CN111018987A - 一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其应用，可以抑制人内皮素受体的功能。本发明包括这些抗体的制备、克隆、表达和鉴定，本发明能有效应用于人的肺动脉高压、伴随有肺动脉压升高的疾病和生殖器官癌症的治疗。

Description

一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其应用

本申请是申请日为2015年12月01日、申请号为201510867288.7、名称为“一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其应用”的发明申请的分案。

技术领域

本发明涉及一种抗体，特别涉及一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其应用

背景技术

内皮素(endothelin，ET)是调节心血管功能的重要因子，对维持基础血管张力与心血管系统稳态起重要作用。它不仅存在于血管内皮，也广泛存在于各种组织和细胞中(Barton等,2008,Can.J.Physiol.Pharmacol.86:485-498)。它是由21个氨基酸组成的多肽，分子量为2,400Da，N端是两个二硫键将1-15，3-11位置的半胱氨酸连接起来，C端是一些疏水性氨基酸的残基。N端结构决定其与受体的亲和力，C端结构决定其与受体的结合位置。ET-1另有两个亚型即ET-2，ET-3，其差别在于个别氨基酸的残基，对于心血管起主要作用的是ET-1。内皮细胞受到刺激合成并释放ET-1，其调控主要在基因转录水平。

内皮素受体(endothelin receptors，ETR)有ET_AR和ET_BR二种，属G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor,GPCR)。ET_AR活化后通过激活细胞膜上Na⁺/Ca²⁺交换体(Na⁺/Ca²⁺exchanger,NCX)和Na⁺/H⁺交换体(Na⁺/H⁺ exchanger，NHE)使胞内Ca²⁺浓度升高和肌纤维对Ca²⁺的敏感性增加，介导血管平滑肌细胞和心肌细胞收缩(Neylon,1999,Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.26:149-153)。一般来说，ET_BR与ET_AR的功能相互抗衡，ET_BR主要是使血管平滑肌细胞和心肌细胞舒张(Nelson等,2003,Nat.Rev.Cancer 3:110-113)。

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)由肺内或者与肺关联血管的不断束紧(vasoconstriction)引起心脏对肺供血量不足后，心脏对肺供血压力补偿性增加而引起，其微观表现有肺小动脉内膜增厚，血管紧缩，重构，僵硬或者血栓造成的局部闭塞，进而血管对肺血液循环的阻力上升(Simonneau等,2004,J.Am.Coll.Cardiol.43:5S–12S；Barst等,2004,J.Am.Coll.Cardiol.43:40S–47S)。内皮素受体ET_AR抑制剂能够有效的阻断由内皮素引起的血管压力增加来达到缓解肺动脉高压的症状，改善病人的运动能力和血液动力学(Serasli等,2010,Recent Pat.Cardiovasc.Drug Discov.5:184-95)。

本发明提供了与ET_AR受体相结合的抗体，它们可以抑制此受体的信号通路，并被用于单独治疗或者协同治疗肺动脉高压，同时也可以被用于诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体，可以抑制人内皮素受体的功能，本发明抗体可以应用于肺动脉高压的治疗。

ET_AR属于GPCR的A家族成员，其有七个跨膜区，胞外区非常短小，只占蛋白全长的1/7，而GPCR的抗体只能针对它的胞外区。因此，由于GPCR本身的结构特点和天然的低表达率，导致有生物学活性的GPCR抗原难以制备。GPCR属于膜蛋白，本身难以纯化，要获得针对GPCR的单克隆抗体，不可能仅靠GPCR的N末端多肽的免疫来制备，一般是通过全细胞和细胞膜的免疫来制备，最后通过全细胞的结合和功能性的实验来鉴定。本发明通过特定的细胞膜和全细胞免疫技术，获得了一种针对ET_AR的具有抑制性功能的单克隆鼠源抗体，进一步通过人源化获得其人源化抗体，以便用于患者的治疗。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体，所述抗体包含以下方案之一的氨基酸序列：

a.选自以下序列之一的轻链CDR3序列：

与选自L1-L12的轻链CDR3序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQID NO:68其中之一相差总共不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR3序列；

b.选自以下序列之一的重链CDR3序列：

与选自H1-H12的重链CDR3序列：SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ IDNO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136其中之一相差总共不超过四个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR3序列；

c.方案a的轻链CDR3序列和方案b的重链CDR3序列。

作为优选，所述抗体还包含以下方案的一种或几种组合的氨基酸序列：

a.选自以下之一的轻链CDR1序列：

与选自L1-L12的轻链CDR1序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30其中之一相差不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR1序列；

b.选自以下之一的轻链CDR2序列：

与选自L1-L12的轻链CDR2序列：SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48其中之一相差不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR2序列；

c.选自以下之一的重链CDR1序列：

与选自H1-H12的重链CDR1序列：SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQID NO:88、SEQ ID NO:90其中之一相差不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR1序列；

d.选自以下之一的重链CDR2序列：

与选自H1-H12的重链CDR2序列：SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114其中之一相差不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR2序列。

一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体，所述抗体包含以下方案之一：

a.包含以下方案的一种或几种的轻链可变结构域：

i.选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:30其中之一的轻链CDR1序列；

ii.选自SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48其中之一的轻链CDR2序列；

iii.选自SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68其中之一的轻链CDR3序列；

b.包含以下方案的一种或几种的重链可变结构域：

i.选自SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ IDNO:90其中之一的重链CDR1序列；

ii.选自SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQID NO:112、SEQ ID NO:114其中之一的重链CDR2序列；

iii.选自SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136其中之一的重链CDR3序列；

c.a的轻链可变结构域和b的重链可变结构域。

一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体，所述抗体包含以下方案之一的氨基酸序列：

a.选自以下方案之一的轻链可变结构域序列：

i.具有与选自L1-L14的轻链可变结构域序列：SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ IDNO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164其中之一至少80％相同的氨基酸序列；

ii.具有与编码L1-L14的轻链可变结构域序列的多聚核苷酸序列：SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163其中之一至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的氨基酸序列；b.选自以下方案之一的重链可变结构域序列：

i.具有与H1-H14的重链可变结构域序列：SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ IDNO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ IDNO:192其中之一至少80％相同的氨基酸序列；

ii.具有与编码H1-H14的重链可变结构域序列的多聚核苷酸序列：SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191其中之一至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的氨基酸序列；c.a的轻链可变结构域序列和b的重链可变结构域序列。

作为优选，所述抗体包含以下方案之一的氨基酸序列：

a.选自L1-L14的轻链可变结构域序列：SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ IDNO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ IDNO:164其中之一的轻链可变结构域序列；

b.选自H1-H14的重链可变结构域序列:SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ IDNO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ IDNO:192其中之一的重链可变结构域序列；

c.a的轻链可变结构域序列和b的重链可变结构域序列。

作为优选，方案c中a的轻链可变结构域序列与b的重链可变结构域序列的组合选自以下之一：L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13、L14H14。

作为优选，所述抗体还包含以下方案之一的氨基酸序列：

a.SEQ ID NO:194的轻链恒定序列；

b.SEQ ID NO:196的轻链恒定序列；

c.SEQ ID NO:198的重链恒定序列；

d.SEQ ID NO:194的轻链恒定序列和SEQ ID NO:198的重链恒定序列；

e.SEQ ID NO:196的轻链恒定序列和SEQ ID NO:198的重链恒定序列。作为优选，所述抗体选自鼠源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、Fab片段、F(ab’)x片段、结构域抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体。

作为优选，当所述抗体与人内皮素受体结合时选自以下之一的结合方式：

a.以与参比抗体相同的Kd与人内皮素受体结合；

b.以与所述参比抗体相同的IC50抑制人内皮素受体的内皮素激活；

c.在人内皮素受体上与所述参比抗体交叉竞争结合。

作为优选，所述参比抗体包含SEQ ID NO:138的轻链可变结构域序列和SEQ IDNO:166重链可变结构域序列的组合。

作为优选，所述抗体为鼠源抗体或人源化抗体时，当其与人内皮素受体结合时：

a.以≤500nM的IC50值降低人内皮素素信号传导；

b.在肺动脉高压大鼠模型或肺动脉高压猕猴模型中降低肺动脉高压；

c.a和b两者。

一种药用组合物，其包含与药用可接受载体混合的本发明的抗体。

作为优选，所述抗体选自鼠源抗体或人源化抗体。

一种分离的核酸，其包含编码本发明的抗体的轻链可变结构域、重链可变结构域或轻链可变结构域和重链可变结构域两者的多聚核苷酸序列。

作为优选，编码本发明的抗体的轻链可变结构域的多聚核苷酸序列选自SEQ IDNO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ IDNO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163其中之一；

编码本发明的抗体的重链可变结构域的多聚核苷酸序列选自SEQ ID NO:165、SEQID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQID NO:189、SEQ ID NO:191其中之一。

一种重组表达载体，其包含本发明的的核酸。

一种宿主细胞，其包含本发明的载体。

一种生产能与人内皮素受体特异性结合的抗体的方法，包括在允许表达所述抗体的条件下培养本发明的宿主细胞。一种在需要治疗的人中降低肺动脉高压的方法，包括给予受试者治疗有效量的本发明的药用组合物。

一种用于治疗肺动脉高压、伴随有肺动脉压升高的疾病和生殖器官癌症的试剂盒，包含本发明的药用组合物。

一种本发明的药用组合物在制备用于治疗肺动脉高压、伴随有肺动脉压升高的疾病和生殖器官癌症的药物中的用途。

本发明的突出优点在于：

(a)本发明的单克隆抗体针对人内皮素受体有高结合活性和功能活性。

(b)本发明的单克隆抗体针对人内皮素受体，它们都是新的抗ET_AR的功能性抗体。我们已经获得此鼠源抗体的人源化抗体，可用于患者的治疗。

(c)本发明不同于以往的小分子药物，抗体将提供生物大分子药物的独特优势。

因此，本发明的高亲和力、高特异性的单克隆抗体在临床上具有重要的价值。

附图说明

图1：显示了ELISA实验筛选不同杂交瘤细胞上清与CHO-DHFR-ET_AR(图中标为CHO-ET_AR)细胞结合的结果。其中，从15F3杂交瘤细胞克隆到了anti-ET_AR抗体A-1。

图2：显示了流式细胞术(FACS)检测重组表达的anti-ET_AR抗体(A-1、A-2、A-7、A-12)与人ET_AR的特异性结合结果。其中蓝色波形表示anti-ET_AR与CHO-DHFR-的结合曲线，红色波形表示anti-ET_AR与CHO-DHFR-ET_AR的结合曲线。

图3：显示了钙流实验筛选不同杂交瘤细胞上清抑制细胞内人ET_AR介导的Ca²⁺变化结果。

图4：显示了钙流实验检测重组表达的anti-ET_AR抗体与人ET_AR的浓度梯度抑制曲线(IC₅₀＝37.91nM，R²＝0.97)(A-1),(IC₅₀＝87.84nM，R²＝0.97)(A-9)。

图5：显示了重组表达的anti-ET_AR(A-1)在低氧诱导肺动脉高压的食蟹猴中的体内活性，可以明显改善低氧诱导的肺动脉收缩压增高，通过比较肺动脉收缩压变化与时间曲线下面积，发现A-1在96小时之内始终保持降低肺动脉收缩压的药效。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明涉及抗体例如可与人内皮素受体(ET_AR)特异性结合的抗体。这些包括可抑制或阻断内皮素与人ET_AR结合并降低内皮素经受体信号传导的抗体。在一个实施方案中提供了包括拮抗性抗体的可降低动物模型肺动脉高压的鼠源抗体。

本发明进一步提供可特异性结合至人内皮素受体的抗体相关的组合物、试剂盒和方法。也提供了核酸分子及其衍生物和片段，其包含编码与内皮素受体结合的多肽的全部或部分的多聚核苷酸，例如编码全部或部分抗内皮素受体抗体、抗体片段或抗体衍生物的核酸。本发明进一步提供包含该类核酸的载体和质粒以及包含该类核酸和/或载体和质粒的细胞和细胞系。所提供方法包括，例如，制备、鉴定或分离与人ET_AR结合的抗体例如抗ET_AR抗体的方法，测定该抗体是否与ET_AR结合的方法、以及将与ET_AR结合的抗体给予动物模型的方法。

定义

使用标准的单字母或三字母缩写表明多聚核苷酸和多肽序列。除非另外指明，多肽序列的氨基端在左而它们的羧基端在右，单链核酸序列和双链核酸序列的上游链的5’端在左而它们的3’端在右。多肽的具体部分可由氨基酸残基编号表示，例如氨基酸80至130，或由该位点的实际残基表示例如Lys80至Lys130。也可通过解释其与参比序列的差异描述具体的多肽或多聚核苷酸序列。具体轻链和重链可变结构域的多聚核苷酸和多肽可表示为L1(“轻链可变结构域1”)，H1(“重链可变结构域1”)。包含轻链和重链的抗体可通过结合轻链的名称和重链可变结构域的名称表示。例如，“L4H7"表示包含L4轻链可变结构域和H7重链可变结构域的抗体。

除非本文另外定义，与本文相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。进一步，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数并且复数含义术语应包括单数含义。通常，与本文所述细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质核酸化学以及杂交相关的命名法和技术为本领域熟知和经常使用的。本发明的方法和技术通常根据本领域已知的常规方法以及本说明书引用和讨论的各种普通和更具体的参考文献所描述的进行，除非另外说明。参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)，以及Harlow and Lane Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory Press(1990)，均以参考形式并于本文。酶反应和纯化技术根据操作说明进行，如本领域通常完成或本文所述。与本文描述的分析化学、合成有机化学和医学和药学化学相关的术语以及实验操作和技术均为本领域熟知和普遍使用者。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和给药以及患者的治疗。

以下术语，除非另外指明，应理解为具有以下含义：术语“分离的分子”(其中所述分子为例如多肽、多聚核苷酸或抗体)为就其来源或衍生源而言(1)与在天然状态下与其相伴的天然相关组分分离，(2)基本与同种的其它分子游离(3)由不同种细胞表达或(4)不天然存在。因此，化学合成或由与其天然来源的细胞不同的细胞体系表达的分子将与天然相关组分“分离”。也可使用本领域已知的纯化技术通过分离使分子基本与其天然相关组分游离。例如，可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定多肽样品的纯度并使用本领域熟知的技术将凝胶染色以观察该多肽。对于某些目的，可使用HPLC或其它本领域熟知的纯化方法提供更高的分辨率。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白”均指包含两个或多个通过肽健相互连接的氨基酸的分子。这些术语涵盖例如天然和人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物(例如突变蛋白、变异体和融合蛋白)以及转录后或否则为共价或非共价修饰的蛋白。肽、多肽或蛋白可为单体或多聚体。

如本文使用的术语“多肽片段”指与对应的全长蛋白相比具有氨基端和/或羧基端缺失的多肽。片段长度可为例如至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、80、90、100、150或200个氨基酸。片段长度可为例如最多1000、750、500、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11或10个氨基酸。片段可在其一端或两端进一步包含一个或多个附加氨基酸，例如，来自不同天然蛋白质的氨基酸序列(例如，Fc或亮氨酸拉链结构域)或人工氨基酸序列(例如，人工接头序列)。

本发明多肽包括以任何原因和经任何方法修饰的多肽，例如，以：(1)降低蛋白水解敏感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的亲和性，(4)改变结合亲和性以及(4)赋予或修饰其它物理化学或功能性质。类似物包含多肽的突变蛋白。例如，可在天然序列(例如在形成分子内接触的结构域之外的多肽部分)中进行单个或多个氨基酸替换(例如，保守氨基酸替换)。“保守氨基酸替换”为不显著改变母体序列结构特性者(例如，替换氨基酸不应破坏母体序列中出现的螺旋或干扰其它赋予母体序列特性或对其功能是必须的二级结构类型)。领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins,Structures andMolecular Principles(Creighton编辑，W.H.Freeman and Company(1984))；Introduction to Protein Structure(Branden and Tooze编辑,Garland Publishing(1991))；和Thornton等，1991，Nature 354:105-106，均以参考形式并于本文。

