CN112794909B - 一种抗tigit单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种抗tigit单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗TIGIT单克隆抗体及其应用，所述抗TIGIT单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包括SEQ ID NO:1所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:3所示的重链CDR3；所述轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。本发明的抗TIGIT单克隆抗体对抗原TIGIT的特异性识别结合能力强，能够有效阻断TIGIT与其配体CD155的结合，应用前景广阔。

Description

一种抗TIGIT单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于抗体工程技术领域，涉及一种抗TIGIT单克隆抗体及其应用。
背景技术
T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)是脊髓灰质炎病毒受体(PVR)/Nectin家族的成员，由细胞外免疫球蛋白可变区(IgV)结构域、Ⅰ型跨膜结构域、具有经典免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫球蛋白酪氨酸尾(ITT)基序的胞内结构域组成，是表达于淋巴细胞中的共抑制受体，在效应和调节性CD4+T细胞、滤泡辅助CD4+T细胞、效应CD8+T细胞和自然杀伤(NK)细胞中高表达，已成为癌症免疫治疗的新兴靶点。
目前，已经提出几种有关TIGIT介导效应T细胞和NK细胞抑制作用的机制。TIGIT可能以细胞外在方式作为CD155的配体，或以细胞内在方式通过干扰DNAM-1共刺激或直接将抑制信号传递至效应细胞来发挥作用。TIGIT和CD155广泛表达于不同类型的实体瘤中，说明TIGIT-CD155信号通路可能是一种重要的肿瘤免疫逃逸机制，是继TIGIT/PD-L1之后的新型免疫检查点。此外，TIGIT表达于调节性T细胞(T reg)上，可以增强T reg的抑制功能，从而抑制多种免疫细胞。由于其在淋巴细胞上广泛表达，TIGIT已成为一种重要的免疫检查点，抑制癌症免疫周期的每一步。TIGIT对NK细胞释放肿瘤抗原可能存在阻止作用，通过树突状细胞损害T细胞启动或抑制CD8+T细胞杀死癌细胞。大量的临床前研究表明，TIGIT是治疗癌症患者的合适靶点。
随着对TIGIT介导的免疫反应研究的不断深入，研究者针对癌症患者设计了TIGIT阻断剂的优化组合策略，目前已有10余种IgG1同种型的人源化抗TIGIT抗体进入临床试验，但是尚无相关药物获批。因此，仍需要发展具有高特异性、低毒副作用以及良好临床药效的抗TIIGIT抗体，开发靶向TIGIT疗法刺激抗肿瘤应答，用于治疗肿瘤以及相关感染性疾病。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种抗TIGIT单克隆抗体及其应用，所述抗TIGIT单克隆抗体对TIGIT具有高特异性和高亲和力，能够有效阻断TIGIT与其配体的结合，特异性解除TIGIT对机体的免疫抑制作用，激活T淋巴细胞，在提高免疫细胞活性和增强免疫应答、预防治疗肿瘤和感染性疾病等方面具有重要意义。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种抗TIGIT单克隆抗体，所述抗TIGIT单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包括SEQ ID NO:1所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:3所示的重链CDR3；
所述轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3；
SEQ ID NO:1：GDSITSGF；
SEQ ID NO:2：ISYSGSS；
SEQ ID NO:3：AAGDFGNYGYAMDN；
SEQ ID NO:4：QRVTTA；
SEQ ID NO:5：SAS；
SEQ ID NO:6：QQYYSTPLT。
本发明中，从鼠源抗人TIGIT抗体噬菌体文库中筛选鼠源抗人TIGIT抗体，筛选获得的抗体的重链可变区CDR1～3和轻链可变区CDR1～3共同决定抗体对抗原的特异性识别结合能力，含有SEQ ID NO:1～6的CDR的抗体mT251对TIGIT蛋白具有显著的特异性结合能力，对细胞表达的TIGIT抗原也具有结合活性，可以与CD155竞争结合TIGIT，在细胞水平上有效阻断TIGIT与其配体CD155的结合。
优选地，所述抗TIGIT单克隆抗体mT251的重链可变区包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:7：
DVKLKESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGFWNWIRKFPGNKLEYMGYISYSGSSYYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCAAGDFGNYGYAMDNWGQGTSVTVSS。
优选地，所述抗TIGIT单克隆抗体的轻链可变区包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:8：
DVLMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQRVTTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTITSVQPEDLAIYYCQQYYSTPLTFGAGTKLEIK。
优选地，所述抗TIGIT单克隆抗体还包括恒定区。
优选地，所述抗TIGIT单克隆抗体包括人源化抗体、嵌合抗体、双价或多价抗体。
第二方面，本发明提供了一种人源化抗TIGIT单克隆抗体，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
所述轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3；
SEQ ID NO:9：GGSITSGF；
SEQ ID NO:10：AAGDFGNYGYAMDV。
本发明中，对鼠源抗TIGIT单克隆抗体进行人源化改造，获得的hmT251改变了重链CDR1和重链CDR3，但是保留了与人TIGIT抗原的结合活性，相较于鼠源抗TIGIT单克隆抗体mT251、与人TIGIT抗原的结合活性没有明显的下降。
优选地，所述重链可变区包括SEQ ID NO:11～14所示的重链框架区；
SEQ ID NO:11(VH-FR1)：DVRLKESGPGLVKPSQTLSLTCTVS；
