CN111867630B - 靶向cldn18.2的抗体、双特异性抗体、adc和car及其应用 - Google Patents

靶向cldn18.2的抗体、双特异性抗体、adc和car及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111867630B
CN111867630B CN201980019477.5A CN201980019477A CN111867630B CN 111867630 B CN111867630 B CN 111867630B CN 201980019477 A CN201980019477 A CN 201980019477A CN 111867630 B CN111867630 B CN 111867630B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
heavy chain
light chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201980019477.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111867630A (zh
Inventor
刘佳建
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
L&l Biopharma Co ltd
Original Assignee
L&l Biopharma Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from CN201810610790.3A external-priority patent/CN110606891B/zh
Priority claimed from CN201811295845.2A external-priority patent/CN111110862A/zh
Priority claimed from CN201910108951.3A external-priority patent/CN111518214B/zh
Priority claimed from CN201910276473.7A external-priority patent/CN111848809A/zh
Application filed by L&l Biopharma Co ltd filed Critical L&l Biopharma Co ltd
Publication of CN111867630A publication Critical patent/CN111867630A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111867630B publication Critical patent/CN111867630B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/537—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines spiro-condensed or forming part of bridged ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供了一种靶向CLDN18.2的抗体，其包含VL和/或VH，所述VL包含以下的CDR序列：如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的VL CDR1氨基酸序列；如SEQ ID NO:13所示的VL CDR2氨基酸序列；如SEQ ID NO:14所示的VL CDR3氨基酸序列；所述VH包含以下的CDR序列：如SEQ ID NO:15所示的VH CDR1氨基酸序列；如SEQ ID NO:16所示的VH CDR2氨基酸序列；如SEQ ID NO:17所示的VH CDR3氨基酸序列。还公开了一种靶向CLDN18.2的双特异性抗体、上述抗体的偶联体、靶向CLDN18.2的CAR分子及含其的细胞，以及他们的应用。

Description

靶向CLDN18.2的抗体、双特异性抗体、ADC和CAR及其应用
本申请要求申请日为2018年6月17日的中国专利申请CN 201810610790.3、2018年11月01日的中国专利申请CN 201811295845.2、2019年02月03日的中国专利申请CN201910108951.3、2019年04月08日的中国专利申请CN 201910276473.7的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种靶向CLDN 18.2的抗体、双特异性抗体、ADC和CAR及其应用。
背景技术
癌症是人类健康的巨大威胁，也是疾病领域导致死亡的重要原因之一。癌症治疗经历手术、化疗、靶向药物、肿瘤免疫治疗、联合治疗等各阶段的发展后，近年已经取得了巨大成就。在众多的癌症患者中，肺癌、胃癌、胰腺癌、食道癌和卵巢癌等癌症患者的治疗手段仍然高度未满足。针对这些肿瘤的治疗手段，包括大分子靶向药物如新的单克隆抗体，以及这些单克隆抗体和已有的肿瘤免疫治疗手段，如与免疫检查点抑制剂PD-1、PD-L1抗体联合治疗，为巨大的未满足的临床治疗的需求提供了新的可能和选择。
细胞连接密蛋白(密蛋白，Claudin或CLDN)在人、鼠等物种中都有表达，是细胞间层密封关联蛋白，在控制对细胞层间离子流、维持细胞极性和细胞间信号转递具有重要作用。CLDN家族蛋白已经发现的有29种之多，CLDN18就是其中之一。CLDN18有两个同源分子，分别称为密蛋白18.1(CLDN18.1)和密蛋白18.2(CLDN18.2)。人密蛋白18.1(hCLDN18.1)和人密蛋白18.2(hCLDN18.2)高度同源，氨基酸同源性高达92％。hCLDN18.2在正常组织表达非常有限，仅见于胃黏膜分化上皮细胞，但在胃癌包括转移胃癌组织有特别的高表达(Sahin U.et al.Claudin-18 splice variant 2 is a pan-cancer target suitablefor therapeutic antibody delveopment.Clin Cancer Res.2008；14(23)：7642-34)。进一步发现，CLDN18.2在不同癌症，包括大约70％的胃癌、50％的胰腺癌、30％的食道癌、25％的肺癌和卵巢癌等的患者组织都有表达。因此，CLDN18.2早已经成为理想的肿瘤患者标记物和抗肿瘤药物开发靶点，特别是靶向CLDN18.2的抗体开发用于肿瘤治疗，但因为靶点的特殊性，开发针对CLDN18.2治疗性抗体非常困难。人CLDN18.2蛋白全长261个氨基酸，见NCBI公开序列NP_001002026.1 claudin-18 isoform 2，其中1-23为信号肽。CLDN18.2蛋白是一个跨膜蛋白，有两个膜外区域分别为信号肽后面大约55个氨基酸的胞外区1(Extracellularloop 1，ECL1)和23个氨基酸ECL2。这一结构和人CLDN18.1非常相似，而且人CLDN18.2和人CLDN18.1的ECL2区域则完全相同。因而针对人CLDN18.2蛋白靶点抗体的开发，需要寻找针对人CLDN18.2蛋白的ECL1区域或空间结构的抗体。这使得这方面的工作变得更加困难。
此外，针对人CLDN18.2膜蛋白的抗体发挥其功效至少包括诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长，通过和病人免疫细胞的效应作用，包括抗体依赖细胞毒性(ADCC)，和补体依赖细胞毒性(CDC)效应细胞介导的杀伤肿瘤细胞作用。而要寻找这样功能的抗体会更加困难。目前针对人CLDN18.2抗体研究只有IMAB362抗体(参见WO 2014/146672)在临床试验阶段。IMAB362是针对人CLDN18.2的抗体，是人、鼠源嵌合抗体，存在免疫原性风险，亲和力不很高。细胞学实验证明其无内吞活性，不适合做ADC开发，且治疗效果极为有限，这在本发明的肿瘤模型药效评价中也得到了验证。此外，针对CLDN18.2靶点还没有进入临床或前期研发的双特异抗体。针对CLDN18.2靶点目前还没有在临床上开发的抗体药物偶联体(antibody drug conjugates，ADC)药物。嵌合抗原受体(CAR)T细胞(简称CART或CAR-T)是从患者体内分离出T细胞，在体外利用CAR改造修饰T细胞，使其能够特异性识别癌细胞，将改造后的CART细胞扩增、回输至患者体内，达到治疗肿瘤的效果。CN201410341504.X公开了一种及靶向CLD18A2(即Claudin18.2)的T淋巴细胞及其制备方法和应用，也有临床数据报道，但是CART药效和安全性还有很大的提升空间。
因此，本领域缺乏有效的靶向人CLDN18.2蛋白的抗体特别是人源化的抗体，以及细胞活性、PK活性和动物药效等更好的抗体、双特异性抗体、抗体药物偶联体(ADC)药物，以及更加有效的嵌合抗原受体(CAR)及含其的细胞。
发明内容
为克服本领域缺乏靶向CLDN18.2的抗体、双特异抗体、抗体药物偶联体和CAR分子的缺陷的技术问题，提供了一种靶向CLDN18.2的抗体、人源化抗体、双特异性抗体及其抗体药物偶联体、CAR分子及其制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明第一方面的技术方案为：一种靶向CLDN18.2的抗体，其包含轻链可变区(VL)和/或重链可变区(VH)，所述VL包含以下的互补决定区(CDR)序列：
如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的VL CDR1氨基酸序列；如SEQ ID NO：13所示的VL CDR2氨基酸序列；如SEQ ID NO：14所示的VL CDR3氨基酸序列；
所述VH包含以下的CDR序列：
如SEQ ID NO：15所示的VHCDR1氨基酸序列；如SEQ ID NO：16所示的VH CDR2氨基酸序列；如SEQ ID NO：17所示的VH CDR3氨基酸序列。
所述靶向CLDN18.2的抗体和人、鼠CLDN18.2特异结合活性更好，Emax更高；亲和力(KinExA)高(优选达到了10pM级)；人血细胞中CDC活性更好；诱导CLDN18.2+细胞凋亡活性更好，抑制肿瘤细胞生长活性更好，动物药效更优，且体内药物代谢(PK)好，特别是更长的T1/2。其和鼠CLDN18.2有更好的结合活性。
在一优选的实施例中，如上所述的靶向CLDN18.2的抗体，所述VL包含如SEQ IDNO：11所示的VL CDR1、SEQ ID NO：13所示的VL CDR2和SEQ ID NO：14所示的VL CDR3的氨基酸序列；所述VH包含如SEQ ID NO：15所示的VH CDR1、SEQ ID NO：16所示的VH CDR2和SEQID NO：17所示的VH CDR3的氨基酸序列；或，
所述VL包含如SEQ ID NO：12所示的VL CDR1、SEQ ID NO：13所示的VL CDR2和SEQID NO：14所示的VL CDR3的氨基酸序列；所述VH包含如SEQ ID NO：15所示的VH CDR1、SEQID NO：16所示的VH CDR2和SEQ ID NO：17所示的VH CDR3的氨基酸序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述靶向CLDN18.2的抗体，其中所述抗体的CDR区为脱氨基化敏感位点优化的CDR序列；优选地，所述CDR区脱氨基化敏感位点优化的CDR序列为轻链CDR序列；优选地，所述CDR区脱氨基化敏感位点优化的CDR序列为轻链CDR1第L30A和/或L30B位优化的CDR1序列。
在本发明的一个优选的实施方案中，提供一种如上所述靶向CLDN18.2的抗体，其中所述抗体的轻链CDR1第L30A和/或L30B的NS突变为NT，且前提是第L30E位不为Q和第L34位不为T。
在本发明的一个优选的实施方案中，提供一种如上所述靶向CLDN18.2的抗体，其中所述抗体的轻链CDR1第L30A和/或L30B的NS突变为NT，且前提是突变前所述轻链CDR1为如SEQ ID NO：12所示的序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述靶向CLDN18.2的抗体，其中所述抗体的CDR区为脱氨基化敏感位点优化的CDR序列；优选地，所述CDR区脱氨基化敏感位点优化的CDR序列为重链CDR序列；优选地，所述CDR区脱氨基化敏感位点优化的CDR序列为重链CDR3第H99和/或H100位优化的CDR序列。
在本发明的一个优选的实施方案中，提供一种如上所述靶向CLDN18.2的抗体，其中所述抗体的重链CDR3第H99和/或H100位的NS突变为NT，且前提是轻链CDR1第L30E位不为Q和第L34位不为T。
在本发明的一个优选的实施方案中，提供一种如上所述靶向CLDN18.2的抗体，其中所述抗体的重链CDR3第H99和/或H100位的NS突变为NT，且前提是突变前所述轻链CDR1为如SEQ ID NO：12所示的序列。
其中，如上所述的轻链CDR1第L30A、L30B、L30E和L34位，重链CDR3第H99和H100位以Kabat编号规则定义。
在一优选的实施例中，如上所述的靶向CLDN18.2的抗体，所述靶向CLDN18.2的抗体为鼠源抗体；所述鼠源CLDN18.2抗体经亲和力(affinity)成熟，其亲和力提高3-10倍或以上，优选10倍或以上。
优选地，所述鼠源抗体的VL为如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列或其突变；和/或，所述鼠源抗体的VH为如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或其突变；
所述突变为所述VL和/或VH的氨基酸序列上发生了一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或添加，且所述突变的氨基酸序列与所述VL和/或VH的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，并保持或改善了所述抗体与CLDN18.2的结合；所述至少85％序列同一性优选为至少90％序列同一性；更优选为至少95％序列同一性；最优选为至少99％序列同一性。
在一优选的实施例中，如上所述的靶向CLDN18.2的抗体，所述靶向CLDN18.2的抗体包含鼠源抗体的可变区和鼠或人抗体恒定区；所述鼠抗体恒定区包括鼠IgG1、IgG2a、IgG2b3或IgG3的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区，所述人抗体恒定区包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区。
优选地，所述靶向CLDN18.2的抗体为鼠源抗体的可变区和人抗体恒定区组合成的嵌合抗体。所述嵌合抗体经亲和力(affinity)成熟，其亲和力提高3-10倍或以上，优选10倍或以上。
更优选地，所述嵌合抗体的轻链氨基酸序列为如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或其突变；和/或，所述嵌合抗体的重链氨基酸序列为如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或其突变。
在一优选的实施例中，如上所述的靶向CLDN18.2的抗体，所述靶向CLDN18.2的抗体为人源化抗体。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述靶向CLDN18.2的抗体，其中所述人源化抗体的轻链可变区框架(FR)序列选自人种系轻链序列，FR序列优选包含1-10个氨基酸回复突变。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述靶向CLDN18.2的抗体，其中所述人源化抗体的轻链可变区CDR序列可以分别按照CCG、Kabat、Chothia、AbM或Contact等编号规则定义，所述CDR序列包含表4-表8所列轻链CDR序列或其突变。
