CN108239149B

CN108239149B - 高亲和力、高特异性、多抗原识别表位的具有更高功能性的抗人pd-l1抗体

Info

Publication number: CN108239149B
Application number: CN201611212480.3A
Authority: CN
Inventors: 殷刘松; 张贵斌; 蒋忻坡; 林峰; 覃喜建; 赵涛
Original assignee: Legend Biotech Ireland Ltd
Current assignee: Legend Biotech Ireland Ltd
Priority date: 2016-12-25
Filing date: 2016-12-25
Publication date: 2021-03-05
Anticipated expiration: 2036-12-25
Also published as: CN108239149A

Abstract

本发明公开了一种高亲和力、高特异性、多抗原识别表位的具有更高功能性的抗人PD‑L1抗体。该PD‑L1单克隆抗体能够特异性的与PD‑1结合，并且能够有效的阻断PD‑L1与PD‑1蛋白的结合，特异地解除PD‑L1的免疫负调节，激活T细胞分泌细胞因子。上述功能均达到目前唯一PD‑L1靶向药物Tecentriq(MPDL3280A)的水准，并且有部分抗体不同于Tecentriq的抗原表位，具有更大的多样性。其中有一株PD‑L1抗体可以促进PD‑L1与PD‑1蛋白的结合，但却仍然是解除PD‑L1的免疫负调节，激活T细胞分泌细胞因子。

Description

高亲和力、高特异性、多抗原识别表位的具有更高功能性的抗人PD-L1抗体

技术领域

本发明属于肿瘤免疫疗法和分子免疫学领域，具体涉及一种高亲和力、高特异性、多抗原识别表位的具有更高功能性的抗人PD-L1抗体。

背景技术

人类获得性免疫系统通过体液免疫(B细胞介导)和细胞免疫(T细胞介导)两大机制抵御外界感染和内部病发。T细胞作为免疫系统中的重要一员，在肿瘤免疫治疗中发挥着巨大的作用。从传统的细胞因子类药物到最近兴起的免疫检查点抑制剂治疗都是通过直接或间接的激活T细胞来达到消除肿瘤的目的(Esther et al,physiol,25(2):85-101,2010；Drew,Nature Reviews Cancer 12:252-264,2012)。

T细胞激活需要两级信号。第一级信号，也称为主要刺激信号，是通过TCR识别特异性MHC呈递的抗原来实现的。这种信号是抗原特异性的。激活T细胞的第二级刺激信号，也称为共刺激信号(Jennifer et al,Annu Rev Immunol,27:591-619,2009)。当然T细胞同时也会接受一些共抑制信号而抑制T细胞激活。这类免疫刺激或抑制性分子称作免疫检查点。免疫检查点疗法就是通过调节共刺激或共抑制信号来控制T细胞活性，让高活性的T细胞去杀伤肿瘤细胞从而达到治疗癌症的目的(Suzanne et.al,Cancer Cell 27(4):450-461,2015)。

程序性死亡受体1(PD-1)是一种重要的免疫抑制分子，属于T细胞调节因子CD28/PD-L1家族中的一员。目前已经有针对PD-1的抗体药物，包括默克在2014年上市的Keytruda和百时美施贵宝在2015年上市的Opdivo。目前两个抗体药物在2015年的销售额分别是5.66亿美元和9.42亿美元。

程序性死亡受体-配体1(PD-L1)是PD-1的配体之一(另一个配体是PD-L2)。PD-L1是大小约为40kDa的第一性跨膜蛋白和PD-1一样也是一个重要的免疫检查点分子。PD-L1和PD-1结合后会传导共抑制信号降低T细胞的活性和增生。研究发现正常的人体组织细胞不表达PD-L1，但该免疫检查点在多种肿瘤细胞表面却有大量表达。这些过表达的PD-L1会强烈的抑制T细胞对肿瘤的毒性从而促使肿瘤细胞逃脱T细胞监控和杀伤(Dong et al,NatMed；8:793-800,2002)。

而PD-L1单克隆抗体药物却能够特异性阻断PD-1和PD-L1的结合从而减弱或封闭PD-L1对T细胞负调节信号的传导，增强T细胞对各种抗原的免疫反应。目前PD-L1单克隆抗体药物已在临床试验阶段用于治疗多种人类癌症，包括非小细胞肺癌,黑色素瘤，结肠直肠癌,肾细胞癌，卵巢癌，前列腺癌，胃癌，乳腺癌(Julie et al.,N Engl Med 366:2455-2465,2012)。

2016年5月19日FDA批准了第一个PD-L1抗癌抗体药物的上市，它来自罗氏旗下基因泰克的PD-L1抗体atezolizumab(商品名Tecentriq)用于治疗晚期膀胱癌。这标志着该免疫检查点在肿瘤免疫疗法的临床阶段成功可行。而且，随着临床前实验验证针对不同免疫调节因子的单克隆抗体在协同治疗癌症方面的能力(Mace et al,Journal forImmunoTherapy of cancer 3:366,2015；Lussier et al,Journal for ImmunoTherapy ofCancer 3:21,2015),PD-L1单克隆抗体已与不同免疫抑制分子的单克隆抗体或者小分子化合物形成组合疗法在进行针对不同癌症的临床实验。

