TW201930350A - 針對pd-l1之抗體及其變異體 - Google Patents
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Abstract
本申請案提供一種特異性識別PD-L1之抗體諸如單株抗體(mAb)或其抗原結合片段。亦提供醫藥組成物、或製備及使用該抗體或其抗原結合片段之方法。
Description
本申請案係關於能夠與PD-L1蛋白特異性結合之抗體或其抗原結合片段以及此類藥劑之用途。在一些實施例中,本申請案係關於針對PD-L1之小鼠及人源化單株抗體以及此等抗體之用途。該等抗體或其抗原結合片段可用作診斷劑且可用於治療與PD-L1之活性及/或表現相關聯之疾病。
體液免疫(經B細胞介導)及細胞免疫(經T細胞介導)為人類後天性免疫系統對抗體外感染及體內病理變化的兩種武器。T細胞作為免疫系統中的重要成員,在腫瘤免疫療法中起到必不可少的作用。T細胞活化為傳統細胞因子藥物及新提出的免疫檢查點藥物二者消除癌細胞之重要機制(Esther等人,physiol,25(2):85-101,2010;Drew,Nature Reviews Cancer 12:252-264,2012)。
T細胞活化有兩個信號步驟。第一步為藉由TCR識別MHC所呈遞之抗原來活化的主要刺激。此信號為抗原特異性的。T細胞活化之第二類信號亦稱為共刺激信號(Jennifer等人,Annu Rev Immunol,27:591-619,2009)。相比之下,T細胞亦接收一些共抑制信號。此等刺激或抑制T細胞功能之生物分子被稱為免疫檢查點分子。免疫檢查點療法之目的為通過免疫檢查點控制T細胞之刺激或抑制信號來殺死腫瘤細胞並最終治癒癌症(Suzanne等人,Cancer Cell 27(4):450-461,2015)。
程式性細胞死亡蛋白1(PD-1)為一種細胞表面受體,其藉由抑制T細胞發炎活性在下調免疫系統及促進自身耐受性中起到重要作用。PD-1為免疫檢查點且通過促進淋巴結中抗原特異性T細胞之細胞凋亡(程式性細胞死亡)同 時減少調節性T細胞(消炎、抑制性T細胞)之細胞凋亡的雙重機制來預防自體免疫(Francisco等人,Immunological Reviews.236:219-42,2010;Fife等人,Annals of the New York Academy of Sciences.1217:45-59,2011)。通過此等機制,PD-1抑制免疫系統。此舉預防自體免疫疾病,但其亦可妨礙免疫系統殺死癌細胞。一類新的阻斷PD-1的藥物(即PD-1抑制劑)激活免疫系統以攻擊腫瘤且因此在用於治療一些類型的癌症中取得不同程度的成功。
已開發出許多靶向PD-1受體的癌症免疫療法藥劑。一種此類抗PD-1抗體藥物納武單抗(nivolumab)(Opdivo-Bristol Myers Squibb)於2014年7月經日本且於2014年12月經US FDA批准治療轉移性黑素瘤。另一抗PD-1抗體藥物為派姆單抗(Pembrolizumab)(Keytruda,MK-3475,Merck),其於2014年9月經FDA批准治療轉移性黑素瘤。英國晚期黑素瘤患者可經由2015年3月之英國早期獲藥計劃(Early Access to Medicines Scheme;EAMS)獲得派姆單抗。其在美國正用於肺癌、淋巴癌及間皮瘤之臨床試驗中。其已獲得一定的成功,副作用小。2015年10月2日,派姆單抗經FDA批准用於在其他治療之後疾病進展的晚期(轉移性)非小細胞肺癌(NSCLC)患者。
PD-1結合兩種配體,程式性死亡配體1(PD-L1)及程式性死亡配體2(PD-L2)。PD-L1為大小約53kDa的單跨膜蛋白且同樣為非常重要的免疫檢查點分子。PD-1與PD-L1結合將激活減少T細胞活性及增殖的共抑制信號。在人體中,PD-L1表現於許多免疫細胞類型包括活化的及免疫無能的/耗竭的T細胞上,於天然及活化B細胞上,以及於脊髓樹突狀細胞(DC)、單核球及肥大細胞上。其亦表現於非免疫細胞上,包括胰島、肝庫弗(Kupffer)細胞、血管內皮及經選擇之上皮細胞例如氣道上皮細胞及腎小管上皮細胞,在該等細胞中其表現在發炎事件期間增強。PD-L1表現亦以增加的水準存在於許多腫瘤上,包括但不限於乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、肺癌、腎癌(包括腎細胞癌)、胃癌、膀胱癌、 非小細胞肺癌(NSCLC)、肝細胞癌(HCC)及胰臟癌以及黑素瘤。過度表現之PD-L1將大大抑制T細胞對腫瘤細胞的毒性並幫助腫瘤細胞避開T細胞監視及消除(Dong等人,Nat Med;8:793-800,2002)。
抑制PD-1與PD-L1之間的結合的PD-L1單株抗體減弱或阻斷PD-L1對T細胞施加的下調信號傳導,且因此恢復T細胞對免疫原的活性。目前,PD-L1單株抗體用於對抗許多人類癌症的臨床研究,包括非小細胞肺癌、黑素瘤、結腸直腸癌、腎細胞癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌及乳癌(Julie等人,N Engl Med 366:2455-2465,2012)。
FDA於2016年批准第一種抗PD-L1抗體藥物。此藥物由Genentech開發且名為阿特珠單抗(atezolizumab)(商標名Tecentriq)以治療晚期膀胱癌。該藥物證明,此特別的分子可成功地用於臨床階段的免疫檢查點療法中。臨床前研究已證明,針對不同免疫檢查點分子的抗體可協同地作用以治癒癌症(Mace等人,Journal for Immuno Therapy of cancer 3:366,2015;Lussier等人,Journal for Immuno Therapy of Cancer 3:21,2015)。有臨床研究測試PD-L1抗體與其他免疫檢查點抑制單株抗體或小分子之組合療法以治療不同癌症。
度伐單抗(durvalumab)為另一種FDA批准的抗PD-L1抗體藥物,其由Medimmune/AstraZeneca開發。度伐單抗經批准用於治療具有局部晚期或轉移性泌尿上皮癌之患者,該等患者在含鉑化療期間或之後具有疾病進展或在以含鉑化療進行之新輔助或輔助治療之12個月內具有疾病進展。
本申請案係關於針對PD-L1蛋白之靶向結合劑以及其製備及使用方法。
在一般態樣中,本申請案係關於一種分離的抗體或其抗原結合片段,其包含: (a)重鏈可變域(VH),其包含i.重鏈CDR1,其包含選自由SEQ ID NO:71-82組成之群的胺基酸序列;ii.重鏈CDR2,其包含分別選自由SEQ ID NO:83-94組成之群的胺基酸序列,其中SEQ ID NO:87視情況由SEQ ID NO:95-97中之任一者置換;及iii.重鏈CDR3,其包含分別選自由SEQ ID NO:98-109組成之群的胺基酸序列;及(b)輕鏈可變域(VL),其分別包含,i.輕鏈CDR1,其包含選自由SEQ ID NO:110-121組成之群的胺基酸序列,其中SEQ ID NO:111視情況由SEQ ID NO:122置換,且SEQ ID NO:114視情況由SEQ ID NO:123置換;ii.輕鏈CDR2,其包含分別選自由SEQ ID NO:124-135組成之群的胺基酸序列;及iii.輕鏈CDR3,其包含分別選自由SEQ ID NO:136-147組成之群的胺基酸序列,其中該抗體或抗原結合片段能夠與PD-L1較佳人類PD-L1特異性結合。
較佳地,本申請案之抗體或其抗原結合片段與PD-L1(較佳地,人類PD-L1)之間的結合之KD為10-7M至約10-12M、較佳約10-8M至約10-12M、更佳約10-9M至約10-12M或更小。
本申請案之抗體或其抗原結合片段可為齧齒動物的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。其亦可為雙特異性的,其進一步包含能夠與第二抗原諸如CTLA-4、TIGIT、TIM-3或LAG-3特異性結合的第二抗體部分。較佳地,第二抗體部分為單域抗體(sdAb)。
進一步提供一種醫藥組成物,其包含本申請案之任一分離的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑。
本申請案之另一態樣提供一種治療患有PD-L1相關疾病之個體的方 法,其包括向該個體投與有效量的上文所述之任一醫藥組成物。在一些實施例中,PD-L1相關疾病為癌症。在一些實施例中,癌症為實體腫瘤,諸如結腸癌。在一些實施例中,該方法進一步包括向該個體投與另外的癌症療法,諸如手術、放射、化學療法、免疫療法、激素療法或其組合。在一些實施例中,PD-L1相關疾病為病原性感染。在一些實施例中,醫藥組成物係全身投與,例如靜脈內(i.v.)投與。在一些實施例中,醫藥組成物係局部投與,例如腫瘤內投與。在一些實施例中,該個體為人。
本發明之其他態樣、特徵及優點將自以下揭示內容(包括實施方式及其較佳實施例以及隨附申請專利範圍)顯而易知。
前述發明內容以及以下實施方式當結合隨附圖式閱讀時將更好理解。出於說明本發明之目的,在附圖中示出目前較佳之實施例。然而應理解,本發明不限於所示之精確配置及手段。在附圖中:圖1描繪以重組PD-L1 ECD蛋白第4次免疫接種之後經免疫接種之小鼠之免疫反應。
圖2A-2L描繪PD-L1過量表現穩定細胞株與根據本申請案之實施例之小鼠單株抗體(mAb)之間的結合親和力,更具體地,圖2A:1H1G4D9;圖2B:18B7G2;圖2C:21D1F4D4;圖2D:25B6E5D8;圖2E:25G1F9F8;圖2F:27D3D3G2:圖2G:29A8H8C7;圖2H:30A6B2D9;圖2I:30A7B5D9;圖2J:42G2D7C3;圖2K:51F3D2G4;且圖2L:53C1F3D4。
圖3A-3J描繪根據本申請案之實施例之小鼠mAb對PD-L1細胞株與其受體PD-1 ECD蛋白之間的相互作用的阻斷作用,更具體地,圖3A:1H1G4D9;圖3B:21D1F4D4;圖3C:25G1F9F8;圖3D:27D3D3G2;圖3E:29A8H8C7;圖3F:30A6B2D9;圖3G:30A7B5D9;圖3H:42G2D7C3;圖 3I:51F3D2G4;且圖3J:53C1F3D4。
圖4A-4H描繪藉由基於PD-L1細胞之報道基因測定的根據本申請案之實施例之小鼠mAb之功能活性評估,更具體地,圖4A:18B7F4G8;圖4B:27D3D3G2;圖4C:29A8H8C7;圖4D:42G2D7C3;圖4E:51F3D2G4;且圖4F:53C1F3D4,以及度伐單抗(陽性抗PD-L1抗體對照)(圖4G)及人類IgG1同型對照mAb(圖4H)。
圖5A-5F描繪藉由混合淋巴細胞反應(MLR)測定的根據本申請案之實施例之小鼠mAb之功能活性評估,更具體地,圖5B:29A8H8C7;圖5C:53C1F3D4;FIG.5E:27D7G3D4;且圖5F:18B7F4G8,以及阿特珠單抗(陽性抗PD-L1抗體對照)(圖5A及5D)。
圖6A-6D描繪根據本申請案之實施例之兩種小鼠mAb 29A8H8C7(圖6A)及53C1F3D4(圖6B)之單價結合親和力測定。亦測定阿特珠單抗(圖6C)及度伐單抗(圖6D)之結合親和力以供比較。
圖7A-7J描繪根據本申請案之實施例之嵌合抗體29A8H8C7(圖7A)及嵌合53C1F3D4(圖7B)、3種人源化29A8H8C7(圖7C-7E)及5種人源化53C1F3D4(圖7F-7J)與His標記之人類PD-L1之單價結合親和力測定。
圖8A-8L描繪根據本申請案之實施例之嵌合抗體29A8H8C7(圖8A)及53C1F3D4(圖8B)、3種人源化29A8H8C7(圖8C-8E)、5種人源化53C1F3D4(圖8F-8J)以及陽性對照抗體阿特珠單抗(圖8K)及度伐單抗(圖8L)與食蟹猴PD-L1 Fc-融合蛋白之單價結合親和力測定。
圖9A-9L描繪人類PD-L1過量表現穩定細胞株與根據本申請案之實施例之嵌合(圖9A及圖9E)或人源化抗體(圖9B-9D及圖9F-9J)之間的結合親和力。度伐單抗(圖9K)及阿特珠單抗(圖9L)用作抗PD-L1陽性對照。
圖10A-10L描繪食蟹猴PD-L1過量表現穩定細胞株與根據本申請案 之實施例之嵌合抗體(圖10A及圖10E)及人源化抗體(圖10B-10D及圖10F-10J)之間的結合親和力。度伐單抗(圖10K)及阿特珠單抗(圖10L)用作抗PD-L1陽性對照。
圖11A-11L描繪根據本申請案之實施例之嵌合mAb(圖11A及圖11E)及人源化mAb(圖11B-11D及圖11F-11J)對PD-L1細胞株及其受體PD-1ECD蛋白之間的相互作用的阻斷作用。度伐單抗(圖11K)及阿特珠單抗(圖11L)用作抗PD-L1陽性對照。
圖12A-12L描繪藉由基於PD-L1細胞之報道基因測定的根據本申請案之實施例之嵌合mAb(圖12A及圖12E)及人源化mAb(圖12B-12D及圖12F-12J)之功能活性評估。度伐單抗(圖12K)及阿特珠單抗(圖12L)用作抗PD-L1陽性對照。
圖13A-13I描繪藉由混合淋巴細胞反應(MLR)測定的根據本申請案之實施例之6種人源化mAb(圖13B-13C、圖13E-13F及圖13H-13I)及度伐單抗(陽性抗PD-L1抗體對照)(圖13A、圖13D及圖13G)之功能活性評估。
圖14A-14G描繪以根據本申請案之實施例之人源化抗體及基準抗體度伐單抗治療之後的腫瘤生長。圖14A-14E描繪治療之後個別攜帶腫瘤之小鼠之腫瘤體積。圖14F描繪治療之後五組攜帶腫瘤之小鼠之平均腫瘤體積。圖14G描繪在研究結束時五組攜帶腫瘤之小鼠之平均體重。
本申請案含有序列表,其作為ASCII格式序列表經由EFS-Web以電子方式提交,文件名為「688096.119序列表」,創建日期為2017年12月26日,且大小為約546KB。經由EFS-Wab提交之序列表為本發明之一部分且以全文引用之方式併入本文。
先前技術中及本說明書通篇引用或描述各種出版物、文章及專利;此等引用各自以全文引用之方式併入本文。已包括在本說明書中之文件、法令、材料、裝置、物品或諸如此類之討論係出於為本發明提供情境之目的。此類討論並非承認任一或所有此等事項形成關於所揭示或主張之任何發明的先前技術之一部分。
除非另外定義,否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與一般熟習本發明所屬之技術者通常所理解相同的含義。否則,本文所用之某些術語具有如本說明書中所闡述之含義。本文所引用之所有專利、公開之專利申請案及公開案如同在本文中充分陳述一般以引用之方式併入。
一般熟習此項技術者應理解,描述具有廣泛應用且涵蓋可考慮的各種章節、段落及句子之所有組合。任一實施例之討論僅意謂示例性且不意欲表明本揭示案(包括申請專利範圍)之範疇限於此等實例。
本申請案提供與PD-L1特異性結合之抗體(尤其單株抗體(mAb))或其抗原結合片段(下文亦稱為「抗PD-L1 mAb」)及其作為治療PD-L1相關疾病諸如癌症之新策略的用途。
據此,本申請案之一個態樣提供一種能夠特異性識別PD-L1(較佳人類PD-L1)的分離的抗體(較佳單株抗體)或其抗原結合片段。分離的抗PD-L1抗體可為全長抗PD-L1 mAb(例如,鼠類或人源化)、包含融合至另一抗體(諸如單域抗體(sdAb))或另一抗體之抗原結合片段的抗PD-L1 mAb或其抗原結合片段之蛋白或多肽。抗PD-L1抗體可為單特異性的或多特異性的、單價的或多價的。
亦提供包含本申請案之分離的抗體(較佳單株抗體)或其抗原結合片段之組成物(諸如醫藥組成物)、套組及製品,以及製備該分離的抗體或其抗原結合片段、該等組成物、套組及製品的方法,及使用本申請案之該等組成物、套組及製品治療PD-L1相關疾病(諸如癌症)的方法。
必須注意的是,除非上下文另外明確規定,否則如本文及隨附申請專利範圍中所用,單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。
除非另外說明,否則處於一系列要素之前之術語「至少」應理解為表示該系列中之每一要素。熟習此項技術者將僅使用常規實驗即會認識到或能夠確定本文所述之本發明之特定實施例的許多等效物。此類等效物意欲由本發明涵蓋。
除非上下文另外要求,否則在整個本說明書及隨附申請專利範圍中,用語「包含(comprise)」及變異體(諸如包含「comprises」及包含「comprising」)應理解為意指包括所述整數或步驟或者整數或步驟之群組,而不排除任何其他整數或步驟或者整數或步驟之群組。當在本文中使用時,術語「包含」可替代為術語「含有」或「包括」,或者有時在本文中使用時可替代為術語「具有」。
當在本文中使用時,「由......組成」排除在所主張要素中未指明之任何要素、步驟或成分。當在本文中使用時,「基本上由......組成」不排除對所主張之基本及新穎特徵不產生實質性影響的材料或步驟。每當在本文用於本申請案之態樣或實施例之上下文中使用時,任何前述術語「包含」、「含有」、「包括」及「具有」可由術語「由......組成」或「基本上由......組成」置換以改變本揭示案之範疇。
如本文所用,多個所述要素之間的連接術語「及/或」應理解為涵蓋個體及組合選項兩者。例如,當兩個要素藉由「及/或」結合時,第一選項係指第一要素在無第二要素之情況下的適用性。第二選項係指第二要素在無第一要素之情況下的適用性。第三選項係指第一要素及第二要素一起的適用性。此等選項之任一者均理解為落在該含義內,且因此滿足如本文所用之術語「及/或」之要求。多於一個選項的同時適用性亦理解為落在該含義內,因此滿足術語「及 /或」之要求。
除非以其他方式說明,在本文中描述之任何數值諸如濃度或濃度範圍應理解為在所有情況下皆受到用語「約(about)」之修飾。因此,數值通常包括所述值之±10%。例如,濃度1mg/mL包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同樣,濃度範圍1mg/mL至10mg/mL包括0.9mg/mL至11mg/mL。除非上下文另有明確指出,否則如本文所用,數值範圍之使用明確地包括該範圍內的所有可能的子範圍、所有單獨數值,包括此等範圍內之整數及該等值之分數。
術語「程式性細胞死亡1配體1」、「PD-L1」、「B7同源物1(B7-H1)」、「PD-L1抗原」、「PDCD1配體1」及「CD274」(參見例如Chemnitz(2004)J.Immunol.173:945-954)可互換使用,且包括人類PD-L1之變異體、同功型、物種同源物,及具有至少一個與PD-L1共有之抗原決定基之類似物(參見例如Butte(2008)Mol Immunol.45:3567-3572)。因此,在某些實施例中,本申請案之抗PD-L1構建體可與來自除人類之外之物種之PD-L1或在結構上與人類PD-L1相關之其他蛋白(例如,人類PD-L1同源物)交叉反應。在其他實施例中,本申請案之抗PD-L1構建體可對人類PD-L1具有完全特異性,且不表現出物種或其他類型之交叉反應性。
術語「人類PD-L1」係指人類序列PD-L1或其衍生物。例如,人類PD-L1可具有GenBank登錄號Q9NZQ7之胺基酸序列。人類PD-L1亦可藉由具有例如保守突變或在非保守區中之突變而具有與Genbank登錄號Q9NZQ7之人類PD-L1不同的胺基酸序列,且該PD-L1具有與Genbank登錄號Q9NZQ7之人類PD-L1實質上相同的生物學功能。例如,人類PD-L1之生物學功能係PD-L1之細胞外域中具有抗原決定基,其特異性地由本發明之抗PD-L1構建體來結合或人類PD-L1之生物學功能係T細胞活性之調節。
術語「抗原決定基」意謂能夠與抗體特異性結合的蛋白決定子。抗 原決定基通常由分子之化學活性表面分組諸如胺基酸或糖側鏈組成且通常具有具體的三維結構特徵以及具體的電荷特徵。構象抗原決定基與非構象抗原決定基之區別在於:在變性溶劑存在下,喪失與前者之結合而未喪失與後者之結合。
如本文所用之術語「程式性細胞死亡1(PD-1)」意欲指代屬於免疫球蛋白超家族且在T細胞及前B細胞上表現之細胞表面受體。人類PD-1之示例性胺基酸序列在Genbank登錄號NP_005009.2中揭示。
如本文所用,「治療(treatment)」或「治療(treating)」係用於獲得有利或所需結果(包括臨床結果)的方法。出於本發明之目的,有益或期望之臨床結果包括但不限於以下一種或多種:緩解由疾病引起之一種或多種症狀,減少疾病之程度,穩定疾病(例如,預防或延遲疾病之惡化),預防或延遲疾病之傳播(例如,轉移),預防或延遲疾病之復發,延遲或減緩疾病之進展,改善疾病狀態,提供疾病之緩解(部分或全部),減少治療疾病所需之一種或多種其他藥物之劑量,延遲疾病之進展,提高生活品質及/或延長生存期。「治療」亦涵蓋降低癌症的病理後果。本發明之方法考慮此等治療態樣中的任何一種或多種。
本文所用的術語「有效量」係指足以治療特定病症、病狀或疾病諸如改善、緩和、減輕及/或延遲其症狀中的一種或多種的藥劑或藥劑組合的量。關於癌症,有效量包括足以引起腫瘤縮小及/或降低腫瘤生長速率(諸如抑制腫瘤生長)或預防或延遲其他不需要之細胞增殖之量。在一些實施例中,有效量係足以延緩發展之量。在一些實施例中,有效量係足以預防或延緩復發之量。有效量可以一或多次投與之形式投與。有效量之藥物或組成物可:(i)減少癌細胞之數量;(ii)減小腫瘤大小;(iii)在一定程度上抑制、延緩、減緩並較佳阻止癌細胞浸潤到外周器官中;(iv)抑制(即,在某種程度上減緩並且較佳地停止)腫瘤轉移;(v)抑制腫瘤生長;(vi)預防或延遲腫瘤之發生及/或復發;及/或(vii)在一定程度上緩解與癌症相關之一或多種症狀。
術語「抗體」、「抗體部分」或「抗體構建體」係以其最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構,包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、全長抗體及其抗原結合片段,只要其展現所要抗原結合活性即可。
基本的4鏈抗體單元為由兩個相同輕(L)鏈及兩個相同重(H)鏈組成的異四聚醣蛋白。IgM抗體由5個基本的異四聚體單元連同稱為J鏈之另外的肽組成,且含有10個抗原結合位點,而IgA抗體包含2-5個基本的4鏈單元,該等單元可聚合以與J鏈組合而形成多價集合體。在IgG之情況下,4鏈單元一般為約150,000道耳頓。各L鏈藉由共價二硫鍵連接至H鏈,而兩個H鏈取決於H鏈同型而藉由一或多個二硫鍵彼此連接。各H鏈及L鏈亦具有規則隔開的鏈內二硫橋。各H鏈在N末端具有可變域(VH),接著對於α及γ鏈之各者而言為三個恆定域(CH),且對於μ及ε同型而言為四個CH域。各L鏈在N末端具有可變域(VL),接著在其另一端為恆定域。VL與VH對齊,且CL與重鏈之第一恆定域(CH1)對齊。據信特定胺基酸殘基形成輕鏈可變域與重鏈可變域之間的界面。將VH及VL配對在一起形成單一抗原結合位點。不同類別抗體之結構及性質參見例如Basic and Clinical Immunology,第8版,Daniel P.Sties,Abba I.Terr及Tristram G.Parsolw(編),Appleton & Lange,Norwalk,Conn.,1994,第71頁及第6章。任何脊椎動物物種之L鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸於兩種截然不同類型(稱為κ及λ)之一。視其重鏈恆定域(CH)之胺基酸序列而定,免疫球蛋白可歸於不同類別或同型。有五類免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,其具有分別稱為α、δ、ε、γ及μ之重鏈。γ及α類基於CH序列及功能之相對較小的差異被進一步分成亞類,例如,人類表現以下亞類:IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。
術語「僅有重鏈之抗體」或「HCAb」係指功能性抗體,其包含重鏈, 但缺少通常在4-鏈抗體中發現之輕鏈。已知駱駝科動物(例如駱駝、美洲駝或羊駝)產生HCAb。
術語「單域抗體」或「sdAb」係指具有三個互補決定區(CDR)之單一抗原結合多肽。單獨sdAb能夠在不與相應含CDR多肽配對的情況下結合至抗原。在一些情況下,單域抗體由駱駝科HCAb改造,並且其重鏈可變域在本文中稱為「VHH」(重鏈抗體重鏈之可變域)。一些VHH亦可稱為奈米抗體。駱駝科動物sdAb係已知最小之抗原結合抗體片段之一(參見,例如,Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-8(1993);Greenberg等人,Nature 374:168-73(1995);Hassanzadeh-Ghassabeh等人,Nanomedicine(Lond),8:1013-26(2013))。基本VHH具有從N末端到C末端之以下結構:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,其中FR1至FR4分別指框架區1至4,並且其中CDR1至CDR3係指互補決定區1至3。
「分離」抗體係已經從其生產環境(例如天然或重組)之組分中鑒定、分離及/或回收之抗體。較佳地,分離的多肽不與來自其產生環境的所有其他組分締合。來自其產生環境的污染物組分(諸如由重組轉染細胞導致的彼等組分)係通常干擾抗體之研究、診斷或治療用途的物質,並且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中,將多肽被純化至:(1)如例如藉由勞立法(Lowry method)所確定的大於95重量%抗體,並且在一些實施例中大於99重量%;(2)足以藉由使用旋杯式測序儀獲得N末端或內部胺基酸序列的至少15個殘基的程度,或者(3)均質,藉由使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳地銀染色法,在非還原或還原條件下進行SDS-PAGE。分離的抗體包括重組細胞內之原位抗體,因為抗體之天然環境之至少一種組分將不存在。然而,分離的多肽、抗體或構建體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。
抗體之「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈之胺基末端域。 重鏈及輕鏈之可變域可分別稱為「VH」及「VL」。此等結構域通常係抗體的最易變部分(相對於相同類別的其他抗體)並且包含抗原結合位點。來自駱駝科物種之僅有重鏈之抗體具有單個重鏈可變區,其被稱為「VHH」。因此VHH係一種特殊類型之VH。
術語「可變」係指如下實情,即在各抗體之間可變域之某些區段在序列上有很大差異。V域介導抗原結合且界定具體抗體對其具體抗原之特異性。然而,可變性未在可變域之整個跨度內均勻地分佈。而是,其集中於輕鏈及重鏈可變域中之稱為互補決定區(CDR)或超變區(HVR)的三個區段中。可變域之更高度保守部分稱為框架區(FR)。天然重鏈及輕鏈之可變域各自包含四個FR區,其主要採用β-摺疊構型,由三個CDR連接,該等CDR形成連接β-摺疊結構之環且在一些情況下形成β-摺疊結構之一部分。各鏈中之CDR藉由FR區緊密地保持在一起,且與來自另一鏈之CDR一起促進形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人,Sequences of Immunological Interest,第五版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恆定域不直接參與抗體與抗原之結合,但表現出多種效應子功能,諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性。
如本文所用之術語「單株抗體」係指從實質上均質的抗體群體獲得之抗體,即構成該群體的個別抗體係相同的,除了可以微量存在的可能天然存在的突變及/或轉譯後修飾(例如,異構化,脫醯胺)之外。單株抗體具有高度特異性,其針對單一抗原位點。相較於通常包括針對不同決定子(表位)之不同抗體的多株抗體製劑,各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。除了其特異性,單株抗體之優勢在於,其藉由融合瘤培養來合成,不受其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」指示抗體之特性為獲自實質上均質的抗體群體,且不應理解為需要藉由任何具體方法來產生抗體。例如,欲根據本申請案使用之單株抗體可藉由多種技術製成,包括例如融合瘤方法(例如,Kohler及Milstein.,Nature, 256:495-97(1975);Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995);Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988);Hammerling等人,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981));重組DNA方法(參見例如美國專利第4,816,567號);噬菌體呈現技術(參見例如Clackson等人,Nature,352:624-628(1991);Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004);及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004));及用於在具有部分或全部編碼人類免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因座或基因的動物中產生人類或人類樣抗體的技術(參見例如WO 1998/24893;WO 1996/34096;WO 1996/33735;WO 1991/10741;Jakobovits等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:2551(1993);Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993);Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993);美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號及第5,661,016號;Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992);Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994);Morrison,Nature 368:812-813(1994);Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996);Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996);及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
