CN111848794A - 一种分离的lag-3结合蛋白及其应用 - Google Patents

一种分离的lag-3结合蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种分离的LAG‑3结合蛋白及其用途，其能够以约1×10‑9M以下的KD值结合人LAG‑3蛋白，阻断LAG‑3蛋白与Daudi细胞的结合，刺激免疫细胞分泌IL‑2，抑制肿瘤生长，和/或抑制肿瘤细胞增殖。本申请还提供了包含所述LAG‑3结合蛋白的多特异性抗原结合蛋白。

Description

一种分离的LAG-3结合蛋白及其应用
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种分离的LAG-3结合蛋白及其应用。
背景技术
淋巴细胞活化基因-3(LAG-3，CD223)是一种I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，在活化的CD4+和CD8+T细胞、B细胞、NK细胞、浆细胞样树突状细胞和调节性T细胞的表面上表达。LAG-3能与II类主要组织相容性复合物(MHC II)结合，向表达LAG-3的细胞递送负面信号并下调抗原依赖性的CD4+和CD8T+细胞应答。LAG-3具有负向调节T细胞的增殖、产生细胞因子和裂解靶细胞的能力。此外，靶向LAG-3及一种或多种其他抗原的制剂也被用于治疗多种疾病。然而，许多单独施用时有活性的抗体在被制备为双功能或多功能分子后，活性减弱甚至消失。
因此，本领域亟需开发新的LAG-3结合蛋白，特别是适合用于制备双功能或多功能分子的LAG-3结合蛋白。
发明内容
本申请提供了一种分离的LAG-3结合蛋白，其能以1x10-9M或更低的KD值结合人LAG-3蛋白，阻断LAG-3蛋白与Daudi细胞的结合，刺激免疫细胞分泌IL-2，抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。本申请的LAG-3结合蛋白还适合被用于制备双特异性或多特异性的抗原结合蛋白。
一方面，本申请提供了一种分离的LAG-3结合蛋白，其包含抗体轻链可变区VL和抗体重链可变区VH，所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中所述LCDR1包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，所述HCDR1包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQID NO：30所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：
1)能够以1x10-9M或更低的KD值结合人LAG-3蛋白，其中所述KD值通过Biacore方法测定；
2)以20nM或更高的EC50值结合食蟹猴LAG-3蛋白；
3)基本上不结合小鼠LAG-3蛋白；
4)能够阻断LAG-3蛋白与Daudi细胞的结合；
5)能够刺激免疫细胞分泌IL-2，所述IL-2的分泌在ELISA测定中测得；
6)能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述VL包括框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述L-FR1包含SEQ ID NO：41、56中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述L-FR2包含SEQ ID NO：42、57-58中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述L-FR3包含SEQ ID NO：43、59-64中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述L-FR4包含SEQ ID NO：44、65中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述VL包含SEQ ID NO：91所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述VL包含SEQ ID NO：7、80-86中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述VH包括框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述H-FR1包含SEQ ID NO：45、49中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述H-FR2包含SEQ ID NO：46、50-51中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述H-FR3包含SEQ ID NO：47、52-54中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述H-FR4包含SEQ ID NO：48、55中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述VH包含SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的LAG-3结合蛋白中，所述VH包含SEQ ID NO：8、87-90中任一项所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了分离的一种或多种核酸分子，其编码本申请所述的分离的LAG-3结合蛋白。
另一方面，本申请提供了一种载体，其包含根据本申请所述的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含根据本申请所述的核酸分子或根据本申请所述的载体。
另一方面，本申请提供了一种制备本申请所述的分离的LAG-3结合蛋白的方法，所述方法包括在使得本申请所述的分离的LAG-3结合蛋白表达的条件下，培养根据本申请所述的细胞。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含本申请所述的分离的LAG-3结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
另一方面，本申请提供了一种本申请所述的分离的LAG-3结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
另一方面，本申请提供了一种预防、缓解或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本申请所述的分离的LAG-3结合蛋白。
另一方面，本申请提供了一种多特异性抗原结合蛋白，其包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分结合LAG-3且包含本申请所述的LAG-3结合蛋白，所述第二抗原结合部分结合不为LAG-3的其他抗原。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白中，所述不为LAG-3的其他抗原为肿瘤相关抗原。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白中，所述肿瘤相关抗原包括PD-1，PD-L1，TIM3和/或CD47。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合部分包括一个或多个scfv形式的所述LAG-3结合蛋白。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合部分包含：针对所述其他抗原的抗体轻链或其片段；以及针对所述其他抗原的抗体重链或其片段。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合部分包括一个或多个scfv形式的所述LAG-3结合蛋白，且每个所述scfv形式的LAG-3结合蛋白各自独立地与针对所述其他抗原的所述抗体轻链或其片段或者与针对所述其他抗原的所述抗体重链或其片段直接或间接连接。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白中，所述间接连接包括通过多肽连接子连接。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白中，至少一个所述scfv形式的LAG-3结合蛋白与针对所述其他抗原的所述抗体轻链或其片段直接或间接连接，且位于针对所述其他抗原的所述抗体轻链或其片段的N端。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白中，至少一个所述scfv形式的LAG-3结合蛋白与针对所述其他抗原的所述抗体轻链或其片段直接或间接连接，且位于针对所述其他抗原的所述抗体轻链或其片段的C端。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白中，至少一个所述scfv形式的LAG-3结合蛋白与针对所述其他抗原的所述抗体重链或其片段直接或间接连接，且位于针对所述其他抗原的所述抗体重链或其片段的N端。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白中，至少一个所述scfv形式的LAG-3结合蛋白与针对所述其他抗原的所述抗体重链或其片段直接或间接连接，且位于针对所述其他抗原的所述抗体重链或其片段的C端。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白中，至少一个所述scfv形式的LAG-3结合蛋白与针对所述其他抗原的所述抗体轻链或其片段直接或间接连接，且至少一个所述scfv形式的LAG-3结合蛋白与针对所述其他抗原的所述抗体重链或其片段直接或间接连接。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白包含第一多肽链及第二多肽链，其中所述第一多肽链包含下述任一项所述的氨基酸序列：SEQ ID NO：106、109、111、112、115和117；且所述第二多肽链包含下述任一项所述的氨基酸序列：SEQ ID NO：107、108、110、113、114和116。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白包含2条相同的所述第一多肽链，以及2条相同的所述第二多肽链。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合部分包括一个或多个scfv形式的所述其他抗原结合蛋白，且所述一个或多个scfv形式的其他抗原结合蛋白结合不为LAG-3的所述其他抗原。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合部分包含本申请所述的LAG-3结合蛋白，所述LAG-3结合蛋白包含针对LAG-3的抗体轻链或其片段，以及针对LAG-3的抗体重链或其片段。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合部分包括一个或多个scfv形式的所述其他抗原结合蛋白，且每个所述scfv形式的其他抗原结合蛋白各自独立地与所述针对LAG-3的抗体轻链或其片段或者与所述针对LAG-3的抗体重链或其片段直接或间接连接。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白中，所述间接连接包括通过多肽连接子连接。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白中，至少一个所述scfv形式的其他抗原结合蛋白与所述针对LAG-3的抗体重链或其片段直接或间接连接。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白中，至少一个所述scfv形式的其他抗原结合蛋白位于所述针对LAG-3的抗体重链或其片段的N端。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白包含第一多肽链及第二多肽链，其中所述第一多肽链包含下述任一项所述的氨基酸序列：SEQ ID NO：94；且所述第二多肽链包含下述任一项所述的氨基酸序列：SEQ ID NO：118。
在某些实施方式中，所述的多特异性抗原结合蛋白，其包含2条相同的所述第一多肽链，以及2条相同的所述第二多肽链。
另一方面，本申请提供了分离的一种或多种核酸分子，其编码本申请所述的多特异性抗原结合蛋白。
另一方面，本申请提供了一种载体，其包含本申请所述的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。
另一方面，本申请提供了一种制备本申请所述的多特异性抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得本申请所述的多特异性抗原结合蛋白表达的条件下，培养本申请所述的细胞。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含本申请所述的多特异性抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
另一方面，本申请提供了一种本申请所述的多特异性抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
另一方面，本申请提供了一种预防、缓解或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本申请所述的分离的LAG-3结合蛋白。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示的是本申请所述多特异性抗原结合蛋白的结构示意图。
图2显示的是本申请所述LAG-3嵌合抗体mab7c、mab84c和人LAG-3的结合活性(ELISA)。
图3显示的是本申请所述LAG-3嵌合抗体mab7c和mab84c刺激人T细胞的活性。
图4显示的是本申请所述LAG-3嵌合抗体mab7c、mab84c以及其人源化抗体阻止hLAG-3和MHCII(Daudi细胞)结合的活性。
图5A-5N显示的是本申请所述多特异性抗原结合蛋白与人LAG-3的结合活性。
图6A-6N显示的是本申请所述多特异性抗原结合蛋白与人PD-1的结合活性。
图7显示的是本申请所述多特异性抗原结合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析结果。
图8显示的是本申请所述多特异性抗原结合蛋白的体内药效。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
在本申请中，术语“LAG-3”和“LAG3”可互换的使用，通常指淋巴细胞活化基因3，也称为CD223，属于免疫球蛋白超家族。LAG-3是一种细胞表面蛋白，可包含4个Ig样的胞外区域(第一区域，第二区域，第三区域，第四区域)。本申请所述LAG-3可以包括LAG3抗原或其片段。在本申请中，所述LAG-3可以是人LAG-3，猴LAG-3，小鼠LAG-3。例如，所述人LAG-3在NCBI的登录号为NP_002277.4。所述人LAG-3胞外区域可包含NCBI登录号为NP_002277.4所示序列中第23-422位的氨基酸序列。例如，本申请所述猴LAG-3可以是食蟹猴LAG-3，其在NCBI的登录号为NP_001271679。例如，本申请所述鼠LAG-3可以是小鼠LAG-3，其在GenBank中的登录号为EDK99777。
在本申请中，术语“LAG-3结合蛋白”通常指能与LAG-3结合的蛋白质，可以为LAG-3抗体或其抗原结合片段，也可以包含免疫缀合物，多特异性抗体或融合蛋白等。
在本申请中，术语“基本上不结合”通常指不结合或不以高亲和力结合。在本申请中，所述不结合或不以高亲和力结合可以是，与对照抗体(例如，一种可以与小鼠LAG-3蛋白结合的LAG-3抗体)相比，与某一特定靶点(例如所述特定靶点可以为抗原，例如，可以为小鼠LAG-3蛋白)的结合能力下降了至少约50％。例如，可以为下降了至少约60％、至少约80％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约500％或更多。
在本申请中，术语“PD-1”和“PD1”可互换地使用，通常指细胞程序性死亡蛋白1(Programmed cell death protein1)，也可以称为CD279、PDCD1、SLEB2，其是CD28受体家族的成员。PD-L1与PD-1结合可以降低免疫T细胞参与的免疫应答。所述PD-1可以包含一个免疫球蛋白(Ig)超家族结构域、一个20AA的功能域、一个跨膜结构域和胞内结构域。在本申请中，所述PD-1可以为完整的PD-1，也可以为包含PD-1中的一个或多个结构域的片段，只要该片段仍可以与PD-L1结合即可。在本申请中，所述PD-1可以是人PD-1或其片段。例如，所述人PD-1在UniProtKB数据库中的登录号为No.Q15116；所述人PD-1在GenBank中的登录号为AAH74740。
在本申请中，术语“PD-L1”和“PDL1”可互换地使用，通常指细胞程序性死亡配体1，也称为表面抗原分化簇274(CD274)或B7同源蛋白1(B7-H1)、PDCD1L1、PDCD1LG1、PDL1，属于肿瘤坏死因子超家族。PD-L1可以是由290个氨基酸残基组成的I型跨膜糖蛋白，包含一个IgV样区、一个IgC样区、一个跨膜疏水区和一个30个氨基酸的胞内尾部。所述PD-L1可以是人PD-L1或其片段。例如，所述人PD-L1可包含NCBI数据库中登录号为NP_054862.1所示的氨基酸序列，其中胞外区可包含第19-239位氨基酸。
在本申请中，术语“Tim-3”、“Tim3”和“TIM3”可互换地使用，通常指T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域分子-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3)，也称为甲型肝炎病毒细胞受体2(Hepatitis Avirus cellular receptor2，HAVCR2)、CD366，是TIM家族的一个受体蛋白，在T细胞、Treg细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、单核细胞表面表达。Tim-3具有结构保守的免疫球蛋白可变(IgV)结构域和粘蛋白结构域的I型跨膜蛋白。所述Tim-3可以为人Tim-3或其片段。例如，人Tim-3在UniProtKB数据库中的登录号为No.Q8TDQ0，其胞外区可包含No.Q8TDQ0所示第22至199为氨基酸序列。
在本申请中，术语“CD47”通常指是在人体中由CD47基因编码的跨膜蛋白，也称为整联素关联蛋白(IAP)。其分子量可以在47-55kDa之间。CD47由五个跨膜区和一个细胞外N端的IgV结构域组成，胞外区可以包括139个氨基酸。所述CD47可以为人CD47或其片段。例如，人CD47在UniProtKB数据库中的登录号为No.Q08722。
在本申请中，术语“Daudi细胞”通常指一种人Burkkit淋巴瘤细胞。所述Daudi细胞能表达人类主要组织相容性复合物II类分子(MHC II)。
在本申请中，术语“IL2”、“IL-2”和“Interleukin2”可互换地使用，通常指白细胞介素2，也称为T细胞生长因子(Tcellgrowth factor，TCGF)，分子量为15.5-16kDa，是含有113个氨基酸残基的糖蛋白，在人类由第4号染色体上的一个基因编码。IL2是一种能调节包细胞免疫活性的细胞因子，主要由T细胞(特别是CD4+T细胞)受抗原或丝裂原刺激后合成；B细胞、NK细胞及单核-巨噬细胞也能产生IL2。例如，人IL2可包含参见UniProtKB数据库中登录号No.Q0GK43所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“不为LAG-3的其他抗原”通常指与LAG-3不同的任意抗原。如，所述抗原可以是PD-l，PD-L1，Tim-3，和/或，CD47。
在本申请中，术语“肿瘤相关抗原”通常指在肿瘤细胞上表达的抗原分子。所述抗原分子主要在肿瘤细胞上表达，也可以在正常细胞中表达，因而可作用为针对基于抗体的治疗的潜在的免疫治疗目标。例如，可以是PD-1，PD-L1，Tim-3，和/或，CD47。
在本申请中，术语“一个或多个scfv形式的所述LAG-3结合蛋白”通常指由1个、2个、3个或更多的scFv组成的能结合LAG-3的蛋白。所述scFv可包含轻链可变区和重链可变区。例如，所述scFv可为轻链可变区-连接子-重链可变区，其轻链可变区C末端与重链可变区N末端通过连接子相连。又例如，所述scFv可为重链可变区-连接子-轻链可变区，其重链可变区C末端与轻链可变区N末端通过连接子相连。
在本申请中，术语“第一条多肽链”通常指多特异性抗体中包含抗体轻链的多肽链。所述包含抗体轻链的多肽链可包含轻链可变区，轻链恒定区。所述第一条多肽链可包含0个、1个或多个scFv形式的抗原结合蛋白。所述scFv的N端或C端可通过连接子连接在所述抗体轻链的C端或N端。
在本申请中，术语“第二条多肽链”通常指多特异性抗体中包含抗体重链的多肽链。所述包含抗体重链的多肽链可包含重链可变区，重链恒定区。所述第二条多肽链可包含0个、1个或多个scFv形式的抗原结合蛋白。所述scFv的N端或C端可通过连接子连接在所述抗体重链的C端或N端。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常指这样的抗体，其中每个重链或轻链氨基酸序列的一部分与来自特定物种的抗体中相应氨基酸序列同源，或者属于特定的类别，而该链的其余区段则与另一物种中的相应序列同源。例如，轻链和重链的可变区均来自一个动物物种(如小鼠、大鼠等)的抗体的可变区，而恒定部分则与来自另一物种(如人)的抗体序列同源。例如，为获得嵌合抗体，可利用非人源的B细胞或杂交瘤细胞产生可变区，而与其组合的恒定区则来自人。所述可变区具有易于制备的优点，并且其特异性不受与其组合的恒定区的来源的影响。同时，由于嵌合抗体的恒定区可来源于人类，因此嵌合在注射时抗体引发免疫应答的可能性会低于使用恒定区为非人来源的抗体。
在本申请中，术语“核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到细胞(例如，宿主细胞)中和/或细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。在本申请中，所述载体可以为质粒。
在本申请中，术语“细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是HEK293细胞。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指哺乳动物中的机体(例如，细胞或其组成部分)在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的赘生物。在本申请中，肿瘤可以包括结肠癌。
在本申请中，术语“位于……之间”通常是指某种氨基酸片段的C端与第一氨基酸片段的N端直接或间接连接，并且其N端与第二氨基酸片段的C端直接或间接连接。在轻链中，例如，所述L-FR2的N末端与所述LCDR1的C末端直接或间接相连，且所述L-FR2的C末端与所述LCDR2的N末端直接或间接相连。又例如，所述L-FR3的N末端与所述LCDR2的C末端直接或间接相连，且所述L-FR3的C末端与所述LCDR3的N末端直接或间接相连。在重链中，例如，所述H-FR2的N末端与所述HCDR1的C末端直接或间接相连，且所述H-FR2的C末端与所述HCDR2的N末端直接或间接相连。又例如，所述H-FR3的N末端与所述HCDR2的C末端直接或间接相连，且所述H-FR3的C末端与所述HCDR3的N末端直接或间接相连。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
抗体、其抗体结合片段或变体
本申请所述的抗原结合蛋白
一方面，本申请提供一种分离的LAG-3结合蛋白，其包含抗体轻链可变区VL和抗体重链可变区VH，所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3。
在本领域中，可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如1)基于序列可变性的Kabat定义规则(Wu和Kabat，J Exp Med 132：211-50，1970；Kabat等人，SequencesofProteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes ofHealth，Bethesda，Md.，1991)，2)基于结构环区域位置的Chothia定义规则(A1-Lazikani等人，JMol Biol 273：927-48，1997)，3)用Oxfbrd Molecular的AbM抗体模型软件权衡上述两种规则的AbM定义规则，4)基于得到的复合物晶体结构分析的Contact定义规则。这些标记CDR方法可总结如下表1。
表1本领域抗体CDR定义不同方法汇总
CCG定义 Kabat定义 AbM定义 Chothia定义 Contact定义
轻链CDR1 L24-L34 L24-L34 L24-L34 L24-L34 L30-L36
轻链CDR2 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L45-L55
轻链CDR3 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L96
