CN109232738B - 一种抗人ox40单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种抗人ox40单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种多抗原识别表位的抗人OX40抗体，本发明的OX40单克隆抗体能够特异性的与人OX40的多种表位结合，并且能够刺激或抑制OX40下游通路，激活或抑制T细胞分泌细胞因子。

Description

一种抗人OX40单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于肿瘤免疫疗法和分子免疫学领域，具体涉及一种高亲和力、高特异性、多抗原识别表位的具有更高功能性的抗人OX40抗体。
背景技术
在肿瘤治疗中，肿瘤免疫治疗被广泛运用，它已成为肿瘤治疗的一个最重要的手段。免疫系统是一种宿主防御系统，为了正常地发挥作用，免疫系统必须能够灵敏的检测到外来病原体的入侵，并将它们与生物体自身的健康组织区分开来。癌变是正常体细胞失去正常细胞调节功能，基因突变累计到一定程度的结果肿瘤免疫治疗通过增强人体的免疫功能，使人体T细胞能更好的识别癌变细胞，从而起到杀伤癌细胞的作用。
脊椎动物的免疫系统是一个由多种器官、组织、细胞和分子组成的功能性系统，是机体防卫外源物入侵的最有效的机制，这些免疫器官、组织、细胞和分子相互协作，相互制衡，从而达到保护机体免受外来侵染和维持体内平衡的作用，这种相互协作，相互制衡需要众多免疫检查点蛋白的协调，刺激性免疫检查点蛋白增强免疫系统的防御反应，抑制性免疫检查点蛋白控制过强的免疫系统，防止产生自身免疫反应。对抑制性免疫检查点，如PD-1和CTLA-4，的研究比较多，抑制性免疫检查点蛋白像是表达在T细胞上的刹车，用抗体介导的对抑制性免疫检查点蛋白的拮抗作用去松开这个刹车，达到增强T细胞的杀死肿瘤细胞的功能。然而，对绝大多数的癌症患者，仅仅对抑制性免疫检查点蛋白进行调控是不足于消除肿瘤的，要增强T细胞的杀死肿瘤细胞的功能，不仅要松开T细胞上的刹车，还要对T细胞上的油门踩一下，T细胞上的油门就是刺激性免疫检查点蛋白，如4-1BB和OX40。刺激性免疫检查点蛋白给免疫系统一个通行证，促进了辅助性CD4+T细胞和细胞毒性CD8+ T细胞的扩增，提升了免疫系统抗肿瘤的能力。细胞免疫是通过T细胞受体（TCR）识别抗原呈递细胞（APC）上主要组织相容性复合体（MHC）呈递的抗原来引起的，这是T细胞激活的第一级信号，然而，T细胞激活并不是仅仅由第一级信号作用就能完成的，还需要第二级信号，T细胞的第二级信号是抗原非依赖性的，T细胞激活的第二级信号来自与其细胞表面的受体或配体与在APC上表达的相应的协同刺激因子相互作用后的信号。在研发免疫检查点蛋白的治疗性药物时，对刺激性免疫检查点蛋白，要研制激动剂或刺激性抗体，对抑制性免疫检查点蛋白，要研制抑制剂或抑制性抗体。
OX40 (CD134; TNFRSF4) 表达于活化的T细胞表面, 在自然杀伤细胞 （NK），自然杀伤T细胞（NKT），和中性粒细胞上也有表达。OX40（CD134）及其配体OX40L（CD252）同属于肿瘤坏死因子超家族成员, 与4-1BB，CD27, CD40，GITR等等同属于一个大家族。OX40/OX40L是第二级共刺激免疫检查点分子，参与了T细胞的活化、增殖以及存活的过程，对生发中心的形成和树突状细胞的分化成熟起到关键性作用。本发明提供对OX40的刺激性抗体，增强T细胞对各种抗原的免疫反应来进行肿瘤免疫治疗，另外，本发明提供对OX40的抑制性抗体，可以用来抑制T细胞的功能，从而来治疗自身免疫性疾病。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗人OX40单克隆抗体及其应用。
本发明的另一目的在于提供上述抗人OX40单克隆抗体的编码基因。
本发明的又一目的在于提供上述抗人OX40单克隆抗体的制备方法。
本发明的又一目的在于提供上述抗人OX40单克隆抗体的应用。
本发明的又一目的在于提供一种包含上述抗人OX40单克隆抗体的抗肿瘤和抗自身免疫性疾病的制剂。
本发明的又一目的在于提供一种包含上述抗人OX40单克隆抗体的检测肿瘤和自身免疫性疾病的检测试剂。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种抗人OX40单克隆抗体，该单克隆抗体的蛋白序列含有重链可变区和轻链可变区，该单克隆抗体选自如下（1）~（11）中的任意一种：
（1）所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
（2）所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；
（3）所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；
（4）所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；
（5）所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列。
（6）所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列；
（7）所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列；
（8）所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列；
（9）所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列；
（10）所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列。
（11）所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列。
上述单克隆抗体的编码基因。
上述的编码基因选自如下（12）~（22）中的任意一种：
（12）含有如SEQ ID NO：2所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的寡聚核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：4所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的寡聚核苷酸序列；
（13）含有如SEQ ID NO：6所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的寡聚核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：8所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的寡聚核苷酸序列；
（14）含有如SEQ ID NO：10所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的寡聚核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：12所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的寡聚核苷酸序列；
（15）含有如SEQ ID NO：14所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的寡聚核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：16所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的寡聚核苷酸序列；
