDR2與VH
-CDR3，其中式FTFS(Y/H)(G/A)MH(序列編號：314)代表包含VH
-CDR1之共有序列；其中式(L/V)(T/I)(Y/W)HXGX(R/K)K(F/Y)YADSV(R/K)G(序列編號：315)代表包含VH
-CDR2之共有序列；而其中式EX(M/V)G(A/G)XXDX(序列編號：316)代表包含VH
-CDR3之共有序列；及(b)輕鏈、或者輕鏈或其之部分(如果係抗體片段)，其包括VL
-CDR1、VL
-CDR2與VL
-CDR3，其中式XGNXXNIGS(H/Y)AVG(序列編號：317)代表包含VL
-CDR1之共有序列；其中式G(R/K)SP(A/P)SG(序列編號：318)代表包含VL
-CDR2之共有序列；而其中式STWDS(R/S)LSAV(V/L)(序列編號：319)代表包含VL
-CDR3之共有序列。
進一步態樣中，本發明提供單離的抗-hGM-CSF抗體或上述抗體之抗原結合片段於製造藥劑。這些藥劑用於治療與hGM-CSF異常表現(例如，過度表現)相關之疾病、症狀或異常。為了此目的，可用本文所述之任一抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段來製造藥劑。
抗體或抗原結合片段辨別hGM-CSF中的ELYK(序列編號：2)與TMMASHYKQH(序列編號：3)。
某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括(a)重鏈，其包括VH
-CDR1、VH
-CDR2與VH
-CDR3，其中式FTFS(Y/H)(G/A)MH(序列編號：314)代表包含VH
-CDR1之共有序列；其中式(L/V)(T/I)(Y/W)HXGX(R/K)K(F/Y)YADSV(R/K)G(序列編號：315)代表包含VH
-CDR2之共有序列；而其中式EX(M/V)G(A/G)XXDX(序列編號：316)代表包含VH
-CDR3之共有序列；及(b)輕鏈、或者輕鏈或其之部分(如果係抗體片段)，其包括VL
-CDR1、VL
-CDR2與VL
-CDR3，其中式XGNXXNIGS(H/Y)AVG(序列編號：317)代表包含VL
-CDR1之共有序列；其中式G(R/K)SP(A/P)SG(序列編號：318)代表包含VL
-CDR2之共有序列；而其中式STWDS(R/S)LSAV(V/L)(序列編號：319)代表包含VL
-CDR3之共有序列。一實施例中，抗體或其之抗原結合片段以不超過400pM的KD
結合hGM-CSF，另一實施例中KD
小於約160pM(諸如，EV1018或EV1019)，根據實施例所述之技術藉此確定KD
。
本發明亦包括單離的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，以製造用於治療與hGM-CSF過度表現相關之疾病或異常的藥劑，其中抗體或其之抗原結合片段具有下列特徵。抗體或抗原結合片段包括(a)重鏈、或者重鏈或其之部分(如果係抗體片段)，其包括VH
-CDR1、VH
-CDR2與VH
-CDR3，其中式FTFS(Y/H)(G/A)MH(序列編號：314)代表包含VH
-CDR1之共有序列；其中式(L/V)(T/I)(Y/W)HXGX(R/K)K(F/Y)YADSV(R/K)G(序列編號：315)代表包含VH
-CDR2之共有序列；而其中式EX(M/V)G(A/G)XXDX(序列編號：316)代表包含VH
-CDR3之共有序列；及(b)輕鏈、或者輕鏈或其之部分(如果係抗體片段)，其包括VL
-CDR1、VL
-CDR2與VL
-CDR3，其中式XGNXXNIGS(H/Y)AVG(序列編號：317)代表包含VL
-CDR1之共有序列；其中式G(R/K)SP(A/P)SG(序列編號：318)代表包含VL
-CDR2之共有序列；而其中式STWDS(R/S)LSAV(V/L)(序列編號：319)代表包含VL
-CDR3之共有序列，且其中抗體或其之抗原結合片段中和hGM-CSF活性。不同實施例中，抗-hGM-CSF單株抗體或其抗原結合片段之增殖抑制試驗的IC50值係小於20pM、小於30pM、小於40pM、小於50pM、小於60pM、小於70pM、小於80pM、小於90pM或小於100pM，各個實例在ED80下執行TF-1增殖抑制試驗中確定且如同實施例所描述。特定實施例中，抗體或其之抗原結合片段之IC50值係小於20pM或小於30pM，在ED80下的TF-1增殖試驗中確定。
下述為辨別本發明提供之間斷表位之起始抗體的產生；然而，不應理解成受限於特定方法。技術領域中可替換所述特徵而不悖離本發明之範圍。
本發明之抗-hGM-CSF單株抗體與其之抗原結合部分係透過下列步驟衍生自取自原發性肺泡蛋白沈著症患者的血液：離析細胞株以產生抗體、自取得的抗體產生細胞庫中挑選抗體陽性細胞、並藉由親合力純化作用純化得自抗體陽性細胞之懸浮液的抗體。
1)分離對抗hGM-CSF之完整人類抗體產生細胞株自罹患原發性肺泡蛋白沈著症(IPAP)且血清中具有高水平抗-hGM-CSF單株抗體之患者血液中單離B-淋巴球。接著誘使B-淋巴球增殖。習知誘使增殖的方法。例如，將癌症誘導因子「Epstein-Barr病毒」(此後稱為EBV)應用在轉型方法(D.Kozbor等人)以誘使增殖。更明確地說，以EBV感染B-淋巴球，並誘使增殖。將增殖細胞存放成抗體產生細胞庫。
2)自抗體產生細胞庫單離單株抗體應用通常用於產生單株抗體之已知方法，自誘使增殖之細胞中挑出單株細胞。
自抗體產生細胞庫選出淋巴球以產生結合hGM-CSF之抗體。更明確地說，藉由限制稀釋法挑選產生結合hGM-CSF之抗體的細胞族群(株)。較佳係利用hGM-CSF與鼠抗-hIgG抗體(經標記以偵測結合hGM-CSF的部分)來應用ELISA。藉由反覆地培養選擇之抗體陽性細胞並篩選以取得僅產生所欲抗體之細胞族群(株)。直到「單離抗體產生細胞株」的步驟係描述於第1圖所示之流程圖。
3)利用A蛋白或G蛋白的親合力純化在純化抗-hGM-CSF單株抗體時，有可能將選擇之永生化細胞培養於Roller瓶(2升攪拌瓶)或其他培養系統。過濾並濃縮懸浮液。接著，藉由具有A蛋白-瓊脂糖凝膠(Sepharose)或G蛋白-瓊脂糖凝膠等(New Jersey,Piscataway,Pharmacia Corp.)之親合力層析來純化蛋白。在將緩衝溶液換成PBS之後，以280nm的OD或較佳藉由懸液計分析來測量蛋白濃度。藉由針對亞型抗原的抗原特定方法來確定抗體亞型。
得到之抗-hGM-CSF單株抗體係完全人類抗體，其係由人體中敏化之B-淋巴球所產生，藉此抗-hGM-CSF單株抗體很少顯示針對抗體的免疫反應。當選殖抗體產生細胞時，以EB病毒感染B-淋巴球並藉由EB病毒活性誘使其增殖。因此，特徵在於藉由應用上述EB病毒活性來選殖抗體產生細胞。EB病毒方法的優點係在人體中產生天然抗體及取得高親合力抗體。例如，抗-hGM-CSF單株抗體的親合力係人工免疫小鼠產生之抗體的10-100倍高。庫包括一群EB病毒感染而增殖的B-淋巴球。有可能自庫單離特定抗體產生細胞株並取得人類抗體。
如上所示，技術領域中可取代或轉換所述特徵而不悖離本發明之範圍。核酸、或體與宿主細胞可表現本發明中之重組抗體或其之抗原結合部分。這些亦包括於本發明中。
下表顯示的是EV1018之重鏈變體與輕鏈變體及EV1019之重鏈變體與輕鏈變體。表分別提供EV1018之重鏈與輕鏈變體及EV1019之重鏈與輕鏈變體，並使其可能確定EV1018與EV1019各個之重鏈與輕鏈所有可能的組合。熟悉技術之人士可利用技術習知方法與本文提供的資訊來產生任一組合。
進一步態樣中，本文揭露產生抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段之處理(方法)。一般而言，產生抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段之方法包括取得或產生實質由編碼免疫球蛋白(由重鏈與輕鏈或Fab區所構成)之DNA所構成之DNA；將產生之DNA以讓其操作性連接至適當啟動子的方式插入可複製之表現載體，藉此產生包括操作性連接至適當啟動子之DNA的載體；將載體導入宿主細胞，藉此產生包含載體之宿主細胞；在適合DNA表現與產生編碼之胜肽與抗-hGM-CSF單株抗體或抗原結合片段的條件下培養宿主細胞。可藉由技術中習知方法自宿主細胞或宿主細胞培養基重新取得得到之抗-hGM-CSF單株抗體或抗原結合片段。
更明確地說，處理包括產生至少VH
-CDR1、VH
-CDR2與VH
-CDR3及VL
-CDR1、VL
-CDR2與VL
-CDR3於宿主細胞中。方法包括將編碼VH
-CDR1、VH-CDR2、VH
-CDR3、VL
-CDR1、VL
-CDR2與VL
-CDR3之DNA導入適當的宿主細胞，將得到之宿主細胞(宿主細胞包含編碼VH
-CDR1、VH
-CDR2、VH
-CDR3、VL
-CDR1、VL
-CDR2、VL
-CDR3之DNA)維持於適合表現DNA(產生編碼之胜肽)的條件下，且形成/組裝抗-hGM-CSF單株抗體或抗原結合片段，藉此產生抗-hGM-CSF單株抗體或抗原結合片段。特定實施例中，VH
-CDR1呈現於FTFS(Y/H)(G/A)MH(序列編號：314)、VH
-CDR2呈現於(L/V)(T/I)(Y/W)HXGX(R/K)K(F/Y)YADSV(R/K)G(序列編號：315)、VH
-CDR3呈現於EX(M/V)G(A/G)XXDX(序列編號：316)、VL
-CDR1呈現於XGNXXNIGS(H/Y)AVG(序列編號：317)、VL
-CDR2呈現於G(R/K)SP(A/P)SG(序列編號：318)且VL
-CDR3呈現於STWDS(R/S)LSAV(V/L)(序列編號：319)；且產生之抗-hGM-CSF單株抗體或抗原結合片段結合hGM-CSF。編碼VH
-CDR1、VH
-CDR2、VH
-CDR3、VL
-CDR1、VL
-CDR2與VL
-CDR3之DNA可為一或多個單元(諸如，所有VH
/VL
成分可由一DNA所編碼，某些或所有成分可由不同DNA所編碼)。
例如，第一DNA可編碼完整的重鏈而第二DNA可編碼完整的輕鏈。完整的重鏈可選自序列編號：10-33、38-80、160-183、222-245、320與322所構成之群組而完整的輕鏈可選自序列編號：34-37、202-221、321與323所構成之群組。申請專利範圍第40項呈現一實施例，其中完整的重鏈係選自序列編號：10-33、38-80、160-183、222-245、320與322所構成之群組而完整的輕鏈可選自序列編號：34-37、202-221、321與323所構成之群組。
申請專利範圍第40或41項之處理可更包括單離抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段。
包括編碼VH
-CDR1與/或 VH
-CDR2與/或VH
-CDR3之DNA的載體亦係本文之主題。VH
-CDR1可為SYGMH(序列編號：4)或SHAMH(序列編號：333)、VH
-CDR2係LTYHHGNRKFYADSVRG(序列編號：5)或VIWHDGSKKYYADSVKG(序列編號：334)而VH
-CDR3係ESMGAINDN(序列編號：6)或EWVGGTCDS(序列編號：335)。
載體包括編碼VL
-CDR1、VL
-CDR2及VL
-CDR3之DNA，其中VL
-CDR1係IGNNNNIGSHAVG(序列編號：7)或SGNSSNIGSYAVG(序列編號：330)、VL
-CDR2係GRSPPS(序列編號：8)或GKSPAS(序列編號：331)而VL
-CDR3係STWDSSLSAVV(序列編號：9)或STWDSRLSAVL(序列編號：332)。
例如，重鏈與輕鏈的引導序列在蛋白成熟處理中被切除。切除之引導序列對最終抗體特性沒有影響。為了補足刪除之序列，在連接或PCR擴增方法中將選殖之cDNA併入合成寡核苷酸。本文可交替應用詞彙「引導序列」與「信號序列」。
替代處理中，可用一組短的重疊寡核苷酸合成整個變異區，接著以PCR擴增方法擴增寡核苷酸，以便完全得到變異區的人工克隆。
本發明另一態樣係關於編碼能夠結合hGM-CSF並中和hGM-CSF生物活性之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段的單離去氧核糖核酸(DNA)，其中單離的DNA之核苷酸序列編碼的胺基酸序列包括選自序列編號：4-9所構成之群組的至少一者。本發明亦包括單離的DNA，其中核苷酸序列編碼之胺基酸序列包括選自序列編號：330-335所構成之群組的至少一者。
當單離的去氧核糖核酸(DNA)編碼能夠結合hGM-CSF並中和hGM-CSF生物活性之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段時，下列的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段亦包括於本發明中：能在嚴格條件下與上述之DNA雜和的單離DNA。
下列載體與宿主細胞亦包括於本發明中：
1)包括單離DNA之載體，
2)與重組表現載體合併的宿主細胞。
再者，亦可藉由表現多變的scFv(變異區的單鏈片段)抗體來取得特定抗體，這係藉由利用當前發展的噬菌體呈現方法(利用基因工程技術表現重組抗體於噬菌體表面)人工重組VH
與VL
基因成噬菌體融合蛋白而達成。
可藉由熟悉技術人士習知的方法取得本發明之抗體片段，諸如編碼抗體之DNA的截短型所編碼之片段的重組表現、或蛋白質分解抗體胺基酸鏈，藉此熟悉技術人士應用標準生物試驗(例如，本文所述)來確定哪個片段維持抗體結合功能或中和活性。
本發明提供EV1018抗體本身及多種變形的EV1018抗體(例如，變體)概述於表A。某些實施例中，重鏈包含一或更多相對野生型重鏈序列之胺基酸取代。某些實施例中，輕鏈包含一或更多相對野生型EV1018輕鏈序列之胺基酸取代。某些實施例中，重鏈與輕鏈各自包含一或更多胺基酸取代。