重链CDR1 H26-H35 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
重链CDR2 H50-H65 H50-H65 H50-H58 H52-H56 H47-H58
重链CDR3 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H93-H101
其中，Laa-Lbb可以指从抗体轻链的N端开始，第aa位至第bb位的氨基酸序列；Haa-Hbb可以指从抗体重链的N端开始，第aa位至第bb位的氨基酸序列。例如，L24-L34可以指从抗体轻链N端开始，第24位至第34位的氨基酸序列；H26-H35可以指从抗体重链N端开始，第26位至第35位的氨基酸序列。
本申请所述分离的LAG-3结合蛋白的轻链可变区可包含LCDR1，LCDR2和LCDR3。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含LCDR1，且所述LCDR1可包含SEQ IDNO：25所示的氨基酸序列：RASQDIGSRLN(SEQ ID NO：25)。例如，该序列可以是根据Kabat定义规则确定的序列。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含LCDR2，且所述LCDR2可包含SEQ IDNO：26所示的氨基酸序列：ATSSLDS(SEQ ID NO：26)。例如，该序列可以是根据Kabat定义规则确定的序列。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含LCDR3，且所述LCDR3可包含SEQ IDNO：27所示的氨基酸序列：LQCASSPLT(SEQ ID NO：27)。例如，该序列可以是根据Kabat定义规则确定的序列。
本申请所述的分离的LAG-3结合蛋白还可包含框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含L-FR1，所述的L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述的L-FR1包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASX1GX2RVX3X4TC(SEQ ID NO：66)；其中，X1＝L，V；X2＝E，D；X3＝S，T；X4＝L，I。例如，该序列可以是根据Kabat定义规则确定的序列。
在本申请中，与SEQ ID NO：41所示LAG-3结合蛋白的L-FR1相比，所述L-FR1可至少包含在选自以下的氨基酸取代：在X1、X2、X3和/或X4处的氨基酸取代。
在本申请中，与SEQ ID NO：41所示LAG-3结合蛋白的L-FR1相比，所述L-FR1可至少包含在X1、X2、X3和/或X4处的氨基酸取代，其中X1处的氨基酸可被取代为V；X2处的氨基酸可被取代为D；X3处的氨基酸可被取代为T；X4处的氨基酸可被取代为I。
例如，所述L-FR1可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：41和56。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含L-FR2，所述的L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述的L-FR2包含SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列：
WLQQX1PX2GTX3KRLIY(SEQ ID NO：67)；其中，X1＝E，K；X2＝D，G；X3＝I，P。例如，该序列可以是根据Kabat定义规则确定的序列。
在本申请中，与SEQ ID NO：42所示LAG-3结合蛋白的L-FR2相比，所述L-FR2可至少包含在选自以下的氨基酸取代：在X1、X2和/或X3处的氨基酸取代。
在本申请中，与SEQ ID NO：42所示LAG-3结合蛋白的L-FR2相比，所述L-FR2可至少包含在X1、X2和/或X3处的氨基酸取代，其中X1处的氨基酸可被取代为K；X2处的氨基酸可被取代为G；X3处的氨基酸可被取代为P。
例如，所述L-FR2可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：42、57和58。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含L-FR3，所述的L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述的L-FR3包含SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列：
GVPX1RFSGSX2SGX3DX4X5LTISSLX6X7EDFX8X9YYC(SEQ ID NO：68)；其中，X1＝K，S；X2＝R，G；X3＝S，T；X4＝Y，F；X5＝F，T；X6＝E，Q；X7＝S，P；X8＝V，A；X9＝D，T。例如，该序列可以是根据Kabat定义规则确定的序列。
在本申请中，与SEQ ID NO：43所示LAG-3结合蛋白的L-FR3相比，所述L-FR3可至少包含在选自以下的氨基酸取代：在X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和/或X9处的氨基酸取代。
在本申请中，与SEQ ID NO：43所示LAG-3结合蛋白的L-FR3相比，所述L-FR3可至少包含在X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和/或X9处的氨基酸取代，其中X1处的氨基酸可被取代为S；X2处的氨基酸可被取代为G；X3处的氨基酸可被取代为T；X4处的氨基酸可被取代为F；X5处的氨基酸可被取代为T；X6处的氨基酸可被取代为Q；X7处的氨基酸可被取代为P；X8处的氨基酸可被取代为A；X9处的氨基酸可被取代为T。
例如，所述L-FR3可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：43、59-64。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含L-FR4，所述的L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述的L-FR4包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列：
FGX1GTKLEX2K(SEQ ID NO：69)；其中，X1＝A，Q；X2＝L，I。例如，该序列可以是根据Kabat定义规则确定的序列。
在本申请中，与SEQ ID NO：44所示的抗体的L-FR4相比，所述L-FR4可至少包含在选自以下的氨基酸取代：在X1和/或X2处的氨基酸取代。
在本申请中，与SEQ ID NO：44所示的L-FR4相比，所述L-FR4可至少包含在至少包含在X1和/或X2处的氨基酸取代，其中，X1处的氨基酸可被取代为Q；X2处的氨基酸可被取代为I。
例如，所述L-FR4可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：44和65。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含轻链可变区VL，且所述的VL包含SEQ ID NO：91所示的氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASX1GX2RVX3X4TCRASQDIGSRLNWLQQX5PX6GTX7KRLIYATSSLDSGVPX8RFSGSX9SGX10DX11X12LTISSLX13X14EDFX15X16YYCLQCASSPLTFGX17GTKLEX18K(SEQ ID NO：91)；其中，X1＝L，V；X2＝E，D；3＝S，T；X4＝L，I；X5＝E，K；X6＝D，G；X7＝I，P；X8＝K，S；X9＝R，G；X10＝S，T；X11＝Y，F；X12＝F，T；X13＝E，Q；X14＝S，P；X15＝V，A；X16＝D，T；X17＝A，Q；X18＝L，I。
在本申请中，与SEQ ID NO：7所示的抗体的VL相比，所述VL可至少包含在选自以下的氨基酸取代：在X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17和/或X18处的氨基酸取代。
在本申请中，与SEQ ID NO：7所示的VL相比，所述VL可至少包含在至少包含在X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17和/或X18处的氨基酸取代，其中，X1处的氨基酸可被取代为V；X2处的氨基酸可被取代为D；X3处的氨基酸可被取代为T；X4处的氨基酸可被取代为I；X5处的氨基酸可被取代为K；X6处的氨基酸可被取代为G；X7处的氨基酸可被取代为P；X8处的氨基酸可被取代为S；X9处的氨基酸可被取代为G；X10处的氨基酸可被取代为T；X11处的氨基酸可被取代为F；X12处的氨基酸可被取代为T；X13处的氨基酸可被取代为Q；X14处的氨基酸可被取代为P；X15处的氨基酸可被取代为A；X16处的氨基酸可被取代为T；X17处的氨基酸可被取代为Q；X18处的氨基酸可被取代为I。
例如，所述VL区可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：7、80-86。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含轻链恒定区CL，CL可以是人轻链κ、λ型。例如，所述抗体轻链恒定区可包括人抗体轻链恒定区κ链。在本申请中，所述CL可包含SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含轻链LC。例如，所述LC可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：93-100和104。
本申请所述分离的LAG-3结合蛋白的重链可变区可包含HCDR1，HCDR2和HCDR3。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含HCDR1，且所述HCDR1可包含SEQ IDNO：31所示的氨基酸序列：DYYMN(SEQ ID NO：31)。例如，该序列可以是根据Kabat定义规则确定的序列。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含HCDR2，且所述HCDR2可包含SEQ IDNO：29所示的氨基酸序列：VINPYNGDTSYNQKFKG(SEQ ID NO：29)。例如，该序列可以是根据Kabat定义规则确定的序列。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含HCDR3，且所述HCDR3可包含SEQ IDNO：30所示的氨基酸序列：DDGYYVEYFDY(SEQ ID NO：30)。例如，该序列可以是根据Kabat定义规则确定的序列。
本申请所述的分离的LAG-3结合蛋白还可包含框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含H-FR1，所述的H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述的H-FR1包含SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列：
EVQLX1QSGX2X3X4X5KPGX6SVKX7SCKASGYTFT(SEQ ID NO：70)；其中，X1＝Q，V；X2＝P，A；X3＝V，E；X4＝L，V；X5＝V，K；X6＝A，S；X7＝M，V。例如，该序列可以是根据Kabat定义规则确定的序列。
在本申请中，与SEQ ID NO：45所示LAG-3结合蛋白的H-FR1相比，所述H-FR1可至少包含在选自以下的氨基酸取代：在X1、X2、X3、X4、X5、X6和/或X7处的氨基酸取代。
在本申请中，与SEQ ID NO：45所示LAG-3结合蛋白的H-FR1相比，所述H-FR1可至少包含在X1、X2、X3、X4、X5、X6和/或X7处的氨基酸取代，其中X1处的氨基酸可被取代为V；X2处的氨基酸可被取代为A；X3处的氨基酸可被取代为E；X4处的氨基酸可被取代为V；X5处的氨基酸可被取代为K；X6处的氨基酸可被取代为S；X7处的氨基酸可被取代为V。
例如，所述H-FR1可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：45和49。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含H-FR2，所述的H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述的H-FR2包含SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列：
WVKQX1X2GX3X4LEWXsG(SEQ ID NO：71)；其中，X1＝S，A；X2＝H，P；X3＝K，Q；X4＝S，G；X5＝M，I。例如，该序列可以是根据Kabat定义规则确定的序列。
在本申请中，与SEQ ID NO：46所示LAG-3结合蛋白的H-FR2相比，所述H-FR2可至少包含在选自以下的氨基酸取代：在X1、X2、X3、X4和/或X5处的氨基酸取代。
在本申请中，与SEQ ID NO：46所示LAG-3结合蛋白的H-FR2相比，所述H-FR2可至少包含在X1、X2、X3、X4和/或X5处的氨基酸取代，其中X1处的氨基酸可被取代为A；X2处的氨基酸可被取代为P；X3处的氨基酸可被取代为Q；X4处的氨基酸可被取代为G；X5处的氨基酸可被取代为M。
例如，所述H-FR2可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：46、50和51。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含H-FR3，所述的H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述的H-FR3包含SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列：
KATX1TX2DKSX3STAYMELX4SLX5SEDX6AVYYCAR(SEQ ID NO：72)；其中，X1＝L，I；X2＝V，A；X3＝S，T；X4＝N，S；X5＝T，R；X6＝T，S。例如，该序列可以是根据Kabat定义规则确定的序列。
在本申请中，与SEQ ID NO：47所示LAG-3结合蛋白的H-FR3相比，所述H-FR3可至少包含在选自以下的氨基酸取代：在X1、X2、X3、X4、X5和/或X6处的氨基酸取代。
在本申请中，与SEQ ID NO：47所示LAG-3结合蛋白的H-FR3相比，所述H-FR3可至少包含在X1、X2、X3、X4、X5和/或X6处的氨基酸取代，其中X1处的氨基酸可被取代为I；X2处的氨基酸可被取代为A；X3处的氨基酸可被取代为T；X4处的氨基酸可被取代为S；X5处的氨基酸可被取代为R；X6处的氨基酸可被取代为T。
例如，所述H-FR3可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：47、52-54。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含H-FR4，所述的H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述的H-FR4包含SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列：
WGQGTX1X2TVSS(SEQ ID NO：73)；其中，X1＝L，T；X2＝L，V。例如，该序列可以是根据Kabat定义规则确定的序列。
在本申请中，与SEQ ID NO：48所示的抗体的H-FR4相比，所述H-FR4可至少包含在选自以下的氨基酸取代：在X1和/或X2处的氨基酸取代。
在本申请中，与SEQ ID NO：48所示的H-FR4相比，所述H-FR4可至少包含在X1和/或X2处的氨基酸取代，其中，X1处的氨基酸可被取代为L；X2处的氨基酸可被取代为V。
例如，所述H-FR4可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：48和55。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含轻链可变区VH，且所述的VH可包含SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列：
QLX1QSGX2X3X4X5KPGX6SVKX7SCKASGYTFTDYYMNWVKQX8X9GX10X11LEWX12GVINPYNGDTSYNQKFKGKATX13TX14DKSX15STAYMELX16SLX17SEDX18AVYYCARDDGYYVEYFDYWGQGTX19X20TVSS(SEQID NO：92)；其中，X1＝Q，V；X2＝P，A；X3＝V，E；X4＝L，V；X5＝V，K；X6＝A，S；X7＝M，V；X8＝S，A；X9＝H，P；X10＝K，Q；X11＝S，G；X12＝I，M；X13＝L，I；X14＝V，A；X15＝S，T；X16＝N，S；X17＝T，R；X18＝S，T；X19＝T，L；X20＝L，V。
在本申请中，与SEQ ID NO：8所示的抗体的VH相比，所述VH可至少包含在选自以下的氨基酸取代：在X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19或X20处的氨基酸取代。
在本申请中，与SEQ ID NO：8所示的VH相比，所述VH可至少包含在至少包含在X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19或X20处的氨基酸取代，其中，X1处的氨基酸可被取代为V；X2处的氨基酸可被取代为A；X3处的氨基酸可被取代为E；X4处的氨基酸可被取代为V；X5处的氨基酸可被取代为K；X6处的氨基酸可被取代为S；X7处的氨基酸可被取代为V；X8处的氨基酸可被取代为A；X9处的氨基酸可被取代为P；X10处的氨基酸可被取代为Q；X11处的氨基酸可被取代为G；X12处的氨基酸可被取代为M；X13处的氨基酸可被取代为I；X14处的氨基酸可被取代为A；X15处的氨基酸可被取代为T；X16处的氨基酸可被取代为S；X17处的氨基酸可被取代为R；X18处的氨基酸可被取代为T；X19处的氨基酸可被取代为L；X20处的氨基酸可被取代为V。
例如，所述VH区可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、87-90。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白包含重链恒定区CH，CH可以是人hIgG1，hIgG2，hIgG3或hIgG4。例如，所述抗体重链恒定区可以包括hIgG4。在本申请中，所述CH可包含SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白可包含重链HC。例如，所述HC可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：100-103和105。
在某些情形中，本申请所述分离的LAG-3结合蛋白可包含抗体轻链可变区VL和抗体重链可变区VH，所述VL可包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述VH可包含HCDR1，HCDR2和HCDR3。
在本申请中，所述LCDR1可包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，所述可LCDR3包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，所述HCDR1可包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。
本申请所述分离的LAG-3结合蛋白可包含框架区L-FR1-4及H-FR1-4。
例如，本申请所述分离的LAG-3结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：59-64任一项所示的氨基酸序列，L-FR4可包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列，且H-FR1可包含SEQID NO：49所示的氨基酸序列。H-FR2可包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列。L-FR3可包含SEQ ID NO：52-54任一项所示的氨基酸序列。L-FR4可包含SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述分离的LAG-3结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：59-64任一项所示的氨基酸序列，L-FR4可包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列，且H-FR1可包含SEQID NO：49所示的氨基酸序列，H-FR2可包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列。H-FR3可包含SEQ ID NO：52-54任一项所示的氨基酸序列。H-FR4可包含SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述分离的LAG-3结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列。L-FR2可包含SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列。L-FR3可包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列。L-FRR4可包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列。且H-FR1可包含SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列，H-FR2可包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列。H-FR3可包含SEQ IDNO：52所示的氨基酸序列。H-FR4可包含SEQ ID NO：55。
例如，本申请所述分离的LAG-3结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列。L-FR2可包含SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列。L-FR3可包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列。L-FR4可包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列。且H-FR1可包含SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列，H-FR2可包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列。H-FR3可包含SEQ IDNO：53所示的氨基酸序列。H-FR4可包含SEQ ID NO：55。
例如，本申请所述分离的LAG-3结合蛋白的L-FR1可包含SEQIDNO：41所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列，L-FR4可包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列，且H-FR1可包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列，H-FR2可包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。H-FR3可包含SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列。H-FR4可包含SEQ ID NO：48。