但目前上市的只有一种PD-L1单克隆抗体药物，而且免疫检查点类单克隆抗体在人体内也存在不同程度的副反应，包括可在某些患者中诱导免疫原性，过度抑制检查点信号可能引起自身免疫病(Claire et al,JAMA Oncol,2(10):1346-1353,2016)，以及不同PD-L1单克隆抗体会具有不同程度的可开发性。因此，尚需开发新的能够阻断PD-L1与PD-1蛋白结合的功能性抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种人PD-L1单克隆抗体及其应用。

本发明的另一目的在于提供上述人PD-L1单克隆抗体的编码基因。

本发明的又一目的在于提供上述人PD-L1单克隆抗体的制备方法。

本发明的又一目的在于提供一种抗肿瘤制剂。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种人PD-L1单克隆抗体，该单克隆抗体的蛋白序列含有重链可变区和轻链可变区，该单克隆抗体选自如下(1)～(5)中的任意一种：

(1)所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

(2)所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；

(3)所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；

(4)所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；

(5)所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列。

上述单克隆抗体的编码基因。该编码基因选自如下(6)～(10)中的任意一种：

(6)含有如SEQ ID NO：2所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ IDNO：4所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列；

(7)含有如SEQ ID NO：6所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ IDNO：8所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列；

(8)含有如SEQ ID NO：10所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ IDNO：12所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列；

(9)含有如SEQ ID NO：14所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ IDNO：16所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列；

(10)含有如SEQ ID NO：18所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ IDNO：20所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。

含有上述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

上述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备人PD-L1单克隆抗体中的应用。

一种制备人PD-L1单克隆抗体的方法，将包含上述编码基因的重组表达载体转染感受态细胞，并进行培养得到人PD-L1单克隆抗体。

本发明技术人员通过以下方法获得了克隆18B7F4G8,29A8H8C7,51F3D2G4,42G2D7C3,53C1F3D4的独特V-区域核苷酸/蛋白序列：

1)用重组表达的人PD-L1胞外区免疫小鼠，获得针对人PD-L1的免疫反应；

2)取步骤1)中小鼠的脾脏细胞进行融合，并对获得的杂交瘤细胞进行筛选，获得特异性识别人PD-L1，并且能够阻断PD-L1与PD-1蛋白结合的阳性母克隆；

3)对步骤2)中获得的阳性母克隆进行亚克隆，获得稳定的杂交瘤细胞株；

4)用步骤3)中获得的杂交瘤细胞株进行测序，获得抗体轻链和重链的可变区编码序列。

用步骤4)中获得的可变区编码序列进行重组抗体生产功能性人PD-L1单克隆抗体。

本发明所述的单克隆抗体能够特异性结合人PD-L1，能够阻断PD-L1与PD-1蛋白结合，并且能够解除PD-L1的免疫负调节，激活T细胞分泌细胞因子。

上述的功能性人PD-L1单克隆抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

一种抗肿瘤制剂，其包含上述的功能性人PD-L1单克隆抗体。

本发明的有益效果

本发明的PD-L1单克隆抗体能够特异性的与PD-L1结合，并且能够有效的阻断PD-L1与PD-1蛋白的结合，特异地解除PD-L1的免疫负调节，激活T细胞分泌细胞因子。上述功能均达到目前唯一PD-L1靶向药物Tecentriq(MPDL3280A)的水准，并且有部分抗体不同于Tecentriq的抗原表位，具有更大的多样性。其中有一株PD-L1抗体可以促进PD-L1与PD-1蛋白的结合，但却仍然是解除PD-L1的免疫负调节，激活T细胞分泌细胞因子。

附图说明

图1：免疫之后的鼠血清效价检测

图2：纯化单克隆抗体能够特异性结合人PD-L1重组蛋白

PD-L1抗体克隆与PD-L1-Fc重组蛋白结合ELISA实验，18B7F4G8:EC₅₀＝5.31ng/ml；29A8H8C7:EC₅₀＝4.98ng/ml；51F3D2G4:EC₅₀＝6.30ng/ml；42G2D7D3:EC₅₀＝4.58ng/ml；53C1F3D4:EC₅₀＝4.67ng/ml；MPDL3280A:EC₅₀＝6.20ng/ml。

图3：纯化单克隆抗体能够特异性结合表达人PD-L1的细胞系

PD-L1抗体克隆与表达PD-L1的CHO-K1/GLP1/Gα15稳定细胞结合(峰2)而不与母细胞CHO结合(峰1)。

图4：纯化单克隆抗体能够阻断PD-L1与PD-1蛋白的结合

重组蛋白PD-L1和重组蛋白PD-1的结合受到PD-L1抗体克隆的抑制。18B7F4G8这株对PD-L1和PD-1的结合有促进作用，29A8H8C7:IC₅₀＝0.39μg/ml；51F3D2G4:IC₅₀＝0.40μg/ml；42G2D7D3:IC₅₀＝0.48μg/ml；53C1F3D4:IC₅₀＝0.32μg/ml；MPDL3280A:IC₅₀＝0.23μg/ml。