（16）含有如SEQ ID NO：18所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的寡聚核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：20所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的寡聚核苷酸序列；
（17）含有如SEQ ID NO：22所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的寡聚核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：24所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的寡聚核苷酸序列；
（18）含有如SEQ ID NO：26所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的寡聚核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：28所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的寡聚核苷酸序列；
（19）含有如SEQ ID NO：30所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的寡聚核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：32所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的寡聚核苷酸序列；
（20）含有如SEQ ID NO：34所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的寡聚核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：36所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的寡聚核苷酸序列；
（21）含有如SEQ ID NO：38所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的寡聚核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：40所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的寡聚核苷酸序列；
（22）含有如SEQ ID NO：42所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的寡聚核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：44所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的寡聚核苷酸序列。
含有上述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
上述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗人OX40单克隆抗体中的应用。
一种制备抗人OX40单克隆抗体的方法，将包含上述编码基因的重组表达载体转染真核表达细胞，并进行培养得到抗人OX40单克隆抗体。
上述的抗人OX40单克隆抗体在制备抗肿瘤或抗自身免疫性疾病的药物中的应用。
一种抗肿瘤或抗自身免疫性疾病的制剂，其包含上述的抗人OX40单克隆抗体。
上述的抗人OX40单克隆抗体在制备检测肿瘤或自身免疫性疾病的检测试剂中的应用。
一种检测肿瘤或自身免疫性疾病的检测试剂，其包含上述的抗人OX40单克隆抗体。
本发明技术人员通过以下方法获得了克隆12A5A2F3, 8F9D5B9, 12A5B7C10,8F9B10D7, 9G4C8B11, 99A2A8D4E8, 17B12G2C3, 41D6H10E4A7, 51E2G12D6, 83C2H3B6,68G8C4B12的独特V-区域寡聚核苷酸/蛋白序列：
1）用重组表达的人OX40胞外区免疫小鼠，获得针对人OX40的免疫反应；
2）取步骤1）中小鼠的脾脏细胞进行融合，并对获得的杂交瘤细胞进行筛选，获得特异性识别人OX40的阳性母克隆；
3）对步骤2）中获得的阳性母克隆进行亚克隆，获得稳定的杂交瘤细胞株；
4）用步骤3）中获得的杂交瘤细胞株进行测序，获得抗体轻链和重链的可变区基因编码序列。
5) 用步骤4）中获得的可变区基因编码序列进行克隆重组，转染至合适的表达体系生产功能性抗人OX40单克隆抗体。
本发明所述的单克隆抗体能够特异性结合人OX40，并且能够刺激或抑制OX40下游通路，激活或抑制T细胞分泌细胞因子。
本发明的有益效果
本发明的抗人OX40单克隆抗体能够特异性的与人OX40的多种表位结合，具有更高的亲和力，并且能够刺激或抑制OX40下游通路，激活或抑制T细胞分泌细胞因子。
附图说明
图1：免疫之后的鼠血清ELISA效价检测。
图2：免疫之后的鼠血清FACS效价检测。
图3：纯化的单克隆抗体能够特异性结合抗人OX40重组蛋白。
图4：纯化的单克隆抗体能够特异性结合表达抗人OX40的细胞系。
图5：纯化的单克隆抗体能够刺激免疫系统，刺激免疫细胞分泌白介素8。
图6：纯化的单克隆抗体能够抑制免疫系统，抑制免疫细胞分泌白介素8。
具体实施方式
本发明涉及一种具有功能性的抗人OX40抗体，下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义相同。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1：人OX40杂交瘤细胞株的获得
1）动物免疫
抗原采用His标签的人OX40胞外结构域的重组蛋白OX40-Fc（Sino Biological，10481-H08H）。用含50 μg OX40-His蛋白的200 μl弗氏完全佐剂（Sigma-Aldrich）的1:1乳液皮下免疫雌性Balb/c和C57bl/6小鼠。随后，每二周腹腔/皮下交替注射含25 μg OX40-Fc的弗氏不完全佐剂（Sigma-Aldrich）的1:1乳液最多达3次，从而对小鼠进行加强免疫。骨髓瘤融合前4天，表现出最高抗体滴度（图1，图2）的二只小鼠接受了25 ug OX40-His（不含佐剂）的腹腔加强免疫。
2）杂交瘤融合和筛选
提取脾脏并进行均质化以产生单细胞悬液，同时准备骨髓瘤细胞（SP2/0）单细胞悬液。使用电融合将8.9×107个脾细胞与4.1×107个SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合。将融合的细胞重悬于100 ml含杂交瘤细胞选择剂胸腺核苷嘧啶，次黄嘌呤和氨基喋呤的DMEM/10% FBS培养基中，并用移液管以100 μl的体积移至50×96孔板中。将板在37 °C下在6%CO2中孵育。7天的孵育之后，开始使用下文所述的ELISA结合和FACS结合来测试针对OX40-His的抗体的存在情况。
ELISA结合检测方法：间接ELISA用于评估上清液中抗体对于OX40-His的结合能力。将ELISA板（Nunc）用100 μl/孔的PBS中0.5 μg/ml的重组OX40-His或His蛋白在4°C下包被过夜。用PBS-T（0.05%吐温）洗涤板，并将其用200 μl/孔的含1%BSA的PBST在37 °C封闭0.5小时。随后弃去封闭液，向每个板加入100 μl杂交瘤细胞培养上清液，然后在室温下孵育1小时。将板用PBST洗涤三次，并用100 μl/孔的缀合辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG（Fab-特异性）（GenScript）37 °C孵育0.5小时。将板用PBST洗涤五次，然后加入TMB显色液（GenScript）并在室温下在黑暗中孵育15分钟。通过加入50 μl的1M HCl终止液（Sigma）终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。