本申请所述分离的LAG-3结合蛋白可包含抗体轻链可变区VL和抗体重链可变区VH。例如，所述VL可包含SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO：88-91所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可包含SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO：88-91任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可包含SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO：88-91任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可包含SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO：87-88任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可包含SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO：87-88任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可包含SEQ ID NO：85所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO：87-88任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可包含SEQ ID NO：86所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO：87-90任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
本申请所述分离的LAG-3结合蛋白可包含抗体轻链恒定区CL和抗体重链恒定区CH。例如，所述CL可包含SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列，所述CH可包含SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白中LCRD1可包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，LCRD2可包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，LCRD3可包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，且L-FR1可包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列，且L-FR4可包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列，H-FR1可包含SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列，且H-FR4可包含SEQID NO：55所示的氨基酸序列。
例如，所述L-FR2可包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ IDNO：59-64任一项所示的氨基酸序列，H-FR2可包含SEQ ID NO：50、51任一项所示的氨基酸序列，H-FR3可包含SEQ ID NO：52-54任一项所示的氨基酸序列。所述的LAG-3结合蛋白中VL可包含SEQ ID N：80-84、86任一项所示的氨基酸序列，VH可包含SEQ ID N：87-90任一项所示的氨基酸序列。所述的LAG-3结合蛋白中LC可包含SEQ ID NO：93-97任一项所示的氨基酸序列，HC可包含SEQ ID NO：101-103任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述L-FR2可包含SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ IDNO：59所示的氨基酸序列，H-FR2可包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，H-FR3可包含SEQID NO：52所示的氨基酸序列。所述的LAG-3结合蛋白中VL可包含SEQ ID N：85所示的氨基酸序列，VH可包含SEQ ID N：87所示的氨基酸序列。所述的LAG-3结合蛋白中LC可包含SEQ IDNO：98所示的氨基酸序列，HC可包含SEQ ID NO：100所示的氨基酸序列。
例如，所述L-FR2可包含SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ IDNO：63所示的氨基酸序列，H-FR2可包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，H-FR3可包含SEQID NO：5所示的氨基酸序列。所述的LAG-3结合蛋白中VL可包含SEQ IDN：85所示的氨基酸序列，VH可包含SEQ ID N：88所示的氨基酸序列。所述的LAG-3结合蛋白中LC可包含SEQ IDNO：98所示的氨基酸序列，HC可包含SEQ ID NO：101所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的LAG-3结合蛋白中LCRD1可包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，LCRD2可包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，LCRD3可包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，且L-FR1可包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列，L-FR4可包含SEQ IDNO：44所示的氨基酸序列，H-FR1可包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列，且H-FR2可包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列，H-FR3可包含SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列，且H-FR2可包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列。所述的LAG-3结合蛋白中VL可包含SEQ ID N：8所示的氨基酸序列，VH可包含SEQ ID N：8所示的氨基酸序列。所述的LAG-3结合蛋白中LC可包含SEQ ID NO：104所示的氨基酸序列，HC可包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列。
在本申请中所述分离的LAG-3结合蛋白可以结合人LAG-3。结合亲和性可通过本领域已知的任何方法测定。在某些情形中，所述结合亲和力可通过表面等离子共振法(SPR)、酶联免疫法(ELISA)、结合抗原沉淀法、平衡透析法、生物膜干涉(BLI)测定。例如，可以使用Biacore(Biacore T200，GE Healthcare)通过表面等离子共振法测定。例如，所述分离的LAG-3结合蛋白能以1x10-9M或更低的KD值(例如，所述KD的值可为1×10-9M、约9×10-10M、约8×10-10M、约7×10-10M、约6×10-10M、约5×10-10M、约4×10-10M、约3×10-10M、约2×10-10M、约1×10-10M或以下)结合人LAG-3蛋白。
例如，本申请所述分离的LAG-3结合蛋白能够结合不同形式的人LAG-3。所述不同形式的人LAG-3可以包括人LAG-3抗原及其片段。例如，所述人LAG-3抗原及其片段可包括NCBI中登录号为NP_002277.4所示的氨基酸序列。所述人LAG-3抗原及其片段还可包括胞外区域的第一区域和第二区域(Domain1和Domian2，即D12)，NCBI中登录号为NP_002277.4中第23至第239位的氨基酸序列。所述不同形式的人LAG-3可包括人LAG-3抗原单体和人LAG-3-hFc二聚体形式。例如，所述分离的LAG-3结合蛋白以不超过0.3nM的EC50值结合不同形式的人LAG-3蛋白(例如，所述EC50值不超过0.2nM、不超过0.1nM或更低)，如通过ELISA测定所测量的。
本申请所述分离的LAG-3结合蛋白能结合食蟹猴LAG-3蛋白。例如，可以以20nM或更高的EC50值(30nM或更高、40nM或更高、50nM或更高)的EC50值结合食蟹猴LAG-3蛋白，例如，在ELISA测定中所测量的。本申请所述的LAG-3结合蛋白基本上不结合小鼠LAG-3蛋白。
多特异性抗原结合蛋白
另一方面，本申请提供了一种多特异性抗原结合蛋白，其包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分结合LAG-3且包含本申请所述的LAG-3结合蛋白，所述第二抗原结合部分结合不为LAG-3的其他抗原。
在本申请中，所述的多特异性抗原结合蛋白的所述第一抗原结合部分可包含一个或多个scfv形式的所述LAG-3结合蛋白。所述一个或多个scfv形式的所述LAG-3结合蛋白可包含轻链可变区和重链可变区。本申请中，所述scFv可以为轻链可变区-连接子-重链可变区，其轻链可变区的C端与连接子相连，连接子与其重链可变区的N端相连。所述scFv可以为重链可变区-连接子-轻链可变区，其重链可变区的C端与连接子相连，连接子与其轻链可变区的N端相连。
在本申请中，所述的多特异性抗原结合蛋白的所述第二抗原结合部分可包含针对其他抗原的抗体轻链或其片段；以及针对所述其他抗原的抗体重链或其片段。所述针对其他抗原结合蛋白可以为针对PD-1、PD-L1、CD47、Tim-3的抗原结合蛋白。
本申请所述的多特异性抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合部分的每个所述scfv形式的LAG-3结合蛋白各自独立地与针对所述其他抗原的所述抗体轻链或其片段或者与针对所述其他抗原的所述抗体重链或其片段直接或间接连接。本申请所述间接连接包括通过多肽连接子连接。
在本申请中，所述的多特异性抗原结合蛋白的所述第一抗原结合部分可包含所述LAG-3结合蛋白的抗体轻链或其片段；以及所述LAG-3结合蛋白的抗体重链或其片段。
在本申请中，所述的多特异性抗原结合蛋白的所述第二抗原结合部分可包含一个或多个scfv形式的针对其他抗原结合蛋白。所述针对其他抗原结合蛋白可以为针对PD-1、PD-L1、CD47、Tim-3的抗原结合蛋白。所述一个或多个scfv形式的针对其他抗原结合蛋白可包含轻链可变区和重链可变区。本申请中，所述scFv可以为轻链可变区-连接子-重链可变区，其轻链可变区的C端与连接子相连，连接子与其重链可变区的N端相连。所述scFv可以为重链可变区-连接子-轻链可变区，其重链可变区的C端与连接子相连，连接子与其轻链可变区的N端相连。
本申请所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分包括一个或多个scfv形式的针对其他抗原结合蛋白，且每个所述scfv形式的针对其他抗原结合蛋白各自独立地与所述LAG-3结合蛋白的所述抗体轻链或其片段或者与针对所述其他抗原的所述抗体重链或其片段直接或间接连接。本申请所述间接连接包括通过多肽连接子连接。
本申请所述连接子可以为(G4S)m。例如，所述的m可以为0～10之间的整数。又例如，所述连接子可以为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3。
本申请所述的多特异性抗原结合蛋白包含第一多肽链及第二多肽链。
所述多特异性抗原结合蛋白的所述第一条多肽链可以包含抗体轻链和scFv。
所述第一条多肽链的所述抗体轻链可包含轻链可变区和轻链恒定区。所述第一条多肽链的所述轻链可变区可以为所述针对其他抗原结合蛋白或所述LAG-3结合蛋白的抗体轻链可变区。所述第一条多肽链的所述轻链恒定区可以为人IgG的κ型轻链恒定区或者人IgG的λ型轻链恒定区。
所述第一条多肽链的所述scFv可以为scFv形式的所述LAG-3结合蛋白或scFv形式的所述针对其他抗原结合蛋白。所述scFv的数量可以为0个或多个。例如，所述scFv的数量可以为0个、1个、2个。
本申请所述第一条多肽链的所述scFv可以与所述第一条多肽链的所述抗体轻链直接或间接连接。本申请所述间接连接包括通过多肽连接子连接。本申请所述第一条多肽链的所述scFv的N端或C端可通过连接子相应地连接在所述抗体轻链的C端或N端。
所述多特异性抗原结合蛋白的所述第二条多肽链可以包含抗体重链和scFv。
所述第二条多肽链的所述抗体重链可包含重链可变区和重链恒定区。所述第二条多肽链的所述重链可变区可以为所述针对其他抗原结合蛋白或所述LAG-3结合蛋白的抗体重链可变区。所述第二条多肽链的所述重链恒定区可以为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等的恒定区。例如。所述重链恒定区可以为人IgG重链恒定区。
所述第二条多肽链的所述scFv可以为scFv形式的所述LAG-3结合蛋白或scFv形式的所述针对其他抗原结合蛋白。所述scFv的数量可以为0个或多个。例如，所述scFv的数量可以为0个、1个、2个。
本申请所述第二条多肽链的所述scFv可以与所述第二条多肽链的所述抗体重链直接或间接连接。本申请所述间接连接包括通过多肽连接子连接。本申请所述第二条多肽链的所述scFv的N端或C端可通过连接子相应地连接在所述抗体重链的C端或N端。所述连接子连接在所述抗体重链恒定区的C端的时候，其最末端氨基酸K可以突变。例如，所述最末端氨基酸K可以突变为A。
本申请所述的多特异性抗原结合蛋白，其包含2条相同的所述第一多肽链，以及2条相同的所述第二多肽链。
例如，所述多特异性抗原结合蛋白的所述第一条多肽链可以包含抗体轻链和0个scFv。所述多特异性抗原结合蛋白的所述第二条多肽链可以包含抗体重链和1个scFv。所述scFv可以为轻链可变区-连接子-重链可变区。所述scFv重链可变区的C端可通过连接子与所述抗体重链的N端相连。所述多特异性抗原结合蛋白可具备图1A所示结构。所述scFv可以为重链可变区-连接子-轻链可变区。所述scFv重链可变区的N端可通过连接子与所述抗体重链的C端相连。所述多特异性抗原结合蛋白可具备图1B所示结构。
例如，所述多特异性抗原结合蛋白的所述第一条多肽链可以包含抗体轻链和1个scFv。所述多特异性抗原结合蛋白的所述第二条多肽链可以包含抗体重链和0个scFv。所述scFv可以为轻链可变区-连接子-重链可变区。所述scFv重链可变区的C端可通过连接子与所述抗体轻链的N端相连。所述多特异性抗原结合蛋白可具备图1C所示结构。所述scFv可以为重链可变区-连接子-轻链可变区。所述scFv重链可变区的N端可通过连接子与所述抗体轻链的C端相连。所述多特异性抗原结合蛋白可具备图1D所示结构。
例如，所述多特异性抗原结合蛋白的所述第一条多肽链可以包含抗体轻链和0个scFv。所述多特异性抗原结合蛋白的所述第二条多肽链可以包含抗体重链和2个scFv。所述第一个scFv可以为轻链可变区-连接子-重链可变区。所述第一个scFv重链可变区的C端可通过连接子与所述抗体重链的N端相连。所述第二个scFv可以为重链可变区-连接子-轻链可变区。所述第二个scFv重链可变区的N端可通过连接子与所述抗体重链的C端相连。所述多特异性抗原结合蛋白可具备图1E所示结构。
例如，所述多特异性抗原结合蛋白的所述第一条多肽链可以包含抗体轻链和1个scFv。所述scFv可以为重链可变区-连接子-轻链可变区。所述scFv重链可变区的N端可通过连接子与所述抗体轻链的C端相连。所述多特异性抗原结合蛋白的所述第二条多肽链可以包含抗体重链和1个scFv。所述scFv可以为重链可变区-连接子-轻链可变区。所述scFv重链可变区的N端可通过连接子与所述抗体重链的C端相连。所述多特异性抗原结合蛋白可具备图1F所示结构。所述scFv可以为轻链可变区-连接子-重链可变区。所述scFv重链可变区的C端可通过连接子与所述抗体重链的N端相连。所述多特异性抗原结合蛋白可具备图1G所示结构。
在本申请中，所述多特异性抗原结合蛋白中能够与除LAG-3以外的靶点结合的序列，均可以采用现有技术。已成药的PD-1抗体Nivolumab/Opidivo(简称Nivo)，Pembrolizumab/Keytruda(简称Pem)和PD-L1抗体Atezolumab(简称Atezo)、Avelumab(简称Avel)、Durvalumab(简称Dura)的相关序列可从www.drugbank.ca查到。PD-1抗体Ba08-1轻重链序列可参见专利申请WO2016015685A1。Tim-3抗体Ab6的轻、重链可参见专利申请CN108948193A。CD47抗体Hu5F9轻重链序列可参见专利申请US9382320B2。CD47抗体iMab轻重链序列可参见专利申请WO2018075857A1。PD-1抗体JS001(简称JS1)可参见专利申请WO2014206107A1。
在本申请中涉及的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列，还应理解为至少包含以下的范围：与该所述蛋白质或多肽具备相同或类似功能的变体或同源物。
在本申请中，所述变体可以为，在所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合LAG-3蛋白的抗体或其片段)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。例如，所述取代可以为保守取代。
在本申请中，所述同源物可以为，与所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合LAG-3蛋白的抗体或其片段)的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中，所述同源性通常指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”：将两条待比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”，分子生物学杂志，215：403-410，1990。
核酸、载体、宿主细胞和制备方法
在另一个方面，本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子，所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述的抗体、其抗原结合片段。例如，所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述抗体、其抗原结合片段，也可以编码其中的一部分(例如，HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、轻链或重链中的一种或多种)。
本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。例如，所述分离的核酸可以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生。
在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述抗体、其抗原结合片段的核酸，这些方法包括但不限于，采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸PCR，具体操作可参见Sambrook等人，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；和Ausube等人Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York N.Y.，1993。
在另一个方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。所述表达控制序列还可包括增强子序列或上游活化子序列。在某些实施方式中，适当的启动子可包括，例如用于SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6RNA启动子、CMV启动子及其人工杂合启动子(如CMV)，其中启动子的某部分可与其他细胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子的某部分融合，其可包含或不包含另外的内含子。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。
所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。
在另一方面，本申请提供了宿主细胞，所述宿主细胞可包含本申请所述的一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如原核细胞(例如，细菌细胞)、CHO细胞、NS/0细胞、HEK293细胞，或者其他真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。例如，所述宿主细胞可以为HEK293T细胞或HEK293F细胞。
在另一个方面，本申请提供了制备本申请所述的抗体、其抗原结合片段的方法。所述方法可包括，在使得所述抗体、其抗原结合片段表达的条件下，培养本申请所述的宿主细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
在某些情形中，所述方法还可包括收获(例如分离和/或纯化)，本申请所述的抗体、其抗原结合片段的步骤。例如，可以采用蛋白G-琼脂糖、蛋白A-琼脂糖或金属螯合进行亲和层析，还可通过凝胶电泳和/或高效液相色谱等来纯化和分离本申请所述的抗体、其抗原结合片段。
药物组合物、应用
在另一个方面，本申请提供了一种药物组合物，其可包含本申请所述的抗体、其抗体结合片段或变体，所述的核酸分子，所述的载体，所述的宿主细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
在本申请中，所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药，肌肉内给药，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。
所述药物组合物可以用于抑制肿瘤生长。例如，本申请的药物组合物可以抑制或延缓疾病的发展或进展，可以减小肿瘤大小(甚至基本消除肿瘤)，和/或可以减轻和/或稳定疾病状态。
本申请所述的药物组合物可以包含预防和/或治疗有效量的所述抗体、其抗原结合片段。所述预防和/或治疗有效量是能够预防和/或治疗(至少部分治疗)患有或具有发展风险的受试者中的疾病或病症和/或其任何并发症而所需的剂量。在本申请中，所述药物组合物可以包含针对两种不同抗原的抗体、其抗原结合片段。
另一方面，本申请提供了所述抗体、其抗原结合片段在制备预防或治疗疾病或病症的药物中的用途。
另一方面，本申请提供的所述抗体、其抗原结合片段，可用于预防或治疗疾病或病症。
另一方面，本申请提供了用于预防或治疗肿瘤的所述的抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本申请提供了预防或治疗肿瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用本申请所述的分离的LAG-3结合蛋白。在本申请中，所述肿瘤可包括结肠癌。
本申请还可包括以下的实施方式：
1.分离的LAG-3结合蛋白，其包含抗体轻链可变区VL和抗体重链可变区VH，所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中所述LCDR1包含SEQ IDNO：25所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，所述HCDR1包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。
2.根据实施方式1所述的分离的LAG-3结合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：
1)能够以1x10-9M或更低的KD值结合人LAG-3蛋白，其中所述KD值通过Biacore方法测定；
2)以20nM或更高的EC50值结合食蟹猴LAG-3蛋白；
3)基本上不结合小鼠LAG-3蛋白；
4)能够阻断LAG-3蛋白与Daudi细胞的结合；
5)能够刺激免疫细胞分泌IL2，所述IL2的分泌在ELISA测定中测得；
6)能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。
3.根据实施方式1-2中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其包括抗体或其抗原结合片段。
4.根据实施方式3所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
5.根据实施方式3-4中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述VL包括框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。
6.根据实施方式5所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列。
7.根据实施方式5-6中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述L-FR1包含SEQ ID NO：41、56中任一项所示的氨基酸序列。
8.根据实施方式5-7中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列。
9.根据实施方式5-8中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述L-FR2包含SEQ ID NO：42、57、58中任一项所示的氨基酸序列。
10.根据实施方式5-9中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列。
11.根据实施方式5-10中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述L-FR3包含SEQ ID NO：43、59-64中任一项所示的氨基酸序列。