图5：纯化单克隆抗体能够解除PD-L1的免疫负调节，刺激T细胞分泌白介素2

A.CD⁴⁺T细胞及同种异体的树突细胞共培养，在共培养系统中加入不同浓度的PD-L1抗体克隆，PD-L1抗体克隆阻断表达在CD4+T细胞上的PD-1和表达在树突细胞上的PD-Ll的结合，导致T细胞的激活，IL-2分泌增加。18B7F4G8:EC₅₀＝0.3594μg/ml；29A8H8C7:EC₅₀＝0.1007μg/ml；51F3D2G4:EC₅₀＝0.2094μg/ml；42G2D7D3:EC₅₀＝0.2346μg/ml；53C1F3D4:EC₅₀＝0.09474μg/ml；MPDL3280A:EC₅₀＝0.05154μg/ml。

B.表达PD-1的效用细胞与表达PD-L1的靶细胞共培养，相对光单位(RLU)用来衡量效用细胞激活的指标。在共培养系统中加入不同浓度的PD-L1抗体克隆，PD-L1抗体克隆阻断表达在效用细胞上PD-1和表达在靶细胞上的PD-Ll的结合，导致效用细胞的激活，RLU读数增加。18B7F4G8:EC₅₀＝0.3595μg/ml；29A8H8C7:EC₅₀＝0.7511μg/ml；51F3D2G4，EC₅₀＝0.8830μg/ml；42G2D7D3:EC₅₀＝1.170μg/ml；53C1F3D4:EC₅₀＝0.5762μg/ml；MPDL3280A:EC₅₀＝0.6229μg/ml。

具体实施方式

本发明涉及一种具有功能性的人PD-L1抗体，下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义相同。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。

实施例1：人PD-L1杂交瘤细胞株的获得以及单克隆抗体的制备

1)动物免疫

抗原采用融合至人IgG1 Fc段的人PD-L1胞外结构域的重组蛋白PD-L1-Fc(GenScript，Z03371)。用含50μg PD-L1-Fc融合蛋白的200μl弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich)的1:1乳液皮下免疫雌性Balb/c和C57bl/6小鼠。随后，每二周腹腔/皮下交替注射含25μg PD-L1-Fc的弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich)的1:1乳液最多达3次，从而对小鼠进行加强免疫。10只小鼠血清效价在三免之后均达到10⁵以上。骨髓瘤融合前4天，表现出最高抗体滴度(图1)的两只小鼠(848号和853号)接受了25μg PD-L1-Fc(不含佐剂)的腹腔加强免疫。

2)杂交瘤融合和筛选

提取脾脏并进行均质化以产生单细胞悬液，同时准备骨髓瘤细胞(SP2/0)单细胞悬液。使用电融合将8.9×10⁷个脾细胞与4.1×10⁷个SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合。将融合的细胞重悬于100ml含杂交瘤细胞选择剂胸腺核苷嘧啶，次黄嘌呤和氨基喋呤的DMEM/10％FBS培养基中，并用移液管以100μl的体积移至50×96孔板中。将板在37℃下在6％CO₂中孵育。7天的孵育之后，开始使用下文所述的ELISA结合，ELISA竞争和FACS结合来测试针对PD-L1-Fc的抗体的存在情况。

ELISA结合检测方法：间接ELISA用于评估上清液中抗体对于PD-L1-Fc的结合能力。将ELISA板(Nunc)用100μl/孔的PBS中0.5μg/ml的重组PD-L1-Fc或人IgG1在4℃下包被过夜。用PBS-T(0.05％吐温)洗涤板，并将其用200μl/孔的含1％BSA的PBST在37℃封闭0.5小时。随后弃去封闭液，向每个板加入100μl杂交瘤细胞培养上清液，然后在室温下孵育1小时。将板用PBST洗涤三次，并用100μl/孔的缀合辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(Fab-特异性)(GenScript)37℃孵育0.5小时。将板用PBST洗涤五次，然后加入TMB显色液(GenScript)并在室温下在黑暗中孵育15分钟。通过加入50μl的1MHCl终止液(Sigma)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。

ELISA竞争检测方法：竞争法ELISA被用于评估上清液中的抗体对于PD-L1和其配体PD-1蛋白的结合的阻断能力。将ELISA板(Nunc)用100μl/孔的PBS中0.5μg/ml的重组人PD-1蛋白在4℃下包被过夜。用PBS-T(0.05％吐温)洗涤板，并将其用200μl/孔的含1％BSA的PBST在37℃封闭0.5小时。随后弃去封闭液，每个测试孔加入50μl待测上清液，对照孔加入50μl无关上清液。然后每孔添加50μl生物素标记的PD-L1-Fc(浓度为0.15μg/ml)，在37℃孵育1小时。将板用PBST洗涤三次，并用100μl/孔的抗生物素蛋白链菌素HRP(SA-HRP，GenScript)37℃孵育10分钟。最后将板用PBST洗涤五次，然后加入TMB显色液(GenScript)并在室温下在黑暗中孵育15分钟。通过加入50μl的1MHCl终止液(Sigma)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。