FACS检测方法：FACS结合实验被用于评估上清液中的抗体对于CHO细胞膜表面表达的OX40的结合能力。收集用于检测的表达OX40的CHO细胞和阴性对照的母细胞，用PBS清洗3次。在96孔板中加入2.5X105个检测细胞和待测上清液100 ul，4 °C孵育1小时。随后用PBS清洗细胞3次，添加100μl iFluor标记的山羊抗小鼠IgG，4 °C孵育45分钟。最后用PBS清洗细胞3次，用FACS BD Calibur读取信号。
3）杂交瘤亚克隆
使用有限稀释法进行亚克隆。使用血球细胞计数器并在含杂交瘤细胞选择剂胸腺核苷嘧啶，次黄嘌呤和氨基喋呤的DMEM/10%FBS培养基中对细胞进行系列稀释来确定细胞数量，直至细胞密度达到5-15个细胞/ml。对于每个杂交瘤，将200 μl的细胞溶液用移液管移至96孔板中，密度为1-3个细胞/孔。将培养物在37 °C下在5% CO2中培养1周后，对上清液进行上述ELISA结合，ELISA竞争和FACS结合测试，来评估针对OX40-His的抗体的存在情况。
实施例2：单克隆抗体的可变区测序及抗体重组生产
使用快速ELISA小鼠抗体亚型鉴定试剂盒（Clonotyping System-HRP，SouthernBiotech）对杂交瘤细胞培养上清中的抗体进行亚型鉴定后，使用TRIzol（Ambion）从3×106-5×106个杂交瘤细胞提取总RNA，并利用抗体亚型特异性引物和通用引物（PrimeScriptTM 1stStrand cDNA Synthesis Kit， Takara）将其逆转录为cDNA。随后通过RACE PCR（GenScript）扩增鼠免疫球蛋白重链和轻链V-区域片段，并将所得的PCR片段亚克隆至pMD18-T 载体系统（Takara）中，并使用载体特异性引物对插入片段进行测序。最终获得了克隆12A5A2F3, 8F9D5B9, 12A5B7C10, 8F9B10D7, 9G4C8B11, 99A2A8D4E8,17B12G2C3, 41D6H10E4A7, 51E2G12D6, 83C2H3B6, 68G8C4B12的独特V-区域核苷酸/蛋白序列。
12A5A2F3重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO: 1
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12A5A2F3轻链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO: 3
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GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTCTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTATATTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAGCAGATTATTCTCTCACCGTTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGTCAACAGGCTAATACACTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
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GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAGGGCAAGTCTGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAATTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
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CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTTTCTGGGTTTTCACTGGACACGTCTGGTATGGGTGTGACCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCACTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGCACCCAGGTGTTACTCAAGATCACCAGTGTGGTCACTGCAGATACTGCCACATATTACTGTGCTCGAAGAGCTCTAGGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
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GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCCATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAACATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAACAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAAGACGCTTCCTCCCACGTTCGGTGCTGGGACCGAGCTGGAGCTGAAA
83C2H3B6重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO: 37
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83C2H3B6重链可变区DNA序列：SEQ ID NO: 38
CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAGCTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAGCACAGACTATAATGCAGCTTACATATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAAGCTGATGACACCGCCACATACTACTGTGCCAATTATGATTACGACGTCCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
83C2H3B6轻链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO: 39
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83C2H3B6轻链可变区DNA序列：SEQ ID NO: 40
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68G8C4B12重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO: 41
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68G8C4B12轻链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO: 43
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68G8C4B12轻链可变区DNA序列：SEQ ID NO: 44
GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCTAGTCAGGACATTAGCTTTTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAACAAGAAGATTTTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTCATACACTTCCATGGACGTTCGGTGGAGGCTCCAAGCTGGAAATCAAA
分别合成包含轻链可变区+恒定区与重链可变区+恒定区的DNA片段，将其分别插入pTT5表达载体中，形成表达质粒。
将上述质粒共转染HEK293-6E细胞，并于37 °C摇瓶中培养10天后，收取上清用于抗体纯化。纯化之前，将管道和蛋白A柱用0.2 M NaOH去热原。将柱用含有0.05M Tris和1.5M NaCl（pH8.0）的缓冲液重新平衡。随后将收获的细胞培养物上清液，使用2×上述缓冲液1:1稀释并过滤除菌。将过滤的上清液和蛋白A柱室温孵育2小时，用并1×上述缓冲液洗涤柱后，使用无菌0.1 M柠檬酸钠（pH3.5）洗脱IgG，收集了洗脱液并用九分之一体积的无菌1 M Tris-HCl（pH9）中和。在无菌条件下，将所述产品缓冲液交换为PBS（pH7.4）以除去任何的洗脱缓冲液并浓缩所述样品。浓缩之后，使用1.43的消光系数Ec（0.1%）通过OD280nm对抗体进行定量。
纯化的抗体通过BioRad电泳系统用10% 预制胶（GenScript）通过SDS-PAGE来分析。将所述凝胶用Estain2.0 (GenScript)染色并通过比较染色带与Protein Ladder（GenScript）来估计分子大小和纯度。
实施例3：单克隆抗体对人OX40重组蛋白的结合
间接ELISA用于评估纯化抗体对于OX40-His的结合能力。将ELISA板（Nunc）用100μl/孔的PBS中0.5 μg/ml的重组OX40-His或His蛋白在4°C下包被过夜。用PBS-T（0.05% 吐温）洗涤板，并将其用200 μl/孔的含1% BSA的PBST在37 °C封闭0.5小时。随后弃去封闭液，向首孔加入10 μg/ml的纯化抗体100 μl，并按照3倍梯度稀释，共计11个测试浓度梯度。然后在室温下孵育1小时。将板用PBST洗涤三次，并用100 μl/孔的缀合辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG（Fab-特异性）（GenScript）37 °C孵育0.5小时。将板用PBST洗涤五次，然后加入TMB显色液（GenScript）并在室温下在黑暗中孵育15分钟。通过加入50 μl的1M HCl终止液（Sigma）终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。克隆12A5A2F3, 8F9D5B9, 12A5B7C10,8F9B10D7, 9G4C8B11, 99A2A8D4E8, 17B12G2C3, 41D6H10E4A7, 51E2G12D6, 83C2H3B6,68G8C4B12对于重组蛋白OX40-His的结合能力如图3。根据ELISA浓度梯度实验计算得到的EC50表明这些抗体对于抗原都表现出相当高的亲和力。
实施例4：单克隆抗体对表达人OX40的细胞系的结合
收集用于检测的表达OX40的CHO细胞和阴性对照的母细胞，用PBS清洗3次。在96孔板中加入2.5X105个检测细胞和5 μg/ml纯化抗体100 ul，4 °C孵育1小时。随后用PBS清洗细胞3次，添加100μl iFluor标记的山羊抗小鼠IgG，4 °C孵育45分钟。最后用PBS清洗细胞3次，用FACS BD Calibur读取信号。克隆12A5A2F3, 8F9D5B9, 12A5B7C10, 8F9B10D7,9G4C8B11, 99A2A8D4E8, 17B12G2C3, 41D6H10E4A7, 51E2G12D6, 83C2H3B6, 68G8C4B12对于表达OX40的CHO细胞系的结合如图4。这些抗体对于阳性细胞上表达的OX40抗原的结合信号值都在对照样品的200倍以上，表现出非常高亲和力。
实施例5：单克隆抗体的功能性检测
OX40过表达的功能细胞系被用来做抗OX40的单克隆抗体的功能性检测。把OX40过表达的功能细胞系铺在384孔板上，37 °C及5% CO2孵育过夜，把不同浓度的抗体样品加入到每个孔内，无抗体孔作为背景对照，鼠的IgG2a作为阴性对照，OX40L作为抗OX40的单克隆抗体的阳性对照，在37 °C及5% CO2条件下孵育24小时后，从每孔中取100 μl上清检测IL-8含量（Cisbio的检测试剂盒）。在对OX40激动性抗体的检测中，OX40激动性抗体直接作用于细胞膜上的OX40蛋白，激活了细胞，使之分泌IL-8, IL-8分泌越多，表明对T细胞的激活越大。克隆12A5A2F3, 8F9D5B9, 12A5B7C10, 8F9B10D7, 9G4C8B11, 99A2A8D4E8是OX40激动性抗体, 它们对于T细胞的激活能力如图5所示（OX40L: EC50 = 2.18 nM；12A5A2F3: EC50= 11.55 nM；8F9D5B9: EC50= 1.59 nM；12A5B7C10: EC50 = 0.72 nM；8F9B10D7: EC50=3.18 nM；9G4C8B11: EC50 = 6.50 nM；99A2A8D4E8: EC50= 0.58 nM）。在对OX40抑制性抗体的检测中，OX40抑制性抗体阻断了细胞膜上的OX40蛋白与它的配体OX40L的结合，抑制了细胞，减少了IL-8的分泌, IL-8分泌越少，表明对T细胞的抑制越大。 17B12G2C3,41D6H10E4A7, 51E2G12D6, 83C2H3B6, 68G8C4B12对于T细胞的抑制能力如图6所示（17B12G2C3: IC50 = 8.23 nM；41D6H10E4A7: IC50 = 52.27 nM；
51E2G12D6: IC50= 1.45 nM；83C2H3B6: IC50 = 67.99 nM；68G8C4B12: EC50=2.36 nM）。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京金斯瑞生物科技有限公司
<120> 高亲和力、高特异性、多抗原识别表位的具有更高功能性的抗人OX40抗体
<130> 2017
<160> 44
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 12A5A2F3重链可变区氨基酸序列
<400> 1
Gly Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ala Tyr Tyr Ser Asn Tyr Leu Leu Leu Cys Tyr Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 12A5A2F3重链可变区DNA序列
<400> 2
ggagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60
tcctgtgttg cctctggatt cactttcagt aactacttga tgaactgggt ccgccagtct 120
ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctcaa attagattga aatctgataa ttatgcaaca 180
cattatgcgg agtctgtgga agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 240
gtctacctgc aaatgaacaa cttaagggct gaagacactg gaatttatta ctgcacagcc 300