12.根据实施方式5-11中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列。
13.根据实施方式5-12中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述L-FR4包含SEQ ID NO：44、65中任一项所示的氨基酸序列。
14.根据实施方式1-13中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述VL包含SEQ ID NO：91所示的氨基酸序列。
15.根据实施方式1-14中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述VL包含SEQ ID NO：7、80-86中任一项所示的氨基酸序列。
16.根据实施方式1-15中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述VH包括框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。
17.根据实施方式16所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列。
18.根据实施方式16-17中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述H-FR1包含SEQ ID NO：45、49中任一项所示的氨基酸序列。
19.根据实施方式16-18中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列。
20.根据实施方式16-19中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述H-FR2包含SEQ ID NO：46、50、51中任一项所示的氨基酸序列。
21.根据实施方式16-20中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列。
22.根据实施方式16-21中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述H-FR3包含SEQ ID NO：47、52-54中任一项所示的氨基酸序列。
23.根据实施方式16-22中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列。
24.根据实施方式16-23中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述H-FR4包含SEQ ID NO：48、55中任一项所示的氨基酸序列。
25.根据实施方式1-24中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述VH包含SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列。
26.根据实施方式1-25中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述VH包含SEQ ID NO：8、87-90中任一项所示的氨基酸序列。
27.分离的一种或多种核酸分子，其编码实施方式1-26中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白。
28.载体，其包含根据实施方式27所述的核酸分子。
29.细胞，其包含根据实施方式27所述的核酸分子或根据实施方式28所述的载体。
30.制备实施方式1-26中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白的方法，所述方法包括在使得实施方式1-26中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白表达的条件下，培养根据实施方式29所述的细胞。
31.药物组合物，其包含实施方式1-26中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白、实施方式27所述的核酸分子、实施方式28所述的载体和/或实施方式29所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
32.实施方式1-26中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白、实施方式27所述的核酸分子、实施方式28所述的载体、实施方式29所述的细胞和/或实施方式31所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
33.预防、缓解或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用实施方式1-26中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白。
34.多特异性抗原结合蛋白，其包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分结合LAG-3且包含实施方式1-26中任一项所述的LAG-3结合蛋白，所述第二抗原结合部分结合不为LAG-3的其他抗原。
35.根据实施方式34所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述不为LAG-3的其他抗原为肿瘤相关抗原。
36.根据实施方式35所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述肿瘤相关抗原包括PD-1，PD-L1，TIM3和/或CD47。
37.根据实施方式34-36中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分包括一个或多个scfv形式的所述LAG-3结合蛋白。
38.根据实施方式34-37中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合部分包含：针对所述其他抗原的抗体轻链或其片段；以及针对所述其他抗原的抗体重链或其片段。
39.根据实施方式37所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分包括一个或多个scfv形式的所述LAG-3结合蛋白，且每个所述scfv形式的LAG-3结合蛋白各自独立地与针对所述其他抗原的所述抗体轻链或其片段或者与针对所述其他抗原的所述抗体重链或其片段直接或间接连接。
40.根据实施方式39所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述间接连接包括通过多肽连接子连接。
41.根据实施方式34-40中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中至少一个所述scfv形式的LAG-3结合蛋白与针对所述其他抗原的所述抗体轻链或其片段直接或间接连接，且位于针对所述其他抗原的所述抗体轻链或其片段的N端。
42.根据实施方式34-41中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中至少一个所述scfv形式的LAG-3结合蛋白与针对所述其他抗原的所述抗体轻链或其片段直接或间接连接，且位于针对所述其他抗原的所述抗体轻链或其片段的C端。
43.根据实施方式34-42中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中至少一个所述scfv形式的LAG-3结合蛋白与针对所述其他抗原的所述抗体重链或其片段直接或间接连接，且位于针对所述其他抗原的所述抗体重链或其片段的N端。
44.根据实施方式34-43中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中至少一个所述scfv形式的LAG-3结合蛋白与针对所述其他抗原的所述抗体重链或其片段直接或间接连接，且位于针对所述其他抗原的所述抗体重链或其片段的C端。
45.根据实施方式34-44中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中至少一个所述scfv形式的LAG-3结合蛋白与针对所述其他抗原的所述抗体轻链或其片段直接或间接连接，且至少一个所述scfv形式的LAG-3结合蛋白与针对所述其他抗原的所述抗体重链或其片段直接或间接连接。
46.根据实施方式34-45中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其包含第一多肽链及第二多肽链，其中所述第一多肽链包含下述任一项所述的氨基酸序列：SEQ ID NO：106、109、111、112、115和117；且所述第二多肽链包含下述任一项所述的氨基酸序列：SEQID NO：107、108、110、113、114和116。
47.根据实施方式46所述的多特异性抗原结合蛋白，其包含2条相同的所述第一多肽链，以及2条相同的所述第二多肽链。
48.根据实施方式34-36中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合部分包括一个或多个scfv形式的所述其他抗原结合蛋白，且所述一个或多个scfv形式的其他抗原结合蛋白结合不为LAG-3的所述其他抗原。
49.根据实施方式48所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分包含实施方式1-26中任一项所述的LAG-3结合蛋白，所述LAG-3结合蛋白包含针对LAG-3的抗体轻链或其片段，以及针对LAG-3的抗体重链或其片段。
50.根据实施方式49所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合部分包括一个或多个scfv形式的所述其他抗原结合蛋白，且每个所述scfv形式的其他抗原结合蛋白各自独立地与所述针对LAG-3的抗体轻链或其片段或者与所述针对LAG-3的抗体重链或其片段直接或间接连接。
51.根据实施方式50所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述间接连接包括通过多肽连接子连接。
52.根据实施方式48-51中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中至少一个所述scfv形式的其他抗原结合蛋白与所述针对LAG-3的抗体重链或其片段直接或间接连接。
53.根据实施方式52所述的多特异性抗原结合蛋白，其中至少一个所述scfv形式的其他抗原结合蛋白位于所述针对LAG-3的抗体重链或其片段的N端。
54.根据实施方式48-53中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其包含第一多肽链及第二多肽链，其中所述第一多肽链包含下述任一项所述的氨基酸序列：SEQ ID NO：94；且所述第二多肽链包含下述任一项所述的氨基酸序列：SEQ ID NO：118。
55.根据实施方式54所述的多特异性抗原结合蛋白，其包含2条相同的所述第一多肽链，以及2条相同的所述第二多肽链。
56.分离的一种或多种核酸分子，其编码实施方式34-55中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白。
57.载体，其包含根据实施方式56所述的核酸分子。
58.细胞，其包含根据实施方式56所述的核酸分子或根据实施方式57所述的载体。
59.制备实施方式34-55中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得实施方式34-55中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白表达的条件下，培养根据实施方式58所述的细胞。
60.药物组合物，其包含实施方式34-55中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白、实施方式56所述的核酸分子、实施方式57所述的载体和/或实施方式58所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
61.实施方式34-55中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白、实施方式56所述的核酸分子、实施方式57所述的载体、实施方式58所述的细胞和/或实施方式60所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
62.预防、缓解或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用实施方式34-55中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1鼠源LAG-3抗体的获得
1.1免疫小鼠
实验用4周龄的雌性SJL小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司(动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0011)。购进所述小鼠后，在实验室环境中饲养1周，进行白天光/夜晚暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。小鼠分成3只/组/笼。
用人LAG-3重组蛋白(由本申请表达纯化，人LAG-3基因的碱基序列来自NCBI登录号为NP_002277.4所示的碱基序列)进行免疫。佐剂为TiterMax(Sigma-Aldrich，T2684)。抗原与佐剂比例为1∶1。以100μl/25μg/只的剂量进行首次免疫，以100μl/12.5μg/只的剂量进行第二次、第三次免疫，小腿肌肉注射。融合前3天，以100μl/25μg/只的剂量加强免疫。免疫时间为第0、14、28、42、56天和59天(加强免疫)。于第22，36，50，64天，用ELISA法检测小鼠血清抗体滴度，选择血清中抗体滴度高并且滴度处于平台期的小鼠进行脾细胞融合，将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(
Figure BDA0002042438980000321
CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞铺96孔板，得到初始克隆。
在另一个实验中，采用QuickAntibody-mouse5W(北京博奥龙免疫技术有限公司，货号：KX0210041)作为佐剂。抗原与佐剂体积比例为1∶1。以100μl/10μg/只的剂量进行首次免疫，以100μl/10μg/只的剂量进行第二次、第三次免疫，小腿肌肉注射。融合前3天，以100μl/20鹏/只的剂量加强免疫。免疫时间为第0、14、28(加强免疫)。于第21、35天，用ELISA法检测小鼠血清抗体滴度，选择血清中抗体滴度高并且滴度不再大幅度上升的小鼠进行脾细胞融合，将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(
Figure BDA0002042438980000322
CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞铺96孔板，得到初始克隆。
1.2抗LAG-3抗体与人hLAG-3的结合活性实验
用pH7.4的PBS缓冲液将人LAG-3抗原稀释至1μg/ml，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，CLS3590-100EA)中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液230μl/孔，37℃孵育3小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4，含0.05％tweeen-20)洗板5次后，加入50μl上述初始克隆分泌的抗体，10μg/ml起始，5倍稀释。阳性对照抗体Ref(即BMS-986016，轻链序列来自WO2014008218A1中SEQ ID NO：12，重链序列来自WO2014008218A1中SEQ ID NO：14)。37℃孵育1小时，PBST洗板5次，加入50μl/孔1：2500稀释的抗小鼠或人HRP二抗(JacksonImmunoResearch，Cat#115-035-003or109-035-003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，52-00-03)，室温孵育10-15min，加入50μl/孔1MH2SO4终止反应，用MULTISKAN Go酶标仪(ThermoFisher，51119200)在450nm处读取吸收值，计算EC50值
1.3抗LAG-3抗体阻止LAG-3和Daudi细胞结合活性实验
将Daudi细胞株(ATCC，CCL-213)扩培后，按2x105/孔铺96孔板，1600rpm离心10min后，用免疫染色固定液(上海碧云天生物技术有限公司Cat#P0098)100μl/孔室温固定半小时。PBS(源培生物，Cat#B320)洗一遍后230μl 5％牛奶37℃封闭2小时，PBST洗3遍。每孔加入25μl，100μg/ml，3倍梯度稀释的初始克隆分泌的待测抗体和25μl 2.5μg/ml的bio-LAG-3-mFc(北京义翘生物科技有限公司，16498-H05H)。37℃孵育1小时，后PBST洗5遍。加入50μl/孔1∶1000稀释的链亲和素-HRP二抗(genscript，M00091)，37℃孵育1小时后PBST洗5遍，每孔加入50μl TMB(Surmodic Cat#TTMB-1000-01)显色，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应。酶标仪(Mμltiskan GO Thermo型号51119200)读数，Graphpad prism5进行数据分析。
选择初始克隆号为2F9、5E、16F1、16F6的杂交瘤细胞株进行克隆，进一步有限稀释得到单克隆抗体细胞株，用上述ELISA法检测所分泌抗体与人hLAG-3的结合活性和阻止hLAG-3和Daudi细胞结合的活性。结果见表2和表3。
表2杂交瘤融合(TiterMax佐剂组)筛选单克隆细胞活性
Figure BDA0002042438980000331
表3杂交瘤融合(Quick Antibody-mouse5W佐剂组)筛选单克隆细胞活性
Figure BDA0002042438980000332
Figure BDA0002042438980000341
-：表示未进行该部分实验。
表2，表3中为杂交瘤细胞和单克隆抗体分泌的抗LAG-3抗体与人hLAG-3结合的EC50值，以及阻止hLAG-3和Daudi细胞结合的EC50值。
1.4鉴定和分析鼠源抗体mab7和mab84
分别从2F9，16F6中筛选得到单克隆细胞株2F9A3C7C3，16F6B9B2D6，扩增培养后，取1×106个细胞，用Trizol(Invitrogen，15596-018)提取RNA(按照试剂盒说明书步骤)，将提取的RNA反转录成cDNA，反转录试剂盒购自生工生物技术(上海)股份有限公司，Cat#B532435。以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增。扩增产物测序，分别得到鼠源单克隆抗体mab7(来自2F9A3C7C3)，鼠源单克隆抗体mab84(来自16F6B9B2D6)的轻、重链可变区碱基/编码序列。所用引物参阅Novagen发表的手册TB326Rev.C0308。
mab7轻链可变区包含SEQ ID NO：1所示的碱基序列，mab7重链可变区包含SEQ IDNO：2所示的碱基序列。该碱基序列编码得到的mab7抗体轻链可变区包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，mab7重链可变区包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
mab84轻链可变区包含SEQ ID NO：3所示的碱基序列，mab84重链可变区包含SEQID NO：4所示的碱基序列。该碱基序列编码得到的mab84轻链可变区包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，mab84重链可变区包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
实施例2鼠源LAG-3抗体的人源化
2.1得到嵌合抗体
将实施例1得到的鼠源抗体轻链可变区与人轻链κ型重组，鼠源抗体重链可变区与人重链恒定区hIgG4重组，得到完整的人鼠嵌合抗体。将抗体轻、重链序列克隆到pTT5载体(Biovector，Cat#：102762)上，得到重组质粒。
HEK293F细胞(LifeTechnologies Cat.No.11625019)在Gibco FreeStyle293Expression Medium(Gibco，Cat#12338018)培养基扩培。瞬时转染开始之前，调节细胞浓度至6～8×105个细胞/ml，1％FBS(AusGeneX，Cat#FBSSA500-S)，37℃8％CO2摇床培养24h，再次镜检存活率＞95％，细胞浓度在1.2×106个细胞/ml。
准备300ml培养体系细胞，15ml Opti-MEM(Gibco，Cat#31985070)溶入重链、轻链质粒各300μg(如果不是重组蛋白，单个质粒用量为150μg)，0.22μm过滤除菌。再取15mlOpti-MEM溶入1mg/ml PEI(Polysciences，Inc，Cat#23966-2)600μl，静置5min。把PEI缓慢加入质粒中，室温孵育10min，边摇晃培养瓶边缓慢滴入质粒PEI混合溶液，37℃8％CO2摇床培养5天收样，3300G 10min取上清。将上清高速离心去除杂质，用PBS(pH7.4)平衡含有Protein A(Mabselect，GE Healthcare Life Science，Cat#71-5020-91 AE)的重力柱(生工生物，Cat#F506606-0001)，2-5倍柱体积冲洗。将样品过柱。用5-10倍柱体积的PBS(生工生物，Cat#B548117-0500)冲洗柱子。再用pH3.5的0.1M乙酸洗脱目的蛋白，后用pH8.0的Tris-HCl调节至中性，酶标仪测定浓度，分装、存储备用。得到嵌合抗体mab7c，mab84c。使用实施例1的ELISA法测定mab7c，mab84c与hLAG-3的结合活性，Ref为对照抗体，结果如图2所示。与对照(EC50＝3.3nM)相比，mab7c(EC50＝0.15nM)和mab84c(EC50＝0.28nM)与hLAG-3的结合活性更强。
2.2刺激细胞因子的释放
收集人PBMC(由健康志愿者捐献外周血液中分离)，用含10％FBS的RPMI1640培养基重悬细胞并计数，调整细胞密度为1x106个细胞/ml，加入96孔板，85μl/孔，放入培养箱。用培养基配制超抗原(SEB，购自北京康博贝宁科技有限公司)，使初始浓度为2μg/ml，每孔加入5μl(使终浓度为100ng/ml)。用培养基按比例配制待测抗体，对照抗体为Ref(由实施例2的方法表达纯化，轻、重链重组质粒用量分别为150μg)。每孔加入10μl，使待测抗体在100μl体系中的浓度为需要的浓度梯度。细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱孵育3天后，取出细胞培养板，3000rpm离心10min，每孔取出80μl上清进行人IL-2的检测。IL-2ELISA检测，按照试剂盒(深圳欣博盛生物科技有限公司；cat：EHC003.96)说明书进行操作，步骤如下：将取出的细胞培养上清以25倍(不同次实验稀释倍数有不同)稀释后加入酶标板中(100μl/孔)；标准品用标本通用稀释液稀释成不同浓度梯度：1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml，每孔加100μl；空白孔加标本通用稀释液。封板胶纸封住反应孔，37℃，孵育90分钟。洗板5次，每次3分钟，每孔加入100μl生物素抗体工作液，空白孔加生物素化抗体稀释液，新封板胶纸封住反应孔，37℃，孵育60分钟。洗板5次，每次3分钟，每孔加入100μl酶结合工作液，空白孔加酶结合稀释液，新封板胶纸封住反应孔，37℃，避光孵育30分钟。洗板5次，每次3分钟，每孔加入100μl显色底物TMB，37℃，避光孵育15分钟。加入终止液，100μl/孔，混匀后，3分钟内，酶标仪读OD450。结果分析：计算IL-2值，并和空白对照相比，换算成增加百分比(％)来评估样品激活人T细胞活性。
结果如图3所示，嵌合抗体mab7c、mab84c能激活人T细胞活性，释放IL-2因子；且呈现比较好的剂量依赖，EC50分别为0.20nM和0.29nM。而同等条件下，与对照抗体相比，mab7c、mab84c显示了更好的剂量依赖性。
2.3对抗体mab7和mab84进行人源化
本申请对实施例1得到的鼠源mab7，mab84抗体进行了人源化设计和筛选，以及序列优化。具体过程描述如下。
对mab7，mab84的CDR序列进行同源性比较分析，从人抗体种系中选择IGKV2-28*01(F)、hJK4.1用于mab7轻链人源化，选择IGHV1-18*01(F)、hJh4.1用于mab7重链人源化，从人抗体种系中选择IGKV1-39*01(F)、hJK2.1用于mab84轻链人源化，选择IGHV1-69*02(F)、hJh4.1用于mab84重链人源化.