优选地，所述人源化抗体的VL包含如SEQ ID NO：29-33中任一个所示的氨基酸序列或其突变；所述突变为所述VL和/或VH的氨基酸序列上发生了一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或添加，且所述突变的氨基酸序列与所述VL和/或VH的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，并保持或改善了所述抗体与CLDN18.2的结合；所述至少85％序列同一性优选为至少90％序列同一性；更优选为至少95％序列同一性；最优选为至少99％序列同一性。
更优选地，轻链CDR1第L30E和L34位优化(突变)成人种系CDR1相应位点的氨基酸。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述靶向CLDN18.2的抗体，其中所述人源化抗体的重链可变区框架(FR)序列选自人种系重链序列，FR序列优选包含0-10个氨基酸回复突变。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述靶向CLDN18.2的抗体，其中所述人源化抗体的重链可变区CDR序列可以分别按照CCG、Kabat、Chothia、AbM或Contact等编号规则定义，所述CDR序列包含表4-表8所列重链CDR序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述靶向CLDN18.2的抗体，其中所述人源化抗体的重链可变区序列包含SEQ ID NO：34-37中任一个所示的氨基酸序列或其突变。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述靶向CLDN18.2的抗体，其中所述人源化抗体包含序列为SEQ ID NO：29-33中任一个所示的氨基酸序列或其突变的轻链可变区和序列为SEQ ID NO：34-37中任一个所示的氨基酸序列或其突变的重链可变区的组合。
在一优选的实施例中，如上所述的靶向CLDN18.2的抗体，所述抗体的轻链包含选自人抗体κ或λ型轻链恒定区或其突变；和/或，所述抗体的重链包含选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区或其突变；
优选地，所述重链恒定区或其变体，包含人IgG1 Fc区第234位、第235位和第243位，或第239、第330和第332位突变；
更优选地，所述重链恒定区或其变体，包含人IgG1 Fc区第356-358位为EEM或DEL的变体。
在一优选的实施例中，如上所述的靶向CLDN18.2的抗体，所述轻链包含SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列或其突变；和/或，
所述重链包含SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44或SEQID NO：46所示的氨基酸序列或其突变。
在一优选的实施例中，如上所述的靶向CLDN18.2的抗体，其包含以下轻链和重链：
所述重链如SEQ ID NO：39的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ ID NO：38的氨基酸序列所示；或，所述重链如SEQIDNO：39的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQIDNO：40的氨基酸序列所示；或，所述重链如SEQ ID NO：41的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ ID NO：38的氨基酸序列所示；或，所述重链如SEQ ID NO：41的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ ID NO：40的氨基酸序列所示；或，所述重链如SEQ ID NO：39的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ IDNO：42的氨基酸序列所示；或，所述重链如SEQ ID NO：43的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQID NO：42的氨基酸序列所示；或，所述重链如SEQ ID NO：44的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ ID NO：42的氨基酸序列所示；或，所述重链如SEQ ID NO：43的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ ID NO：45的氨基酸序列所示；或，所述重链如SEQ ID NO：44的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ ID NO：45的氨基酸序列所示；或，所述重链如SEQ ID NO：39的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ ID NO：45的氨基酸序列所示；或，所述重链如SEQ ID NO：46的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ ID NO：38的氨基酸序列所示。
在一优选的实施例中，如上所述的靶向CLDN18.2的抗体，其中所述靶向CLDN18.2的抗体包括免疫球蛋白、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段(scFv)。
为解决上述技术问题，本发明的第二方面的技术方案为：提供一种双特异性抗体，其包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，所述第一蛋白功能区为如第一方面的技术方案所述的靶向CLDN18.2的抗体；所述第二蛋白功能区为靶向非CLDN18.2抗原的抗体。所述的双特异性抗体既能保留单个CLDN18.2抗体所具有的结合活性、功能活性，也能够保持另一个蛋白功能区的结合和功能活性。而且，所述双特异性抗体结构类似正常IgG抗体，可以按常规抗体表达纯化方法，完成表达和纯化，并且稳定。
本发明的双特异性抗体为序列特异的IgG结构类似的双特异抗体(Sequence-based IgG like bispecific antibody，SBody)。
在一具体实施例中，如上所述的双特异性抗体，所述非CLDN18.2抗原为免疫检查点抗原或肿瘤治疗靶点，所述免疫检查点抗原包括PD-1、PD-L1、Tim3、LAG3、CD47；所述肿瘤治疗靶点包括SIRPα(signal regulatory protein α，信号调节蛋白α)等，SIRPα是一种膜蛋白，主要在髓系细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞等表达。更优选地，所述第二蛋白功能区包括抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗Tim3抗体、抗LAG3抗体、抗CD47抗体、抗CD3抗体和抗CSF-1R抗体。最优选地，所述抗PD-1抗体为Nivolumab(简称Nivo)、Pembrolizumab(简称Pem)或者Ba08(即专利申请CN201410369300中所述Ba08-1)。所述抗PD-L1抗体为Atezolumab(简称Atezo)、Avelumab(简称Avel)或者Durvalumab(简称Durv)，所述抗CD3抗体为Blincyto或AMG420中结合CD3的轻、重链可变区序列构建的抗体。
或，所述第二蛋白功能区为细胞因子和细胞因子受体或它们的片段；优选地，所述细胞因子或它的片段包括TGFβ、IL10和CSF-1，所述细胞因子受体或它的片段包括TGFβRII、IL10受体和巨噬细胞集落刺激因子1受体(CSF-1R)。
在一些具体实施例中，如上所述的双特异性抗体，所述抗体为免疫球蛋白、scFv(single chain Fv，也称为单链可变片段)、Fab、Fab’或F(ab’)2。较佳地，所述免疫球蛋白的恒定区为人抗体恒定区，所述人抗体恒定区包括人抗体轻链恒定区和人抗体重链恒定区，所述人抗体轻链恒定区优选κ链或者λ链，所述人抗体重链恒定区优选hIgG1、hIgG2或者hIgG4。
为了设计生产工艺简单且保留有效活性的双特异抗体，本发明的双特异性抗体的形式为类似正常IgG的结构，具体地，在其结构上设计能够靶向两个靶点的轻链和/或者重链可变区的蛋白功能区，两个蛋白功能区共享相同的重链Fc区域。较佳地，将一个靶点的抗体分子以一个或者多个scFv的形式，或者完整的细胞因子或它的片段，或者完整的细胞因子受体或它的片段，连到另一靶点完整抗体的轻链或重链的一端。这样既避免表达不同重链Fc和/或不同轻链带来表达产物的不均一，例如Knob形式的Fc和Hole形式的Fc共表达，其表达过程中会有不均一的Fc-Fc配对形式，给纯化工艺带来很多不便利；也可以避免轻、重链部分区域交换(cross)设计可能对结构活性的影响，以及工艺过程中出现的Fc错配现象。通过一个或者多个scFv设计，还可以调节针对特定靶点的活性。
在一些具体实施例中，如上所述的双特异性抗体，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为一个或多个scFv、细胞因子或它的片段、或细胞因子受体或它的片段；或者，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白，所述的第一蛋白功能区为一个或多个scFv；其中，所述scFv包括重链可变区与轻链可变区，所述重链可变区与轻链可变区通过连接子连接，所述连接子优选(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)w[以下简称(G4S)w]；所述scFv、细胞因子或它的片段、或细胞因子受体或它的片段通过连接子与所述免疫球蛋白连接，所述连接子选白可以是本领域常见的肽段或(G4S)w；所述的w优选为0～10之间的整数，更优选为1、2、3或者4。
所述双特异设计概括(通式1)如下表。
表01双特异性抗体的设计
表01中，含轻链的序列指该序列除了包括轻链序列以外，还可以包括与轻链序列连接的scFv；含重链的序列指该序列除了包括重链序列以外，还可以包括与重链序列连接的scFv。为表述方便，表中的scFv在本文中如非特别指明，除本领域技术人员理解的含义外，还可以是细胞因子和细胞因子受体或它们的片段的序列。其中，T1代表针对靶点1的第一蛋白功能区，T2代表针对靶点2的第二蛋白功能区。T1(scFv)代表针对靶点1抗体的scFv序列；T2(scFv)代表针对靶点2抗体的scFv序列。
(scFv)n1，(scFv)n2，(scFv)n3，(scFv)n4中的n1，n2，n3，n4分别为自然数，可以是0、1、2、3等，在本发明的具体实施例中，n1，n2，n3，n4中其中至少1个数值为1，其余为0。VL，代表针对靶点1或者2的抗体轻链可变区序列；VH，代表针对靶点1或者2的抗体重链可变区序列。Lc，代表轻链(κ或者λ)的恒定区序列，优选人轻链恒定区序列；Hc代表重链，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等的恒定区序列，优选人的重链恒定区序列。重链恒定区C末端连接scFv或其它蛋白序列的时候，其C末端末位氨基酸K可以突变，优选突变为A。由此，在方案1中，T1为免疫球蛋白，T2为scFv；在方案2中，T2为免疫球蛋白，T1为scFv；scFv针对的靶点相同；在方案3、4中，两端的scFv针对两个不同的靶点。
当表01中的scFv为常规的scFv，即其不为细胞因子和细胞因子受体或它们的片段的序列时，所述scFv为轻链可变区-连接子-重链可变区，其轻链可变区N末端或重链可变区C末端通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端；或所述scFv为重链可变区-连接子-轻链可变区，其重链可变区N末端或者轻链可变区C末端通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端。
需说明的是，当上述scFv为轻链可变区-连接子-重链可变区时，其连接方式为轻链可变区的C末端与连接子连接，所述连接子再与重链可变区的N末端连接，从而将scFv轻链可变区的N末端和重链可变区的C末端暴露出来，使其可以通过连接子与免疫球蛋白的轻链和或重链连接。在本发明中，当其连接免疫球蛋白的轻链时，在一些具体的实施例中优选地使用scFv的重链可变区的C末端通过连接子与免疫球蛋白轻链的N末端连接；当其连接免疫球蛋白的重链时，在一些具体的实施例中优选地使用scFv的轻链可变区的N末端与免疫球蛋白重链的C末端连接。
当所述scFv为重链可变区-连接子-轻链可变区时，其连接方式为轻链可变区的N末端与连接子连接，所述连接子再与重链可变区的C末端连接，从而将scFv轻链可变区的C末端和重链可变区的N末端暴露出来，使其可以通过连接子与免疫球蛋白的轻链和或重链连接。在此情况下，当其连接免疫球蛋白的轻链时，在一些具体的实施例中优选地使用scFv的轻链可变区的C末端与免疫球蛋白轻链的N末端连接；当其连接免疫球蛋白的重链时，在一些具体的实施例中优选地使用scFv的重链可变区的N末端与免疫球蛋白重链的C末端连接。优选地，所述连接子为(G4S)3，和/或，所述scFv的数量为两个，对称地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链。
更佳地，所述的双特异性抗体选自以下任一种：
(1)所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包括轻链如SEQ ID NO：38所示、重链如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列；所述第二蛋白功能区为scFv；其中，
两个scFv的重链可变区的C末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的N末端；且，所述scFv的轻链可变区为Atezo的轻链可变区，所述scFv的重链可变区为Atezo的重链可变区；或，
两个scFv的重链可变区的C末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链可变区的N末端；且，所述scFv的轻链可变区为Hu5F9的轻链可变区，所述scFv的重链可变区为Hu5F9的轻链可变区；或，
两个scFv的重链可变区的N末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的C末端；且，所述scFv的轻链可变区为AMG420的轻链可变区，所述scFv的重链可变区为AMG420的重链可变区。
此外，所述的双特异性抗体还可以包括以下结构，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包括轻链如SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：42所示、重链如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列；所述第二蛋白功能区为scFv：
所述scFv的轻链可变区为iMab的轻链可变区(即WO2018075857_4序列)，重链可变区为iMab的重链可变区(即WO2018075857_3序列)；或，所述scFv的轻链可变区的序列为Tim3的轻链可变区(如专利申请CN201710348699.4中的SEQ ID NO：27所示)，所述scFv的重链可变区为Tim3的重链可变区(如专利申请CN201710348699.4中的SEQ ID NO：36所示)；或，所述scFv的轻链可变区的序列为BlincytoCD3的轻链可变区，所述scFv的重链可变区为BlincytoCD3的重链可变区；或，所述scFv的轻链可变区的序列为Pem的轻链可变区，所述scFv的重链可变区为Pem的重链可变区；或，