術語「全長抗體」、「完整抗體」或「完全抗體」可互換使用,表示呈大致上完整形式的抗體,與抗體片段不同。具體地說,全長4鏈抗體包括具有重鏈及輕鏈(包括Fc區)的抗體。全長僅重鏈抗體包括重鏈(例如VHH)及Fc區。恆定結構域可為天然序列恆定結構域(例如人類天然序列恆定結構域)或其胺基酸序列變異體。在一些情況下,完整抗體可具有一或多種效應子功能。
「抗體片段」包括完整抗體之一部分,較佳地該完整抗體之抗原結 合區及/或可變區。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段;雙抗體(diabody);線性抗體(參見美國專利第5,641,870號,實例2;Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995]);單鏈抗體分子;單域抗體(諸如VHH)及由抗體片段形成之多特異性抗體。木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個的相同抗原結合片段,稱為「Fab」片段,及殘留「Fc」片段,該名稱反映了容易結晶之能力。Fab片段由整條L鏈連同H鏈之可變區結構域(VH)及一條重鏈之第一恆定結構域(CH1)組成。每個Fab片段關於抗原結合係單價的,即,它具有單一抗原結合位點。抗體經木瓜蛋白酶處理產生單個大F(ab')2片段,該片段大致對應於具有不同抗原結合活性的兩個二硫鍵連接的Fab片段並且仍然能夠交聯抗原。Fab'片段因在CH1域之羧基末端處具有少量額外的殘基(包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸)而不同於Fab片段。Fab'-SH為本文中恆定域之半胱胺酸殘基攜帶自由硫醇基的Fab'之名稱。F(ab')2抗體片段最初以Fab'片段對之形式產生,該等片段之間具有鉸鏈半胱胺酸。抗體片段之其他化學偶聯亦係已知的。
Fc片段包含藉由二硫鍵保持在一起的兩條H鏈之羧基末端部分。抗體之效應子功能由Fc區中之序列決定,該區亦由存在於某些細胞型上之Fc受體(FcR)識別。
術語「恆定域」係指免疫球蛋白分子的相對於免疫球蛋白之其他部分,即含有抗原結合位點之可變域,具有更保守之胺基酸序列的部分。恆定域含有重鏈之CH1、CH2及CH3域(統稱為CH)及輕鏈之CHL(或CL)域。
來自任何哺乳動物物種之抗體(免疫球蛋白)之「輕鏈」可基於其恆定域的胺基酸序列指定為兩種明顯不同類型(稱為卡帕(κ)及拉姆達(λ))中之一者。
「Fv」係含有完全抗原識別及結合位點之最小抗體片段。此片段由處於緊密、非共價締合的一個重鏈可變區結構域及一個輕鏈可變區結構域的二聚體組成。從此兩個結構域之摺疊產生六個高變環(從H鏈及L鏈各自產生3個 環),該等高變環促成用於抗原結合之胺基酸殘基並且賦予抗體抗原結合特性。然而,甚至單個可變域(或僅包含三個CDR對抗原具有特異性之HVR之Fv中的一半)具有識別及結合抗原的能力,但與整個結合位點相比,處於較低的親和力下。
「單鏈Fv」(亦縮寫為「sFv」或「scFv」)係包含連接到單一多肽鏈中之VH及VL抗體結構域之抗體片段。較佳地,sFv多肽亦包含VH結構域與VL結構域之間的多肽接頭,該接頭能夠使sFv形成用於抗原結合之所需結構。關於sFv之評述,參見Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg及Moore編,Springer-Verlag,New York,第269-315頁(1994)。
本文所述之抗體之「功能片段」構成完整抗體之一部分,通常包括完整抗體之抗原結合區或可變區或保留或具有經修飾之FcR結合能力的抗體之Fc區。抗體片段之實例包括線性抗體、單鏈抗體分子及由抗體片段形成之多特異性抗體。
術語「雙抗體」係指藉由在VH與VL域之間以短接頭(約5-10個殘基)構建sFv片段(參見前一段落)來製備之小抗體片段,使得達成V域之鏈內而不是鏈間配對,從而得到二價片段,即具有兩個抗原結合位點之片段。雙特異性抗體為兩種抗體之VH及VL域存在於不同多肽鏈上的兩個「交叉」sFv片段之異二聚體。雙抗體更詳細地描述於例如EP 404,097;WO 93/11161;Hollinger等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)中。
本文中之單株抗體特定地包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白),其中重鏈及/或輕鏈之一部分與源於特定物種或屬特定抗體類別或亞類之抗體中的相應序列一致或同源,而該(等)鏈之剩餘部分與源於另一物種或屬另一抗體類別或亞類之抗體中的相應序列一致或同源,以及該等抗體之片段,只要其展現所需生物活性即可(美國專利第4,816,567號;Morrison等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。「人源化抗體」用作「嵌合抗體」之亞組。
非人類(例如,美洲駝或駱駝科)抗體之「人源化」形式為含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的抗體。在一些實施例中,人源化抗體為其中來自受者的CDR(在下文定義)的殘基被來自諸如小鼠、大鼠、兔、駱駝科、美洲駝、羊駝或非人類靈長類動物的非人類物種(供體抗體)的CDR的具有所需特異性、親和力及/或能力的殘基置換的人類免疫球蛋白(受者抗體)。在一些情況下,人類免疫球蛋白之框架區(「FR」)殘基由對應的非人類殘基置換。此外,人源化抗體可包含不存在於受者抗體或供體抗體中之殘基。可進行此等修飾以進一步改良抗體性能,諸如結合親和力。一般而言,人源化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部,其中全部或實質上全部高變環對應於非人類免疫球蛋白序列之彼等,且全部或實質上全部FR區為人類免疫球蛋白序列之彼等,但是FR區可包括一或多處個別FR殘基取代,該一或多處取代改良抗體性能,諸如結合親和力、異構化、免疫原性等。FR中此等胺基酸取代之數目通常在H鏈中不多於6,且在L鏈中不多於3。人源化抗體視情況亦將包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc),通常為人類免疫球蛋白之恆定區。關於其他細節,參見例如Jones等人,Nature 321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988);及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。亦參見例如Vaswani及Hamilton,Ann.Allergy,Asthma & Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995);Hurle及Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994);及美國專利第6,982,321號與第7,087,409號。
「人類抗體」為具有對應於人類所產生之抗體之胺基酸序列的胺基酸序列及/或已使用如本文所揭示之製備人類抗體之任一技術製成的抗體。人類抗體之此定義特定地排除包含非人類抗原結合殘基之人源化抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術,包括噬菌體呈現文庫產生。Hoogenboom及 Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991);Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77頁(1985);Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)中所述之方法亦可用於製備人類單株抗體。亦參見van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。人類抗體可藉由向基因轉殖動物投與抗原來製備,該基因轉殖動物已經修飾以響應於抗原攻擊產生該等抗體,但其內源基因座已失能,例如經免疫之異種小鼠(關於XENOMOUSETM技術,參見例如美國專利第6,075,181號及第6,150,584號)。關於經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體,亦參見例如Li等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
當在本文中使用時,術語「高變區」、「HVR」或「HV」係指抗體可變域之序列高度可變及/或形成結構確定環的各區。通常,單域抗體包含三個HVR(或CDR):HVR1(或CDR1)、HVR2(或CDR2)及HVR3(或CDR3)。在三種HVR中,HVR3(或CDR3)顯示最大多樣性,並且被認為在賦予抗體之精細特異性方面發揮獨特作用。參見,例如Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-448(1993);Sheriff等人,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
術語「互補決定區」或「CDR」用於指由Kabat系統定義之高變區。參見Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md(1991)。
多個HVR描述在使用中並且涵蓋在本文中。Kabat互補決定區(CDR)基於序列可變性並且係最常用的(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。Chothia替代地提及結構環之位置(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR表示Kabat HVR與Chothia結構化環之間的折衷,並且藉由Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體來使用。「接觸」HVR 基於可用複合物晶體結構之分析。來自此等HVR中每個殘基在以下表1中指出。
HVR可包括如下之「延長HVR」:在VL中,24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)、以及89-97或89-96(L3),且在VH中,26-35(H1)、50-65或49-65(H2)、以及93-102、94-102或95-102(H3)。對於此等定義中之每個,可變域殘基係根據Kabat等人(出處同上)進行編號。
單域抗體(諸如VHH)之胺基酸殘基係根據Kabat等人給出之VH域之一般編號進行編號(「Sequence of proteins of immunological interest」,US Public Health Services,NIH Bethesda,Md.,出版號91),如同在Riechmann及Muyldermans,J.Immunol.Methods 2000年6月23日;240(1-2):185-195之文章中應用於來自駱駝科動物之VHH域。根據該編號,VHH之FR1包含1-30位之胺基酸殘基,VHH之CDR1包含31-35位之胺基酸殘基,VHH之FR2包含36-49位之胺基酸,VHH之CDR2包含50-65位之胺基酸殘基,VHH之FR3包含66-94位之胺基酸殘基,VHH之CDR3包含95-102位之胺基酸殘基,VHH之FR4包含103-113位之胺基酸殘基。在該態樣中,應注意,如業內對於VH域及VHH域所周知,每個CDR中胺基酸殘基之總數可以不同,並且可以不對應於由Kabat編號指示之胺基酸殘基之總數(即,根據Kabat編號之一個或多個位置在實際序列中可能未被佔據,或者實際序列可能含有比Kabat編號允許之數量更多之胺基酸 殘基)。
表述「如Kabat中之可變域殘基編號」或「如Kabat中之胺基酸位置編號」及其變型係指用於Kabat等人(出處同上)中之抗體編譯之重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用此編號系統,實際線性胺基酸序列可含有更少的或額外的胺基酸,該等胺基酸對應於可變域之FR或HVR的縮短或對其進行的插入。例如,重鏈可變域可包括H2之殘基52之後的單個胺基酸插入(根據Kabat之殘基52a)及重鏈FR殘基82之後的插入殘基(例如,根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。可藉由在抗體序列之同源區處與「標準」Kabat編號序列比對來確定給定抗體之殘基的Kabat編號。
除非本文另有說明,否則免疫球蛋白重鏈中殘基之編號係如Kabat等人(出處同上)之EU索引之編號。「如Kabat中之EU索引」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。
「框架」或「FR」殘基係除了如本文所定義之HVR殘基以外的彼等可變域殘基。
「人類共有框架」或「受體人類框架」為表示人類免疫球蛋白VL或VH框架序列之選擇中最常出現之胺基酸殘基的框架。一般而言,人類免疫球蛋白VL或VH序列選自可變域序列之亞組。一般而言,序列之亞組為如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中之亞組。實例包括對於VL,亞組可為如Kabat等人(出處同上)中之亞組κ I、κ II、κ III或κ IV。另外,對於VH,亞組可為如Kabat等人中之亞組I、亞組II或亞組III。可替代地,人類共有框架可來源於上述者,其中具體殘基,諸如當人類框架殘基基於其與供體框架之同源性藉由將供體框架序列與各種人類框架序列之集合進行比對來選擇時。「來源於」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之受體人類框架可包含人 類免疫球蛋白框架或人類共有框架之相同胺基酸序列,或其可含有預先存在的胺基酸序列變化。在一些實施例中,預先存在的胺基酸變化之數目為10個或更少、9個或更少、8個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少、或2個或更少。
「親和力成熟」抗體係在其一或多個CDR中具有一或多個改變而導致抗體對抗原之親和力相較於不具有彼等改變之親本抗體改良的抗體。在一些實施例中,親和力成熟抗體對靶抗原具有奈莫耳或甚至皮莫耳的親和力。親和力成熟抗體係藉由此項技術中已知的程序產生。例如,Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)描述藉由VH域及VL域改組之親和力成熟。CDR及/或框架殘基之隨機誘變描述於例如:Barbas等人Proc Nat'l.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994);Schier等人Gene 169:147-155(1995);Yelton等人J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson等人,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);及Hawkins等人,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
如本文所用,術語「特異性結合」、「特異性識別」或「對...具有特異性」係指可量測的及可再現的相互作用,諸如靶標與抗原結合蛋白質(諸如mAb)之結合,該結合在存在包括生物分子在內之分子之異種群體的情況下確定靶標的存在。例如,特異性結合靶標(其可以為抗原決定基)之抗原結合蛋白(諸如mAb)係與結合其他靶標相比,以更大親和力、親合力、更容易地及/或以更長持續時間結合該靶標之抗原結合蛋白(諸如mAb)。在一些實施例中,抗原結合蛋白(諸如mAb)與不相關靶標之結合程度不到抗原結合蛋白(諸如mAb)與靶標之結合的約10%,如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在一些實施例中,特異性結合靶標之抗原結合蛋白(諸如mAb)具有10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M之解離常數(KD)。在一些實施例中,抗原結合蛋白特異性地結合在來自不同物種的蛋白間保守的蛋白上之表位。在一 些實施例中,特異性結合可包括但不需要專一性結合。
術語「特異性」係指抗原結合蛋白(諸如mAb)針對抗原之特定抗原決定基的選擇性識別。例如,天然抗體為單特異性的。如本文所用之術語「多特異性」表示抗原結合蛋白具有多抗原決定基特異性(即,能夠特異性結合一個生物分子上之兩個、三個或更多個不同的抗原決定基或能夠特異性結合兩個、三個或更多個不同的生物分子上之抗原決定基)。如本文所用之「雙特異性」表示抗原結合蛋白具有兩種不同的抗原結合特異性。除非另有說明,否則所列出之雙特異性抗體結合之抗原之順序係任意的。即,例如,術語「抗PD-L1/PD-1」、「抗PD-1/PD-L1」、「PD-L1×PD-1」、「PD-1×PD-L1」、「PD-1-PD-L1」及「PD-L1-PD-1」可互換地用來指特異性結合PD-L1及PD-1之雙特異性抗體。如本文所用之術語「單特異性」表示具有一個或多個結合位點之抗原結合蛋白(諸如mAb),每個結合位點結合相同抗原之相同抗原決定基。
如本文所用的術語「價」表示抗原結合蛋白質中存在特定數目的結合位點。例如天然抗體或全長抗體具有兩個結合位點並且係二價的。因此,術語「三價」、「四價」、「五價」及「六價」分別表示抗原結合蛋白中存在兩個結合位點、三個結合位點、四個結合位點、五個結合位點及六個結合位點。
「抗體效應子功能」係指可歸因於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異體Fc區)的彼等生物活性,且隨抗體同型而有所不同。抗體效應子功能之實例包括:C1q結合及補體依賴性細胞毒性;Fc受體結合;抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC);吞噬作用;細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調;及B細胞活化。「減少或最小化的」抗體效應子功能意謂其自野生型或未經修飾之抗體減少至少50%(可替代地60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%)。一般熟習此項技術者可易於確定及衡量抗體效應子功能之測定。在較佳實施例中,補體結合、補體依賴性細胞毒性及抗體依 賴性細胞毒性之抗體效應子功能受到影響。在一些實施例中,效應子功能通過恆定區中消除醣基化的突變(例如「無效應子突變」)來消除。在一個態樣中,無效應子突變包含CH2區中之N297A或DANA突變(D265A及/或N297A)。Shields等人,J.Biol.Chem.276(9):6591-6604(2001)。可替代地,導致減少或消除效應子功能的另外的突變包括:K322A及L234A/L235A(LALA)。可替代地,效應子功能可通過生產技術來減少或消除,諸如在未經醣基化之宿主細胞(例如,大腸桿菌(E.coli.))中之表現或以導致醣基化模式改變成在促進效應子功能時無效或不太有效的方式(例如Shinkawa等人,J.Biol.Chem.278(5):3466-3473(2003))。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或ADCC係指一種細胞毒性形式,其中結合至某些細胞毒性細胞(例如,自然殺傷(NK)細胞、嗜中性球及巨噬細胞)上存在之Fc受體(FcR)上的分泌Ig使得此等細胞毒性效應細胞能夠與攜帶抗原之靶細胞特異性結合並隨後以細胞毒素殺傷靶細胞。抗體「武裝」細胞毒性細胞且為藉由此機制殺傷靶細胞所需。用於介導ADCC的原代細胞NK細胞僅表達FcγRIII,而單核細胞表達FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之Fc表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464頁中之表3中。為了評估所關注之分子之ADCC活性,可執行活體外ADCC測定,諸如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中所述者。用於此類測定之有用效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。可替代地或另外,所關注之分子之ADCC活性可例如在動物模型(諸如Clynes等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中揭示之動物模型)中進行活體內評估。
本文術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之C末端區,包括天然序列Fc區及變異體Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc區的邊界可變化,但人類IgG重鏈Fc區通常限定為從在位置Cys226處之胺基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基末端。Fc區之C末端離胺酸(根據EU編號系統之殘基447)可例如在抗體 產生或純化期間或藉由對編碼抗體之重鏈的核酸進行重組工程化來去除。因此,完整抗體的組成物可包括K447殘基全部去除的抗體群體、無K447殘基去除的抗體群體、以及具有擁有或沒有K447殘基之抗體之混合物的抗體群體。用於本文描述之抗體中之合適的天然序列Fc區包括人類IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3及IgG4。
「Fc受體」或「FcR」描述結合抗體Fc區之受體。較佳FcR為天然序列人類FcR。此外,較佳FcR為結合IgG抗體(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞類之受體(包括此等受質之等位基因變異體及替代地剪接形式)的FcR,FcγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」),其具有主要在其細胞質結構域中不同的相似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質結構域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制模體(ITIM)。(參見M.Daëron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR綜述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991);Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994);及de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。本文中術語「FcR」涵蓋其他FcR(包括將來欲鑒別之FcR)。
術語「Fc受體」或「FcR」亦包括新生兒受體FcRn,其負責將母體IgG轉移至胎兒。Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等人,J.Immunol.24:249(1994)。量測與FcRn結合之方法為已知的(參見例如Ghetie及Ward,Immunol.Today 18:(12):592-8(1997);Ghetie等人,Nature Biotechnology 15(7):637-40(1997);Hinton等人,J.Biol.Chem.279(8):6213-6(2004);WO 2004/92219(Hinton等人))。可以例如在表現人類FcRn之基因轉殖小鼠或轉染人類細胞株中或者在投與具有變異體Fc區之多肽的靈長類動物中測定活體內與FcRn之結合及人類FcRn高親和力結合多肽之血清半衰期。WO 2004/42072(Presta)描述改良 或減弱與FcR之結合的抗體變異體。亦參見例如Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指靶細胞在補體存在下溶解之能力。經典補體路徑之活化係藉由補體系統之第一組分(C1q)與結合其同源抗原的(適當亞類的)抗體之結合來起始。為了評估補體活化,可執行CDC測定,例如,如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述。具有改變的Fc區胺基酸序列及增加或減少的C1q結合能力的抗體變異體描述於美國專利第6,194,551B1號及WO99/51642中。彼等專利公開案之內容明確地以引用之方式併入本文。亦參見Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
「結合親和力」總體上係指分子(例如,抗體)之單一結合位點與它的結合配偶體(例如,抗原)之間的非共價相互作用之總和的強度。除非另外指示,否則如本文所用,「結合親和力」係指反映結合對的成員之間的1:1相互作用的內在結合親和力。結合親和力可以由KD、Koff、Kon或Ka表示。如本文所用,術語「Koff」意指抗體(或抗原結合域)從抗體/抗原複合物中解離之解離速率常數,如從動力學選擇設置確定,以s-1為單位表示。如本文所用,術語「Kon」意指抗體(或抗原結合域)與抗原結合形成抗體/抗原複合物之締合速率常數,以M-1s-1為單位表示。如本文所用,術語平衡解離常數「KD」係指特定抗體-抗原相互作用之解離常數,並且描述佔據存在於平衡之抗體分子溶液中之所有抗體結合域之一半所需之抗原濃度,並且等於Koff/Kon,以M為單位表示。KD之量測預先假定所有結合劑都在溶液中。在抗體與細胞壁連接之情況下,例如在酵母表現系統中,相應平衡速率常數表示為EC50,此給出了KD之良好近似值。親和常數Ka係解離常數KD之倒數,以M-1為單位表示。
解離常數(KD)用作顯示抗體對抗原之親和力之指標。例如,藉由使用標記有多種標記物試劑之抗體的Scatchard方法,以及藉由使用BiacoreX (Amersham Biosciences製造)(其係櫃枱買賣量測套組)或類似套組,根據用戶手冊及套組附帶之實驗操作方法,可以易於進行分析。可以使用此等方法導出之KD值以M(莫耳每升)為單位表示。特異性結合靶標之抗體或其抗原結合片段可具有例如10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M之解離常數(KD)。
抗體或抗原結合域之結合特異性可以藉由此項技術已知之方法經實驗確定。此類方法包括但不限於Western印跡、ELISA印跡、RIA印跡、ECL印跡、IRMA印跡、EIA印跡、BIAcore測試及肽掃描。
半數最大抑制濃度(IC50)係物質(諸如抗體)抑制特定生物或生物化學功能之有效性之量度。它表明需要多少特定藥物或其他物質(抑制劑,諸如抗體)來抑制特定之生物過程(例如,PD-L1與B7-1,或過程之組分,即酶、細胞、細胞受體或微生物之間之結合)達一半。該等值通常表示為莫耳濃度。對於促效劑藥物或其他物質(例如抗體),IC50與「EC50」相當。EC50亦表示在活體內獲得最大作用的50%所需的血漿濃度。如本文所用,「IC50」用於指示在活體外中和50%之抗原生物活性(諸如PD-L1生物活性)所需之抗體(諸如抗PD-L1 mAb)之有效濃度。IC50或EC50可以藉由生物測定來量測,諸如藉由FACS分析(競爭結合測定)之配體結合之抑制,基於細胞之細胞因子釋放測定或擴增之發光鄰近均相測定(AlphaLISA)。
相對於肽、多肽或抗體序列的「胺基酸序列同一性百分比(%)」及「同源性」定義為,在比對序列並且引入缺口(若需要)以獲得最大序列同一性百分比之後,候選序列中與特定肽或多肽序列中胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分比,而不考慮任何保守取代作為序列同一性的一部分。出於確定胺基酸序列同一性百分比的目的所進行的比對可以本領域技術範圍內的各種方式實現,例如使用公眾可獲得的計算機軟體,諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或 MEGALIGNTM(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定量測比對的適當參數,包括對所比較的序列的全長獲得最大比對所需的任何算法。