tactatagta actacttact tttgtgctac tttgactact ggggccaagg caccactctc 360
acagtctcct ca 372
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 12A5A2F3轻链可变区氨基酸序列
<400> 3
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 4
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 12A5A2F3轻链可变区DNA序列
<400> 4
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattataata ctccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 5
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 8F9D5B9重链可变区氨基酸序列
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Leu Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Cys Ile Tyr Tyr Asp Tyr Glu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 8F9D5B9重链可变区DNA序列
<400> 6
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagttg 60
tcctgcaagg cttctggcta cactttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120
cctggactag gccttgagtg gattggaatg attcatccta atagtggtaa tactaactac 180
aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc atgtatctac 300
tatgattacg aggattacta tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 8F9D5B9轻链可变区氨基酸序列
<400> 7
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Gln Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 8
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc aatacactgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ctccattcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaataaa a 321
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 12A5B7C10重链可变区氨基酸序列
<400> 9
Gly Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ala Tyr Tyr Ser Asn Tyr Leu Leu Leu Cys Tyr Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 12A5B7C10重链可变区DNA序列
<400> 10
ggagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60
tcctgtgttg cctctggatt cactttcagt aactacttga tgaactgggt ccgccagtct 120
ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctcaa attagattga aatctgataa ttatgcaaca 180
cattatgcgg agtctgtgga agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 240
gtctacctgc aaatgaacaa cttaagggct gaagacactg gaatttatta ctgcacagcc 300
tactatagta actacttact tttgtgctac tttgactact ggggccaagg caccactctc 360
acagtctcct ca 372
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 12A5B7C10轻链可变区氨基酸序列
<400> 11
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 12A5B7C10轻链可变区DNA序列
<400> 12
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattataata ctccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 13
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 8F9B10D7重链可变区氨基酸序列
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Leu Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Cys Ile Tyr Tyr Asp Tyr Glu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 8F9B10D7重链可变区DNA序列
<400> 14
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagttg 60
tcctgcaagg cttctggcta cactttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120
cctggactag gccttgagtg gattggaatg attcatccta atagtggtaa tactaactac 180
aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc atgtatctac 300
tatgattacg aggattacta tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 8F9B10D7轻链可变区氨基酸序列
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Gln Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 16
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 8F9B10D7轻链可变区DNA序列
<400> 16
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc aatacactgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ctccattcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaataaa a 321