(2)所述第一蛋白功能区为scFv，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白；两个scFv的重链可变区的C末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的N末端；所述scFv的轻链可变区的序列如SEQ ID NO：29所示，所述scFv的重链可变区的序列如SEQ IDNO：34所示；其中，
所述免疫球蛋白包括Nivo的轻链可变区、轻链恒定区为κ链、Nivo的重链可变区以及重链恒定区为hIgG4的氨基酸序列；或，
所述免疫球蛋白包括Pem的轻链可变区、轻链恒定区为κ链、Pem的重链可变区以及重链恒定区为hIgG4的氨基酸序列；或，
所述免疫球蛋白包括Atezo的轻链可变区、轻链恒定区为κ链、Atezo的重链可变区以及重链恒定区为hIgG1的氨基酸序列。
同样地，所述的双特异性抗体还可以包括以下免疫球蛋白：所述第一蛋白功能区为scFv，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白，轻链恒定区为κ链、重链恒定区为hIgG1的氨基酸序列；其中，所述免疫球蛋白的轻链可变区为iMab的轻链可变区(即WO2018075857_4序列)，重链可变区为iMab的重链可变区(即WO2018075857_3序列)；或，所述免疫球蛋白的轻链可变区为Tim3的轻链可变区(如专利申请CN201710348699.4中的SEQ ID NO：27所示)，所述免疫球蛋白的重链可变区为Tim3的重链可变区(如专利申请CN201710348699.4中的SEQID NO：36所示)；或，所述免疫球蛋白的轻链可变区为Hu5F9的轻链可变区，重链可变区为Hu5F9的轻链可变区；所述免疫球蛋白的轻链可变区的序列为Avel的轻链可变区，所述免疫球蛋白的重链可变区为Avel的重链可变区；或，所述免疫球蛋白的轻链可变区的序列为BlincytoCD3的轻链可变区，所述免疫球蛋白的重链可变区为BlincytoCD3的重链可变区。
当表01中T1(scFv)，T2(scFv)中的scFv为细胞因子或它的片段、或细胞因子受体或它的片段时，其结构为连接子(Linker)-细胞因子受体及其变体序列，或者细胞因子及其变体序列-Linker。Linker的另一端连接免疫球蛋白的轻链和或重链的N和或C末端，优选(G4S)w，w为0、1、2、3、4；优选w＝3或w＝4。
在一具体的实施例中，如上所述的双特异性抗体，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为细胞因子或它的片段、或细胞因子受体或它的片段；所述细胞因子或它的片段、或细胞因子受体或它的片段的数量优选为两个或四个；其通过连接子对称地与所述免疫球蛋白两条轻链和/或两条重链的C末端和/或N末端连接，所述连接子优选为(G4S)3；
优选地，所述免疫球蛋白包括轻链如SEQ IDNO：38所示；重链如SEQ IDNO：39所示的氨基酸序列；其中，
所述细胞因子或它的片段、或细胞因子受体或它的片段为TGFβRII，其序列如SEQID NO：1所示，且数量为两个；所述TGFβRII对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的C末端，其C末端氨基酸由K突变为A；或，
所述细胞因子或它的片段、或细胞因子受体或它的片段为IL10，其序列如SEQ IDNO：2所示，且数量为两个；所述IL10对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的C末端，其C末端氨基酸由K突变为A。
在一些较佳的具体实施例中，如上所述的双特异性抗体，所述的双特异性抗体包括以下轻链氨基酸序列和含重链的氨基酸序列：
如SEQ ID NO：53所示的轻链氨基酸序列，如SEQ ID NO：54所示的含重链的氨基酸序列；或，如SEQ ID NO：55所示的轻链氨基酸序列，如SEQ ID NO：56所示的含重链的氨基酸序列；或，如SEQ ID NO：38所示的轻链氨基酸序列，如SEQ ID NO：57所示的含重链的氨基酸序列；或，如SEQ IDNO：38所示的轻链氨基酸序列，如SEQ IDNO：58所示的含重链的氨基酸序列；或，如SEQ ID NO：38所示的轻链氨基酸序列，如SEQ ID NO：59所示的含重链的氨基酸序列；或，如SEQ ID NO：38所示的轻链氨基酸序列，如SEQ ID NO：60所示的含重链的氨基酸序列；或，如SEQ ID NO：38所示的轻链氨基酸序列，如SEQ ID NO：61所示的含重链的氨基酸序列；或，如SEQ ID NO：38所示的轻链氨基酸序列，如SEQ ID NO：4所示的含重链的氨基酸序列。
或者，本发明所述的双特异性抗体为DVD-Ig(Dual-variable domain Ig)双特异性抗体，其结构是在正常抗体轻、重链的N末端分别再接入另一个抗体的VL和VH，通过两个抗体可变区结合双靶点实现双功能。
所述双特异性抗体的设计概括(通式2)如下表
表02双特异性抗体的DVD结构设计
T1、T2分别代表针对靶点1和靶点2。表02中，含轻链的序列指该序列除了包括正常完整的轻链序列以外，还包括另一个轻链可变区序列。含重链的序列指该序列除了包括正常完整的重链序列以外，还包括另一个重链可变区序列。轻链可变区和完整的轻链之间、重链可变区和完整的重链之间通过连接子(Linker)连接。
在一具体实施例中，所述的双特异性抗体为DVD-Ig双特异性抗体。较佳地，所述第二蛋白功能区包含正常抗体完整的轻链和重链，所述第一蛋白功能区包含轻链可变区和重链可变区；或，所述第一蛋白功能区包含正常抗体完整的轻链和重链，所述第二蛋白功能区包含轻链可变区和重链可变区。更佳地，所述轻链与所述轻链可变区之间，所述的重链与所述的重链可变区之间均通过连接子连接；所述的连接子优选(G4S)w，所述的w优选为0～10之间的整数，更优选为1、2、3或者4。
在一优选的具体实施例中，所述的双特异性抗体由含轻链的序列和含重链的序列组成。所述的双特异性抗体选自以下组合：含轻链的序列为Ab10VL-(G4S)3-NivoVL-Lc(κ链)，含重链的序列为Ab10VH-(G4S)3-NivoVH-Hc(hIgG4)；或，含轻链的序列为AtezoVL-(G4S)3-Ab10VL-Lc(κ链)，含重链的序列为AtezoVH-(G4S)3-Ab10VH-Hc(hIgG1)；或，含轻链的序列为Hu5F9VL-(G4S)3-Ab10VL-Lc(κ链)，含重链的序列为Hu5F9VH-(G4S)3-Ab10VH-Hc(hIgG1)。
或者，本发明所述的双特异性抗体为包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，其中之一的蛋白功能区为免疫球蛋白，另一蛋白功能区为Fab’或F(ab’)2。
为解决上述技术问题，本发明的第三方面技术方案为：提供一种抗体药物偶联体(ADC)，其结构如下式I所示：
Ab-[(L2)n-L1-D]y 式I
其中，D为具有细胞毒性的小分子药物，L1和L2为分别连接所述药物和所述抗体的接头；n为0或1；y表示偶联于Ab的D的平均数，且0＜y≤10，优选2≤y≤7；更优选3≤y≤6；最优选4.4或4.8；
所述Ab为如本发明的第一方面所述的靶向CLDN18.2的抗体，或如本发明的第二方面所述的双特异性抗体。
在抗体的药物偶联体的制备过程中，依据偶联的方法，如果是定点偶联，则抗体携带药物的数量确定，抗体药物偶联体则可以是单一产物(非混合物)。如果是位点随机偶联，不同抗体上携带的药物偶联体分子数量实际上是不同的，因此本发明所述的抗体的药物偶联体实为一种混合物，且通式中的y反映了混合物中抗体携带药物偶联体的平均值。其在数值计算后通常表现为非整数的正数，例如4.4或4.8。来自偶联反应的ADC制剂中的每个抗体的药物部分的平均数可以通过常规方法例如质谱法、ELISA测定和HPLC来表征。还可以测定ADC的定量分布，在一些情况下，将y为某个值的均匀ADC从具有其它载药量的ADC分离、纯化和表征可以通过诸如逆相HPLC或电泳的方法来实现。
本发明的通式中，接头L2若存在(即n为1)，则L2、L1和D的数量相同，此时抗体的药物偶联体为Ab-[L2-L1-D]y；若L2不存在(即n为0)，即仅包括一种接头的情况下，L1和D的数量相同，此时抗体的药物偶联体实际应为Ab-[L1-D]y。此外，本发明通式所示的抗体的药物偶联体实为理想状态下的抗体的药物偶联体，即通式只考虑了连接有连接子L1的L2(若存在)的数量、连接有D的L1的数量。而本领域技术人员皆知，在实际合成的抗体的药物偶联体中，应存在未连接D的接头，因此抗体实际偶联的药物分子的平均数量应≤y，即y为偶联至抗体的药物的理论最大值。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种抗体药物偶联体，所述小分子药物为选自毒素、化疗剂、抗生素、放射性同位素和核溶酶的细胞毒剂。
优选地，所述小分子药物选自以下组：单甲基澳瑞他汀(monomethylauristatin)、美登素(maytansine)类生物碱、喜树碱类生物碱、加利车霉素、多柔比星(阿霉素)、多卡霉素(duocarmycin)，或其组合。更优选地，所述单甲基澳瑞他汀为单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，所述美登素类为N2′-脱乙酰基-N2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DMl)，N2′-脱乙酰基-N2′-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM3)和N2′-脱乙酰基-N2′-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种抗体药物偶联体，所述L1选自可切割接头、不可切割接头、亲水接头、预先带电荷的接头和基于二羧酸的接头。优选地，所述接头选自N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、6-马来酰亚氨基己酰基(MC)、马来酰亚氨基丙酰基(MP)、缬氨酸-瓜氨酸(VC)、丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)、对氨基苄氧羰基(PAB)和MC-VC-PAB。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种抗体药物偶联体，所述L2为以下式II所示的化合物：
其中，X1选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；
X2选自烷基、环烷基和杂环基；m为0-5；S为硫原子；
优选地，当X1为氢原子、X2为烷基、m为1时，式II所示的化合物为硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种抗体药物偶联体，所述小分子药物为DM1，所述接头L1为SMCC，n为0，由此形成如下式III所示的抗体药物偶联体：
或，所述小分子药物为MMAF，所述接头L1为MC-VC-PAB，L2为硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯，n为1，由此形成如下式IV所示的抗体药物偶联体：
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的抗体的药物偶联体，在一些实施方式中，与接头连接的单个抗体分子缀合的细胞毒剂或小分子药物的数量y(或载荷，或DAR)为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，但由于连接反应的特殊性，连接有接头的抗体上缀合的小分子药物的DAR实际上为介于0至10、1至8、2至7、3至6或4至5的平均值。即本发明的抗体偶联物实为抗体连接了不同数目的接头-药物或仅接头的混合物，因此y值为药物偶联数目的平均值且数值为整数或非整数。在某些实施方案中，本发明ADC的药物载荷的范围为1到约8；约2到约7；约3到约6；约4到约5；约4.1到约4.9；约4.2到约4.8；约4.3到约4.7；约4.4到约4.6；约4.4、4.6或约4.8。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种抗体药物偶联体，其为如下式V所示的抗体药物偶联体：
或，如下式VI所示的抗体药物偶联体：
或，如下式VII所示的抗体药物偶联体：
或，如下式VIII所示的抗体药物偶联体：
其中，所述Ab10包含如SEQ ID NO：38所示的轻链和如SEQ ID NO：39所示的重链；所述Ab6包含如SEQ ID NO：42所示的轻链和如SEQ ID NO：39所示的重链。
为解决上述技术问题，本发明的第四方面的技术方案为：提供一种所述的抗体药物偶联体的制备方法，
当n为1时，所述制备方法包括以下步骤：
(1)制备中间体1：取所述抗体与所述接头L2在溶液中混合，反应后纯化即得含中间体1的溶液，所述中间体1如下式IX所示：
其中，X1选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；
X2选自烷基、环烷基和杂环基；m为0-5；S为硫原子；
优选地，X1为氢原子，X2为烷基，m为1，即L2为硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯；
(2)制备中间体2：取所述接头L1与所述药物制备成中间体2：L1-D；
(3)将步骤(1)获得的含中间体1的溶液，与步骤(2)获得的含中间体2的溶液混合，反应后纯化即得含抗体药物偶联体的溶液；
当n为0时，所述制备方法包括以下步骤：
(1)制备中间体3：取所述抗体与所述接头L1在溶液中混合，反应后纯化即得含中间体3的溶液；
(2)将步骤(1)获得的含中间体3的溶液，与含所述药物的溶液混合，反应后纯化即得含抗体药物偶联体的溶液；
优选地，所述步骤(1)和/或(2)中，所述反应温度为25℃；所述反应时间为2～4小时；和/或，所述纯化为用凝胶过滤纯化，更优选为Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化。
为解决上述技术问题，本发明的第五方面的技术方案为：提供一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体(CAR)。
设计CAR时，针对特定抗原的抗体基因是一种关键性的选择，鉴于体内基因表达的复杂性以及各种不可控因素，选择到一个合适的用于CAR的基因是非常困难的。并且，很多肿瘤特异性的抗原，很难找到针对其的且适合于构建CAR细胞的特异性分子，在建立CAR后，往往无法获得有活性的胞外结合区，这也是发展CAR技术的难点。此外，尽管CAR细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但亦需要考虑其较高的风险。比如，由于某些正常组织低表达CAR所能识别的特异性抗原可能造成CAR细胞对表达相应抗原的正常组织的损伤。现有技术中，靶向Claudin18.2抗体特异性结合Claudin18.2的效果不佳，靶向Claudin18.2的CAR细胞的效果也不够优异，而众所周知的是，开发出兼具有效性和安全性的靶向Claudin18.2的CAR细胞难度极大。发明人通过实验意外地发现，本发明CAR中的抗体结合活性/亲和力高，意味着在同样的工艺(同病毒滴度，转染效率)下，本发明的CAR能更好地结合到靶细胞，特异性更好，减少非靶细胞结合所产生的副作用。使用本发明的CAR，即使很少的剂量就可以发挥作用，有极高的应用价值。本发明中针对CLDN18.2的CAR细胞的抗原结合部分(抗体)是人源化的序列，可以减少CAR治疗产生免疫原性风险。通过新一代CAR设计，具体地是在CAR的C末端引入能有效杀伤肿瘤的细胞因子、细胞因子和其受体结合复合物等，并使得这些因子和/或复合物能够分泌胞外、肿瘤细胞区域达到更好的抑制肿瘤的效果。
所述CAR包括：(a)特异性识别CLDN18.2的胞外结合结构域scFv；(b)铰链结构域；(c)跨膜结构域；(d)共刺激胞内结构域；(e)信号传导结构域；
其中，所述胞外结合结构域包括如本发明的第一方面所述的靶向CLDN18.2的抗体的轻链可变区和重链可变区。
在一较佳的具体实施例中，如上所述的CAR中，
(1)所述铰链结构域选自一种或多种以下分子的铰链区：CD8α、CD28、CD152、PD1和IgG1重链；