本发明也提供了ET_AR抗体的非肽类似物。非肽类似物普遍用于提供与模板肽具有相似性质的药物。这些非肽化学物类型被称作“模拟肽(peptide mimetics)”或“拟肽(peptidomimetics)”。Fauchere，1986，Adv.Drug Res.15:29-69；Veber和Freidinger，1985，Trends Neurosci.8:392-396；Evans等，1987，J.Med.Chem.30:1229-1239，均以参考形式并于本文。与治疗用肽结构相似的模拟肽可用于产生相等的治疗或预防效果。通常，拟肽与范例多肽的结构相似(即具有期望生物化学性质或药理学活性的多肽)，例如人类抗体，但是具有一个或多个任选被选自-CH₂NH-、-CH₂ S-、-CH₂-CH₂-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH₂-、-CH(OH)CH₂-、和-CH₂SO-的连接通过本领域熟知的方法取代的肽连接。用相同类型的D-氨基酸系统取代一致序列的一个或多个氨基酸(例如，D-赖氨酸取代L-赖氨酸)也可用于生成更稳定的肽。此外，可通过本领域已知的方法(Rizo and Gierasch，1992，Annu.Rev.Biochem.61:387-418)，以参考形式并于本文)例如通过添加可形成将肽环化的分子间二硫键的内部半胱氨酸残基生成包含一致序列或基本相同的一致序列变异体的拘束肽(constrained peptides)。

多肽(例如抗体)的“变异体”包含相对于另一多肽序列在氨基酸序列中插入、缺失和/或替换了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。本发明的变异体包括融合蛋白。

多肽的“衍生物”为经化学修饰的多肽(例如，抗体)，例如通过与其它化学部分例如聚乙二醇、白蛋白(例如人血清白蛋白)结合、磷酸化和糖基化。除非另外说明，术语“抗体”包括除包含两个全长重链和两个全长轻链的抗体外的其衍生物，变异体、片段和突变蛋白，其实例见下文。

“抗体”为包含与抗原结合部分并任选为允许抗原结合部分采取促进该抗体与该抗原结合的构象的支架或框架部分的蛋白。抗体的实例包括抗体、抗体片段(例如抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。该抗体可包含例如可选择的蛋白支架或具有移植CDRs或CDRs衍生物的人工支架。该支架包括但不限于包含被引入的例如以稳定化该抗体的三维结构的抗体衍生支架以及包含例如生物相容性多聚体的全合成支架。参见，例如，Korndorfer等，2003，Proteins:Structure，Function and Bioinformatics 53:121-129；Roque等，2004,Biotechnol.Prog.20:639-654。此外，可使用模拟肽抗体(“PAMs”)以及基于模拟抗体的支架，其如支架一样利用纤维蛋白连接素。

抗体可具有例如天然免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”为四聚体分子。在天然的免疫球蛋白中，各四聚体由两个相同的多肽链对组成，各对具有一个“轻”(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。各链的氨基端包括约100至110或更多氨基酸的可变结构域，主要与抗原识别相关。各链的羧基端部分确定了主要与效应器作用相关的恒定区。人的轻链分为κ和λ轻链。重链分为μ、δ、α或ε，并确定了抗原的同种型，例如分别为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变和恒定区由约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链也包括约10多个氨基酸的“D”区。参见，Fundamental Immunology Ch.7(Paul编辑，第2版，Raven Press，1989)(其完整内容以参考形式并于本文用于任何目的)。各轻/重链对的可变区形成抗体结合位点，这样一个完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。

天然免疫球蛋白链显示出由三个高度可变区连接的相对保守骨架区(FR)的相同基本结构，也被称作互补决定区或CDRs。从N端到C端，轻和重链均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各结构域氨基酸的分配与Kabat等在Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版，US Dept.of Health and Human Services,PHS，NIH，NIH Publication No.91-3242，1991中的定义一致。

除非另外指明，“抗体”指完整的免疫球蛋白或其可与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合部分。可由重组DNA技术或通过酶或化学裂解完整抗体生产抗原结合部分。抗原结合部分包括，尤其是，Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、结构域抗体(dAbs)，包括互补决定区(CDRs)的片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双链抗体(diabodies)、三链抗体(triabodies)、四链抗体(tetrabodies)和至少包含足以赋予多肽特异抗原结合的免疫球蛋白的一部分的多肽。

Fab片段为具有V_L、V_H、C_L和C_H1结构域的单价片段；F(ab’)₂片段为具有两个在铰链区由二硫键连接的Fab片段的二价片段；Fd片段具有V_H或V_L结构域；dAb片段具有V_H结构域、V_L结构域，或V_H或V_L结构域的抗原结合片段(美国专利号6846634、6696245，美国专利申请公开号05/0202512、04/0202995、04/0038291、04/0009507、03/0039958,Ward等，1989，Nature341:544-546.)

单链抗体(scFv)为其中的V_L扣V_H区由接头(例如，合成的氨基酸残基序列)连接以形成连续蛋白质的抗体，其中该接头足够长以允许该蛋白链折叠回自身并形成单价抗原结合位点(参见，例如，Bird等，1988，Science 242:423-26and Huston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-83)。双链抗体为包含两个多肽链的二价抗体，其中各多肽链包含由接头连接的V_H和V_L结构域，该接头很短以致于不允许两个结构域在相同链上的配对，因此允许各结构域与另一多肽链上的互补结构域配对(参见，例如，Holliger等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-48，和Poljak等，1994，Structure 2:1121-23)。如果双链抗体的两个多肽链是相同的，那么由它们配对得到的双链抗体将具有相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可用于制备具有不同抗原结合位点的双链抗体。相似地，三链抗体和四链抗体分别为包含三个和四个多肽链的抗体并分别形成三个和四个抗原结合位点，其可相同或不同。

可使用Kabat等在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版,US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication No.91-3242，1991中描述的方法鉴定给定抗体的互补决定区(CDRs)和骨架区(FR)。可向分子中共价或非共价并入一个或多个CDRs使其成为抗体。抗体可以较大多肽链并入CDR(s)。可将CDR(s)共价连接至另一乡肽链，或非共价并入CDR(s)。CDRs允许抗体与具体的相关抗原特异性结合。

抗体可有一个或多个结合位点。如果多于一个结合位点，该结合位点可与另一个相同或不同。例如，天然人免疫球蛋白通常具有两个相同的结合位点，而“双特异性”或“双功能”抗体具有两个不同的结合位点。

术语“鼠源抗体”包括具有一个或多个来源于小鼠免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的所有抗体。

术语“人源化抗体”是将小鼠抗体分子的互补决定区序列移植到人抗体可变区框架中而制成的抗体。

“抗原结合结构域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”为包含与抗原相互作用的氨基酸残基(或其它部分)并有助于抗体对抗原的特异性和亲和力的抗体的部分。对与其抗原特异性结合的抗体而言，这将包括至少部分的至少一个其CDR结构域。

“表位”为与抗体(例如，通过抗体)结合的分子部分。表位可包含分子的非连续部分(例如，在多肽中，在多肽的一级序列中不连续的氨基酸残基在该多肽的三级和四级结构中相互足够接近以致于被一个抗体结合)。

两个多聚核苷酸或两个多肽序列的“相同百分比”由使用GAP计算机程序(GCGWisconsin Package；version 10.3(Accelrys，San Diego，CA)的一部分)使用其默认参数比较序列测定。

术语“多聚核苷酸”、“寡聚核苷酸”和“核酸”可在全文中交替使用并包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸类似物(例如，肽核酸和非天然核苷酸类似物)生成的DNA或RNA类似物及其杂交体。核酸分子可为单链或双链。在一个实施方案中，本发明的核酸分子包含编码本发明抗体或其片段、衍生物、突变蛋白或变异体连续的开放阅读框。

如果它们的序列可反向平行排列则两个单链多聚核苷酸是相互“互补的”，这样一个多聚核苷酸中的各核苷酸与另一多聚核苷酸中的互补核苷酸相反，不会引入空隙并且各序列的5’或3’端没有未配对的核苷酸。如果两个多聚核苷酸可在中等严格条件下相互杂交那么一个多聚核苷酸与另一多聚核苷酸“互补”。因此，一个多聚核苷酸可与另一多聚核苷酸互补，但并不是它的互补序列。

“载体”为可用于将与其相连的另一核酸引入细胞的核酸。载体的一种类型为“质粒”，其指可连接附加核酸区段的线性或环状双链DNA分子。载体的另一类型为病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺病毒伴随病毒)，其中可将附加DNA区段引入病毒基因组。某些载体可在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体以及游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞时整合入宿主细胞的基因组中并因此与宿主基因组一起复制。“表达载体”为可引导所选多聚核苷酸表达的载体类型。

如果调控序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达水平、时间或位点)那么核苷酸序列与调控序列“可操作地相连”。“调控序列”为可影响与其可操作相连的核酸的表达(例如，表达水平、时间或位点)的核酸。调控基因，例如，直接对受调控核酸发挥作用或通过一个或多个其它分子(例如，与调控序列和/或核酸结合的多聚核苷酸)的作用。调控序列的实例包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。调控序列的进一步实例描述于例如Goeddel，1990,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Volume 185,Academic Press,San Diego,CA and Baron等,1995,Nucleic Acids Res.23:3605-06。

“宿主细胞”为用于表达核酸例如本发明核酸的细胞。宿主细胞可为原核生物，例如大肠杆菌，或者其可为真核生物，例如单细胞真核生物(例如，酵母或其它真菌)、植物细胞(例如烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。通常，宿主细胞为可用多肽编码核酸转化或转染的培养细胞，其可接着在宿主细胞中表达。短语“重组宿主细胞”可用于表述用预期表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可为包含该核酸但是不以期望水平表达的细胞，除非向该宿主细胞引入了调控序列这样其与核酸可操作地相连。应理解的是术语宿主细胞不仅指具体的受试者细胞也指该细胞的子代或可能的子代。由于例如突变或环境影响后续世代会出现某些修饰，该子代事实上可能与母体细胞不同但是仍然属于本文使用的术语范围。

内皮素受体

内皮素受体(ET_AR)属于7-跨膜受体家族的A亚家族，其通过异源三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)与一个或多个胞内信号传导途径偶联(Jelinek等，1993,Science259:1614-1616,Segre等,1993,Trends Endocrinol.Metab.4:309-314)。如本文所使用“内皮素受体”和“ET_AR”可交替使用。

在一个实施方案中，可选择本发明的抗体结合表达于细胞上的膜结合内皮素受体并通过内皮素受体抑制或阻断内皮素信号传导。在一个实施方案中，本发明的抗体与人内皮素受体特异性结合。在进一步的实施方案中，与人内皮素受体结合的抗体也可与其它物种的内皮素受体结合，例如大鼠。下文中的实施例提供生成与人膜结合内皮素受体结合的鼠源抗体，在进一步的实施方案中与其它物种的内皮素受体结合。

已知数个物种的内皮素受体的多聚核苷酸和多肽序列。SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6显示了人、猴子和大鼠的序列。序列数据来源于美国国立生物技术信息中心的GeneBank数据库。

内皮素受体A

人(Homo sapiens)多聚核苷酸(SEQ ID NO：1)

登录号：S63938。

人(Homo sapiens)氨基酸(SEQ ID NO：2)

登录号：AAB20278。

猴子(Homo sapiens)多聚核苷酸(SEQ ID NO：3)

登录号：JV635771。

猴子(Homo sapiens)氨基酸(SEQ ID NO：4)

登录号：AFJ71111。

大鼠(Rattus norvegicus)多聚核苷酸(SEQ ID NO:5)

登录号：M60786。

大鼠(Rattus norvegicus)氨基酸(SEQ ID NO:6)

登录号：AAA41114。

抗体

一方面，本发明提供与人内皮素受体特异性结合的抗体(例如，抗体、抗体片段、抗体衍生物、抗体突变蛋白和抗体变异体)。在一个实施方案中该抗体为鼠源抗体或其人源化抗体。

根据本发明的抗体包括与人内皮素受体结合并通过内皮素受体抑制内皮素信号传导的抗体。在一个实施方案中，该抗体的IC50值为200nM或更低。另一方面，该抗体与内皮素受体特异性结合，抑制信号传导并显示出治疗性生物作用，例如降低动物模型的肺动脉高压。在一个实施方案中，该抗体为与内皮素受体特异性结合并通过内皮素受体抑制信号传导的鼠源抗体。在另一实施方案中，该抗体为与内皮素体特异性结合、通过内皮素受体抑制信号传导并可以降低肺动脉高压的鼠源抗体。

在一个实施方案中，该抗体包含与下表中A-1/A-14的CDR序列各相差5、4、3、2、1或0个单氨基酸添加、替换和/或缺失的序列。如本文所使用，与表1所示的CDR序列最多不超过例如四个氨基酸添加、瞽换和或缺失的CDR序列指与表1中的序列相比具有4、3、2、1或0个单氨基酸添加、替换和/或缺失的序列。

在另一个实施方案中，该抗体包含一个或多个下文所示的CDR一致序列(consensus sequences)。提供了轻链CDR1、CDR2、CDR3和重链CDR1、CDR2和CDR3的一致序列。

抗体A-1/A-14的轻链CDRs以及示例性抗体A-1/A-14的重链CDRs见表1。A-1至A-14对应于下文的L1至L14以及下文的H1至H14。也显示了编码CDRs氨基酸序列的多聚核苷酸序列。

另一方面，本发明提供包含选自L1-L14的轻链可变区或选自H1-H14的重链可变区及其片段、衍生物、突变蛋白或变异体的抗体。可用名称“LxHy”表示该类抗体，其中“x”对应于轻链可变区并且“y”对应于重链可变区。例如，L2H1指具有包含如下文表2所示L2氨基酸序列的轻链可变区和包含H1氨基酸序列的重链可变区的抗体。本发明抗体包括例如包含选自组合L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13和L14H14的轻链和重链可变结构域的组合。在一个实施方案中，该抗体为鼠源抗体或其人源化抗体。

表1

轻链L1-L12

重链H1-H12

表2提供了编码示例性ET_AR抗体的可变轻链和可变重链结构域的氨基酸序列的多聚核苷酸(DNA)序列(SEQ ID NO:137-192)。

轻链可变区多聚核苷酸和氨基酸序列：

L1(A-1)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:137，氨基酸序列SEQ ID NO:138。

L2(A-2)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:139，氨基酸序列SEQ ID NO:140。

L3(A-3)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:141，氨基酸序列SEQ ID NO:142。

L4(A-4)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:143，氨基酸序列SEQ ID NO:144。

L5(A-5)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:145，氨基酸序列SEQ ID NO:146。

L6(A-6)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:147，氨基酸序列SEQ ID NO:148。

L7(A-7)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:149，氨基酸序列SEQ ID NO:150。

L8(A-8)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:151，氨基酸序列SEQ ID NO:152。

L9(A-9)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:153，氨基酸序列SEQ ID NO:154。

L10(A-10)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:155，氨基酸序列SEQ ID NO:156。

L11(A-11)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:157，氨基酸序列SEQ ID NO:158。

L12(A-12)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:159，氨基酸序列SEQ ID NO:160。

L13(A-13)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:161，氨基酸序列SEQ ID NO:162。

L14(A-14)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:163，氨基酸序列SEQ ID NO:164。

重链可变区多聚核苷酸和氨基酸序列：

H1(A-1)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:165，氨基酸序列SEQ ID NO:166。

H2(A-2)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:167，氨基酸序列SEQ ID NO:168。

H3(A-3)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:169，氨基酸序列SEQ ID NO:170。

H4(A-4)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:171，氨基酸序列SEQ ID NO:172。

H5(A-5)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:173，氨基酸序列SEQ ID NO:174。

H6(A-6)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:175，氨基酸序列SEQ ID NO:176。

H7(A-7)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:177，氨基酸序列SEQ ID NO:178。

H8(A-8)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:179，氨基酸序列SEQ ID NO:180。

H9(A-9)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:181，氨基酸序列SEQ ID NO:182。

H10(A-10)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:183，氨基酸序列SEQ ID NO:184。

H11(A-11)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:185，氨基酸序列SEQ ID NO:186。

H12(A-12)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:187，氨基酸序列SEQ ID NO:188。

H13(A-13)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:189，氨基酸序列SEQ ID NO:190。