某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括輕鏈EV1018-野生型-原型(序列編號：34)與一下列重鏈變體：EV1018(序列編號：10)、EV1018-野生型-IgG1KO(序列編號：11)、EV1018-T97A-IgG1KO(序列編號：12)、EV1018-T97V-IgG1KO(序列編號：13)、EV1018-N95D-IgG1KO(序列編號：14)、EV1018-N95E IgG1KO(序列編號：15)、EV1018-N95K IgG1KO(序列編號：16)、EV1018-N95Q IgG1KO(序列編號：17)、EV1018-N93Q-N95 TIgG1KO(序列編號：18)、EV1018-野生型-IgG1-BI(序列編號：19)、EV1018-T97A IgG1-BI(序列編號：20)、EV1018-T97V IgG1-BI(序列編號：21)、EV1018-N95D IgG1-BI(序列編號：22)、EV1018-N95E IgG1-BI(序列編號：23)、EV1018-N95K IgG1-BI(序列編號：24)、EV1018-N95Q IgG1-BI(序列編號：25)、EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI(序列編號：26)、EV1018-T97A IgG1-原型-恆定(序列編號：27)、EV1018-T97V IgG1-原型-恆定(序列編號：28)、EV1018-N95D IgG1-原型-恆定(序列編號：29)、EV1018-N95E IgG1-原型-恆定(序列編號：30)、EV1018-N95K IgG1-原型-恆定(序列編號：31)、EV1018-N95Q IgG1-原型-恆定(序列編號：32)、EV1018-N93Q-N95T IgG1-原型-恆定(序列編號：33)、EV1018-野生型-IgG1-KO-QVQL(序列編號：38)、EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL(序列編號：39)、EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL(序列編號：40)、EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL(序列編號：41)、EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL(序列編號：42)、EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL(序列編號：43)、EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL(序列編號：44)、EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL(序列編號：45)、EV1018-野生型-IgG1-QVQL-BI(序列編號：46)、EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI(序列編號：47)、EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI(序列編號：48)、EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI(序列編號：49)、EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI(序列編號：50)、EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI(序列編號：51)、EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI(序列編號：52)、EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI(序列編號：53)、EV1018-IgG2(序列編號：54)、EV1018-野生型-IgG2(序列編號：55)、EV1018-T97A-IgG2(序列編號：56)、EV1018-T97V-IgG2(序列編號：57)、EV1018-N95D-IgG2(序列編號：58)、EV1018-N95E-IgG2(序列編號：59)、EV1018-N95K-IgG2(序列編號：60)、EV1018-N95Q-IgG2(序列編號：61)、EV1018-N93Q-N95T-IgG2(序列編號：62)、EV1018-IgG4(序列編號：63)、EV1018-野生型-IgG4(序列編號：64)、EV1018-T97A-IgG4(序列編號：65)、EV1018-T97V-IgG4(序列編號：66)、EV1018-N95D-IgG4(序列編號：67)、EV1018-N95E-IgG4(序列編號：68)、EV1018-N95K-IgG4(序列編號：69)、EV1018-N95Q-IgG4(序列編號：70)、EV1018-N93Q-N95T-IgG4(序列編號：71)、EV1018-IgG4-SP(序列編號：72)、EV1018-野生型-IgG4-SP(序列編號：73)、EV1018-T97A-IgG4-SP(序列編號：74)、EV1018-T97V-IgG4-SP(序列編號：75)、EV1018-N95D-IgG4-SP(序列編號：76)、EV1018-N95E-IgG4-SP(序列編號：77)、EV1018-N95K-IgG4-SP(序列編號：78)、EV1018-N95Q-IgG4-SP(序列編號：79)與EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP(序列編號：80)。
某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括輕鏈EV1018-野生型-BI(序列編號：35)與一下列重鏈變體：EV1018(序列編號：10)、EV1018-野生型-IgG1KO(序列編號：11)、EV1018-T97A-IgG1KO(序列編號：12)、EV1018-T97V-IgG1KO(序列編號：13)、EV1018-N95D-IgG1KO(序列編號：14)、EV1018-N95EIgG1KO(序列編號：15)、EV1018-N95KIgG1KO(序列編號：16)、EV1018-N95Q IgG1KO(序列編號：17)、EV1018-N93Q-N95T IgG1KO(序列編號：18)、EV1018-野生型-IgG1-BI(序列編號：19)、EV1018-T97AIgG1-BI(序列編號：20)、EV1018-T97VIgG1-BI(序列編號：21)、EV1018-N95D IgG1-BI(序列編號：22)、EV1018-N95EIgG1-BI(序列編號：23)、EV1018-N95K IgG1-BI(序列編號：24)、EV1018-N95Q IgG1-BI(序列編號：25)、EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI(序列編號：26)、EV1018-T97A IgG1-原型-恆定(序列編號：27)、EV1018-T97V IgG1-原型-恆定(序列編號：28)、EV1018-N95D IgG1-原型-恆定(序列編號：29)、EV1018-N95E IgG1-原型-恆定(序列編號：30)、EV1018-N95K IgG1-原型-恆定(序列編號：31)、EV1018-N95Q IgG1-原型-恆定(序列編號：32)、EV1018-N93Q-N95T IgG1-原型-恆定(序列編號：33)、EV1018-野生型-IgG1-KO-QVQL(序列編號：38)、EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL(序列編號：39)、EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL(序列編號：40)、EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL(序列編號：41)、EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL(序列編號：42)、EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL(序列編號：43)、EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL(序列編號：44)、EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL(序列編號：45)、EV1018-野生型-IgG1-QVQL-BI(序列編號：46)、EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI(序列編號：47)、EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI(序列編號：48)、EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI(序列編號：49)、EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI(序列編號：50)、EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI(序列編號：51)、EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI(序列編號：52)、EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI(序列編號：53)、EV1018-IgG2(序列編號：54)、EV1018-野生型-IgG2(序列編號：55)、EV1018-T97A-IgG2(序列編號：56)、EV1018-T97V-IgG2(序列編號：57)、EV1018-N95D-IgG2(序列編號：58)、EV1018-N95E-IgG2(序列編號：59)、EV1018-N95K-IgG2(序列編號：60)、EV1018-N95Q-IgG2(序列編號：61)、EV1018-N93Q-N95T-IgG2(序列編號：62)、EV1018-IgG4(序列編號：63)、EV1018-野生型-IgG4(序列編號：64)、EV1018-T97A-IgG4(序列編號：65)、EV1018-T97V-IgG4(序列編號：66)、EV1018-N95D-IgG4(序列編號：67)、EV1018-N95E-IgG4(序列編號：68)、EV1018-N95K-IgG4(序列編號：69)、EV1018-N95Q-IgG4(序列編號：70)、EV1018-N93Q-N95T-IgG4(序列編號：71)、EV1018-IgG4-SP(序列編號：72)、EV1018-野生型-IgG4-SP(序列編號：73)、EV1018-T97A-IgG4-SP(序列編號：74)、EV1018-T97V-IgG4-SP(序列編號：75)、EV1018-N95D-IgG4-SP(序列編號：76)、EV1018-N95E-IgG4-SP(序列編號：77)、EV1018-N95K-IgG4-SP(序列編號：78)、EV1018-N95Q-IgG4-SP(序列編號：79)與EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP(序列編號：80)。
某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括輕鏈EV1018-野生型-B12(G1)(序列編號：36)與一下列重鏈變體：EV1018(序列編號：10)、EV1018-野生型-IgGlKO(序列編號：11)、EV1018-T97A-IgGlKO(序列編號：12)、EV1018-T97V-IgGlKO(序列編號：13)、EV1018-N95D-IgGlKO(序列編號：14)、EV1018-N95EIgGlKO(序列編號：15)、EV1018-N95KIgGlKO(序列編號：16)、EV1018-N95Q IgGlKO(序列編號：17)、EV1018-N93Q-N95T IgGlKO(序列編號：18)、EV1018-野生型-IgGl-BI(序列編號：19)、EV1018-T97A IgGl-BI(序列編號：20)、EV1018-T97V IgGl-BI(序列編號：21)、EV1018-N95D IgGl-BI(序列編號：22)、EV1018-N95EIgGl-BI(序列編號：23)、EV1018-N95K IgGl-BI(序列編號：24)、EV1018-N95Q IgGl-BI(序列編號：25)、EV1018-N93Q-N95T IgGl-BI(序列編號：26)、EV1018-T97A IgGl-原型-恆定(序列編號：27)、EV1018-T97V IgGl-原型-恆定(序列編號：28)、EV1018-N95D IgG1-原型-恆定(序列編號：29)、EV1018-N95E IgG1-原型-恆定(序列編號：30)、EV1018-N95K IgG1-原型-恆定(序列編號：31)、EV1018-N95Q IgG1-原型-恆定(序列編號：32)、EV1018-N93Q-N95T IgG1-原型-恆定(序列編號：33)、EV1018-野生型-IgG1-KO-QVQL(序列編號：38)、EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL(序列編號：39)、EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL(序列編號：40)、EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL(序列編號：41)、EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL(序列編號：42)、EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL(序列編號：43)、EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL(序列編號：44)、EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL(序列編號：45)、EV1018-野生型-IgG1-QVQL-BI(序列編號：46)、EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI(序列編號：47)、EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI(序列編號：48)、EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI(序列編號：49)、EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI(序列編號：50)、EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI(序列編號：51)、EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI(序列編號：52)、EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI(序列編號：53)、EV1018-IgG2(序列編號：54)、EV1018-野生型-IgG2(序列編號：55)、EV1018-T97A-IgG2(序列編號：56)、EV1018-T97V-IgG2(序列編號：57)、EV1018-N95D-IgG2(序列編號：58)、EV1018-N95E-IgG2(序列編號：59)、EV1018-N95K-IgG2(序列編號：60)、EV1018-N95Q-IgG2(序列編號：61)、EV1018-N93Q-N95T-IgG2(序列編號：62)、EV1018-IgG4(序列編號：63)、EV1018-野生型-IgG4(序列編號：64)、EV1018-T97A-IgG4(序列編號：65)、EV1018-T97V-IgG4(序列編號：66)、EV1018-N95D-IgG4(序列編號：67)、EV1018-N95E-IgG4(序列編號：68)、EV1018-N95K-IgG4(序列編號：69)、EV1018-N95Q-IgG4(序列編號：70)、EV1018-N93Q-N95T-IgG4(序列編號：71)、EV1018-IgG4-SP(序列編號：72)、EV1018-野生型-IgG4-SP(序列編號：73)、EV1018-T97A-IgG4-SP(序列編號：74)、EV1018-T97V-IgG4-SP(序列編號：75)、EV1018-N95D-IgG4-SP(序列編號：76)、EV1018-N95E-IgG4-SP(序列編號：77)、EV1018-N95K-IgG4-SP(序列編號：78)、EV1018-N95Q-IgG4-SP(序列編號：79)與EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP(序列編號：80)。