(2)所述跨膜结构域选自一种或多种以下分子的跨膜区：TCR的α、β、ζ链，CD3ε、CD3ζ，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD27，CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD134，4-1BB，CD152，CD154和PD1；
(3)所述共刺激胞内结构域选自一种或多种以下分子的胞内区：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54、CD83、OX40、CD134、4-1BB、CD150、CD152、CD223、CD270、PD-L2、PD-L1、CD278、DAP10、NKD2C SLP76、TRIM、FcεRIγ和MyD88，优选CD28胞内区和/或4-1BB胞内区；和/或，
(4)所述信号传导结构域选自一种或多种以下分子的胞内区：Igα、Igβ，TCRξ，FcR1γ、FcR1B，CD3γ、CD3δ、CD3ε，CD2，CD5，CD22，CD28，CD79a、CD79b，CD278，CD66d和CD3ζ；优选CD3ζ胞内区。
在一较佳的实施例中，所述CAR中，所述铰链结构域为CD8α铰链区，所述跨膜结构域为CD8α跨膜区，所述共刺激胞内结构域为CD28胞内区和/或4-1BB胞内区，所述信号传导结构域为CD3ζ胞内区(在实施例的CAR通式中简称CD3ζ)；
优选地，所述CD8α铰链区为人CD8α铰链区；所述CD8α跨膜区为人CD8α跨膜区；所述CD28胞内区为人CD28胞内区；所述4-1BB胞内区为人4-1BB胞内区；和/或，所述CD3ζ胞内区为人CD3ζ胞内区。
为解决上述技术问题，本发明的第六方面的技术方案为：提供一种含有靶向Claudin18.2的CAR的核酸构建体，所述核酸构建体具有如式car-[(IRES)-f]q所示的结构，其中，IRES为如SEQ ID NO：55的核苷酸序列所示的内部核糖体进入位点序列；f编码功能性蛋白F，q为0或非0自然数；car编码包括上述第五方面的CAR。
在一较佳的实施例中，如上所述的核酸构建体中，当q为非0自然数优选为1时，所述功能性蛋白F包括：
(1)细胞因子或其活性片段，优选IL10或IL15或其活性片段；更优选地，所述IL10的氨基酸序列如SEQ ID NO：54所示；
(2)细胞因子受体或其活性片段，优选IL15 Rα或其片段或IL15 Rα片段(sushi)或IL15 Rα片段(sushi+)；或，
(3)细胞因子受体或其活性片段与细胞因子的融合蛋白，优选IL15Rα或其片段或IL15Rα(sushi)或IL15Rα(sushi+)与IL15的融合片段。
在一较佳的实施例中，所述核酸构建体的结构为：
(1)scFv-人CD8α铰链区-人CD8α跨膜区-人4-1BB胞内区-人CD3ζ胞内区；优选地，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；此处较佳的一核苷酸构建体在下文中命名为CAR1a；或，
(2)scFv-人CD8α铰链区-人CD8α跨膜区-人4-1BB胞内区-人CD3ζ胞内区-(IRES)-IL15；此处较佳的一核苷酸构建体在下文中命名为CAR3ab；或，
(3)scFv-人CD8α铰链区-人CD8α跨膜区-人4-1BB胞内区-人CD3ζ胞内区-(IRES)-IL10；此处较佳的一核苷酸构建体在下文中命名为CAR3ab10；或，
(4)scFv-人CD8α铰链区-人CD8α跨膜区-人4-1BB胞内区-人CD3ζ胞内区-(IRES)-IL15Rα(sushi+)-IL15；此处较佳的一核苷酸构建体在下文中命名为CAR4a。
本领域技术人员需知，上述的构建体为核酸，为了简明起见，该构建体的四种结构省略了“编码...的核苷酸序列”的表述。例如上述构建体结构中的scFv实为“编码scFv的核苷酸序列”，人CD8α铰链区实为“编码人CD8α铰链区的核苷酸序列”，以此类推。此外，上述结构中IL10和IL15除了可以为野生型的IL10和IL15以外，还可以是IL10和IL15的突变体或其活性片段。
上述的核酸构建体中，进一步还可以包括CD27 T细胞记忆和存活信号传导结构域，和/或，可自毁结构域例如编码诱导型半胱天冬酶(iCasp)的核苷酸序列或编码单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)的核苷酸序列。可自毁结构域能调控抗原识别信号通路，最大限度降低CAR细胞对正常组织的伤害，减少脱靶效应。当不良反应发生时，在无毒性前体药物刺激下，激活自杀基因，诱导CAR细胞凋亡，终止治疗。
为解决上述技术问题，本发明的第七方面的技术方案为：提供一种分离的核酸，其编码如上所述的靶向CLDN18.2的抗体或如上所述的双特异性抗体。
为解决上述技术问题，本发明的第八方面的技术方案为：提供一种表达载体，其包含如上所述的分离的核酸，或如上所述的核酸构建体。
优选地，所述表达载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。更优选慢病毒载体，其骨架质粒可以为pBABEpuro。
为解决上述技术问题，本发明的第九方面的技术方案为：提供一种基因修饰的细胞，其转染有如上所述的核酸构建体、所述的表达载体；优选地，所述基因修饰的细胞为真核细胞，更优选分离的人细胞；进一步更优选免疫细胞如T细胞，或NK细胞如NK92细胞系。
为解决上述技术问题，本发明的第十方面的技术方案为：提供一种制备基因修饰的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：将所述的核酸构建体、所述的表达载体或所述的病毒转入待修饰的细胞内即得；
较佳地，所述基因修饰的细胞为真核细胞，优选分离的人细胞；更优选免疫细胞如T细胞或NK细胞；进一步更优选为NK92细胞系。
为解决上述技术问题，本发明的第十一方面的技术方案为：提供一种药物组合物，所述药物组合物包含所述的靶向CLDN18.2的抗体、所述的双特异性抗体、所述的基因修饰的细胞或所述的抗体药物偶联体，以及药学上可接受的载体；优选地，所述药物组合物还包括免疫检查点抗体。
为解决上述技术问题，本发明的第十二方面的技术方案为：提供一种所述的靶向CLDN18.2的抗体、所述的双特异性抗体、所述的抗体药物偶联体、所述的核酸构建体、所述的表达载体、所述的病毒、所述的基因修饰的细胞或所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用；较佳地，所述肿瘤为CLDN18.2阳性肿瘤，优选胃癌、食管癌、肺癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤或者白血病。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明通过创新免疫和筛选方法，进行多种创新设计，提供了一种全新的靶向CLDN18.2的抗体，优选人源化抗体，其和人、鼠CLDN18.2特异结合活性更好，Emax更高；亲和力(KinExA)高(优选达到了10pM级)；人血细胞中CDC活性更好；诱导CLDN18.2+细胞凋亡活性更好，抑制肿瘤细胞生长活性更好，动物药效更优，且体内药物代谢(PK)好，特别是更长的T1/2。其和鼠CLDN18.2也具有更好的结合活性。
本发明提供了一种双特异抗体，其一个靶点是针对CLDN18.2，另一个则针对CLDN18.2以外的靶点。创新设计意外发现所得到的双特异性抗体(SBody)优选分子保留了双靶点的结合活性、功能活性；而且双特异设计类似IgG结构，工艺纯化简单，而且稳定。这为后期开发中工艺制备抗体带来了便利。同时，所设计的靶点包括PD-1/PD-L1等免疫检查点抗原时，其和CLDN18.2结合，可以将肿瘤免疫和靶向抗体联合作用在一个分子中实现，产生等同2个分子联用效果或者更好的协同效果，为肿瘤免疫治疗和靶向治疗结合带来更加便利的药物开发选择。
本发明首创针对CLDN18.2的抗体药物偶联体(ADC)。其中抗体分子效果如上所述。由该抗体和细胞毒素偶联得到的ADC分子不仅保留了其抗人、鼠CLDN18.2的优良特异结合活性，内吞活性与高效杀伤肿瘤细胞的特点，同时携带细胞毒性毒素，能更加特异地、靶向杀伤肿瘤细胞，靶向特异抑制肿瘤细胞增殖，产生意想不到的的更加优秀的治疗肿瘤药效。这些特点使得本发明ADC药物以及其药用盐、溶剂化合物或者和其它药物联用的组合，为肿瘤患者特别是CLDN18.2阳性癌症患者提供更加特异有效的、更好治疗选择、手段和方法。此外，本发明提供的抗体药物偶联体/抗体具有更好的药代性能，安全窗口大以及更低的毒副作用。
本发明提供了一种新的靶向Claudin18.2的CAR分子，其活性和亲和力更高，能更好地靶向肿瘤细胞；其不结合Claudin18.1，具有极佳的特异性，减少非靶细胞结合所产生的副作用；CAR分子的抗原结合序列优选人源化，减少免疫原性风险，安全性更佳；CAR分子结合细胞因子或细胞因子受体一起使用，治疗效果更佳；含本发明CAR分子的免疫细胞治疗效果更好，尤其在较佳实施例中，本发明的CAR分子接近100％的抑癌效果。
附图说明
图1为本发明鼠源抗人CLDN18.2抗体mab5b和人CLDN18.2(图1a)以及鼠CLDN18.2(图1b)的结合活性(ELISA)；
图2为本发明抗人CLDN18.2抗体mab5b人源化抗体(图2a)以及人源化优化抗体(图2b)和人CLDN18.2的结合活性(ELISA)；
图3为本发明人源化抗人CLDN18.2抗体、人源化优选抗体CDC活性评价；
图4为本发明人源化抗人CLDN18.2抗体、人源化优选抗体诱导肿瘤细胞凋亡的活性(图4a，图4b)；
图5为本发明人源化抗人CLDN18.2抗体、人源化优选抗体动物模型体内药效评价(图5a，图5b)；
图6为本发明人源化抗体Ab10和Ab6内吞活性分析；
图7A为LB302结构及相关检测数据图，其包括结构示意图(c)，以及和人CLDN18.2的结合活性检测结果(a)，和人PD-1的结合活性检测结果(b)。
图7B为LB301结构及相关检测数据图，其包括结构示意图(c)，以及和人CLDN18.2的结合活性检测结果(a)，和人PD-1的结合活性检测结果(b)。
图7C为LB309结构及相关检测数据图，其包括结构示意图(c)，以及和人CLDN18.2的结合活性检测结果(a)，和人PD-1的结合活性检测结果(b)。
图7D为LB308结构及相关检测数据图，其包括结构示意图(c)，以及和人CLDN18.2的结合活性检测结果(a)，和人PD-1的结合活性检测结果(b)。
图8为LB401结构及相关检测数据图，其中a为样品在-80℃保存60天(60d)，在4℃保存30天、在37℃保存7天以及14天的样品和人CLDN18.2的结合活性检测结果；b为LB401结构示意图。
图9为针对CLDN18.2设计的CART细胞动物体内药效，其显示了注射CART(空载体)、CART1a、CART3ab、CART3ab10和CART4a细胞的小鼠的肿瘤体积变化。
具体实施方式
术语解释：
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如本领域技术人员知晓，或J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。
如本文使用的，术语“包括”或“包含”旨在表示组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素。“基本上由……组成”当被用来定义组合物和方法时，应该表示排除对于预期用途的组合来说具有任何实质性作用的其他元素。例如，如本文定义的基本上由该元素组成的组合物，将不会从分离和纯化方法和药学上可接受的载体(例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等)中排除微量污染物。“由……组成”应该表示排除多于微量元素的其他成分和用于施用本文公开的组合物的实质性方法步骤。通过这些过渡性术语的每一个进行定义的方面都在本发明的范围之内。
术语“CLDN18.2”包括同种型、哺乳动物(例如人)的CLDN18.2、人CLDN18.2的物种同源物和包含至少一个与CLDN18.2的共同表位的类似物。CLDN18.2(例如人CLDN18.2)的氨基酸序列是本领域中已知的，如NCBI数据库显示。
术语“CLDN18.1”包括同种型、哺乳动物(例如人)的CLDN18.1、人CLDN18.1的物种同源物和包含至少一个与CLDN18.1的共同表位的类似物。CLDN18.1(例如人CLDN18.1)的氨基酸序列是本领域中已知的，如NCBI数据库显示。
本发明所述的“CLDN18.2抗体”、“抗CLDN18.2抗体”、“CLDN18.2抗体分子”与“抗CLDN18.2抗体分子”可互换使用。术语“表位”指抗原(例如，人CLDN18.2)中与抗体分子特异性相互作用的部分。术语“竞争”在本发明中指抗体分子干扰抗CLDN18.2抗体分子与靶(例如，人CLDN18.2)结合的能力。对结合作用的干扰可以是直接或间接的(例如，通过抗体分子或靶的变构调节作用)。可以使用竞争结合测定法(例如，FACS测定法、ELISA或BIACORE测定法)确定抗体分子是否能够干扰另一种抗体分子与其靶结合的程度。
本发明所述的术语“抗体”包括免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
在本发明中，本发明所述的抗体轻链可变区可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。在本发明中，本发明所述的抗体重链可变区可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、2、3、4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域[称为互补决定区(CDR)]，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对应的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。特别地，重链还可以包含3个以上CDR，例如6、9或12个。例如在本发明的双特异性抗体中，重链可以是IgG抗体的重链的N端连接另一个抗体的ScFv，这种情况下重链含有9个CDR。
本发明所述的抗体或抗原结合片段的VL区和VH区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat、Contact、CCG、AbM和Chothia编号规则。例如，Kabat编号规则遵循KabatEA.Et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest[NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1987 and 1991)]的定义，Chothia编号规则遵循Chothia&Lesk 1987)Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人(1989)Nature 342：877-883的定义。给定CDR的边界可取决于用于识别的方案而变化，本发明所述定义规则以及所述抗体定义之CDR序列，见表3-8。例如，Kabat方案基于结构比对，而Chothia方案基于结构信息。用于Kabat及Chothia方案的编号基于最常用的抗体区序列长度，及通过插入字母调适插入物(例如，“30a”)及一些抗体中呈现删除部分。两种方案在不同位置放置某些插入物及删除部分(“插入缺失(indel)”)导致差异性编号。Contact方案基于对复合物结晶结构的分析且在许多方面中类似于Chothia编号方案。因此，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”及该抗体或其区的个别CDR(例如，“CDR-H1、CDR-H2)应了解为涵盖如通过本文描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。在一些情况中，规定用于识别一个或多个特定CDR的方案，例如如通过Kabat、Chothia或Contact方法界定的CDR。在其他情况下，给定CDR的特定氨基酸序列。