H14(A-14)：多聚核苷酸序列SEQ ID NO:191，氨基酸序列SEQ ID NO:192。

本发明抗体的具体实施方案包含与上文所列CDRs和/或FRs(骨架区)的氨基酸序列相同的一个或多个氨基酸序列。在一个实施方案中，该抗体包含上文所列轻链CDR1序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的轻链CDR2序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的轻链CDR3序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的重链CDR1序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的重链CDR2序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的重链CDR3序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的轻链FR1序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的轻链FR2序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列轻链FR3序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列轻链FR4序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列重链FR1序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列重链FR2序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列重链FR3厚列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列重链FR4序列。

在另一个实施方案中，该抗体的CDR3序列与来自A-1的CDR3序列的差异最多不超过6、5、4、3、2、1或0个单氨基酸添加、替换和/或缺失。在另一个实施方案中，抗体的轻链CDR3序列与上述A-1的轻链CDR3序列的差异不得超过6、5、4、3、2、1或0个单氨基酸添加、替换和/或缺失并且抗体的重链CDR3序列与上文所述A-1/A-2的重链CDR3序列的差异最多不超过6、5、4、3、2、1或0个单氨基酸添加、替换和/或缺失。在另一个实施方案中，抗体进一步包含1、2、3、4或5个CDR序列，各序列独自与A-1的CDR序列的差异最多不超过6、5、4、3、2、1或0个单氨基酸差异。在另一个实施方案中，抗体包含上文所列轻链可变区的CDRs和重链可变区的CDRs。在另一实施方案中，抗体包含上文所述的1、2、3、4、5和/或6个一致CDR序列。在一个实施方案中，该抗体为鼠源抗体。

在一个实施方案中，该抗体(例如抗体或抗体片段)包含轻链可变结构域，其包含与选自L1的轻链可变结构域序列存在15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸差异的氨基酸序列，其中各该序列的差异独立为一个氨基酸残基的缺失、插入或替换。在另一个实施方案中，该轻链可变结构域包含与选自L1的轻链可变结构域至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该轻链可变结构域包含与下文所列L1多聚核苷酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该轻链可变结构域包含在中等条件下与编码选自L1的轻链可变结构域的多聚核苷酸互补序列杂交的多聚核苷酸编码的氨基酸序列。在另一个实施方棠中，该轻链可变结构域包含在严格条件下与编码选自L1的轻链可变结构域的多聚核苷酸的互补序列杂交的多聚核苷酸编码的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，本发明提供包含重链可变结构域的抗体，该可变结构域包含选自H1的重链可变结构域序列存在15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个残基存在差异的氨基酸序列，其中各该序列差异独立为一个氨基酸的缺失、插入或替换。在另一个实施方案中，该重链可变结构域包含与选自H1的重链可变结构域序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该重链可变结构域包含在中等严格条件下与编码选自H1的重链可变结构域的多聚核苷酸互补序列杂交的多聚核苷酸编码的氨基酸序列。在一个实施方案中，该重链可变结构域包含在严格条件下与编码选自H1的重链可变结构域的多聚核苷酸互补序列杂交的的多聚核苷酸编码的氨基酸序列。

本发明的抗体(例如，抗体、抗体片段和抗体衍生物)可包含本领域已知的任何恒定区。轻链恒定区可为例如κ或λ型轻链恒定区，例如小鼠κ或λ型轻链恒定区。重链恒定区可为例如α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区，例如小鼠α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区。在一个实施方案中，该轻链或重链恒定区为天然恒定区的片段、衍生物、变异体或突变蛋白。

已知从相关抗体衍生不同亚类或同种型抗体的技术，即亚类转换(subclassswitching)。因此，可从IgM抗体衍生IgG抗体，反之亦然。这类技术允许制备具有给定抗体(母体抗体)的抗原结合性质的新抗体，但是也显示与母体抗体不同的抗体同种型或亚类相关的生物学性质。也可应用重组DNA技术。可在该操作中应用编码具体抗体多的已克隆DNA，例如编码期望同种型的抗体恒定结构域的DNA。也可参见Lanitto等，2002，MethodsMol.Biol.178:303-16。

在一个实施方案中，本发明的抗体进一步包含恒定轻链κ或λ结构域或这些的片段。轻链恒定区序列和它们的编码多聚核苷酸提供如下，

轻链恒定区：

多聚核苷酸(κ)，(SEQ ID NO:193)

氨基酸(κ)，(SEQ ID NO:194)

多聚核苷酸(λ)，(SEQ ID NO:195)

氨基酸(λ)，(SEQ ID NO:196)

在另一个实施方案中，本发明抗体进一步包含重链恒定结构域或其片段如下,

重链恒定区：

多聚核苷酸(IgG1)，(SEQ ID NO:197)

氨基酸(IgG1)，(SEQ ID NO:198)

本发明抗体(例如抗体)包括例如包含组合L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13和L14H14并具有期望表型(例如，IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgE和IgD)以及其Fab或F(ab')₂片段的那些。

本发明抗体(例如抗体)包括例如包含组合L1H1并具有期望表型(例如，IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgE和IgD)以及其Fab或F(ab')₂片段的那些。

抗体和抗体片段

在一个实施方案中该抗体为抗体。术语“抗体”指完整抗体或其抗原结合片段，如定义部分所广泛描述。抗体可包含完整的抗体分子(包括具有全长重和/或轻链的多克隆、单克隆、嵌合、人源化或人类抗体)或包含其抗原结合片段。抗体片段包括F(ab’)2、Fab、Fab’、Fv、Fc和Fd片段，并可整合入单结构域抗体、单链抗体、最大抗体(maxibodies)、微抗体(minibodies)、内抗体(intrabodies)、二链抗体、三链抗体、四链抗体、v-NAR和bis-scFv(参见，例如Hollinger and Hudson，2005，Nature Biotechnology 23:1126-1136)。也包括抗体多肽例如美国专利号6703199中所公开的那些，包括纤维结合素多肽单抗体。其它抗体多肽公开于美国专利出版物2005/0238646，其为单链多肽。在一个实施方案中，本发明该抗体包含上文表2所列的至少一个CDR或一致CDR。

在一个实施方案中，使用核苷酸引物扩增在杂交瘤中表达相关单克隆抗体的基因的可变区。这些引物可由本领域普通技术人员合成或从商业来源购买(参见，例如Stratagene，La Jolla，California)，其销售鼠和人可变区引物包括V_Ha、V_Hb、V_Hc、V_Hd、C_H1、V_L和C_L区的引物)。这些引物可用于扩增重链或轻链可变区，然后将其分别插入载体例如ImmunoZAP^TMH或IlllfflunoZAP^TML(Stratagene)中。然后将这些载体引入大肠杆菌、酵母或哺乳动物为基础的表达系统。可使用这些方法生产大量包含V_H和V_L结构域融合的单链蛋白(参见Bird等，1988，Science 242:423-426)。

一旦使用上述任何免疫和其它技术获得了根据本发明生产抗体的细胞，可根据本文所述标准方法通过分离并从其扩增DNA或mRNA将特异抗体基因克隆。测序从其生产的抗体并鉴定CDRs，可如之前所述对编码CDRs的DNA进行操作以生成根据本发明的其它抗体。

本发明的抗体优选在本文描述的基于细胞的测定法中和/或本文描述的体内测定法中调节内皮素信号传导和/或交叉阻断本申请所述抗体之一的结合和/或经本申请所述抗体之一被结合ET_AR交叉阻断。因此可使用本文所述测定法鉴定该类结合剂。

在一些实施方案中，通过首先鉴定在本文描述的基于细胞的和/或体内测定法中与过表达ET_AR的细胞结合和/或中和和/或交叉阻断本申请描述的抗体和/或经本申请描述的抗体之一被结合ET_AR交叉阻断的抗体以生成抗体。

本领域技术人员应理解的是一些蛋白质，例如抗体，可能进行可多种转录后修饰。这些修饰的类型和程度取决于用于表达该蛋白的宿主细胞系以及培养条件。该类修饰包括糖基化作用、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺作用的变化。由于羧肽酶的作用频繁修饰导致羧端碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)的丢失(如Harris，1995，Journal of Chromatography 705:129-134中所述)。

生产鼠单克隆抗体的可选择方法为将杂交瘤细胞注入同系基因小鼠的腹膜腔，例如经处理(例如姥鲛烷初次免疫)促进形成包含单克隆抗体的腹水的小鼠。可通过多种已确立的技术分离和纯化单克隆抗体。该类分离技术包括使用蛋白A-琼脂糖的亲和色谱法、分子排阻色谱法和高子交换色谱法，参见，例如，Coligan第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页；Baines等，“Purification of Immunoglobulin G(IgG),”Methods in MolecularBiology，第10卷，第79-104页(The Humana Press，Inc.，1992)。可使用基于抗体的特殊性质(例如，重链或轻链同种型、结合特异性等)筛选的适当配基通过亲和色谱法纯化单克隆抗体。固定化于固体载体的适当配基的实例包括蛋白A、蛋白G、抗恒定区(轻链或重链)抗体、抗独特型抗体以及TGF-p结合蛋白或其片段或变异体。

可使用抗体结合位点中央的互补决定区(CDRs)的分子进化分离亲和性增加的抗体，例如对c-erbB-2亲和性增加的抗体，如Schier等，1996，J.Mol.Biol.263:551-567所述。因此，该类技术可用于制备人内皮素受体的抗体。

例如可在检测是否存在内皮素受体的体外或体内测定法中使用针对人内皮素受体的抗体。

也可通过任何传统技术制备抗体。例如，可从天然表达这些抗体的细胞将其纯化(例如，可从生产抗体的杂交瘤将其纯化)或使用本领域任何已知的技术在重组表达系统中生产。参见，例如，Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in BiologicalAnalyses,Kennet等编辑，Plenum Press(1980)；和Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Land编辑,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)。这在下文的核酸部分讨论。

可通过任何已知技术制备抗体并筛选期望性质。一些技术涉及分离编码相关抗体(例如，抗内皮素受体抗体)的多肽链(或其部分)的核酸，并通过重组DNA技术操作核酸。该核酸可与另一相关核酸融合或经修饰(例如通过诱变或其它传统技术)以添加、缺失或替换一个或多个氨基酸残基。

当需要提高根据本发明包含一个或多个上述CDRs的抗体的亲和性时，可通过多种亲和成熟方案包括维持CDRs(Yang等，1995，J.Mol.Biol.254:392-403)、链替换(Marks等，1992，Bio/Technology 10:779-783)、使用大肠杆菌的突变株(Low等，1996，J.Mol.Biol.250:350-368)DNA重排(Patten等，1997，Curr.Opin.Biotechnol.8:724-733)、噬菌体展示(Thompson等，1996，J.Mol.Biol.256:7-88)以及其它PCR技术(Crameri等，1998，Nature 391：288-291)。所有这些亲和力成熟方法讨论于Vaughan等，1998，NatureBiotechnology 16:535-539中。

抗体片段

在另一方面本发明提供本发明抗内皮素受体片段。该片段可完全由抗体衍生序列组成或可包含附加序列。抗原结合片段的实例包括Fab、F(ab’)2、单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体和结构域抗体，其它实例提供于Lunde等，2002，Biochem.Soc.Trans.30:500-06。

可经氨基酸桥(短肽接头)连接重链和轻链可变结构域(Fv区)形成单链抗体，从而得到单多肽链。已通过将编码肽接头的DNA融合在编码两个可变结构域多肽(V_L和V_H)的DNAs之间制备该单链FVs(scFvs)。所得多肽可折叠回自身形成抗原结合单体，或它们可形成多聚体(例如，二聚体、三聚体或四聚体)，取决于两个可变结构域之间的柔性接头的长度(Kortt等，1997，Prot.Eng.10:423；Kortt等2001，Biomol.Eng.18:95-108)。通过组合包含多肽的不同V_L和V_H，可形成与不同表型结合的多体scFvs(Kriangkum等，2001，Biomol.Eng.18:31-40)。已研发的用于生产单链抗体的技术包括美国专利号4946778；Bird，1988，Science 242:423；Huston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Ward等，1989，Nature 334:544-546；de Graaf等，2002，Methods Mol Biol.178:379-87申描述的那些。来源于本文提供的抗体的单链抗体包括但不限于包含可变结构域组合L1H1的scFvs，均涵盖于本发明。

也可通过抗体的蛋白水解作用例如根据传统方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整的抗体获得来源于抗体的抗原结合片段。举例而言，可用胃蛋白酶酶裂解抗体提供称作F(ab’)2的SS片段生产抗体片段。可使用巯基还原剂进一步裂解这一片段产生3.5S Fab’单价片段。可选择性的，可使用巯基保护基团进行该裂解反应得到二硫键的裂解。作为可选择的，使用木瓜蛋白酶的酶裂解直接产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。这些方法描述于例如Goldenberg，美国专利号4,331,647，Nisonoff等，1960，Arch.Biochem.Biophys.89:230；Porter，1959，Biochem.J.73:119；Edelman等，Methods in Enzymology l:422(Academic Press，1967)；以及Andrews和Titus,J.A.Current Protocols in Immunology(Coligan等编辑，John Wiley&Sons,2003)，第2.8,1-2.8.10页和第2.10A.1-2.10A.5页。其它裂解抗体的方法，例如制备重链以形成单价重、轻链片段(Fd)，进一步裂解片段或也可使用其它酶、化学或基因技术，只要片段与可被该完整抗体识别的抗原结合。

另一种形式的抗体片段为包含一个或多个抗体互补决定区(CDRs)的肽。可通过构建编码相关CDR的多肽获得CDRs。例如可通过使用聚合酶链式反应用抗体生成细胞的mRNA作为模板合成可变区制备该类多肽，参见，例如，Larrick等，1991，Methods:A Companionto Methods in Enzymology 2:106；Courtenay-Luck，“Genetic Manipulation ofMonoclonal Antibodies,”Monoclonal Antibodies:Production,Engineering andClinical Application，Ritter等编辑，166页(Cambridge University Press，1995)；和Ward等，“Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,”MonoclonalAntibodies:Principles and Applications，Birch等编辑，137页(Wiley-Liss，Inc.，1995)。该抗体片段可进一步包含本文所述抗体的至少一个可变结构域。因此，例如，V区结构域可为单体并且是V_H或V_L结构域，其可以如下文所述的至少等于1x 10^-7M或更低的亲和度独立与内皮素受体结合。

该可变区结构域可为任何天然可变结构域或其基因工程形式。基因工程形式指使用重组DNA工程技术生产的可变区结构域。该基因工程形式包括例如通过向特异抗体的氨基酸序列插入、缺失或改变从特异抗体可变区产生的。具体实例包括包含只含一个CDR以及任选来自一个抗体的一个或多个框架氨基酸和来自另一抗体的可变区结构域剩余部分的基因工程可变区结构域。

可变区结构域可与至少一个其它抗体结构域或其片段在C端氨基酸共价连接。因此，举例而言，存在于可变区结构域的V_H结构域可与免疫球蛋白CH1结构域或其片段相连。相似地，V_L结构域可与C_K结构域或其片段相连。以这种方式，例如，该抗体可为Fab片段，其中抗原结合结构域包含它们的C端分别与CH1和C_K结构域共价连接的联合V_H和V_L结构域。可用其它氨基酸延长C_H1结构域，例如以提供铰链区或如Fab’片段中的部分铰链结构域或提供其它结构域，例如抗体CH2和CH3结构域。

抗体的衍生物和变异体

例如可通过随机诱变或通过定点诱变(例如寡聚核苷酸诱导的定点诱变)改变编码对应于氨基酸序列A-1/A-2的核苷酸序列L1和H1以产生与未突变多聚核苷酸相比包含一个或多个具体核苷酸替换、缺失或插入的经改变的多聚核苷酸。用于产生该类改变的技术实例描述于Walder等，1986，Gene 42:133；Bauer等，1985，Gene 37:73；Craik,1985,BioTechniques,3:12-19；Smith等，1981,Genetic Engineering:Principles andMethods，Plenum Press；以及美国专利号4518584和4737462。这些和其它方法可用于产生例如与未衍生化抗体相比具有期望性质例如亲和性、亲和力或对内皮素受体的特异性增强、体内或体外活性或稳定性增强或体内副作用降低的抗内皮素受体抗体的衍生物。