<210> 17
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 9G4C8B11重链可变区氨基酸序列
<400> 17
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ala Tyr Tyr Ser Asn Tyr Val Gly Trp Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 9G4C8B11重链可变区DNA序列
<400> 18
gatgtacagc ttcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60
acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtggttatt actggaactg gatccggcag 120
tttccaggaa acaaactgga atggatgggc tacataagct acgatggtag caataactac 180
aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240
ctgaagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aagagatcgg 300
gcctactata gtaactacgt agggtggtac ttcgatgtct ggggcacagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 19
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 9G4C8B11轻链可变区氨基酸序列
<400> 19
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 20
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 9G4C8B11轻链可变区DNA序列
<400> 20
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atatcctgca gagccagtga aagtgttgat aattatggca atagttttat gcactggtac 120
cagcagacac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180
gggatccctg ccaagttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240
cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgctc 300
acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 333
<210> 21
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 99A2A8D4E8重链可变区氨基酸序列
<400> 21
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Lys Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Val Arg Pro Trp Tyr Leu Ala Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 99A2A8D4E8重链可变区DNA序列
<400> 22
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60
tcctgcaagg cttctggtta taccttcaca gactattcaa tgcactgggt gaagcaggct 120
ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataagcactg agactggtga gccaacatat 180
gcagatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240
ttgcagatca agaacctcaa aaatgaggac acggcttcat atttctgtgc tcgcgtacga 300
ccctggtatc tcgctgtctg gggcgcaggg accacggtca ccgtctcctc a 351
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 99A2A8D4E8轻链可变区氨基酸序列
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Val Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Asn Thr Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 24
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 99A2A8D4E8轻链可变区DNA序列
<400> 24
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctctctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tatattcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggagcagat tattctctca ccgttagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgtcaacag gctaatacac ttccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 25
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 17B12G2C3重链可变区氨基酸序列
<400> 25
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Trp Leu Leu Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 17B12G2C3重链可变区DNA序列
<400> 26
gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgtaagg cttctggata cacgttcact gactactaca tgaactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta acaatggtgg tactaactac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacaacctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatcgggg 300
ggatggttac tacaggacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 17B12G2C3轻链可变区氨基酸序列
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Leu Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 17B12G2C3轻链可变区DNA序列