SEQ ID NO:12(VH-FR2)：WNWIRKHPGNGLEYIGY；
SEQ ID NO:13(VH-FR3)：
YYNPSLKSRVTISRDTSKNQYSLKLSSVTAADTAVYYC；
SEQ ID NO:14(VH-FR4)：WGQGTTVTVSS。
优选地，所述重链可变区包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:15：
DVRLKESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGFWNWIRKHPGNGLEYIGYISYSGSSYYNPSLKSRVTISRDTSKNQYSLKLSSVTAADTAVYYCAAGDFGNYGYAMDVWGQGTTVTVSS。
优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16～19所示的轻链框架区；
SEQ ID NO:16(VL-FR1)：DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAS；
SEQ ID NO:17(VL-FR2)：VAWYQQKPGKSPKLLIY；
SEQ ID NO:18(VL-FR3)：
YRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC；
SEQ ID NO:19(VL-FR4)：FGGGTKVEIK。
优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:20：
DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQRVTTAVAWYQQKPGKSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPLTFGGGTKVEIK。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体还包括恒定区。
第三方面，本发明对第二方面所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体进行亲和力成熟改造，在不改变重链框架区和轻链框架区的前提下，对抗体的重链CDR和轻链CDR进行优化，获得了22条人源化抗TIGIT单克隆抗体变体，与TIGIT抗原具有高亲和力。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的轻链可变区包括SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的轻链可变区包括SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:40所示的轻链CDR1。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的轻链可变区包括SEQ ID NO:6、SEQID NO:41或SEQ ID NO:42所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9、SEQID NO:21或SEQ ID NO:22所示的重链CDR1。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39所示的重链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:23～36之一所示的重链CDR2。
优选地，人源化抗TIGIT单克隆抗体变体3G6的重链可变区包括SEQ ID NO:21所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体1D5的重链可变区包括SEQ ID NO:22所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体1F2的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:23所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体2B12的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:24所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体1E1的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:25所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体3H10的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:26所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体3B12的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:27所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体3A1的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:28所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体3D5的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:29所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体3A8的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:30所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体3E3的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:31所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体1B5的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:32所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体3D12的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:33所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体2E10的