本发明领域的其它抗内皮素受体抗体衍生物包括抗内皮素受体抗体或其片段与它蛋白或多肽的共价或聚集结合物，例如通过表达包含与抗内皮素受体抗体多肽的N端或C端融合的异源多肽的重组融合蛋白。例如，该结合肽可为异源信号(或引导)多肽，例如酵母α因子前导肽或例如表位标签的肽。包含融合蛋白的抗体可包含被添加以辅助抗体的纯化或鉴定的肽(例如多聚组氨酸)。抗体也可与FLAG肽连接，如Hopp等，1988,Bio/Technology6:1204和美国专利5011912所述。FLAG肽具有高抗原性并提供被特异单克隆抗体(mAb)可逆结合的表位，允许已表达重组蛋白的快速检测和方便纯化。可商业购买(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)用于制备其中FLAG肽与给定多肽融合的融合蛋白的试剂，在另一个实施方案中，包含一个或多个抗体的寡聚体可用作内皮素受体拮抗剂或用更高级的寡聚体。寡聚体可以是共价连接的或非共价连接的二聚体、三聚体或更高的寡聚体形式。可使用包含两个或更多个抗体的寡具体，其中一个实例为同型二聚体。其它寡聚体包括异二聚体、同型三聚体、异三聚体、同型四聚体、杂四聚体等。

一个实施方案是针对包含多个抗体的寡聚体，它们通过与抗体融合的肽部分之间的共价或非共价相互作用连接。该类肽可为肽接头(spacers)或具有促进寡聚化作用性质的肽。亮氨酸拉链和某些来源于抗体的多肽为可促进抗体寡聚化的肽，如下文详细描述。

在具体的实施方案中，寡聚体包含两个至四个抗体。寡聚体的抗体可为任何形式，如上文所述任何形式，例如变异体或片段。优选地，该寡聚体包含具有内皮素受体结合活性的抗体。

在一个实施方案中，使用来源于免疫球蛋白的多肽制备寡聚体。制备包含一些与抗体衍生多肽(包括Fc结构域)的不同部位融合的异源多肽已描述于例如Ashkenazi等，1991，PNAS USA 88:10535；Byrn等，1990,Nature 344:677；和Hollenbaugh等，Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins,Current Protocols inImmunology,Suppl.4，第10.19.1-10.19.11页。本发明的一个实施方案是针对包含两个由融合抗内皮素受体抗体的内皮素结合片段与抗体的Fc区产生的融合蛋白的二聚体。可通过以下方式制备二聚体：例如在适当的表达载体中插入编码融合蛋白的基因融合，在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达该融合基因并允许已表达融合蛋白像抗体分子一样组装，其中Fc部分之间的链间二硫键形成二聚体。

如本文所使用术语“Fc多肽”包括来源于抗体Fc区的天然和突变蛋白形式的多肽。也包括包含促进二聚体化的铰链区的该类多肽的截短形式。包含Fc部分(以及由其形成的寡聚体)的融合蛋白提供了在蛋白A或蛋白G柱子上进行亲和层析法方便纯化的优势。

PC申请W0 93/10151(以参考形式并于本文)中一种适当的Fc多肽为从N端铰链区延伸至人IgG1抗体的Fc区的天然C端的单链多肽。另一种可用的Fc多肽为美国专利5457035和Baum等，1994,EMBO J.13:3992-4001中描述的Fc突变蛋白。该突变蛋白的氨基酸序列与W0 93/10151中所示天然Fc序列的氨基酸序列相同，除了氨基酸19从亮氨酸变为丙氨酸，氨基酸20从亮氨酸变为谷氨酰胺以及氨基酸22从甘氨酸变为丙氨酸。该突变蛋白表现出对Fc受体的亲和力降低。在其它实施方案中，抗内皮素受体抗体的重链和/或轻链可被取代为抗体重链和/或轻链的可变部分。

或者，该寡聚体为包含多个抗体的融合蛋白，包含或不包含接头肽(spacerpeptides)。这些适当的接头肽描述于美国专利4751180和4935233。

制备寡聚抗体的另一种方法涉及使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链结构域为促进它们所存在的蛋白寡聚化作用的肽。最初发现亮氨酸拉链存在于数种DNA结合蛋白中(Landschulz等，1988，Science 240:1759)，此后发现存在于各种不同蛋白中。在已知的亮氨酸拉链中为可二聚体化或三聚体化的天然肽或其衍生物。适用于生产可溶寡聚蛋白的亮氨酸拉链结构域的实例描述于PCT申请W0 94/10308，来源于肺表面活性蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链描述于Hoppe筝，1994，FEBS Letters 344:191，以参考形式并于本文。允许与其融合的异源蛋白稳定三聚体化的经修饰的亮氨酸拉链的使用描述于Fanslow等，1994，Semin.Immunol.6:267-78。在一种方法中，在适当的宿主细胞中表达包含与亮氨酸拉链肽融合的抗内皮素受体抗体片段或衍生物的重组融合蛋白，从培养物上清中收集可溶寡聚抗内皮素受体抗体片段或其衍生物。

在另一个实施方案中，该抗体衍生物可包含至少本文公开的CDRs之一。举例而言，可将一个或多个CDR整合入已知的抗体骨架区(IgG1，IgG2等)或与适当的载体结合以增强其半衰期。适当载体包括但不限于Fc、白蛋白、转铁蛋及类似物质。这些和其它适当的载体为本领域已知。该结合CDR肽可为单体、二聚体、四聚体或其它形式。在一个实施方案中，一个或多个水溶性多聚体在结合剂的一个或多个特异位点结合，例如在氨基端。在一个实例中，抗体衍生物包含一个或多个水溶性多聚体附着物包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙二醇。参见，例如，美国专利号4640835、4496689、4301144、4670417、4791192和4179337，在一些实施方案中，衍生物包含一个或多个一甲氧基.聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其它基于碳水化合物的聚合物，聚(N-乙烯基吡咯酮).聚乙二醇、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇，以及该类聚合物的混合物。在一些实施方案中，一个或多个水溶性聚合物与一个或多个侧链随机结合。在一些实施方案中。PEG可提高结合剂例如抗体的治疗作用。一些该类方法描述于例如美国专利号6133426，其以参考形式以任何目的并于本文。

应当理解的是本发明抗体可具有至少一个氨基酸替换，只要该抗体保留了结合特异性。因此，抗体结构的修饰包含于本发明范畴。这些可包括不破坏抗体内皮素受体结合能力的氨基酸替换，其可为保守或非保守的。保守氨基酸替换可包括非天然氨基酸残基，其通常经化学肽合成整合而不是生物系统合成。这些包括拟肽和其它反向或倒转形式的氨基酸部分。保守氨基酸替换也可涉及用非天然残基替换天然氨基酸残基这样对该位点氨基酸残基的极性或电荷作用很小或没有作用。非保守替换可涉及一类氨基酸或氨基酸类似物的一个成员与具有不同物理性质(例如，体积、极性、疏水性、电荷)的另一类氨基酸的成员交换。

而且，本领域技术人员可生成在各期望氨基酸残基上包含氨基酸替换的待测变异体。可使用本领域技术人员已知的活性测定法筛选该类变异体。该类变异体可用于收集关于适当变异体的信息。举例而言，如果发现某一氨基酸残基可引起活性破坏、非期望的降低或不当的活性，可避免具有该类变化的变异体。换言之，基于从这些常规试验收集的信息，本领域技术人员可轻松确定应避免进一步替换(单独或与其它突变组合)的氨基酸。

技术人员可使用已知技术确定如本文所列的多肽的适当变异体。在一些实施方案中，本领域技术人员可通过靶向对于活性不重要的区域鉴定经改变后不会破坏活性的分子适当区域。在一些实施方案中，可鉴定在相似多肽中保守的残基或分子部分。在一些实施方案中，甚至可保守替换对于生物活性或结构重要的区域而不破坏生物活性或不会不利作用于多肽结构。此外，本领域技术人员可考察结构.功能研究鉴定对活性或结构重要的相似多肽中的残基。鉴于这一对比，可预测对应于在相似蛋白中对活性或结构重要的氨基酸残基的蛋白质中氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可为这些经预测重要的氨基酸残基选择化学相似氨基酸替换。

本领域技术人员也可分析与相似多肽的结构相关的三维结构和氨基酸序列。鉴于该类信息，本领域技术人员可预测就三维结构而言抗体的氨基酸残基比对。在一些实施方案中，本领域技术人员可选择不对经预测在蛋白质表面的氨基酸残基进行显著改变，因为该类残基可能参与与其它分子的重要相互作用。许多科学出版物致力于二级结构的预测。参见，Moult，1996，Curr.Op.Biotech.7:422-427，Chou等，1974，Biochemistry 13:222-245；Chou等，1974，Biochemistry 113:211-222；Chou等，1978，Adv.Enzymol.Relat.AreasMol.Biol.47:45-148；Chou等，1979，Ann.Rev.Biochem.47:251-276和Chou等，Biophys.J.26:367-384。此外，目前可使用计算机程序辅助预测二级结构。举例而言，序列同一性大于30％或相似性大于40％的两个多肽或蛋白质通常具有相似的结构拓扑学。近期蛋白结构数据库(PDB)的增长增强了二级结构的可预测性，包括多肽或蛋白结构中潜在的折叠数量。参见，Holm等，1999，Nucl.Acid.Res.27:244-247。已表明(Brenner等，1997，Curr.Op.Struct.Biol.7:369-376)在给定多肽或蛋白质中存在有限数量的折叠并且一旦确定了临界数量的结构，结构预测将变得显著更加精确。

预测二级结构的其它方法包括“穿接(threading)”(Jones，1997，Curr.Opin.Struct.Biol.,7:377-87；Sippl等，1996，Structure 4:15-19；“图谱分析(profile analysis)”(Bowie等，1991，Science 253:164-170；Gribskov等，1990，Meth.Enzym.183:146-159；Gribskov等，1987，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 84:4355-4358和“进化联系(evolutionary linkage)”(参见Holm,supra(1999),and Brenner,supra(1997))。在一些实施方案中，抗体变异体包括糖基化变异体，其中与母体多肽的氨基酸序列相比改变了糖基化位点的数量和/或类型。在一些实施方案中，变异体与天然蛋白质相比具有更多或更少数量的N连接糖基化位点。或者，去除该序列的替换可移除现有的N连接糖链。也提供了N连接糖链的重排，其中去除了一个或多个N连接糖链位点(通常为天然存在的那些)并创造了一个或多个新的N连接位点。其它优选抗体变异体包括半胱氨酸变异体，与母体氨基酸序列相比其中缺失或由另一氨基酸(例如丝氨酸)替换一个或多个半胱氨酸残基。当抗体必须折叠成生物活性构象时(例如在分离可溶包涵体之后)可用半胱氨酸变异体。半胱氨酸变异体通常比天然蛋白质具有较少的半胱氨酸残基，并通常具有偶数个半胱氨酸以最小化未配对半胱氨酸引起的相互作用。

本领域技术人员可在需要该类替换时确定期望的氨基酸替换(保守或非保守)。在一些实施方案中，氨基酸替换可用于鉴定人内皮素受体抗体的重要残基或者增加或降低本文所述人内皮素受体抗体的亲和力。

根据一些实施方案，优选的氨基酸替换为以下：(1)降低蛋白质水解敏感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力和/或(4)赋予或修饰该类多肽上的其它物理化学或功能性质。根据一些实施方案，可在天然存在序列中(在一些实施方案中，在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分)进行单个或多个氨基酸替换(在一些实施方案中为保守氨基酸替换)。在一些实施方案中，保守氨基酸替换通常不会本质上改变母体序列的结构特性(例如，替换氨基酸不应破解存在于母体序列中的螺旋或干扰特征化母体序列的其它类型二级结构)。本领域队可的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins，Structures and Molecular Principles，Creighton编辑，W.H.Freeman and Company(1984)；Introduction to Protein Structure，Branden andTooze编辑,Garland Publishing(1991)；以及Thornton等，1991,Nature 354:105，其以参考形式并于本文。

在一些实施方案中，本发明抗体可与多聚体、脂类或其它部分(moieties)化学键合。

抗原结合试剂可包含至少一个本文描述的CDRs，其掺入生物相容性骨架结构中。在一个实例中，该生物相容性骨架结构包含足以形成构象稳定结构支持或骨架或支架的多肽或其部分，其可在局限的表面区域展示可与抗原结合的一个或多个氨基酸序列(例如，CDRs、可变区等)。该类结构可为天然存在多肽或多肽“折叠”(结构基序)，或相对与天然多肽或折叠可具有一个或多个修饰，例如氨基酸添加、缺失或替换。这些支架可来源于任何物种(或多于一个物种)的多肽，例如，人类、其它哺乳动物、其它脊椎动物、无脊椎动物、细菌或病毒。

生物可溶性骨架结构通常是基于蛋白质支架或骨架而不是免疫球蛋白结构域。举例而言，可使用基于纤维结合素、锚蛋白、脂质运载蛋白(lipocalin)、新抑癌蛋白、细胞色素b、CP1锌指蛋白、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1、Z结构域和淀粉酶抑肽结构域(参见，例如，Nygren和Uhlen,1997,Current Opinion in Structural Biology 7:463-469)。

此外，本领域技术人员可认识到适当的结合剂包括这些抗体的部分，例如一个或多个重链CDR1、CDR2、CDR3，轻链CDR1、CDR2和CDR3，如本文所具体公开。至少一个重链CDR1、CDR2、CDR3、CDR1，CDR2和CDR3区具有至少一个氨基酸替换，只要该抗体保留了非替换CDR的结合特异性。该抗体的非CDR部分可为非蛋白分子，其中该结合剂交叉阻断本文公开的抗体与人ET_AR的结合和/或抑制经该受体的内皮素信号传导。该抗体的非CDR部分可为非蛋白质分子，其中该抗体在竞争结合测定法中显示出与至少抗体A-1/A-2之一所显示相似的与人ET_AR肽的结合类型，和/或中和内皮素的活性。抗体的非CDR部分可由氨基酸组成，其中该抗体为重组结合蛋白或合成肽，并且该重组结合蛋白交叉阻断本文公开的抗体与人ET_AR的结合和/或中和体内或体外内皮素活性。抗体的非CDR部分可由氨基酸组成，其中该抗体为重组抗体，并且该重组抗体在竞争结合测定法中显示出与至少抗体A-1/A-2之一所显示相似的与人ET_AR肽的结合类型，和/或中和内皮素信号传导。

核酸

一方面，本发明提供分离的核酸分子。该核酸分子包含例如编码全部或部分抗体的多聚核苷酸，例如本发明抗体的一条链或两条链，或其片段、衍生物、突变蛋白或变异体；足以用作杂交探针的多聚核苷酸；PCR引物或用于鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多聚核苷酸的测序引物；用于抑制多聚核苷酸表达的反义核酸以及其互补序列。该核酸可为任何长度。例如它们的长度可为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1500、3000、5000或更多个核苷酸，和/或包含一个或多个附加序列，例如调控序列，和/或是较大核酸例如载体的一部分。该核酸可为单链或双链并包含RNA和/或DNA核苷酸以及其人工变异体(例如，肽核酸)。

可从经ET_AR抗原免疫的小鼠B细胞中分离编码抗体多肽(例如，重链或轻链、仅可变结构域或全长)的核酸。可通过常规方法例如聚合酶链式反应(PCR)分离该核酸。

编码重链和轻链可变区的核酸序列如上文所示。熟练的技术人员可理解由于遗传密码的简并性，本文公开的各多肽序列可由更多数量的其他核酸序列编码。本发明提供编码本发明抗体的各简并核苷酸序列。

本发明进一步提供在具体杂交条件下与其他核酸(例如，包含任何A-1/A-2的核苷酸序列的核酸)杂交的核酸。杂交核酸的方法为本领域熟知。参见，例如，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Son(1989)，6.3.1-6.3.6。如本文定义，例如，中等严格条件使用包含5X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)的预洗溶液、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)、约50％甲酰胺的杂交缓冲液、6X SSC和55℃的杂交温度(或其他相似的杂交溶液，例如包含绚50％甲酰胺的，以42℃杂交)，并且洗脱条件为60℃，使用0.5X SSC、0.1％SDS。严格杂交条件在6X SSC中于45℃杂交，然后于68℃在0.1X SSC、0.2％SDS中洗涤一次或多次。此外，本领域技术人员可操作杂交和/或洗涤条件以增加或降低杂交严格度这样包含相互之间至少65、70、75、80、85、90、95、98或99％同源的核苷酸序列的核酸通常仍可以相互杂交。影响杂交条件选择的基本参数和设计适当条件的指导列于例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press，第9和11章；Current Protocols in Molecular Biology，1995，Ausubel等编辑，John Wiley&Sons，Inc.，第2.10和6.3-6.4节)并可由具有本领域普通技术的人员基于例如DNA的长度和/或碱基组成轻松确定。可通过突变在核酸中引入变化，藉此导致其编码的多肽(例如，抗原结舍蛋白)氨基酸序列的变化。可使用本领域已知的任何技术引入突变。在一个实施方案中，使用例如定点诱变方案改变一个或多个具体氨基酸残基。在另一个实施方案中，使用例如随机诱变方案改变一个或多个随机选择的残基。无论其如何生成，可表达突变多肽并筛选期望性质。