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人CLDN18.2的单克隆抗体。制备时用CLDN18.2抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。
术语“人抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)。然而，术语“人抗体”不包括这样的抗体，即其中已将衍生自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)种系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗体”)。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再要据需要克隆所得人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入载体中，最后在真核细胞，工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中，所述的CLDN18.2嵌合抗体的抗体轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ型或其变体的轻链FR区。所述的CLDN18.2嵌合抗体的抗体重链可变区进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链RF区。人抗体的恒定区可选自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后改变ADCC(antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)、CDC(complement dependent cytotoxicity、CDC、补体依赖细胞毒作用)活性的IgG1。可通过对IgG上Fc段的修饰，可降低或消除，或增强抗体的ADCC、CDC效应功能。所述的修饰指在抗体的重链恒定区进行突变，如选自IgG1的N297A，L234A，L235A；IgG2/4chimera，IgG4的F235E、或L234A/E235A，F243L、或S239D/A330L/I332E突变。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。特别的，本发明所述CLDN18.2抗体的CDR是按CCG、Kabat、AbM、Chothia或Contact等编号规则定义的各CDR序列，移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。优选地，本发明所述CLDN18.2抗体的CDR，优选轻链CDR1中的0-5个位点突变成人抗体CDR对应位点的氨基酸。这些可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。人FR种系序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站www.imgt.org和www.vbase2.org得到。
如本文所用，关于抗体的术语“特异性结合”意指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可以结合来自一个或更多个物种的该抗原。但是，这种种间交叉反应性本身不改变抗体根据特异性的分类。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合该抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体根据特异性的分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，意味着该相互作用取决于化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体一般识别并结合特定的蛋白质结构，而不是蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有经标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A的分子(或游离的，未标记的A)的存在将减少结合于抗体的标记的A的量。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的CLDN18.2人源化抗体小鼠的CDR序列选自SEQ ID NO：11-28。人的抗体可变区框架经过设计选择，其中所述抗体轻链可变区上的轻链FR区序列，来源于人种系轻链IGKV4-1*01(F)和hJK2.1的组合序列SEQ ID NO：29-33，包含人种系轻链IGKV4-1*01(F)的FR1，FR2，FR3区和hJK2.1的FR4区；其中所述抗体重链可变区上的重链FR区序列，来源于人种系重链IGHV1-69*01(F)和hJH4.1的组合序列SEQ ID NO：34-37，包含人种系重链IGHV1-69*01(F)的FR1，FR2，FR3区和hJH4.1的FR4区。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少回复突变，以保持活性。在本发明一个优选的实施方案中，所述的人源化抗体可变区回复突变为0，即全人源化抗体。
术语“脱氨基化(deamidation)”指移除位点上或分子某个位点上的氨基。“脱氨基化(deamidation)敏感位点，指更容易、更倾向产生脱氨基化作用的分子和分子某个位点。
术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗原结合片段实例包括但不限于：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、线性抗体(linearantibody)、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。工程改造的抗体变体综述于Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fc”区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。“Fab’片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此F(ab’)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。术语“Fv”意指向抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段，但缺少恒定区。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链结合片段(例如，scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子[参见，例如，Bird等人，Science 242：423-426(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)]。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的G4S氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(G4S)4或(G4S)3接头，但也可使用其变体。
术语“多特异性抗体”按其最广义使用，涵盖具有多表位特异性的抗体。这些多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体，其中该VH-VL单元具有多表位特异性；具有两个或多个VL和VH区的抗体，每个VH-VL单元与不同的靶点或同一个靶点的不同表位结合；具有两个或更多个单可变区的抗体，每个单可变区与不同的靶点或同一个靶点的不同的表位结合；全长抗体、抗体片段、双特异性抗体(diabodies)、和三抗体(triabodies)、共价或非共价连接在一起的抗体片段等。
抗体分子包含双特异性抗体(diabody)和单链分子以及抗体的抗原结合片段(例如，Fab、F(ab’)2，scFv和Fv)。抗体分子包含一条重链和一条轻链(在本发明中称作半抗体)或由其组成。Fab′、F(ab’)2、Fc、Fd、Fv、单链抗体(例如scFv)、单一可变结构域抗体、双特异性抗体(Dab)(双价和双特异性)和嵌合(例如，人源化)抗体，它们可以通过修饰完整抗体产生，或使用重组DNA技术从头合成的那些抗体分子。这些功能性抗体片段保留选择性地与其相应抗原或受体结合的能力。抗体和抗体片段可以来自任何抗体类别，包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD和IgE并且来自任何抗体亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。抗体分子的制备可以是单克隆或多克隆的。抗体也可以是人抗体、人源化抗体、CDR移植抗体或体外生成的抗体。抗体可以具有例如选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。抗体还可以具有例如选自κ或λ型的轻链。
本发明所公开的抗体也可以是单结构域抗体。单结构域抗体可以包括其互补决定区是单结构域多肽组成部分的抗体。例子包括但不限于重链抗体、天然缺少轻链的抗体、衍生自常规4链抗体的单结构域抗体、工程化抗体和除衍生自抗体的那些支架之外的单结构域支架。单结构域抗体可以是现有技术的任何抗体，或将来的任何单结构域抗体。单结构域抗体可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、羊驼、山羊、兔和牛。根据一些方面，单结构域抗体是天然存在的单结构域抗体，称作缺少轻链的重链抗体。出于清晰原因，从天然缺少轻链的重链抗体衍生的这种可变结构域在本发明中称作VHH或纳米体以将它与四链免疫球蛋白的常规VH区分。这种VHH分子可以衍生自骆驼科(Camelidae)物种(例如骆驼、羊驼、单峰驼、驼羊和原驼)中产生的抗体。除骆驼之外的其他物种可以产生天然缺少轻链的重链抗体，这类VHH也被考虑。VH区和VL区可以再划分为超变区，称作“互补性决定区”(CDR)，其间插有更保守的区域，称作“框架区”(FR)。框架区和CDR的范围已有多种方法定义。
本发明的抗体包括单克隆抗体。本发明所述的单克隆抗体或mAb或Ab，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。本发明所述载体的宿主细胞，可以是但不限于真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞或人细胞。合适的真核细胞包括但不限于Vero细胞、Hela细胞、COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、293T、293E、BHK细胞、合适的昆虫细胞包括但不限于Sf9细胞。
单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术，合成技术(如CDR-grafting)，或其它现有技术进行重组得到。生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。
本文中使用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”指：包含能够结合抗原的胞外域(胞外结合结构域)、铰链结构域、跨膜结构域(跨膜区)和使胞质信号传到结构域的多肽(即胞内信号域)。铰链结构域可以被认为是用于向细胞外抗原结合区提供柔性的一部分。胞内信号域指经由确定的信号传导途径通过产生第二信使而将信息传递到细胞内以调节细胞活性的蛋白质、或通过相应于此类信使而作为效应子发挥作用的蛋白质，产生可以促进CAR的细胞(例如CART细胞)的免疫效应子功能的信号。胞内信号域包含信号传导结构域，还可以包括源自共刺激分子的共刺激胞内结构域。
术语“信号传导结构域”是指CAR转导效应子功能信号并指导细胞执行其专门功能的部分。信号传导结构域的实例包括但不限于T细胞受体复合物的ζ链或其任何同系物。
本文中术语“CD3ζ”定义为GenBanK登录号BAG36664.1提供的蛋白质、或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。“CD3ζ胞内区”定义为来自ζ链的胞质结构域的氨基酸残基，其足以功能性地传递T细胞活化所需的初始信号。一方面，CD3ζ胞内区包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至164、其功能性同源物一来自非人物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。如本文使用的，术语“CD3ζ信号传导结构域”或“CD3ζ胞内区”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD3ζ胞内区氨基酸序列具有至少80％、或替代地至少90％同一性、优选至少约95％、更优选至少约97％、更优选至少约98％、最优选至少约99％同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。
术语“共刺激胞内结构域”指共刺激分子的胞内区，为T细胞上的关连结合性配偶体，其特异性结合共刺激配体，由此介导免疫细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激分子是有效免疫反应所需的、非抗原受体的细胞表面分子或其配体。共刺激分子包括但不限于以下分子的胞内区，如MHCI类分子、BTLA和Toll配体受体、以及OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。
本文中术语“4-1BB”指TNFR超家族的成员，其具有GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸序列、或来自非人物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基；“4-1BB”共刺激胞内结构域定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸序列214-255，或来自非分类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基，或与本申请所示的4-1BB共刺激结构域序列具有至少80％、或替代地至少90％氨基酸序列同一性、优选95％序列同一性、更优选至少97、98或99％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。
如本文使用的，术语“CD28共刺激结构域”是人CD28共刺激结构域或是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与人CD28共刺激结构域序列具有至少80％、或替代地至少90％氨基酸序列同一性、优选95％序列同一性、更优选至少97、98或99％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。
在本发明中，一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述蛋白包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述蛋白包含识别胞外抗原的胞外结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述蛋白包含胞外结合结构域、共刺激结构域和信号传导结构域，所述共刺激结构域包含源自一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域。一方面，CAR在CAR融合蛋白的N端包含可选的前导序列(或信号肽)。一方面，CAR在胞外抗原识别结构域的N端还包含前导序列，其中前导序列任选地在CAR的细胞加工和定位至细胞膜的过程中从抗原识别结构域(例如scFv)的N端切下。