某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括輕鏈EV1018-野生型-原型-恆定(序列編號：37)與一下列重鏈變體：EV1018(序列編號：10)、EV1018-野生型-IgGlKO(序列編號：11)、EV1018-T97A-IgGlKO(序列編號：12)、EV1018-T97V-IgGlKO(序列編號：13)、EV1018-N95D-IgG1KO(序列編號：14)、EV1018-N95EIgGlKO(序列編號：15)、EV1018-N95K IgGlKO(序列編號：16)、EV1018-N95Q IgG1KO(序列編號：17)、EV1018-N93Q-N95T IgG1KO(序列編號：18)、EV1018-野生型-IgG1-BI(序列編號：19)、EV1018-T97A IgG1-BI(序列編號：20)、EV1018-T97V IgG1-BI(序列編號：21)、EV1018-N95D IgG1-BI(序列編號：22)、EV1018-N95EIgG1-BI(序列編號：23)、EV1018-N95K IgG1-BI(序列編號：24)、EV1018-N95Q IgG1-BI(序列編號：25)、EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI(序列編號：26)、EV1018-T97A IgG1-原型-恆定(序列編號：27)、EV1018-T97V IgG1-原型-恆定(序列編號：28)、EV1018-N95D IgG1-原型-恆定(序列編號：29)、EV1018-N95EIgG1-原型-恆定(序列編號：30)、EV1018-N95K IgG1-原型-恆定(序列編號：31)、EV1018-N95Q IgG1-原型-恆定(序列編號：32)、EV1018-N93Q-N95T IgG1-原型-恆定(序列編號：33)、EV1018-野生型-IgG1-KO-QVQL(序列編號：38)、EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL(序列編號：39)、EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL(序列編號：40)、EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL(序列編號：41)、EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL(序列編號：42)、EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL(序列編號：43)、EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL(序列編號：44)、EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL(序列編號：45)、EV1018-野生型-IgG1-QVQL-BI(序列編號：46)、EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI(序列編號：47)、EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI(序列編號：48)、EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI(序列編號：49)、EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI (序列編號：50)、EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI(序列編號：51)、EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI(序列編號：52)、EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI(序列編號：53)、EV1018-IgG2(序列編號：54)、EV1018-野生型-IgG2(序列編號：55)、EV1018-T97A-IgG2(序列編號：56)、EV1018-T97V-IgG2(序列編號：57)、EV1018-N95D-IgG2(序列編號：58)、EV1018-N95E-IgG2(序列編號：59)、EV1018-N95K-IgG2(序列編號：60)、EV1018-N95Q-IgG2(序列編號：61)、EV1018-N93Q-N95T-IgG2(序列編號：62)、EV1018-IgG4(序列編號：63)、EV1018-野生型-IgG4(序列編號：64)、EV1018-T97A-IgG4(序列編號：65)、EV1018-T97V-IgG4(序列編號：66)、EV1018-N95D-IgG4(序列編號：67)、EV1018-N95E-IgG4(序列編號：68)、EV1018-N95K-IgG4(序列編號：69)、EV1018-N95Q-IgG4(序列編號：70)、EV1018-N93Q-N95T-IgG4(序列編號：71)、EV1018-IgG4-SP(序列編號：72)、EV1018-野生型-IgG4-SP(序列編號：73)、EV1018-T97A-IgG4-SP(序列編號：74)、EV1018-T97V-IgG4-SP(序列編號：75)、EV1018-N95D-IgG4-SP(序列編號：76)、EV1018-N95E-IgG4-SP(序列編號：77)、EV1018-N95K-IgG4-SP(序列編號：78)、EV1018-N95Q-IgG4-SP(序列編號：79)與EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP(序列編號：80)。
本發明提供抗體EV1019本身與許多的EV1019抗體之變形概述於表B。某些實施例中，重鏈包含一或更多相對野生型重鏈序列之胺基酸取代。某些實施例中，輕鏈包含一或更多相對野生型EV1019輕鏈序列之胺基酸取代。某些實施例中，重鏈與輕鏈各自包含一或更多胺基酸取代。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019(序列編號：160)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-野生型-IgGl-BI(序列編號：161)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-野生型-IgGlKO(序列編號：162)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105G(序列編號：163)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105G-IgG1-BI(序列編號：164)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105G-IgGlKO(序列編號：165)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105S(序列編號：166)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105S-IgG1-BI(序列編號：167)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105S-IgG1KO(序列編號：168)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105A(序列編號：169)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105A-IgG1-BI(序列編號：170)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105A-IgG1KO(序列編號：171)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-B12(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105Q(序列編號：172)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105Q-IgGl-BI(序列編號：173)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-B12(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105Q-IgGlKO(序列編號：174)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105T(序列編號：175)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105T-IgG1-BI(序列編號：176)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105T-IgG1KO(序列編號：177)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105M(序列編號：178)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105M-IgG1-BI(序列編號：179)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105M-IgG1KO(序列編號：180)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105L(序列編號：181)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105L-IgG1-BI(序列編號：182)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105L-IgG1KO(序列編號：183)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-IgG2(序列編號：222)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-野生型-IgG4(序列編號：223)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-野生型-IgG4SP(序列編號：224)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105G-IgG2(序列編號：225)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-B12(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105G-IgG4(序列編號：226)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105G-IgG4SP(序列編號：227)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105S-IgG2(序列編號：228)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105S-IgG4(序列編號：229)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105S-IgG4SP(序列編號：230)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105A-IgG2(序列編號：231)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105A-IgG4(序列編號：232)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105A-IgG4SP(序列編號：233)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105Q-IgG2(序列編號：234)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105Q-IgG4(序列編號：235)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105Q-IgG4SP(序列編號：236)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、
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本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105T-IgG2(序列編號：237)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：
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本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105T-IgG4(序列編號：238)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105T-IgG4SP(序列編號：239)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-B12(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
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本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105M-IgG4(序列編號：241)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105M-IgG4SP(序列編號：242)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105L-IgG2(序列編號：243)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105L-IgG4(序列編號：244)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