可将突变引入核酸而不显著改变其编码多肽的生物学活性。例如，可进行引起非必需氨基酸残基处氨基酸替换的核苷酸替换。在一个实施方案中，突变本文为L-1至L-2和H-1至H-2提供的核苷酸序列或其片段、变异体或衍生物这样其编码包含本文所示L-1至L-2和H-1至H-2的氨基酸残基的一个或多个缺失或替换，成为两个或多个序列相异的残基。在另一个实施方案中，诱变作用在本文所示L-1至L-2和H-1至H-2的一个或多个氨基酸残基附近插入一个氨基酸成为两个或多个序列相异的残基。或者，可将一个或多个突变引入核酸以选择性改变其编码多肽的生物学活性(例如，与ET_AR结合)。例如，该突变可在数量上或性质上改变生物学活性。量变的实例包括增加、降低或消除该活性。质变的实例包括改变抗体的抗原特异性。

在另一方面，本发明提供适于用做引物或检测本发明核酸序列的杂交探针的核酸分子。本发明的核酸分子可仅包含编码本发明全长多肽的核酸序列的一部分，例如，可用作探针或引物或编码本发明多肽活性部分的片段(例如，ET_AR结合部分)的片段。

基于本发明核酸序列的探针可用于检测该核酸或相似核酸，例如编码本发明多肽的转录物。该探针可包含标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。该类探针可用于鉴定表达该多肽的细胞。

在另一方面本发明提供包含编码本发明多肽或其部分的核酸的载体。载体的实例包括但是不限于质粒、病毒载体、非游离基因哺乳动物载体和表达载体，例如重组表达载体。

本发明的重组表达载体可包含适于该核酸在宿主细胞中表达的形式的本发明核酸。该重组表达载体包括一个或多个调控序列，基于用于表达的宿主细胞进行筛选，其与该预表达的核酸序列可操作性相连。调控序列包括引导核苷酸序列在多个种类宿主细胞中组成型表达的(例如，SV40早期基因增强剂、劳斯氏肉瘤病毒启动子和细胞巨化病毒启动子)，引导仅在某些宿主细胞中核苷酸序列的表达的(例如，组织特异调控序列，参见Voss等，1986，Trends Biochem.Sci.11:287，Maniatis等，1987，Science 236:1237，其完整内容以参考形式并于本文)以及引导核苷酸序列响应具体处理或条件的诱导型表达的(例如，哺乳动物细胞中的金属硫堇启动子和原核和真核系统二者中的四环霉素反应(tet-sesponsive)启动子和/或链霉素反应启动子(同前))。本领域技术人员应理解表达载体的设计取决于例如用于转化的宿主细胞的选择、所需蛋白表达水平等因素。本发明的表达载体可引入宿主细胞，藉此生产由本文所述核酸编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。

另一方面，本发明提供可引入本发明表达载体的宿主细胞。宿主细胞可为任何原核或真核细胞。原核宿主细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。更高级的真核细胞包括昆虫细胞、酵母细胞以及哺乳动物源的确立细胞系。适当哺乳动物宿主细胞系的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或它们的衍生物例如Veggie CHO和在无血清培养基中生长的相关细胞系(参见Rasmussen等，1998，Cytotechnology 28:31)或CHO株DXB-11，其缺失DHFR(参见Urlaub等，1980，Proc.Natl.Acad,Sci.USA 77:4216-20)。其它CHO细胞系包括CHO-K1(ATCC#CCL-61)、EM9(ATCC#CRL-1861)，和UV20(ATCC#CRL-1862)，其它宿主细胞包括猴肾细胞的COS-7系(ATCC#CRL-1651)(参见Gluzman等，1981，Cell 23:175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL-163)，AM-1/D细胞(描述于美国专利序列号6210924)、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL-10)细胞系、来源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL-70)(参见McMahan等，1991，EMBO J.10:2821)、人胚肾细胞例如293，293EBNA或MSR 293、人上皮A431细胞、人C010205细胞、其它经转化灵长动物细胞系、正常二倍体细胞、来源于初生组织体外培养物的细胞株、初移植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。用于细菌、真菌、酵母和哺乳细胞宿主的适当克隆和表达载体描述于Pouwels等(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,1985)。

可通过传统转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。对于稳定的哺乳动物转染而言，取决于使用的表达载体和转染技术，已知只有一小部分细胞可将外源DNA鏊合入它们的基因组中。为了鉴定和筛选这些整合子，通常将编码筛选标记(例如抗生素抗性)的基因与所关注基因一起引入宿主细胞。优选的筛选标记包括可赋予药物(如G418、潮霉素和甲氨喋呤)抗性的那些。在其它方法中可通过药物筛选鉴别包含被引入核酸的稳定转染细胞(例如，整合了筛选基因的细胞可存活，而其它细胞则死亡)。

可在提高多肽表达的条件下培养已转化细胞，可通过常规蛋白纯化方法回收多肽。一种该纯化方法描述于下文实施例。预用于本文的多肽包括基本同源的重组哺乳动物抗内皮素受体抗体多肽，其基本不含污染性内源材料。

抗体的活性

一方面，本发明提供能与人内皮素受体特异性结合的鼠源抗体或人源化抗体。该类抗体包括可减少或中和内皮素信号传导的拮抗或中和抗体。在一个实施方案中，抗体，例如本发明的抗体的IC₅₀值为100nM或更低；在另一个实施方案中，80nM或更低；在另一个实施方案中，60nM或更低。在另一个实施方案中，抗体例如本发明的鼠抗体可与人内皮素受体特异性结合，而且其IC₅₀值与参比抗体基本相似。在另一个实施方案中，抗体具有由下述实施例所描述的测定法(戎相似测定法)检测的与参比抗体基本相似的Kb(或Kd)。在本文中，术语“基本相似”意为与参比抗体的IC₅₀或Kb(或Kd)可比或约100％、99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或50％。参比抗体包括，例如，具有重链和轻链组合L1H1、L2H2的抗体。在一个实施方案中，参比抗体包括A-1。在另一个实施方案中，抗体例如本发明的鼠抗体或人源化抗体可与人内皮素受体特异性结合，并能降低动物模型的肺动脉高压。在一个实施方案中，与未处理动物相比肺动脉高压降低2％；在另一个实施方案中，与未处理动物相比肺动脉高压降低5％；在另一个实施方案中，与未处理动物相比肺动脉高压降低10％；在另一个实施方案中，与未处理动物相比肺动脉高压降低15％，在另一个实施方案中为20％，在另一个实施方案中为25％或更多。肺动脉高压降低量由剂量控制，对于动物或人类患者而言，治疗有效剂量是为将肺动脉高压降低至正常范围的剂量。

适应症

肺动脉高压是各种原因引起的静息状态下右心导管测得的肺动脉平均压(meanpulmonary arterial pressure，mPAP)≥25mmHg的一组临床病理生理综合征。由于肺血管重塑引起肺循环血流动力学改变，最终可导致右心衰竭，甚至死亡。肺动脉高压是我国临床常见疾病，其致残和致死率颇高，是严重危害患者身心健康，增加社会医疗负担的重大疾病。

肺动脉高压的程度取决于相关的心脏畸形，常见的引起继发性肺动脉高压的先天性心脏病包括：主动脉狭窄、主肺动脉窗、房间隔缺损、完全性房室间隔缺损、动脉缩窄、扩张性心肌病、右室双出口、肥厚性心肌病、二尖瓣狭窄、动脉导管未闭、单心室、永存动脉干、室间隔缺损。肺动脉高压主要累及肺动脉和右心，表现为右心室肥厚，右心房扩张。肺动脉主干扩张，周围肺小动脉稀疏。肺小动脉内皮细胞、平滑肌细胞增生肥大，血管内膜纤维化增厚，中膜肥厚，管腔狭窄，闭塞，扭曲变形，呈丛状改变。肺小静脉也可以出现内膜纤维增生和管腔阻塞。

本发明提供可与人内皮素受体特异性结合，降低动物模型肺动脉高压的抗体。可以明显改善动物模型的肺动脉高压的症状。

治疗方法

另一方面，治疗受试者的方法，包括给予治疗剂量的本发明提供的抗体。在一个实施方案中，抗体为鼠源抗体或人源化抗体。本文中，术语“受试者”指哺乳动物，包括人类，可与术语“患者”交替使用。鼠源抗体或其人源化抗体可用于治疗和控制患者体内肺动脉高压为特点的病症或症状。术语“治疗”包括减轻或预防至少一种症状或病症的其它方面，或者减轻疾病严重性，等等。本发明的抗体不需要产生完全治愈的效果，或根除疾病的所有症状或表现，即可构成有效治疗剂。如相关领域所公认，作为治疗剂的药物可减少给定疾病状态的严重程度，但不需消除疾病的所有表现即可被认为是有效的治疗剂。相似地，预防给药治疗不需在预防症状出现上完全有效即可构成有效预防剂。只减少疾病的影响(例如，通过减少其症状的数量或严重度，或通过提高另一治疗效果，或通过产生另一有效作用)，或者减少受试者中疾病发生或加重的可能性就已经足够。本发明的一个实施方案涉及包含以足以诱导反应具体病症严重性的指示剂高于基线水平的持续改善的量和时间给予患者抗体的方法。

如相关领域所理解，将包含本发明抗体的药用组合物以对适应症恰当的方式给予病人。在一个实施方案中，药物组合物包含本发明的鼠源抗体或人源化抗体。药物组合物可采用任意适当技术包括但不限于肠道外、局部或吸入给药。如果是注射，可通过例如关节内、静脉内、肌肉内、损伤区内、腹膜内或皮下途径，以快速注射或连续输注给予药用组合物。可考虑例如在疾病或损伤部位局部给药，如透皮给药和埋植剂持续释放给药。吸入给药包括例如鼻腔或口腔吸入、采用喷雾剂、以气雾剂形式吸入抗体等等。其它选择包括口腔制剂包括片剂、糖浆剂或锭剂。

以包含一个或更多其它组分例如生理学可接受载体、辅料或稀释剂的组合物形式给予本发明抗体是有利的。组合物可任选额外包含一个或更多如下所述的生理学活性剂。在多个具体实施方案中，组合物包含除一个或更多本发明抗体(例如鼠源抗体或人源化抗体)之外的一个、两个、三个、四个、五个或六个生理学活性剂。

在一个实施方案中，药物组合物包含本发明鼠源抗体或人源化抗体以及一个或更多选自以下的物质：pH适合于抗体的缓冲液、抗氧化剂例如抗坏血酸、低分子量多肽(例如含少于10个氨基酸的多肽)、蛋白质、氨基酸、糖例如糊精、络合物例如EDTA、谷胱甘肽、稳定剂和辅料。根据适当工业标准，也可加入防腐剂。可使用适当辅料溶液作为稀释剂将组合物配制成冻干粉末。适当组分在所用剂量和浓度下对受者无毒。可用于药物处方组分的进一步实例见Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版(1980)和20版(2000)，MackPublishing Company提供医学从业者使用的试剂盒，其包括一种或更多本发明抗体以及治疗本文讨论任何病症的标签或其它说明。在一个实施方案中，试剂盒包括以上述组合物形式装在一个或多个管型瓶中的一种或多种抗体的无菌制剂。

给药剂量和频率可根据以下因素而改变：给药途径、所用具体抗体、所治疾病的性质和严重度、症状为急性还是慢性以及患者的体积和总体症状。可通过本领域熟知的方法确定适当剂量，例如在临床试验中包括剂量放大研究。

本发明抗体可在例如一段时间内按规律间隔给药一次或多次。在具体实施方案中，在至少一个月或更长时间给药一次给予鼠源抗体或人源化抗体，例如一个、两个或三个月或者甚至不确定。对于治疗慢性症状，长期治疗通常最有效。但是，对于治疗急性症状，短期给药例如从一周至六周就已足够。通常，给予人类抗体直至患者表现出所选体征或指示剂高于基线水平的医学相关改善度为止。

本文提供的治疗方案的一个实例包括以适当剂量一周一次皮下注射抗体治疗肺动脉高压引起的症状。可持续每周或每月给予抗体直到达到所需结果例如病人症状消退。可按需要重新治疗，或者，可选择地，给予维持剂量。

可在使用抗体例如人类抗体治疗之前、进行中和/或之后监测病人肺动脉压，以检测其压力的任何变化。对于某些病症，肺动脉压的变化可随例如疾病进程等因素而变化。可用已知技术测定肺动脉压。

本发明方法和组合物的具体实施方案涉及使用例如抗体和一个或多个内皮素拮抗剂、两个或更多本发明抗体，或者本发明抗体和一个或更多其它内皮素拮抗剂。在进一步的实施方案中，单独或与其它用于治疗使患者痛苦的症状的药剂组合给予抗体。这些药剂的实例包括蛋白质以及非蛋白质药物。当联合给予多种药物时，如本领域所熟知其剂量应相应调整。“联合给药”组合疗法不限于同时给药，也包括在涉及给予患者至少一种其它治疗剂的疗程中至少给予一次抗原和蛋白的治疗方案。

另一方面，本发明提供制备治疗肺动脉高压及相关病症药剂的方法，其包含本发明抗体与药学可接受辅料中的混合物，用于治疗肺动脉高压的相关病症。药剂制备方法如上所述。

具体实施例：

1、免疫用抗原细胞稳定株的构建

接种CHO-DHFR-细胞至6孔板中，培养24h后转染质粒于6孔板中的细胞，hET_AR基因(核苷酸序列见SEQ ID NO:1，氨基酸序列见SEQ ID NO:2)克隆于修饰后的pIRES质粒(Clontech)，转染前更换培养液,按照Invitrogen公司推荐Lipofectamine 2000的转染条件进行转染。48小时后，再换为含有10nM MTX(甲氨碟呤)的完全培养基，每隔3天换液，待两周左右，出现稳定生长的克隆，消化分散细胞集落，待长至50％愈合度时，逐渐提高MTX的浓度进行分别加压筛选，直至MTX的浓度为10μM。构建的稳定细胞株分别进行FACS检测，利用多克隆ET_AR抗体(Abcam)鉴定加压后的细胞群体，筛选后的CHO-DHFR-hET_AR细胞膜上hET_AR有大量表达，最后经过亚克隆、鉴定获得6株ET_AR高表达细胞稳定株。

2、抗体的制备

将在弗氏佐剂中乳化的CHO-DHFR-hET_AR全细胞，以2×10⁶细胞/只的剂量皮下注射BALB/c小鼠(6-8周龄)。2周后，使用不完全弗氏佐剂乳化免疫原，加强免疫小鼠，此后每周加强一次。经过总共6次免疫后，通过剪尾的方式采血，离心分离血清，进行FACS检测血清效价。达到适合抗体滴度时，断颈处死小鼠，无菌状态下获取脾脏细胞。收集生长状态处于对数生长期的SP2/0细胞，2000rpm,3min离心，沉淀用无血清培养至重悬，再次离心-重悬，计数。混合脾脏细胞和SP2/0细胞，保证SP2/0:脾脏细胞≥1:1，共“洗涤-离心”3次。弹散最后一次离心后的沉淀，逐滴加入1mL预温的PEG-1350(30s内滴完)，上下吹吸1分钟，缓慢加入30mL预热的无血清培养基以终止PEG的融合作用，1500rpm，5min离心，弹散细胞沉淀，加入融合培养基，按每孔20000个脾细胞及5000个饲养层细胞铺于96孔板中,每孔100μL。融合后的杂交瘤细胞和饲养层细胞一起在96孔板中进行培养，并进行HAT(次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸苷)筛选，以除去非融合的细胞。10天后收取培养板中的杂交瘤细胞上清进行ELISA检测。