“同源性”、“变异序列”、“突变”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。“优化”指保持或改善了所述抗体与抗原结合的突变，在本发明中，指保持、维持或改善了与CLDN18.2的结合的突变。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”(如果为单链)在本发明中互换地使用。术语“核酸”、“核酸序列”，“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”和“多核苷酸”互换使用。
术语“氨基酸修饰”包括氨基酸取代、添加和/或缺失，“氨基酸取代”和“保守性氨基酸取代”分别是其中氨基酸残基以另一种氨基酸残基置换和以具有相似侧链的氨基酸残基置换。
术语“IL10”、“白介素10”及“interleukin-10”可以互换使用，具有相同意思。同样地，术语“IL15”、“白介素15”及“interleukin-15”可以互换使用，具有相同意思。适当氨基酸修饰可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。所述IL10或IL15的活性片段都可以应用到本发明中。在这里，所述的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其作为全长多肽的一部分，仍然能保持全长的多肽的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长多肽的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长多肽的80％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％的活性。在所述IL10或IL10多肽序列的基础上，经修饰或改良的多肽也可以应用到本发明中，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或多肽的效力而加以修饰或改良的多肽。也就是说，任何不影响多肽的生物活性的变化形式都可用于本发明中。
本领域技术人员皆知，IL15与IL15受体结合发挥其生物学功能。IL15受体有三个亚基，分别为IL15受体α、IL15Rβ(CD122)和γ(也称CD132)。IL15Rα细胞外区域为结合IL15的部分，其中的区域sushi结构域与IL15结合可发挥IL15的生物学功能。在本发明中，“sushi+”意指除了sushi片段以外，还包括了其它多肽片段。上述IL15Rα、IL15Rα(sushi)和IL15Rα(sushi+)的氨基酸序列可参见CN106755107A。IL15和IL15Rα结合，除自身细胞被激活外，因为IL15Rα的介导，还可以将信号传递到另一个细胞激活细胞活性。这些活性包括选择性地扩增CD8+T细胞，NK细胞等，而且不像IL2那样活化调节T细胞，从而在抗肿瘤免疫反应中可能发挥不同的功能。
本文所使用的“慢病毒”是指逆转录病毒科(Retroviridaefamily)的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞；它们可以将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的一种最有效方法。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。来自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平基因转移的手段。
本文使用的术语“载体”是包含分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的组合物。在本领域中已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
本发明使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌等原核细胞，如酵母细胞等的真菌细胞，或者如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
术语“转染”是指将外源核酸引入真核细胞。转染可以通过本领域已知的各种手段来实现，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹道技术(biolistics)。
术语“免疫细胞”指可以引发免疫应答的细胞，“免疫细胞”及其语法上的其他形式可以指任何来源的免疫细胞。“免疫细胞”包括例如衍生自在骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白血细胞(白细胞)、淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和骨髓来源的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)。术语“免疫细胞”也可以是人或非人的。
如本文使用的，术语“T细胞”是指在胸腺中成熟的一类淋巴细胞。T细胞在细胞介导的免疫中起重要作用，并且与与其他淋巴细胞(例如B细胞)的不同点在于细胞表面上存在T细胞受体。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)、自然杀伤T细胞、T调节细胞(Treg)和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。如本文使用的，术语“NK细胞”是指起源于骨髓并且在先天免疫系统中起重要作用的一类淋巴细胞。NK细胞提供针对病毒感染的细胞、肿瘤细胞或其他应激细胞的快速免疫反应，即使是细胞表面上不存在抗体和主要组织相容性复合体。
例如，免疫细胞可以是来自血液的，如自体的T细胞、异体T细胞、自体NK细胞、异体NK细胞，也可以来源自细胞系，如利用EBV病毒感染来制备NK细胞系，从胚胎干细胞和iPSC诱导分化来的NK细胞以及NK92细胞系等。
“任选”、“任一”、“任意”或“任一项”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。本发明所用，“一个”和“一种”在本发明中用来指的一个或多于一个的语法对象。除非内容明确提示，否则术语“或”在本发明中用来意指术语“和/或”并且与之互换使用。“约”和“大约”应当通常意指鉴于测量的性质或精度，所测量的量的可接受误差程度。示例性误差程度一般在其10％范围内和更一般在其5％范围内。本发明公开的方法和组合物涵盖这样的多肽和核酸，它们具有指定的序列，变异序列或与其基本上相同或相似的序列，例如，与序列指定至少85％、90％、95％、99％或更多相同的序列。在氨基酸序列的情况下，术语“基本上相同”在本发明中用来指第一氨基酸序列。
如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体一抗原相互作用的解离平衡常数(KD)，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体一抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数结合抗原，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。例如用KINEXA方法KINEXA400仪器上检测到的抗体和细胞结合的亲和力。如本文中所使用的，术语EC50是指半最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect)，即能引起50％最大效应的浓度。
本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。
如本文所用，术语“抗体的药物偶联体”、“偶联物”、“偶联体”或“ADC”可互换使用，指具有式I、III、IV、V、VI或VII等结构所示的抗体的药物偶联体。
澳瑞他汀是全合成药物，化学结构式相对容易改造，以便优化其物理性质和成药特性。用于和抗体偶联的澳瑞他汀衍生物主要包括单甲基澳瑞他汀E(MMAE)和单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，前者是由天然微管蛋白聚合酶抑制剂尾海兔素10(dolastatin-10)衍生出的合成五肽，在C-端加上一个2-氨基-1-苯基丙基-1-醇而合成。MMAE对多种人类肿瘤细胞株的抑制活性小于一纳摩尔。为了降低MMAE自身细胞毒活性，MMAF在尾海兔素10的C-端加上一个苯丙氨酸，因为在结构上引入一个羧基，MMAF的细胞膜通过性较差，因此对细胞的生物活性显著降低，但是和抗体偶联后对细胞的抑制活性大幅度提高(US7750116)。
在有些实施方案中，抗体细胞毒性药物偶联物或其可药用盐或溶剂化合物包含偶联有一个或多个美登木素生物碱分子的本发明抗体。美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白多聚化未发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenusserrata)分离得到(美国专利No.3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱，诸如美登醇和C-3美登醇醋(美国专利No.4,151,042)。美登木素生物碱药物模块在抗体-药物偶联物中是有吸引力的药物模块，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰或衍生化来制备；(ii)易于用适于通过非二硫化物接头偶联至抗体的官能团衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。适于用作美登木素生物碱药物模块的美登素化合物是本领域公知的，而且可以依照已知方法从天然来源分离，或是使用遗传工程技术生产(参见Yu等(2002)PNAS99：7968-7973)。美登醇和美登醇类似物也可以依照已知方法合成制备。美登木素生物碱药物模块的例示性实施方案包括：DM1、DM3和DM4，正如本文中所公开的。
本发明中使用的术语“连接单元”、“连接子”和“接头”指适用于本发明的用于连接本发明的抗体和小分子药物的基团。示例性的接头包括MC、MP、val-cit、ala-phe、PAB、SPP、SMCC、SIAB。在一个实施方案中，所述接头是MC-vc-PAB。
药物载荷(Loading)由y表示，即通式I、III、IV、V和VI分子中每个抗体的平均药物模块数，又称为药物抗体偶联比率(drug antibody ratio，DAR)。来自偶联反应的ADC制备物中每个抗体的平均药物模块数可以通过常规手段来表征，诸如质谱、ELISA测定法、和HPLC。还可以测定ADC在y方面的定量分布。在有些情况中，将y为某数值的同质ADC从具有其它药物载荷的ADC中分离、纯化、和表征可以通过诸如反相HPLC或电泳的手段来实现。药物载荷的范围可以为每个抗体0.8-10个药物模块(D)。
ADC的载荷(药物/抗体比率DAR)可以以不同方式来控制，例如通过：(i)限制药物一接头中间物或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制偶联反应的时间或温度，(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原性条件，(iv)通过重组技术对抗体的氨基酸序列进行工程改造，使得半胱氨酸残基的数目和位置为了控制接头-药物附着的数目和/或位置而进行改变(诸如如本文中和W02006/034488(完整收入本文作为参考)中所述而制备的thioMab或thioFab)。
本发明所述的方法、组合物、联合治疗可以与其他活性剂或治疗方式，所述的方法包括向对象以有效治疗或预防疾病(例如，癌症)的量，施用本发明所述的抗CLDN18.2抗体分子，任选地，与PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、CTLA-4、Tim-3抗体(免疫治疗)或其它肿瘤治疗抗体，Her-2、EGFR、VEGF、VEGFR抗体等，以及ADC(抗体药物偶联，如T-DM1)，双特异抗体，化疗药物等的一种或多种抑制剂的组合，还包括施用抗CLDN18.2抗体分子、额外的活性剂或全部可以按这样的量或剂量施用，所述量或剂量高于、低于或等于单独(例如，作为单一疗法)使用的每种活性剂的量或剂量。抗CLDN18.2抗体，额外的活性剂或全部的施用量或剂量比单独(例如，作为单一疗法)使用的每种活性剂的量或剂量低(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
此外，正如本发明的实施例中描述的那样，抗CLDN18.2抗体以及CLDN18.2抗体的药物偶联体可以结合CLDN18.2诱导靶细胞(肿瘤细胞)凋亡，抑制肿瘤细胞生长，增加体内效应细胞对肿瘤细胞ADCC，CDC杀伤作用来达到治疗癌症患者的目的。因此，在某些实施方案中，本发明所描述的抗CLDN18.2抗体以及CLDN18.2抗体的药物偶联体通过这些机理显示本发明抗体抗肿瘤效应，以及抑制肿瘤细胞生长的方法，包括将治疗有效量的本发明中所述的抗CLDN18.2抗体以及CLDN18.2抗体的药物偶联体施用于受试者。该方法适用于癌症的体内治疗。为了获得靶向特异治疗效果，抗CLDN18.2抗体分子可以与其它抗体一起施用。在将CLDN18.2抗体以及CLDN18.2抗体的药物偶联体组合一种或多种活性剂施用时，该组合可以以任何顺序或同时施用癌症类型，特别是CLDN18.2高表达的肿瘤患者。在某些方面中，提供在对象中治疗对象(例如，减少或缓解)过度增生性病状或疾病(例如，癌症)。该方法包括向对象单独或与其他活性剂或治疗方式组合地施用本发明所述的一种或多种抗CLDN18.2抗体或CLDN18.2抗体的药物偶联体。
组合进一步包括免疫检查点凋节物的抑制物或激活物，例如，抗PD-L1抗体分子、抗PD-1抗体分子，或CTLA-4抑制物(例如，抗CTLA-4抗体)，或非免疫检查点调节物的抑制物或激活物(例如化学药物，小分子靶向药物，大分子包括抗体靶向药物，例如anti-Her2、anti-VEG、anti-VEGFR、anti-EGFR等抗体，抗体偶联药物，双特异抗体，CAR-T细胞组合等)，或其任意组合。CLDN18.2抗体治疗也可以与标准癌症治疗组合。
术语“免疫检查点”是指在免疫细胞的细胞表面上的一组分子，其可以充当“闸”以下调或抑制免疫应答，例如抗肿瘤免疫应答，进而和本发明抗体联合治疗肿瘤。免疫检查点分子包括但是不同限于PD-1、PD-L1、细胞毒性的T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、B7-H1、B7-H3、OX-40，4-1BB(CD137)、CD40、和淋巴细胞活化基因3(LAG-3)，等等。
使用单独的或与另一种免疫调节剂(例如抗LAG-3，抗Tim-3，抗PD-1或抗PD-L1、抗CTLA-4抗体分子)组合的抗CLDN18.2抗体分子来治疗胃癌、胰腺癌、肺癌、食管道癌、卵巢癌等。抗CLDN18.2抗体分子可以与以下一者或多者组合施用：基于免疫的策略、靶向药物(例如，VEGF抑制剂如针对VEGF的单克隆抗体)；VEGF酪氨酸激酶抑制剂如舒尼替尼、索拉非尼、阿帕替尼；RNAi抑制剂或VEGF信号传导的下游介导物的抑制剂，例如，雷帕霉素哺乳动物靶(mTOR)的抑制剂。
如本发明所用，术语“癌”、“癌症”、“癌症病人”意在包括全部类型的癌性生长物或致瘤过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或侵袭力阶段是什么。例子包括但不限于实体瘤、血液学癌、软组织肿瘤和转移性病灶。
可以利用本发明中公开的靶向CLDN18.2的抗体、双特异性抗体、ADC及CAR细胞或其组合适合治疗的癌症的非限定性的实例包括，肺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、头颈癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌和白血病等，或其转移性病灶。