将mab7、mab84的CDR区移植到所选择的人源化轻、重链人抗体种系模板上，再与hIgG4重链，κ型轻链恒定区重组。然后，以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，回复突变位点数目可以是10个或更多，选择0-10个。得到人源化抗体mab835，采用实施例1所述ELISA法测定人源化抗体与人LAG-3的结合活性。
同样的，将mab84进行回复突变，得到人源化抗体ab8422-ab8443，评估其与人LAG-3的结合活性。结果如下。
表4人源化抗体序列及结合活性评价
Figure BDA0002042438980000361
Figure BDA0002042438980000371
上述结果表明，由mab7序列得到的人源化抗体Ab835保留了和hLAG-3的结合活性，且和mab7c没有差别；由本申请鼠源抗体mab84序列得到的人源化抗体保留了和hLAG-3的结合活性，很多分子恢复到了和鼠源抗体mab84c同样甚至更好的结合活性，其中Ab8422，Ab8423，Ab8424，Ab8428，Ab8429，Ab8430，Ab8434，Ab8435，Ab8436，Ab8437，Ab8438，Ab8439，Ab8440，Ab8441，Ab8442和ab8443等抗体的结合活性均和mab84c接近或者更好。即本申请的人源化抗体具有与亲本抗体mab7c、mab84c相仿的对人LAG3的结合活性。
实施例3人源化抗体的结合活性评价
3.1本申请的抗体能够结合不同形式的人LAG-3
不同形式的人LAG-3：hLAG-3-his(北京白普赛斯生物科技有限公司，LA3-H5222；或北京义翘神州科技有限公司，16498-H08H)和hLAG-3-hFc(北京义翘神州科技有限公司，16498-H05H)购买得到。hLAG-3-D12-his、hLAG-3-D12-hFc采用实施例2的方法表达纯化，hLAG-3-D12序列来自NCBI Reference Sequence：NP_002277.4所示第23-239位氨基酸序列。
采用实施例1中的ELISA法测定实施例2得到的人源化抗体与不同形式的人LAG-3结合的EC50值，Ab835作为阴性对照。
结果如下表5所示，人源化抗体能够与不同形式的hLAG-3结合，且与hLAG-3结合的EC50值均低于1nM。
表5本申请抗体和不同形式LAG-3的结合活性综合评价
Figure BDA0002042438980000381
3.2本申请的抗体具备种属特异性
本实施例所用食蟹猴LAG-3(cyno-LAG-3-hFc，购自北京百普赛斯生物科技有限公司，LA3-C5252)。鼠LAG-3-his(mLAG-3-his)采用实施例2的方式表达，其序列来自GeneBank登录号为EDK99777.1所示第23-406位氨基酸序列。
his标记：将表达的mLAG-3-his高速离心去除杂质，用含有10mM咪唑，0.5M NaCl的PBS溶液(pH7.4)平衡镍柱(Ni smart beads 6FF常州天地人和生物科技有限公司Cat#SA036010)，2-5倍柱体积冲洗。将样品上清过柱。使用含有10mM咪唑，0.5MNaCl的PBS溶液(pH7.4)冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。用含有250mM咪唑，0.5MNaCl的PBS(pH7.4)洗脱目的蛋白。将洗脱的目的蛋白过超滤管(Merck Millipore Cat#UFC500308)12000g 10min离心，再补加1ml PBS，得到纯化的mLAG-3-his蛋白。
LAG-3抗体和不同种属的LAG-3(cyno-LAG-3-hFc，mLAG-3his)的结合ELISA实验如实施例1所述。
结果如下表6所示，Ab835和Ab8438，Ab8441同食蟹猴LAG-3的结合力分别为39nM、31nM、37nM，比与人LAG-3的结合活性要弱。此外，这些抗体都不和小鼠LAG-3结合。
表6本申请抗体和不同种属LAG-3的结合活性综合评价
Figure BDA0002042438980000382
3.3本申请的抗体能够结合细胞表面的LAG-3
人LAG-3高表达细胞株(hLAG-3+细胞)构建
本申请所用的人LAG-3高表达细胞株通过公司稳定细胞株构建平台完成。具体步骤如下：实验开始第1天，将293T细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，Cat#GNHu17)接种于两个6cm培养皿，每个培养皿里的细胞数达到7.5×105。第2天将包裹质粒(pGag-pol，pVSV-G等BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)和克隆有人LAG-3基因的质粒pBabe-hLAG-3各4μg加入OPTI-MEM(Thermofisher Scientific，Cat#31985070)，使最终体积为200μl，另准备200μl OPTI-MEM加入36μl转染试剂fectin(上海源培生物科技股份有限公司，Cat#F210)，二者混匀，室温放置5min，然后将混合物(每皿各200μl)滴加入培养好的293T细胞。第3天将293T细胞培养液换为4ml DMEM高糖培养基(上海源培生物科技股份有限公司/源培生物，Cat#L130KJ)。第4天将CHO-K1细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，Cat#SCSP-507)接种于10cm培养皿，使细胞数达到5×105。第5天收集293T细胞上清(病毒)，用0.45μm滤膜过滤至培养好的CHO-K1细胞，同时加入10μg/ml polybrene(上海翊圣生物科技有限公司，Cat#40804ES76)，混匀后放置培养箱，3～4h后换成DMEM/F1210％FBS培养基(源培生物，Cat#L310KJ)。第7天将CHO-K1细胞传代，第8天传代的细胞开始加入10μg/ml嘌呤霉素进行筛选(源培生物，Cat#S250J0)。2-3天细胞大量死亡，更换培养基继续培养，直到细胞不再死亡时，细胞大量扩增，筛选单克隆细胞株，扩培，冻存保种。
hLAG-3+细胞结合活性(ELISA)检测
将上述得到的细胞人LAG-3高表达的单克隆细胞株扩培后，按1x105/孔铺96孔板，37℃培养箱过夜孵育后去除上清，用免疫染色固定液(上海碧云天生物技术有限公司，Cat#P0098)100μl/孔，室温固定半小时。PBS(源培生物，Cat#B320)洗一遍后230μl 5％牛奶37℃封闭2小时，PBST洗3遍。每孔加入50μl，10μg/ml，5倍梯度稀释的待测抗体。37℃孵育1小时，后PBST洗5遍。加抗人HRP(JacksonImmuno Research，Cat#109-035-003)1∶2500 50μl/孔37℃孵育1小时，后PBST洗5遍，每孔加入50μl TMB(Surmodic Cat#TTMB-1000-01)显色，加入50μl/孔1M H25O4终止反应。酶标仪(MultiskanGO Thermo型号51119200)读数，Graphpadprism5进行数据分析。
结果如下表7所示，人源化抗体均Ab835，Ab8438，Ab841能与hLAG-3+细胞结合，且EC50值不超过1.5nM。
表7本申请抗体和细胞表面的LAG-3的结合活性评价
Figure BDA0002042438980000391
3.4阻止LAG-3和Daudi细胞结合
实施例2得到的人源化抗体与Daudi细胞的结合活性采用实施例1所述方法进行测定。
结果如图4所示，人源化抗体Ab835和Ab8438保留了和鼠源抗体一样的细胞功能活性，即阻止人LAG-3和Daudi细胞的结合活性。
实施例4人源化抗体的亲和力评价
采用Baicore仪器(GE Healthcare，Biacore T200)测定实施例2得到的人源化抗体和人LAG-3结合的亲和力KD。
用pH7.4的运行缓冲液HBS-EP+(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA和0.05％的P20)，先将Protein A(Thermo Pierce，Cat#21181)偶联到生物传感芯片CM5(Cat.#BR-1005-30，GE)上，将芯片用新配制的50mMNHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和200mM EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)激活。然后注入pH4.010mMNaAC配制的10μg/ml的ProteinA。待测抗浓度为5μg/ml，抗原LAG-3-his浓度梯度0nM，1.875nM，3.75nM，7.5nM，15nM，和30nM，流速30μl/分钟，结合时间180秒，解离时间300秒。实验后，用10mM甘氨酸-HCl，pH1.5，30μl/min，30s清洗芯片。实验数据用Biacore T200evaluation version3.0(GE)软件以1∶1 Langmuir模型进行拟合，得出亲和力数值KD。
结果如下表所示。Ab835、Ab8438、Ab8441与hLAG-3的亲和力(KD)均在1nM以下。
表8本申请抗体和hLAG-3的结合亲和力评价
抗体号 hLAG-3-his Biacore检测活性(KD，nM)
Ab835 0.45
Ab8438 0.71
Ab8441 0.6
实施例5双特异性抗体的制备
用实施例2得到的人源化LAG-3抗体，进行多种双特异性抗体的设计，双特异性抗体各部分序列见表9所示。涉及的对应各个靶点的单克隆抗体序列见表10。
表9双特异性抗体各部分序列
Figure BDA0002042438980000401
Figure BDA0002042438980000411
备注：“-”表示该序列来自现有技术，其中，PD-1抗体Atezo抗体轻、重链序列参见Drugbank登录号为DB11595的抗体氨基酸序列，Avel抗体轻、重链序列参见Drugbank登录号为DB11945的抗体氨基酸序列，Durv抗体轻、重链序列参见Drugbank登录号为DB11714的抗体氨基酸序列。PD-1抗体Ba08-1轻、重链可变区序列来自专利WO2016015685A1中SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：4。Tim-3抗体Ab6的轻、重链来自公开专利CN108948193A中SEQ ID NO：38和SEO ID NO：39。CD47抗体Hu5F9轻、重链可变区序列来自美国专利US9382320B2中SEQ IDNO：42和SEQ ID NO：37。CD47抗体iMab轻重链可变区序列来自专利WO2018075857中SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：3。PD-1抗体JS1轻重链可变区序列来自专利WO2014206107A1中SEQ IDNO：34和SEQ ID NO：33。
表10本申请所述单克隆抗体的编号及其轻重链序列
编号 靶点 轻链序列 重链序列
AB835 LAG-3 SEQ ID NO：78 SEQ ID NO：79
Ab8438 LAG-3 SEQ ID NO：94 SEQ ID NO：103
Ab8441 LAG-3 SEQ ID NO：99 SEQ ID NO：100
L105 PD-1 SEQ ID NO：106 SEQ ID NO：110
LB125 PD-1 Ba08VL-CL Ba08VH-CH
LB185 PD-L1 AtezoVL-CL AtezoVH-CH(hIgG1)
LB315 PD-L1 AvelVL-CL(λ链) AvelVH-CH(hIgG1)
LB318 PD-L1 DurvVL-CL DurvVH-CH(hIgG1)
LB192 CD47 Hu5F9VL-CL Hu5F9VH-CH
LS956 CD47 iMabVL-CL iMabVH-CH
LB251 PD-1 JS001VL-CL JS1VH-CH
Ab6 Tim-3 Ab6-CL Ab6-CH
备注：CL(λ链)表示人IgG的λ型轻链恒定区，CH(hIgG1)表示hIgG1重链恒定区，IgG1的C末端连接连接子的时候，其最末端氨基酸K突变为A。
针对LAG-3和PD-1的双特异性抗体
本申请针对LAG-3和PD-1两个靶点设计了不同序列结构的双特异性抗体，见下表。
表11针对LAG-3和PD-1双靶点设计的双特异性抗体
Figure BDA0002042438980000421
Figure BDA0002042438980000431
以LB210为例，轻链序列为NivoVL-CL，表示Nivo抗体轻链可变区(NivoVL，SEQ IDNO：119)的C端与人IgG1的κ型轻链恒定区(CL，SEQ ID NO：74)的N端相连；重链序列为Ab8438VL-(G4S)3-Ab8438VH-(G4S)3-NivoVH-CH，表示实施例2得到的人源化抗体Ab8438的轻链可变区(Ab8438VL，SEQ ID NO：81)的C端通过连接子(G4S)3(SEQ ID NO：123)与Ab8438的重链可变区(Ab835VH，SEQ ID NO：90)的N端相连，Ab8438VH的C端通过连接子与Nivo抗体重链可变区(NivoVH，SEQ ID NO：120)的N端相连，NivoVH的C端与人IgG4重链恒定区(CH，SEQ ID NO：75)的N端相连，其中IgG4的重链恒定区末端氨基酸K突变为A。
针对LAG-3和PD-L1的双特异性抗体
本申请针对LAG-3和PD-L1两个靶点设计了不同序列结构的双特异性抗体，见下表。
表12针对LAG-3和PD-L1双靶点设计的双特异性抗体
抗体编号 轻链序列 重链序列
LB223 AtezoVL-CL AtezoVH-CH(hIgG1)-(G4S)<sub>3</sub>-Ab835VH-(G4S)<sub>3</sub>-Ab835VL
LB224 AtezoVL-CL AtezoVH-CH(hIgG1)-(G4S)<sub>3</sub>-Ab8438VH-(G4S)<sub>3</sub>-Ab8438VL
备注：CH(hIgG1)表示重链恒定区来自hIgG1重链恒定区，IgG1的C末端连接连接子的时候，其最末端氨基酸K突变为A。
针对LAG-3和Tim3的双特异性抗体
本申请针对LAG-3和Tim3两个靶点设计了不同序列结构的双特异性抗体，见下表。
表13针对LAG-3和Tim3双靶点设计的双特异性抗体
抗体编号 轻链序列 重链序列
LB151 Ab6VL-CL Ab835VL-(G4S)<sub>3</sub>-Ab835VH-(G4S)<sub>3</sub>-Ab6VH-CH
LB1511 Ab6VL-CL Ab8438VL-(G4S)<sub>3</sub>-Ab8438VH-(G4S)<sub>3</sub>-Ab6VH-CH
针对LAG-3和CD47的双特异性抗体
本申请针对LAG-3和CD47两个靶点设计了不同序列结构的双特异性抗体，见下表。
表14针对LAG-3和CD47双靶点设计的双特异性抗体
抗体编号 轻链序列 重链序列
LB1551 Hu5F9VL-CL Ab835VL-(G4S)<sub>3</sub>-Ab835VH-(G4S)<sub>3</sub>-Hu5F9VH-CH(hIgG1)
LB1552 Hu5F9VL-CL Ab8438VL-(G4S)<sub>3</sub>-Ab8438VH-(G4S)<sub>3</sub>-Hu5F9VH-CH(hIgG1)
备注：CH(hIgG1)表示重链恒定区来自hIgG1重链恒定区，IgG1的C末端连接连接子的时候，其最末端氨基酸K突变为A。
按实施例2中的蛋白表达纯化方法分别克隆表达、纯化上述双特异性抗体。
实施例6双特异性抗体的结合能力
6.1和LAG-3结合
实施例5得到的双特异性抗体与LAG-3的结合能力按照实施例1的ELISA法测得。结果如下表15及图5A-5N所示。
表15针对LAG-3的双特异性抗体的结合活性评价
Figure BDA0002042438980000441
Figure BDA0002042438980000451
表15中，括号里面的数值为同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体的结合活性EC50。EC50改变倍数指同样实验条件下，双特异性抗体和对应的单克隆抗体的结合活性EC50的比值。比值越大，说明所设计的双特抗体对单靶点的结合力减弱越多，比如比值为2，则说明所设计的双特异性抗体对靶点结合活性和对应的单克隆抗体相比减弱了1倍。
6.2和PD-1结合
用pH7.4的PBS缓冲液将人PD-1抗原根据不同assay，稀释至2μg/ml浓度，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，CLS3590-100EA)中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(上海生工生物工程有限公司，A600669-0250)封闭液200μl/孔，37℃孵育箱孵育3小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4PBS含0.05％tweeen-20)洗板5次后，加入50μl/孔用1％BSA5倍连续稀释的待测抗体，37℃孵育1小时，PBST洗板5次，加入50μl/孔1∶2500稀释的HRP标记的二抗(Jackson Immuno Research，115-035-003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，52-00-03)，室温孵育5-10min，加入50μl/孔1M H25O4终止反应，用MULTISKAN Go酶标仪(ThermoFisher，51119200)在450nm处读取吸收值，根据OD值计算EC50。结果如下表和图6A-6N所示。
表16针对PD-1的双特异性抗体的结合活性评价
Figure BDA0002042438980000461
Figure BDA0002042438980000471
表16中，括号里面的数值为同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体的结合活性EC50。EC50改变倍数含义为同样实验条件下，双特异性抗体和对应的单克隆抗体的结合活性EC50的比值。比值越大，说明所设计的双特抗体对单靶点的结合力减弱越多，比如比值为2，则说明所设计的双特异性抗体对靶点结合活性和对应的单克隆抗体相比减弱了1倍。
表15和表16中，从LB211到LB219共24组分子，是LAG-3抗体Ab835和Ab8438的scFv分别和三种PD-1抗体Pem，Nivo，Ba081在各自重链N端，重链C端，轻链N端，轻链C端设计成的双特异分子。上述双特异性抗体中，LB209，LB221，LB235，LB204，LB222，LB232，LB231，LB233，LB217，LB219均保留了对双靶点LAG3和PD-1的结合活性。这些分子的结合活性相对单独的LAG3抗体或PD-1抗体没有改变，有的活性甚至增强(改变倍数＜1)。
数据显示，同样的PD-1抗体的同样位置，如果结合的scFv形式的LAG-3抗体不同，得到的双特异性抗体对PD-1和LAG-3双靶点的结合活性影响不同。在同样的PD-1抗体的同样的位置上，scFv形式的Ab835设计成的双特异性抗体比Ab8438对LAG-3和PD-1双靶点活性的影响要大很多，前者显著减弱了所设计双特异性抗体对双靶点的结合活性。如，比较LB152和LB209，Ab835scFv在Pem重链的N末端设计成的双特异性抗体LB152对LAG-3结合活性比同靶点对应的单克隆抗体减弱4.47倍，对PD-1结合活性减弱2.24倍；而Ab8438scFv在Pem重链的N末端设计成的双特异性抗体LB209对LAG-3结合活性改变0.71倍，对PD-1结合活性改变0.91倍，可以说该分子对PD-1和LAG-3的结合活性均没有影响(见图5A-5B，图6A-6B结合曲线)。又如，比较LB201和LB231，分别为Ab835和Ab8438与Pem在抗体轻链的N端连接得到的双特异性抗体，对LAG-3和PD-1的结合活性影响不同。其中，LB201对PD-1的结合活性减弱了(见图5K，6K结合曲线)，而LB231对LAG-3和PD-1的活性均没有影响(见图5L，6L结合曲线)。又如，比较LB216和LB217，分别为Ab835和Ab8438与Pem抗体在轻链C端连接得到的双特异性抗体，对LAG-3和PD-1的结合活性影响不同。其中，LB216对LAG-3的结合活性减弱7倍多，而LB217对PD-1和LAG3的结合活性均没有影响(见图5M-N，6M-N结合曲线)。
上表15和表16中从LB211到LB219共24组数据还表明，对于同样的scFv，和同样的PD-1抗体连接，如果连接在重、轻链的不同位置，对双靶点的结合活性影响不同。如，比较LB211、LB234、LB202和LB214，为scFv形式的Ab835分别连接在PD-1抗体Pem的重链N端，重链C端，轻链N端，轻链C端得到的双特异性抗体，对LAG-3和PD-1双靶点的结合活性的改变影响不同。再如，比较LB210、LB235、LB232、LB215，为scFv形式的Ab8438分别连接在Nivo的重链N端、重链C端、轻链N端、轻链C端得到的双特异性抗体，对LAG-3和PD-1双靶点的结合活性的改变影响不同。
上表数据还表明，同样的scFv，和不同的PD-1抗体设计成的双特异性抗体，即使连接位置相同，对双靶点活性影响也各不相同。如，比较LB210、LB209和LB221，分别为scFv形式的Ab8438在NIvo、Pem、Ba081的重链N端连接得到的双特异性抗体，对LAG-3和PD-1的结合活性不同。其中，LB209对双靶点的结合活性没有影响，LB221对LAG-3和PD-1的结合活性均有增强作用，LB210对LAG3的结合活性没有影响，但对PD-1的结合活性减弱了2倍(如图5B-5D，图6B-6D结合曲线所示)。
实施例5得到的双特异性抗体，其scFv也可以是针对PD-1的抗体蛋白，另一部分是针对LAG-3的完整抗体，包括Ab835和Ab8438。如LB207、LB208、LB205、LB206，上述结果表明，LB208和LB206对双靶点(LAG-3，PD-1)的结合活性没有减弱。而LB20-7对PD-1，LB20-5对PD-1和LAG3的结合活性都有明显减弱，且减弱倍数超过了2倍。这些数据同样表明，双特异性抗体活性是序列特异的。在这些双特异性抗体中，Nivo和Pem的scFv与Ab8438抗体连接设计的双特异性抗体保留了对双靶点(LAG-3，PD-1)的结合活性，而Ab835对双靶点结合活性影响改变较大。
为了增加双特异性抗体中scFv对结合LAG-3的活性，scFv可以是一对或者一对以上，比如2对scFv。数据表示，连接2对scFv形成的双特异性抗体不会减弱对LAG-3和PD-1的结合活性。如，LB236、LB237、LB238分别为2对Ab8438scFv各自在Nivo、Pem、Ba081的PD-1抗体重链的N端和C端连接形成的双特异性抗体，三者对LAG-3的结合活性均没有影响。2对抗LAG3抗体的scFv也可以分别在PD-1抗体轻链、重链的N或C末端，如，LB2042、LB2092、LB2212、LB2222的双特异性抗体，对LAG-3的结合活性均有提高。
6.3和PD-L1结合
人PD-L1抗原由本发明合成，序列来自NCBI数据库NP_054862.1的19-239位氨基酸。双特异性抗体与PD-L1的结合能力按照本实施例前述部分的ELISA法测得。
结果如下表所示。
表17针对PD-L1的双特异性抗体的结合活性评价
Figure BDA0002042438980000481
Figure BDA0002042438980000491
表17中，括号里面的数值为同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体的结合活性EC50。EC50改变倍数的含义为同样实验条件下，双特异性抗体和对应的单克隆抗体的结合活性EC50的比值。比值越大，说明所设计的双特抗体对单靶点的结合力减弱越多，比如比值为2，则说明所设计的双特异性抗体对靶点结合活性和对应的单克隆抗体相比减弱了1倍。比值在2以内(实验误差范围)，说明结合活性没有受到影响。
表15、表17中的LB223和LB224是针对LAG-3和PD-L1双靶点设计的双特异性抗体。上述结果表明，LAG-3抗体Ab835，Ab8438的scFv和PD-L1抗体形成的双特异性抗体均保留了对LAG-3和PD-L1双靶点的结合活性。
6.4和Tim3结合
Tim3抗原为合成，序列来自UniProtKB登录号为Q8TDQ0.3第22-199位。双特异性抗体与Tim3的结合能力按照本实施例前述部分的ELISA法测得。
表18针对Tim3的双特异性抗体的结合活性评价
Figure BDA0002042438980000492
LB151中对LAG-3和Tim3的活性数据分别如表15和表18所示，LB151对LAG-3的结合活性没有受到影响。
实施例7双特异性抗体的功能活性评价
将上述保留了双靶点活性的双特异性抗体分别针对两个靶点进行功能评估，具体如下。
7.1阻止LAG-3和Daudi细胞结合
将Daudi细胞株(ATCC，CCL-213)扩培后，按2×105/孔铺96-well plate，1600rpm离心10min后，用免疫染色固定液(上海碧云天生物技术有限公司Cat#P0098)100μl/孔室温固定半小时。PBS(源培生物，Cat#B320)洗一遍后230μl5％牛奶37℃封闭2小时，PBST洗3遍。每孔加入25μl，100μg/ml，3倍梯度稀释的待测样品和25μl2.5μg/ml的bio-LAG-3-mFc(北京义翘生物科技有限公司，16498-H05H)。37℃孵育1小时，后PBST洗5遍。加入50μl/孔1∶1000稀释的streptavidin-HRP二抗(genscript，M00091)，37℃孵育1小时，后PBST洗5遍，每孔加入50μl TMB(Surmodic Cat#TTMB-1000-01)显色，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应。酶标仪(MultiskanGO Thermo型号51119200)读数，Graphpad prism 5进行数据分析，结果如下表。
表19双特异性抗体阻止LAG-3和Daudi细胞结合的功能活性评价
Figure BDA0002042438980000501
表19中，括号里面的数值为同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体阻断抗原和配体结合活性IC50。IC50改变倍数的含义为，双特异性抗体和对应的单克隆抗体(对照抗体)的IC50的比值。比值越大，说明所设计的双特抗体对单靶点的功能活性减弱越多，比如比值为2，则说明所设计的双特异性抗体对靶点功能活性和对应的单克隆抗体相比减弱了1倍。
表19数据表明，与对应的单克隆抗体相比，双特异性抗体对LAG-3和Daudi细胞结合的阻断活性改变都在1.5倍以内，甚至活性更好，如LB221，LB204，LB222，LB2092，LB2042，LB256，LB257，LB259和LB260。
7.2阻止PD-1和PD-L1结合
用pH为7.4的PBS缓冲液将PD-L1稀释至2μg/ml浓度，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，CLS3590-100EA)中，于37℃孵育2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(上海生工生物工程有限公司，A600669-0250)封闭液200μl/孔，37℃孵育3小时进行封闭。弃去封闭液，用PBST(pH7.4PBS含0.05％tweeen-20)洗板5次后，每孔加入25μl用1％BSA 5倍连续稀释的待测样品和25μl终浓度为10μg/ml的biotin标记的PD-L1，37℃孵育1小时，PBST洗板5次，加入50μl/孔1：1000稀释的HRP标记的二抗(金斯瑞生物科技有限公司，M00091)，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，52-00-03)，室温孵育5-10min，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应，用MULTISKAN Go酶标仪(ThermoFisher，51119200)在450nm处读取吸收值，根据OD值计算IC50。
Biotin标记的试剂盒为Biotin Labeling Kit-NH2，购自东仁化学科技(上海)有限公司，货号LK03。操作方法按说明书进行，标记好的抗体用Multiskan GO(ThermoFisher)酶标仪检测浓度后使用。结果如下表所示。
表20双特异性抗体阻止PD-1和PD-L1结合的功能活性评价
Figure BDA0002042438980000511
表20中，括号里面的数值为同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体阻断抗原和配体结合活性IC50。IC50改变倍数的含义为，双特异性抗体和对应的单克隆抗体(对照抗体)的IC50的比值。比值越大，说明所设计的双特抗体对单靶点的功能活性减弱越多，比如比值为2，则说明所设计的双特异性抗体对靶点功能活性和对应的单克隆抗体相比减弱了1倍。比值在2以内为实验误差范围，即活性没有受到影响。
表20数据表明，与对应的单克隆抗体相比，双特异性抗体对PD-1和PD-L1结合的阻断活性改变都在1.5倍以内。
表19和表20的功能活性结果表明，本申请设计的双特异性抗体包括LB204，LB209，LB232，LB231，LB215等都保留了对双靶点的功能活性，即阻止LAG-3和Daudi细胞结合，阻止PD-1和PD-L1结合。
实施例8双特异性抗体的稳定性评价
将实施例5得到的双特异性抗体，用实施例2的方法进行ProteinA重力柱纯化。纯化样品置换到pH7.4的PBS buffer中，1mg/ml。于不同条件保存，包括-80℃保存60天以上，4℃保存10天，37℃保存10天等。不同条件保存的样品经电泳(PAGE)评价样品的降解程度。
通过检测结合活性评价不同保存条件对样品活性是否受到影响。同样检测条件下，检测出的活性值(EC50)和-80℃保存的样品所检测到的活性值比较。活性检测方法如上述实施例1的ELISA法。
表21针对LAG-3和PD-1双靶点设计的双特异性抗体稳定性评价(37℃保存10天)
Figure BDA0002042438980000521
备注：EC50改变倍数为相对于-80℃保存样品活性(括号内数值)改变倍数。
稳定性分析结果表明，上述双特异分子在4℃保存10天，对双靶点的活性和-80℃保存60天活性没有显著改变(EC50差别在2倍以内)，说明这些分子在-80℃，4℃能够稳定保存。
在37℃保存10天后，各个分子活性改变相差较大(数据见上表21)。在所检测的分子中，LB209，LB204，LB215，LB219几个分子在37℃保存10天，对双靶点的活性几乎没有影响(活性改变在2倍左右)，说明这几个分子在所设计的双特异性抗体中，稳定性是最好的。
图7分别为Ab8438scFv和PD-1抗体Pem重链C末端连接(LB204)，重链N末端连接(LB209)，轻链C末端连接(LB217)，轻链N末端连接(LB231)所得到的双特异性抗体的非变性和变性凝胶电泳PAGE结果。泳道1、2；3、4；5、6；以及7、8分别为LB204，LB209，LB217和LB231的非变性和变性样品，M：分子量标记。图7结果表明，常规简单的Protein A抗体纯化工艺能得到比较纯的稳定完整的LB204，LB209和LB231双特异性抗体。LB217出现轻重链不完整的组合(泳道5)。说明LB204，LB209，LB231这些分子更加容易用常规的简单工艺即可得到到完整、纯化的双特异性抗体。且LB204，LB209稳定性更好。这些数据表明，Ab835，AB8438和PD-1抗体设计得到的双特异性抗体稳定性特异。
实施例9双特异性抗体的表达量评价
为了评估本申请双特异性抗体的表达水平，用实施例2的蛋白表达方法在同一表达系统(293F细胞转瞬)表达纯化后，用酶标仪(ThermoFisher，51119200)测定浓度，得到各自的表达量，结果如下表。
表22双特异性抗体表达水平评价
抗体编号 表达量(mg/L) 抗体编号 表达量(mg/L) 抗体编号 表达量(mg/L)
LB211 0.71 LB232 40.74 LB2222 5.89
LB152 0.93 LB231 8.28 LB207 2.96
LB153 0.97 LB233 15.17 LB208 14.15
LB210 21.11 LB214 0.23 LB205 1.74