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:34所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体2D2的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:35所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体1G2的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:36所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体1G4的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:37所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体3G8的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:38所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体2D3的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:39所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体2D5的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:40所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体1F5的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:41所示的轻链CDR3。
优选地，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体2G11的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:42所示的轻链CDR3。
本发明中，人源化抗TIGIT单克隆抗体变体与TIGIT抗原具有结合活性，可以特异性识别Jurkat-T细胞上表达的TIGIT抗原蛋白，解除TIGIT对机体的免疫抑制作用，其中，3G6、3G8和3D12变体能够激活T细胞、显著促进T细胞分泌IL-2因子，提高免疫细胞活性并增强免疫应答。
第四方面，本发明提供了一种抗TIGIT/PD-1双特异性抗体，所述抗TIGIT/PD-1双特异性抗体包括第二方面所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体。
所述抗TIGIT/PD-1双特异性抗体还包括抗PD-1抗体。
本发明中，TIGIT/PD-1双特异性抗体能够高亲和力结合TIGIT和PD-1两种抗原分子，并可以阻断CD155-TIGIT和PD-L1-PD-1的相互作用，应用于hPD-1/hTIGIT小鼠MC38结直肠癌动物模型中，表现出明显的肿瘤抑制效果。
第五方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括第一方面所述的抗TIGIT单克隆抗体、第二方面所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体、第三方面所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体变体或第四方面所述的抗TIGIT/PD-1双特异性抗体的编码基因。
第六方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括第五方面所述的核酸分子。
第七方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞表达第一方面所述的抗TIGIT单克隆抗体、第二方面所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体、第三方面所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体变体或第四方面所述的抗TIGIT/PD-1双特异性抗体。
优选地，所述重组细胞的基因组中整合有第五方面所述的核酸分子。
优选地，所述重组细胞包括第六方面所述的表达载体。
第八方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的抗TIGIT单克隆抗体、第二方面所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体、第三方面所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体变体或第四方面所述的抗TIGIT/PD-1双特异性抗体中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的任意一种或至少两种的组合。
第九方面，本发明提供了第一方面所述的抗TIGIT单克隆抗体、第二方面所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体、第三方面所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体变体、第四方面所述的抗TIGIT/PD-1双特异性抗体、第五方面所述的核酸分子、第六方面所述的表达载体、第七方面所述的重组细胞或第八方面所述的药物组合物在制备疾病预防和/或治疗药物中的应用。
优选地，所述疾病包括癌症、病毒感染性疾病或免疫系统疾病中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述癌症包括肺癌、肾癌、黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、头颈癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、卵巢癌、骨癌、结直肠癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性白血病或急性白血病中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述病毒感染性疾病包括HIV病毒感染性疾病、肝炎病毒感染性疾病、疱疹病毒感染性疾病或流感病毒感染性疾病中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述免疫系统疾病包括红斑狼疮、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、重症肌无力、多发性硬化症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、硬皮病、结节性多动脉炎或Wegener肉芽肿病中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的鼠源抗人TIGIT单克隆抗体mT251对人源TIGIT蛋白具有显著的特异性结合能力，对细胞表达的TIGIT抗原也具有结合活性，可以在细胞水平上有效阻断TIGIT与其配体CD155的结合；