实施例1：密蛋白18.1、18.2(CLDN18.1、CLDN18.2)高表达细胞株构建
本发明所用的人CLDN18.1、人CLDN18.2、小鼠CLDN18.1、小鼠CLDN18.2高表达细胞株通过公司稳定细胞株构建平台完成。具体步骤如下：
实验开始第1天，将293T细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库Cat#GNHu17)接种于两个6em培养皿，每个培养皿里的细胞数达到7.5×105个。第2天将包裹质粒(pGag-pol、pVSV-G、pBabe等BioVector，质粒载体菌种细胞基因保藏中心)和克隆有人或鼠CLDN18.2或CLDN18.1基因的质粒pBabe-CLDN18.2或pBabe-CLDN18.1各4μg加入OPTI-MEM(Thermofisher Scientific Cat#31985070)，使最终体积为200μl，另准备200μl OPTI-MEM加入36μl转染试剂fectin(上海源培生物科技股份有限公司Cat#F210)，二者混匀，室温放置5min，然后将混合物(每皿各200μl)滴加入培养好的293T细胞。第3天将293T细胞培养液换为4ml DMEM高糖培养基(上海源培生物科技股份有限公司/源培生物：Cat#310KJ)。第4天将CHO-K1细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库Cat#SCSP-507)接种于10cm培养皿，使细胞数达到5×105。第5天收集293T细胞上清(病毒)，用0.45μm滤膜过滤至培养好的CHO-K1细胞，同时加入10μg/ml polybrene(上海翊圣生物科技有限公司Cat#40804ES76)，混匀后放置培养箱，3～4h后换成DMEM/F1210％FBS培养基(源培生物，Cat#L310KJ)。第7天将CHO-K1细胞传代，第8天传代的细胞开始加入10μg/ml puromycin进行筛选(源培生物，Cat#S250J0)。2-3天细胞大量死亡，更换培养基继续培养，直到细胞不再死亡时，细胞大量扩增，筛选单克隆细胞株、扩培并冻存保种。
本发明构建稳定表达CLDN18细胞株分别标记为：人CLDN18.1+细胞(hCLDN18.1+cell)、人CLDN18.2+细胞(hCLDN18.2+cell)、鼠CLDN18.1+细胞(mCLDN18.1+cell)、鼠CLDN18.2+细胞(mCLDN18.2+cell)。所用的蛋白序列源自公开发表的数据库，各蛋白氨基酸序列如下。
人CLDN18.1(hCLDN18.1)源于NCBI数据库中＞NP_0574531，claudin-18isoform1precursor[Homo sapiens]。人CLDN18.2(hCLDN18.2)源于NCBI数据库中＞NP_001002026.1claudin-18isoform 2[Homo sapiens]。鼠CLDN18.1(mCLDN18.1)源于NCBI数据库中＞NP_062789.1claudin-18isoform A1.1precursor。鼠CLDN18.2(mCLDN18.2)源于NCBI数据库中NP_001181850.1claudin-18isoform A2.1[Mus musculus]。
实施例2：抗CLDN18.2抗体和CLDN18.2+和CLDN18.1+细胞株结合(ELISA)实验
将实施例1得到的细胞人CLDN18.1、人CLDN18.2、鼠CLDN18.1或鼠CLDN18.2高表达的单克隆细胞株扩培后，按5×104个/孔铺96-well plate，37℃培养箱过夜孵育后去除上清，用免疫染色固定液(上海碧云天生物技术有限公司Cat#P0098)100μl/孔室温固定半小时。PBS(源培生物，Cat#B320)洗一遍后5％牛奶37℃封闭2小时，PBST洗3遍。加入待测样品(人或鼠源抗体，Jackson Immuno Research)。37℃孵育1小时，后PBST洗3遍。加Anti-humanor mouseHRP 1：250050μl/孔37℃孵育1小时，后PBST洗3遍，TMB(Surmodic Cat#TTMB-1000-01)显色，加入50μl/孔1MH2SO4终止反应。酶标仪(MultiskanGO Thermo型号51119200)读数，Graphpad prism 5进行数据分析。
实施例3：重组蛋白、抗体的克隆、表达和纯化，活性检测(ELISA，blocking assay)
本发明用到的重组蛋白/抗体的克隆，表达和纯化均按本领域技术人员熟知的分子克隆方法进行。
具体地，本发明用到的表达载体购自长沙优宝生物科技有限公司，后由上海健信生物医药科技有限公司(健信生物)引入EcoRI酶切位点(GAATTC)，便于双酶切切或同源重组方法克隆外源基因。基因合成由生工生物工程(上海)股份有限公司(生工生物)等公司完成。293细胞、CHO-K购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
本发明中重组蛋白和抗体是在293细胞瞬时转染表达并纯化得到。具体步骤是，293细胞在Gibco FreeStyle 293 Expression Medium(Gibco，Cat#12338018)培养基扩培。开始瞬转之前，调节细胞浓度至6～8×105cell/ml，1％FBS(Aus Gene X FBS Excellent供应商：AusGeneX，China，Cat#FBSSA500-S)，37℃8％CO2摇床培养24h，再次镜检存活率＞95％，细胞浓度在1.2×106cell/ml。
准备300ml培养体系细胞，15ml Opti-MEM(Gibco，Cat#31985070)溶入重链、轻链质粒各150μg，0.22μm过滤除菌。再取15ml Opti-MEM溶入1mg/ml PEI(Polysciences，Inc，Cat#23966-2)600μl后静置5min。在500ml培养体系中，25ml Opti-MEM(Gibco，Cat#31985070)溶入重链、轻链质粒各250μg，0.22μm过滤除菌。再取25ml Opti-MEM溶入1mg/mlPEI 1000μl后静置5min。把PEI缓慢加入质粒中，室温孵育10min，边摇晃培养瓶边缓慢滴入质粒PEI混合溶液，37℃8％CO2摇床培养5天收样，3300G 10min取上清进行纯化。
纯化：将样品高速离心去除杂质，用PBS pH 7.4平衡含有Protein A(Mabselect，GE Healthcare Life Science，Cat#71-5020-91AE)的重力柱(生工生物，Cat#F506606-0001)，2-5倍柱体积冲洗。将样品过柱。用5-10倍柱体积的PBS(生工生物，Cat#B548117-0500)冲洗柱子。再用pH 3.5 0.1M乙酸洗脱目的蛋白，后用pH 8.0的Tris-HCl调节至中性，酶标仪测定浓度，分装、储存备用。
本发明中的重组人CLDN18.2(claudin18.2)胞外区域(20位D-70为A片段)和Fc融合蛋白是通过293系统瞬时转染后纯化。该蛋白可用于免疫小鼠血清滴度检测。
本发明有的实验中用到抗体人CLDN18.2(anti-hCLDN18.2)抗体(称为对照分子或阳性分子)作为比较。该抗体在本发明中简写为Ref(Reference)，序列源自WO2014146672。
抗原包板ELISA：用pH 7.4的PBS缓冲液将本发明表达的人PD-1、PD-L1、CD47、LAG3、Tim3、或者购自Peprotech的TGFβ1(Cat#100-21-10)、TGFβ2(Cat#100-35B)、TGFβ3(Cat#100-36E)。购自Sinobiological的IL10(货号SEKA10947)，FcγRI/CD64(Cat.#1257-FC-050，R&D Systems)等抗原根据不同assay，稀释至1-2μg/ml浓度，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，CLS3590-100EA)中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(上海生工生物工程有限公司，A600669-0250)封闭液200μl/孔，37℃孵育箱孵育3小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4 PBS含0.05％tweeen-20)洗板5次后，加入50μl/孔用1％BSA 5倍连续稀释的待测抗体，37℃孵育1小时，PBST洗板5次，加入50μl/孔1：2500稀释的HRP标记的二抗(JacksonImmuno Research，115-035-003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，52-00-03)，室温孵育5-10min，加入50μl/孔1MH2SO4终止反应，用MULTISKAN Go酶标仪(ThermoFisher，51119200)在450nm处读取吸收值，根据OD值计算EC50。
抗体阻止抗原和其配体结合实验(Blocking assay)
用pH为7.4的PBS缓冲液将本发明表达的抗原PD-1、PD-L1、CD47稀释至2μg/ml浓度，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，CLS3590-100EA)中，于37℃孵育2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(上海生工生物工程有限公司，A600669-0250)封闭液200μl/孔，37℃孵育3小时进行封闭。弃去封闭液，用PBST(pH7.4PBS含0.05％tweeen-20)洗板5次后，每孔加入25μl用1％BSA5倍连续稀释的待测样品和25μl终浓度为10μg/ml的biotin标记的配体(PD-1，PD-L1，SIRPα等，本发明表达纯化)，37℃孵育1小时，PBST洗板5次，加入50μl/孔1：1000稀释的HRP标记的二抗(金斯瑞生物科技有限公司，M00091)，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，52-00-03)，室温孵育5-10min，加入50μl/孔1MH2SO4终止反应，用MULTISKAN Go酶标仪(ThermoFisher，51119200)在450nm处读取吸收值，根据OD值计算IC50。
Biotin标记的试剂盒为Biotin Labeling Kit-NH2，购自东仁化学科技(上海)有限公司，货号LK03。操作方法按说明书进行，标记好的抗体用MultiskanGO(ThermoFisher)酶标仪检测浓度后使用。
实施例4：抗人CLDN18.2抗体的发现
本发明抗人CLDN18.2单克隆抗体是用实施例1中得到的人CLDN18.2高表达细胞株(hCLDN18.2+cell)免疫的小鼠，取免疫小鼠脾进行杂交瘤融合，从数百万株杂交瘤克隆中筛选、优化得到的。
实验用小鼠，雌性，4周龄(SJL购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0011；Balb/c购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，白天光/夜晚暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。小鼠分成3只/组/笼。
培养实施例1中构建的人CLDN18.2高表达细胞株(hCLDN18.2+cell，人CLDN18.2+细胞)，胰酶消化后DMEM培养基(源培生物，Cat#L310KJ)洗涤后，重悬于DMEM培养基中。按100μl/1×107细胞/只，腹腔注射免疫小鼠。首次免疫的时候用Titermax(Sigma-Aldrich，T2684)按1∶1和细胞混匀免疫。随后免疫1周一次，免疫10次后，用实施例子2之ELISA方法，人CLDN18.1+cell和人CLDN18.2+cell同时铺板，或用上述实施例子3中的重组表达的人CLDN18.2胞外(ECL1)蛋白铺板，检测免疫小鼠血清效价，以人CLDN18.1+cell铺板的ELISA值作为背景，计算小鼠血清免疫效价(滴度)。在12-15次免疫以后，选择血清滴度高并且滴度处于平台期的小鼠进行脾细胞融合，融合前以200μl/2×107细胞/只冲免小鼠，冲免3天后，取小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞铺96孔板。
取96孔板中杂交瘤细胞上清同时用人CLDN18.1+cell和人CLDN18.2+cell铺板检测杂交瘤细胞产生的抗体结合情况。表1a是部分杂交瘤上清的检测结果。
表1a杂交瘤融合克隆和人CLDN18.2+cell、人CLDN18.1+cell结合活性检测
因为人的CLDN18.2和CLDN18.1有高达92％的同源性(240/261)，且该蛋白是跨膜蛋白，只有少部分的肽段在胞外(比如51氨基酸的ECL1)，免疫原性极低，产生特异抗体的可能性非常小。所以上述筛选中，能得到分泌识别CLDN18的杂交瘤不仅很少，而且在很少的杂交瘤中，绝大部分杂交瘤上清中的抗体是能同时结合人CLDN18.2和CLDN18.1的抗体。
非常意料之外的是，本发明发现一株杂交瘤克隆，其分泌的上清只同人CLDN18.2+cell结合，和人CLDN18.1+cell不结合，见表1a中的mab5，克隆号C13C1。表1a数据显示，同样的筛选条件下，该克隆上清只和人CLDN18.2+cell结合，检测值是1.41，而同人CLDN18.1+cell几乎不结合，结合活性读值只为0.09。
进一步对本发明意外发现的该杂交瘤细胞株C13C1能分泌独特的抗人CLDN18.2抗体进行确认。将C13C1杂交瘤细胞进行了多次有限稀释，精心又精细地优化筛选每次稀释后的单克隆，最终发现了能分泌独特的抗人CLDN18.2的抗体的单克隆细胞株，结果见表1b。
表1b杂交瘤C13C1优化筛选发现的杂交瘤单克隆细胞株
从表1b的结果可以看出，本发明得到初始杂交瘤克隆C13C1经精细、优化筛选得到的的单克隆细胞株C13C1F1D3G6和C13C1F1D3H5所分泌的抗体均保留了和人CLDN18.2细胞结合，读值分别为0.8895和0.8778。而和人CLDN18.1细胞没有结合，读值分别为0.0859和0.0756。该读值接近本次ELISA本底0.081。初始杂交瘤克隆F2A4经同步筛选也得到了单克隆细胞株F2A4F6F3E4和F2A4F6F3H7。这些单克隆细胞株和预期一样，和人CLDN18.2细胞、人CLDN18.1细胞有同样的结合活性，数据见表1b。这些结果表明，本发明发现单克隆细胞株，比如C13C1F1D3G6，能够分泌独特的抗体，意外地，所分泌的抗体只能同人CLDN18.2结合，而不结合人CLDN18.1。
这意味着本发明意外发现的抗体能够有效地只识别人CLDN18.2蛋白，具有作为单克隆抗体治疗肿瘤的潜力，特别是治疗人CLDN18.2蛋白过表达的癌症患者，包括但不限于胰腺癌、胃癌、食道癌、肺癌等。因为完全不结合人CLDN18.1蛋白，从而预期可以避免治疗性抗体和人CLDN18.1等蛋白非特异结合而导致的毒、副作用。
实施例5：本发明鼠源抗人CLDN18.2抗体筛选、鉴定
从上述实施例子中得到的杂交瘤单克隆细胞株C13C1F1D3G6(表1b)中提取该细胞株所分泌的抗体序列，即得到本发明鼠源抗体mab5b序列。从杂交瘤优选的单克隆细胞株中提取抗体序列过程为本领域技术人员熟知并常用的方法。
具体地，本发明通过扩增培养上述实施例子中发现的杂交瘤单克隆细胞C13C1F1D3G6，收取1×106个细胞，用Trizol(Invitrogen，15596-018)提取RNA(按照试剂盒说明书步骤)，将提取的RNA反转录成cDNA，反转录试剂盒购自生工生物技术(上海)股份有限公司，Cat#B532435。以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增后，扩增产物测序即得到mab5b的抗体轻重链可变区序列。所用引物参阅Novagen发表的手册(TB326Rev.C0308)。