FACS检测方法：FACS结合实验被用于评估上清液中的抗体对于CHO细胞膜表面表达的PD-L1的结合能力。收集用于检测的表达PD-L1的CHO细胞和阴性对照的母细胞，用PBS清洗3次。在96孔板中加入2.5X10⁵个检测细胞和待测上清液100ul，4℃孵育1小时。随后用PBS清洗细胞3次，添加100μliFluor标记的山羊抗小鼠IgG，4℃孵育45分钟。最后用PBS清洗细胞3次，用FACS BD Calibur读取信号。

3)杂交瘤亚克隆

使用有限稀释法进行亚克隆。使用血球细胞计数器并在含杂交瘤细胞选择剂胸腺核苷嘧啶，次黄嘌呤和氨基喋呤的DMEM/10％FBS培养基中对细胞进行系列稀释来确定细胞数量，直至细胞密度达到5-15个细胞/ml。对于每个杂交瘤，将200μl的细胞溶液用移液管移至96孔中，密度为1-3个细胞/孔。将培养物在37℃下在5％CO₂中培养1周后，对上清液进行上述ELISA结合，ELISA竞争和FACS结合测试，来评估针对PD-L1-Fc的抗体的存在情况。

实施例2：单克隆抗体的可变区测序及抗体重组生产

使用快速ELISA小鼠抗体亚型鉴定试剂盒(Clonotyping System-HRP，SouthernBiotech)对单克隆抗体进行亚型鉴定后，使用TRIzol(Ambion)从3×10⁶-5×10⁶个杂交瘤细胞提取总RNA，并利用抗体亚型特异性引物和通用引物(PrimeScript^TM 1stStrandcDNA Synthesis Kit，Takara)将其逆转录为cDNA。随后通过RACE PCR(GenScript)扩增鼠免疫球蛋白重链和轻链V-区域片段，并将所得的PCR片段亚克隆至pMD18-T载体系统(Takara)中，并使用载体特异性引物对插入片段进行测序。最终获得了克隆18B7F4G8,29A8H8C7,51F3D2G4,42G2D7C3,53C1F3D4的独特V-区域核苷酸/蛋白序列。

序列信息：

18B7F4G8重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO:1

18B7F4G8重链可变区DNA序列：SEQ ID NO:2

18B7F4G8轻链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO:3

18B7F4G8轻链可变区DNA序列：SEQ ID NO:4

29A8H8C7重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO:5

29A8H8C7重链可变区DNA序列：SEQ ID NO:6

29A8H8C7轻链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO:7

29A8H8C7轻链可变区DNA序列：SEQ ID NO:8

51F3D2G4重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO:9

51F3D2G4重链可变区DNA序列：SEQ ID NO:10

51F3D2G4轻链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO:11

51F3D2G4轻链可变区DNA序列：SEQ ID NO:12

42G2D7C3重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO:13

42G2D7C3重链可变区DNA序列：SEQ ID NO:14

42G2D7C3轻链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO:15

42G2D7C3轻链可变区DNA序列：SEQ ID NO:16

53C1F3D4重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO:17

53C1F3D4重链可变区DNA序列：SEQ ID NO:18

53C1F3D4轻链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO:19

53C1F3D4轻链可变区DNA序列：SEQ ID NO:20

分别合成包含轻链可变区+恒定区与重链可变区+恒定区的DNA片段，将其分别插入pTT5表达载体中，形成表达质粒。

将上述质粒共转染HEK293-6E细胞，并于37℃摇瓶中培养10天后，收取上清用于抗体纯化。纯化之前，将管道和蛋白A柱用0.2M NaOH去热原。将柱用含有0.05M Tris和1.5MNaCl(pH8.0)的缓冲液重新平衡。随后将收获的细胞培养物上清液，使用2×上述缓冲液1:1稀释并过滤除菌。将过滤的上清液和蛋白A柱室温孵育2小时，用并1×上述缓冲液洗涤柱后，使用无菌0.1M柠檬酸钠(pH3.5)洗脱IgG，收集了洗脱液并用九分之一体积的无菌1MTris-HCl(pH9)中和。在无菌条件下，将所述产品缓冲液交换为PBS(pH7.4)以除去任何的洗脱缓冲液并浓缩所述样品。浓缩之后，使用1.43的消光系数Ec(0.1％)通过OD280nm对抗体进行定量。

纯化的抗体通过BioRad电泳系统用10％预制胶(GenScript)通过SDS-PAGE来分析。将所述凝胶用Estain2.0(GenScript)染色并通过比较染色带与Protein Ladder(GenScript)来估计分子大小和纯度。