3、全细胞ELISA筛选

将CHO-DHFR-hET_AR过表达hET_AR细胞和不表达hET_AR的CHO-DHFR-细胞分别接种至96孔板，长至90％愈合度。除去细胞培养上清，PBS洗两遍，加入100μl 100％甲醇4℃固定10min。再加入100μl新鲜配制的0.6％H₂O₂-PBS，室温处理20min，PBS洗涤2遍。经过PBS-1％BSA封闭后，加入杂交瘤细胞上清4℃孵育90min。多次洗涤后，每孔加入100μl稀释的GxM-HRP-Fc二抗(Sigma-Aldrich)，37℃孵育0.5h。洗涤5次后,每孔加入100μl TMB显色底物，37℃反应15min，2M H₂SO₄终止，读取OD₄₅₀值。阳性对照为免疫小鼠的血清；阴性对照为细胞培养基上清。如图1所示，经过ELISA的初步检测，筛选到了数个分泌抗hET_AR抗体的阳性杂交瘤细胞株。选取这些分泌抗hET_AR抗体的杂交瘤株，进行克隆化以获得能稳定分泌针对hET_AR的细胞株。最后选取杂交瘤细胞分泌的抗体上清进行FACS验证。

4、抗体基因的克隆及亚克隆

收集分泌抗体的杂交瘤细胞，按照QIAGEN的mRNA抽提试剂盒操作规程，提取杂交瘤细胞的mRNA。然后将提取后的mRNA反转录成cDNA，逆转录引物为小鼠轻、重链恒定区的特异性引物，重链逆转录引物为(5’-TTTGGRGGGAAGATGAAGAC-3’)(SEQ ID NO:199)，轻链逆转录引物为(5’-TTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3’)(SEQ ID NO:200)和(5’-TTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’)(SEQ ID NO:201)。RT-PCR的反应条件为：25℃ 5min；50℃60min；70℃ 15min。将反转录的cDNA用0.1mM的TE稀释至500μl，加入到超滤离心管(AmiconUltra-0.5)中，2000g离心10min；弃滤液，再加500μl的0.1mM的TE，2000g离心10min；弃滤液，将制备管倒置到新的离心管中，2000g离心10min，得到纯化后的cDNA；取10μl的纯化后的cDNA作为模板，加入4μl的5xtailing buffer(Promega)，4μl的dATP(1mM)和10U的末端转移酶(Promega，市售)后混匀，37℃孵育5min后65℃ 5min；然后以加上PolyA尾的cDNA为模板，PCR扩增抗体的轻、重链可变区基因。上游引物均为OligodT，重链下游引物为(5’-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3’)(SEQ ID NO:202)和(5’-TGGACAGGGCTCCATAGTTCC-3’)(SEQID NO:203)，轻链下游引物为(5’-ACTCGTCCTTGGTCAACGTG-3’)(SEQ ID NO:204)。PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min 40cycles；72℃ 7min；PCR产物连接到PMD 18-T载体(Takara Bio)后进行测序。克隆的抗体序列见表2。

基于已测序得到的抗体的DNA序列设计PCR引物，从而将完整轻链、重链信号肽和可变域以及小鼠IgG1恒定区与表达载体pTM5相连。

5.抗体的人源化及优化

首先，将筛选所得的鼠源抗体轻、重链可变区序列，并使用NCBI的在线抗体可变区序列比对工具Ig Blast，搜索与输入的抗体可变区序列同源的人源的抗体生殖细胞系基因序列(Ig Germline Gene sequence)，并将除CDR序列外，同源性最高的人源基因序列做为模板序列进行CDR嫁接，得到人源化抗体可变区序列，并外包合成人源化抗体轻、重链的基因。根据序列设计PCR引物，在合成序列的5’端和3’端引入合适的限制性内切酶位点，并通过PCR扩增后将其与人IgG2或者IgG4恒定区序列拼接后得到完整的重组人源化抗体序列。重组的抗体根据步骤7进行表达，并按照步骤9中的FACS技术验证其针对ET_AR的亲和力。在保留了针对ET_AR亲和力的人源化抗体群中，遴选出亲和力表现最优秀的抗体，并通过定点突变，对其可变区序列进行进一步的改造，更进一步提高其针对ET_AR的亲和力。

6.ET_AR人源化抗体的基因克隆与亚克隆

优化后的人源化抗体重链及轻链可变区序列由金斯瑞生物科技有限公司合成，合成时重链可变区5’端带入Nhe1酶切位点，3’端带入Sal1酶切位点，从而将完整的重链可变区序列与已装入重链恒定区的表达载体pTM5相连；同样，合成时轻链可变区5’端带入Nhe1酶切位点，3’端带入Bsiw1酶切位点，从而将完整的重链可变区序列与已装入轻链恒定区的表达载体pTM5相连。

7.抗体的瞬时表达

接种5×10⁵/ml的悬浮HEK293或者CHO表达细胞系至转瓶中，经过24小时37℃，5％CO₂旋转培养后，密度达到1×10⁶/ml后被用于转染。转染过程中使用polyethylenimine(PEI)作为转染介质，将其与的DNA(DNA用量为每1×10⁶个细胞0.5ug，其中抗体轻链和重链的比重为3:2)混合，PEI和DNA的质量混合优选配比为3:1。两者混合物在静置孵育15分钟后被加入到细胞培养中。细胞在接受PEI与DNA混合物后继续37℃，5％CO₂旋转培24小时后，向细胞培养液中加入0.5％的胰蛋白胨作为表达需要的添加物，最后在表达完成后(96小时以上)收集细胞上清用于抗体的纯化分离。

8、抗体的纯化分离

收集的细胞上清经过高速(8000rpm，15分钟)离心去除细胞以及细胞碎片后，再用0.45um滤膜过滤澄清，澄清后的上清被用于纯化。纯化过程由层析仪完成。上清首先流过蛋白G亲和层析柱，上清中包含的抗体在此期间与蛋白G亲和层析柱的配基相结合后被滞留于柱内，然后低pH值(小于等于3.0)的洗脱缓冲液灌洗层析柱解离与层析柱结合的抗体，收集到的抗体洗脱液的低pH值用1M的Tris-HCl迅速中和以保护抗体不变性失活。得到的抗体洗脱液经过16小时的透析后置换成PBS缓冲体系。

9、流式细胞仪分析验证功能性抗体(FACS)

用含10mM EDTA的PBS消化、收集10⁵个CHO-DHFR-hET_AR细胞，分别加入1.5ml EP管，离心后弃上清，阴性对照样本用流式上样缓冲液(PBS，2％FBS)重悬。阳性处理组细胞每管加200μl抗体上清，室温孵育；1500rpm离心，弃上清，用流式上样缓冲液洗一次，再离心，重悬，加入1:50稀释的FITC标记的羊抗鼠荧光二抗(BD Pharmingen)，200μl/孔，室温避光孵育30min；离心，弃上清，再用流式上样缓冲液洗一次，离心，最后用流式上样缓冲液重悬，上机检测。如图2所示，重组的ET_AR功能性抗体表达上清和表达有ET_AR的CHO-DHFR-ET_AR细胞有特异性结合，灰色峰和虚线峰为阴性对照，杂交瘤细胞上清对应的实线峰有明显右移。

10、钙流实验验证功能性抗体

以每孔25000个接种共表达hET_AR-Aequorin的CHO-DHFR细胞至黑色96孔细胞培养板，37℃培养过夜。第二天除去细胞上清，加入50μl底物coelenterazine h(Promega)避光孵育2h，再加入50μl杂交瘤细胞上清或纯化后的抗体继续孵育30分钟。在MolecularDevices的SpectraMax L酶标仪上采用自动进样器灌注Endothelin 1，在40s内检测瞬间钙流变化，记录出峰时间和峰值。如图3所示，不同杂交瘤上清显示出不同的抑制细胞内人ET_AR介导的Ca²⁺变化的结果,A-1抗体表现出明显的抑制ET_AR介导的Ca²⁺变化。如图4所示，重组的ET_AR功能性抗体随着浓度的提高，明显抑制细胞内人ET_AR介导的Ca²⁺变化。

11、建立低氧诱导食蟹猴肺动脉高压模型以评价抗体的体内活性

与中美冠科生物技术有限公司合作建立了低氧诱导食蟹猴肺动脉高压模型，并在低氧诱导肺动脉高压的食蟹猴模型中评价A-1抗体单次静脉注射的药效。实验前给禁食动物秤体重，根据体重以10mg/kg的剂量给药。给药方式为静脉注射；给药3小时后，动物麻醉，超声检测动物心脏三尖瓣反流速度同时监测心率及血氧饱和度，取得基础数据后进行12％低氧诱导，同时测定三尖瓣返流速度；分析给药后在12％低氧诱导下，分析给药后对低氧诱导的肺动脉压有无改善；在给药48小时后，再作测试。动物麻醉，超声检测动物心脏三尖瓣反流速度同时监测心率及血氧饱和度，取得基础数据后进行12％低氧诱导，同时测三尖瓣返流速度，分析给药第三天时对低氧诱导的肺动脉压有无改善；如48小时后仍有药物作用，再进行96小时低氧诱导实验。如图5所示，计算肺动脉收缩压变化与时间曲线下面积，通过比较曲线下面积，发现A-1在96小时之内始终保持降低肺动脉收缩压药效。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州鸿运华宁生物医药工程有限公司

<120> 一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其应用

<130> 2015

<160> 204

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1868

<212> DNA

<213> 人

<400> 1

gaattcggga aaaagtgaag gtgtaaaagc agcacaagtg caataagaga tatttcctca 60

aatttgcctc aagatggaaa ccctttgcct cagggcatcc ttttggctgg cactggttgg 120

atgtgtaatc agtgataatc ctgagagata cagcacaaat ctaagcaatc atgtggatga 180

tttcaccact tttcgtggca cagagctcag cttcctggtt accactcatc aacccactaa 240

tttggtccta cccagcaatg gctcaatgca caactattgc ccacagcaga ctaaaattac 300

ttcagctttc aaatacatta acactgtgat atcttgtact attttcatcg tgggaatggt 360

ggggaatgca actctgctca ggatcattta ccagaacaaa tgtatgagga atggccccaa 420

cgcgctgata gccagtcttg cccttggaga ccttatctat gtggtcattg atctccctat 480

caatgtattt aagctgctgg ctgggcgctg gccttttgat cacaatgact ttggcgtatt 540

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tctttgctgg ttccctcttc atttaagccg tatattgaag aaaactgtgt ataacgagat 1080

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tactcccata atcctctcgg agaaaaaaat cacaaggcaa ctgtgagtcc gggaatctct 1440

tctctgatcc ttcttcctta attcactccc acacccaaga agaaatgctt tccaaaaccg 1500

caagggtaga ctggtttatc cacccacaac atctacgaat cgtacttctt taattgatct 1560

aatttacata ttctgcgtgt tgtattcagc actaaaaaat ggtgggagct gggggagaat 1620

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ccgaattc 1868

<210> 2

<211> 427

<212> PRT

<213> 人

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Met Glu Thr Leu Cys Leu Arg Ala Ser Phe Trp Leu Ala Leu Val Gly

1 5 10 15

Cys Val Ile Ser Asp Asn Pro Glu Arg Tyr Ser Thr Asn Leu Ser Asn

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His Val Asp Asp Phe Thr Thr Phe Arg Gly Thr Glu Leu Ser Phe Leu

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Met His Asn Tyr Cys Pro Gln Gln Thr Lys Ile Thr Ser Ala Phe Lys

65 70 75 80

Tyr Ile Asn Thr Val Ile Ser Cys Thr Ile Phe Ile Val Gly Met Val

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Gly Asn Ala Thr Leu Leu Arg Ile Ile Tyr Gln Asn Lys Cys Met Arg

100 105 110

Asn Gly Pro Asn Ala Leu Ile Ala Ser Leu Ala Leu Gly Asp Leu Ile

115 120 125

Tyr Val Val Ile Asp Leu Pro Ile Asn Val Phe Lys Leu Leu Ala Gly

130 135 140

Arg Trp Pro Phe Asp His Asn Asp Phe Gly Val Phe Leu Cys Lys Leu

145 150 155 160

Phe Pro Phe Leu Gln Lys Ser Ser Val Gly Ile Thr Val Leu Asn Leu

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Cys Ala Leu Ser Val Asp Arg Tyr Arg Ala Val Ala Ser Trp Ser Arg

180 185 190

Val Gln Gly Ile Gly Ile Pro Leu Val Thr Ala Ile Glu Ile Val Ser

195 200 205

Ile Trp Ile Leu Ser Phe Ile Leu Ala Ile Pro Glu Ala Ile Gly Phe

210 215 220

Val Met Val Pro Phe Glu Tyr Arg Gly Glu Gln His Lys Thr Cys Met

225 230 235 240

Leu Asn Ala Thr Ser Lys Phe Met Glu Phe Tyr Gln Asp Val Lys Asp

245 250 255

Trp Trp Leu Phe Gly Phe Tyr Phe Cys Met Pro Leu Val Cys Thr Ala

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Ile Phe Tyr Thr Leu Met Thr Cys Glu Met Leu Asn Arg Arg Asn Gly

275 280 285

Ser Leu Arg Ile Ala Leu Ser Glu His Leu Lys Gln Arg Arg Glu Val

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Ala Lys Thr Val Phe Cys Leu Val Val Ile Phe Ala Leu Cys Trp Phe

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Pro Leu His Leu Ser Arg Ile Leu Lys Lys Thr Val Tyr Asn Glu Met

325 330 335

Asp Lys Asn Arg Cys Glu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Leu Met Asp Tyr

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Ile Gly Ile Asn Leu Ala Thr Met Asn Ser Cys Ile Asn Pro Ile Ala

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Leu Tyr Phe Val Ser Lys Lys Phe Lys Asn Cys Phe Gln Ser Cys Leu

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Cys Cys Cys Cys Tyr Gln Ser Lys Ser Leu Met Thr Ser Val Pro Met

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Asn Gly Thr Ser Ile Gln Trp Lys Asn His Asp Gln Asn Asn His Asn

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<212> DNA

<213> 小鼠

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tacttttggc tgaccatggt gggaggcgta atggctgaca atccggagag atacagcgct 480

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tacgtggtca ttgacctccc catcaacgtg tttaagctct tggcaggacg ctggcctttc 840

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Tyr Ile Asn Thr Val Ile Ser Cys Thr Ile Phe Ile Val Gly Met Val

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Asn Gly Pro Asn Ala Leu Ile Ala Ser Leu Ala Leu Gly Asp Leu Ile

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Arg Trp Pro Phe Asp His Asn Asp Phe Gly Val Phe Leu Cys Lys Leu

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Phe Pro Phe Leu Gln Lys Ser Ser Val Gly Ile Thr Val Leu Asn Leu

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Cys Ala Leu Ser Val Asp Arg Tyr Arg Ala Val Ala Ser Trp Ser Arg

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Val Gln Gly Ile Gly Ile Pro Leu Ile Thr Ala Ile Glu Ile Val Ser

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Ile Trp Ile Leu Ser Phe Ile Leu Ala Ile Pro Glu Ala Ile Gly Phe

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Val Met Val Pro Phe Glu Tyr Lys Gly Glu Leu His Arg Thr Cys Met

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Asp Lys Asn Arg Cys Glu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Leu Met Asp Tyr

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Val Met Val Pro Phe Glu Tyr Lys Gly Glu Gln His Arg Thr Cys Met

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agatctagtc agaacattgt ccatagtact ggaaacacct atttagaa 48