LB209 6.31 LB216 1.27 LB206 5.64
LB221 9.71 LB218 1.33 LB256 56.5
LB234 1.95 LB215 19.03 LB257 58.6
LB203 0.08 LB217 10.03 LB258 30.6
LB213 0.32 LB219 14.51 LB259 41.8
LB235 53.94 LB237 15.11 LB260 1.6
LB204 5.10 LB236 3.12
LB222 9.39 LB238 6.4
LB202 2.50 LB2042 6.40
LB201 0.79 LB2092 12.05
LB212 1.77 LB2212 0.79
上述结果表明，实施例5得到的针对LAG-3和PD-1的双特异性抗体表达产量差别很大。综合上述数据分析，不同LAG-3抗体的scFv，在同样的PD-1抗体不同的位置连接得到双特异性抗体，表达量不同，Ab8438scFv对应的双特异性抗体的表达量比阴性对照Ab835要高20-80倍，比如，LB210比LB211产量高29倍(21.1/0.71)；LB235比LB234产量高27倍(53.94/1.95)；LB232比LB202产量高15倍(40.74/2.5)；LB215比LB214高产量高82倍(19.03/0.23)。
上述数据又显示，同样LAG-3抗体的scFv与同样PD-1连接，如果连接位置不同，得到的双特异性抗体表达量也相差2倍以上，比如LB210(21.1mg/L)，LB235(53.94mg/L)，LB232(40.74mg/L)和LB215(19.03mg/L)。
上述数据还显示，同样LAG-3抗体的scFv序列和不同的PD-1抗体在同样的位置连接得到的双特异性抗体，表达量也相差也很大，Pem和Ba081基本没有差别，而Nivo比Pem有的高10倍以上，如比较LB235(53.94mg/L)，LB204(5.1mg/L)和LB222(9.39mg/L)的表达量。
此外，Ab8438，Ab835分别和JS001设计的双特异性抗体LB256-LB260这些分子的瞬时表达数据(上表)表明LB256，LB257表达量最高。
这些数据表明，本申请抗LAG3抗体Ab835，AB8438和PD-1抗体设计的双特异性抗体，表达量也是序列特异的。
实施例10双特异性抗体的体内药效评价(减少肿瘤体积)
用人PD-1和LAG-3双转基因小鼠(C57BL/6-hPD1/hLAG-3)建立动物药效模型，评价本申请LAG-3抗体以及LAG-3和PD-1双靶点抗体动物体内药效体。双转基因小鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司，生产许可证编号：SCXK(苏)2018-0008。
MC38细胞(购自中科院细胞所)培养于含10％胎牛血清(上海博升生物科技有限公司，货号：BS-0002-500)，1％HEPES(赛默飞世尔科技有限公司，货号：15630080)的DMEM/高糖培养基中(上海源培生物科技股份有限公司，货号：L110KJ)，在含5％CO2的37℃的细胞培养箱中连续培养。C57BL/6-hPD1/hLAG-3雌性小鼠，5只/笼饲养于SPF级环境，温度20-25℃；湿度40％-60％，自由进食进水，定期更换垫料。
待MC38细胞长至对数生长期(汇合率在80％-90％)时，用0.25％胰酶消化，收集细胞，并用无血清的DMEM/高糖培养基洗涤细胞两次，后用无血清的DMEM/高糖培养基重悬，计数，用Matrigel(碧迪医疗器械(上海)有限公司，货号：354234)与DMEM/高糖培养基按1：1的比例混合，调整细胞浓度为1×107细胞/ml用于接种。接种MC38细胞悬液100μl(106个)于小鼠右肋部皮下，挑选肿瘤细胞长至体积约100-120mm3大小后随机分组，每组5只。
待测样品用PBS配制，无菌。Blank组为PBS。PD-1抗体(Pem)，Ab8438，双特异性抗体LB204由按实施例2和实施5的方法克隆表达纯化得到。给药方式为腹腔注射，PD-1组：PD-1抗体给药剂量为10μg/100μl/只；PD-1∶Ab8438(1∶40)组：PD-1抗体给药剂量为10μg/100μl/只，Ab8438给药剂量为400μg/100μl/只，。给药频率2次/周，共给药4次。PD-1抗体(30μg/100μl/只)和Ab8438抗体按照1∶1的比例给药，即PD-1∶Ab8438(1∶1)组。LB204组按照和30μg/100μl/只PD-1抗体剂量等摩尔剂量给药。给药频率2次/周，共给药3次。注射样品当天为第0天。每次给药前测量体重，肿瘤体积，记录数据。
肿瘤大小计算公式：肿瘤体积TV(mm3)＝0.5x(肿瘤长径x肿瘤短径2)；相对肿瘤增长率(T/C％)＝100％*(T-T0)/(C-C0)；抑瘤率(TGI)＝(1-T/C)*100％；其中T0，T分别为样品组实验开始时及实验结束时的肿瘤体积；C0，C分别为对照组实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。
结果(见图8)表明，本申请LAG-3抗体Ab8438和PD-1抗体联用(PD-1∶Ab8438(1∶40)组)显示很好的抑瘤效果，抑制率在第10-21天维持在100％，即肿瘤没有增长，而同剂量的PD-1抗体单独只显示10％-30％抑瘤率。该组数据确定本申请LAG-3抗体Ab8438在动物体内显示显著的抑瘤药效。
PD-1抗体和Ab8438按1∶1剂量(PD-1∶Ab8438(1∶1)组)和同摩尔剂量的LB204(由PD-1抗体和Ab8438设计的双特异性抗体)显示同样的抑瘤效果，第10-21天均维持100％抑瘤率。该结果说明本申请双特异性抗体LB204和同剂量的PD-1抗体和LAG-3抗体联用显示同样的效果。虽然临床最佳双特异性抗体剂量还需要进一步实验确定，但单药比联合给药至少将更加便利。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
序列表
<110> 上海健信生物医药科技有限公司
<120> 一种分离的LAG-3结合蛋白及其应用
<130> 0056-PA-001
<160> 123
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 511
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7轻链可变区
<400> 1
atgaagtttg ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcggtgat 60
gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120
tcttgcagat ctagtcagag cattgtacat agtgatgaca acacctattt agaatggtac 180
ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240
ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300
agagtggagt ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcgca tgttcctccg 360
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420
atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttctga 480
acaactctac cccagagaca tacatgtccc t 511
<210> 2
<211> 526
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7重链可变区碱基序列
<400> 2
atgaaatgca cctgggtttt tctcttcctc ctctcaggaa ctgcaggtgt ccactctgag 60
ttccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gcgcttcagt gaagatatcc 120
tgcaaggctt ctggttattt attcactgac tataacatga actgggtgaa gcagagcaat 180
ggaaagagcc ttgagtggat tggagtaatt gatcctaact atggtactat tacctacaat 240
cagaagttca agaacaaggc cgcattgact gtagaccaat cttccagcac agcctactta 300
cacctcaaca gcgtgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcagc tattactacg 360
gcagtgaggt attttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcagccaaa 420
acgacacccc catctgtcta tccactggcc cctggatctg ctgcccaaac taactccatg 480
gtgaccctgg gatgcctgtc aagggctatt cctagccaga aagtga 526
<210> 3
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84轻链可变区碱基序列
<400> 3
atgagggccc cctgctcaga ttcttgggat cttgttgctc ttgtttccag gtaccagatg 60
tgacattcag atgacccagt ctccatcctc cttatctgcc tctctgggag aaagagtcag 120
tctcacttgt cgggcaagtc aggacattgg tagtaggtta aactggcttc agcaggaacc 180
agatggaact attaaacgcc tgatctacgc cacatccagt ttagattctg gtgtccccaa 240
aaggttcagt ggcagtaggt ctgggtcaga ttattttctc accatcagca gccttgagtc 300
tgaagatttt gtagactatt actgtctaca atgtgctagt tctccgctca cgttcggtgc 360
tgggaccaag ctggagctga aacgggctga tgctgcacca actgtatcca tcttcccacc 420
atccagtgag cagttaacat ctggaggtgc ctcagtcgtg tgcttcttga acaactctac 480
cccagagaca atccagttcc 500
<210> 4
<211> 532
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84重链可变区碱基序列
<400> 4
atgaaatgca cctgggtttt tctcttcctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccactctgag 60
gtccagctgc aacagtctgg acctgtgctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatgtcc 120
tgtaaggctt ctggatacac attcactgac tactatatga actgggtgaa gcagagccat 180
ggaaagagcc ttgagtggat tggagttatt aatccttaca acggtgatac tagctacaac 240
cagaagttca agggcaaggc cacattgact gttgacaagt cctccagcac agcctacatg 300
gagctcaaca gcctgacatc tgaggactct gcagtctact actgtgcaag agacgatggt 360
tactacgttg agtactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc 420
aaaacaacac ccccatcagt ctatccactg gcccctgggt gtggagatac aactggttcc 480
tctgtgactc tgggatgcct ggtcaagggc tactaccgta gtcaggaagc cg 532
<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7轻链可变区
<400> 5
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asp Asp Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ser Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7重链可变区
<400> 6
Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Leu Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asp Pro Asn Tyr Gly Thr Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Ala Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu His Leu Asn Ser Val Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ile Thr Thr Ala Val Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84轻链可变区
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Phe Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 8
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84重链可变区
<400> 8
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Val Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7 LCDR1（CCG,Kabat,AbM,Chothia）
<400> 9
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asp Asp Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7 LCDR2（CCG，Kabat，AbM，Chothia）
<400> 10
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7 LCDR3（CCG，Kabat，AbM，Chothia）
<400> 11
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7 HCDR1（CCG，AbM）
<400> 12
Gly Tyr Leu Phe Thr Asp Tyr Asn Met Asn
1 5 10
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7 HCDR2（CCG，Kabat）
<400> 13
Val Ile Asp Pro Asn Tyr Gly Thr Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7 HCDR3（CCG，Kabat，AbM，Chothia）
<400> 14
Ile Thr Thr Ala Val Arg Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7 HCDR1（Kabat）
<400> 15
Asp Tyr Asn Met Asn
1 5
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7 HCDR2（AbM）
<400> 16
Val Ile Asp Pro Asn Tyr Gly Thr Ile Thr
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7 HCDR1（Chothia）
<400> 17
Gly Tyr Leu Phe Thr Asp Tyr
1 5
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> MAB7 HCDR2（CHOTHIA）
<400> 18
Asp Pro Asn Tyr Gly Thr
1 5
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7 LCDR1（Contact）
<400> 19
Val His Ser Asp Asp Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
1 5 10
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7 LCDR2（Contact）
<400> 20
Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
1 5 10
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7 LCDR3（Contact）
<400> 21
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Pro
1 5
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7 HCDR1（Contact）
<400> 22
Thr Asp Tyr Asn Met Asn
1 5
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7 HCDR2（Contact）
<400> 23
Trp Ile Gly Val Ile Asp Pro Asn Tyr Gly Thr Ile Thr
1 5 10
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab7 HCDR3（Contact）
<400> 24
Ala Ala Ile Thr Thr Ala Val Arg Tyr Phe Asp
1 5 10
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84，Ab8422-8443，通式的LCDR1（CCG，Kabat，AbM，Chothia）
<400> 25
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg Leu Asn
1 5 10
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84，Ab8422-8443，通式的LCDR2（CCG，Kabat，AbM，Chothia）
<400> 26
Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84，Ab8422-8443，通式的LCDR3（CCG，Kabat，AbM，Chothia）
<400> 27
Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84 HCDR1（CCG，AbM）
<400> 28
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84，Ab8422-8443，通式的HCDR2（CCG，Kabat）
<400> 29
Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84，Ab8422-8443，通式的HCDR3（CCG，Kabat，AbM，Chothia）
<400> 30
Asp Asp Gly Tyr Tyr Val Glu Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84，Ab8422-8443，通式的HCDR1（Kabat）
<400> 31
Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84 HCDR2（AbM）
<400> 32
Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser
1 5 10
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84HCDR1（Chothia）
<400> 33
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
1 5
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84 HCDR2（Chothia）
<400> 34
Asn Pro Tyr Asn Gly Asp
1 5
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84 LCDR1（Contact）
<400> 35
Gly Ser Arg Leu Asn Trp Leu
1 5
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84 LCDR2（Contact）
<400> 36
Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp
1 5 10
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84 LCDR3（Contact）
<400> 37
Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
1 5
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84 HCDR1（Contact）
<400> 38
Thr Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5
<210> 39
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84 HCDR2（Contact）
<400> 39
Trp Ile Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser
1 5 10
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84 HCDR3（Contact）
<400> 40
Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Val Glu Tyr Phe Asp
1 5 10
<210> 41
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84 L-FR1（Kabat）
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys
20
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84 L-FR2（Kabat）
<400> 42
Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 43
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84 L-FR3（Kabat）
<400> 43
Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Phe
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84 L-FR4（Kabat）
<400> 44
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
1 5 10
<210> 45
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84 H-FR1（Kabat）
<400> 45
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84 H-FR2（Kabat）
<400> 46
Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 47
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84 H-FR3（Kabat）
<400> 47
Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84 H-FR4（Kabat）
<400> 48
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 49
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8422-8443 H-FR1（Kabat）
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 50
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8422，8423，8424，8425，8426，8427，8441 H-FR2（Kabat）
<400> 50
Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8428，8429，8430，8431，8432，8433，8440，Ab8434，8435，8436，8
442，Ab8437，8438，8439，8443 H-FR2（Kabat）
<400> 51
Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 52
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AB8422，8423，8424，8425，8426，8427，8441，AB8437，8438，8439，8
443 H-FR3（KABAT）
<400> 52
Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 53
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8428，8429，8430，8431，8432，8433，8440 H-FR3（Kabat）
<400> 53
Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 54
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8434，8435，8436，8442 H-FR3（Kabat）
<400> 54
Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8422-8443 H-FR4（Kabat）
<400> 55
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 56
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8422-8443 L-FR1（Kabat）
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 57
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8422，8428，8434，8437，Ab8423，8429，8435，8438，Ab8424，8430，
8436，8439，Ab8425，8431，Ab8426，8432，Ab8440，8441，8442，8443
L-FR2（Kabat）
<400> 57
Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 58
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8427，8433 L-FR2（Kabat）
<400> 58
Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 59
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8422，8428，8434，8437 L-FR3（Kabat）
<400> 59
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 60
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8423，8429，8435，8438 L-FR3（Kabat）
<400> 60
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 61
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8424，8430，8436，8439 L-FR3（Kabat）
<400> 61
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 62
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8425，8431 L-FR3（Kabat）
<400> 62
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 63
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8426，8432，Ab8427，8433L-FR3（Kabat）
<400> 63
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 64
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8440，8441，8442，8443 L-FR3（Kabat）
<400> 64
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8422-8443 L-FR4（Kabat）
<400> 65
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 66
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L-FR1（Kabat）
<220>
<221> X
<222> (15)..(15)
<223> X=L,V
<220>
<221> X
<222> (17)..(17)
<223> X=E,D
<220>
<221> X
<222> (20)..(20)
<223> X=S,T
<220>
<221> X
<222> (21)..(21)
<223> X=L,I
<400> 66
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Xaa Gly
1 5 10 15
Xaa Arg Val Xaa Xaa Thr Cys
20
<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L-FR2（Kabat）