(2)本发明的人源化hmT251相较于鼠源抗TIGIT单克隆抗体mT251，与人TIGIT抗原的结合活性没有明显的下降，与Jurkat细胞表面的TIGIT抗原具有结合活性；
(3)本发明的22条人源化抗TIGIT单克隆抗体变体与TIGIT抗原具有高亲和力，可以阻断TIGIT与CD155的结合，其中，3G6、3G8和3D12变体可以提高SED活化PBMC分泌IL-2的能力，重新激活T细胞，解除免疫抑制；
(4)本发明的抗TIGIT/PD-1双特异性抗体对TIGIT和PD-1均具有结合能力，通过阻断CD155-TIGIT和PD-L1-PD-1的相互作用从而发挥抗肿瘤效果，在制备肿瘤预防和/或治疗药物方面具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为ELISA检测鼠源抗TIGIT单克隆抗体mT251与人TIGIT抗原的结合活性；
图2A为FACS检测阴性对照hIgG与过表达人TIGIT的Jurkat细胞的结合结果，图2B为鼠源抗TIGIT单链抗体mT251与过表达人TIGIT的Jurkat细胞的结合结果；
图3A为ELISA检测鼠源抗TIGIT单链抗体mT251与抗原LAG-3的结合活性，图3B为ELISA检测鼠源抗TIGIT单链抗体mT251与抗原PD-1的结合活性，图3C为ELISA检测鼠源抗TIGIT单链抗体mT251与抗原PD-L1的结合活性；
图4为ELISA检测抗TIGIT单链抗体mT251阻断TIGIT与CD155的结合活性；
图5为FACS检测抗TIGIT抗体在细胞水平阻断TIGIT与CD155的结合活性；
图6为ELISA检测人源化抗体hmT251与TIGIT抗原蛋白的结合活性；
图7A为FACS检测hIgG与过表达人TIGIT的Jurkat细胞的结合结果，图7B为FACS检测人源化抗体hmT251与过表达人TIGIT的Jurkat细胞的结合结果；
图8A为ELISA检测人源化抗体hmT251与抗原CTLA4的结合活性，图8B为ELISA检测人源化抗体hmT251与抗原LAG3的结合活性，图8C为ELISA检测人源化抗体hmT251与抗原PD-L1的结合活性，图8D为ELISA检测人源化抗体hmT251与抗原PD-1的结合活性；
图9A为部分变体蛋白1E1、3H10、3B12、3A1、3D5、3A8、1F5、3E3、1B5的SDS-PAGE结果，图9B为部分变体蛋白3G6、2G11、3D12、2D5、1D5、2E10、2D2、3G8、1G2的SDS-PAGE结果；
图10A为hmT251亲和力成熟变体1F2、1G4与人TIGIT抗原的结合活性，图10B为hmT251亲和力成熟变体2D3、2B12与人TIGIT抗原的结合活性，图10C为hmT251亲和力成熟变体2E10、2D2、3G8、1G2与人TIGIT抗原的结合活性，图10D为hmT251亲和力成熟变体1E1、3H10、3B12、3A1、3D5与人TIGIT抗原的结合活性，图10E为hmT251亲和力成熟变体3A8、1F5、3E3、1B5、3G6与人TIGIT抗原的结合活性，图10F为hmT251亲和力成熟变体3D12、2D5、1D5、2G11与人TIGIT抗原的结合活性；
图11A为FACS检测hmT251亲和力成熟变体2B12、3A8、3B12、1E1、3E3、3D12与过表达人TIGIT的Jurkat细胞的结合结果，图11B为FACS检测hmT251亲和力成熟变体1D5、2D2、2D3与过表达人TIGIT的Jurkat细胞的结合结果，图11C为FACS检测hmT251亲和力成熟变体3D5、3H10、1G4、3G6、1B5、2E10与过表达人TIGIT的Jurkat细胞的结合结果；
图12为hmT251亲和力成熟变体与CD155抗原竞争结合TIGIT抗原的活性；
图13为hmT251亲和力成熟变体提高SED活化PBMC分泌IL-2的功能；
图14为hmT251亲和力成熟变体3G6、3G8和3D12与CD155抗原竞争结合TIGIT抗原的曲线；
图15A为ELISA检测TIGIT/PD-1双特异性抗体与PD-1的结合活性，图15B为ELISA检测TIGIT/PD-1双特异性抗体与TIGIT的结合活性；
图16为利用生物测定系统检测抗TIGIT/PD-1双特异性抗体的体外活性结果；
图17为TIGIT/PD-1双特异性抗体在MC38结直肠癌动物模型中的抗肿瘤作用。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
本发明所用“氨基酸”是指20种天然存在的氨基酸或者任何可能出现在某一特定位置的非天然的氨基酸类似物。
本发明所用“氨基酸突变”是指多肽链中某一个氨基酸的添加、取代、插入和/或删除。
本发明所用“抗体”包括全长抗体和抗体片段，涉及来自有机体的天然抗体、基因工程抗体或者通过重组技术获得的抗体，术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体等，术语“抗体”还包括鼠源抗体、人源化抗体和人抗体等。
本发明所用术语“EC50”即半最大效应浓度(concentration for 50％of maximaleffect)，是指引起50％最大效应所对应的抗体浓度。
本发明所用“人源化抗体”是指人源免疫球蛋白(受体抗体)的部分或者全部CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或者抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或者反应性的非人源(如小鼠、大鼠或兔)抗体；此外，受体抗体的框架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或者被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步改善或者优化抗体的一种或多种特性。
实施例1鼠源抗TIGIT抗体的制备
(1)TIGIT抗原的制备
本实施例首先制备TIGIT抗原(NCBI登录号：NP_776160.2，胞外区21～141位氨基酸)：将TIGIT抗原的基因克隆至真核表达载体，利用PEI法将重组真核表达质粒转染至293F宿主细胞，培养后收集细胞上清液，进行protein A亲和纯化得到TIGIT-Fc融合蛋白，再用TEV蛋白酶酶切，亲和层析纯化得到重组人TIGIT蛋白抗原。
(2)单链抗体噬菌体文库的制备和筛选
重组人TIGIT蛋白抗原用完全弗氏佐剂乳化后，注射免疫6～8周龄的BALB/c小鼠；每间隔两周后采用不完全弗氏佐剂乳化的重组人TIGIT蛋白抗原进行第二、第三、第四次免疫；四次免疫后取小鼠尾血，ELISA法测定梯度稀释的血清效价，根据结果确定是否加强免疫；