实施例3：单克隆抗体对人PD-L1重组蛋白的结合

间接ELISA用于评估纯化抗体对于PD-L1-Fc的结合能力。将ELISA板(Nunc)用100μl/孔的PBS中0.5μg/ml的重组PD-L1-Fc或人IgG1在4℃下包被过夜。用PBS-T(0.05％吐温)洗涤板，并将其用200μl/孔的含1％BSA的PBST在37℃封闭0.5小时。随后弃去封闭液，向首孔加入10μg/ml的纯化抗体100μl，并按照3倍梯度稀释，共计11个测试浓度梯度。然后在室温下孵育1小时。将板用PBST洗涤三次，并用100μl/孔的缀合辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(Fab-特异性)(GenScript)37℃孵育0.5小时。将板用PBST洗涤五次，然后加入TMB显色液(GenScript)并在室温下在黑暗中孵育15分钟。通过加入50μl的1MHCl终止液(Sigma)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。如图2，各克隆的EC50如下：18B7F4G8:EC₅₀＝5.31ng/ml；29A8H8C7:EC₅₀＝4.98ng/ml；51F3D2G4:EC₅₀＝6.30ng/ml；42G2D7D3:EC₅₀＝4.58ng/ml；53C1F3D4:EC₅₀＝4.67ng/ml；MPDL3280A:EC₅₀＝6.20ng/ml.与MPDL3280A相比，这些测试的克隆均接近或超过到其抗原结合能力。

实施例4：单克隆抗体对表达人PD-L1的细胞系的结合

收集用于检测的表达PD-L1的CHO细胞和阴性对照的母细胞，用PBS清洗3次。在96孔板中加入2.5X10⁵个检测细胞和5μg/ml纯化抗体100ul，4℃孵育1小时。随后用PBS清洗细胞3次，添加100μliFluor标记的山羊抗小鼠IgG，4℃孵育45分钟。最后用PBS清洗细胞3次，用FACS BD Calibur读取信号。如图3，所有图中克隆和细胞系的结合都表现出很强的结合能力，FACS偏移都在2个log甚至以上。

实施例5：单克隆抗体阻断PD-L1与PD-1蛋白的结合

将ELISA板(Nunc)用100μl/孔的PBS中0.5μg/ml的重组人PD-1蛋白在4℃下包被过夜。用PBS-T(0.05％吐温)洗涤板，并将其用200μl/孔的含1％BSA的PBST在37℃封闭0.5小时。随后弃去封闭液，首个测试孔加入50μg/ml待测纯化抗体50μl，并按照3倍梯度稀释，共计11个测试浓度梯度。然后每孔添加50μl生物素标记的PD-L1-Fc(浓度为0.15μg/ml)，在37℃孵育1小时。将板用PBST洗涤3次，并用100μl/孔的抗生物素蛋白链菌素HRP(SA-HRP，GenScript)37℃孵育10分钟。最后将板用PBST洗涤5次，然后加入TMB显色液(GenScript)并在室温下在黑暗中孵育15分钟。通过加入50μl的1MHCl终止液(Sigma)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。如图4，各克隆的IC₅₀如下，29A8H8C7：IC₅₀＝0.39μg/ml；51F3D2G4:IC₅₀＝0.40μg/ml；42G2D7D3:IC₅₀＝0.48μg/ml；53C1F3D4:IC₅₀＝0.32μg/ml；MPDL3280A,IC₅₀＝0.23μg/ml；有4株克隆的阻断能力非常接近阳性药MPDL3280A.但是18B7F4G8这株对PD-L1和PD-1的结合确具有促进作用。

实施例6：单克隆抗体表位鉴定

竞争ELISA用于评估纯化抗体的抗原表位。将ELISA板(Nunc)用100μl/孔的PBS中0.5μg/ml的重组PD-L1-Fc在4℃下包被过夜。用PBS-T(0.05％吐温)洗涤板，并将其用200μl/孔的含1％BSA的PBST在37℃封闭0.5小时。随后弃去封闭液，每孔分别加入一对(其中一个已标记生物素)用于竞争实验的待测抗体，每个纯化抗体100μl(10μg/ml)。然后在37℃下孵育1小时。将板用PBST洗涤3次，并用100μl/孔的抗生物素蛋白链菌素HRP(SA-HRP，GenScript)37℃孵育10分钟。将板用PBST洗涤五次，然后加入TMB显色液(GenScript)并在室温下在黑暗中孵育15分钟。通过加入50μl的1MHCl终止液(Sigma)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。克隆18B7F4G8,51F3D2G4,42G2D7D3是同一个表位(表位1)，与阳性对照药MPDL3280A是不同的表位，而53C1F3D4与阳性药表位相同(表位2)，29A8H8C7同时覆盖表位1和表位2。