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1 5

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 39

tatgcttccc aatccatctc t 21

<210> 40

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 40

Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser

1 5

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 41

ggtgcagcca gtttgaaaag t 21

<210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 42

Gly Ala Ala Ser Leu Lys Ser

1 5

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 43

aaagtttcca accgattttc t 21

<210> 44

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 44

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 45

gacacatcca aactggcttc t 21

<210> 46

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 46

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 47

tatacatcaa ctttacagtc a 21

<210> 48

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 48

Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 49

<211> 27

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 49

caacatagtt atagctggcc gtggacg 27

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 50

Gln His Ser Tyr Ser Trp Pro Trp Thr

1 5

<210> 51

<211> 27

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 51

cagcatcatt atggtattcc gttcacg 27

<210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 52

Gln His His Tyr Gly Ile Pro Phe Thr

1 5

<210> 53

<211> 27

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 53

tggcaaggta cacattttcc gctcacg 27

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 54

Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 55

<211> 27

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 55

ctacaatatg ctagttctcc gtatacg 27

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 56

Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210> 57

<211> 27

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 57

caaagtggta acacctttcc gtggacg 27

<210> 58

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 58

Gln Ser Gly Asn Thr Phe Pro Trp Thr

1 5

<210> 59

<211> 27

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 59

caacagtata ggagtattcc gtggacg 27

<210> 60

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 60

Gln Gln Tyr Arg Ser Ile Pro Trp Thr

1 5

<210> 61

<211> 27

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 61

tttcaaggtt cacattttcc attcacg 27

<210> 62

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 62

Phe Gln Gly Ser His Phe Pro Phe Thr

1 5

<210> 63

<211> 27

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 63

tttcaaggtt cacatttccc attcacg 27

<210> 64

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 64

His Gln Trp Ser Thr Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 65

<211> 27

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 65

cagcagtgga gtagtaaccc acccacg 27

<210> 66

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 66

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 67

<211> 24

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 67

cagcagttta gtaaacttcg gaca 24

<210> 68

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 68

Gln Gln Phe Ser Lys Leu Arg Thr

1 5

<210> 69

<211> 36

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 69

gggttctcac tgaccacttc tggcttgggt gttgcc 36

<210> 70

<211> 12

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 70

Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser Gly Leu Gly Val Ala

1 5 10

<210> 71

<211> 30

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 71

ggctacacct ttactagcta ctggatacac 30

<210> 72

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 72

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His

1 5 10

<210> 73

<211> 30

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 73

ggcctcaaca ttaaagacat ctatattcac 30

<210> 74

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 74

Gly Leu Asn Ile Lys Asp Ile Tyr Ile His

1 5 10

<210> 75

<211> 30

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 75

ggttactcat tcaccaacta ctggatacac 30

<210> 76

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 76

Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp Ile His

1 5 10

<210> 77

<211> 30

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 77

ggattcactt tcagtgacta tcccatgtct 30

<210> 78

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 78

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Pro Met Ser

1 5 10

<210> 79

<211> 30

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 79

ggattcactt tcagtagctt tggcatgtct 30

<210> 80

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 80

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser

1 5 10

<210> 81

<211> 30

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 81

ggattcactt tcagtaccta tggcatgtct 30

<210> 82

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 82

Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly Met Ser

1 5 10

<210> 83

<211> 30

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 83

ggattcactt tcagtagtta tggcatgtct 30

<210> 84

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 84

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser

1 5 10

<210> 85

<211> 36

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 85

gggttttcac tgaccacttc tggtatgggt gtaggc 36

<210> 86

<211> 12

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 86

Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser Gly Met Gly Val Gly

1 5 10

<210> 87

<211> 36

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 87

ggattttcac tgagcacttc tggtttgggt gtaggc 36

<210> 88

<211> 12

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 88

Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Leu Gly Val Gly

1 5 10

<210> 89

<211> 24

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 89

ggattcacct tcagtgatta ttac 24

<210> 90

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 90

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 91

<211> 48

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 91

cacatttggt cggatggtga cacgcgctat tacccagccc tgaagaac 48

<210> 92

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 92

His Ile Trp Ser Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Tyr Pro Ala Leu Lys Asn

1 5 10 15

<210> 93

<211> 36

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 93

tacattaatc ctgacactga ttatagtgag tacaat 36

<210> 94

<211> 12

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 94

Tyr Ile Asn Pro Asp Thr Asp Tyr Ser Glu Tyr Asn

1 5 10

<210> 95

<211> 36

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 95

aggattgatc ctgcgaacgg taagactgca tatgac 36

<210> 96

<211> 12

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 96

Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Lys Thr Ala Tyr Asp

1 5 10

<210> 97

<211> 36

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 97

atgattgatc cttccgatgc tgaaactggg ttaaat 36

<210> 98

<211> 12

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 98

Met Ile Asp Pro Ser Asp Ala Glu Thr Gly Leu Asn

1 5 10

<210> 99

<211> 24

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 99

gttagtgatg gtggtggttc cacc 24

<210> 100

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 100

Val Ser Asp Gly Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 101

<211> 24

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 101

attagtagtg ctggtagttt cacc 24

<210> 102

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 102

Ile Ser Ser Ala Gly Ser Phe Thr

1 5

<210> 103

<211> 51

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 103

accattaata ctaatggtgg taccacctat tatcgagaca gtgtgaaggg c 51

<210> 104

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 104

Thr Ile Asn Thr Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 105

<211> 51

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 105

accataaata ctaatggtgg taacacctat tattcagaca atgtgaaggg c 51

<210> 106

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 106

Thr Ile Asn Thr Asn Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 107

<211> 51

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 107

accattagta ctaatggtgc caccgccaat tatccagaca gtgtgaaggg c 51

<210> 108

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 108

Thr Ile Ser Thr Asn Gly Ala Thr Ala Asn Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 109

<211> 48

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 109

cacatttggt gggatgatga taagtactat aatccatccc tgaagagc 48

<210> 110

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 110

His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 111

<211> 48

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 111

cacatttggt gggatgatga taagtactat aatccatccc ttaagaga 48

<210> 112

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 112

His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Arg

1 5 10 15

<210> 113

<211> 30

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 113

attagaaatc gggctaatgg ttacacaaca 30

<210> 114

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 114

Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr

1 5 10

<210> 115

<211> 30

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 115

atgaaggatg atagtcttta ctttgacaac 30

<210> 116

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 116

Met Lys Asp Asp Ser Leu Tyr Phe Asp Asn

1 5 10

<210> 117

<211> 30

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 117

gcaagtgctg gttattattt ttttgacttc 30

<210> 118

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 118

Ala Ser Ala Gly Tyr Tyr Phe Phe Asp Phe

1 5 10

<210> 119

<211> 15

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 119

ggtagggggg cccac 15

<210> 120

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 120

Gly Arg Gly Ala His

1 5

<210> 121

<211> 33

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 121

gcaagaattg gcgattacta taatatggac tac 33

<210> 122

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 122

Ala Arg Ile Gly Asp Tyr Tyr Asn Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 123

<211> 45

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 123

acaagacatg cttcctacta tagctacgac cattctatgg actac 45

<210> 124

<211> 15

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 124

Thr Arg His Ala Ser Tyr Tyr Ser Tyr Asp His Ser Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 125

<211> 36

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 125

gcaagacggg ggtacgacgt tgggtgcttt gaccac 36

<210> 126

<211> 12

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 126

Ala Arg Arg Gly Tyr Asp Val Gly Cys Phe Asp His

1 5 10

<210> 127

<211> 27

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 127

gcaagagact acggggctat ggactac 27

<210> 128

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 128

Ala Arg Asp Tyr Gly Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 129

<211> 27

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 129

gcaactgaaa agggagctat gggctac 27

<210> 130

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 130

Ala Thr Glu Lys Gly Ala Met Gly Tyr

1 5

<210> 131

<211> 57

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 131

gctcgaagaa ctgagactat gattacgaca gtgctatatt actatgctat ggactac 57

<210> 132

<211> 19

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 132

Ala Arg Arg Thr Glu Thr Met Ile Thr Thr Val Leu Tyr Tyr Tyr Ala

1 5 10 15

Met Asp Tyr

<210> 133

<211> 54

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 133

gctcgaagga gggaagttaa cttcggtatt aactattact attctatgga ctac 54

<210> 134

<211> 18

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 134

Ala Arg Arg Arg Glu Val Asn Phe Gly Ile Asn Tyr Tyr Tyr Ser Met

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 135

<211> 36

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 135

gtaagagatt cctatcacta cgggtacttc gatgtc 36

<210> 136

<211> 12

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 136

Val Arg Asp Ser Tyr His Tyr Gly Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 137

<211> 324

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 137

gacatcttgc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaaa aagagtcagt 60

ttctcctgca gggccagtca gaacattggc acaagcatac actggtatca gcaaagaaca 120

aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctaagt ctatatctgg gatttcttcc 180

aggtttagtg gcagtggctc agggacagat tttactctta gtatcaacag tgtggagtct 240

gaagatattg cagcttatta ctgtcaacat agttatagct ggccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa acgg 324

<210> 138

<211> 108

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 138

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Lys Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Lys Ser Ile Ser Gly Ile Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln His Ser Tyr Ser Trp Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 139

<211> 324

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 139

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctacat ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gagcaagtga aaatatttac agttatttag catggtatca gcagagacag 120

ggaaaatctc ctcacctcct ggtcaataat gcaaaaacct tagcagaagg tgtgccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc aggcacacat ttttctctga ggatcagcgg cctgcagcct 240

gaagattttg ggagttatta ctgtcagcat cattatggta ttccgttcac gttcggaggg 300

gggaccaagt tgtcaataaa acgg 324

<210> 140

<211> 108

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 140

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Gln Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Val

35 40 45

Asn Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Ser Leu Arg Ile Ser Gly Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ile Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ser Ile Lys Arg

100 105

<210> 141

<211> 339

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 141

gatgttgtga tgacccagat tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60

atctcttgca agtcaagtca gagcctcttt gatattgatg gaaagacata tttgaattgg 120

ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc tgaattggac 180

tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tactattgtt ggcaaggtac acattttccg 300

ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacgg 339

<210> 142

<211> 113

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 142

Asp Val Val Met Thr Gln Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ile

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

Arg

<210> 143

<211> 324

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 143

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcagt 60

ctcacttgtc gggcaagtca ggacattggt ggtagcttaa actggcttca gcagaaacca 120

gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc acatccagct tagattctgg tgtccccaaa 180

aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagtt ttttctctca ccatcaccag ccttgagtct 240

gaagattttg tagactattt ctgtctacaa tatgctagtt ctccgtatac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa acgg 324

<210> 144

<211> 108

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 144

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Gly Ser

20 25 30

Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Val Phe Ser Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Val Asp Tyr Phe Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 145

<211> 324

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 145

gacattgtga tgactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtctct 60

ctttcctgca gggccagcca gactattagc gacttcttac actggtatca acaaaaatca 120

catgagtctc caaggcttct catcaaatat gcttcccaat ccatctctgg gatcccctcc 180

aggttcagtg gcactggatc agggtcagat ttcactctca ctatcaacag tgtggaacct 240

gaagatgttg gagtgtatta ctgtcaaagt ggtaacacct ttccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa acgg 324

<210> 146

<211> 108

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 146

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Thr Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Asn Thr Phe Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 147

<211> 324

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 147

gacatccaga tgacacaatc ttcatcctcc ttttctggat ttctaggaga cagagtcacc 60

attacttgca gggcaagtga ggacatacac actcaattag cctggtatca gcagaaacca 120

ggaaatgctc ctaggctctt aatatctggt gcagccagtt tgaaaagtgg ggttccttca 180

agattcagtg gcactggatc tggaaaggat tacactctca gcattaccag tcttcagact 240

gaagatgttg ctacatatta ctgtcaacag tataggagta ttccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa acgg 324

<210> 148

<211> 108

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 148

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Gly Phe Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile His Thr Gln

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Gly Ala Ala Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Thr Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 149

<211> 339

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 149

gatgttttga tgacccaaac tccgctctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcacgcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gtacattgtt catagtactg gaaccaccta tttagaatgg 120

tacctacaga aaccaggcca gtctccacag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

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<210> 150

<211> 113

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 150

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp His Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Tyr Ile Val His Ser

20 25 30

Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 151

<211> 339

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 151

gaagttgtga tgacccaaac tccactctcc ttgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca ttaccttgtt catgataacg gaaacaccta tgttgaatgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaggtttc caaccgattt 180

tctggagtcc cagacaggtt tactggcagt ggttcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg agtctgagga tctgggaatt tattactgct ttcaaggttc acatttccca 300

ttcacgttcg gctcggggac agagttggaa ataaaacgg 339

<210> 152

<211> 113

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 152

Glu Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser His Tyr Leu Val His Asp

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Val Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ser Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 153

<211> 339

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 153

gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gaacattgtc catagtactg gaaacaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgattt ataaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc caaacaggtt ccgtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

accagagtgg aggctgagga tctgggaatt tattactgct ttcaaggttc acattttcca 300

ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaacgg 339

<210> 154

<211> 113

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 154

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asn Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 155

<211> 321

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 155

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

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acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180

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<210> 156

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 156

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg Arg

100 105

<210> 157

<211> 321

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 157

caaattgttc tcacccagtc tccagcactc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

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gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cacccacgtt cggtgctggg 300

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<210> 158

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 158

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 159

<211> 321

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 159

gaaatccaga tgacacagac tccatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcacttgca gtgcaagtca gggcattaac aattatttga actggtatca gcagaaacca 120

ggtggaaaga ctagactcct catctattat acatcaactt tacagtcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacacat tattctctca ccatcagcaa tctggaacct 240

gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tttagtaaac ttcggacatt cggtggaggc 300

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<210> 160

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 160

Glu Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Lys Thr Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Ser Lys Leu Arg Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 161

<211> 324

<212> DNA

<213> 人

<400> 161

gagattgtgc tgactcagag tccagacttc cagtcagtga cccccaagga gaaagtcacc 60

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gatcagtccc ctaagctgct gatcaaatat gcctctaaga gtatttcagg ggtgccctct 180

agattcagcg gctccgggtc tggaacagac tttactctga ccattaactc cctggaggct 240

gaagatgccg ctacttacta ttgtcagcat agctactcat ggccttggac attcgggcag 300

gggaccaaag tggaaatcaa acgt 324

<210> 162

<211> 108

<212> PRT

<213> 人

<400> 162

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Lys Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Tyr Ser Trp Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 163

<211> 339

<212> DNA

<213> 人

<400> 163

gatattgtga tgacccaaac tccgctctcc ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gaacattgtt catagtactg gaaacaccta tttagaatgg 120

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agcagagtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgct ttcaaggttc acattttcca 300

ttcacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacgt 339

<210> 164

<211> 113

<212> PRT

<213> 人

<400> 164

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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Arg

<210> 165

<211> 360

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 165

caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ctcactgacc acttctggct tgggtgttgc ctggattcgt 120

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<210> 166

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 166

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser

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Gly Leu Gly Val Ala Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

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Trp Leu Ala His Ile Trp Ser Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Tyr Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Ser Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Ala Arg Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Met Lys Asp Asp Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ile Phe Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 167

<211> 351

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 167

cagatccagt tggtgcagtc tggggctgaa ctggcaaaac ctggggcctc agtgaggatg 60

tcctgcgaga cttctggcta cacctttact agctactgga tacactggat aaaagagagg 120

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tattattttt ttgacttctg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351

<210> 168

<211> 117

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 168

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Met Ser Cys Glu Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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Trp Ile His Trp Ile Lys Glu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Tyr Ile Asn Pro Asp Thr Asp Tyr Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Arg Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Phe Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Ala Gly Tyr Tyr Phe Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 169

<211> 336

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 169

gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagaa cttgtgaaac caggggcctc agtcaagttg 60

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<210> 170

<211> 112

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 170

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Leu Asn Ile Lys Asp Ile

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Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Lys Thr Ala Tyr Asp Leu Lys Phe

50 55 60

Gln Ala Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Lys Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Arg Gly Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 171

<211> 354

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 171

cagatccagt tggtgcagtc tgggcctcag ctggttaggc ctggggcttc agtgaagata 60

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<210> 172

<211> 118

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 172

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gln Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ala Glu Thr Gly Leu Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Gly Asp Tyr Tyr Asn Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 173

<211> 366

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 173

gaagtgaagg tggtggagtc tgggggaggt ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactatccca tgtcttgggt tcgccagact 120

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<210> 174

<211> 122

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 174

Glu Val Lys Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

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Ala Tyr Val Ser Asp Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ile Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg His Ala Ser Tyr Tyr Ser Tyr Asp His Ser Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 175

<211> 357

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 175

cagatccagt tggtgcagtc tgggggagac ttagtgaggc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggca tgtcttggat tcgccagact 120

ccagacaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg ctggtagttt cacctactat 180

ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctgtat 240

ctacaaatga acagtctgaa gtctgaggac tcagccatgt attactgtgc aagacggggg 300

tacgacgttg ggtgctttga ccactggggc cgaggcacca ctctcacagt ctcctca 357

<210> 176

<211> 119

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 176

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Arg Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Ala Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Tyr Asp Val Gly Cys Phe Asp His Trp Gly Arg Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 177