取小鼠脾脏进行研磨处理，制备脾淋巴细胞悬液；提取脾细胞总RNA并逆转录得cDNA，PCR扩增所有抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列，并经重叠延伸PCR扩增得到VH-linker-VL单链抗体(scFv)，后克隆至噬菌粒载体并转化宿主细胞TG1，获得鼠源抗人TIGIT单链抗体噬菌体文库；
鼠源抗人TIGIT单链抗体噬菌体文库经包装、展示、三轮淘洗后，富集阳性克隆并测序，得到数株鼠源抗TIGIT单链抗体，其中，鼠源抗TIGIT单链抗体mT251的重链可变区如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区如SEQ ID NO:8所示。
实施例2鼠源抗TIGIT单链抗体的功能验证
(1)单链抗体的表达与纯化
本实施例采用293F瞬时转染系统表达鼠源抗TIGIT单链抗体：
将鼠源抗TIGIT单链抗体mT251的基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1-Fc，构建mT251 scFv-Fc重组真核表达质粒；将质粒扩增提取后瞬转293F细胞，培养并收集细胞上清液，进行protein A亲和层析柱纯化，纯化产物即为鼠源抗TIGIT单链抗体-Fc重组蛋白。
(2)ELISA检测抗TIGIT单链抗体与人TIGIT抗原的结合活性
将TIGIT抗原加入酶标板中4℃孵育过夜；室温封闭、洗涤；加入待测抗体，室温孵育、洗涤；加入HRP标记羊抗人IgG(H+L)二抗，室温孵育、洗涤；显色后用酶标仪在450nm处检测吸光度，以log(抗体浓度)为横坐标，OD450为纵坐标，绘制曲线。
图1为ELISA检测鼠源抗TIGIT单链抗体与人TIGIT抗原的结合活性，候选抗体mT251具有与TIGIT抗原的高结合活性；以EC50表示抗TIGIT单链抗体与人TIGIT抗原的结合活性，mT251的EC50为0.1253μg/mL，说明鼠源TIGIT单链抗体mT251能够高亲和力结合hTIGIT抗原蛋白。
(3)FACS检测抗TIGIT单链抗体与Jurkat/TIGIT细胞表面TIGIT抗原的结合活性
收集对数期的Jurkat/TIGIT细胞，加入抗TIGIT抗体，冰上孵育1小时；PBS清洗后，加入PE标记羊抗人IgG二抗，冰上孵育1小时；清洗后用PBS重悬细胞，在流式细胞仪上用PE通道检测荧光信号。
结果如图2A和图2B所示，鼠源抗TIGIT单链抗体mT251能识别Jurkat/TIGIT细胞表达的TIGIT抗原。
(4)ELISA检测抗TIGIT单链抗体的非特异性结合
将LAG-3、PD-1或PD-L1抗原加入酶标板中4℃孵育过夜；室温封闭、洗涤；加入待测抗体，室温孵育、洗涤；加入HRP标记羊抗人IgG(H+L)二抗，室温孵育、洗涤；显色后用酶标仪在450nm处检测吸光度，以log(抗体浓度)为横坐标，OD450为纵坐标，绘制曲线。
图3A、图3B和图3C分别为ELISA检测鼠源抗TIGIT单链抗体与其他抗原LAG-3、PD-1或PD-L1的结合活性，综合图1结果可知筛选的鼠源TIGIT抗体mT251能够特异性结合TIGIT，而不与LAG-3、PD-1和PD-L1等抗原蛋白结合。
实施例3鼠源抗TIGIT抗体阻断TIGIT与配体CD155的结合
(1)竞争ELISA检测抗TIGIT抗体阻断TIGIT与CD155的结合活性
将TIGIT抗原加入酶标板孵育过夜，PBST洗涤后室温封闭；洗涤后加入梯度稀释的抗TIGIT抗体室温孵育；洗涤后加入生物素标记的CD155抗原，室温孵育后洗涤。加入Straptavidin-HRP室温孵育，再次洗涤后加入TMB显色液。使用酶标仪在450nm处检测吸光度，以log(抗体浓度)为横坐标，OD450为纵坐标，绘制曲线。
结果如图4所示，mT251抗体能够有效阻断TIGIT与CD155的结合。
(2)FACS检测抗TIGIT抗体在细胞水平阻断TIGIT与CD155的结合活性
收集对数期的Jurkat/CD155细胞加入TIGIT-Fc融合蛋白孵育；加入TIGIT抗体稀释液孵育；洗涤后加入PE标记羊抗人IgG二抗冰上孵育；洗涤后重悬细胞，在流式细胞仪上用PE通道检测荧光信号。
结果如图5所示，mT251抗体能够在细胞水平上有效阻断TIGIT与CD155的结合活性。
实施例4鼠源抗TIGIT抗体mT251的人源化改造、表达和功能验证
(1)鼠源抗体人源化
本实施例首先对具有TIGIT/CD155阻断效应的鼠源单链抗体mT251进行人源化改造和功能验证，mT251的重链互补决定区(HC-CDR)和轻链互补决定区(LC-CDR)具体为：
鼠源单链抗体mT251的重链互补决定区HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3分别被指定为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3，轻链互补决定区LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3分别被指定为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6。
通过搜索IMGT结构域空位比对3D结构数据库(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)，比对鼠源抗体的骨架区(Framework，FR)和人源抗体的骨架区，根据高同源性突变位点的鼠源抗体序列的框架氨基酸，与原有重链互补决定区和轻链互补决定区重新组合，获得人源化抗体序列hmT251：
人源化单链抗体hmT251的重链互补决定区HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3分别被指定为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10，轻链互补决定区LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3分别被指定为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6；
重链框架区VH-FR1、VH-FR2、VH-FR3、VH-FR4分别被指定为SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14，轻链框架区VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3、VL-FR4分别被指定为SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19；
重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)分别被指定为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:20。