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X=E,K
<220>
<221> X
<222> (7)..(7)
<223> X=D,G
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X=I,P
<400> 67
Trp Leu Gln Gln Xaa Pro Xaa Gly Thr Xaa Lys Arg Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 68
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L-FR3
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X=K,S
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X=R,G
<220>
<221> X
<222> (13)..(13)
<223> X=S,T
<220>
<221> X
<222> (15)..(15)
<223> X=Y,F
<220>
<221> X
<222> (16)..(16)
<223> X=F,T
<220>
<221> X
<222> (23)..(23)
<223> X=E,Q
<220>
<221> X
<222> (24)..(24)
<223> X=S,P
<220>
<221> X
<222> (28)..(28)
<223> X=V,A
<220>
<221> X
<222> (29)..(29)
<223> X=D,T
<400> 68
Gly Val Pro Xaa Arg Phe Ser Gly Ser Xaa Ser Gly Xaa Asp Xaa Xaa
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Xaa Xaa Glu Asp Phe Xaa Xaa Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L-FR4（Kabat）
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> X=A,Q
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X=L,I
<400> 69
Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Leu Glu Xaa Lys
1 5 10
<210> 70
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H-FR1（Kabat）
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X=Q,V
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X=P,A
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X=V,E
<220>
<221> X
<222> (11)..(11)
<223> X=L,V
<220>
<221> X
<222> (12)..(12)
<223> X=V,K
<220>
<221> X
<222> (16)..(16)
<223> X=A,S
<220>
<221> X
<222> (20)..(20)
<223> X=M,V
<400> 70
Glu Val Gln Leu Xaa Gln Ser Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Pro Gly Xaa
1 5 10 15
Ser Val Lys Xaa Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 71
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H-FR2（Kabat）
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X=S,A
<220>
<221> X
<222> (6)..(6)
<223> X=H,P
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> X=K,Q
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X=S,G
<220>
<221> X
<222> (12)..(12)
<223> X=M,I
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 71
Trp Val Lys Gln Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Leu Glu Trp Xaa Gly
1 5 10
<210> 72
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H-FR3（Kabat）
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X=L,I
<220>
<221> X
<222> (6)..(6)
<223> X2=V,A
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X2=S,T
<220>
<221> X
<222> (18)..(18)
<223> X=N,S
<220>
<221> X
<222> (21)..(21)
<223> X=T,R
<220>
<221> X
<222> (25)..(25)
<223> X=T,S
<400> 72
Lys Ala Thr Xaa Thr Xaa Asp Lys Ser Xaa Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Xaa Ser Leu Xaa Ser Glu Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H-FR4（Kabat）
<220>
<221> X
<222> (6)..(6)
<223> X=L,T
<220>
<221> X
<222> (7)..(7)
<223> X=L,V
<400> 73
Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Xaa Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 74
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人抗体κ链轻链恒定区
<400> 74
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 75
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人IgG4重链恒定区
<400> 75
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 76
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab835轻链可变区
<400> 76
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asp Asp Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 77
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab835重链可变区
<400> 77
Gln Phe Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Leu Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asp Pro Asn Tyr Gly Thr Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Thr Asp Gln Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Ile Thr Thr Ala Val Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 78
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab835轻链
<400> 78
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asp Asp Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 79
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab835重链
<400> 79
Gln Phe Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Leu Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asp Pro Asn Tyr Gly Thr Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Thr Asp Gln Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Ile Thr Thr Ala Val Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 80
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8422,8428,8434,8437轻链可变区
<400> 80
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 81
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8423,8429,8435,8438 轻链可变区
<400> 81
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 82
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8424,8430,8436,8439 轻链可变区
<400> 82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 83
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8425,8431轻链可变区
<400> 83
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 84
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8426,8432轻链可变区
<400> 84
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 85
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8427,8433轻链可变区
<400> 85
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 86
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8440,8441,8442,8443轻链可变区
<400> 86
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 87
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8422,8423,8424,8425,8426,8427,8441重链可变区
<400> 87
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Val Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 88
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8428,8429,8430,8431,8432,8433,8440重链可变区
<400> 88
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Val Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 89
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8434,8435,8436,8442重链可变区
<400> 89
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Val Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 90
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8437,8438,8439,8443重链可变区
<400> 90
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Val Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 91
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链可变区
<220>
<221> X
<222> (15)..(15)
<223> X=L,V
<220>
<221> X
<222> (17)..(17)
<223> X=E,D
<220>
<221> X
<222> (20)..(20)
<223> X=S,T
<220>
<221> X
<222> (21)..(21)
<223> X=L,I
<220>
<221> X
<222> (39)..(39)
<223> X=E,K
<220>
<221> X
<222> (41)..(41)
<223> X=D,G
<220>
<221> X
<222> (44)..(44)
<223> X=I,P
<220>
<221> X
<222> (60)..(60)
<223> X=K,S
<220>
<221> X
<222> (66)..(66)
<223> X=R,G
<220>
<221> X
<222> (69)..(69)
<223> X=S,T
<220>
<221> X
<222> (71)..(71)
<223> X=Y,F
<220>
<221> X
<222> (72)..(72)
<223> X=F,T
<220>
<221> X
<222> (79)..(79)
<223> X=E,Q
<220>
<221> X
<222> (80)..(80)
<223> X=S,P
<220>
<221> X
<222> (84)..(84)
<223> X=V,A
<220>
<221> X
<222> (85)..(85)
<223> X=D,T
<220>
<221> X
<222> (100)..(100)
<223> X=A,Q
<220>
<221> X
<222> (106)..(106)
<223> X=L,I
<400> 91
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Xaa Gly
1 5 10 15
Xaa Arg Val Xaa Xaa Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Xaa Pro Xaa Gly Thr Xaa Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Xaa Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Xaa Ser Gly Xaa Asp Xaa Xaa Leu Thr Ile Ser Ser Leu Xaa Xaa
65 70 75 80
Glu Asp Phe Xaa Xaa Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Leu Glu Xaa Lys
100 105
<210> 92
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链可变区
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X=Q,V
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X=P,A
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X=V,E
<220>
<221> X
<222> (11)..(11)
<223> X=L,V
<220>
<221> X
<222> (12)..(12)
<223> X=V,K
<220>
<221> X
<222> (16)..(16)
<223> X=A,S
<220>
<221> X
<222> (20)..(20)
<223> X=M,V
<220>
<221> X
<222> (40)..(40)
<223> X=S,A
<220>
<221> X
<222> (41)..(41)
<223> X=H,P
<220>
<221> X
<222> (43)..(43)
<223> X=K,Q
<220>
<221> X
<222> (44)..(44)
<223> X=S,G
<220>
<221> X
<222> (48)..(48)
<223> X=I,M
<220>
<221> X
<222> (70)..(70)
<223> X=L,I
<220>
<221> X
<222> (72)..(72)
<223> X=V,A
<220>
<221> X
<222> (76)..(76)
<223> X=S,T
<220>
<221> X
<222> (84)..(84)
<223> X=N,S
<220>
<221> X
<222> (87)..(87)
<223> X=T,R
<220>
<221> X
<222> (91)..(91)
<223> X=S,T
<220>
<221> X
<222> (115)..(115)
<223> X=T,L
<220>
<221> X
<222> (116)..(116)
<223> X=L,V
<400> 92
Glu Val Gln Leu Xaa Gln Ser Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Pro Gly Xaa
1 5 10 15
Ser Val Lys Xaa Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Leu Glu Trp Xaa
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Xaa Thr Xaa Asp Lys Ser Xaa Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Xaa Ser Leu Xaa Ser Glu Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Val Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Xaa Xaa Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 93
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8422,8428,8434,8437轻链
<400> 93
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 94
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8423,8429,8435,8438, LB208轻链
<400> 94
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 95
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8424,8430,8436,8439 轻链
<400> 95
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 96
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8425,8431轻链
<400> 96
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 97
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8426,8432轻链
<400> 97
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 98
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8427,8433轻链
<400> 98
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 99
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8440,8441,8442,8443轻链
<400> 99
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 100
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8422,8423,8424,8425,8426,8427,8441重链
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Val Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 101
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8428,8429,8430,8431,8432,8433,8440重链
<400> 101
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Val Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 102
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8434,8435,8436,8442重链
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Val Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 103
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab8437,8438,8439,8443重链
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Val Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 104
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> mab84轻链
<400> 104
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Phe Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 105
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<400> 105
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
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Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
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Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Val Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
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225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 106
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LB209，LB204, Pem轻链
<400> 106
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 107
<211> 704
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LB209重链
<400> 107
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Val Ile Asn Pro Tyr
165 170 175
Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Gly Tyr
210 215 220
Tyr Val Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly
260 265 270
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn
275 280 285
Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
290 295 300
Met Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys
305 310 315 320
Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala
325 330 335
Tyr Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
340 345 350
Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
355 360 365
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
370 375 380
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
385 390 395 400
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
405 410 415
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
420 425 430
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
435 440 445
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
450 455 460
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
465 470 475 480
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
485 490 495
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
500 505 510
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
515 520 525
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
530 535 540
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
545 550 555 560
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
565 570 575
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
580 585 590
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
595 600 605
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
610 615 620
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
625 630 635 640
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
645 650 655
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
660 665 670
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
675 680 685
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
690 695 700
<210> 108
<211> 704
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LB204重链
<400> 108
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Ala Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
450 455 460
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val
465 470 475 480
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met
485 490 495
Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Val
500 505 510
Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly
515 520 525
Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