本發明某些實施例中，抗體或其之抗原結合片段包括重鏈EV1019-C105L-IgG4SP(序列編號：245)及選自下列所構成之群組的輕鏈：EV1019-野生型-原型(序列編號：202)、EV1019-野生型-BI(序列編號：203)、EV1019-野生型-BI2(序列編號：204)、EV1019-野生型-原型-恆定(序列編號：205)、EV1019-N25S(序列編號：206)、EV1019-N25S-BI2(序列編號：207)、EV1019-N25G(序列編號：208)、EV1019-N25G-BI2(序列編號：209)、EV1019-N25T(序列編號：210)、EV1019-N25T-BI2(序列編號：211)、EV1019-N25R(序列編號：212)、EV1019-N25R-BI2(序列編號：213)、EV1019-N25Q(序列編號：214)、EV1019-N25Q-BI2(序列編號：215)、EV1019-S27N(序列編號：216)、EV1019-S27N-BI2(序列編號：217)、EV1019-S27G(序列編號：218)、EV1019-S27G-BI2(序列編號：219)、EV1019-S27A(序列編號：220)與EV1019-S27A-BI2(序列編號：221)。
此外，可組合重鏈之變異區與輕鏈之變異區以產生結合抗原之Fab片段。上述保有相同或等效抗原結合能力之組合可用於產生不同的抗體結合片段形式，例如單鏈變異片段(scFv)。ScFv係免疫球蛋白之重鏈與輕鏈之變異區的融合，其係由短的連接子(通常係絲胺酸、甘胺酸)連接在一起，且習知於技術中。因此，可將EV1018重鏈之變異區與EV1018輕鏈之變異區組合。某些實施例中，重鏈與/或輕鏈之變異區可為變體，其包含一或更多相對於鏈之野生型序列的胺基酸改變。相似地，可將EV1019重鏈之變異區與EV1019輕鏈之變異區組合。某些實施例中，重鏈與/或輕鏈之變異區可為變體，其包含一或更多相對於鏈之野生型序列的胺基酸改變。
某些實施例中，任一下列1018重鏈變異區(諸如，野生型與其之變體)可與輕鏈變異區EV1018-VL-野生型-原型(序列編號：364)組合以形成結合hGM-CSF之抗原結合片段：EV1018-VH(序列編號：348)、EV1018-VH-野生型-(序列編號：349)、EV1018-VH-T97A(序列編號：350)、EV1018-VH-T97V(序列編號：351)、EV1018-VH-N95D(序列編號：352)、EV1018-VH-N95E(序列編號：353)、EV1018-VH-N95K(序列編號：354)、EV1018-VH-N95Q(序列編號：355)、EV1018-VH-N93Q-N95T(序列編號：356)、EV1018-VH-T97A IgG1-原型-恆定(序列編號：357)、EV1018-VH-T97V IgG1-原型-恆定(序列編號：358)、EV1018-VH-N95D IgG1-原型-恆定(序列編號：359)、EV1018-VH-N95E IgG1-原型-恆定(序列編號：360)、EV1018-VH-N95K IgG1-原型-恆定(序列編號：361)、EV1018-VH-N95Q IgG1-原型-恆定(序列編號：362)與EV1018-VH-N93Q-N95T IgG1-原型-恆定(序列編號：363)。
某些實施例中，任一下列1018重鏈變異區(諸如，野生型與其之變體)可與輕鏈變異區EV1018-VL-野生型-BI(序列編號：365)組合以形成結合hGM-CSF之抗原結合片段：EV1018-VH(序列編號：348)、EV1018-VH-野生型-(序列編號：349)、EV1018-VH-T97A(序列編號：350)、EV1018-VH-T97V(序列編號：351)、EV1018-VH-N95D(序列編號：352)、EV1018-VH-N95E(序列編號：353)、EV1018-VH-N95K(序列編號：354)、EV1018-VH-N95Q(序列編號：355)、EV1018-VH-N93Q-N95T(序列編號：356)、EV1018-VH-T97A IgG1-原型-恆定(序列編號：357)、EV1018-VH-T97V IgG1-原型-恆定(序列編號：358)、EV1018-VH-N95D IgG1-原型-恆定(序列編號：359)、EV1018-VH-N95E IgG1-原型-恆定(序列編號：360)、EV1018-VH-N95K IgG1-原型-恆定(序列編號：361)、EV1018-VH-N95Q IgG1-原型-恆定(序列編號：362)與EV1018-VH-N93Q-N95T IgG1-原型-恆定(序列編號：363)。
同樣地，某些實施例中，EV1019之抗原結合片段包括重鏈變異區EV1019-VH-野生型-(序列編號：152)及選自下列所構成之群組的輕鏈變異區：EV1019-VL-野生型-(序列編號：184)、EV1019-VL-BI(序列編號：185)、EV1019-VL-N25S(序列編號：186)、EV1019-VL-BI-N25S(序列編號：187)、EV1019-VL-N25G(序列編號：188)、EV1019-VL-BI-N25G(序列編號：189)、EV1019-VL-N25T(序列編號：190)、EV1019-VL-BI-N25T(序列編號：191)、EV1019-VL-N25R(序列編號：192)、EV1019-VL-BI-N25R(序列編號：193)、EV1019-VL-N25Q(序列編號：194)、EV1019-VL-BI-N25Q(序列編號：195)、EV1019-VL-S27N(序列編號：196)、EV1019-VL-BI-S27N(序列編號：197)、EV1019-VL-S27G(序列編號：198)、EV1019-VL-BI-S27G(序列編號：199)、EV1019-VL-S27A(序列編號：200)、EV1019-VL-BI-S27A(序列編號：201)。
某些實施例中，EV1019之抗原結合片段包括重鏈變異區EV1019-VH-C105G(序列編號：153)及選自下列所構成之群組的輕鏈變異區：EV1019-VL-野生型-(序列編號：184)、EV1019-VL-BI(序列編號：185)、EV1019-VL-N25S(序列編號：186)、EV1019-VL-BI-N25S(序列編號：187)、EV1019-VL-N25G(序列編號：188)、EV1019-VL-BI-N25G(序列編號：189)、EV1019-VL-N25T(序列編號：190)、EV1019-VL-BI-N25T(序列編號：191)、EV1019-VL-N25R(序列編號：192)、EV1019-VL-BI-N25R(序列編號：193)、EV1019-VL-N25Q(序列編號：194)、EV1019-VL-BI-N25Q(序列編號：195)、EV1019-VL-S27N(序列編號：196)、EV1019-VL-BI-S27N(序列編號：197)、EV1019-VL-S27G(序列編號：198)、EV1019-VL-BI-S27G(序列編號：199)、EV1019-VL-S27A(序列編號：200)、EV1019-VL-BI-S27A(序列編號：201)。
某些實施例中，EV1019之抗原結合片段包括重鏈變異區EV1019-VH-C105S(序列編號：154)及選自下列所構成之群組的輕鏈變異區：EV1019-VL-野生型-(序列編號：184)、EV1019-VL-BI(序列編號：185)、EV1019-VL-N25S(序列編號：186)、EV1019-VL-BI-N25S(序列編號：187)、EV1019-VL-N25G(序列編號：188)、EV1019-VL-BI-N25G(序列編號：189)、EV1019-VL-N25T(序列編號：190)、EV1019-VL-BI-N25T(序列編號：191)、EV1019-VL-N25R(序列編號：192)、EV1019-VL-BI-N25R(序列編號：193)、EV1019-VL-N25Q(序列編號：194)、EV1019-VL-BI-N25Q(序列編號：195)、EV1019-VL-S27N(序列編號：196)、EV1019-VL-BI-S27N(序列編號：197)、EV1019-VL-S27G(序列編號：198)、EV1019-VL-BI-S27G(序列編號：199)、EV1019-VL-S27A(序列編號：200)、EV1019-VL-BI-S27A(序列編號：201)。
某些實施例中，EV1019之抗原結合片段包括重鏈變異區EV1019-VH-C105A(序列編號：155)及選自下列所構成之群組的輕鏈變異區：EV1019-VL-野生型-(序列編號：184)、EV1019-VL-BI(序列編號：185)、EV1019-VL-N25S(序列編號：186)、EV1019-VL-BI-N25S(序列編號：187)、EV1019-VL-N25G(序列編號：188)、EV1019-VL-BI-N25G(序列編號：189)、EV1019-VL-N25T(序列編號：190)、EV1019-VL-BI-N25T(序列編號：191)、EV1019-VL-N25R(序列編號：192)、EV1019-VL-BI-N25R(序列編號：193)、EV1019-VL-N25Q(序列編號：194)、EV1019-VL-BI-N25Q(序列編號：195)、EV1019-VL-S27N(序列編號：196)、EV1019-VL-BI-S27N(序列編號：197)、EV1019-VL-S27G(序列編號：198)、EV1019-VL-BI-S27G(序列編號：199)、EV1019-VL-S27A(序列編號：200)、EV1019-VL-BI-S27A(序列編號：201)。
某些實施例中，EV1019之抗原結合片段包括重鏈變異區EV1019-VH-C105T(序列編號：156)及選自下列所構成之群組的輕鏈變異區：EV1019-VL-野生型-(序列編號：184)、EV1019-VL-BI(序列編號：185)、EV1019-VL-N25S(序列編號：186)、EV1019-VL-BI-N25S(序列編號：187)、EV1019-VL-N25G(序列編號：188)、EV1019-VL-BI-N25G(序列編號：189)、EV1019-VL-N25T(序列編號：190)、EV1019-VL-BI-N25T(序列編號：191)、EV1019-VL-N25R(序列編號：192)、EV1019-VL-BI-N25R(序列編號：193)、EV1019-VL-N25Q(序列編號：194)、EV1019-VL-BI-N25Q(序列編號：195)、EV1019-VL-S27N(序列編號：196)、EV1019-VL-BI-S27N(序列編號：197)、EV1019-VL-S27G(序列編號：198)、EV1019-VL-BI-S27G(序列編號：199)、EV1019-VL-S27A(序列編號：200)、EV1019-VL-BI-S27A(序列編號：201)。
某些實施例中，EV1019之抗原結合片段包括重鏈變異區EV1019-VH-C105M(序列編號：157)及選自下列所構成之群組的輕鏈變異區：EV1019-VL-野生型-(序列編號：184)、EV1019-VL-BI(序列編號：185)、EV1019-VL-N25S(序列編號：186)、EV1019-VL-BI-N25S(序列編號：187)、EV1019-VL-N25G(序列編號：188)、EV1019-VL-BI-N25G(序列編號：189)、EV1019-VL-N25T(序列編號：190)、EV1019-VL-BI-N25T(序列編號：191)、EV1019-VL-N25R(序列編號：192)、EV1019-VL-BI-N25R(序列編號：193)、EV1019-VL-N25Q(序列編號：194)、EV1019-VL-BI-N25Q(序列編號：195)、EV1019-VL-S27N(序列編號：196)、EV1019-VL-BI-S27N(序列編號：197)、EV1019-VL-S27G(序列編號：198)、EV1019-VL-BI-S27G(序列編號：199)、EV1019-VL-S27A(序列編號：200)、EV1019-VL-BI-S27A(序列編號：201)。
某些實施例中，EV1019之抗原結合片段包括重鏈變異區EV1019-VH-C105Q(序列編號：158)及選自下列所構成之群組的輕鏈變異區：EV1019-VL-野生型-(序列編號：184)、EV1019-VL-BI(序列編號：185)、EV1019-VL-N25S(序列編號：186)、EV1019-VL-BI-N25S(序列編號：187)、EV1019-VL-N25G(序列編號：188)、EV1019-VL-BI-N25G(序列編號：189)、EV1019-VL-N25T(序列編號：190)、EV1019-VL-BI-N25T(序列編號：191)、EV1019-VL-N25R(序列編號：192)、EV1019-VL-BI-N25R(序列編號：193)、EV1019-VL-N25Q(序列編號：194)、EV1019-VL-BI-N25Q(序列編號：195)、EV1019-VL-S27N(序列編號：196)、EV1019-VL-BI-S27N(序列編號：197)、EV1019-VL-S27G(序列編號：198)、EV1019-VL-BI-S27G(序列編號：199)、EV1019-VL-S27A(序列編號：200)、EV1019-VL-BI-S27A(序列編號：201)。
某些實施例中，EV1019之抗原結合片段包括重鏈變異區EV1019-VH-C105L(序列編號：159)及選自下列所構成之群組的輕鏈變異區：EV1019-VL-野生型-(序列編號：184)、EV1019-VL-BI(序列編號：185)、EV1019-VL-N25S(序列編號：186)、EV1019-VL-BI-N25S(序列編號：187)、EV1019-VL-N25G(序列編號：188)、EV1019-VL-BI-N25G(序列編號：189)、EV1019-VL-N25T(序列編號：190)、EV1019-VL-BI-N25T(序列編號：191)、EV1019-VL-N25R(序列編號：192)、EV1019-VL-BI-N25R(序列編號：193)、EV1019-VL-N25Q(序列編號：194)、EV1019-VL-BI-N25Q(序列編號：195)、EV1019-VL-S27N(序列編號：196)、EV1019-VL-BI-S27N(序列編號：197)、EV1019-VL-S27G(序列編號：198)、EV1019-VL-BI-S27G(序列編號：199)、EV1019-VL-S27A(序列編號：200)、EV1019-VL-BI-S27A(序列編號：201)。
本發明包括全長抗-hGM-CSF抗體或其抗原結合部分、或抗-hGM-CSF抗體的部分(當同時施加2或更多種類時)。因此，辨別hGM-CSF之雙專一性抗體與多專一性抗體亦包括於本發明中。
抗-hGM-CSF單株抗體或其抗原結合部分之變形係說明於上方說明書中，但可在技術領域中替換或轉換所述特徵而不悖離本發明之範圍。
也就是說，本發明之範圍內包括下列抗體或其之抗原結合部分：
(I)全長抗體與其之抗原結合部分，
(II)抗體的部分，及
(III)能夠專一性結合並中和hGM-CSF生物活性之重組人類單株抗體、單株抗體(包括嵌合抗體與人類化抗體)或其之抗原結合部分，其中重組人類單株抗體係藉由任何習知技術根據序列編號：4-9與330-335(代表變異區與CDR)之胺基酸序列而取得。
當應用上方之方法根據至少一選自本文所述之序列編號：4-9或330-335構成之各個群組的胺基酸序列而產生之特定抗體或其之抗原結合部分時，抗體或其之抗原結合部分亦包括於本發明中。