(2)人源化抗体hmT251的表达
将人源化抗体hmT251的重链可变区和轻链可变区的编码基因克隆至真核表达载体，转染293F细胞并培养，收集细胞上清液纯化，得到人源化抗体。
(3)ELISA检测人源化抗体hmT251与人TIGIT抗原的结合活性
如前述实施例方法，利用ELISA检测人源化抗体hmT251与人TIGIT抗原的结合活性，结果如图6所示。此外，人源化抗体hmT251与人TIGIT抗原的结合活性EC50为0.07412μg/mL，鼠源抗体mT251与人TIGIT抗原的结合活性EC50为0.09901μg/mL，表明鼠源抗体mT251经人源化后与人TIGIT抗原的结合活性并没有明显的下降。
(4)FACS检测人源化抗体hmT251与Jurkat-T细胞的结合活性
如前述实施例方法，利用FACS检测人源化抗体hmT251与Jurkat-T细胞表面TIGIT的结合活性。结果如图7A和图7B所示，人源化抗体hmT251与Jurkat-T细胞表面TIGIT抗原的结合能力未降低，可以特异性识别Jurkat-T细胞上表达的TIGIT抗原蛋白。
(5)ELISA检测人源化抗体hmT251的非特异性结合
如前述实施例方法，利用ELISA检测人源化抗体hmT251的非特异性结合。结果如图8A、图8B、图8C和图8D所示，靶向TIGIT的人源化抗体hmT251不与CTLA4、LAG3、PD-L1、PD-1等其他抗原蛋白结合，具有较高的特异性。
实施例5人源化抗体hmT251的亲和力成熟
为提高人源化抗TIGIT抗体hmT251与抗原TIGIT的结合活性，本实施例通过提升亲和力进一步提高抗体的理化性质和功能活性。
(1)亲和力成熟文库的构建
为生成人源化抗体hmT251重链互补决定区HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3和轻链互补决定区LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3的随机化亲和力成熟文库，将HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3和LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3的氨基酸三联密码子随机化，分别合成HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3的三联密码子上下游随机引物，使用人源化抗体的单链抗体(VH-linker-VL)为模板、单链抗体上游引物和下游随机引物扩增第一片段，使用相同模板、单链抗体下游引物和上游随机引物扩增第二片段，第一片段的3’端和第二片段的5’端具有交叠区，将第一片段和第二片段进行琼脂糖凝胶电泳纯化回收；
使用第一片段和第二片段为模板、单链抗体上下游引物进行交叠延伸PCR，生成具有随机化CDR的第三片段，将第三片段进行琼脂糖凝胶电泳纯化回收，与经限制性内切酶消化后的噬菌粒载体进行连接，连接产物电转化大肠杆菌感受态细胞TG1，并均匀涂布平板；37℃过夜培养后收集菌体，所得菌体即为人源化抗体的亲和力成熟文库。
针对人源化抗体hmT251共构建6个文库，分别为：hmT251-HC-CDR1文库、hmT251-HC-CDR2文库、hmT251-HC-CDR3文库、hmT251-LC-CDR1文库、hmT251-LC-CDR2文库和hmT251-LC-CDR3文库。
(2)亲和力成熟文库的筛淘
利用噬菌体展示技术实施亲和力成熟的人源化单链抗体的生成，如前述实施例方法，亲和力成熟文库噬菌体文库经包装、展示、三轮淘洗后，富集阳性克隆并测序，得到22个人源化抗体hmT251亲和力成熟变体。其中，重链框架区VH-FR1、VH-FR2、VH-FR3、VH-FR4分别被指定为SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14，轻链框架区VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3、VL-FR4分别被指定为SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19；各个克隆的HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3的序列如表1所示；
表1
Figure BDA0002934084430000091
Figure BDA0002934084430000101
Figure BDA0002934084430000111
Figure BDA0002934084430000121
(3)亲和力成熟变体的表达纯化
如前述实施例方法，利用293F真核表达系统表达纯化亲和力成熟变体，部分变体蛋白的SDS-PAGE结果如9A和图9B所示，其中，图9A中泳道1-9分别为1E1、3H10、3B12、3A1、3D5、3A8、1F5、3E3、1B5变体蛋白，图9B中泳道1-9分别为3G6、2G11、3D12、2D5、1D5、2E10、2D2、3G8和1G2变体蛋白。
(4)ELISA检测hmT251亲和力成熟变体与人TIGIT抗原的结合活性
如前述实施例方法，利用ELISA检测hmT251亲和力成熟变体与人TIGIT抗原的结合活性，示例结果如图10A、图10B、图10C、图10D、图10E、图10F所示，部分亲和力成熟变体与人TIGIT抗原的结合能力较强。
hmT251亲和力成熟变体与人TIGIT抗原的结合活性EC50(μg/mL)如表2所示。
表2
mAbs EC50(μg/mL)
hmT251 0.1550
3G6 0.08159
1D5 0.6968
1F2 0.05256
2B12 0.07536
1E1 0.1279
3H10 0.1034
3B12 0.5896
3A1 0.0999
3D5 0.07156
3A8 0.2196
3E3 2.758
1B5 0.07356
3D12 0.05669
2E10 0.0600
2D2 1.088
1G2 0.07895
1G4 0.1119
3G8 0.1374
2D3 0.1415
2D5 1.042
1F5 0.01319
2G11 0.08345
(5)FACS检测hmT251亲和力成熟变体与Jurkat-T细胞的结合活性
如前述实施例方法，利用FACS检测人源化抗体hmT251变体与Jurkat-T细胞表面TIGIT的结合活性。结果如图11A、图11B和图11C所示，人源化hmT251变体与Jurkat-T细胞表面TIGIT抗原的结合能力未降低，可以特异性识别Jurkat-T细胞上表达的TIGIT抗原蛋白。
(6)竞争ELISA法检测抗TIGIT抗体与CD155竞争结合TIGIT抗原
如前述实施例方法，采用竞争ELISA法检测抗TIGIT抗体与CD155竞争结合TIGIT抗原。结果如图12所示，亲和力成熟的候选抗体能特异性结合TIGIT抗原，阻断TIGIT与CD155的相互作用。
(7)抗TIGIT抗体提高SED活化PBMC分泌IL-2的功能