編碼構建體、抗體或其抗原結合片段之「分離的」核酸分子係經識別並且與至少一種污染物核酸分子分開的核酸分子,該核酸分子在其產生的環境中通常與污染物核酸分子締合。較佳地,分離的核酸分子不與產生環境相關聯的所有組分締合。編碼本文所述多肽及抗體的分離的核酸分子呈其在自然界中存在的形式或狀態以外的形式。因此分離的核酸分子有別於天然存在於細胞中之編碼本文所述多肽及抗體的核酸。分離的核酸包括通常含有核酸分子的細胞中所含有的核酸分子,但核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置的染色體位置處。
如本文所用,術語「載體」係指一種核酸分子,其能夠傳播其所連接之另一種核酸分子。該術語包括呈自主複製核酸結構之載體以及併入其中已引入其的宿主細胞之基因組中之載體。某些載體能夠指導其可操作性連接之核酸的表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。
如本文所用之術語「轉染」或「轉型」或「轉導」係指將外源性核酸轉移或引入至宿主細胞中的過程。「轉染」或「轉型」或「轉導」細胞為已經以外源性核酸轉染、轉型或轉導的細胞。細胞包括原代受試者細胞及其後代。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入有外源性核酸之細胞,包括此類細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」,其包括原代轉型細胞及由其衍生之子代而不考慮繼代數目。後代可能在核酸含量方面未與親本細胞完全一致,但可含有突變。本文包括具有與針對原始轉型細胞所篩選或選擇相同的功能或生物活性之突變後代。
「輔助環境」係指個體已具有癌症病史且一般(但不必要)對療法有反 應的臨床環境,療法包括但不限於手術(例如,手術切除)、放療及化學療法。然而,此等個體因其癌症病史而被認為處於產生疾病之風險。「輔助環境」中之治療或投與係指隨後的治療模式。風險程度(例如,當輔助環境中之個體被認為「高風險」或「低風險」時)取決於若干因素,最通常為首次治療時的疾病程度。
「新輔助環境」係指在初步/確定性療法之前進行方法的臨床環境。
術語「醫藥組成物」之「醫藥調配物」係指以下製劑,其呈允許活性成分之生物活性有效之形式,且不含對調配物所將投與之受試者有不可接受毒性之額外組分。此類調配物係無菌的。「無菌」調配物係滅菌的或不含所有活的微生物及其孢子。
應理解,本文中描述的本發明的實施例包括「由實施例組成」及/或「基本上由實施例組成」。
本文中對「約」某一個值或參數的提及包括(以及描述)針對該值或參數本身的變量。例如,關於「約X」的描述包括「X」的描述。
如本文所使用,提及「並非」某一值或參數通常意謂並描述「不同於」某一值或參數。例如,該方法不用於治療X型癌症,意味著該方法用於治療不同於X之類型之癌症。
本文使用之術語「約X-Y」具有與「約X至約Y」相同之含義。
本文所述之分離的抗PD-L1構建體包含特異性識別PD-L1或與PD-L1結合的單株抗體(mAb)部分(或「抗PD-L1 mAb」)。在本發明之一些實施例中,分離的抗PD-L1構建體為全長IgG。
結構與相關B7家族成員類似,PD-L1蛋白含有細胞外IgV及IgC域 以及短的細胞質區。PD-L1具有與CD28類似的細胞內域,其缺乏內在催化活性且含有一個能夠結合PI3K、PP2A及SHP-2之YVKM模體以及一個能夠結合含SH3蛋白之富脯胺酸模體。
人類PD-L1之示例性胺基酸序列揭示於Genbank登錄號Q9NZQ7,在其中,胺基酸1-18之區為前導肽;胺基酸19-238之區為細胞外域;胺基酸239-259之區為跨膜域;且胺基酸260-290之區為細胞質域。
根據本發明之實施例,人類PD-L1序列之胺基酸序列與Genbank登錄號Q9NZQ7之人類PD-L1至少90%一致,並且含有與其他物種(例如,鼠類)之PD-L1胺基酸序列相比,將胺基酸序列鑒定為人類的胺基酸殘基。在一些實施例中,人類PD-L1之胺基酸序列可以與Genbank登錄號Q9NZQ7之PD-L1至少約95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中,人類PD-L1序列將展示與Genbank登錄號Q9NZQ7之PD-L1不多於10個胺基酸差異。在一些實施例中,人類PD-L1可以展示與Genbank登錄號Q9NZQ7之PD-L1不多於5個、4個、3個、2個或1個胺基酸差異。可以如本文所述確定同一性百分比。在一些實施例中,本文所述之抗PD-L1 mAb特異性結合與Genbank登錄號Q9NZQ7之PD-L1具有100%胺基酸序列同一性的PD-L1多肽。在一些實施例中,本申請案之抗PD-L1 mAb特異性結合包含SEQ ID NO:395之胺基酸序列的PD-L1多肽。
在一些實施例中,本申請案之抗PD-L1 mAb可與來自除人類之外之物種之PD-L1或在結構上與人類PD-L1相關之其他蛋白(例如,人類PD-L1同源物)交叉反應。在一些實施例中,本申請案之抗PD-L1 mAb對人類PD-L1具有完全特異性,且不表現出物種或其他類型之交叉反應性。在一些實施例中,本申請案之抗PD-L1 mAb特異性結合人類PD-L1之可溶性同功型。在一些實施例中,本申請案之抗PD-L1 mAb特異性識別人類PD-L1之膜結合同功型(SEQ ID NO:395)。
在一些實施例中,本文所述之抗PD-L1 mAb特異性識別或結合PD-L1之細胞外域(ECD)。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb特異性結合PD-L1細胞外域(ECD)之N末端部分。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb特異性識別PD-L1細胞外域(ECD)之C末端部分。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb特異性識別PD-L1細胞外域(ECD)之中間部分。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb所特異性識別之PD-L1細胞外域之胺基酸序列與Genbank登錄號Q9NZQ7之PD-L1細胞外域至少約95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb所特異性識別之PD-L1細胞外域之胺基酸序列與Genbank登錄號Q9NZQ7之PD-L1細胞外域100%一致。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb特異性識別具有SEQ ID NO:396之胺基酸序列的PD-L1 ECD多肽。
抗體或抗原結合域之結合特異性可以藉由此項技術已知之方法經實驗確定。此類方法包括但不限於Western印跡、ELISA測試、RIA測試、ECL測試、IRMA測試、EIA測試、BIAcore測試及肽掃描。
在一些實施例中,抗PD-L1 mAb與PD-L1之間的結合之KD為約10-5M至約10-6M、約10-6M至約10-7M、約10-7M至約10-8M、約10-8M至約10-9M、約10-9M至約10-10M、約10-10M至約10-11M、約10-11M至約10-12M、約10-5M至約10-12M、約10-6M至約10-12M、約10-7M至約10-12M、約10-8M至約10-12M、約10-9M至約10-12M、約10-10M至約10-12M、約10-5M至約10-11M、約10-7M至約10-11M、約10-8M至約10-11M、約10-9M至約10-11M、約10-5M至約10-10M、約10-7M至約10-10M、約10-8M至約10-10M、約10-5M至約10-9M、約10-7M至約10-9M、約10-5M至約10-8M或約10-6M至約10-8M。
在一些實施例中,抗PD-L1 mAb與PD-L1之間的結合之Kon為約102 M-1s-1至約104M-1s-1、約104M-1s-1至約106M-1s-1、約106M-1s-1至約107M-1s-1、約102M-1s-1至約107M-1s-1、約103M-1s-1至約107M-1s-1、約104M-1s-1至約107M-1s-1、約105M-1s-1至約107M-1s-1、約103M-1s-1至約106M-1s-1或約104M-1s-1至約106M-1s-1。
在一些實施例中,抗PD-L1 mAb與PD-L1之間的結合之Koff為約1s-1至約10-2s-1、約10-2s-1至約10-4s-1、約10-4s-1至約10-5s-1、約10-5s-1至約10-6s-1、約1s-1至約10-6s-1、約10-2s-1至約10-6s-1、約10-3s-1至約10-6s-1、約10-4s-1至約10-6s-1、約10-2s-1至約10-5s-1或約10-3s-1至約10-5s-1。
在一些實施例中,在以0.12nM PD-1及0.2nM PD-L1進行之擴增之發光鄰近均相測定(AlphaLISA)中,抗PD-L1 mAb之IC50小於10nM。在一些實施例中,藉由FACS分析(競爭結合測定)或基於細胞之細胞因子釋放測定,在配體結合之抑制中,抗PD-L1 mAb之IC50小於500nM。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb之IC50小於1nM、約1nM至約10nM、約10nM至約50nM、約50nM至約100nM、約100nM至約200nM、約200nM至約300nM、約300nM至約400nM或約400nM至約500nM。
在一些實施例中,本文所提供之抗PD-L1抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利第4,816,567號以及Morrison等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中。在一個實例中,嵌合抗體包含非人可變區(例如,來源於駱駝科物種,例如美洲駝之可變區)及人恆定區。在又一個實例中,嵌合抗體為「類別轉換」抗體,其中類別或亞類與親本抗體的類別或亞類相比已經改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在一些實施例中,嵌合抗體為人源化抗體。通常,非人類抗體被人源化以降低對人的免疫原性,同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一 般說來,人源化抗體包含一個或多個可變域,其中HVR,例如CDR(或其部分)來源於非人類抗體,並且FR(或其部分)來源於人類抗體序列。人源化抗體視情況亦將包含至少一部分人恆定區。在一些實施例中,人源化抗體中之一些FR殘基被來自非人類抗體(例如HVR殘基所來源的抗體)之相應殘基取代,例如以恢復或改善抗體特異性或親和力。
人源化抗體及其製備方法綜述於例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008),且進一步描述於例如Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988);Queen等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989);美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號;Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(α-CDR)移植);Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述「表面重塑」);Dall'Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述「FR改組」);以及Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)及Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述達成FR改組之「導向選擇」方法)。
可用於人源化之人類框架區包括但不限於:使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(參見例如Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993));源於輕鏈或重鏈可變區之特定亞組之人類抗體的共有序列之框架區(參見例如Carter等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);及Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993));人類成熟(體細胞突變)框架區或人類生殖系框架區(參見例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008));及由篩檢FR文庫獲得之框架區(參見例如Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
在一些實施例中,mAb被修飾,例如經人源化,而不降低該域對抗原之天然親和力,同時降低其對異源物種之免疫原性。例如,可以確定抗體重鏈及輕鏈可變域(VH及VL)之胺基酸殘基,並且例如在框架區中之一個或多個小 鼠胺基酸被如在人類共有序列中發現之其人類對應物置換,該多肽不失去其典型特徵,即人源化不會顯著影響所產生多肽之抗原結合能力。小鼠單株抗體之人源化需要在兩條鏈(重鏈及輕鏈)中引入並誘變有限量的胺基酸且保存兩條鏈之組裝。
在一些實施例中,本文所提供之抗PD-L1抗體(尤其mAb)為人類抗體。可以使用此項技術已知之各種技術產生人類抗體。人類抗體概述於van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。能夠產生完全人類單域抗體之基因轉殖小鼠或大鼠係此項技術已知的。參見,例如,US20090307787A1、美國專利第8,754,287號、US20150289489A1、US20100122358A1及WO2004049794。
可以藉由向基因轉殖動物投與免疫原來製備人類抗體,該基因轉殖動物已經被修飾以響應抗原性攻擊產生完整人類抗體或具有人類可變區的完整抗體。此類動物通常含有全部或一部分人免疫球蛋白基因座,其替換內源免疫球蛋白基因座,或者存在於染色活體外或隨機整合到動物染色體中。在此類基因轉殖小鼠中,內源免疫球蛋白基因座通常已經失活。關於從基因轉殖動物獲得人類抗體之方法的綜述參見Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。亦參見例如描述XENOMOUSETM技術之美國專利第6,075,181號及第6,150,584號;描述HUMAB®技術之美國專利第5,770,429號;描述K-M MOUSE®技術之美國專利第7,041,870號;及描述VELOCIMOUSE®技術之美國專利申請公開案第US 2007/0061900號。可以例如藉由與不同的人恆定區組合來進一步修飾來自由此類動物產生之的完整抗體之人可變區。
亦可以藉由基於融合瘤之方法製備人類抗體。用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤(heteromyeloma)細胞株已有描述。(參見 例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63頁(Marcel Dekker公司,New York,1987);及Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。其他方法包括例如美國專利第7,189,826號(描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人類-人類融合瘤)中所描述之彼等方法。人類融合瘤技術(三源融合瘤技術(Trioma technology))亦描述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。
亦可以藉由分離選自人類來源之噬菌體展示文庫之Fv純系可變域序列來產生人類抗體。然後可將此類可變域序列與所需人類恆定域組合。下文描述了從抗體文庫中選擇人類抗體的技術。
可以藉由對組合文庫篩選具有期望的一或多種活性之抗體來分離本發明抗體。例如,本領域中已知用於產生噬菌體展示文庫並對此類文庫篩選具有期望的結合特性的抗體之多種方法。此等方法例如綜述於Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人編,Human Press,Totowa,NJ,2001),且進一步描述於例如McCafferty等人,Nature 348:552-554;Clackson等人,Nature 352:624-628(1991);Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo編,Human Press,Totowa,NJ,2003);Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004);及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。 已經描述了構建單域抗體文庫之方法,例如,參見美國專利第7371849號。
在某些噬菌體展示方法中,藉由聚合酶鏈式反應(PCR)分別選殖VH及VL基因之組庫,並隨機重組在噬菌體文庫中,然後可以對其篩選抗原結合噬菌體,如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中描述。噬菌體通常展示作為單鏈Fv(scFv)片段或作為Fab片段之抗體片段。來自經免疫來源之文庫提供對免疫原之高親和力抗體,而不需要構建融合瘤。可替代地,可以在沒有任何免疫之情況下(例如,從人類)選殖天然組庫以提供針對各種各樣的非自身抗原以及自身抗原之抗體的單一來源,如由Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)描述。最後,亦可以藉由從幹細胞選殖未重排的V基因區段,並使用含有隨機序列之PCR引物來合成製備天然文庫,以編碼高度可變的CDR3區並在活體外實現重排,如由Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)描述。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如美國專利第5,750,373號以及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
認為從人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段係本文中之人類抗體或人類抗體片段。
本文所述之抗PD-L1 mAb之生物活性可以藉由量測其半數最大抑制濃度(IC50)來確定,IC50係抗體抑制特定生物或生物化學功能(例如抑制PD-L1與其受體PD-1之間的結合)之有效性之量度。例如,此處IC50可用於指示活體外中和50% PD-L1生物活性所需之抗PD-L1 sdAb之有效濃度。對於促效劑藥物或其他物質(諸如抗體),IC50與「EC50」相當。EC50亦表示在活體內獲得最大作用的50%所需的血漿濃度。IC50或EC50可以藉由此項技術中已知之測定來量測,例如 生物測定,諸如藉由FACS分析(競爭結合測定)之配體結合之抑制,基於細胞之細胞因子釋放測定或擴增之發光鄰近均相測定(AlphaLISA)。
例如,可以使用流式細胞術研究配體結合之阻斷(亦參見實例1)。表現人類PD-L1之CHO細胞可以從貼壁培養瓶中解離,並與用於測試的不同濃度之抗PD-L1 mAb,及恆定濃度之經標記之PD-1蛋白(例如生物素標記之hPD-1/Fc蛋白)混合。可採用抗PD-L1抗體陽性對照,諸如阿特珠單抗。將混合物在室溫下平衡30分鐘,用FACS緩衝液(含有1% BSA之PBS)洗滌三次。然後,加入特異性識別恆定濃度之經標記PD-1蛋白之抗體(如PE/Cy5鏈黴抗生物素蛋白二級抗體),並在室溫下溫育15分鐘。用FACS緩衝液洗滌細胞並藉由流式細胞術分析。可以使用Prism(GraphPad Software,San Diego,CA)使用非線性迴歸分析資料以計算IC50。競爭測定之結果將證明抗PD-L1 mAb抑制經標記之PD-1與PD-L1之間相互作用之能力。
亦可藉由基於PD-L1之細胞因子釋放之阻斷測定來測試抗PD-L1 mAb之生物活性。與對細胞增殖相比,PD-1信號傳導通常對細胞因子產生具有較大作用,其中對IFN-γ、TNF-α及IL-2產生之作用顯著。PD-1介導之抑制信號傳導亦取決於TCR信號傳導之強度,其中在低水準TCR刺激下實現較大抑制。此減少可藉由通過CD28之共刺激(Freeman等人,J.Exp.Med.192:1027-34(2000))或IL-2之存在(Carter等人,Eur.J.Immunol.32:634-43(2002))來克服。此外,若干研究顯示獨立於PD-1之PD-L1或PD-L2之受體。B7.1已被鑒定為PD-L1之結合配偶體(Butte等人,Immunity 27:111-22(2007))。化學交聯研究表明,PD-L1及B7.1可通過其IgV樣域相互作用。B7.1:PD-L1相互作用可將抑制信號引入至T細胞中。因此,通過對PD-L1之信號傳導之拮抗作用,包括阻斷PD-L1與PD-1、B7.1或兩者相互作用,從而防止PD-L1將陰性共刺激信號發送至T細胞及其他抗原呈現細胞有可能回應於對感染(例如,急性及慢性)及腫瘤免疫而增強免疫。 此外,本申請案之抗PD-L1抗體可與PD-1:PD-L1信號傳導之其他組分之拮抗劑(例如拮抗劑抗PD-1及抗PD-L2抗體)組合。因此,藉由抗PD-L1抗體之PD-L1路徑之阻斷可使用多種監測T細胞增殖、IFN-γ釋放或IL-2分泌的生物測定進行研究。
例如,將PD-1效應細胞(以人類PD-1蛋白及NFAT螢光素酶穩定轉染之Jurkat細胞)及CHO-K1/人類CD274(穩定表現人類CD274之CHO-K1)混合於孔中。在不同的濃度下將抗PD-L1 mAb添加至各孔中。沒有抗體可用作背景對照。可採用陰性對照(諸如人類IgG1)及陽性對照(諸如阿特珠單抗)。在37℃/5% CO2溫育箱中溫育24小時之後,自各測試孔取出培養基以供IL-2分泌量測(Cisbio)。量測各測試抗體之EC50值,該值將反映測試抗PD-L1 mAb阻斷Jurkat細胞上PD-1與PD-L1之間的相互作用因此活化T細胞IL-2產生的能力。
在一些實施例中,本申請案之抗PD-L1抗體(尤其抗PD-L1 mAb)阻斷或拮抗PD-L1配體所轉導之信號。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb可結合PD-L1上之抗原決定基,以便抑制PD-L1與PD-1相互作用。在一些實施例中,在抗體組合位點與PD-L1配體結合位點之比例大於1:1且抗體濃度大於10-8M之條件下,抗PD-L1 mAb可以將PD-L1與其受體PD-1之結合降低至少約5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、99%或99.9%中之任一者。
在一些實施例中,提供一種抗PD-L1 mAb,其包含:重鏈可變域(VH),其具有包含SEQ ID NO:71-82中任一者之胺基酸序列之重鏈CDR1或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體,包含SEQ ID NO:83-97中任一者之胺基酸序列之重鏈CDR2或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,及包含SEQ ID NO:98-109中任一者之胺基酸序列之重鏈CDR3或其包含至多約3個(諸如約1個、2 個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體;及輕鏈可變域(VL),其具有包含SEQ ID NO:110-123中任一者之胺基酸序列之輕鏈CDR1或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,包含SEQ ID NO:124-135中任一者之胺基酸序列之輕鏈CDR2或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸取代之變異體,及包含SEQ ID NO:136-147中任一者之胺基酸序列之輕鏈CDR3或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb與PD-L1之間的結合之KD為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中,抗PD-L1抗體係齧齒動物的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些實施例中,抗PD-L1 mAb包含有包含SEQ ID NO:98-109中任一者之胺基酸序列之VH CDR3及包含SEQ ID NO:136-147中任一者之胺基酸序列之VL CDR3,且胺基酸取代位於VH及VL域之CDR1及/或CDR2。
因此,在一些實施例中,提供一種抗PD-L1 mAb,其包含:重鏈可變域(VH),其具有包含SEQ ID NO:71-82中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體,包含SEQ ID NO:83-97中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,及包含SEQ ID NO:98-109中任一者之胺基酸序列之CDR3;及輕鏈可變域(VL),其具有包含SEQ ID NO:110-123中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,包含SEQ ID NO:124-135中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸取代之變異體,及包含SEQ ID NO:136-147中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb與PD-L1之間的結合之KD為約10-5M至約10-12M(諸 如約10-7M至約10-12M或約10-8M至約10-12M)或更小。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb係齧齒動物的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些實施例中,提供一種抗PD-L1 mAb,其包含:重鏈可變域(VH),其具有包含SEQ ID NO:71-82中任一者之胺基酸序列之CDR1,包含SEQ ID NO:83-97中任一者之胺基酸序列之CDR2,及包含SEQ ID NO:98-109中任一者之胺基酸序列之CDR3;及輕鏈可變域(VL),其具有包含SEQ ID NO:110-123中任一者之胺基酸序列之CDR1,包含SEQ ID NO:124-135中任一者之胺基酸序列之CDR2,及包含SEQ ID NO:136-147中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb與PD-L1之間的結合之KD為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb係齧齒動物的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些實施例中,本申請案之抗體或抗原結合片段包含表20及21中提供之CDR之序列。
CDR可以以各種成對組合進行組合以產生許多人源化抗PD-L1抗體。人源化取代對於熟習此項技術者來說係清楚的。例如,可以藉由比較天然存在之VH或VL之FR序列與一或多個密切相關之人類VH或VL之對應FR序列,然後使用此項技術已知(亦如本文所述)之方法將一或多個此等潛在有用之人源化取代引入該VH或VL中來確定潛在有用之人源化取代。將人源化重鏈及輕鏈配對。可以測試所產生之人源化抗體之PD-L1結合親和力、穩定性、表現之容易程度及水準,及/或其他所需性質。本文所述之抗PD-L1 mAb可以為部分或完全人源化的。較佳地,所產生之人源化抗體(諸如人源化mAb)或其抗原結合片段在本文所述之KD、Kon、Koff之情況下結合PD-L1。