下方提供之表分別列出EV1018與EV1019抗體之有用的抗體鏈與片段。
更詳細地描述於本發明之下列實施例中。以專利申請範圍撰寫者習知的方式組織實施例的描述，因為這似乎有用於將此即將取得之專利申請案給予的保護範圍之教示舉例說明於說明書中。
項目1.一實施例係單離的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，其中抗體或其之抗原結合片段辨別hGM-CSF(序列編號：1)中的ELYK(序列編號：2)與TMMASHYKQH(序列編號：3)。
項目2.另一實施例係單離的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，其包括：
(a)重鏈，其包括VH
-CDR1、VH
-CDR2與VH
-CDR3，其中式FTFS(Y/H)(G/A)MH(序列編號：314)代表包含VH
-CDR1之共有序列；其中式(L/V)(T/I)(Y/W)HXGX(R/K)K(F/Y)YADSV(R/K)G(序列編號：315)代表包含VH
-CDR2之共有序列；而其中式EX(M/V)G(A/G)XXDX(序列編號：316)代表包含VH
-CDR3之共有序列；及(b)輕鏈、或者輕鏈或其之部分(如果係抗體片段)，其包括VL
-CDR1、VL-CDR2與VL
-CDR3，其中式XGNXXNIGS(H/Y)AVG(序列編號：317)代表包含VL
-CDR1之共有序列；其中式G(R/K)SP(A/P)SG(序列編號：318)代表包含VL
-CDR2之共有序列；而其中式STWDS(R/S)LSAV(V/L)(序列編號：319)代表包含VL
-CDR3之共有序列，其中抗體或其之抗原結合片段專一性結合hGM-CSF。
項目3.另一實施例係項目1或2下揭露之抗體或抗原結合片段，其除了項目1或2下提供之特徵外，更以小於160pM的KD
結合人類GM-CSF。
項目4.另一實施例係項目1-3任一者下揭露之抗體或其之抗原結合片段，其中抗體或抗原結合片段中和hGM-CSF活性，以致抗體或其之抗原結合片段的IC50值小於30pM(在ED80下之TF-1增殖試驗中確定)。
項目5.另一實施例係項目4下揭露之抗體或其之抗原結合片段，其中IC50值係小於20pM。
項目6.另一實施例係項目2-5任一者下揭露之抗體或其之抗原結合片段，其中重鏈係γ1
、γ2
、γ3
或γ4
。
項目7.另一實施例係項目2-6任一者下揭露之抗體或其之抗原結合片段，其中重鏈係選自序列編號：10-33、38-80與160-245所提出之聚胜肽構成的群組。
項目8.另一實施例係項目2-7任一者下揭露之抗體或其之抗原結合片段，其中輕鏈係λ輕鏈。
項目9.另一實施例係項目8下揭露之抗體或其之抗原結合片段，其中λ輕鏈包含一或兩者下列之胺基酸取代：R100G與A153G。
項目10.另一實施例係項目2-9任一者下揭露之抗體，其中輕鏈係選自序列編號：34-37與202-221所提出之聚胜肽構成的群組。
項目11.另一實施例係項目2-10任一者下揭露之抗體或其之抗原結合片段，其中輕鏈係K輕鏈。
項目12.另一實施例係項目2-11任一者下揭露之抗體或其之抗原結合片段，其中重鏈包含一或更多選自下列所構成之群組的胺基酸取代：T97A、T97V、N95D、N95E、N95K、N95Q、N93Q/N95T、K144R、L164A、L165A與K144R。
項目13.另一實施例係項目2-12任一者下揭露之抗體或其之抗原結合片段，其中重鏈包含一或更多選自下列所構成之群組的胺基酸取代：T97A、T97V、N95D、N95E、N95K、N95Q、N93Q/N95T、K144R、L164A、L165A與K144R，且其中輕鏈包含一或兩者下列之胺基酸取代：R100G與A153G。
項目14.另一實施例係項目2-13任一者下揭露之抗體或其之抗原結合片段，其中VH
-CDR1包括胺基酸殘基SYGMH(序列編號：4)或SHAMH(序列編號：333)。
項目15.另一實施例係項目2-14任一者下揭露之抗體或其之抗原結合片段，其中VH
-CDR2包括胺基酸殘基LTYHHGNRKFYADSVRG(序列編號：5)或VIWHDGSKKYYADSVKG(序列編號：334)。
項目16.另一實施例係項目2-15任一者下揭露之抗體或其之抗原結合片段，其中VH
-CDR3包括胺基酸殘基ESMGAINDN(序列編號：6)或EWVGGTCDS(序列編號：335)。
項目17.另一實施例係項目2-16任一者下揭露之抗體或其之抗原結合片段，其中VL
-CDR1包括胺基酸殘基IGNNNNIGSHAVG(序列編號：7)或SGNSSNIGSYAVG(序列編號：330)。
項目18.另一實施例係項目2-17任一者下揭露之抗體或其之抗原結合片段，其中VL
-CDR2包括胺基酸殘基GRSPPS(序列編號：8)或GKSPAS(序列編號：331)。
項目19.另一實施例係項目2-18任一者下揭露之抗體或其之抗原結合片段，其中VL
-CDR3包括胺基酸殘基STWDSSLSAVV(序列編號：9)或STWDSRLSAVL(序列編號：332)。
項目20.另一實施例係專一性結合hGM-CSF的單離抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，其中抗體或其之抗原結合片段包括6個不同CDR，其中6個CDR係序列編號：4-9所提出之聚胜肽。
項目21.另一實施例係專一性結合hGM-CSF的單離抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，其中抗體或其之抗原結合片段包括6個不同CDR，其中6個CDR係序列編號：327-332所提出之聚胜肽。
項目22.另一實施例係任一項目下所揭露之抗體或其之抗原結合片段，其更包括信號序列。
項目23.另一實施例係任一項目下所揭露之抗體或其之抗原結合片段，其中信號序列係選自序列編號：324、325與326所構成之群組。
項目24.另一實施例係單離的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，其包括重鏈與輕鏈，其中重鏈係EV1018(序列編號：10)或選自序列編號：11-33、38-80之變體，而其中輕鏈係EV1018-野生型-原型(序列編號：34)或選自序列編號：35-37之變體。
項目25.另一實施例係單離的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，其包括重鏈與輕鏈，其中重鏈係EV1019(序列編號：160)或選自序列編號：161-183與222-245之變體，且其中輕鏈係EV1019-野生型-原型(序列編號：202)或選自序列編號：203-221之變體。
項目26.另一實施例係包括重鏈變異區與輕鏈變異區之抗體或其之抗原結合片段，其中重鏈變異區係EV1018-VH(序列編號：348)或選自序列編號：349-363之變體，且其中輕鏈變異區iS EV1018-VL-野生型-原型(序列編號：364)或EV1018-VL-野生型-BI(序列編號：365)。
項目27.另一實施例係包括重鏈變異區與輕鏈變異區之抗體或其之抗原結合片段，其中重鏈變異區係EV1019-VH-野生型-(序列編號：152)或選自序列編號：153-159之變體，且其中輕鏈變異區係EV1019-VL-野生型-(序列編號：184)或選自序列編號：185-201之變體。
項目28.另一實施例係套組，其包括：(a)項目1-25任一者下揭露之抗體或其之抗原結合片段；及(b)一或更多容器。
項目29.另一實施例係組合物，其包括任一項目下揭露之抗體或其之抗原結合片段及藥學可接受載體。
項目30.另一實施例係項目29中揭露之組合物，其更包括結合hGM-CSF的第二單離抗體或其之抗原結合片段，以致組合物包括複數個結合hGM-CSF的抗體、其之抗原結合片段或上述之組合。
項目31.另一實施例係項目30中揭露之組合物，其中該複數結合hGM-CSF的抗體、其之抗原結合片段或上述之組合的至少一者係選自序列編號：10-80、152-245與320-323構成之群組的聚胜肽。
項目32.另一實施例係套組，其包括項目29-31任一者下揭露之組合物及一或更多容器。
項目33.另一實施例係項目32中揭露之套組，其更包括操作指南。
項目34.另一實施例係項目1-27與29-31任一者下揭露之抗體或其之抗原結合片段或組合物，用於治療受試者中與hGM-CSF過度表現相關之疾病或異常，其中抗體或其之抗原結合片段結合hGM-CSF並能夠中和hGM-CSF活性，且另一實施例係項目1-27與29-31任一者下揭露之抗體或其之抗原結合片段或組合物，用於製造或製備治療受試者中與hGM-CSF過度表現相關之疾病或異常的藥劑，其中抗體或其之抗原結合片段結合hGM-CSF並能夠中和hGM-CSF活性。
項目35.另一實施例係項目34中揭露之應用，其中疾病或異常係選自下列所構成之群組：慢性阻塞性肺病(COPD)、氣喘、囊狀纖維化症、間質性肺病、鼻炎、關節炎與相關之關節病、牛皮癬、骨髓性白血病、多發性硬化症。
項目36.另一實施例係項目34或35任一者下揭露之應用，其中抗體或抗原結合片段係以不超過最大容忍劑量之劑量被施加至受試者，其中最大容忍劑量係約500mg/劑。
項目37.另一實施例係項目1-27與29-31任一者下揭露之抗體或其之抗原結合片段或組合物，用於治療受試者中與hGM-CSF過度表現相關之疾病或異常，其中抗體或其之抗原結合片段結合hGM-CSF並能夠中和hGM-CSF活性。
項目38.另一實施例係項目37中揭露之應用，其中疾病或異常係選自下列所構成之群組：慢性阻塞性肺病(COPD)、氣喘、囊狀纖維化症、間質性肺病、鼻炎、關節炎與相關之關節病、牛皮癬、骨髓性白血病、多發性硬化症。
項目39.另一實施例係項目36或37任一者下揭露之應用，其中抗體或抗原結合片段係以不超過最大容忍劑量之劑量被施加至受試者，其中最大容忍劑量係約500mg/劑。
項目40.另一實施例係序列編號：2與3提出之聚胜肽中hGM-CSF的表位，其中表位由項目20或21任一者下揭露之抗體或其之抗原結合片段所辨別，且其中聚胜肽序列代表hGM-CSF(序列編號：1)的間斷片段。
項目41.另一實施例係表位，其係人類GM-CSF的間斷片段，其中表位包括所有或一部分的人類GM-CSF(序列編號：1)之胺基酸殘基77-80與人類GM-CSF(序列編號：1)之胺基酸殘基95-104，且表位由包括6個不同CDR(如序列編號：4-9或序列編號：330-335所提出)之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段所辨別。
項目42.另一實施例係在宿主細胞中產生結合hGM-CSF之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段(包括至少VH-CDR1、VH-CDR2與VH-CDR3及VL-CDR1、VL-CDR2與VL-CDR3)的方法，該方法包括：
(i)取得具有至少一編碼至少VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2與VL-CDR3之DNA的宿主細胞，及
(ii)在宿主細胞中表現DNA，其中：式FTFS(Y/H)(G/A)M H(序列編號：314)代表包含VH-CDR1之共有序列；其中式(L/V)(T/I)(Y/W)HXGX(R/K)K(F/Y)YADSV(R/K)G(序列編號：315)代表包含VH-CDR2之共有序列；其中式EX(M/V)G(A/G)XXDX(序列編號：316)代表包含VH-CDR3之共有序列；其中式XGNXXNIGS(H/Y)AVG(序列編號：317)代表包含VL-CDR1之共有序列；其中式G(R/K)SP(A/P)SG(序列編號：318)代表包含VL-CDR2之共有序列；及其中式STWDS(R/S)LSAV(V/L)(序列編號：319)代表包含VL-CDR3之共有序列；(iii)在適合DNA表現與抗體或其抗原結合片段產生的條件下培養宿主細胞。
項目43.另一實施例係項目42中揭露之方法，其中至少一DNA編碼重鏈與輕鏈，其中重鏈係選自序列編號：10-33、38-80、160-183、222-245所構成之群組；而其中輕鏈係選自序列編號：34-37、202-221所構成之群組。
項目44.另一實施例係項目42或43任一者下揭露之方法，其更包括單離抗體或其之抗原結合片段。
項目45.另一實施例係包括編碼VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3之DNA的載體，其中：VH-CDR1係SYGMH(序列編號：4)或SHAMH(序列編號：333)；VH-CDR2係LTYHHGNRKFYADSVRG(序列編號：5)或VIWHDGSKKYYADSVKG(序列編號：334)；及VH-CDR3係ESMGAINDN(序列編號：6)或EWVGGTCDS(序列編號：335)。
項目46.另一實施例係包括編碼VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3之DNA的載體，其中：VL-CDR1係IGNNNNIGSHAVG(序列編號：7)或SGNSSNIGSYAVG(序列編號：330)；VL-CDR2係GRSPPS(序列編號：8)或GKSPAS(序列編號：331)；及VL-CDR3係STWDSSLSAVV(序列編號：9)或STWDSRLSAVL(序列編號：332)。
項目47.另一實施例係辨別結合項目40或41任一者下揭露之表位的分子之方法，(i)利用包括表位之探針篩選生物樣本或胜肽庫，(ii)單離專一性結合探針的分子，及(iii)辨別分子。
項目48.另一實施例係項目47中揭露之方法，其中分子係抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段。
項目49.另一實施例係項目47或46任一者下揭露之方法，其中探針更包括可偵測標記。
項目50.另一實施例係項目47-49任一者下揭露之方法，其中探針係固定的。
項目51.另一實施例係能夠結合hGM-CSF(hGM-CSF)並中和hGM-CSF(hGM-CSF)生物活性之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其特徵在於抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分的互補決定區(CDR)係由一或更多選自序列編號：4-9構成之群組的胺基酸序列所代表。
項目52.另一實施例係能夠結合hGM-CSF並中和hGM-CSF生物活性之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其特徵在於抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分的互補決定區(CDR)係由一或更多選自序列編號：330-335構成之群組的胺基酸序列所代表。
項目53.另一實施例係項目51或52任一者下揭露之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其特徵在於抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分的胺基酸序列中互補決定區(CDR)內有一或更多胺基酸被取代、刪除、插入或附加。
項目54.另一實施例係項目51-53任一者下揭露之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其特徵在於當hGM-CSF引起TF-1細胞增殖時，抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分以約14pM的濃度抑制約50%的TF-1細胞增殖。