<211> 348

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 177

gaggtgcacc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt acctatggca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccagacaaga ggctggagtt ggtcgcgacc attaatacta atggtggtac cacctattat 180

cgagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgatgac acagccatgt attactgtgc aagagactac 300

ggggctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 348

<210> 178

<211> 116

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 178

Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Thr Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 179

<211> 345

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 179

gatgtgcacc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgacagtc 60

tcctgcgcag cctctggatt cactttcagt acctatggca tgtcttgggt tcgccagact 120

cgagacaaga ggctggagtt ggtcgcaacc ataaatacta atggtggtaa cacctattat 180

tcagacaatg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca atgccaagaa caccctgtat 240

ttggaaatga gaggtctgag gtctggggac acagccatgt attactgtgc aagagactac 300

ggggctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctct 345

<210> 180

<211> 115

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 180

Asp Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Arg Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Thr Asn Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Arg Gly Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser

115

<210> 181

<211> 348

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 181

gaggtgcagc tgcagcagcc tgggggaggc ttagtacagc ctggagggtc cctgacactc 60

tcctgtgcaa cctctggatt cactttcagt agttatggca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccagccaaga ggctggagtt ggtcgcaacc attagtacta atggtgccac cgccaattat 180

ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagag caccctgtac 240

ctacaaatgc gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aactgaaaag 300

ggagctatgg gctactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 348

<210> 182

<211> 116

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 182

Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Ala Lys Arg Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Thr Asn Gly Ala Thr Ala Asn Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Arg Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Glu Lys Gly Ala Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 183

<211> 381

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 183

caagttactc taaaagagtc tggccctggg atattgaagc cctcacagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttcactgacc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120

cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180

tataatccat ccctgaagag ccaggtcaca atctccaagg acacctccag aaaccaggta 240

ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca cttactactg tgctcgaaga 300

actgagacta tgattacgac agtgctatat tactatgcta tggactactg gggtcaagga 360

acctcagtca ccgtctcctc a 381

<210> 184

<211> 127

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 184

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Gln Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Glu Thr Met Ile Thr Thr Val Leu Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 185

<211> 378

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 185

caagttactc taaaagagtc tggccctggg atattgaagc cctcacagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctggatt ttcactgagc acttctggtt tgggtgtagg ctggattcgt 120

cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180

tataatccat cccttaagag acagatcaca atctccaagg attcctccag aaaccaggta 240

ttcctcaaga tcaccaatgt ggacactgca gatactgcca cttactactg tgctcgaagg 300

agggaagtta acttcggtat taactattac tattctatgg actactgggg tcaaggaacc 360

tcagtcaccg tctcctca 378

<210> 186

<211> 126

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 186

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Leu Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Arg Gln Ile Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Arg Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Thr Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Arg Glu Val Asn Phe Gly Ile Asn Tyr Tyr Tyr Ser

100 105 110

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 187

<211> 363

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 187

gaggtgaagc tggtggagtc tggaggacgc ttggtacagc ctgggaattc tctgagactc 60

tcctgtgcaa cttctggatt caccttcagt gattattaca tgagttgggt ccgccagact 120

ccaggaaggg cacttgagtg gttgagtttt attagaaatc gggctaatgg ttacacaaca 180

gagtacagtg catctgtgaa gggtcgattc accatctcca gagataattc ccaaagcatc 240

ctctatcttc acatgagcac cctgagacct gaggacagtg ccacttatta ctgtgtaaga 300

gattcctatc actacgggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 188

<211> 121

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 188

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Arg Ala Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ser Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile

65 70 75 80

Leu Tyr Leu His Met Ser Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg Asp Ser Tyr His Tyr Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 189

<211> 360

<212> DNA

<213> 人

<400> 189

caggtgaccc tgaaggaatc cgggcctact ctggtgaaac ctacccagac tctgactctg 60

acttgtactt ttagcggctt ctcactgacc acatctggac tgggagtggc ttggatcaga 120

cagcctcctg gaaaggccct ggagtggctg gctcacattt ggagcgacgg cgatactcgg 180

tactatccag ccctgaaaaa cagactgact atcaccaagg acacatccaa aaaccaggtg 240

gtcctgacaa tgactaatat ggaccccgtc gataccgcaa catactattg cgcccatatg 300

aaggatgact ctctgtactt tgataactgg gggcagggaa ctctggtgac cgtgagcagc 360

<210> 190

<211> 120

<212> PRT

<213> 人

<400> 190

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser

20 25 30

Gly Leu Gly Val Ala Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Ser Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Tyr Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Asn Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala His Met Lys Asp Asp Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 191

<211> 348

<212> DNA

<213> 人

<400> 191

gaggtgcagc tgctggaatc tgggggggga ctggtgcagc ctggaggaag cctgagactg 60

agttgtgccg caagtgggtt tacatttagc tcctacggaa tgagctgggt gaggcaggct 120

ccaggcaagg gactggagtg ggtctctgca atcagtacca acggagccac agcttactat 180

gccgactccg tgaagggccg gttcactatc tcaagagata acagcaagaa caccctgtat 240

ctgcagatga attctctgcg ggcagaagac acagccgtct actattgcgc tactgagaaa 300

ggggcaatga gccactgggg acagggcaca ctggtgaccg tgagttcc 348

<210> 192

<211> 116

<212> PRT

<213> 人

<400> 192

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Thr Asn Gly Ala Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Glu Lys Gly Ala Met Ser His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 193

<211> 318

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 193

gctgatgctg caccaactgt atccatcttc ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga 60

ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg 120

aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc 180

aaagacagca cctacagcat gagcagcacc ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga 240

cataacagct atacctgtga ggccactcac aagacatcaa cttcacccat tgtcaagagc 300

ttcaacagga atgagtgt 318

<210> 194

<211> 106

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 194

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

1 5 10 15

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

35 40 45

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

65 70 75 80

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

85 90 95

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 195

<211> 315

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 195

ggtcagccca agtccactcc cactctcacc gtgtttccac cttcctctga ggagctcaag 60

gaaaacaaag ccacactggt gtgtctgatt tccaactttt ccccgagtgg tgtgacagtg 120

gcctggaagg caaatggtac acctatcacc cagggtgtgg acacttcaaa tcccaccaaa 180

gagggcaaca agttcatggc cagcagcttc ctacatttga catcggacca gtggagatct 240

cacaacagtt ttacctgtca agttacacat gaaggggaca ctgtggagaa gagtctgtct 300

cctgcagaat gtctc 315

<210> 196

<211> 105

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 196

Gly Gln Pro Lys Ser Thr Pro Thr Leu Thr Val Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Lys Glu Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asn

20 25 30

Phe Ser Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asn Gly Thr Pro

35 40 45

Ile Thr Gln Gly Val Asp Thr Ser Asn Pro Thr Lys Glu Gly Asn Lys

50 55 60

Phe Met Ala Ser Ser Phe Leu His Leu Thr Ser Asp Gln Trp Arg Ser

65 70 75 80

His Asn Ser Phe Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly Asp Thr Val Glu

85 90 95

Lys Ser Leu Ser Pro Ala Glu Cys Leu

100 105

<210> 197

<211> 975

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 197

gccaaaacaa cagccccatc ggtctatcca ctggcccctg tgtgtggaga tacaactggc 60

tcctcggtga ctctaggatg cctggtcaag ggttatttcc ctgagccagt gaccttgacc 120

tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180

ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc 240

acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300

gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360

cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420

gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480

gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 540

agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600

aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660

aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720

agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780

aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 840

tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900

acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960

tctcctggta aaggc 975

<210> 198

<211> 325

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 198

Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys Gly

325

<210> 199

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成的序列

<400> 199

tttggrggga agatgaagac 20

<210> 200

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成的序列

<400> 200

ttaacactct cccctgttga a 21

<210> 201

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成的序列

<400> 201

ttaacactca ttcctgttga a 21

<210> 202

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成的序列

<400> 202

tggacaggga tccagagttc c 21

<210> 203

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成的序列

<400> 203

tggacagggc tccatagttc c 21

<210> 204

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成的序列

<400> 204

actcgtcctt ggtcaacgtg 20

Claims (30)

1.一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体，其包含:

(a)轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24；

轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:44；

轻链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:62；

重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:84；

重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:106或SEQ ID NO:108；和

重链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:128或SEQ ID NO:130；(b)轻链CDR1氨基酸序列:SEQID NO:26；

轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:46；

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重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:86；

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(c)轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:30；

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(d)轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:10；

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(e)轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:12；

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(f)轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:14；

轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:38；

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重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:76；

重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:98；和

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(g)轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:16；

轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:40；

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重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:78；

重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:100；和

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(h)轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:18；

轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:42；

轻链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:60；

重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:80；

重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:102；和

重链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:126；或

(i)轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:28；

轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:46；

轻链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:66；

重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:88；

重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:112；和

重链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:134。

2.根据权利要求1所述的抗体，其包含:

轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24；

轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:44；

轻链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:62；

重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:84；

重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:106或SEQ ID NO:108；和

重链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:128或SEQ ID NO:130。

3.根据权利要求2所述的抗体，其包含:

轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:20；

轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:44；

轻链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:62；

重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:82；

重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:104；和

重链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:128。

4.根据权利要求2所述的抗体，其包含:

轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:22；

轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:44；

轻链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:62；

重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:82；

重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:106；和

重链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:128。

5.根据权利要求2所述的抗体，其包含:

轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:24；

轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:44；

轻链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:62；

重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:84；

重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:108；和

重链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:130。

6.根据权利要求1所述的抗体，其包含:

(a)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQ ID NO:140；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQID NO:168；

(b)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQ ID NO:142；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQID NO:170；

(c)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQ ID NO:144；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQID NO:172；

(d)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQ ID NO:146；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQID NO:174；

(e)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQ ID NO:148；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQID NO:176；

(f)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQ ID NO:150；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQID NO:178；

(g)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQ ID NO:152；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQID NO:180；

(h)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQ ID NO:154；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQID NO:182；

(i)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQ ID NO:156；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQID NO:184；

(j)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQ ID NO:158；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQID NO:186；或

(k)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQ ID NO:160；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQID NO:188。

7.根据权利要求2所述的抗体，其包含轻链可变结构域氨基酸序列:SEQ ID NO:150；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQ ID NO:178。

8.根据权利要求2所述的抗体，其包含轻链可变结构域氨基酸序列:SEQ ID NO:152；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQ ID NO:180。

9.根据权利要求2所述的抗体，其包含轻链可变结构域氨基酸序列:SEQ ID NO:154；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQ ID NO:182。

10.根据权利要求1所述的抗体，其包含:

(a)与SEQ ID NO:139至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的轻链可变结构域氨基酸序列；和与SEQ ID NO:167至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的重链可变结构域氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:141至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的轻链可变结构域氨基酸序列；和与SEQ ID NO:169至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的重链可变结构域氨基酸序列；

(c)与SEQ ID NO:143至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的轻链可变结构域氨基酸序列；和与SEQ ID NO:171至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的重链可变结构域氨基酸序列；

(d)与SEQ ID NO:145至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的轻链可变结构域氨基酸序列；和与SEQ ID NO:173至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的重链可变结构域氨基酸序列；

(e)与SEQ ID NO:147至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的轻链可变结构域氨基酸序列；和与SEQ ID NO:175至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的重链可变结构域氨基酸序列；

(f)与SEQ ID NO:149至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的轻链可变结构域氨基酸序列；和与SEQ ID NO:177至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的重链可变结构域氨基酸序列；

(g)与SEQ ID NO:151至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的轻链可变结构域氨基酸序列；和与SEQ ID NO:179至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的重链可变结构域氨基酸序列；

(h)与SEQ ID NO:153至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的轻链可变结构域氨基酸序列；和与SEQ ID NO:181至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的重链可变结构域氨基酸序列；

(i)与SEQ ID NO:155至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的轻链可变结构域氨基酸序列；和与SEQ ID NO:183至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的重链可变结构域氨基酸序列；

(j)与SEQ ID NO:157至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的轻链可变结构域氨基酸序列；和与SEQ ID NO:185至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的重链可变结构域氨基酸序列；或

(k)与SEQ ID NO:159至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的轻链可变结构域氨基酸序列；和与SEQ ID NO:187至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的重链可变结构域氨基酸序列。

11.根据权利要求2所述的抗体，其包含与SEQ ID NO:149至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的轻链可变结构域氨基酸序列；和与SEQ ID NO:177至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的重链可变结构域氨基酸序列。

12.根据权利要求2所述的抗体，其包含与SEQ ID NO:151至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的轻链可变结构域氨基酸序列；和与SEQ ID NO:179至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的重链可变结构域氨基酸序列。

13.根据权利要求2所述的抗体，其包含与SEQ ID NO:153至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的轻链可变结构域氨基酸序列；和与SEQ ID NO:181至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的重链可变结构域氨基酸序列。

14.根据权利要求1所述的抗体，其还包含选自以下的氨基酸序列:

(a)轻链恒定区氨基酸序列:SEQ ID NO:194；

(b)轻链恒定区氨基酸序列:SEQ ID NO:196；

(c)重链恒定区氨基酸序列:SEQ ID NO:198；

(d)轻链恒定区氨基酸序列:SEQ ID NO:194和重链恒定区氨基酸序列:SEQ ID NO:198；和

(e)轻链恒定区氨基酸序列:SEQ ID NO:196和重链恒定区氨基酸序列:SEQ ID NO:198。

15.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是鼠源抗体、人抗体或人源化抗体。

16.根据权利要求1所述的抗体，其中:

(a)所述抗体以与参比抗体以基本相同的K_d与人内皮素受体结合；

(b)所述抗体以与所述参比抗体基本相同的IC₅₀抑制人内皮素受体的内皮素激活；或

(c)所述抗体在人内皮素受体上与所述参比抗体交叉竞争结合。

17.根据权利要求16所述的抗体，其中所述参比抗体包含SEQ ID NO:138的轻链可变结构域序列和SEQ ID NO:166的重链可变结构域序列。

18.根据权利要求16所述的抗体，所述抗体为鼠源抗体或人源化抗体，且其中:

(a)所述抗体以≤500nM的IC₅₀值降低人内皮素信号传导；

(b)所述抗体在肺动脉高压大鼠模型或肺动脉高压猴模型中降低肺动脉高压；

(c)(a)和(b)所述抗体兼具(a)、(b)两种性质。

19.一种药用组合物，其包含权利要求1的抗体和药用可接受赋型剂。

20.根据权利要求19所述的药用组合物，其中所述抗体是鼠源抗体或人源化抗体。

21.一种分离的核酸，其包含编码权利要求1的抗体的轻链可变结构域、重链可变结构域或轻链可变结构域和重链可变结构域两者的多聚核苷酸序列。

22.根据权利要求21所述的分离的核酸，

其中编码所述抗体轻链可变结构域的多聚核苷酸序列选自:SEQ ID NO:139、SEQ IDNO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157和SEQ ID NO:159；和

其中编码所述抗体重链可变结构域的多聚核苷酸序列选自:SEQ ID NO:167、SEQ IDNO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185和SEQ ID NO:187。

23.一种重组表达载体，其包含权利要求21的核酸。

24.一种宿主细胞，其包含权利要求23的重组表达载体。

25.一种生产能与人内皮素受体特异性结合的抗体的方法，其包括在允许生产所述抗体的条件下培养权利要求24的宿主细胞。

26.一种用于治疗肺动脉高压、伴随有肺动脉压升高的疾病或生殖器官癌症的试剂盒，其包含权利要求19的药用组合物。

27.一种权利要求19的药用组合物在制备用于治疗肺动脉高压、伴随有肺动脉压升高的疾病、与血管平滑肌有关的疾病、与平滑肌有关的疾病、镰状细胞疾病、心脏功能衰退、心力衰竭或生殖器官癌症的药物中的用途。

28.一种权利要求19的药用组合物在制备用于治疗与血管平滑肌有关的疾病的药物中的用途。

29.一种权利要求1的抗体在制备用于治疗肺动脉高压、伴随有肺动脉压升高的疾病、与平滑肌有关的疾病、镰状细胞疾病、心脏功能衰退、心力衰竭或生殖器官癌症的药物中的用途。

30.一种权利要求1的抗体在制备用于治疗与血管平滑肌有关的疾病的药物中的用途。

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