采用密度梯度离心法从人外周血获得新鲜PBMC，用含SED的RPMI 1640培养基重悬后接种于96孔板；加入抗TIGIT抗体后于37℃、5％CO2培养箱中培养4天后，取细胞上清液测定IL-2浓度。
结果如图13所示，部分变体能促进T细胞分泌IL-2因子，其中3G6、3G8和3D12变体能够显著促进IL-2因子的分泌。
(8)竞争ELISA法检测变体3G6、3G8和3D12与CD155竞争结合TIGIT抗原
如前述实施例方法，结果如图14所示，变体3G6、3G8和3D12能够有效竞争TIGIT抗原与CD155的结合，且具有浓度依赖性。
实施例6基于人源化抗TIGIT抗体的双特异性抗体的构建和功能验证
(1)基于人源化抗TIGIT抗体和人源化抗PD-1抗体构建TIGIT/PD-1双特异性抗体
基于筛选的人源化抗TIGIT抗体和申请人前期筛选的人源化抗PD-1抗体，利用基因工程手段构建TIGIT/PD-1双特异性抗体，其中，抗体的Fc部分按照发明人先前的专利申请公开WO2017034770A1的方法进行改造，分别将两种抗体的编码基因克隆至真核表达载体中。根据前述实施例抗体的制备方法，获得人源化TIGIT/PD-1双特异性抗体。
(2)ELISA检测TIGIT/PD-1双特异性抗体与TIGIT和PD-1抗原的结合活性
如前述实施例方法，结果如图15A和图15B所示，构建的TIGIT/PD-1双特异性抗体能够高亲和力结合两种抗原分子。
(3)利用生物测定系统检测抗TIGIT/PD-1双特异性抗体的体外活性
生物测定系统包括两种细胞：表达TIGIT、PD-1、TCR复合物和荧光素酶的效应细胞，和表达CD155、PD-L1和TCR活化剂的人工抗原呈递细胞。在该生物测定系统中，荧光素酶表达需要TCR结合共刺激信号，CD155-TIGIT相互作用导致净抑制性信号传导且无荧光素酶表达，PD-L1与PD-1的结合抑制荧光素酶表达，CD155-TIGIT和PD-L1/PD-1相互作用阻断减轻了抑制性信号、促进了共刺激信号，驱动荧光素酶的表达。
将表达TIGIT和PD-1的Jurkat效应细胞与表达CD155、PD-L1和TCR活化剂的CHO-K1人工抗原呈递细胞(aAPC)共培养，Jurkat效应细胞含有由启动子驱动的荧光素酶报告基因，在不存在阻断性抗TIGIT抗体的情况下，CD155-TIGIT和PD-L1-PD-1结合导致T细胞共抑制且无启动子活性；加入TIGIT/PD-1双抗后，PD-L1/PD-1相互作用被阻断，减轻一种共抑制信号，而CD155-TIGIT相互作用被中断，发出共刺激信号并驱荧光素酶产生。
结果如图16所示，TIGIT/PD-1双特异性抗体通过阻断CD155-TIGIT和PD-L1-PD-1的相互作用来活化效应细胞表达荧光素酶，并具有较强的功能活性。
(4)基于hPD-1/hTIGIT小鼠MC38结直肠癌动物模型的TIGIT/PD-1双抗药效实验
利用B-hPD-1/hTIGIT小鼠构建MC38结肠癌动物模型，并测试TIGIT/PD-1双抗药物的体内药效。
具体步骤如下：
将MC38细胞接种于B-hPD-1/hTIGIT人源化小鼠的右侧皮下，待肿瘤生长到大约75mm3时，按肿瘤体积挑选12只小鼠进行随机分组，每组6只，共2组，分别为：对照组(G1组)和TIGIT/PD-1双抗(G2组；5mg/kg)；分组当天给药(D0)，所有组给药途径均为静脉注射，每周给药2次，连续给药6次后结束实验，给药和观察期间每周2次测量小鼠体重和肿瘤体积，并记录测量值；
实验结束时，动物安乐死，剥取肿瘤进行称重、拍照，计算肿瘤体积生长抑制率。
结果如图17所示，EX4为供试TIGIT/PD-1双抗分子，在实验过程中，动物状态和进食情况良好，表明动物对TIGIT/PD-1耐受性较好；动物共给药四次，观察一周后结束实验，结束实验时对照组平均肿瘤体积为1242±193mm3，TIGIT/PD-1组平均肿瘤体积为546±96mm3，肿瘤体积生长抑制率TGITV为59.6％，说明TIGIT/PD-1双抗具有明显的肿瘤抑制效果。
综上所述，本发明的抗TIGIT单克隆抗体及由此衍生的人源化抗TIGIT单克隆抗体、人源化抗TIGIT单克隆抗体变体、TIGIT/PD-1双特异性抗体能够有效阻断TIGIT与CD155的结合，特异性解除TIGIT对机体的免疫抑制作用，激活T淋巴细胞，在提高免疫细胞活性和增强免疫应答、预防治疗肿瘤和感染性疾病等方面具有重要的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州爱思迈生物医药科技有限公司
<120> 一种抗TIGIT单克隆抗体及其应用
<130> 20210203
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1 5

Claims (17)

1.一种抗TIGIT单克隆抗体，其特征在于，所述抗TIGIT单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包括SEQ ID NO:1所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:3所示的重链CDR3；
所述轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗TIGIT单克隆抗体，其特征在于，所述抗TIGIT单克隆抗体的重链可变区包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
所述抗TIGIT单克隆抗体的轻链可变区包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的抗TIGIT单克隆抗体，其特征在于，所述抗TIGIT单克隆抗体还包括恒定区。
4.一种人源化抗TIGIT单克隆抗体，其特征在于，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
所述轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
5.根据权利要求4所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区包括SEQ ID NO:11～14所示的重链框架区；
所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16～19所示的轻链框架区。
6.根据权利要求5所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；
所述轻链可变区包括SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求4-6任一项所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体，其特征在于，所述人源化抗TIGIT单克隆抗体还包括恒定区。