实施例7：单克隆抗体的功能性检测

在混合淋巴细胞反应中，通过试剂盒(Miltenyl Biotec)，从人的外周血单核细胞分离并纯化获得CD⁴⁺T细胞及同种异体的单核细胞。诱导单核细胞成为树突细胞。每孔含有10⁵个CD⁴⁺T细胞及10⁴个同种异体的单核细胞，最终工作体积是200μl。不同浓度的抗体样品加入到每个孔内。无抗体孔作为背景对照，人IgG4抗体作为阴性对照，MPDL3280A作为PD-L1抗体的阳性对照。37℃及5％CO₂条件下，孵育72小时后，从每孔中取100μl上清检测IL-2含量(Cisbio的检测试剂盒)。

如图5：在细胞水平的抗体功能性检测实验中，人的PD-1及由NFAT核转录反应元件(NFAT-RE)控制的荧光报告基因稳定转染在效用细胞中，人的PD-L1及细胞表面蛋白抗原多肽/主要组织相容性复合体(MHC)稳定转染在靶细胞中作为人为的抗原提呈细胞，表达PD-1的效用细胞与表达PD-L1的靶细胞共培养，相对光单位(RLU)用来衡量效用细胞激活的指标。在共培养系统中加入不同浓度的PD-L1抗体克隆，PD-L1抗体克隆阻断表达在效用细胞上PD-1和表达在靶细胞上的PD-Ll的结合，导致效用细胞的激活，RLU读数增加。与MPDL3280A相比，这些测试的克隆均接近或超过到其功能。

实施例8：单克隆抗体的亲和力测定

以10μl/min流速的HBS-EP缓冲液平衡芯片表面5min，随后以10μl/min的流速注射“NHS+EDC”的1：1混合液7mim来活化芯片，将稀释在10mM醋酸钠缓冲液中的捕获抗体(Goatanti-mouse IgG)以10μl/min流速注射约7min进行耦联，最后以10μl/min的流速注射乙醇胺7min进行表面封闭。

以HBS-EP缓冲液作为样品进行三个预循环来平衡芯片使基线稳定，10μl/min流速注射稀释在HBS-EP缓冲液中的抗体0～5min(通过调整捕获时间来控制抗体和抗原结合信号在～100RU)，缓冲液平衡1min。以30μl/min流速注射低浓度抗原0.33nMPD-L1-Fc 5min，抗原与抗体发生结合，之后30μl/min流速注射缓冲液15min进行解离，100μl/min流速注射50mMHCl共四次，每次10s进行再生，一次循环结束。改变抗原浓度(如1nMPD-L1-Fc)进行下一个梯度浓度的循环测定直到所有梯度浓度(0.33nM、1nM、3nM、9nM、27nMPD-L1-Fc)及重复浓度(如9nMPD-L1-Fc)测定结束。

实验数据经过双扣减(对照通道及零浓度)后，在Biacore T200 evaluationsoftware中进行“1:1Binding”模型的拟合。使用Biacore T200测定抗体针对PD-L1-Fc重组蛋白的亲和力。如表1所示，PD-L1抗体克隆的对PD-L1的亲和力由Biacore测得均达到sub-nM级至pM级。Tecentriq的亲和力为1.62E-10,克隆18B7F4G8,29A8H8C7和51F3D2G4的亲和力明显高于PD-L1的上市药品。

表1纯化单克隆抗体的亲和力测定

SEQUENCE LISTING

<110> 南京金斯瑞生物科技有限公司

<120> 高亲和力、高特异性、多抗原识别表位的具有更高功能性的抗人PD-L1抗体

<130> 2016

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 18B7F4G8 重链可变区氨基酸序列

<400> 1

Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Cys Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Ile

1 5 10 15

Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro

20 25 30

Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr

35 40 45

Ser Gly Tyr Thr Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro

65 70 75 80

Ser Leu Lys Ser Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln

85 90 95

Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Met Thr Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Asn Ser Leu Phe Ala Ser Trp Gly His Gly Thr Leu

115 120 125

Val Thr Val Ser Ala

130

<210> 2

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 18B7F4G8 重链可变区DNA序列

<400> 2

atgagagtgc tgattctttt gtgcctgttc acagcctttc ctggtatcct gtctgatgtg 60

cagcttcagg agtcaggacc tgacctggtg aaaccttctc agtcactttc actcacctgc 120

actgtcactg gctactccat caccagtggt tatacctggc actggatccg gcagtttcca 180

ggaaacaaac tggaatggat gggctacata cactacagtg gttccactaa gtacaaccca 240

tctctcaaaa gtcgattctc tatcactcga gacacatcca agaaccagtt cttcctgcag 300

ttgaattcta tgactgctga ggacacagcc acatattact gtgcaagaaa ctccctgttt 360

gcttcctggg gccacgggac tctggtcact gtctctgca 399

<210> 3

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 18B7F4G8 轻链可变区氨基酸序列

<400> 3

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser

35 40 45

Val Asp Thr Tyr Gly Asp Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Asn Glu Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys

130

<210> 4

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 18B7F4G8 轻链可变区DNA序列

<400> 4

atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60

gacattgtgc tgacccaatc tccagcctct ttggctgtgt ctctggggca gagggccacc 120

atatcctgca gagccagtga aagtgttgat acttatggcg atagttttat gcactggttt 180

cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctacc gtgcatccaa cctagaatct 240

gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 300

cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggctccgtac 360

acgttcgggg gggggaccaa gctggaaata aaa 393

<210> 5

<211> 138

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 29A8H8C7重链可变区氨基酸序列

<400> 5

Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Ile

1 5 10 15

Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Gly Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro

20 25 30

Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr

35 40 45

Ser Asp Phe Ala Trp Asp Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly His Ile Arg Phe Ser Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Pro

65 70 75 80

Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln

85 90 95

Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Leu Ile Thr Lys Gly Phe Phe Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 6

<211> 414

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 29A8H8C7重链可变区DNA序列

<400> 6

atgagagtgc tgattctttt gtggctgttc acagcctttc ctggtatcct gtctgatgtg 60

cagcttcagg ggtcgggacc tggcctggtg aaaccttctc agtctctgtc cctcacctgc 120

actgtcactg gctactcaat caccagtgat tttgcctggg actggatccg gcagtttcca 180

ggaaacaaac tggagtggat gggccacata cgattcagtg gtactactag ctacaaccca 240

tctctcaaaa gtcgaatctc tatcactcga gacacatcca agaaccagtt cttcctgcag 300

ttgaattctg tgacttctga ggacacagcc acatattact gtgcaaggtc tactttgatt 360

actaaaggtt tttttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 414

<210> 7

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 29A8H8C7轻链可变区氨基酸序列

<400> 7

Met Glu Ser Gln Ile Gln Ala Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser

1 5 10 15

Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser

20 25 30

Thr Ser Val Gly Gly Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp

35 40 45

Val Ser Pro Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Val Gln Thr Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr

100 105 110

Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

<210> 8

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 29A8H8C7轻链可变区DNA序列

<400> 8

atggagtcac agattcaggc atttgtattc gtgtttctct ggctgtctgg tgttgacgga 60

gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggagg cagggtcagc 120

atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt cctgctgtag cctggtatca acaaaaacca 180

ggacaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 240

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag tgtgcagact 300

gaagacctgg cactttatta ctgtcagcaa cattatagca ctccgtggac gttcggtgga 360

ggcaccaagc tggaaatcaa a 381

<210> 9

<211> 138

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 51F3D2G4重链可变区氨基酸序列

<400> 9

Met Glu Trp Ile Trp Ile Ile Leu Phe Ile Leu Ser Gly Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe

35 40 45

Thr Gly Tyr Gly Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Phe Pro Arg Thr Ala Asn Thr Tyr Phe Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Tyr Asp Pro Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 10

<211> 414

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 51F3D2G4重链可变区DNA序列

<400> 10

atggaatgga tctggatcat tctcttcatc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccaatcccag 60

gttcagttgc agcagtctgg agctgagctg gcgaggcctg gggcttcagt gcggctgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacat cttcacaggc tatggtataa gttgggtgaa acagagaact 180

ggacagggcc ttgagtggat tggagagatt tttcctagaa ctgctaatac ttacttcaat 240

gagaagttca agggcaaggc cacgctgact gcagacaaat cctccagcac agcgtacatg 300

gagctccgca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcaag agattacgac 360

ccttactatg ctttggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 414

<210> 11

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 51F3D2G4轻链可变区氨基酸序列

<400> 11

Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe

1 5 10 15

Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His

20 25 30

Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys

35 40 45

Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr

85 90 95

Phe Thr Ile Ser Ser Glu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln His Tyr Ser Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys

130

<210> 12

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 51F3D2G4轻链可变区DNA序列

<400> 12

atgggcatca aaatggagtc acagattcag gtctttgtat tcgtgtttct ctggttgtct 60

ggtgttgacg gagacattgt gatgacccag tctcacaaat tcatgtccac atcagtagga 120

gacagggtca ccatcacctg caaggccagt caggatgtga gtactgctgt agactggtat 180

caacagaaac caggacaatc tcctaaacta ctgatttact cggcatccta ccggtacact 240

ggagtccctg atcgcttcac tggcagtgga tctgggacgg ctttcacttt caccatcagc 300

agtgagcagg ctgaagacct ggcagtttat tactgtcagc aacattatag tgttccgttc 360

acattcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 393

<210> 13

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 42G2D7C3重链可变区氨基酸序列

<400> 13

Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Phe

1 5 10 15

Leu Ser Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro

20 25 30

Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr

35 40 45

Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Asn Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Ser Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Asn Asp Tyr Asn Pro