項目55.另一實施例係項目54中揭露之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其特徵在於抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分抑制周圍血液樹突細胞的增殖。
項目56.另一實施例係項目54中揭露之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其特徵在於抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分對hGM-CSF具有高親合力，其之KD
值係4x10-10
M或更小。
項目57.另一實施例係項目51-56任一者下揭露之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其特徵在於抗體屬於IgG1
(λ)類型(亞型)。
項目58.另一實施例係項目51-57任一者下揭露之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其特徵在於抗-hGM-CSF單株抗體係人類單株抗體。
項目59.另一實施例係hGM-CSF引起之疾病的醫藥組合物，其包括：項目51-58任一者下揭露之抗-hGM-CSF單株抗體或抗原結合部分及藥學可接受載體。
項目60.另一實施例係項目59中揭露之醫藥組合物，其特徵在於hGM-CSF過度表現引起之疾病係選自下列構成之群組的任一者：(a)過敏疾病，諸如氣喘、異位性皮膚炎與花粉熱，(b)移植排斥，移植物對抗宿主疾病(GVHD)，(c)自體免疫疾病，例如類風濕性關節炎。
項目61.另一實施例係編碼能夠結合hGM-CSF並中和hGM-CSF生物活性之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分的單離去氧核糖核酸(DNA)，其特徵在於單離的DNA編碼之胺基酸序列包括選自序列編號：4-9構成之群組的至少一者。
項目62.另一實施例係編碼能夠結合hGM-CSF並中和hGM-CSF生物活性之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分的單離DNA，其特徵在於單離的DNA編碼之胺基酸序列包括選自序列編號：330-335構成之群組的至少一者。
項目63.另一實施例係能夠在嚴格條件下與項目61或項目62所述之DNA雜合的單離DNA。
項目64.另一實施例係載體，其特徵在於項目61-63任一者所述之單離DNA係併於其中。
項目65.另一實施例係宿主細胞，其特徵在於項目64中揭露之重組表現載體係導入其中。
項目66.另一實施例係提高活性的方法，其特徵在於複數種類專一於相同特定抗原的抗-hGM-CSF單株抗體或其抗原結合部分係同時施加。
項目67.另一實施例係項目66中揭露之提高活性的方法，其特徵在於複數種類的抗-hGM-CSF單株抗體或其抗原結合部分包括二或更多選自下列(a)與(b)類型的抗體或其抗原結合部分：(a)抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其之互補決定區(CDR)係由序列編號：4-9、序列編號：330-335、序列編號：336-341或序列編號：342-347的胺基酸序列所代表，且其係專一於hGM-CSF，(b)(a)的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其之胺基酸序列中有一或更多胺基酸被取代、刪除、插入或附加，且其係專一於hGM-CSF。
項目68.另一實施例係項目67中揭露之提高活性的方法，其特徵在於當hGM-CSF引發TF-1細胞增殖時，二或更多類型的抗體或其抗原結合部分各自以約55pM的濃度抑制將近80% TF-1細胞增殖。
項目69.另一實施例係醫藥組合物或獸醫藥學組合物，其包括：複數種類專一於相同特定抗原的抗-hGM-CSF單株抗體或其抗原結合部分及藥學可接受載體。
項目70.另一實施例係項目69中揭露之醫藥組合物或獸醫藥學組合物，其特徵在於複數種類的抗-hGM-CSF單株抗體或其抗原結合部分包括二或更多選自下列(a)與(b)類型的抗體或其抗原結合部分：(a)抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其之互補決定區(CDR)係由序列編號：4-9、序列編號：330-335、序列編號：336-341或序列編號：342-347的胺基酸序列所代表，且其係專一於hGM-CSF，(b)(a)的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分，其之胺基酸序列中有一或更多胺基酸被取代、刪除、插入或附加，且其係專一於hGM-CSF。
項目71.另一實施例係項目70中揭露之醫藥組合物或獸醫藥學組合物，其特徵在於當hGM-CSF引發TF-1細胞增殖時，二或更多類型的抗體或其抗原結合部分各自以約55pM的濃度抑制將近80% TF-1細胞增殖。之後，更明確地描述本發明之實施例，但實施例並不限制本發明之範圍。
第1圖顯示單離抗體產生細胞株的流程圖。自捐贈者的血液(其之血清具有高的抗-GM-CSF單株抗體效價)單離B-淋巴球，接著以EBV感染。將EBV感染後的增殖細胞作為抗體產生細胞庫。
將抗體產生細胞庫的細胞分散於96孔盤上並培養3-4週。篩選各個孔之培養懸浮液是否存在抗-hGM-CSF單株抗體。藉由ELISA利用塗覆有重組hGM-CSF(rhGM-CSF)之96孔盤來執行篩選。將孔中產生抗體的陽性細胞植於新的96孔盤上並培養3-4週，接著各個孔之培養懸浮液接受第二次篩選抗-hGM-CSF單株抗體是否存在。孔中產生抗體的陽性細胞接受限數稀釋培養於96孔盤上3-5週。之後，確定各孔的培養懸浮液是否存在抗體，且最終自1細胞/孔配置的孔中取得抗體產生細胞株。
發明者辨別三個抗體產生細胞株EV1007、EV1018與EV1019(表1)產生之抗體的同型與亞型。藉由與篩選培養懸浮液中抗體產生物所用實質相同的ELISA來進行辨別，其利用培養懸浮液作為第一抗體而同型與亞型專一性抗體作為第二抗體。
表1顯示新取得的三個抗-hGM-CSF單株抗體與單株抗體J158 4C(之後稱為EV1003，其報導於國際PCT公開案WO 07/049472)的抗體名稱與其亞型。
自抗體產生細胞選殖抗體基因。自抗體產生細胞萃取整體RNA，並藉由利用寡-dT引子與逆轉錄酶來合成其之cDNA。
藉由利用cDNA為模板，可藉由PCR擴增編碼人類抗體之基因。根據抗體基因的DNA序列資料庫來設計引子以便5'端包含轉錄起始位置而3'端包含轉譯終止位置。
將抗體基因(EV1007、EV1018與EV1019，各自係由(H)重鏈與(L)輕鏈基因所構成)之cDNA選殖入質體載體，並藉由定序機(ABI)來分析其之核苷酸序列。根據取得的核苷酸序列來確定其之胺基酸序列。針對抗體(EV1007、EV1018、EV1019與EV1003)之互補決定區(CDR)的分析應用Kabat法。藉由序列編號：4-9與330-347表示四個抗體的CDR序列。明確地說，EV1018的L-鏈CDR1、L-鏈CDR2、L-鏈CDR3、H-鏈CDR1、H-鏈CDR2與H-鏈CDR3分別提出於序列編號：4-9。EV1019的L-鏈CDR1、L-鏈CDR2、L-鏈CDR3、H-鏈CDR1、H-鏈CDR2與H-鏈CDR3分別提出於序列編號：330-335。EV1003的L-鏈CDR1、L-鏈CDR2、L-鏈CDR3、H-鏈CDR1、H-鏈CDR2與H-鏈CDR3分別提出於序列編號：336-341。EV1007的L-鏈CDR1、L-鏈CDR2、L-鏈CDR3、H-鏈CDR1、H-鏈CDR2與H-鏈CDR3分別提出於序列編號：342-347。
將編碼三個抗體(各自係由H與L鏈構成)之基因插入表現載體中。利用Lipofectamine與PluS試劑(Invitrogen)將編碼各個抗體之L與H鏈基因的質體暫時轉染入293T細胞並試驗暫時抗體表現。
轉染後兩天，收集含有分泌之抗體的細胞培養懸浮液。藉由ELISA偵測培養懸浮液中的人類IgG與抗-GM-CSF單株抗體以確認人類抗體與抗-GM-CSF單株抗體的暫時表現。
如上述般將編碼抗-GM-CSF單株抗體之表現載體轉染入CHO-K1細胞。轉染後兩天，將細胞植入96-孔盤並培養於含有過當篩選標記之篩選培養基約兩週。藉由ELISA篩選各個孔之培養懸浮液中的抗-hGM-CSF單株抗體。將孔中抗體表現陽性的單一細胞配置於96-孔盤的孔中。以表現抗-GM-CSF單株抗體來篩選生長於篩選培養基中的單一細胞並取得穩定表現抗-GM-CSF單株抗體之細胞株。
將穩定表現抗-GM-CSF單株抗體之CHO細胞株培養於無血清培養基中。在各個表現週期後，收集培養懸浮液並透過親合力層析根據製造者指南利用HiTrap rProtein A FF預裝管柱(Amersham)來單離抗體。藉由ELISA證實單離的抗體具有對hGM-CSF的結合活性且藉由SDS-PAGE證實單離的抗體係由抗體約50kDaH-鏈與約25kDaL-鏈所構成。
為了計算重組hGM-CSF結合抗-hGM-CSF單株抗體的親合力常數，在Biacore SystemTM
上執行表面電漿共振子(SPR)(第2圖)。
分析抗體與抗原間之交互作用的方法中，透過與G蛋白(固定於感應晶片表面)的交互作用而在感應晶片上獲得純化的抗體，接著將重組抗原注至感應晶片。應用純化的抗體並將重組hGM-CSF當作抗原。
衍生自酵母菌(Leukine Berlex)與大腸桿菌(Peprotech)之重組hGM-CSF對抗-hGM-CSF單株抗體的平衡解離常數(KD
)係顯示於表2中。
此試驗中，就對酵母菌GM-CSF(Leukine)之KD
值而言，EV1007係1.2x10-9
M、EV1018係2.3x10-10
M而EV1019係3.6x10-10
M。先前已經產生之單株抗體EV1003的KD
值係2.3x10-10
M。
就對大腸桿菌(Peprotech)類的KD
值而言，EV1007係9.3 x 10-10
M、EV1018係1.5 x 10-10
M、EV1019係1.5 x 10-10
M而EV1003係9.5 x 10-11
M。產生的所有四個hGM-CSF單株抗體均以高親合力結合重組hGM-CSF。
利用Blood Dendritic Cell Isolation Kit II Human (Militenyi Biotech)自7 x 107
個人類單核細胞取得5 x 105
個包含類漿細胞DC與骨髓DC的樹突細胞(DC)。
將取得的DC懸浮於RPMI 1640培養基(Gibco)中，該培養基附加有10% FCS、rGM-CSF(1ng/mL，Peprotech)、TNF-α(10ng/mL)與抗-GM-CSF單株抗體(1μg/mL)，並以2 x 104
細胞/孔的濃度將其植入96-孔平底盤中且培養10天。
將發明者已經產生之抗-GM-CSF多株抗體(抗-GM-CSF pAbs，R＆D)(1μg/mL)與人類抗-人類巨細胞病毒單株抗體(hIgG)(1μg/mL)作為對照組。結果顯示於第3圖中。
如第3圖所示，EV1003、EV1018與EV1019抑制GM-CSF-依賴性DC增殖。相對地，EV1007並無顯示抑制。另一方面，抗-GM-CSF pAb抑制GM-CSF-依賴性DC增殖，但hIgG則無。
EV1003、EV1018與EV1019可單獨地阻礙GM-CSF-依賴性DC增殖。
發明者利用TF-1細胞(其取決於hGM-CSF存在而增殖)來試驗純化的抗-hGM-CSF單株抗體(EV1007、EV1018與EV1019)與先前產生的EV1003之中和能力，顯示於第4與5圖中。
將純化的抗體與重組hGM-CSF預先培養並將混合物加入TF-1細胞培養基。培養2天後，藉由比色試驗來確定TF-1細胞的增殖狀態。具有GM-CSF-中和活性之抗體可阻礙添加之重組GM-CSF的活性，造成抑制GM-CSF-依賴性TF-1細胞生長。
第4與5圖分別顯示抗體對TF-1細胞增殖(分別由酵母菌hGM-CSF(Leukine)與大腸桿菌hGM-CSF(Peprotech)所刺激)的抑制效應(中和活性)。
獨立地確定各個抗體之抑制效應並將抗-GM-CSF pAb與hIgG作為對照(如實施例9所述)。
在2μg/mL至31pg/mL的濃度範圍試驗四個連續稀釋倍數的抗體。應用最終濃度0.5ng/mL的rhGM-CSF於所有試驗。40小時培養後，藉由利用Cell Counting Kit(WST-1試驗，DOJIN)之A450/ref. A495的色彩密度來評估TF-1細胞的生長。
第4與5圖的y軸中，將具有31pg/mL對照hIgG之TF-1細胞的生長設為100%，並將不具有rhGM-CSF之TF-1細胞的生長設為0%。在圖示底部指出試驗之抗體並在圖示下側指出其之濃度。
利用濃度0.5ng/mL的酵母菌rhGM-CSF(Leukine)來刺激TF-1細胞增殖並將各個抗-hGM-CSF單株抗體之中和能力的結果顯示於第4圖中。雖然陰性對照的hIgG在2μg/mL高濃度下顯示非專一性抑制細胞生長，但其在低於2μg/mL濃度下並無顯示抑制作用。抗-hGM-CSF多株抗體(抗-GM-CSFpAbs)顯示依靠125ng/mL或高於125ng/mL抗體濃度的細胞生長抑制。
純化的單株抗體之中，EV1003在31ng/mL的濃度下抑制TF1細胞生長至陽性對照的60%，且在31ng/mL或高於31ng/mL發現濃度依賴性生長抑制。EV1018與EV1019分別在0.5ng/mL或高於0.5ng/mL與2ng/mL或高於2ng/mL的濃度下顯示約50%的抑制。證實EV1018與EV1019對hGM-CSF具有極高的中和活性。EV1007在0.5μg/mL或高於0.5μg/mL的濃度下清楚的顯示細胞生長抑制，這表示其之中和能力相當低。
利用濃度0.5ng/mL的大腸桿菌rhGM-CSF(Peprotech)來刺激TF-1細胞增殖並將各個抗-hGM-CSF單株抗體之中和能力的結果顯示於第5圖中。此試驗中，陰性對照的hIgG在2μg/mL高濃度下顯示非專一性抑制細胞生長，但其在低於2μg/mL濃度下並無顯示抑制作用。抗-hGM-CSF多株抗體(抗-GM-CSFpAbS)顯示依靠31ng/mL或高於31ng/mL抗體濃度的細胞生長抑制。
純化的單株抗體之中，EV1003在31ng/mL或高於31ng/mL顯示明顯的濃度依賴性TF1細胞增殖抑制。
EV1018與EV1019分別在0.5ng/mL或高於0.5ng/mL與2ng/mL或高於2ng/mL的濃度下顯示高於約50%的抑制。證實EV1018與EV1019的中和活性極高。
EV1007在0.5μg/mL或高於0.5μg/mL的濃度下清楚地顯示細胞生長抑制，這表示其之中和能力相對於EV1018與EV1019而言非常低。
確定兩個抗體之組合的中和活性(第6與7圖)。將混合抗體的五種組合列於表3中。
藉由4μg/mL至62pg/mL的濃度範圍中連續四個倍數稀釋來配置各個抗體的試驗溶液，並混合相同濃度的兩個抗體(最終濃度顯示於第6與7圖中)。藉由利用CellCounting Kit(WST-1試驗，DOJIN)之A450/ref.A495的色彩密度來評估TF-1細胞生長。
如第4與5圖中所示，第6與7圖之y軸中，將具有31pg/mL對照hIgG之TF-1細胞的生長設為100%，並將不具有rhGM-CSF之TF-1細胞的生長設為0%。將具有31pg/mL對照hIgG之TF1細胞生長的結果顯示於第4與5圖中，而不顯示於第6與7圖中。在圖示底部指出抗體混合之組合並在圖示下側指出其之濃度。