530 535 540
Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
545 550 555 560
Asp Asp Gly Tyr Tyr Val Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
565 570 575
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
580 585 590
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
595 600 605
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
610 615 620
Asp Ile Gly Ser Arg Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr
625 630 635 640
Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro
645 650 655
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile
660 665 670
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys
675 680 685
Ala Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
690 695 700
<210> 109
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LB217轻链
<400> 109
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
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Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
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115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser
225 230 235 240
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys
245 250 255
Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln
260 265 270
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn
275 280 285
Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr
290 295 300
Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg
305 310 315 320
Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr
325 330 335
Val Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
340 345 350
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
355 360 365
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370 375 380
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
385 390 395 400
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
405 410 415
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
420 425 430
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
435 440 445
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
450 455 460
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
465 470 475
<210> 110
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LB217，LB231,Pem重链
<400> 110
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
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<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LB231轻链
<400> 111
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Val Ile Asn Pro Tyr
165 170 175
Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Gly Tyr
210 215 220
Tyr Val Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
260 265 270
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr
275 280 285
Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
290 295 300
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro
305 310 315 320
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
325 330 335
Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser
340 345 350
Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
355 360 365
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
370 375 380
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
385 390 395 400
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
405 410 415
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
420 425 430
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
435 440 445
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
450 455 460
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
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Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
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Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Val Ile Asn Pro Tyr
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Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
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Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
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Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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435 440 445
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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
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<210> 114
<211> 697
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LB235重链
<400> 114
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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50 55 60
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Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
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Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
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Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
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Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
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Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
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Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
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Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
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Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
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Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro
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Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp
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Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu
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Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Val Glu
545 550 555 560
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
565 570 575
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile
580 585 590
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
595 600 605
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg Leu Asn
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Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala
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Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg
645 650 655
Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
660 665 670
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu Thr Phe
675 680 685
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
690 695
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<400> 115
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
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Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
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Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Val Glu Tyr Phe
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Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
340 345 350
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
355 360 365
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
370 375 380
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg Leu Asn Trp Leu
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405 410 415
Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly
420 425 430
Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
435 440 445
Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln
450 455 460
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
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225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
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Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
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Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
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Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
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Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<400> 117
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
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Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
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100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu
195 200 205
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210 215 220
Tyr Val Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
260 265 270
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser
275 280 285
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
290 295 300
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305 310 315 320
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
420 425 430
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
435 440 445
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
450 455 460
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
465 470
<210> 118
<211> 697
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LB208重链
<400> 118
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp
165 170 175
Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr
210 215 220
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln
245 250 255
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
260 265 270
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys
275 280 285
Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Val Ile Asn Pro Tyr
290 295 300
Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu
325 330 335
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Gly Tyr
340 345 350
Tyr Val Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
355 360 365
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys
370 375 380
Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
405 410 415
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
420 425 430
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
435 440 445
Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
450 455 460
Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
465 470 475 480
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
485 490 495
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
500 505 510
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
515 520 525
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
530 535 540
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
545 550 555 560
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
565 570 575
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
580 585 590
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
595 600 605
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
610 615 620
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
625 630 635 640
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
645 650 655
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
660 665 670
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
675 680 685
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
690 695
<210> 119
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nivo轻链可变区
<400> 119
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 120
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Nivo重链可变区
<400> 120
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 121
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Pem轻链可变区
<400> 121
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 122
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Pem重链可变区
<400> 122
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 123
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 连接子
<400> 123
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15

Claims (21)

1.分离的LAG-3结合蛋白，其包含抗体轻链可变区VL和抗体重链可变区VH，所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中所述LCDR1包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQID NO：27所示的氨基酸序列，所述HCDR1包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的分离的LAG-3结合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：
1)能够以1x10-9M或更低的KD值结合人LAG-3蛋白，其中所述KD值通过Biacore方法测定；
2)以20nM或更高的EC50值结合食蟹猴LAG-3蛋白；
3)基本上不结合小鼠LAG-3蛋白；
4)能够阻断LAG-3蛋白与Daudi细胞的结合；
5)能够刺激免疫细胞分泌IL2，所述IL2的分泌在ELISA测定中测得；
6)能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述VL包含SEQ IDNO：91所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述VL包含SEQ ID NO：7、80-86中任一项所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述VH包含SEQ IDNO：92所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的分离的LAG-3结合蛋白，其中所述VH包含SEQ ID NO：8、87-90中任一项所示的氨基酸序列。
7.分离的一种或多种核酸分子，其编码权利要求1-6中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白。
8.载体，其包含根据权利要求7所述的核酸分子。
9.细胞，其包含根据权利要求7所述的核酸分子或根据权利要求8所述的载体。
10.制备权利要求1-6中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白的方法，所述方法包括在使得权利要求1-6中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白表达的条件下，培养根据权利要求9所述的细胞。
11.药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体和/或权利要求9所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
12.权利要求1-6中任一项所述的分离的LAG-3结合蛋白、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的细胞和/或权利要求11所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
13.多特异性抗原结合蛋白，其包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分结合LAG-3且包含权利要求1-6中任一项所述的LAG-3结合蛋白，所述第二抗原结合部分结合不为LAG-3的其他抗原。
14.根据权利要求13任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分包括一个或多个scfv形式的所述LAG-3结合蛋白。
15.根据权利要求13-14中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合部分包含：针对所述其他抗原的抗体轻链或其片段；以及针对所述其他抗原的抗体重链或其片段。
16.根据权利要求14所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分包括一个或多个scfv形式的所述LAG-3结合蛋白，且每个所述scfv形式的LAG-3结合蛋白各自独立地与针对所述其他抗原的所述抗体轻链或其片段或者与针对所述其他抗原的所述抗体重链或其片段直接或间接连接。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中至少一个所述scfv形式的LAG-3结合蛋白与针对所述其他抗原的所述抗体轻链或其片段直接或间接连接，且至少一个所述scfv形式的LAG-3结合蛋白与针对所述其他抗原的所述抗体重链或其片段直接或间接连接。
18.根据权利要求13-17中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其包含第一多肽链及第二多肽链，其中所述第一多肽链包含下述任一项所述的氨基酸序列：SEQ ID NO：106、109、111、112、115和117；且所述第二多肽链包含下述任一项所述的氨基酸序列：SEQ IDNO：107、108、110、113、114和116。
19.根据权利要求13-18中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合部分包括一个或多个scfv形式的所述其他抗原结合蛋白，且所述一个或多个scfv形式的其他抗原结合蛋白结合不为LAG-3的所述其他抗原。
20.根据权利要求19所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分包含权利要求1-6中任一项所述的LAG-3结合蛋白，所述LAG-3结合蛋白包含针对LAG-3的抗体轻链或其片段，以及针对LAG-3的抗体重链或其片段。
21.根据权利要求13-20中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其包含第一多肽链及第二多肽链，其中所述第一多肽链包含下述任一项所述的氨基酸序列：SEQ ID NO：94；且所述第二多肽链包含下述任一项所述的氨基酸序列：SEQ ID NO：118。
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