65 70 75 80

Ser Leu Gln Asp Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln

85 90 95

Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Ile

115 120 125

Val Ser Ser

130

<210> 14

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 42G2D7C3重链可变区DNA序列

<400> 14

atgaaagtgt tgagtctgtt gtacctgttg acagccattc ctggtttcct gtctgatgtg 60

cagcttctgg agtcaggacc tggcctcgtg aaaccttctc agtctctgtc tctcacctgc 120

tctgtcactg gttactccat caccagtggt tattactgga actggatccg gcaatttcca 180

ggaaacaatc tggaatggat gggctccata aactacgatg gtagcaatga ctacaaccca 240

tctctccaag atcgaatctc catcactcgt gacacatcta agaaccagtt tttcctgaag 300

ttgaattctg tgactactga ggacacagcc acatattact gtgcaagaag actcgactac 360

tggggccaag gcaccactct catagtctcc tca 393

<210> 15

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 42G2D7C3轻链可变区氨基酸序列

<400> 15

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile

20 25 30

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser

35 40 45

Ser Phe Ile Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser

50 55 60

Pro Lys Pro Trp Ile Leu Arg Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr

100 105 110

His Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

115 120 125

<210> 16

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 42G2D7C3轻链可变区DNA序列

<400> 16

atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cattatgtcc 60

agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gctatcatgt ctgcatctcc aggggagaag 120

gtcaccatat cctgcagtgc cagctcattt ataaattaca tgtactggta ccagcagaag 180

ccaggatcct cccccaaacc ctggattctt cgcacatcca ccctggcttc tggagtccct 240

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 300

gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtatcata gttacccact cacgttcggt 360

gctgggacca agctggagct gaaa 384

<210> 17

<211> 138

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 53C1F3D4重链可变区氨基酸序列

<400> 17

Met Glu Trp Ile Trp Ile Ile Leu Phe Ile Leu Ser Gly Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Asn Glu Leu Ala Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe

35 40 45

Thr Gly Tyr Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Phe Pro Arg Arg Val Asn Thr Tyr Tyr Ser

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Tyr Asp Pro Tyr Phe Ala Leu Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 18

<211> 414

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 53C1F3D4重链可变区DNA序列

<400> 18

atggaatgga tctggatcat tctcttcatc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccaatcccag 60

gttcagttgc agcagtctgg aaatgaactg gcgaggcctg gggcttcagt gcggctgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacat tttcacaggc tatggtataa cctgggtgag acagagacct 180

ggacagggcc ttgagtggat tggagagatt tttcctagac gtgttaatac ttactacagt 240

gagaagttca agggcagggc cacgctgact gcagacatat cctccagcac agcttacatg 300

gagctccgca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcaag agattacgac 360

ccttactttg ctttggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 414

<210> 19

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 53C1F3D4轻链可变区氨基酸序列

<400> 19

Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe

1 5 10 15

Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His

20 25 30

Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys

35 40 45

Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr

85 90 95

Phe Thr Ile Ser Gly Glu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys

130

<210> 20

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 53C1F3D4轻链可变区DNA序列

<400> 20

atgggcatca aaatggagtc acagattcag gtctttgtat tcgtgtttct ctggttgtct 60

ggtgttgacg gagacattgt gatgacccag tctcacaaat tcatgtccac atcagtagga 120

gacagggtca gcatcacctg caaggccagt caggatgtga gtactgctgt agactggtat 180

caacagaaac caggtcaatc tcctaaacta ctgatttact cggcatccta ccggtacact 240

ggagtccctg atcgcttcac tggcagtgga tctgggacgg ctttcacttt caccatcagc 300

ggtgagcagg ctgaagacct ggcagtttat tactgtcagc aacattatag tattcccttc 360

acattcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 393

Claims

1.一种人PD-L1单克隆抗体，其特征在于：该单克隆抗体的蛋白序列含有重链可变区和轻链可变区，该单克隆抗体选自如下（1）~（5）中的任意一种：

（1）所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

（2）所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；

（3）所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；

（4）所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；

（5）所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述单克隆抗体的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于该编码基因选自如下（6）~（10）中的任意一种：

（6）含有如SEQ ID NO：2所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ IDNO：4所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列；

（7）含有如SEQ ID NO：6所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ IDNO：8所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列；

（8）含有如SEQ ID NO：10所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ IDNO：12所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列；

（9）含有如SEQ ID NO：14所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ IDNO：16所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列；

（10）含有如SEQ ID NO：18所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ IDNO：20所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。

4.含有权利要求3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备人PD-L1单克隆抗体中的应用。

6.一种制备人PD-L1单克隆抗体的方法，其特征在于将包含权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体转染感受态细胞，并进行培养得到人PD-L1单克隆抗体。

7.权利要求1所述的人PD-L1单克隆抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为非小细胞肺癌, 黑色素瘤，结肠直肠癌, 肾细胞癌，卵巢癌，前列腺癌，胃癌，乳腺癌或膀胱癌。

9.一种抗肿瘤制剂，其特征在于：其包含权利要求1所述的人PD-L1单克隆抗体。

10.根据权利要求9所述的抗肿瘤制剂，其特征在于，所述的肿瘤为非小细胞肺癌, 黑色素瘤，结肠直肠癌, 肾细胞癌，卵巢癌，前列腺癌，胃癌，乳腺癌或膀胱癌。