在一些實施例中,提供一種抗PD-L1人源化mAb或其抗原結合片段,其包含:包含SEQ ID NO:1-44中任一者之胺基酸序列之VH域或其與SEQ ID NO:1-44中任一者具有至少約80%(諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中任一者)序列同一性之變異體;及包含SEQ ID NO:45-70中任一者之胺基酸序列之VL域或其與SEQ ID NO:45-70中任一者具有至少約80%(諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之變異體。在一些實施例中,提供一種抗PD-L1 mAb,其包含:包含SEQ ID NO:1-44中任一者之胺基酸序列之VH域或其在VH域中包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體;及包含SEQ ID NO:45-70中任一者之胺基酸序列之VL域或其在VL域中包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb或其抗原結合片段包含:具有SEQ ID NO:1-44中任一者之胺基酸序列的VH域之變異體,其中該變異體在CDR中包含胺基酸取代,諸如VH之CDR1、及/或CDR2、及/或CDR3;及具有SEQ ID NO:45-70中任一者之胺基酸序列的VL域之變異體,其中該變異體在CDR中包含胺基酸取代,諸如VL中任一者之CDR1、及/或CDR2、及/或CDR3。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb或其抗原結合片段包含:具有SEQ ID NO:1-44中任一者之胺基酸序列的VH域之變異體,其中該變異體在FR中包含胺基酸取代,諸如VH中任一者之FR1、及/或FR2、及/或FR3、及/或FR4;及具有SEQ ID NO:45-70中任一者之胺基酸序列的VL域之變異體,其中該變異體在FR中包含胺基酸取代,諸如SEQ ID NO:45-70中任一者之FR1、及/或FR2、及/或FR3、及/或FR4。
在一些實施例中,提供一種抗PD-L1抗體,諸如mAb(後文稱為「競爭性抗PD-L1抗體或競爭性抗PD-L1 mAb」)或其抗原結合片段,其與本文所述之抗PD-L1 mAb競爭地特異性結合PD-L1。在一些實施例中,可以使用ELISA測定來確定競爭性結合。例如,在一些實施例中,提供一種抗PD-L1 mAb,其與包含分別以下之抗PD-L1 mAb競爭地特異性結合PD-L1:SEQ ID NO:1-44 中任一者之VH胺基酸序列及SEQ ID NO:45-70中任一者之VL胺基酸序列。又例如,在一些實施例中,提供一種抗PD-L1 mAb,其與包含以下之抗PD-L1 mAb競爭地特異性結合PD-L1:重鏈可變域(VH),其具有包含SEQ ID NO:71-82中任一者之胺基酸序列之CDR1,包含SEQ ID NO:83-97中任一者之胺基酸序列之CDR2,及包含SEQ ID NO:98-109中任一者之胺基酸序列之CDR3;及輕鏈可變域(VL),其具有包含SEQ ID NO:110-123中任一者之胺基酸序列之CDR1,包含SEQ ID NO:124-135中任一者之胺基酸序列之CDR2,及包含SEQ ID NO:136-147中任一者之胺基酸序列之CDR3。又例如,在一些實施例中,提供一種抗PD-L1 mAb,其與表20及21中所述之任何抗PD-L1 mAb競爭地特異性結合PD-L1。在一些實施例中,競爭性抗PD-L1 mAb與PD-L1之間的結合之KD為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M或約10-8M至約10-12M)或更小。在一些實施例中,競爭性抗PD-L1 mAb係齧齒動物的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
包含抗PD-L1 mAb之抗PD-L1構建體可以為任何可能之形式。
在一些實施例中,包含抗PD-L1 mAb之抗PD-L1構建體可以進一步包含另外之多肽序列,例如一或多個抗體部分。此類另外之多肽序列可以或可以不改變或以其他方式影響抗PD-L1 mAb之(生物學)性質,並且可以或可以不向本文所述之抗PD-L1 mAb添加其他功能。在一些實施例中,另外之多肽序列賦予本申請案之抗PD-L1 mAb一或多種所需之性質或功能。在一些實施例中,抗PD-L1構建體為嵌合抗原受體(CAR),其包含有包含本文所述之一或多個抗PD-L1結合部分之細胞外抗原結合域。
在一些實施例中,另外之多肽序列可為特異性識別第二抗原之第二抗體部分(諸如sdAb、scFv)。在一些實施例中,第二抗原決定不為PD-L1。在一 些實施例中,第二抗體部分特異性識別PD-L1上與本文所述之抗PD-L1 mAb相同的抗原決定基。在一些實施例中,第二抗體部分特異性識別PD-L1上與本文所述之抗PD-L1 mAb不同的抗原決定基。
在一些實施例中,額外之多肽序列可以增加分子之穩定性、溶解度或吸收,降低免疫原性或毒性,消除或減弱不期望之副作用,及/或與本文所述之抗PD-L1 mAb本身相比,賦予本發明之抗PD-L1構建體其他有利性質及/或降低其不希望之性質。
在一些實施例中,抗PD-L1 mAb為全長IgG。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb包含IgG(諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中任一者)之恆定區。在一些實施例中,恆定區為人類恆定區。在一些實施例中,恆定區為人類IgG1恆定區。
因此在一些實施例中,提供一種抗PD-L1全長IgG,其包含:重鏈,其中該可變區(VH)包含有包含SEQ ID NO:71-82中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,包含SEQ ID NO:83-97中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,及包含SEQ ID NO:98-109中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,且其中該VH融合至免疫球蛋白之重鏈恆定區(鉸鏈、CH1、CH2及CH3);及輕鏈,其中該可變區(VL)包含有包含SEQ ID NO:110-123中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,包含SEQ ID NO:124-135中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,及包含SEQ ID NO:136-147中任一者之胺基酸序列之CDR3 或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,且其中該VL融合至免疫球蛋白之輕鏈恆定區(CL)。在一些實施例中,提供一種抗PD-L1全長IgG,其包含:重鏈,其中該可變區(VH)包含有包含SEQ ID NO:71-82中任一者之胺基酸序列之CDR1,包含SEQ ID NO:83-97中任一者之胺基酸序列之CDR2,及包含SEQ ID NO:98-109中任一者之胺基酸序列之CDR3,或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,且其中該VH融合至免疫球蛋白之重鏈恆定區(鉸鏈、CH1、CH2及CH3);及輕鏈,其中該可變區(VL)包含有包含SEQ ID NO:110-123中任一者之胺基酸序列之CDR1,包含SEQ ID NO:124-135中任一者之胺基酸序列之CDR2,及包含SEQ ID NO:136-147中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,且其中該VL融合至免疫球蛋白之輕鏈恆定區(CL)。在一些實施例中,恆定區為人類IgG1恆定區。在一些實施例中,全長抗PD-L1 IgG與PD-L1之間的結合之KD為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M或約10-8M至約10-12M)或更小。在一些實施例中,全長抗PD-L1 IgG係齧齒動物的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些實施例中,提供一種全長抗PD-L1 mAb,其包含SEQ ID NO:1-44中任一者之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO:45-70中任一者之輕鏈胺基酸序列。
在一些實施例中,提供一種全長抗PD-L1 IgG(後文稱為「競爭性抗PD-L1 IgG」),其與本文所述之任一全長抗PD-L1 IgG競爭地特異性結合PD-L1。可以使用ELISA測定來確定競爭性結合。例如,在一些實施例中,提供一種抗PD-L1 IgG,其與包含以下之抗PD-L1 IgG競爭地特異性結合PD-L1:SEQ ID NO:1-44中任一者之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO:45-70中任一者之輕鏈胺基酸序 列。又例如,在一些實施例中,提供一種抗PD-L1 IgG,其與包含以下之抗PD-L1 IgG競爭地特異性結合PD-L1:重鏈,其中可變區(VH)包含有包含SEQ ID NO:71-82中任一者之胺基酸序列之CDR1,包含SEQ ID NO:83-97中任一者之胺基酸序列之CDR2,及包含SEQ ID NO:98-109中任一者之胺基酸序列之CDR3;及輕鏈,其中可變區(VL)包含有包含SEQ ID NO:110-123中任一者之胺基酸序列之CDR1,包含SEQ ID NO:124-135中任一者之胺基酸序列之CDR2,及包含SEQ ID NO:136-147中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中,競爭性抗PD-L1 IgG與PD-L1之間的結合之KD為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M或約10-8M至約10-12M)或更小。在一些實施例中,競爭性抗PD-L1 IgG係齧齒動物的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些實施例中,抗PD-L1構建體包含與一或多種其他抗體部分(例如特異性識別另一抗原之抗體部分)融合之本文所述之抗PD-L1 mAb。該一或多種其他抗體部分可以為任何抗體或抗體片段形式,例如sdAb、全長抗體、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、單鏈Fv(scFv)、scFv-scFv、微抗體或雙抗體。對於某些抗體片段之綜述,參見Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)。對於scFv片段之綜述,參見例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg及Moore編,(Springer-Verlag,New York),第269-315頁(1994);亦參見WO 93/16185;及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。對於包含救助受體結合抗原決定基殘基且具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段的討論,參見美國專利第5,869,046號。對於多特異性抗體之綜述,參見Weidle等人,Cancer Genomics Proteomics,10(1):1-18,2013;Geering及Fussenegger,Trends Biotechnol.,33(2):65-79,2015;Stamova等人,Antibodies,1(2):172-198,2012。雙抗體為可為二價或雙特異性之具有兩個抗原結合位點之抗體片段。參見例如EP 404,097;WO 1993/01161;Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003);及Hollinger等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗體及四抗體亦描述於Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中。抗體片段可藉由各種技術製備,包括但不限於蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生,如本文所述。在一些實施例中,該一或多種其他抗體部分係抗體模擬物,其係包含令人聯想到抗體之抗原結合域之小工程化蛋白質(Geering及Fussenegger,Trends Biotechnol.,33(2):65-79,2015)。此等分子衍生自現有人支架蛋白並包含單一多肽。可包含在本文所述之抗PD-L1構建體內之示例性抗體模擬物可以為,但不限於,設計之錨蛋白重複蛋白(DARPin;包含3-5個完全合成之錨蛋白重複序列,其側翼為N-及C末端Cap域),一種親和力多聚體(avimer;高親和力蛋白質,其包含多個A域,每個域對靶標具有低親和力),或Anticalin(基於脂質運載蛋白之支架,具有四個可接近之環,每個環之序列可以為隨機的)。
用於製造多特異性抗體之技術包括但不限於具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表現(參見Milstein及Cuello,Nature 305:537(1983),WO 93/08829,及Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991)),及「隆突(knob-in-hole)」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由以下方式製得:工程改造針對製造抗體Fc-雜二聚分子之靜電轉向效應(WO 2009/089004A1);使兩種或更多種抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號,及Brennan等人,Science,229:81(1985));使用白胺酸拉鍊來生產雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992));使用用於製造雙特異性抗體片段之「雙抗體」技術(參見例如Hollinger等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993));及使用單鏈Fv(scFv)二聚體(參見例如Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994));及如例如Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)中所述製備三特異性抗體;以及產生包含串聯單域抗體之多肽(參見例 如美國專利申請第20110028695號;及Conrath等人,J.Biol.Chem.,2001;276(10):7346-50)。本文亦包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點之經改造抗體,包括「章魚抗體(Octopus antibody)」(參見例如US 2006/0025576A1)。
在一些實施例中,抗PD-L1構建體內之兩種或更多個抗體部分可視情況藉由肽接頭連接。抗PD-L1構建體中使用之肽接頭之長度、可撓性及/或其他性質可能對性質具有一些影響,該等性質包括但不限於對於一種或多種特定抗原或抗原決定基之親和力、特異性或親合力。例如,可以選擇較長之肽接頭以確保兩個相鄰之域不在空間上相互干擾。在一些實施例中,肽接頭包含撓性殘基(例如甘胺酸及絲胺酸),使得相鄰之域相對於彼此自由移動。例如,甘胺酸-絲胺酸雙聯體可以為合適之肽接頭。
肽接頭可具有任何合適之長度。在一些實施例中,肽接頭為至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或更多個胺基酸長度中之任一者。在一些實施例中,肽接頭為不超過約100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或更少個胺基酸長度中之任一者。在一些實施例中,肽接頭之長度為約1個胺基酸至約10個胺基酸,約1個胺基酸至約20個胺基酸,約1個胺基酸至約30個胺基酸,約5個胺基酸至約15個胺基酸,約10個胺基酸至約25個胺基酸,約5個胺基酸至約30個胺基酸,約10個胺基酸至約30個胺基酸長,約30個胺基酸至約50個胺基酸,約50個胺基酸至約100個胺基酸,或約1個胺基酸至約100個胺基酸中之任一者。
肽接頭可具有天然存在之序列或非天然存在之序列。例如,衍生自僅重鏈抗體之鉸鏈區之序列可用作接頭。參見,例如,WO1996/34103。在一些實施例中,肽接頭為突變人類IgG1鉸鏈(EPKSSDKTHTSPPSP,SEQ ID NO: 399)。在一些實施例中,肽接頭係柔性接頭。示例性柔性接頭包括甘胺酸聚合物(G)n,甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括,例如,(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n及(GGGGS)n,其中n至少為1之整數),甘胺酸-丙胺酸聚合物,丙胺酸-絲胺酸聚合物,及在此項技術中已知之其他柔性接頭。在一些實施例中,肽接頭包含GGGGSGGGS(SEQ ID NO:397)之胺基酸序列。在一些實施例中,肽接頭包含SEQ ID NO:398(GGGGSGGGGSGGGGS)之胺基酸序列。
在一些實施例中,本申請案之分離的抗體或抗原結合片段為雙特異性或多特異性抗體,其包含本文所述之融合至第二抗體部分的抗PD-L1 IgG,其中該第二抗體部分特異性結合另一抗原,較佳另一抑制性免疫檢查點分子。
在一實施例中,另一抗原為CTLA-4且該第二抗體部分包含特異性結合CTLA-4之抗體或抗原結合片段,諸如抗CTLA-4 mAb,較佳抗CTLA-4 sdAb。包含針對PD-L1及CTLA-4之雙特異性的分離的抗體或抗原結合部分可在後文稱為「抗PD-L1/CTLA-4抗體」、「抗PD-L1/CTLA-4構建體」或「PD-L1×CTLA-4抗體」。
在一實施例中,另一抗原為TIGIT且該第二抗體部分包含特異性結合TIGIT之抗體或抗原結合片段,諸如抗TIGIT mAb,較佳抗TIGIT sdAb。包含針對PD-L1及TIGIT之雙特異性的分離的抗體或抗原結合部分可在後文稱為「抗PD-L1/TIGIT抗體」、「抗PD-L1/TIGIT構建體」或「PD-L1×TIGIT抗體」。
在一實施例中,另一抗原為TIM-3且該第二抗體部分包含特異性結TIM-3之抗體或抗原結合片段,諸如抗TIM-3 mAb,較佳抗TIM3 sdAb。包含針對PD-L1及TIM-3之雙特異性的分離的抗體或抗原結合部分可在後文稱為「抗PD-L1/TIM-3抗體」、「抗PD-L1/TIM-3構建體」或「PD-L1×TIM-3抗體」。
在一實施例中,另一抗原為LAG-3且該第二抗體部分包含特異性結 合LAG-3之抗體或抗原結合片段,諸如抗LAG-3 mAb,較佳抗LAG-3 sdAb。包含針對PD-L1及LAG-3之雙特異性的分離的抗體或抗原結合部分可在後文稱為「抗PD-L1/LAG-3抗體」、「抗PD-L1/LAG-3構建體」或「PD-L1×LAG-3抗體」。
與PD-L1類似,CTLA-4、TIGIT、TIM-3及LAG-3係抑制性免疫檢查點分子。
因此在一些實施例中,提供一種抗PD-L1構建體,其包含特異性識別PD-L1之全長IgG及選自由抗CTLA-4 sdAb、抗TIGIT sdAb、抗TIM-3 sdAb及抗LAG-3 sdAb組成之群的sdAb,其中該抗PD-L1 IgG包含:重鏈,其中該可變區(VH)包含有包含SEQ ID NO:71-82中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,包含SEQ ID NO:83-97中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,及包含SEQ ID NO:98-109中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,且其中該VH融合至免疫球蛋白之重鏈恆定區(鉸鏈、CH1、CH2及CH3):及輕鏈,其中該可變區(VL)包含有包含SEQ ID NO:110-123中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,包含SEQ ID NO:124-135中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,及包含SEQ ID NO:136-147中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,且其中該VL融合至免疫球蛋白之輕鏈恆定區(CL)。在一些實施例中,sdAb之N末端融合至特異性識別PD-L1之全長抗體之重鏈之至少一者之C末端。在一些實施例中,sdAb之C末端融合至特異性識別PD-L1之全長抗體之重鏈之至少一者之N末 端。在一些實施例中,sdAb之N末端融合至特異性識別PD-L1之全長抗體之輕鏈之至少一者之C末端。在一些實施例中,sdAb之C末端融合至特異性識別PD-L1之全長抗體之輕鏈之至少一者之N末端。在一些實施例中,特異性識別PD-L1之全長IgG及第二結合部分sdAb視情況藉由肽接頭連接。在一些實施例中,肽接頭包含SEQ ID NO:397-399之胺基酸序列。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb與PD-L1之間的結合之KD為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M或約10-8M至約10-12M)或更小。在一些實施例中,抗PD-L1 IgG係齧齒動物的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些實施例中,提供一種抗PD-L1構建體,其包含特異性識別PD-L1之全長IgG及選自由抗CTLA-4 sdAb、抗TIGIT sdAb、抗TIM-3 sdAb及抗LAG-3 sdAb組成之群的sdAb,其中該全長IgG包含:包含SEQ ID NO:1-44中任一者之胺基酸序列之VH域或其與SEQ ID NO:1-44中任一者具有至少約80%(諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中任一者)序列同一性之變異體,且其中該VH融合至免疫球蛋白之重鏈恆定區(鉸鏈、CH1、CH2及CH3);及包含SEQ ID NO:45-70中任一者之胺基酸序列之VL域或其與SEQ ID NO:45-70中任一者具有至少約80%(諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中任一者)序列同一性之變異體,且其中該VL融合至免疫球蛋白之輕鏈恆定區(CL)。在一些實施例中,提供一種分離的抗PD-L1構建體,其包含特異性識別PD-L1之全長IgG及選自由抗CTLA-4 sdAb、抗TIGIT sdAb、抗TIM-3 sdAb及抗LAG-3 sdAb組成之群的sdAb,其中該全長IgG包含:包含SEQ ID NO:1-44中任一者之胺基酸序列之VH域或其在VH域中包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,且其中該VH融合至免疫球蛋白之重鏈恆定區(鉸鏈、CH1、CH2及CH3);及包含SEQ ID NO:45-70中任一者之胺基 酸序列之VL域或其在VL域中包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中任一者)胺基酸取代之變異體,且其中該VL融合至免疫球蛋白之輕鏈恆定區(CL)。
在一些實施例中,包含有包含SEQ ID NO:1-44之胺基酸序列之VH域或其變異體的抗PD-L1全長IgG在CDR諸如SEQ ID NO:1-44中任一者之CDR1、及/或CDR2、及/或CDR3中包含胺基酸取代,且其中該VH融合至免疫球蛋白之重鏈恆定區(鉸鏈、CH1、CH2及CH3);且包含SEQ ID NO:45-70中任一者之胺基酸序列之VL域或其變異體在CDR諸如SEQ ID NO:45-70中任一者之CDR1、及/或CDR2、及/或CDR3中包含胺基酸取代,且其中該VH融合至免疫球蛋白之輕鏈恆定區(CL)。在一些實施例中,包含有包含SEQ ID NO:1-44之胺基酸序列之VH域或其變異體的抗PD-L1全長IgG包含SEQ ID NO:1-44中任一者之CDR1、CDR2及CDR3,且胺基酸取代處於FR中,諸如SEQ ID NO:1-44中任一者之FR1、及/或FR2、及/或FR3、及/或FR4,且其中該VH融合至免疫球蛋白之重鏈恆定區(鉸鏈、CH1、CH2及CH3);且包含SEQ ID NO:45-70中任一者之胺基酸序列之VL域或其變異體包含SEQ ID NO:45-70中任一者之CDR1、CDR2及CDR3,且胺基酸取代處於FR中,諸如SEQ ID NO:45-70中任一者之FR1、及/或FR2、及/或FR3、及/或FR4,且其中該VL融合至免疫球蛋白之輕鏈恆定區(CL)。在一些實施例中,包含有包含SEQ ID NO:1-44之胺基酸序列之VH域或其變異體的抗PD-L1全長IgG在CDR及FR中包含胺基酸取代,且其中該VH融合至免疫球蛋白之重鏈恆定區(鉸鏈、CH1、CH2及CH3);且包含SEQ ID NO:45-70中任一者之胺基酸序列之VL域或其變異體在CDR及FR中包含胺基酸取代,且其中該VL融合至免疫球蛋白之輕鏈恆定區(CL)。在一些實施例中,提供一種分離的抗PD-L1構建體,其包含特異性識別PD-L1之全長IgG及選自由抗CTLA-4 sdAb、抗TIGIT sdAb、抗TIM-3 sdAb及抗LAG-3 sdAb組成之群的sdAb,其中該全長IgG包含:包含SEQ ID NO:1-44中任一者之胺 基酸序列之VH域,其融合至免疫球蛋白之重鏈恆定區(鉸鏈、CH1、CH2及CH3);及包含SEQ ID NO:45-70中任一者之胺基酸序列之VL域,其融合至免疫球蛋白之輕鏈恆定區(CL)。在一些實施例中,sdAb之N末端融合至特異性識別PD-L1之全長抗體之重鏈之至少一者之C末端。在一些實施例中,sdAb之C末端融合至特異性識別PD-L1之全長抗體之重鏈之至少一者之N末端。在一些實施例中,sdAb之N末端融合至特異性識別PD-L1之全長抗體之輕鏈之至少一者之C末端。在一些實施例中,sdAb之C末端融合至特異性識別PD-L1之全長抗體之輕鏈之至少一者之N末端。在一些實施例中,特異性識別PD-L1之全長IgG及第二結合部分sdAb視情況藉由肽接頭連接。在一些實施例中,肽接頭包含SEQ ID NO:397-399之胺基酸序列。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb與PD-L1之間的結合之KD為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中,抗PD-L1 mAb係齧齒動物的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些實施例中,亦提供一種包含特異性識別PD-L1之全長IgG的抗PD-L1構建體(後文稱為「競爭性抗PD-L1構建體」),其與本文所述之抗PD-L1/CTLA-4構建體、抗PD-L1/TIGIT構建體、抗PD-L1/TIM-3構建體或抗PD-L1/LAG-3構建體競爭地特異性結合PD-L1。
在一些實施例中,涵蓋本文所提供之抗體之胺基酸序列變異體。例如,可能需要改善抗體之結合親和力及/或其他生物特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如抗體之胺基酸序列內之殘基的缺失及/或插入及/或取代。可對缺失、插入及取代進行任何組合以獲得最終構建體,其限制條件為最終構建體具有所需特徵,例如抗原結合性。
在一些實施例中,提供具有一個或多個胺基酸取代的抗體變異體。用於取代突變誘發之所關注位點包括HVR及FR。保守性取代展示於表2中的標題「較佳取代」下。更實質性變化提供於表2中的標題「示例性取代」下,且如以下關於胺基酸側鏈類別進一步所述。胺基酸取代可引入所關注抗體及經篩選所需活性(例如,保留的/改善的抗原結合性、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)之產物中。
可基於共同側鏈性質將胺基酸分成以下類別:(1)疏水性:正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性:Asp、Glu;(4)鹼性:His、Lys、Arg; (5)影響鏈取向之殘基:Gly、Pro;(6)芳香性:Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將需要將此等類別之一的成員更換成另一類別。
一種類型的取代變異體關於取代親本抗體(例如,人源化抗體或人類抗體)之一個或多個高變區殘基。一般說來,選擇用於進一步研究之所產生變異體相對於親本抗體將在某些生物特性態樣具有改變(例如改善)(例如親和力增加、免疫原性降低)及/或將基本上保留親本抗體之某些生物特性。一個示例性取代變異體為親和力成熟抗體,其可例如使用基於噬菌體展示之親和力成熟技術(諸如本文描述之彼等技術)便利地產生。簡而言之,使一個或多個HVR殘基突變,並且使變異體抗體展示在噬菌體上並篩選特定生物活性(例如結合親和力)。