這些組合之中，相對於各個抗體的單一應用，混合-2：EV1003+1007、混合-3：EV1003+1018與混合-4：EV1003+1019的抑制效應係增加非常多的。例如第6圖中所示，混合-4：EV1003+1019在各個抗體濃度係8ng/mL(約55pM)下抑制TF1細胞生長至陽性對照的10%。
如第4圖所示，濃度8ng/mL的單獨EV1003沒有顯示TF1細胞增殖抑制而濃度8ng/mL的單獨EV1019僅顯示50%的抑制。這些結果指出兩個抗體的組合呈現相當高的中和活性。
雖然EV1007單一應用的抑制效應非常低，但各個抗體濃度8ng/mL(約55pM)的混合-2：EV1003+1007抑制TF1細胞生長至陽性對照的10%，如第6與7圖所示。
如第7圖所示，當應用大腸桿菌rhGM-CSF(Peprotcch)來刺激TF-1細胞增殖時，細胞生長近乎完全受到各個濃度31ng/mL或高於31ng/mL的混合-2：EV1003+1007、混合-3：EV1003+1018與混合-4：EV1003+1019所抑制。證實抗體的組合附加呈現相當強的中和活性。
另一方面，相對於單一應用之抗體(如第4與5圖所示)，混合-5：EV1018+1019的抑制效應以濃度依賴性方式而提高，但是提高的效應低於混合-2-4的效應。
混合-5：EV1018+1019的實例中，其混合效應並不明顯，兩者抗體在單一應用的劑量依賴性曲線(中和效應圖案)係相似的。
如第4與5圖所示，四個抗體(EV1003、EV1007、EV1018與EV1019)之間，2μg/ml濃度的EV1003單一應用顯示最強的抑制，但即便在此高農度下仍殘留約20%的細胞。相對地，31-125ng/mL濃度範圍的混合-2、混合-3與混合-4近乎完全地抑制細胞生長。暗示這三種組合(混合-2、混合-3與混合-4)呈現相當高的中和活性。
相對於其單一應用，組合應用抗-GM-CSF單株抗體(EV1003)與抗-CMV抗體(hIgG)的混合-1並無提高抗體的抑制效應。
本發明取得之三種抗體之中，兩種抗體(EV1018與EV1019)在單一應用與組合應用中顯示極高的中和活性。表3所列之抗體組合中，某些組合呈現高於兩者抗體累加效應的中和活性。
如上產生之抗-GM-CSF單株抗體或其抗原結合部分能夠專一性結合hGM-CSF(造成不同疾病)並去活化(中和)hGM-CSF的生物活性。因此，抗體或其之抗原結合部分對hGM-CSF之中和活性高於目前為止已經製造(現有)的抗-hGM-CSF單株抗體。因為抗體或其之抗原結合部分係人類單株抗體，其並無顯示免疫原性且不會引發免疫反應。
此外相對於其之單一應用，抗-GM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分的同時組合應用呈現對細胞生長相當高的抑制效應(即，中和活性)。
考量這些特性，本發明中所述之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合部分在低劑量可有效作為GM-CSF引起之疾病的預防或治療試劑，疾病包括(但不限於)：過敏疾病，諸如氣喘、COPD、囊狀纖維化症、間質性肺病、鼻炎、異位性皮膚炎與花粉熱、移植排斥、移植物對抗宿主疾病(GVHD)、關節炎與相關之之關節病、牛皮癬、骨髓性白血病、多發性硬化症、阿滋海默症與類風濕性關節炎。
EV1018的重鏈天生包含N-醣化位置於框架3。這顯示於例如序列編號：10中對應於殘基95-97。因此，產生EV1018重鏈的變體並檢驗其之中和活性。如第8圖所提供，結果指出在移除重鏈之框架3中的N-連接醣化位置後仍維持EV1018的生物活性。圖示顯示相對於WT EV1018重鏈(含有N-醣化位置)，兩個醣化位置序列變體(分別稱為N95K與T97A)的ED50值。如所述實質地於TF-1試驗中確定各個純化的IgG之ED50值。
應用小鼠抗-人類Biacore晶片(GE Healthcare)來固定各個抗體並讓商業上取得的溶解純化GM-CSF(Biomol)結合。這些實驗中應用的hGM-CSF係同於下述生物試驗中所應用者。利用Biacore軟體確定結合親合力並將結果概述於表4中。
EV1018的結合能力高於EV1019且遠高於EV1003。EV1018的所有變體之結合能力相同於野生型EV1018的結合能力。
恆河猴GM-CSF序列呈現於公開資料庫(例如，GenBank登錄號NP_001028121)並用來將表現殖株設計成Fc
融合蛋白。導入蛋白酶切割位置以釋出未標記之恆河猴GM-CSF蛋白。得到之蛋白具有良好的生物活性(見下一節)並可由所有的抗-GM-CSF單株抗體(EV1018、EV1019、EV1003)於西方墨點法中辨別(資料未顯示)。執行Biacore測量(利用上述1.1相同設定)並將結果於表5中提出。
所有實例中，與恆河猴GM-CSF的交互作用良好(所有抗-GM-CSF單株抗體辨別恆河猴GM-CSF蛋白的係數係差於hGM-CSF約2-3)。與此，恆河猴提供良好的非人類靈長類模式來發展上述揭露之抗-GM-CSF單株抗體。
執行小鼠GM-CSF(PeproTech與Biomol；例如，GenBank登錄號NP_034099)的測量並將結果概述於表6中。
所有實例中，與小鼠GM-CSF的交互作用係非常差的。此數據提供致力辨別抗-GM-CSF單株抗體結合之hGM-CSF表位的實驗之基礎，其中已經確定雜合於小鼠與人類之間的GM-CSF蛋白。
產生與上述恆河猴GM-CSF表現殖株相似的狨猴GM-CSF表現殖株。將純化蛋白用於Biacore測量並將結果概述於表7中。
與狨猴GM-CSF之交互反應性係明顯的。所有抗-GM-CSF單株抗體辨別恆河猴GM-CSF蛋白之係數係差於hGM-CSF約2-3。如同恆河猴之實例般，狨猴提供良好的動物模式以發展上述揭露之抗-GM-CSF單株抗體。
TF-1人類細胞株的增殖係取決於生長因子。技術中習知此細胞株為研究生長因子之生物效應的良好基礎。
發明者在此利用不同物種的重組GM-CSF(rGM-CSF)，諸如(i)藉由技術中習知標準技術表現於大腸桿菌(Fa. Biomol #2514)中之hGM-CSF的重組hGM-CSF(rhGM-CSF)，或(ii)恆河猴GM-CSF(例如，GenBank登錄號NP_001028121)的重組恆河猴GM-CSF(rrGM-CSF)或(ii)狨猴GM-CSF(例如，GenBank登錄號B0KWQ4)之重組狨猴GM-CSF(rmGM-CSF)，利用技術習知標準技術將兩者表現於HEK 293中。
TF-1細胞生長於細胞培養基(RPMI 1640(Cat.31870 Fa. Gibco)、1x Glutamax 100x(Cat.35050-038 Fa. Gibco)、1mM Sodium Pyrovat 100mM(Cat.11360-039 Fa. Gibco))、10mM Hepes 1M(Cat. 15690-056 Fa. Gibco)、10% FCS(Cat.10500-064 Fa. Gibco)、2ng/ml rGM-CSF(Cat.200-005L Fa. ReliaTech GmbH)。以PBS清洗細胞3次並以1E5細胞/ml的濃度將細胞植入96孔盤(Cat.167008 Fa. Nunc)中試驗培養基內(不具有rGM-CSF的細胞培養基)。將抗體-溶液與GM-CSF-溶液稀釋於稀釋培養基(不具有FCS且不具有rGM-CSF的細胞培養基)並分別加至10μl的體積。在37℃下與濕潤室5% CO2中培養細胞3天。根據套組(CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay,Fa. Promega,Cat. No. G3581)的操作指南將20μl MTS加入來測量細胞活性。陰性對照組係不具有GM-CSF與抗體的TF-1細胞。陽性對照組係不具有抗體的TF-1細胞。
在試驗抗體之中和活性以前，確定人類、恆河猴與狨猴GM-CSF促進增殖的ED80(表8)。能夠促進TF-1增殖的人類與恆河猴GM-CSF係有效的(ED80[人類]
：1.5ng/ml；ED80[恆河猴]
：7ng/ml)，然而狨猴GM-CSF係較不有效的TF-1增殖促進者。因此，人類細胞株TF-1適合用來試驗針對人類與恆河猴GM-CSF的中和活性，但並不適合用來試驗衍生自狨猴的GM-CSF。
在ED80濃度下執行抗體IC50的確定。亦應用商業上可取得之具有習知中和活性的抗體，大鼠抗-hGM-CSFIgG2a抗體(BVD2-23B6,Fa.BD Pharmingen #554501)(表9)。同型對照抗體大鼠IgG2a(R35-95,Fa. BD #554687)並無顯示細胞增殖的抑制(數據未顯示)。
以ng/ml與pM來提供結果(假設抗體分子量係150kD)。
EV1018與EV1019具有對人類重組GM-CSF的良好中和活性。EV1018的中和活性超過BVD2-23B6。
利用重組恆河猴GM-CSF之實驗中，單株抗體EV1018、EV1019與EV1003的中和化性遠高於衍生自大鼠的BVD2-23B6。然而兩種類型的實驗中，EV1018明顯優於試驗的所有抗體。EV1018的所有變體與野生型EV1018具有相同的中和活性。
提出表7中之結果的試驗中，不可能應用商業上可取得之大鼠-抗-人類-GM-CSF IgG2a BVD2-21C11(Fa. BD,#554503)，因為在規定ED80濃度(即，1.5ng/ml劑量的rGM-CSF)下無法取得可靠的結果。為了測量抗體21C11，需要下表10中提出的較小rGM-CSF劑量。
僅藉由比較IC50值而於不同實驗室中比較抗體的效力是不可能的，因為IC50值強烈取决於試驗條件，例如應用刺激物的數量。藉由比較標準抗體與關注之抗體間例如IC50值(如上述於TF-1試驗中取得，但係以不同rGM-CSF標示劑量)的比例而有可能達成較可靠的比較。例如，WO2006/122797(表8，第56與57頁)揭露其最佳抗體係比商業上可取得之抗體大鼠-抗-人類-GM-CSF(殖株BVD2-21C11)好上35倍。商業上可取得之抗-人類-GM-CSF單株抗體(殖株BVD2-21C11)與EV1018間之IC50比例係413。因此，根據與商業上標準的比較，EV1018的中和活性係約高出10倍(如表10所示)。這是令人訝異的，因為WO2006/122797教導熟悉技術人士抗-GM-CSF單株抗體的中和活性與其結合GM-CSF的能力強烈相關(WO2006/122797，改善結合親合力(第50頁表4中顯示)與因此改善之中和潛力(第52-54頁表6與7上顯示)相關)。
比較MOR04357之結合能力(WO2006/122797，第50頁表4：MOR04357-Fab的結合能力係7pM)與EV1018之結合能力，發明者了解EV1018結合GM-CSF係比MOR04357結合GM-CSF小約16倍。然而相較於MOR04357，EV1018的中和活性係高出10倍，這表示中和活性不一定與結合GM-CSF的能力相關。
第1與2列：來自WO2006/122797第56與57頁表8的數據；第3與4列：發明者的數據
IL-8係前趨發炎細胞激素(proinflammatory cytokine)。其係嗜中性白血球發炎的重要因子且牽涉於大多數的發炎反應中。GM-CSF活性的目標細胞係骨髓細胞世系的細胞。前單核白血球細胞株U937係骨髓來源並在GM-CSF刺激後分泌前趨發炎細胞激素IL-8。
U937(ATCC：CRL-1593.2)生長於細胞培養基(RPMI 1640(Cat.31870 Fa. Gibco)、1X Glutamax 100x(Cat.35050-038Fa. Gibco)、10%FCS(Cat.10500-064Fa. Gibco)、1% PenStrep 中。將100μl細胞懸浮液以1E5細胞/ml植入並加入10μl的抗體溶液與10μl的GM-CSF溶液。在37。C下與濕潤室5%CO2
中培養細胞24小時。利用OptEIA Human IL-8 Elisa Set(Fa.BD Bioscience,Cat. No. 555244)來確定IL-8細胞激素水平。
陰性對照組係不添加抗體與不添加GM-CSF的U937細胞，陽性對照組係不具有抗體溶液的U937細胞。確定人類與恆河猴GM-CSF的ED80濃度(表9)並用此濃度來確定不同抗-GM-CSF單株抗體的IC50(表11)。
此細胞試驗中，所有三個抗體非常有效地中和人類GM-CSF與恆河猴GM-CSF。EV1018的中和活性高於EV1019且遠高於EV1003。EV1018的所有變體與野生型EV1018呈現相同的中和活性。
顆粒性白血球係骨髓世系細胞的亞群且係GM-CSF生物活性的目標細胞。除了其他作用功能外，GM-CSF誘導顆粒性白血球表面上的黏著分子CD11b/Macl。骨髓細胞世系之細胞表面上CD11b/Macl的誘導係細胞自周圍血液進入發炎組織之遷移的必需步驟。具有慢性發炎氣管疾病(如COPD與氣喘)的患者在唾液與肺泡沖出液中具有數目提高的顆粒性白血球。因此，試驗抗-GM-CSF-抗體對GM-CSF-介導之初級顆粒性白血球上黏附標記CD11b/Macl誘導的功效。
將80μl健康供應者的凝結抑制週邊血液與預先和rhGM-CSF(Fa Biomol,#2514)培養20分鐘之抗-GM-CSF單株抗體或同型抗體(人類IgG，#1-2511；Fa. Sigma-Aldrich)在37℃下培養15分鐘。陰性對照組係與預先和PBS、01%BSA培養20分鐘之同型抗體在37℃下培養15分鐘的凝結抑制血液。
為了定量CD11b/Macl表現，根據供應商的操作指南來應用標記有植物赤鮮素(phytoerythrin)(Fa：Pharmingen；Cat：333142)之抗-CD11b抗體。簡短地說，將20μl的抗-CD11b抗體溶液加入細胞中，在黑暗中室溫下培養30分鐘。藉由加入2ml裂解溶液(Fa：BD；Cat 349202)來裂解紅血球(紅血球細胞)並在黑暗中室溫下另外培養10分鐘。以PBS、0.1%BSA清洗兩次後，將白血球細胞懸浮於500p1 Cellfix(Fa：BD；Cat 340181)。為了分析，應用LSRII流式細胞儀與DIVA6.1.1軟體來分析FACS數據(兩者係Fa. BD)。利用前向與側向散佈將顆粒性白血球細胞群體限制於點狀圖中並設為100%。利用30pM的rhGM-CSF來刺激顆粒性白血球表面上的CD11b/Mac1。67pM的EV1018足以完全阻礙GM-CSF引起CD11b/Mac1。
這些數據指出EV1018有效地中和發炎過程高度明顯(包括顆粒性白血球數目的提高)背景(例如COPD與氣喘)中的GM-CSF生物活性。
香菸煙霧係發展COPD的最重要因子。動物物種(如大鼠與小鼠)長時間暴露於香菸煙霧造成許多相當於人類疾病的病生理解剖傷害(Fujita與Nakanishi 2007)。COPD的一個重要特徵係慢性支氣管炎，其包括數目增加的嗜中性白血球與巨噬細胞進入肺中。為了證實GM-CSF在煙霧引發細胞湧進肺中扮演重要角色，在小鼠長期香煙煙霧模式中應用抗-GM-CSF單株抗體。
將C57BL/6J小鼠(18-23g)暴露在香煙煙霧中4天。小鼠在第1與2天暴露在6根香煙中、第3天暴露在8根香煙中而第4天暴露在10根香煙中。每根香煙暴露持續16分鐘接著為8分鐘的新鮮空氣。對每一第二根香煙實施額外中斷的24分鐘新鮮空氣。將沒有暴露在香煙煙霧的小鼠作為陰性對照組。