<400> 28
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcacttgca gggcaagtct ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaattcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 29
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 41D6H10E4A7重链可变区氨基酸序列
<400> 29
Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Ser Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Met Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 41D6H10E4A7重链可变区DNA序列
<400> 30
gagttccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggcgcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact gactacaaca tgaactgggt gaagcagagc 120
aatggaaaga gccttgagtg gattggagta attaatccta actatggtag ttctagctac 180
aatcagaagt tcatgggcaa ggccacattg actgtcgacc agtcttccag cacagcctac 240
atgcagctca acagcctgac atctgatgac tctgcagtct attactgtgc aagagggtat 300
tacggtgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345
<210> 31
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 41D6H10E4A7轻链可变区氨基酸序列
<400> 31
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 32
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 41D6H10E4A7轻链可变区DNA序列
<400> 32
gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
accagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300
tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa ataaaa 336
<210> 33
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 51E2G12D6重链可变区氨基酸序列
<400> 33
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asp Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Thr Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys His Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Thr Gln Val
65 70 75 80
Leu Leu Lys Ile Thr Ser Val Val Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Ala Leu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 51E2G12D6重链可变区DNA序列
<400> 34
caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tttctgggtt ttcactggac acgtctggta tgggtgtgac ctggattcgt 120
cagccttcag gaaagggtct ggagtggctg gcacacattt actgggatga tgacaagcac 180
tataacccat ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atacctccag cacccaggtg 240
ttactcaaga tcaccagtgt ggtcactgca gatactgcca catattactg tgctcgaaga 300
gctctaggtg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354
<210> 35
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 51E2G12D6轻链可变区氨基酸序列
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser His Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 36
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 51E2G12D6轻链可变区DNA序列
<400> 36
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc cattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaacat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggaacaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaagacgc ttcctcccac gttcggtgct 300
gggaccgagc tggagctgaa a 321
<210> 37
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 83C2H3B6重链可变区氨基酸序列
<400> 37
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Tyr Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Asn Tyr Asp Tyr Asp Val Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 38
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 83C2H3B6重链可变区DNA序列
<400> 38
caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60
acctgcacag tctctggttt ctcattaact agctatggtg tacactgggt tcgccagtct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtggaagcac agactataat 180