8.一种权利要求4-7任一项所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体变体，其特征在于，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:21所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:22所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:23所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:24所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:25所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:26所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:27所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:28所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:29所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:30所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:31所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:32所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:33所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:34所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:35所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:36所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:37所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:38所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:39所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:40所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQID NO:6所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:41所示的轻链CDR3；或者，
所述人源化抗TIGIT单克隆抗体变体的重链可变区包括SEQ ID NO:9所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；
轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ IDNO:42所示的轻链CDR3。
9.一种抗TIGIT/PD-1双特异性抗体，其特征在于，所述抗TIGIT/PD-1双特异性抗体包括权利要求4-7任一项所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体；
所述抗TIGIT/PD-1双特异性抗体还包括抗PD-1抗体。
10.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码权利要求1-3任一项所述的抗TIGIT单克隆抗体、权利要求4-7任一项所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体、权利要求8所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体变体或权利要求9所述的抗TIGIT/PD-1双特异性抗体的基因。
11.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求10所述的核酸分子。
12.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达权利要求1-3任一项所述的抗TIGIT单克隆抗体、权利要求4-7任一项所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体、权利要求8所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体变体或权利要求9所述的抗TIGIT/PD-1双特异性抗体。
13.根据权利要求12所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的基因组中整合有权利要求10所述的核酸分子。
14.根据权利要求12所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括权利要求11所述的表达载体。
15.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-3任一项所述的抗TIGIT单克隆抗体、权利要求4-7任一项所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体、权利要求8所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体变体或权利要求9所述的抗TIGIT/PD-1双特异性抗体中的任意一种或至少两种的组合。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的任意一种或至少两种的组合。
17.权利要求1-3任一项所述的抗TIGIT单克隆抗体、权利要求4-7任一项所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体、权利要求8所述的人源化抗TIGIT单克隆抗体变体、权利要求9所述的抗TIGIT/PD-1双特异性抗体、权利要求10所述的核酸分子、权利要求11所述的表达载体、权利要求12-14任一项所述的重组细胞或权利要求15或16所述的药物组合物在制备疾病预防和/或治疗药物中的应用；
所述疾病包括癌症；
所述癌症包括肺癌、肾癌、乳腺癌、肝癌、头颈癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、卵巢癌、骨癌、结直肠癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性白血病或急性白血病中的任意一种或至少两种的组合。
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