在第1天與第3天煙霧方案前2小時腹膜內應用300μg的大鼠抗-小鼠GM-CSF IgG2a(殖株MPI-22E9，Fa.EBioScienses，#16-7331)或適當的同型抗體、300μg(大鼠IgG2a，Fa. EBioSciences，#16-4321)或300μl載體(PBS，10mM NaCl)。最後一次暴露後18小時，使動物安樂死並以2x0.8ml Hanks溶液(具有EDTA)清洗肺。藉由離心將支氣管肺泡沖洗液(BALF)分成細胞片狀物與懸浮液。確定片狀物中的骨髓過氧化酶(MPO)活性係骨髓細胞湧入的因素。使500μl的沖洗液樣本在485xg、4℃下旋轉向下10分鐘。將片狀物重新懸浮於200μl0.5%的十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl-trimethyl-am monium bromide,HTAB)。將50μl的懸浮液轉移至96-孔微滴定盤。將250μl的基質溶液(50mM KH2
PO4
，5mMNa2
HPO4
，0.2mg/mlo-聯大茴香胺二鹽酸鹽(o-dianisidin dihydrochloride)，0.2μl/mlH2
O2
)加入各個孔以開始酵素反應。確定450nm下的消光(extinction)90秒。在酵素反應穩定狀態中計算骨髓過氧化酶(MPO)活性。活性表示成每分鐘千分之活性單位[mAU/分]。
藉由流式細胞儀(LSR II,Becton Dickinson)上的多次分析偵測確定BALF懸浮液中的細胞激素MCP-1與MIP-1α。根據Bender MedSystems(Flow Cytomix)的操作指南來執行試驗。簡短地說，將25μl的BALF懸浮液與25μl的1x試驗緩衝液(Basic Kit BMS8440FF)、25μl的微珠混合物(MCP-1與MIP-1a單一套組BMS86005FF、BMS86013FF的混合物)與50μl的生物素耦合混合物(包含於單一套組內)混合並在室溫下500rpm的微盤搖動器上培養2小時。以試驗緩衝液清洗兩次後，將微珠重新溶解於100μl試驗緩衝液並加入50μl卵白素-PE-溶液(包含於基本套組中)。微珠在室溫下500rpm的微盤搖動器上培養1小時。以試驗緩衝液清洗微珠兩次。將微珠重新溶解於500μl試驗緩衝液並藉由流式細胞技術利用Bender MedSystems提供的FlowCytomix Pro 2.2軟體分析。為了定量，根據供應者(Bender MedSystems)的操作指南製備標準(包含於單一套組內)的連續稀釋。根據這些標準來確定細胞激素的濃度。
確定總細胞數與特別細胞數(第9圖)。與皮質類固醇(如地塞米松(dexamethasone)(3mg))相比，抑制細胞湧入26%。第10圖顯示之結果證實GM-CSF在香煙煙霧引發之發炎中扮演重要角色且GM-CSF的中和可明顯減少小鼠長時間暴露於香煙煙霧引發之細胞滲透物。
檢驗包含小鼠、人類、恆河猴與狨猴GM-CSF胜肽之胜肽陣列以尋找是否可發現GM-CSF中作為探討抗體所辨別之表位的特定線性序列。
試驗下列抗體：BIBH1(辨別FAP的無關人類化IgGl陰性對照抗體)(參見US20030103968「Use of alpha specific antibody BIBH1 in the treatment of cancer」(http://www.aSco.org/ASCO/Abstracts+＆+Virtual+Meeting/Abstracts？＆vmview=abst detail view＆confID=10＆abstractID=1028)、EV1018、EV1019與EV1003。
胜肽陣列的結果指出雖然固定之GM-CSF與人類IgG陽性對照組提供強健信號，但並無發現陰性對照抗體超出水平的特定結合。由於可辨別適當摺疊的GM-CSF但無法辨別GM-CSF衍生之胜肽，發明者認為試驗之抗-GM-CSF抗體辨別非線性或結構專一表位。這與文獻(例如，WO2007/092939)中已知的許多其他抗-GM-CSF抗體相反。
應用下列方法：在JPT(Berlin,Germany)合成定製陣列並印在玻璃片上。在室溫輕微搖動下以PBS+1% BSA+0.1% Tween 20阻塞陣列3小時。將抗體於探針緩衝液(PBS，5mM MgCl2
，0.5mM DTT，0.05% Triton X-100，5%甘油，1%BSA)中稀釋至5μg/ml並在4℃下於陣列上培養1-2小時。接著以探針緩衝液清洗陣列三次(每次清洗置於冰上1分鐘)並在4℃下以Cy5標記之山羊抗-人類IgG(0,5μg/ml)培養1小時。再度如上述般清洗，藉由離心(800g)而乾燥並在Perkin-Elmer Proscan微陣列掃描器中以具有Cy5過濾套組的固定PMT掃描。
亦執行透過直系同源取代的表位定位。由於試驗之抗體辨別結構上或間斷的表位，僅可在適當摺疊的GM-CSF背景中確定各個表位。如上述Biacore結果所示，探討之抗體僅輕微地(若真的有)結合小鼠GM-CSF。因此，發明者設計GM-CSF的嵌合型式，其中以對應小鼠序列取代人類GM-CSF的選定區域。由於人類與小鼠GM-CSF推定具有相似的三維結構但僅有73%相同，嵌合蛋白應保有適當的GM-CSF摺疊，與丙胺酸掃描方法相反(以聚丙胺酸延伸取代，會影響蛋白的折疊)。以小鼠序列取代表位或其之部分的嵌合體應無法結合探討之抗體(或顯示結合降低)。將序列定位回已知人類GM-CSF三維結構可讓人重新建構包含表位之胺基酸的空間位置。無法以此方法分析人類與小鼠GM-CSF間保存之胺基酸。
設計十一種不同嵌合體，其中個別與組合地取代七種線性胜肽序列。針對各個嵌合體，以粗體來指出小鼠GM-CSF胺基酸。以底線標示嵌合體間不同的預測N-鍵結醣化位置。將各個嵌合體表現於HEK 293細胞中呈兔Fc融合蛋白以透過兔Fc部分進行純化與定量。利用針對兔Fc之抗體的融合蛋白，對照西方墨點法顯示不同的GM-CSF嵌合融合蛋白以相同數量負載於膠上。不同嵌合體間的移動性轉移係因為人類與小鼠GM-CSF間之醣化的差異。
以EV1003進行的GM-CSF嵌合體西方墨點法顯示嵌合體3、6、9與10顯示極少或沒有結合。嵌合體9係嵌合體3與6的組合而嵌合體10係嵌合體2與6的組合。因此，EV1003不會辨別包含這些嵌合體3與6所呈現位置中的小鼠胺基酸或包含一或兩者這些區域之組合的所有嵌合體。因此這些代表EV1003表位。將嵌合體3與6空間定位在GM-CSF的3維結晶結構顯示這些嵌合體在GM-CSF分子之一面彼此相近，這與這些發現相當一致。此表面代表EV1003所辨別的間斷表位。
以EV1019進行的GM-CSF嵌合體西方墨點法顯示嵌合體4、5與11顯示輕微的結合而嵌合體8近乎沒有顯示結合。嵌合體11係嵌合體1與5的組合而嵌合體8係嵌合體4與5的組合。因此，包含嵌合體4或5所呈現的這些位置中之小鼠胺基酸的所有嵌合體顯示輕微結合EV1019。包含嵌合體4與5所呈現的這些位置中之小鼠胺基酸組合的嵌合體8無法由EV1019所辨別。因此，嵌合體4與5的組合代表EV1019表位。將嵌合體4與5空間定位於GM-CSF的3維結晶結構上顯示這些嵌合體在GM-CSF分子之一面上彼此相近，這與這些發現相當一致。此表面代表EV1019所辨別的間斷表位。由於EV1019的高親合力結合需要兩者區域，間斷表位必需係由GM-CSF表面上或附近(並因此影響表面暴露的胺基酸殘基)彼此相近的變體4與5的胺基酸所構成。這些分別係胺基酸60-63(ELYK)與78-87(TMMASHYKQH)。胺基酸76(P)可能有所貢獻。因為嵌合體4與5間之介面包含大距離，嵌合體4中胺基酸68-69(SL)不太可能在結合表位中扮演重要角色，然而並無法完全排除這種可能性。
以EV1018進行的GM-CSF嵌合體西方墨點法顯示嵌合體4、5與11顯示輕微的結合而嵌合體8顯示近乎沒有的結合。嵌合體11係嵌合體1與5的組合而嵌合體8係嵌合體4與5的組合。因此，包含嵌合體4或5所呈現的這些位置中之小鼠胺基酸的所有嵌合體顯示輕微結合EV1018。包含嵌合體4與5所呈現的這些位置中之小鼠胺基酸組合的嵌合體8無法由EV1018所辨別。因此，嵌合體4與5的組合代表EV1018表位。將嵌合體4與5空間定位於GM-CSF的3維結晶結構上顯示這些嵌合體在GM-CSF分子之一面上彼此相近，這與這些發現相當一致。此表面代表EV1018所辨別的間斷表位。由於EV1018的高親合力結合需要兩者區域，間斷表位必需係由GM-CSF表面上或附近(並因此影響表面暴露的胺基酸殘基)彼此相近的變體4與5的胺基酸所構成。這些分別係胺基酸「ELYK」與「TMMASHYKQH」。
這些結果指出EV1018與EV1019辨別相同或非常相近的GM-CSF分子間斷表位。
第1圖顯示單離抗體產生細胞株的流程圖。
第2圖顯示抗-GM-CSF單株抗體之親合力分析的圖解。
第3圖顯示抗-GM-CSF單株抗體在GM-CSF存在下對周圍血液樹突細胞增殖之抑制效應的評估。
第4圖顯示抗-GM-CSF單株抗體在酵母菌hGM-CSF(Leukine)存在下對TF-1細胞增殖之抑制效應的評估。
第5圖顯示抗-GM-CSF單株抗體在大腸桿菌hGM-CSF(Peprotech)存在下對TF-1細胞增殖之抑制效應的評估。
第6圖顯示兩種抗-GM-CSF單株抗體之組合應用在酵母菌hGM-CSF(Leukine)存在下對TF-1細胞增殖之抑制效應的評估。
第7圖顯示兩種抗-GM-CSF單株抗體之組合應用在大腸桿菌hGM-CSF(Peprotech)存在下對TF-1細胞增殖之抑制效應的評估。
第8圖係描繪劑量依賴性抑制的兩個圖示：人類GM-CSF(8A)與恆河猴GM-CSF(8B)。
第9圖係描述鼠科模式中支氣管肺泡沖洗液之細胞數目的條狀圖。
Claims (26)
- 一種單離的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段包含：(a)一重鏈，包含一含有VH -CDR1之序列、一含有VH -CDR2之序列及一含有VH -CDR3之序列，其中：(i)該含有VH -CDR1之序列係SYGMH(序列編號：4)，(ii)該含有VH -CDR2之序列係LTYHHGNRKFYADSVRG(序列編號：5)，及(iii)該含有VH -CDR3之序列係ESMGAINDN(序列編號：6)；及(b)一輕鏈，包含一含有VL -CDR1之序列、一含有VL -CDR2之序列及一含有VL -CDR3之序列，其中：(i)該含有VL -CDR1之序列係IGNNNNIGSHAVG(序列編號：7)，(ii)該含有VL -CDR2之序列係GRSPPS(序列編號：8)，及(iii)該含有VL -CDR3之序列係STWDSSLSAVV(序列編號：9)。
- 如申請專利範圍第1項所述之抗體或其之抗原結合片段，其中該抗體或其之抗原結合片段以小於400pM的一KD 結合人類GM-CSF。
- 如申請專利範圍第2項所述之抗體或其之抗原結合片段，其中該抗體或其之抗原結合片段中和hGM-CSF活性，以致在ED80下之TF-1增殖試驗中測定之該抗體或其之抗原結合片段之一IC50值小於100pM。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之抗體或其之抗原結合片段，其中該重鏈係選自由γ1 、γ2 、γ3 及γ4 所組成之群組。
- 如申請專利範圍第4項所述之抗體或其之抗原結合片段，其中該重鏈係γ1 。
- 如申請專利範圍第4項所述之抗體或其之抗原結合片段，其中該輕鏈係一λ輕鏈。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之抗體或其之抗原結合片段，其中該重鏈具有序列編號：46或序列編號：51之一胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第7項所述之抗體或其之抗原結合片段，其中該重鏈具有序列編號：51之一胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之抗體或其之抗原結合片段，其中該輕鏈具有序列編號：36之一胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之抗體或其之抗原結合片段，其中該重鏈變異區序列係序列編號：348或序列編號：361，且其中該輕鏈變異區序列係序列編號：365。
- 如申請專利範圍第10項所述之抗體或其之抗原結合片段，其中該重鏈變異區序列係序列編號：361。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之抗體或其之抗原結合片段，其中該重鏈序列係序列編號：46或序列編號：51，且其中該輕鏈序列係序列編號：36。
- 如申請專利範圍第12項所述之抗體或其之抗原結合片段，其中該重鏈序列係序列編號：51。
- 一種醫藥組合物，其包含：申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其之抗原結合片段，及一藥學可接受載體。
- 一種套組，其包含：(a)申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其之抗原結合片段；及(b)一或更多個容器以容納該抗體或其之抗原結合片段。
- 一種單離的核酸，其編碼申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段。
- 如申請專利範圍第16項所述之單離的核酸，其中該核酸係DNA。
- 一種載體，其包含申請專利範圍第17項所述之DNA。
- 一種宿主細胞，其包含申請專利範圍第18項所述之載體，其中該載體係一表現載體。
- 一種以申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其之抗原結合片段作為藥物之用途。
- 一種以申請專利範圍第14項所述之醫藥組合物作為藥物之用途。
- 一種如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其之抗原結合片段之用途，其係用於製備治療一受試者中與hGM-CSF過度表現相關之疾病或異常的藥物。
- 如申請專利範圍第22項所述之用途，其中該抗體或抗原結合片段係以不超過500mg之一劑量被施加至該受試者。
- 如申請專利範圍第22或23項所述之用途，其中該疾病或異常係選自下列所組成之群組：慢性阻塞性肺病(COPD)、氣喘、支氣管性氣喘、小兒氣喘、嚴重氣喘、急性氣喘發作、囊狀纖維化症、間質性肺病、鼻炎、關節炎與相關之關節病、風溼性關節炎、牛皮癬、骨髓性白血病及多發性硬化症。
- 一種如申請專利範圍第14項所述之醫藥組合物之用途，其係用於製備治療一受試者中與hGM-CSF過度表現相關之疾病或異常的藥物。
- 一種在一宿主細胞中產生如申請專利範圍第1項所述之結合hGM-CSF的抗-hGM-CSF單株抗體或其之抗原結合片段的方法，其中該抗體或其之抗原結合片段包含至少一含有VH -CDR1之序列、一含有VH -CDR2之序列、一含有VH -CDR3之序列、一含有VL -CDR1之序列、一含有VL -CDR2之序列及一含有VL -CDR3之序列，該方法包含：(i)取得包含至少一DNA序列之該宿主細胞，該至少一DNA序列至少編碼該含有VH -CDR1之序列、該含有VH -CDR2之序列、該含有VH -CDR3之序列、該含有VL -CDR1之序列、該含有VL -CDR2之序列與該含有VL -CDR3之序列，其中：(a)該含有VH -CDR1之序列係SYGMH(序列編號：4)， (b)該含有VH -CDR2之序列係LTYHHGNRKFYADSVRG(序列編號：5)，(c)該含有VH -CDR3之序列係ESMGAINDN(序列編號：6)；(d)該含有VL -CDR1之序列係IGNNNNIGSHAVG(序列編號：7)，(e)該含有VL -CDR2之序列係GRSPPS(序列編號：8)，及(f)該含有VL -CDR3之序列係STWDSSLSAVV(序列編號：9)；及(ii)在適合DNA表現與該抗體或其之抗原結合片段產生的條件下培養該宿主細胞。
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