可在HVR中進行改變(例如取代)以例如改善抗體親和力。可在HVR「熱點」(即由在體細胞成熟過程期間以高頻率經受突變的密碼子編碼之殘基)(參見例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))及/或SDR(α-CDR)中進行此等改變,且測試所得變異體VH或VL之結合親和力。藉由構建及從二級文庫中重新選擇之親和力成熟已經例如在Hoogenboom等人之Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人編,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中描述。在親和力成熟的一些實施例中,藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變)中之任一種將多樣性引入選用於成熟的可變基因中。然後產生二級文庫。然後篩選文庫以鑒別具有所需親和力的任何抗體變異體。引入多樣性之另一方法涉及HVR定向方法,其中使若干HVR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。可例如使用丙胺酸掃描誘變或模型化來特異性地鑒別抗原結合中涉及的HVR殘基。特別地,經常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在一些實施例中,取代、插入或缺失可發生在一個或多個HVR內,只要此類改變基本上不降低抗體結合抗原之能力即可。例如,可在HVR中進行 基本上不降低結合親和力的保守性改變(例如如本文所提供之保守性取代)。此類改變可處於HVR「熱點」或CDR以外。在以上提供之變異體VHH序列之一些實施例中,各HVR未被改變或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
一種可用於鑒定抗體中可以作為誘變靶位之殘基或區域的方法稱作「丙胺酸掃描誘變」,如由Cunningham及Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述。在此方法中,鑒別某一殘基或一組目標殘基(例如帶電荷殘基,諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且置換為中性或帶負電荷胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)以確定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置上引入其他取代。可替代地或另外,抗原-抗體複合物之晶體結構用來鑒別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及相鄰殘基可作為取代之候選物而被靶向或消除。可篩選變異體以確定其是否含有所需特性。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或更多個殘基之多肽的範圍內的胺基末端及/或羧基末端融合,以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N端或C端與增加抗體之血清半衰期的酶(例如用於ADEPT)或多肽之融合。
在一些實施例中,改變本文提供之抗PD-L1抗體以提高或降低抗體醣基化之程度。對抗體添加醣基化位點或使抗體缺失醣基化位點可藉由改變胺基酸序列以使得產生或除去一個或多個醣基化位點來便利地實現。
當抗PD-L1構建體包含Fc區時,可以改變與其連接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含一般藉由N-鍵連接到Fc區之CH2域之Asn297的分支二天線寡醣。參見例如Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡醣可包括各種碳水化合物,例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖 及唾液酸,以及連接到二天線寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中,可對本發明之抗PD-L1抗體中之寡醣進行修飾以產生具有某些改善特性的抗體變異體。
在一些實施例中,提供具有缺乏(直接或間接)連接到Fc區上之岩藻糖之碳水化合物結構的抗體變異體。例如,此類抗體中之岩藻糖量可以係1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。如藉由MALDI-TOF質譜法所量測,藉由相對於連接到ASn297之所有糖結構(例如複合、雜合及高甘露糖結構)的總和計算Asn297上之糖鏈內岩藻糖的平均量來測定岩藻糖的量,如例如WO 2008/077546中所述。Asn297係指位於Fc區中大致位置297(Fc區殘基之EU編號)上之天冬醯胺殘基;然而,Asn297亦可由於抗體中之微小序列變型而位於位置297的上游或下游約±3個胺基酸處,即在位置294與300之間。此類岩藻醣基化變異體可具有改善的ADCC功能。參見,例如,美國專利公開第US 2003/0157108號(Presta,L.);第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo公司)。涉及「脫岩藻醣基化的」或「岩藻糖缺乏的」抗體變異體之出版物之實例包括:US 2003/0157108;WO 2000/61739;WO 2001/29246;US 2003/0115614;US 2002/0164328;US 2004/0093621;US 2004/0132140;US 2004/0110704;US 2004/0110282;US 2004/0109865;WO 2003/085119;WO 2003/084570;WO 2005/035586;WO 2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki等人J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能夠產生去海藻醣基化抗體之細胞株之實例包括缺乏蛋白質海藻醣基化作用之Lec13 CHO細胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號,Presta,L;及WO 2004/056312 A1,Adams等人,尤其在實例11中)及基因剔除細胞株,諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因FUT8基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人Biotech. Bioeng.87:614(2004);Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006);及WO2003/085107)。
進一步提供具有二等分寡醣之抗PD-L1抗體變異體,例如其中連接到抗體之Fc區的二天線寡醣係由GlcNAc二等分。此類抗體變異體可具有降低的岩藻醣基化及/或改善的ADCC功能。此類抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878(Jean-Mairct等人);美國專利第6,602,684號(Umana等人);及US 2005/0123546(Umana等人)。亦提供在連接到Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變異體。此類抗體變異體可具有改善的CDC功能。此類抗體變異體描述於例如WO 1997/30087(Patel等人);WO 1998/58964(Raju,S.);及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
在一些實施例中,可以將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供之抗PD-L1構建體之Fc區,從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可以包含在一個或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如,取代)之人Fc區序列(例如,人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在一些實施例中,本申請案涵蓋具有一些而非所有效應子功能之抗PD-L1構建體變異體,該等效應子功能使其成為抗PD-L1構建體之活體內半衰期較為重要但某些效應子功能(諸如補體及ADCC)不必要或有害之應用所需要的候選物。可進行活體外及/或活體內細胞毒性測定以確認CDC及/或ADCC活性的降低/減少。例如,可以進行Fc受體(FcR)結合測定以確保抗體缺乏FcγR結合(因此有可能缺乏ADCC活性),但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之原代細胞NK細胞僅表達FcγRIII,而單核細胞表達FcγRI、FcγRII及FcγRIII。在Ravetch及Kiuet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464頁上之表3中匯總了造血細胞上之FcR表達。用於評估所關注分子之ADCC活性之活體外測定的 非限制性實例描述於美國專利第5,500,362(參見例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985);第5,821,337號(參見Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。可替代地,可採用非放射性測定方法(參見例如用於流式細胞術之ACTITM非放射性細胞毒性測定(Cell Technology公司Mountain View,CA);以及CytoTox 96®非放射性細胞毒性測定(Promega,Madison,WI)。用於此類測定之有用效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。可替代地或另外,所關注之分子之ADCC活性可例如在動物模型中進行活體內評估,諸如Clynes等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中揭示之動物模型。亦可進行C1q結合測定以確認抗體不能結合C1q並且因此缺乏CDC活性。參見,例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為了評估補體活化,可進行CDC測定(參見例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996);Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003);及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。亦可以使用本領域中已知之方法來實施FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(參見例如Petkova,S.B.等人,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效應功能之抗體包括具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一個或多個之取代的彼等(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中的兩處或更多處具有取代之Fc突變體,包括殘基265及297取代成丙胺酸之所謂的「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
與FcR之結合改善或削弱的某些抗體變異體已有描述。(參見例如美國專利第6,737,056號;WO 2004/056312及Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在一些實施例中,抗PD-L1構建體變異體包含具有一個或多個改善的ADCC之胺基酸取代(例如在Fc區之的位置298、333及/或334(EU殘基編號)處的取代)的Fc區。
在一些實施例中,對Fc區做出改變,其導致改變的(即,改善的或降低的)C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC),例如,如描述於美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)中。
在一些實施例中,提供一種抗PD-L1構建體(例如,HCAb)變異體,其包含有包含一或多處胺基酸取代之變異體Fc區,該等取代增加半衰期及/或改善與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。具有延長的半衰期及改善的與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的抗體描述於US2005/0014934A1(Hinton等人)中,新生兒Fc受體(FcRn)負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。彼等抗體包含其中具有改善Fc區與FcRn之結合的一個或多個取代的Fc區。此類Fc變異體包括在Fc區殘基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中之一或多者處具有取代之Fc變異體,例如具有Fc區殘基434之取代之Fc變異體(美國專利第7,371,826號)。
關於Fc區變異體之其他實例亦可見Duncan及Winter,Nature 322:738-40(1988);美國專利第5,648,260號;美國專利第5,624,821號;及WO 94/29351。
亦涵蓋包含本文所述之Fc變異體之抗PD-L1構建體(諸如融合至sdAb之全長IgG或抗PD-L1 IgG)或其組合。
在一些實施例中,可能需要產生半胱胺酸改造抗PD-L1抗體,例如「巰基MAb」,其中抗體之一個或多個殘基由半胱胺酸殘基取代。在特定實施 例中,經取代之殘基存在於抗體之可及位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基,反應性硫醇基由此定位在抗體之可及位點處且可用於使抗體結合至其他部分(諸如藥物部分或接頭-藥物部分)以產生如本文進一步所述之免疫結合物。在一些實施例中,以下殘基中之任一者或多個可以由半胱胺酸取代:重鏈之A118(EU編號);及重鏈Fc區之S400(EU編號)。可如例如美國專利第7,521,541號中所述來生成半胱胺酸改造抗PD-L1抗體。
在一些實施例中,可以進一步修飾本文中提供之抗PD-L1抗體以含有本領域已知的且易於獲得的額外非蛋白質部分。適於抗體之衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中的穩定性可具有製造優勢。該聚合物可具有任何分子量,並且可為分支或未分支的。連接到抗體上之聚合物數目可以變化,而且若連接了超過一個聚合物,那麼它們可以係相同或不同的分子。通常,用於衍生化之聚合物的數量及/或類型可基於包括但不限於有待改善的抗體之具體特性或功能、抗體衍生物是否在限定條件下用於療法中等考慮因素來確定。
在一些實施例中,提供抗PD-L1抗體與可藉由暴露於輻射而選擇性加熱的非蛋白質部分的結合物。在一些實施例中,非蛋白質部分係碳奈米管(Kam等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。輻射可具有任何波長,並且包括但不限於不損害普通細胞但會將非蛋白質部分加熱至殺死鄰近於抗體-非蛋白質部分之細胞之溫度的波長。
在一些實施例中,本文所提供之抗PD-L1構建體(諸如抗PD-L1 IgG、抗PD-L1/CTLA-4雙特異性抗體、抗PD-L1/TIGIT雙特異性抗體、抗PD-L1/TIM-3雙特異性抗體或抗PD-L1/LAG-3雙特異性抗體)可以進一步經修飾以含有一或多種具生物學上活性的蛋白、多肽或其片段。如本文所用之「生物活性」或「生物學上活性」係指在活體內顯示生物活性以實現特定功能。例如,它可以指與特定生物分子(例如蛋白質,DNA等)之組合,然後促進或抑制此生物分子之活性。在一些實施例中,生物活性蛋白質或其片段具有免疫刺激/免疫調節、膜轉運或酶活性。
在一些實施例中,可與在本文所述之抗PD-L1構建體融合之生物活性蛋白質或其片段係配體,例如與特定細胞受體相互作用之淋巴因子及細胞因子。淋巴因子係低分子量蛋白質,當抗原或凝集素刺激T細胞生長時,T細胞分泌此等蛋白質。淋巴因子之實例包括但不限於干擾素-α、干擾素-γ、細胞介素-1(IL-1)、細胞介素-2(IL-2)、細胞介素-3(IL-3)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(例如CSF-1、G-CSF或GM-CSF)、趨化因子、巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)、巨噬細胞活化因子(MAF)、NK細胞活化因子、T細胞置換因子、白血病抑制因子(LIF)、淋巴毒素、蝕骨細胞活化因子(OAF)、可溶免疫反應抑制因子(SIRS)、生長刺激因子、單核球生長因子等。可併入至本發明之抗PD-L1融合蛋白之細胞因子包括但不限於腫瘤壞死因子α(TNFα)、干擾素(IFN)及神經生長因子(NGF)等。
本申請案進一步提供醫藥組成物,其包含如本文所述之包含特異性識別PD-L1之全長IgG之抗PD-L1構建體中之任一種(諸如抗PD-L1 IgG、抗PD-L1/CTLA-4雙特異性抗體、抗PD-L1/TIGIT雙特異性抗體、抗PD-L1/TIM-3雙特異性抗體或抗PD-L1/LAG-3雙特異性抗體)及視情況醫藥學上可接受之載 劑。可藉由混合具有期望純度的本文所述抗PD-L1構建體與可選醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.編(1980))以凍乾調配物或水性溶液形式製備醫藥組成物。
醫藥組成物較佳係穩定的,其中包含本文所述之抗PD-L1 mAb之抗PD-L1構建體在儲存時基本上保持其物理及化學穩定性及完整性。用於量測蛋白質穩定性之各種分析技術係此項技術中可用的且綜述於Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee編,Marcel Dekker公司,New York,N.Y.,Pubs.(1991)及Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)。可在選定溫度下持續選定時期量測穩定性。為了快速篩選,可以將調配物在40℃下保持2週至1個月,屆時量測穩定性。當調配物在2-8℃下儲存時,通常調配物應在30℃或40℃下穩定至少1個月,及/或在2-8℃下穩定至少2年。當調配物在30℃下儲存時,調配物通常應在30℃下穩定至少2年,及/或在40℃下穩定至少6個月。例如,儲存期間之聚集程度可用作蛋白質穩定性之指標。在一些實施例中,本文所述之抗PD-L1構建體之穩定調配物可包含少於約10%(較佳少於約5%)之作為調配物中聚集體存在之抗PD-L1構建體。
可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒,且包括緩衝劑;抗氧化劑,包括抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E、偏亞硫酸氫鈉;防腐劑,等滲劑(例如氯化鈉),穩定劑,金屬複合物(如鋅-蛋白質複合物);螯合劑諸如EDTA及/或非離子表面活性劑。
可接受之載劑之實例包括緩衝劑,諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸;抗氧化劑,包括抗壞血酸及甲硫胺酸;防腐劑(諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨、六甲基氯化銨、苯紮氯銨、苄索氯銨;苯酚、丁醇或苄醇;對羥基苯甲酸烷基酯,諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯;鄰苯二酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇;以及間-甲酚);低分子量(小於約10個殘基)多肽;蛋白質, 諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物,諸如聚乙烯基吡咯啶酮;胺基酸,諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸;單醣、二醣以及其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑,諸如EDTA;糖,諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成鹽相對離子,諸如鈉離子;金屬複合物(例如Zn-蛋白質複合物);及/或非離子界面活性劑,諸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)、以及PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
緩衝劑用於將pH控制在優化治療效果之範圍內,特別係在穩定性取決於pH的情況下。緩衝劑較佳以約50mM至約250mM之濃度存在。適用於本申請案之緩衝劑包括有機酸及無機酸及其鹽。例如,檸檬酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、乙酸鹽。另外,緩衝劑可包含組胺酸及三甲胺鹽,諸如Tris。
添加防腐劑以阻止微生物生長,並且通常以0.2%-1.0%(w/v)之範圍存在。添加防腐劑可以例如促進多用途(多劑量)調配物之生產。適用於本申請案之防腐劑包括十八烷基二甲基苄基氯化銨;六甲基氯化銨;苯二甲羥銨鹵化物(例如氯化物、溴化物、碘化物),苄索氯銨;硫柳汞,苯酚,丁醇或苄醇;對羥基苯甲酸烷基酯諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯;鄰苯二酚;間苯二酚;環己醇、3-戊醇及間甲酚。
存在有時稱為「穩定劑」之張力劑以調節或維持組成物中液體之張力。當與大的帶電生物分子諸如蛋白質及抗體一起使用時,它們通常被稱為「穩定劑」,因為它們可以與胺基酸側鏈之帶電基團相互作用,從而減少分子間及分子內相互作用之可能性。考慮到其他成分之相對量,張力劑可以以0.1重量%至25重量%,較佳1重量%至5重量%之任何量存在。較佳之張力劑包括多元糖醇,較佳三元或更高級糖醇,諸如甘油、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。
另外之賦形劑包括可以作為以下一者或多者之試劑:(1)填充劑,(2)溶解度增強劑,(3)穩定劑及(4)防止變性或黏附到容器壁上之試劑。此等賦形劑包括:多元糖醇(上面列舉的);胺基酸諸如丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸、離胺酸、鳥胺酸、白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸等;有機糖或糖醇,諸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌醣(myoinisitose)、肌醇(myoinisitol)、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環醇(例如肌醇)、聚乙二醇;含硫還原劑,諸如尿素、麩胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸鈉、硫代甘油、α-硫代甘油及硫代硫酸鈉;低分子量蛋白質,諸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或其他免疫球蛋白;親水性聚合物,諸如聚乙烯吡咯啶酮;單醣(例如,木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖;二醣(例如乳糖、麥芽糖、蔗糖);三醣諸如棉子糖;及多醣例如糊精或葡聚糖。
存在非離子表面活性劑或清潔劑(亦稱為「潤濕劑」)以幫助溶解治療劑以及保護治療性蛋白免於攪動誘導之聚集,從而亦允許調配物暴露於剪切表面應力而不會引起活性治療蛋白質或抗體之變性。非離子表面活性劑之存在量為約0.05mg/ml至約1.0mg/ml,較佳約0.07mg/ml至約0.2mg/ml。
合適之非離子表面活性劑包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等),聚氧乙烯醚(184、188等)、PLURONIC®多元醇、TRITON®、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(TWEEN®-20、TWEEN®-80等)、聚桂醇400、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50及60、單硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素及羧甲基纖維素。可以使用之陰離子清潔劑包括十二烷基硫酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉及二辛基磺酸鈉。陽離子清潔劑包括苯紮氯銨或苄索氯銨。
為了使醫藥組成物用於活體內投與,它們必須係無菌的。可藉由無菌過濾膜過濾使醫藥組成物無菌。通常將本文中的醫藥組成物放到具有無菌進入端口之容器中,例如具有藉由皮下注射針可刺穿之塞子之靜脈內溶液袋或小 瓶。
投與途徑根據已知及可接受之方法,諸如藉由單次或多次推注或以合適之方式長時間輸注,例如藉由皮下、靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、病灶內或關節內途徑來注射或輸注、局部投與、吸入或藉由持續釋放或延長釋放方式。在一些實施例中,醫藥組成物係局部投與,例如腫瘤內投與。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之合適實例包括含有拮抗劑之固體疏水性聚合物半透性基質,半透性基質呈成形製品的形式,例如膜或微膠囊。該等持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如,聚(甲基丙烯酸2-羥乙基酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與L-麩胺酸乙基酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)組成之可注射微球),以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
本文中的醫藥組成物亦可含有所治療的特定適應症所需要的一種以上活性化合物,較佳為具有互補活性並且不會對彼此有不利影響的化合物。或者/另外,組成物可包含細胞毒劑、化學治療劑、細胞因子、免疫抑制劑或生長抑制劑。此類分子適合於以對於預期用途有效的量組合存在。
該等活性成分亦可截留在例如藉由凝聚技術或界面聚合作用製備之微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙酸甲酯)微膠囊)中、膠狀藥物遞送系統(例如,脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或粗乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版中。
在一些實施例中,醫藥組成物包含在一次性小瓶(諸如一次性密封小瓶)中。在一些實施例中,醫藥組成物包含在多用途小瓶中。在一些實施例中,醫藥組成物以散裝形式包含在容器中。在一些實施例中,醫藥組成物為冷凍保存的。
如本文所述之包含特異性識別PD-L1之mAb之抗PD-L1構建體(諸如抗PD-L1全長IgG、抗PD-L1/CTLA-4雙特異性抗體、抗PD-L1/TIGIT雙特異性抗體、抗PD-L1/TIM-3雙特異性抗體或抗PD-L1/LAG-3雙特異性抗體)及其組成物(諸如醫藥組成物)可用於多種應用,諸如診斷、分子測定及治療。
本發明之一個態樣提供了治療有需要之個體中之PD-L1相關疾病或病症之方法,其包括向該個體投與有效量之包含本文所述之抗PD-L1構建體之醫藥組成物。在一些實施例中,PD-L1相關疾病為癌症。在一些實施例中,PD-L1相關疾病係病原性感染,諸如病毒感染。
本申請案部分涵蓋蛋白質構建體(諸如抗PD-L1全長IgG、抗PD-L1/CTLA-4雙特異性抗體、抗PD-L1/TIGIT雙特異性抗體、抗PD-L1/TIM-3雙特異性抗體或抗PD-L1/LAG-3雙特異性抗體)、編碼其之核酸分子及/或載體、包含編碼其之核酸分子及/或載體之宿主細胞,其可以單獨或以任何方式與另一種療法組合投與,並且在至少一些態樣,與醫藥學上可接受之載劑或賦形劑一起組合投與。在一些實施例中,在投與抗PD-L1構建體之前,它們可以與此項技術熟知之合適之藥物載劑及賦形劑組合。根據本揭示案製備之組成物可用於治療癌症或延遲癌症之惡化。