gcagcttaca tatccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttcttt 240
aaaatgaaca gtctgcaagc tgatgacacc gccacatact actgtgccaa ttatgattac 300
gacgtccctt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca 345
<210> 39
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 83C2H3B6轻链可变区氨基酸序列
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 40
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 83C2H3B6轻链可变区DNA序列
<400> 40
gacattcaga tgacccagtc tcctgcctcc cagtctgcat ctctgggaga aagtgtcacc 60
atcacatgcc tggcaagtca gaccattggt acatggttag catggtatca gcagaaacca 120
gggaaatctc ctcagctcct gatttatgct gcaaccagct tggcagatgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gtagtggatc tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct 240
gaagattttg taagttatta ctgtcaacaa ctttacagta ctcctttcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaataaa a 321
<210> 41
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 68G8C4B12重链可变区氨基酸序列
<400> 41
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Asp Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Val
65 70 75 80
Thr Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Leu Phe Asp Gly Tyr Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 68G8C4B12重链可变区DNA序列
<400> 42
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
acttgcactg tctctgggtt ttcattaacc aactatggtg ttcactgggt tcgccagcct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatgggatg atggaaacac aaattataat 180
tcggctctca tgtccagact gagcatcaac aaagacaact ccaagagcca agttttcgta 240
acaatgaaca gtctgcaaat tgatgacaca gccatgtact actgtgccct ctttgatggt 300
tactacgggt ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc ttca 354
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 68G8C4B12轻链可变区氨基酸序列
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Phe Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Ser Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 44
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 68G8C4B12轻链可变区DNA序列
<400> 44
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggctagtca ggacattagc ttttatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggaacaa 240
gaagattttg ccacttactt ttgccaacag ggtcatacac ttccatggac gttcggtgga 300
ggctccaagc tggaaatcaa a 321

Claims (10)

1.一种抗人OX40单克隆抗体，该单克隆抗体的蛋白序列含有重链可变区和轻链可变区，该单克隆抗体所述的重链可变区为如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区为如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的抗人OX40单克隆抗体的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，含有如SEQ ID NO：22所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的寡聚核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：24所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的寡聚核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗人OX40单克隆抗体中的应用。
6.一种制备抗人OX40单克隆抗体的方法，其特征在于：将包含权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体转染真核表达细胞，并进行培养得到抗人OX40单克隆抗体。
7.权利要求1所述的抗人OX40单克隆抗体在制备抗肿瘤或抗自身免疫性疾病的药物中的应用。
8.一种抗肿瘤或抗自身免疫性疾病的制剂，其特征在于：其包含权利要求1所述的抗人OX40单克隆抗体。
9.权利要求1所述的抗人OX40单克隆抗体在制备检测肿瘤或自身免疫性疾病的检测试剂中的应用。
10.一种检测肿瘤或自身免疫性疾病的检测试剂，其特征在于其包含权利要求1所述的抗人OX40单克隆抗体。
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Assignee: Nanjing vigorous Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: NANJINGJINSIRUI SCIENCE & TECHNOLOGY BIOLOGY Corp.

Contract record no.: X2023990000156

Denomination of invention: An anti-human OX40 monoclonal antibody and its application

Granted publication date: 20211109

License type: Exclusive License

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