在一些實施例中,提供一種治療癌症之方法,其包括向個體投與有效量之包含有包含特異性識別PD-L1之mAb之分離的抗PD-L1構建體(諸如抗PD-L1全長IgG、抗PD-L1/CTLA-4雙特異性抗體、抗PD-L1/TIGIT雙特異性抗體、抗PD-L1/TIM-3雙特異性抗體或抗PD-L1/LAG-3雙特異性抗體)之醫藥組成物。在一些實施例中,癌症係實體腫瘤(諸如結腸癌)。在一些實施例中,醫藥組成物係全身(例如靜脈內)投與。在一些實施例中,醫藥組成物係局部(例如腫瘤內)投與。在一些實施例中,該方法亦包括向個體投與另外之癌症療法(諸如手 術、放射、化學療法、免疫療法、激素療法或其組合)。在一些實施例中,該個體為人類。在一些實施例中,治療癌症之方法具有以下一種或多種生物活性:(1)殺死癌細胞(包括旁觀者殺死);(2)抑制癌細胞之增殖;(3)在腫瘤中誘導免疫反應;(4)減小腫瘤大小;(5)緩解患有癌症之個體之一種或多種症狀;(6)抑制腫瘤轉移;(7)延長生存期;(8)延長癌症進展時間;以及(9)預防、抑制或降低癌症復發之可能性。在一些實施例中,藉由本文所述之醫藥組成物介導之殺傷癌細胞之方法可達成至少約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更大中任一者之腫瘤細胞死亡率。在一些實施例中,藉由本文所述之醫藥組成物介導之殺傷癌細胞之方法可達成至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更大中任一者之旁觀腫瘤細胞(未受溶瘤VV感染)死亡率。在一些實施例中,藉由本文所述之醫藥組成物介導之減小腫瘤大小之方法可減小至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%或100%中任一者)腫瘤大小。在一些實施例中,藉由本文所述之醫藥組成物介導之抑制腫瘤轉移之方法可抑制至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%或100%中任一者)轉移。在一些實施例中,藉由本文所述之醫藥組成物介導之延長個體(諸如人類)存活之方法可延長個體之存活至少1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、18個月或24個月中任一者。在一些實施例中,藉由本文所述之醫藥組成物介導之延長癌症進展時間之方法可延長癌症進展時間至少1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週或12週中任一者。
本文描述之方法適用於治療多種癌症,包括實體癌症及液體癌症。該等方法適用於所有階段之癌症,包括早期癌症、非轉移性癌症、原發性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、轉移性癌症或緩解期癌症。本文描述之方法可以用作第一療法、第二療法、第三療法或與此項技術已知之其他類型之癌症療法之 組合療法,諸如化療、手術、激素療法、放射、基因療法、免疫療法(諸如T細胞療法)、骨髓移植、幹細胞移植、靶向療法、冷凍療法、超聲療法、光動力療法、射頻消融等,在輔助環境或新輔助環境中(即,該方法可以在初步/確定性治療之前進行)。在一些實施例中,該方法用於治療先前已經治療之個體。在一些實施例中,癌症對於先前療法係難以治癒的。在一些實施例中,該方法用於治療先前未接受過治療之個體。
在一些實施例中,該方法合適於治療PD-L1表現、活性及/或信號傳導異常之癌症,該等癌症包括(作為非限制性實例)黑素瘤、前列腺癌、肺癌、結腸癌、胃癌、卵巢癌、乳癌及膠質母細胞瘤。
因此在一些實施例中,提供一種治療免疫療法反應性實體瘤(諸如癌或腺癌,諸如具有異常PD-L1表現、活性及/或信號傳導之癌症)之方法,其包括向個體投與有效量之包含有包含特異性識別PD-L1之單株抗體之分離的抗PD-L1構建體(諸如抗PD-L1全長IgG、抗PD-L1/CTLA-4雙特異性抗體、抗PD-L1/TIGIT雙特異性抗體、抗PD-L1/TIM-3雙特異性抗體或抗PD-L1/LAG-3雙特異性抗體)之醫藥組成物。在一些實施例中,癌症係實體腫瘤(諸如結腸癌)。在一些實施例中,醫藥組成物係全身(例如靜脈內)投與。在一些實施例中,醫藥組成物係局部(例如腫瘤內)投與。在一些實施例中,該方法亦包括向個體投與另外之癌症療法(例如手術、放射、化學療法、免疫療法、激素療法或其組合)。在一些實施例中,該個體為人類。在一些實施例中,治療癌症之方法具有以下一種或多種生物活性:(1)殺死癌細胞(包括旁觀者殺死);(2)抑制癌細胞之增殖;(3)在腫瘤中誘導免疫反應;(4)減小腫瘤大小;(5)緩解患有癌症之個體之一種或多種症狀;(6)抑制腫瘤轉移;(7)延長生存期;(8)延長癌症進展時間;以及(9)預防、抑制或降低癌症復發之可能性。在一些實施例中,藉由本文所述之醫藥組成物介導之殺傷癌細胞之方法可達成至少約40%、50%、60%、70%、80%、90%、 95%或更大中任一者之腫瘤細胞死亡率。在一些實施例中,藉由本文所述之醫藥組成物介導之殺傷癌細胞之方法可達成至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更大中任一者之旁觀腫瘤細胞(未受溶瘤VV感染)死亡率。在一些實施例中,藉由本文所述之醫藥組成物介導之減小腫瘤大小之方法可減小至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%或100%中任一者)腫瘤大小。在一些實施例中,藉由本文所述之醫藥組成物介導之抑制腫瘤轉移之方法可抑制至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%或100%中任一者)轉移。在一些實施例中,藉由本文所述之醫藥組成物介導之延長個體(諸如人類)存活之方法可延長個體之存活至少1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、18個月或24個月中任一者。在一些實施例中,藉由本文所述之醫藥組成物介導之延長癌症進展時間之方法可延長癌症進展時間至少1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週或12週中任一者。
在一些實施例中,該方法適用於治療具有異常PD-1或PD-L1/PD-L2表現、活性及/或信號傳導之癌症,作為非限制性實例,該等癌症包括血液癌症及/或實體瘤。可以使用本發明之抗體抑制其生長之一些癌症包括通常對免疫療法有反應之癌症。用於治療之其他癌症之非限制性實例包括黑素瘤(例如,轉移性惡性黑素瘤)、腎癌(例如透明細胞癌)、前列腺癌(例如激素難治性前列腺腺癌)、乳腺癌、結腸癌及肺癌(例如非小細胞肺癌)。另外,本發明包括其生長可以使用本發明之抗體抑制的難治性或復發性惡性腫瘤。可以使用本發明之抗體治療之其他癌症之實例包括骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌症、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、 非霍奇金氏淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病)、兒童實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊髓軸腫瘤、腦幹膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T-細胞淋巴瘤、環境誘發之癌症(包括由石棉誘導之癌症)以及該等癌症之組合。本申請案亦可用於治療轉移性癌症,尤其係表現PD-L1之轉移性癌症(Iwai等人(2005)Int.Immunol.17:133-144)。
因此,在一些實施例中,提供一種治療免疫療法反應性實體瘤(諸如癌或腺癌,諸如具有異常PD-L1表現、活性及/或信號傳導及/或異常CTLA-4、TIGIT、TIM-3及LAG-3表現、活性及/或信號傳導之癌症)之方法,其包括向個體投與有效量之包含有包含融合至CTLA-4、TIGIT、TIM-3或LAG-3 sdAb的特異性識別PD-L1之全長IgG之分離的抗PD-L1構建體的醫藥組成物。在一些實施例中,提供一種治療免疫療法反應性實體瘤(諸如癌或腺癌,諸如具有異常PD-L1表現、活性及/或信號傳導及/或異常CTLA-4、TIGIT、TIM-3、LAG-3表現、活性及/或信號傳導之癌症)之方法,其包括向個體投與有效量之包含有包含融合至CTLA-4、TIGIT、TIM-3或LAG-3 sdAb的特異性識別PD-L1之全長IgG之分離的抗PD-L1構建體的醫藥組成物。
在一些實施例中,本文所述之方法適用於治療結腸直腸癌,諸如腺癌、胃腸道類癌瘤、胃腸道間質瘤、平滑肌肉瘤、黑素瘤或鱗狀細胞癌。
本申請案之醫藥組成物之劑量及所需藥物濃度可根據設想的特定用途而變化。確定投與之適當劑量或途徑完全在普通技術人員之技能之內。動物實驗為人類療法之有效劑量的確定提供了可靠的指導。有效劑量之物種間類推 可以遵循Mordenti,J.及Chappell,W.「The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics,」In Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobi等人編,Pergamon Press,New York 1989,第42-46頁來進行。
當使用包含本文所述之抗PD-L1 mAb之抗PD-L1構建體之活體內投與時,正常劑量可以從每天約10ng/kg至約100mg/kg哺乳動物體重或更多變化,較佳約1mg/kg/天至10mg/kg/天,諸如約1-3mg/kg/天、約2-4mg/kg/天、約3-5mg/kg/天、約4-6mg/kg/天、約5-7mg/kg/天、約6-8mg/kg/天、約6-6.5mg/kg/天、約6.5-7mg/kg/天、約7-9mg/kg/天或約8-10mg/kg/天,此取決於投與途徑。在申請案範圍內的是,不同的調配物將對於不同的治療及不同的病症係有效的,並且意圖治療特定器官或組織的投與可需要不同於對另一種器官或組織之遞送方式的遞送。此外,劑量可藉由一次或多次單獨的投與來投與,或藉由連續輸注來投與。對於經若干天或更長時間之重複投與,根據病狀,持續進行治療,直至發生期望的疾病症狀阻抑為止。然而,其他劑量方案可以係有用的。此療法之進展藉由常規技術及測定容易地監測。
在一些實施例中,醫藥組成物係投與單次(例如推注)。在一些實施例中,醫藥組成物係投與多次(例如2次、3次、4次、5次、6次或更多次中之任一者)。若為多次投與,則可以藉由相同或不同的途徑執行,並且可以在同一部位或在可替代的部位進行。醫藥組成物可以每週投與兩次,每週投與3次,每週投與4次,每週投與5次,不中斷地每日投與,每週投與一次,不中斷地每週投與,每2週投與一次,每3週投與一次,每月投與一次,每2個月投與一次,每3個月投與一次,每4個月投與一次,每5個月投與一次,每6個月投與一次,每7個月投與一次,每8個月投與一次,每9個月投與一次,每10個月投與一次,每11個月投與一次,或每年投與一次。投與間隔可以為24h至48h、2天至3天、3天至5天、5天至1週、1週至2週、2週至1個月、1個月至2個月、 2個月至3個月、3個月至6個月或6個月至一年中之任一者。間隔亦可以為不規則的(例如在腫瘤進展後)。在一些實施例中,投與方案沒有中斷。在一些實施例中,每4天投與組成物達4次。藉由監測患者之疾病跡象並相應地調整治療,熟習醫學技術者可以容易地確定特定患者之最佳劑量及治療方案。
根據已知方法,諸如靜脈內推注投與,或藉由在一段時間內連續輸注,藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、靜脈內(i.v.)、關節內、滑膜內、鞘內、經口、局部或吸入途徑將本申請案之醫藥組成物(包括但不限於復溶調配物及液體調配物)投與需要用本文所述之抗PD-L1構建體治療之個體,較佳人。可藉由將凍乾之本文所述之抗PD-L1構建體溶解在稀釋劑中以使蛋白質分散在各處來製備復溶之調配物。適用於本申請案之示例性醫藥學上可接受之(對人投與係安全且無毒之)稀釋劑包括但不限於無菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液,或鹽及/或緩衝劑之水溶液。
在一些實施例中,藉由皮下(即在皮膚下)投與來向個體投與醫藥組成物。出於此種目的,可以使用注射器來注射醫藥組成物。然而,其他用於投與醫藥組成物之裝置為可用的,諸如注射裝置;注射筆;自動注射器裝置,無針裝置;及皮下貼片遞送系統。
在一些實施例中,將醫藥組成物靜脈內投與給個體。在一些實施例中,藉由輸注(例如靜脈內輸注)將醫藥組成物投與給個體。免疫療法之輸注技術為此項技術已知的(參見例如Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676(1988))。
如本文所述之包含特異性識別PD-L1之mAb之抗PD-L1構建體(諸如抗PD-L1全長IgG、抗PD-L1/CTLA-4雙特異性抗體、抗PD-L1/TIGIT雙特異性抗體、抗PD-L1/TIM-3雙特異性抗體或抗PD-L1/LAG-3雙特異性抗體)及其 組成物(諸如醫藥組成物)亦可用於診斷或分子測定。例如,該抗體或抗原結合片段可用於檢測或定量生物樣品中之PD-L1,從而檢測或監測與PD-L1有關之疾病(諸如上文所述之疾病)之進展或治療。
本文所述之抗PD-L1構建體(諸如抗PD-L1單株抗體)可使用此項技術中已知或如本文所述之任何方法製備。亦參見實例1-2。
齧齒動物單株抗體可以使用此項技術已知之方法獲得,諸如藉由對齧齒動物物種(諸如小鼠或大鼠)進行免疫並從中獲得融合瘤,或藉由使用此項技術中已知之分子生物學技術選殖Fab片段或單鏈Fc(scFv)之文庫並且隨後利用未選擇之文庫之單個純系藉由ELISA進行選擇或藉由使用噬菌體展示。
為了重組產生單株抗體,將編碼單株抗體之核酸分離或合成並插入可複製之載體中以進一步選殖(擴增DNA)或用於表現。編碼單株抗體之DNA容易分離並且使用常規程序(例如,藉由使用能夠與編碼該抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)進行測序。很多載體係可用的。載體之選擇部分取決於要使用之宿主細胞。通常,較佳之宿主細胞係原核或真核(通常係哺乳動物)來源的宿主細胞。
本發明亦提供以下非限制性實施例。
實施例1包含一種分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其包含:(a)重鏈可變域(VH),其包含:i.重鏈CDR1,其包含SEQ ID NO:71-82中任一者之胺基酸序列,或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體;ii.重鏈CDR2,其包含SEQ ID NO:83-97中任一者之胺基酸序列,或其包含至 多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體;及iii.重鏈CDR3,其包含SEQ ID NO:98-109中任一者之胺基酸序列,或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體;及(b)輕鏈可變域(VL),其包含:i.輕鏈CDR1,其包含SEQ ID NO:110-123中任一者之胺基酸序列,或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體;ii.輕鏈CDR2,其包含SEQ ID NO:124-135中任一者之胺基酸序列,或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體;及iii.輕鏈CDR3,其包含SEQ ID NO:136-147中任一者之胺基酸序列,或其包含至多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體,其中該抗體或抗原結合片段能夠與PD-L1、較佳人類PD-L1特異性結合。
實施例2為一種分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其包含:(a)重鏈可變域(VH),其包含:i.重鏈CDR1,其包含選自由SEQ ID NO:71-82組成之群的胺基酸序列;ii.重鏈CDR2,其包含分別選自由SEQ ID NO:83-94組成之群的胺基酸序列,其中SEQ ID NO:87視情況由SEQ ID NO:95-97中之任一者置換;及iii.重鏈CDR3,其包含分別選自由SEQ ID NO:98-109組成之群的胺基酸序列;及(b)輕鏈可變域(VL),其分別包含,i.輕鏈CDR1,其包含選自由SEQ ID NO:110-121組成之群的胺基酸序列,其中SEQ ID NO:111視情況由SEQ ID NO:122置換,且SEQ ID NO:114視情況由SEQ ID NO:123置換;ii.輕鏈CDR2,其包含分別選自由SEQ ID NO:124-135組成之群的胺基酸序列; 及iii.輕鏈CDR3,其包含分別選自由SEQ ID NO:136-147組成之群的胺基酸序列,其中該抗體或抗原結合片段能夠與PD-L1、較佳人類PD-L1特異性結合。
實施例3為如實施例1或2之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其包含表20之重鏈CDR及表21之相應輕鏈CDR。
實施例4為如實施例1至3中任一項之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其包含:VH域,其包含SEQ ID NO:1-44中任一者之胺基酸序列,或其與SEQ ID NO:1-44中任一者具有至少約80%、至少約90%或至少約95%序列同一性的變異體;及VL域,其包含SEQ ID NO:45-70中任一者之胺基酸序列,或其與SEQ ID NO:45-70中任一者具有至少約80%、至少約90%或至少約95%序列同一性的變異體。
實施例5為如實施例1至4中任一項之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其包含:VH域,其包含SEQ ID NO:1-44中任一者之胺基酸序列,或其在該VH域中包含至多約3個胺基酸取代之變異體;及VL域,其包含SEQ ID NO:45-70中任一者之胺基酸序列,或其在該VL域中包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
實施例6為如實施例5之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其中分別地,該VH域包含選自由SEQ ID NO:1-44組成之群的胺基酸序列;且該VL域包含選自由SEQ ID NO:45-70組成之群的胺基酸序列。
實施例7包含一種分離的抗體,較佳mAb,或抗原結合片段,其包含:(1)包含分別具有SEQ ID NO:75、87及102之胺基酸序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列的VH,以及包含分別具有SEQ ID NO:114、128及140之胺基酸序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列的VL,其中SEQ ID NO:87視情況由 SEQ ID NO:95-97中之任一者置換,且SEQ ID NO:114視情況由SEQ ID NO:123置換;或(2)包含分別具有SEQ ID NO:72、84及99之胺基酸序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列的VH,以及包含分別具有SEQ ID NO:111、125及137之胺基酸序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列的VL,其中SEQ ID NO:111視情況由SEQ ID NO:122置換。
實施例8為如實施例7之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其中該VH包含分別具有SEQ ID NO:72、84及99之胺基酸序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列,且該VL包含分別具有SEQ ID NO:122、125及137之胺基酸序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
實施例9為如實施例7或8之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其中:該VH包含分別具有SEQ ID NO:75、97及102之胺基酸序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列,且該VL包含分別具有SEQ ID NO:123、128及140之胺基酸序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
實施例10為如實施例1至9中任一項之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段與PD-L1之間的結合之KD為約10-5M至約10-12M、約10-7M至約10-12M或約10-8M至約10-12M或更小。
實施例11為如實施例1至10中任一項之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其為齧齒動物的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
實施例12為如實施例11之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其中該VH融合至免疫球蛋白之重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)。
實施例13為如實施例11或12之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其中該VL融合至免疫球蛋白之輕鏈恆定區(CL)。
實施例14為如實施例13之分離的抗體,較佳mAb,其包含人類IgG1之恆定域。
實施例15為如實施例13或14之分離的抗體,較佳mAb,其為包含SEQ ID NO:278-321或348-391中任一者之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO:322-347中任一者之輕鏈胺基酸序列的全長IgG。
實施例16為如實施例1至15中任一項之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其進一步包含特異性識別第二抗原之第二抗體部分。
實施例17為如實施例16之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其中該第二抗體部分為Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、單鏈Fv(scFv)、scFv-scFv、微抗體、雙抗體、sdAb或抗體模擬物。
實施例18為如實施例16或17之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其中該第二抗體部分為sdAb。
實施例19為如實施例16至18中任一項之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其中該第二抗體部分能夠與CTLA-4特異性結合,較佳地,該第二抗體部分為能夠與CTLA-4特異性結合的sdAb。
實施例20為如實施例16至18中任一項之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其中該第二抗體部分能夠與TIGIT特異性結合,較佳地,該第二抗體部分為能夠與TIGIT特異性結合的sdAb。
實施例21為如實施例16至18中任一項之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其中該第二抗體部分能夠與TIM-3特異性結合,較佳地,該第二抗體部分為能夠與TIM-3特異性結合的sdAb。
實施例22為如實施例16至18中任一項之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其中該第二抗體部分能夠與LAG-3特異性結合,較佳地,該第二抗體部分為能夠與LAG-3特異性結合的sdAb。
實施例23為如實施例19至22中任一項之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其中能夠特異性識別PD-L1之全長IgG之重鏈或輕鏈之胺基末端視情況經由肽接頭融合至能夠與CTLA-4、TIGIT、TIM-3或LAG-3特異性結合的該sdAb之羧基末端。
實施例24為如實施例19至22中任一項之分離的抗體,較佳mAb,或其抗原結合片段,其中能夠特異性識別PD-L1之全長IgG之重鏈或輕鏈之羧基末端視情況經由肽接頭融合至能夠與CTLA-4、TIGIT、TIM-3或LAG-3特異性結合的該sdAb之胺基末端。
實施例25為如實施例23或24之分離的抗體或其抗原結合片段,其中能夠特異性識別PD-L1之該全長IgG經由具有SEQ ID NO:397-399之一之胺基酸序列的肽接頭融合至能夠與CTLA-4、TIGIT、TIM-3或LAG-3特異性結合的該sdAb。
實施例26包含一種第二分離的抗體或其抗原結合片段,其能夠與實施例1至25中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段競爭地與PD-L1特異性結合。
實施例27包含一種醫藥組成物,其包含如實施例1至25中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段或如實施例26之第二分離的抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑。
實施例28為如實施例1至25中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段,如實施例26之第二分離的抗體或其抗原結合片段、如實施例27之醫藥組成物,其用於治療有需要之受試者之PD-L1相關疾病。
實施例29為如實施例28之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其中該PD-L1相關疾病為癌症。
實施例30為如實施例29之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段 或醫藥組成物,其中該癌症為實體腫瘤。
實施例31為如實施例29之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其中該癌症為結腸癌。
實施例32為如實施例28至31中任一項之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其與另外的癌症療法組合。
實施例33為如實施例32之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其中該另外的癌症療法為手術、放射、化學療法、免疫療法、激素療法或其組合。
實施例34為如實施例28之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其中該PD-L1相關疾病為病原性感染。
實施例35為如實施例28至34中任一項之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其中該分離的抗體或抗原結合片段或醫藥組成物係用於全身或局部投與。
實施例36為如實施例28至34中任一項之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其中該分離的抗體或抗原結合片段或醫藥組成物係用於靜脈內投與。
實施例37為如實施例28至34中任一項之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其中該分離的抗體或抗原結合片段或醫藥組成物係用於腫瘤內投與。
實施例38為如實施例28至37中任一項之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其中該受試者為人類。
實施例39為一種治療有需要之受試者之PD-L1相關疾病之方法,其包括向該受試者投與有效量之如實施例27之醫藥組成物。
實施例40為如實施例39之方法,其中該PD-L1相關疾病為癌症。
實施例41為如實施例40之方法,其中該癌症為實體腫瘤。
實施例42為如實施例40或41之方法,其中該癌症為結腸癌。
實施例43為如實施例40至42中任一項之方法,其進一步包括向該個體投與另外的癌症療法。
實施例44為如實施例43之方法,其中該另外的癌症療法為手術、放射、化學療法、免疫療法、激素療法或其組合。
實施例45為如實施例39之方法,其中該PD-L1相關疾病為病原性感染。
實施例46為如實施例39至45中任一項之方法,其中該醫藥組成物係全身或局部投與。
實施例47為如實施例39至45中任一項之方法,其中該醫藥組成物係靜脈內投與。
實施例48為如實施例39至45中任一項之方法,其中該醫藥組成物係腫瘤內投與。
實施例49為如實施例39至48中任一項之方法,其中該個體為人類。
以下實例僅意圖例示本發明,並且因此不應視為以任何方式限制本發明。提供以下實例及詳細說明係用以說明而非用以限制。
將人類PD-L1細胞外域Fc融合蛋白(PD-L1-Fc)(GenScritp,目錄號:Z03371,SEQ ID NO:396)用作免疫原。為了進行免疫接種,將抗原蛋白調配成具有CFA(初次免疫)或IFA(加強免疫)、或不具有佐劑(最終加強)之乳液。將約50μg蛋白以1:1比率與弗氏完全佐劑(Sigma-Aldrich)混合且用於使雌性Balb/c 及C57bl/6小鼠免疫。然後,將小鼠每兩週腹膜內用以1:1比率與弗氏不完全佐劑(Sigma-Aldrich)混合之25μg PD-L1-Fc免疫,多達3次。全部10只免疫小鼠之滴度均達到高於105(圖1)。對兩隻小鼠(#848及#853)腹膜內使用25μg PD-L1-Fc(無佐劑)進行最終加強,該兩隻小鼠顯示針對抗原蛋白的最高滴度。最終加強之後四天,進行細胞融合。
將兩隻選擇的小鼠之分離的脾及與融合配偶體骨髓瘤細胞(SP 2/0)製成均質化單細胞懸浮液。通過電融合法融合約8.9×107個脾細胞及4.1×107個SP 2/0細胞。將融合細胞再懸浮於100ml含有胸腺核苷嘧啶、次黃嘌呤及胺基蝶呤融合瘤選擇試劑之DMEM/10% FBS培養基中。將細胞懸浮液分配至多於50個96孔板中,每孔100μl。將細胞於具有6% CO2之37℃溫育箱中培養7天。收集融合瘤上清液並藉由酶聯免疫吸附測定(ELISA)進行PD-L1結合測定及PD-1競爭測定,藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行PD-1過表現細胞株結合,以使用以下方法鑒別PD-L1特異性抗體。
採用間接ELISA評估融合瘤上清液中抗體與PD-L1 ECD(Acrobiosystems,目錄號:PD1-H5229)之結合能力。將重組PD-L1-Fc或人類IgG1(陰性對照)藉由磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)稀釋至0.5μg/ml,並在4℃下塗佈於96孔ELISA板(每孔100μl)上隔夜。使用PBST(補充有0.05% Tween-20之PBS)洗滌各板。在37℃下使用補充有1% BSA之PBST將板(每孔200μl)阻斷0.5小時,然後丟棄。將融合瘤上清液添加於各孔中(每孔100μl),並在室溫下溫育1小時。將板用PBST洗滌3次。添加山羊抗小鼠IgG(Fab特異性)HRP(GenScript)二級抗體(每孔100μl)並在37℃下溫育0.5小時。然後將板用PBST洗滌5次。將四甲基聯苯胺(TMB,GenScript)添加至孔中,並在室溫下溫育15分鐘。添加鹽酸 鹽(HCl,Sigma)終止緩衝液(1M,每孔50μl)以終止反應,並使用光譜儀在450nm下讀板。
採用競爭ELISA評估融合瘤上清液中抗體阻斷PD-L1與其受體PD-1結合的能力。藉由PBS將重組PD-1 ECD蛋白(GenScript目錄號:Z03424)稀釋至0.5μg/ml,並在4℃下塗佈於ELISA板(每孔100μl)上隔夜。使用PBST洗滌各板。在37℃下使用補充有1% BSA之PBST將板(每孔200μl)阻斷0.5小時,然後丟棄。將融合瘤上清液添加於各孔中(每孔50μl),並將添加至其他經塗佈孔(每孔50μl)之非相關上清液用作對照。然後將經生物素化之PD-L1-Fc(0.15μg/ml,每孔50μl)添加至孔中。將板在37℃下溫育1小時,並用PBST洗滌3次。將山葵過氧化酶(HRP)標記之鏈黴抗生物素蛋白(SA-HRP,GenScript)添加至孔中(每孔100μl),並在37℃下將板溫育0.5小時。將板用PBST洗滌5次。將TMB(GenScript)添加至孔中,並在室溫下溫育15分鐘。添加HCl(Sigma)終止緩衝液(1M,每孔50μl)以終止反應,並使用光譜儀在450nm下讀板。
採用FACS評估融合瘤上清液中抗體與CHO細胞表面上表現之PD-L1蛋白的結合能力。收集過表現PD-L1之CHO細胞及親本CHO細胞,並用PBS洗滌3次。將約2.5×105個細胞及100μl融合瘤上清液添加至96孔板之各孔中,並在4℃下溫育1小時。將板使用PBS洗滌3次。將山羊抗小鼠IgG(H+L)iFluor647(GenScript)添加至孔中(每孔100μl)並在4℃下溫育45分鐘。將細胞用PBS洗滌3次,且藉由FACS BD Calibur讀取信號。
藉由上文所述之篩選程序,鑒別十二種PD-L1特異性單株抗體,即1H1G4D9、18B7F4G8、21D1F4D4、25B6E5D8、25G1F9F8、27D3D3G2、 29A8H8C7、30A6B2D9、30A7B5D9、42G2D7C3、51F3D2G4及53C1F3D4。為了得到單株抗體之可變域序列,使用TRIzol(Ambion)從3×106至5×106個融合瘤細胞中提取單純系之總RNA。使用表現小鼠同型ELISA套組(Clonotyping System-HRP,Southern Biotech)測定單株抗體之同型。使用同型特異性引物及通用引物(PrimeScriptTM第1股cDNA合成套組,Takara)將RNA逆轉錄成cDNA。使用cDNA末端之快速擴增(RACE)聚合酶鏈反應(PCR)擴增抗體重鏈及輕鏈之可變區DNA,並將其亞選殖至pMD18-T載體系統(Takara)中。使用載體特異性引物對插入的可變域DNA進行測序。可變域之胺基酸序列顯示於表18及19中。
由融合瘤培養物產生小鼠單株抗體。使用SPR、FACS、報道基因測定及混合淋巴細胞反應(MLR)測定來表徵諸如抗原結合、受體阻斷、小鼠mAb之功能活性的性質。
將冷凍的融合瘤細胞快速解凍並轉移至含有10% FBS之溫熱RPMI 1640培養基中並擴增。將擴增的細胞培養物轉移至含有融合瘤細胞培養基的滾瓶中,使最終細胞密度為1-2×105個細胞/ml。將滾瓶立即置於37℃溫育箱中之滾筒裝置上。然後將融合瘤細胞在2-3rpm轉速下培養兩週。藉由在3,000-4,000rpm下離心15min使融合瘤細胞離心沉降。將培養上清液藉由1.0μm過濾器過濾,然後濃縮至原始體積的1/10。可以按照製造商的手冊,使用1ml HiTrap蛋白A HP柱(GE healthcare)立即純化濃縮的上清液。
使用FACS進行12種小鼠mAb之PD-L1穩定細胞株結合活性評估。將表現人類PD-L1之CHO-K1細胞(Genscript,目錄號M00543)從貼壁培養瓶中解離,並與不同濃度之抗體混合。將抗體及細胞在室溫下溫育30分鐘,用FACS 緩衝液(含有1% BSA之PBS)洗滌三次。添加PE標記之山羊抗小鼠IgG(最小x-反應性)二級抗體(BioLegend,目錄號405307)並在室溫下溫育15分鐘。用FACS緩衝液再次洗滌細胞,並藉由FACSCalibur(BD Bioscience,San Jose,CA)及Flowjo軟體分析。使用Prism 6(GraphPad軟體,San Diego,CA)使用非線性迴歸分析數據,並計算EC50值(圖2A-2L及表3)。一些小鼠mAb,即18B7F4G8、29A8H8C7、42G2D7C3、51F3D2G4及53C1F3D4對細胞上表現之PD-L1蛋白顯示出非常高的親和力。
將表現人類PD-L1之CHO-K1細胞(Genscript,目錄號M00543)從貼壁培養瓶解離,用洗滌緩衝液(補充有0.2% BSA之1×PBS)洗滌兩次並與生物素化PD-1 Fc融合蛋白(28μg/ml,每孔50μl)混合(2×105個細胞/孔,100μl)。然後添加一系列稀釋的小鼠mAb(濃度從900nM開始,3倍稀釋,每孔50μl)。將混合物在4℃下溫育30分鐘,用洗滌緩衝液洗滌兩次,然後添加PEcy5/鏈黴抗生物素蛋白(1μg/ml,150μl/孔)。將板再次在4℃下溫育30分鐘,然後藉由FACSCalibur(BD Bioscience,San Jose,CA)及Flowjo軟體分析各孔中之細胞。使用Prism(GraphPad軟體,San Diego,CA)使用非線性迴歸分析數據,並計算 EC50值(圖3A-3J及表4)。一些小鼠mAb,即18B7F4G8、25B6E5D8對PD-L1細胞株與PD-1蛋白之間的結合沒有阻斷作用,而一些小鼠mAb,即27D3D3G2、29A8H8C7、51F3D2G4及53C1F3D4可以最有效地阻斷相互作用。
使用基於PD-L1細胞之報道基因測定評估顯示高結合活性及/或高阻斷活性的六種小鼠mAb,即18B7F4G8、27D3D3G2、29A8H8C7、42G2D7C3、51F3D2G4及53C1F3D4。效應細胞含有螢光素酶構建體,其在破壞PD-1/PD-L1受體-配體相互作用時經誘導,例如當PD-L1細胞與表現PD-1的效應細胞混合時。因此,可以藉由量測螢光素酶報道基因活性來評估抗PD-L1 mAb抑制CHO-K1穩定細胞上PD-L1的功效。如下進行測定。
在第一天,將PD-L1細胞於37℃水浴中解凍,直至細胞剛好解凍(約3-4分鐘),並將0.5mL解凍的細胞轉移至14.5mL細胞回收培養基(10% FBS/F-12)中。藉由輕輕顛倒管1-2次將細胞懸浮液充分混合。然後將細胞懸浮液轉移至無菌試劑儲存器,並以每孔25μL細胞懸浮液分配至測定板中。添加每孔100μL測定培養基作為空白對照。對作為空白對照之各孔添加每孔100μL細 胞回收培養基。然後將板蓋上蓋子並在CO2溫育箱中在37℃下溫育隔夜。
在測定當天,製備新鮮測定緩衝液(RPMI 1640+1% FBS)。對於對照抗PD-L1抗體(例如度伐單抗)及小鼠mAb中之各者,在測定緩衝液中進行八點連續稀釋。對起始濃度及稀釋方案進行優化以達成全劑量反應曲線。自CO2溫育箱回收含有PD-L1細胞之測定板。自全部孔移除每孔95μl培養基。向含有PD-L1細胞之孔中添加每孔40μL對照抗PD-L1抗體或抗原結合蛋白之連續稀釋液。向各板之空白對照孔中添加每孔80μL測定緩衝液。
接著,將PD-1效應細胞於37℃水浴中解凍,直至細胞剛好解凍(約3-4分鐘)。藉由上下吸取將小瓶中之細胞懸浮液輕輕混合,且將0.5mL細胞添加至5.9mL測定緩衝液中。藉由輕輕顛倒管1-2次將細胞懸浮液充分混合。然後將細胞懸浮液轉移至無菌試劑儲存器中,且將40μL細胞懸浮液分散至含有PD-1細胞及對照抗體或雙特異性抗原結合蛋白之各孔中。將板蓋上蓋子並在CO2溫育箱中在37℃下溫育六小時。
藉由將一瓶緩衝液轉移至含有受質之瓶中來重構螢光素酶測定系統。將系統在室溫下儲存且避光保存以供某天使用。6小時溫育之後,將測定板自CO2溫育箱移除並在周圍溫度下平衡5-10min。向各孔中添加80μL試劑。將板在周圍溫度下溫育5-10min。於GloMax®發現系統(Promega,Madison,WI)或具有輝光型(glow-type)發光讀取能力之板讀取器中量測發光。
發光表示為相對光單位(RLU)。將具有稀釋抗體或雙特異性抗原結合蛋白之孔之RLU值正規化至無抗體或雙特異性抗原結合蛋白對照之RLU以得到螢光素酶誘導倍數。將數據繪製為RLU對抗體或雙特異性抗原結合蛋白濃度之Log10,及誘導倍數對抗體或雙特異性抗原結合蛋白濃度之Log10。使用Prism 6(GraphPad軟體,San Diego,CA)使用非線性迴歸分析數據,並計算EC50值(圖4A-4H及表5)。三種抗體,即27D3D3G2、29A8H8C7及53C1F3D4顯示高功能 活性。小鼠mAb 18B7F4G8具有較低EC50值,然而相較於其他抗體之活化百分比為低的,相較於其他三種抗體,最大20%活化。
使用MLR測定,評估四種小鼠mAb,即18B7F4G8、27D3D3G2、29A8H8C7及53C1F3D4之功能活性。從人類外周血單核細胞(PBMC)分離樹突細胞(DC)及CD4+ T細胞。於FACS測定中分析DC之共刺激分子及MHC II類之表現。驗證表面標記物即CD1a、CD83、CD86及HLA-DR之表現。將合適比率之CD4+ T細胞及DC接種至96孔板之各孔中,並用上文所提及之抗體處理。將測定板在37℃/5% CO2溫育箱中溫育72小時,並使用人類IL-2 HTRF套組(Cisbio,目錄號64IL2PEB)量測由細胞釋放之IL-2。使用Prism 6(GraphPad軟體,San Diego,CA)使用非線性迴歸分析數據,並計算EC50值(圖5A-5F及表6)。根據測定結果,29A8H8C7、53C1F3D4及18B7F4G8之功能活性顯示與抗PD-L1陽性對照抗體阿特珠單抗之功能活性相當的功能活性。
於BiacoreTM T200儀器上藉由表面電漿共振(SPR)確定小鼠mAb 29A8H8C7及53C1F3D4之平衡解離常數(KD)。簡言之,使用EDC活化之胺偶聯化學,將捕捉抗體(用於小鼠mAb之親和力量測之抗小鼠Fc抗體,或用於嵌合及人源化mAb之親和力量測之抗人類Fc抗體,GE healthcare)固定於BiacoreTM CM5晶片上達約7,000RU。將所關注之抗體(5μg/ml)捕捉60秒至感測晶片表面上。使His標記之PD-L1 ECD蛋白(ACROBiosystems)在一系列濃度下流過感測晶片表面。在所有實驗中流速為30μl/min。締合期及解離期分別為5及15min。使用Glycine/HCl pH 1.5使晶片再生。各循環之間使用50mM-HCl移除捕捉的抗體及抗原,以確保各濃度抗原之新鮮結合表面。使用1:1結合模型全面擬合所得感測圖,以計算締合速率及解離速率(分別為ka及kd)以及親和力(KD)。根據結果(圖6A-6D及表7),29A8H8C7及53C1F3D4顯示比阿特珠單抗及度伐單抗高的與PD-L1 ECD蛋白之結合親和力。
使用CDR移植技術,選擇兩種小鼠抗PD-L1 mAb,即29A8H8C7及53C1F3D4用於人源化(參見例如美國專利第5,225,539號)。在執行CDR移植之前,使此等抗體之若干CDR殘基突變以增加CDR之人類性或減少潛在的轉譯後修飾(PTM)之可能性。此等突變為:1.將小鼠29A8H8C7及53C1F3D4之輕鏈可變域(VL)之CDR1中之離胺酸24突變成精胺酸(K24R)以增加人類性,得到29A8VL.M1及53C1VL.M1之VL序列;2.將小鼠53C1F3D4之重鏈可變域(VH) 之CDR2中之天冬醯胺57突變成絲胺酸(N57S)、丙胺酸(N57A)及麩醯胺酸(N57Q),得到分別53C1VH.M1、53C1VH.M2及53C1VH.M3之VH序列,以減少潛在去醯胺之可能性。
使用哺乳動物細胞產生嵌合IgG及其突變體。簡言之,合成編碼重鏈可變區(VH)之DNA片段並插入至經修飾之pTT5載體中,該載體含有編碼具有無效應子突變之人類IgG1重鏈恆定區(鉸鏈、CH1、CH2及CH3)之DNA(恆定區胺基酸序列參見SEQ ID NO:392),得到重鏈表現質體;類似地,合成編碼輕鏈可變區(VL)之DNA片段並插入至經修飾之pTT5載體,該載體含有編碼人類IgG1 κ鏈恆定區(CL)之DNA,得到輕鏈表現質體。製備Maxiprep質體。
將野生型及突變體重鏈及輕鏈合併,得到野生型嵌合IgG及一系列突變體IgG。例如,29A8_嵌合為29A8H8C7嵌合抗體,且使用連接至具有無效應子Fc突變之重鏈恆定區的編碼29A8VH之野生型重鏈質體及連接至輕鏈恆定區的編碼29A8VL之輕鏈質體產生;53C1_VH.M3-VL.M1為嵌合53C1F3D4之突變體,且使用連接至具有無效應子Fc突變之重鏈恆定區的編碼53C1VH.M3之突變體重鏈質體及連接至輕鏈恆定區的編碼53C1VL.M1之突變體輕鏈質體產生。使用合併之質體來轉染HEK293-6E細胞。將轉染之細胞在37℃下培養2天。收集上清液,過濾;且對分泌之嵌合及突變體抗體進行SPR親和力評估。
根據SPR親和力量測,沒有突變顯著影響人類PD-L1與抗PD-L1抗體之間的結合親和力(表8),因此兩種抗體之VL-CDR1中之K24R以及53C1F3D4之VH-CDR2中之N57Q、N57S及N57A可引入至人源化抗體中。
使用CDR移植技術將小鼠抗體人源化(參見例如美國專利第5,225,539號)。簡言之,將鼠類抗體29A8H8C7及53C1F3D4之可變鏈序列與結構生物資訊學合作研究協會(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics;RCSB)蛋白數據庫可獲得之序列相比較。基於最接近的VH及VK結構生成29A8H8C7及53C1F3D4之同源模型。鑒別並分析與29A8H8C7及53C1F3D4具有最高同一性的人類序列(Foote及Winter,J.Mol.Biol.224:487-499(1992);Morea V.等人,Methods 20:267-279(2000);Chothia C.等人,J.Mol.Biol.186:651-663(1985))。鑒別其上建立CDR移植重鏈及輕鏈的最適當的人類框架。對於重鏈,藉由Genbank登錄號CAB51716及BAC02193編碼之框架(其序列以引用方式併入本文)經確定分別最適於29A8H8C7及53C1F3D4。對於輕鏈,藉由Genbank登錄號ABA70776及CAG27369編碼之框架(其序列以引用方式併入本文)經確定分別最適於29A8H8C7及53C1F3D4。
對各鏈執行直接移植以生成表現構建體。直接移植之29A8VH1、29A8VL1、53C1VH1及53C1VL1之胺基酸序列揭示於序列表中(SEQ ID NO:293、336、298及339)。構建直接移植之重鏈(SEQ ID NO:298)及其N57Q突變體即53C1VH1.M3(SEQ ID NO:304)以及具有上文提及之K24R突變之直接移植之輕鏈變異體即29A8VL1.M1及53C1VL1.M1(SEQ ID NO:342及345)。
在人源化抗體之親和力喪失之情況下,使若干框架殘基突變回其鼠類對應物以恢復抗體之結合親和力。對於29A8H8C7之人源化,構建人源化VH 變異體29A8VH2、29A8VH3、29A8VH4及29A8VH5(SEQ ID NO:294-297)及人源化VL變異體29A8VL2.M1及29A8VL3.M1(SEQ ID NO:343及344)。對於53C1F3D4之人源化,亦構建人源化VH變異體53C1VH2、53C1VH3、53C1VH4、53C1VH5及53C1VH6(SEQ ID NO:299-303)及其N57Q突變體即53C1VH2.M3、53C1VH3.M3、53C1VH4.M3、53C1VH5.M3及53C1VH6.M3(SEQ ID NO:305-309)以及人源化VL變異體53C1VL2.M1及53C1VL3.M1(SEQ ID NO:346及347)。
將人源化重鏈及輕鏈合併,且用於產生一系列人源化抗體。使用HEK293細胞短暫地產生此等抗體,且對上清液中之抗體進行SPR親和力評估。人源化變異體之結合親和力顯示於表9及10中。根據親和力評估,人源化29A8H8C7具有一定程度的親和力喪失,而53C1F3D4之結合親和力在人源化之後經保留。選擇29A8H8C7之3種人源化變異體即29A8_VH1-VL1.M1、29A8_VH4-VL1.M1及29A8_VH5-VL1.M1以及53C1F3D4之5種人源化變異體即53C1_VH1-VL1.M1、53C1_VH3-VL1.M1、53C1_VH5-VL1.M1、53C1_VH1.M3-VL1.M1及53C1_VH5.M3-VL1.M1連同嵌合抗體一起用於抗體產生、表徵及功能剖析。此等人源化變異體具有最高人類性例如較少的返回突變,或最高的與人類PD-L1蛋白之親和力。
將編碼2種嵌合抗體及上文提及之8種人源化抗體之合併之重鏈及輕鏈質體用於轉染HEK293-6E細胞。將轉染之細胞在37℃下於搖瓶中培養6天。收集上清液,過濾並加載至蛋白A親和柱上。將柱用1xPBS,pH 7.4徹底洗滌,之後用無菌0.1M檸檬酸鈉,pH 3.5洗脫剩餘抗體。使用1/9體積的1M Tris-HCl,pH 9.0緩衝液中和洗脫之抗體溶液。將抗體之緩衝液改變成1xPBS,pH 7.4或50mM組胺酸pH 6.0。然後藉由在280nM下的吸光度(OD280)確定濃度。使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及粒徑排阻層析法(SEC)確定純度。嵌合抗體及人源化抗體之恆定區可為野生型人類IgG1之恆定區或具有無效應子Fc突變之人類IgG1之恆定區。為簡短起見,使用具有帶有 無效應子Fc突變之人類IgG1之恆定區之嵌合及人源化抗PD-L1進行以下特徵測定。
於BiacoreTM T200儀器上藉由表面電漿共振(SPR)確定人源化29A8H8C7及53C1F3D4與人類及食蟹猴PD-L1之平衡解離常數(KD)。對於單價人類PD-L1結合親和力確定,該方法類似於之前所述之方法,除了所用之捕捉抗體為抗人類Fc抗體。對於食蟹猴PD-L1結合親和力確定,藉由胺偶聯將食蟹猴PD-L1 Fc融合蛋白固定於感測晶片上,且將嵌合及人源化PD-L1抗體及基準抗體阿特珠單抗及度伐單抗用作分析物。根據結果(圖7A-7J及圖8以及表11及12),29A8H8C7與His標記之人類PD-L1及食蟹猴PD-L1 Fc融合蛋白之結合親和力略微減小,而53C1F3D4之結合親和力在人源化之後經完全保留。
如上文所述,使用FACS進行嵌合及人源化mAb之人類及食蟹猴PD-L1穩定細胞株結合活性評估(圖9A-9L及圖10A-10L以及表13及14)。根據結果,人源化抗體具有與其嵌合對應物類似的結合EC50值,且與人類及食蟹猴PD-L1細胞株之結合親和力與抗PD-L1基準抗體度伐單抗及阿特珠單抗之結合親和力相當。
如上文所述,評估嵌合及人源化抗PD-L1抗體及基準對人類PD-1蛋白及人類PD-L1過表現細胞株之間的相互作用的阻斷(圖11A-11L及表15)。根據結果,人源化抗體具有與其嵌合對應物類似的阻斷IC50值,且阻斷IC50值與抗PD-L1基準抗體度伐單抗相當且低於阿特珠單抗。
評估嵌合及人源化抗體之功能活性並使用基於PD-L1細胞之報道基因測定如之前所述進行比較(圖12A-12L及表16)。根據結果,人源化抗體具有與嵌合對應物類似的功能活性,且功能活性與抗PD-L1基準抗體度伐單抗及阿特珠單抗相當。
使用MLR測定評估6種人源化mAb即29A8_VH1-VL1.M1、29A8_VH4-VL1.M1、53C1_VH1-VL1.M1、53C1_VH5-VL1.M1、53C1_VH1.M3-VL1.M1及53C1_VH5.M3-VL1.M1之功能活性(圖13A-13I及表17)。除了29A8_VH1-VL1.M1,全部六種人源化抗體顯示與基準抗體度伐單抗類似的功能活性。
使用異種移植模型評估3種人源化mAb即29A8_VH4-VL1.M1、53C1_VH1.M3-VL1.M1及53C1_VH5.M3-VL1.M1之活體內功效(圖14A-14G及表18)。將基準抗體度伐單抗用作陽性對照。簡言之,藉由胰酶消化收集實驗生長期之MC38-A29-hPDL1 D13-1細胞且在細胞數計數之後再懸浮於HBSS-/-溶液中。將五十四(54)只hPD-1敲入小鼠(C57BL/6品系)(製造及目錄號)在右下側腹處(接近股背面區域)皮下接種單一體積的100μl細胞懸浮液(1×106個細胞,細胞 體積:基質膠體積=1:0.8)。最終,將40只攜帶腫瘤之小鼠納入研究中。自腫瘤植入之後,使用卡尺二維地每週兩次量測動物之腫瘤大小。如下計算腫瘤體積、腫瘤體積之抑制速率及腫瘤生長之抑制速率:
a.腫瘤體積:V(mm3)=(a * b2)/2,其中「a」及「b」分別為腫瘤之長徑及短徑。
b.腫瘤體積之抑制速率(IRTV):IRTV=(CRTV-TRTV)/CRTV * 100%。(TRTV:治療組RTV;CRTV:陰性對照組RTV)。
c.腫瘤生長之抑制速率(IRTW):IRTW=(對照組之平均腫瘤重量-治療組之平均腫瘤重量)/對照組之平均腫瘤重量* 100%
腫瘤接種之後五(5)天,根據腫瘤大小及動物體重,將動物隨機成6組,每組8只。每週三次腹膜內(i.p.)投與測試或對照製品達2週。出於倫理原因,對病狀惡化及/或腫瘤大小>3,000mm3及/或體重損失超過基礎值之30%的動物進行CO2人道安樂死。在研究期間,小鼠體重略微增加<30%。陰性PBS對照組中6只小鼠及53C1_VH5.M3-VL1.M1治療組中1只小鼠之腫瘤大小達到3,000mm3,因此在研究結束之前進行安樂死。所以,不包括第18天的腫瘤大小,其可能為甚至度伐單抗治療組之腫瘤生長抑制不顯著的原因。儘管如此,兩種人源化抗體即53C1_VH1.M3-VL1.M1及53C1_VH5.M3-VL1.M1顯示優於基準度伐單抗之腫瘤生長抑制活性。
表18.小鼠抗PD-L1抗體之重鏈可變區(VH)序列。
表21.輕鏈可變區(VL)CDR序列。
表26.具有野生型恆定區序列之全長IgG1重鏈序列。
表28.抗原序列
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠VH FR3
<400> 185
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠VH FR3
<400> 186
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠VH FR3
<400> 187
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠VH FR3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 32
<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
<400> 295
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<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
<400> 296
<210> 297
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
<400> 297
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<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
<400> 298
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
<400> 299
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<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
<400> 300
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<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
<400> 301
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變且具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
<400> 311
<210> 312
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變且具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
<400> 312
<210> 313
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變且具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
<400> 313
<210> 314
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變且具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
<400> 314
<210> 315
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變且具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
<400> 315
<210> 316
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變且具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
<400> 316
<210> 317
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變且具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
<400> 317
<210> 318
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變且具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
<400> 318
<210> 319
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變且具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
<400> 319
<210> 320
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變且具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
<400> 320
<210> 321
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變且具有N297A突變之人源化IgG1重鏈
<400> 321
<210> 322
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合κ輕鏈
<400> 322
<210> 323
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合κ輕鏈
<400> 323
<210> 324
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合κ輕鏈
<400> 324
<210> 325
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合κ輕鏈
<400> 325
<210> 326
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合κ輕鏈
<400> 326
<210> 327
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合κ輕鏈
<400> 327
<210> 328
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合κ輕鏈
<400> 328
<210> 329
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合κ輕鏈
<400> 329
<210> 330
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合κ輕鏈
<400> 330
<210> 331
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合κ輕鏈
<400> 331
<210> 332
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合κ輕鏈
<400> 332
<210> 333
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合κ輕鏈
<400> 333
<210> 334
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR突變之嵌合κ輕鏈
<400> 334
<210> 335
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR突變之嵌合κ輕鏈
<400> 335
<210> 336
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化κ輕鏈
<400> 336
<210> 337
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化κ輕鏈
<400> 337
<210> 338
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化κ輕鏈
<400> 338
<210> 339
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化κ輕鏈
<400> 339
<210> 340
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化κ輕鏈
<400> 340
<210> 341
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化κ輕鏈
<400> 341
<210> 342
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR1突變之人源化κ輕鏈
<400> 342
<210> 343
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR1突變之人源化κ輕鏈
<400> 343
<210> 344
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR1突變之人源化κ輕鏈
<400> 344
<210> 345
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR1突變之人源化κ輕鏈
<400> 345
<210> 346
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR1突變之人源化κ輕鏈
<400> 346
<210> 347
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR1突變之人源化κ輕鏈
<400> 347
<210> 348
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之嵌合IgG1重鏈
<400> 348
<210> 349
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之嵌合IgG1重鏈
<400> 349
<210> 350
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之嵌合IgG1重鏈
<400> 350
<210> 351
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之嵌合IgG1重鏈
<400> 351
<210> 352
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之嵌合IgG1重鏈
<400> 352
<210> 353
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之嵌合IgG1重鏈
<400> 353
<210> 354
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之嵌合IgG1重鏈
<400> 354
<210> 355
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之嵌合IgG1重鏈
<400> 355
<210> 356
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之嵌合IgG1重鏈
<400> 356
<210> 357
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之嵌合IgG1重鏈
<400> 357
<210> 358
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之嵌合IgG1重鏈
<400> 358
<210> 359
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之嵌合IgG1重鏈
<400> 359
<210> 360
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR突變及WT恆定區之嵌合IgG1重鏈
<400> 360
<210> 361
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR突變及WT恆定區之嵌合IgG1重鏈
<400> 361
<210> 362
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR突變及WT恆定區之嵌合IgG1重鏈
<400> 362
<210> 363
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 363
<210> 364
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 364
<210> 365
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 365
<210> 366
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 366
<210> 367
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 367
<210> 368
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 368
<210> 369
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 369
<210> 370
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 370
<210> 371
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 371
<210> 372
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 372
<210> 373
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 373
<210> 374
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變及WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 374
<210> 375
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變及WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 375
<210> 376
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變及WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 376
<210> 377
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變及WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 377
<210> 378
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變及WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 378
<210> 379
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變及WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 379
<210> 380
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變及WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 380
<210> 381
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變及WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 381
<210> 382
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變及WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 382
<210> 383
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變及WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 383
<210> 384
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變及WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 384
<210> 385
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變及WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 385
<210> 386
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變及WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 386
<210> 387
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變及WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 387
<210> 388
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變及WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 388
<210> 389
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變及WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 389
<210> 390
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變及WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 390
<210> 391
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR2突變及WT恆定區之人源化IgG1重鏈
<400> 391
<210> 392
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N297A突變之IgG1之重鏈恆定區
<400> 392
<210> 393
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1之輕鏈恆定區
<400> 393
<210> 394
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT IgG1之重鏈恆定區
<400> 394
<210> 395
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1
<400> 395
<210> 396
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 ECD
<400> 396
<210> 397
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接頭
<400> 397
<210> 398
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接頭
<400> 398
<210> 399
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接頭
<400> 399
<210> 400
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類PD-1 ECD
<400> 400
Claims (38)
- 一種分離的抗體或其抗原結合片段,其包含:(a)重鏈可變域(VH),其包含,i.重鏈CDR1,其包含選自由SEQ ID NO:71-82組成之群的胺基酸序列;ii.重鏈CDR2,其包含分別選自由SEQ ID NO:83-94組成之群的胺基酸序列,其中SEQ ID NO:87視情況經SEQ ID NO:95-97中之任一者置換;及iii.重鏈CDR3,其包含分別選自由SEQ ID NO:98-109組成之群的胺基酸序列;及(b)輕鏈可變域(VL),其分別包含,i.輕鏈CDR1,其包含選自由SEQ ID NO:110-121組成之群的胺基酸序列,其中SEQ ID NO:111視情況經SEQ ID NO:122置換,且SEQ ID NO:114視情況經SEQ ID NO:123置換;ii.輕鏈CDR2,其包含分別選自由SEQ ID NO:124-135組成之群的胺基酸序列;及iii.輕鏈CDR3,其包含分別選自由SEQ ID NO:136-147組成之群的胺基酸序列,其中該抗體或抗原結合片段能夠與PD-L1、較佳人類PD-L1特異性結合。
- 如申請專利範圍第1項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中:(1)該VH包含分別具有SEQ ID NO:75、87及102之胺基酸序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列,且該VL包含分別具有SEQ ID NO:114、128及140之胺基酸序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3,其中SEQ ID NO:87視情況經SEQ ID NO:95-97中之任一者置換,且SEQ ID NO:114視情況經SEQ ID NO:123置換;或 (2)該VH包含分別具有SEQ ID NO:72、84及99之胺基酸序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列,且該VL包含分別具有SEQ ID NO:111、125及137之胺基酸序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列,其中SEQ ID NO:111視情況經SEQ ID NO:122置換。
- 如申請專利範圍第4項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中:該VH包含分別具有SEQ ID NO:75、97及102之胺基酸序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列,且該VL包含分別具有SEQ ID NO:123、128及140之胺基酸序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
- 如申請專利範圍第4項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中該VH包含分別具有SEQ ID NO:72、84及99之胺基酸序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列,且該VL包含分別具有SEQ ID NO:122、125及137之胺基酸序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
- 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中該VH包含與選自由SEQ ID NO:1-44組成之群的序列至少90%一致的胺基酸序列,且該VL包含與分別選自由SEQ ID NO:45-70組成之群的序列至少90%一致的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第5項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中該VH包含SEQ ID NO:1-44中之任一者之胺基酸序列,或其在該VH中包含至多約3個胺基酸取代之變異體;且該VL包含SEQ ID NO:45-70中之任一者之胺基酸序列,或其在該VL中包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
- 如申請專利範圍第5項或第6項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中: (1)該VH包含選自由SEQ ID NO:5、13、14、15及21-44組成之群的胺基酸序列,且該VL包含選自由SEQ ID NO:49、58、62-64及68-70組成之群的胺基酸序列;或(2)該VH包含選自由SEQ ID NO:2及16-20組成之群的胺基酸序列,且該VL包含選自由SEQ ID NO:46、57、59-61及65-67組成之群的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第7項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中該VH包含SEQ ID NO:21、25、27或31之胺基酸序列,且該VL包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第7項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中該VH包含SEQ ID NO:16或19之胺基酸序列,且該VL包含SEQ ID NO:65之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中該VH融合至免疫球蛋白之重鏈恆定區。
- 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中該VL融合至免疫球蛋白之輕鏈恆定區(CL)。
- 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段與該PD-L1之間的結合之K D為10 -7M至約10 -12M,較佳約10 -8M至約10 -12M,更佳約10 -9M至約10 -12M。
- 如申請專利範圍第1項至第12項中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段,其為齧齒動物的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
- 如申請專利範圍第13項之分離的抗體,其進一步包含人類IgG1之恆定域。
- 如申請專利範圍第14項之分離的抗體,其包含SEQ ID NO:278-321及348-391中任一者之重鏈胺基酸序列以及SEQ ID NO:322-347中任一者之輕鏈胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項至第15項中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段,其進一步包含第二抗體部分,其中該第二抗體部分能夠與第二抗原特異性結合。
- 如申請專利範圍第16項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中該第二抗體部分為Fab、Fab'、(Fab') 2、Fv、單鏈Fv(scFv)、scFv-scFv、微抗體、雙抗體(diabody)、sdAb或抗體模擬物。
- 如申請專利範圍第16項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中該第二抗體部分為sdAb。
- 如申請專利範圍第16項至第18項中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中該第二抗體部分能夠與CTLA-4特異性結合,較佳地,該第二抗體部分為能夠與CTLA-4特異性結合的sdAb。
- 如申請專利範圍第16項至第18項中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中該第二抗體部分能夠與TIGIT特異性結合,較佳地,該第二抗體部分為能夠與TIGIT特異性結合的sdAb。
- 如申請專利範圍第16項至第18項中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中該第二抗體部分能夠與TIM-3特異性結合,較佳地,該第二抗體部分為能夠與TIM-3特異性結合的sdAb。
- 如申請專利範圍第16項至第18項中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中該第二抗體部分能夠與LAG-3特異性結合,較佳地,該第二抗體部分為能夠與LAG-3特異性結合的sdAb。
- 如申請專利範圍第19項至第22項中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中能夠特異性識別PD-L1的全長IgG之重鏈或輕鏈之胺基末端視情況經由肽接頭融合至能夠與CTLA-4、TIGIT、TIM-3或LAG-3特異性結合的該sdAb之羧基末端。
- 如申請專利範圍第19項至第22項中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中能夠特異性識別PD-L1的全長IgG之重鏈或輕鏈之羧基末端視情況經由肽接頭融合至能夠與CTLA-4、TIGIT、TIM-3或LAG-3特異性結合的該sdAb之胺基末端。
- 如申請專利範圍第23項或第24項之分離的抗體或其抗原結合片段,其中能夠特異性識別PD-L1的該全長IgG經由具有SEQ ID NO:397-399之一之胺基酸序列的肽接頭融合至能夠與CTLA-4、TIGIT、TIM-3或LAG-3特異性結合的該sdAb。
- 一種第二分離的抗體或其抗原結合片段,其能夠與如申請專利範圍第1項至第25項中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段競爭地與PD-L1特異性結合。
- 一種醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第1項至第25項中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段或如申請專利範圍第26項之第二分離的抗體或其抗原結合片段、及醫藥學上可接受之載劑。
- 如申請專利範圍第1項至第25項中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段、如申請專利範圍第26項之第二分離的抗體或其抗原結合片段或如申請專利範圍第27項之醫藥組成物,其用於治療有需要之受試者之PD-L1相關疾病。
- 如申請專利範圍第28項之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其中該PD-L1相關疾病為癌症。
- 如申請專利範圍第29項之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其中該癌症為實體腫瘤。
- 如申請專利範圍第29項之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其中該癌症為結腸癌。
- 如申請專利範圍第28項至第31項中任一項之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其與另外的癌症療法組合。
- 如申請專利範圍第32項之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其中該另外的癌症療法為手術、放射、化學療法、免疫療法、激素療法或其組合。
- 如申請專利範圍第28項之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其中該PD-L1相關疾病為病原性感染。
- 如申請專利範圍第28項至第34項中任一項之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其中該分離的抗體或抗原結合片段或醫藥組成物係用於全身或局部投與。
- 如申請專利範圍第28項至第34項中任一項之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其中該分離的抗體或抗原結合片段或醫藥組成物係用於靜脈內投與。
- 如申請專利範圍第28項至第34項中任一項之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其中該分離的抗體或抗原結合片段或醫藥組成物係用於腫瘤內投與。
- 如申請專利範圍第28項至第37項中任一項之供使用之分離的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物,其中該受試者為人類。
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