从本发明优选的杂交瘤单克隆细胞株C13C1F1D3G6中获得抗人CLDN18.2(anti-hCLDN18.2)单克隆抗体轻链核苷酸序列(SEQ ID NO：5)和重链核苷酸序列(SEQ ID NO：6)。
由上述轻链碱基序列翻译即得到本发明发现的杂交瘤单克隆细胞株提取的鼠源抗人CLDN18.2(anti-hCLDN18.2)单克隆抗体mab5b轻链可变区的氨基酸序列为：
由上述重链碱基序列即得到本发明发现的杂交瘤单克隆细胞株提取的鼠源抗人CLDN18.2(anti-hCLDN18.2)单克隆抗体mab5b重链可变区的氨基酸序列为：
本发明发现的杂交瘤单克隆细胞株中提取的上述抗体mab5b，用实施例3所述方法将抗体轻、重链可变区和恒定区分别进行克隆(序列如下)重组表达，纯化后，和对照抗体Ref同时检测对人hCLDN18.1、hCLDN18.2、鼠mCLDN18.1和mCLDN18.2的结合活性，结果如下表2a，表2b和图1。
本发明anti-hCLDN18.2抗体mab5b轻链(L Chain)如SEQ ID NO：9所示；重链(HChain)如SEQ ID NO：10所示。
表2a本发明anti-hCLDN18.2鼠源抗体mab5b和人CLDN18+cell的结合活性
表2b本发明anti-hCLDN18.2鼠源抗体mab5b和鼠CLDN18+cell的结合活性
表2a，图1a结果表明，本发明发现的anti-hCLDN18.2鼠源抗体mab5b和对照抗体(Ref)都不和hCLDN18.1+cell结合，EC50检测不到(ND)，即使在200nM高浓度的时候仍检测不到结合活性，结合值Emax(指在样品浓度提高，结合达到平台时的结合值，即最大特异结合数值)仍然是本底，即背景值。而两个抗体均和hCLDN18.2+cell有很好的结合活性。意外的是，本发明的抗体mab5b结合活性比Ref好1倍以上(EC50为0.115nM vs 0.249nM)。更加意外的是，mab5b所能达到的最大结合数值Emax比Ref要高36％以上[(1.92-1.41)/1.41]。
表2b、图1b结果表明，本发明发现的anti-hCLDN18.2鼠源抗体mab5b和对照抗体(Ref)都不和鼠CLDN18.1+cell结合，EC50检测不到(ND)，即使在200nM高浓度的时候仍检测不到结合活性，结合值Emax仍然是本底，即背景值。而两个抗体均和鼠CLDN18.2+cell有很好的结合活性。意外的是，本发明的抗体mab5b结合活性比Ref好4倍以上(EC50为0.182nMvs1.04nM)。更加意外的是，mab5b所能达到的最大结合数值Emax比Ref要高1倍以上[2.21 vs1.0]。
上述结果表明本发明所发现的新分子mab5b的结合活性(EC50和Emax)比对照分子都要好。并且和hCLDN18.1和mCLDN18.1都没有任何结合活性，说明mab5b不仪结合活性更好，而且特异性也非常优秀。这表明mab5b用于肿瘤治疗产品开发能提供更好疗效和安全性的优势。并且和鼠CLDN18.2也有更好的结合，为在鼠上进行临床前研究提供了更加便利的非灵长类动物选择。
实施例6：本发明抗体mab5b的人源化
本发明发现的抗体mab5b活性优于Ref，显示该抗体可以用于肿瘤治疗药物开发。为了减少药物开发过程中的免疫原性等方面的风险，比如由鼠源抗体完成人源化，并且优化人源化后分子特性，便于用于药物开发，本发明对mab5b进行了人源化筛选，以及序列优化工作。具体过程描述如下。
抗体的CDR定义本领域还有多种不同的方法，这些标记CDR方法可总结如下表3。
表3 本领域抗体CDR定义不同方法汇总*
区域 CCG定义 Kabat定义 AbM定义 Chothia定义 Contact定义
轻链CDR1 L24-L34 L24-L34 L24-L34 L24-L34 L30-L36
轻链CDR2 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L45-L55
轻链CDR3 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L96
重链CDR1 H26-H35 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
重链CDR2 H50-H65 H50-H65 H50-H58 H52-H56 H47-H58
重链CDR3 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H93-H101
*更多信息可以参阅网站：http：//www.bioinf.org.uk/abs/#cdrdef
上述实施例5中得到的鼠源抗人CLDN18.2抗体mab5b按照表3各种定义方法，其CDR序列标记/注释如下。
表4 本发明抗人CLDN18.2(anti-hCLDN18.2)抗体mab5b按CCG定义CDR序列
表5本发明抗人抗体按Kabat定义CDR序列
表6本发明抗体按AbM定义CDR序列
表7本发明抗体按Chothia定义CDR序列
表8本发明抗体按Contact定义CDR序列
对本发明anti-hCLDN18.2抗体(mab5b)上述CDR分析，根据抗体标记系统，标记识别抗体轻、重链的CDR区(如上)基础上，将鼠源抗体mab5b轻、重链可变区序列分别和人抗体种系数据库(v-base)比较，找出同源性高的人抗体轻、重链种系，在此基础上，计算机建模，模拟抗体结构中可能影响和抗原结合的位点，回复突变关键位点和组合，筛选出活性优选的人源化抗体分子。
具体地，通过序列同源性比较分析，发现和mab5b轻链同源性比较好的人抗体种系包含有IGKV4-1*01(F)，IGKV2-28*01(F)，IGKV2D-28*01(F)，IGKV1-27*01(F)，IGKV1-39*01(F)，IGKV1D-39*01(F)，IGKV2-40*01(F)，IGKV2D-29*01(F)，IGKV2D-40*01(F)，IGKV3-15*01(F)。进一步比较、分析，优选人抗体种系轻链IGKV4-1*01(F)。特别地，所选定的人种系轻链IGKV4-1*01(F)的CDR2序列为WASTRES，和本发明发现的鼠源抗体mab5b轻链CDR2序列完全相同。序列比对发现mab5b轻链的J基因区和人抗体种系hJK1，hJK2.1，hJK2.2，hJK2.3，hJK2.4同源性高，进一步比较、分析，优选hJK2.1用于mab5b轻链人源化人抗体种系J区，进行人源化设计、筛选和序列优化。
通过序列同源性比较分析，发现和mab5b重链同源性比较好的人抗体种系包含有IGHV1-69*02(F)，IGHV1-69*06(F)，IGHV1-69*08(F)，IGHV1-69*09(F)，IGHV1-69*10(F)，IGHV1-69*04(F)，IGHV1-69*14(F)，IGHV1/OR15-2*02(P)，IGHV1-69*01(F)，IGHV1-69*11(F)，进一步比较、分析，优选人种系重链IGHV1-69*01(F)序列用于本发明抗体人源化。序列比对发现mab5b的重链J基因区和人抗体种系重链J基因hJh4.1，hJh4.2，hJh4.3，hJh1，hJh2，hJh3.1，hJh3.2同源性高，进一步比较、分析，优选hJh4.1用于本发明mab5b重链人源化人抗体种系J区，进行人源化设计、筛选和序列优化。
将本发明抗体mab5b CDR区(见上述CDR之定义)移植到所选择的人源化轻、重链人抗体种系模板上，再与IgG轻、重链恒定区重组。然后，以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，筛选这些突变以及突变组合，看对抗体活性的影响，并对CDR区化学不稳定氨基酸残基优化，得到结构、活性等优化的抗体分子序列，即本发明抗人CLDN18.2鼠源抗体mab5b的人源化系列优化抗体分子。
具体地，在对本发明抗体mab5b轻链分析发现，包含CDR1(L24-L34位)和CDR2(L50-L56位)序列和本发明人源化优选人种系轻链IGKV4-1*01(F)的序列同源性很高。其中，L24-L34CDR1只有5个氨基酸不同，分别是L29、L30A、L30C、L30E和L34位，见下表9a。而L50-L56位CDR2则完全相同(见下表9b)。本发明首先对mab5b CDR1五个位点(L29、L30A、L30C、L30E和L34位)进行了回复突变成人种系IGKV4-1*01(F)对应位点的氨基酸，组合设计如下表9a。
表9a本发明鼠源anti-hCLDN18.2抗体mab5b序列按Kabat定义的L24-L34位(CDR1，即SEQ ID NO：11)氨基酸以及人源化
表9b本发明鼠源anti-hCLDN18.2抗体mab5b序列L50-L56位(CDR2)氨基酸
氨基酸位置编号 L50 L51 L52 L53 L54 L55 L56
mab5b CDR2 W A S T R E S
IGKV4-1*01(F)CDR2 W A S T R E S
将上述人源化设计分子Var1，Var2，Var3，Var4，Var5，Var6，Var7，Var8和mab5b按前述实施例子3克隆表达纯化，按实施例子2检测和人CLDN18.2+细胞结合活性，结果如下表10。
表10本发明抗体轻链CDR1序列人源化优化
抗体 EC50(nM) Emax
mab5b 0.215 1.93
Var1 0.461 1.83
Var2 0.221 1.7
Var3 0.143 1.46
Var4 0.434 1.7
Var5 0.656 1.37
Var6 7.67 1.14
Var7 9.51 1.02
Var8 0.20 1.79
上述结果表明，本发明抗体mab5b的轻链CDR1人源化优化序列均保留了和mab5b同样(接近)的结合活性。
进一步，用上述所述人源方法，将mab5b进行人源化设计，优选得到本发明mab5b抗体人源化轻链可变区优选序列如下：
由上述所述方法得到本发明人源化重链可变区优选序列如下：
上述轻链可变区序列，包含列出的如L14、L11、L12、L13、L15和未列出的所示任意序列与人抗体轻链κ型或λ型轻链恒定区组合得到本发明人源化抗体轻链序列。上述重链可变区序列，包含列出的如H51、H52、H53、L54和未列出的所示重链可变区序列和hIgG1，2，3，4等不同亚型的恒定区序列组合得到本发明抗体的重链序列。所述轻链、重链任意组合得到本发明人源化抗体，部分人源化抗体序列如下表11所示。
表11 本发明人源化抗体部分优选序列
人源化Ab10抗体氨基酸序列：轻链：
重链：
人源化Ab7抗体氨基酸序列的轻链：SEQ ID NO：40；重链：SEQ ID NO：39；
人源化Ab8抗体氨基酸序列的轻链：SEQ ID NO：38；重链：SEQ ID NO：41；
人源化Ab9抗体氨基酸序列的轻链：SEQ ID NO：40；重链：SEQ ID NO：41；
人源化Ab6抗体氨基酸序列的轻链：
重链：SEQ ID NO：39；
人源化Ab11抗体氨基酸序列的轻链：SEQ ID NO：42；重链：SEQ ID NO：43；
人源化Ab12抗体氨基酸序列的轻链：SEQ ID NO：42；重链：SEQ ID NO：44；
人源化Ab13抗体氨基酸序列的轻链：SEQ ID NO：45；重链：SEQ ID NO：43；
人源化Ab14抗体氨基酸序列的轻链：SEQ ID NO：45；重链：SEQ ID NO：44；
人源化Ab15抗体氨基酸序列的轻链：SEQ ID NO：45；重链：SEQ ID NO：39；
用本发明所述实施例3方法克隆、表达纯化重组抗体，实施例2所述ELISA方法检测筛选上述人源化抗体和hCLDN18.2+cell，hCLDN18.1+cell的结合活性，结果见下表12，和图2a。
表12本发明人源化anti-hCLDN18.2抗体和hCLDN18.2+cell，hCLDN18.1+cell的结合活性
NA：不适用；ND：没有检测到
表12结果表明，本发明发现的抗体mab5b人源化后，保持了鼠源抗体结合活性比对照抗体Ref高的优势，人源化抗体Ab10的EC 50比Ref要好2倍(0.117vs 0.345)。不仅如此，这些人源化优化的分子的结合最高值Emax比对照抗体Ref高出39.8％-54.1％。比鼠源抗体mab5b更加优于对照抗体。
为了进一步优化本发明人源化分子，优选最终序列和人抗体种系轻、重链尽量趋于一致，减少鼠源抗体中少量序列可能造成的免疫原性，优选人源化优化轻链CDR1序列Var3(见表9)设计了系列人源化抗体，并进行了特异结合活性筛选。结果如下表13和图2b。
表13本发明人源化anti-hCLDN18.2抗体优化抗体和hCLDN18.2+cell，hCLDN18.1+cell的结合活性
ND：没有检测到
上述结果表明，本发明进一步优化得到的人源化抗体(表13和图2b)中，这些人源化抗体的回复突变的氨基酸数目各有不同，包括Ab1-Ab20(见表11)。其中，有6个回复突变的，如Ab10(轻链1个，重链5个)；有6个回复突变，并且轻链CDR1人源化优化的，如Ab6(轻链1个，重链5个)；有2个回复突变如Ab14(轻链0个，重链2个)；有只有1个回复突变如Ab11(轻链1个，重链0个)，以及完全没有回复突变的，如Ab13。这些优化的人源化分子活性，包括EC50和Emax活性，都保持了和Ab10(表12中已经优化的mab5b人源化分子)相同的水平且都不和hCLDN18.1+细胞结合。
特别意外地发现的Ab13抗体分子没有任何回复突变，即是全人源化的抗体分子，且CDR1序列人源化优化，其结合活性(EC50和Emax)和Ab6，Ab10一样。
上述结果表明，本发明在鼠源抗体mab5b序列通过人源化，优化筛选得到的抗体分子，包含只人源化FR区，轻链CDR1保持wildtype(没有突变)，如Ab10；或FR区人源化外，轻链CDR1也进行了人源化优化的序列Var3，所得到的Ab6，Ab11-15等，均保持了其结合活性，且均优于对照分子，EC50比对照分子强1倍，Emax比对照分子高出30％-50％，而且都不同hCLDN18.1+细胞结合。
实施例7：本发明抗体序列脱酰胺基(deamidation)敏感位点序列优化
通过对本发明mab5b序列以及人源化后的优化序列(上述表9a，9b，11)计算机结构模拟分析，对可能存在的，特别是CDR区的转录后修饰(Potential post-translationalmodifications，PTMs)位点分析，包括抗体的聚集，脱酰胺基敏感(asparaginedeamidation，位点(NG，NS，NH等)、天冬氨酸异构(DG，DP)敏感位点，N糖基化(N-{P}S/T)敏感位点，氧化敏感位点等分析，发现本发明抗体轻链CDR1(CDR1，LChain)第L30A，L30B位为NS，重链CDR3(CDR3，H Chain)第H99，H100为NS，其中的L30A位、H99位的asparagine(N)可能对deamidation敏感。为了降低本发明抗体用于药物制剂时抗体分子的成药性相关风险，我们对这两个可能的敏感位点进行了序列优化。具体地，对本发明抗体轻链CDR1的L30A，L30B位(NS)；重链CDR3的H99、H100位(NS)点进行突变，优选方案如下：
表14本发明抗体序列脱酰胺基敏感位点序列优化设计
*：NA，不适用(没有做改变)
将上述优化的脱酰胺基敏感位点优化设计后的序列以不同轻、重链组合表达抗体后进一步筛选结合活性。所述抗体组合部分见下表。
表15本发明抗体脱酰胺基敏感位点优化抗体
*：-代表没有突变
上述优选抗体按实施例子3方法表达、纯化后用实施例2之方法检测其和人CLDN18.2+cell的结合活性，结果见表16a，16b和表16c。
表16a 本发明人源化anti-hCLDN18.2抗体脱酰胺基敏感位点优化抗体活性
*：Ab14作为本次assay对照样品(没有NT突变)
表16b 本发明人源化anti-hCLDN18.2抗体脱酰胺基敏感位点优化抗体活性
*：Ab14作为本次assay对照样品(没有NT突变)
表16c本发明人源化anti-hCLDN18.2抗体脱酰胺基敏感位点优化抗体活性
表16a结果表明，Ab21(轻链CDR1NS-＞TS和重链CDR3 NS-＞TS)“几乎没有”结合活性(＞16nM)。Ab23(轻链CDR1NS-＞NT，重链CDR3 NS-＞TS)也“几乎没有”结合活性(＞40nM)。Ab22(轻链CDR1NS-＞TS，重链CDR3 NS-＞NT)结合活性有所下降，但没有完全消失(EC50＝1.37nM vs Ab14EC50＝0.35)。也就是说虽然轻链CDR1的L30A位N-＞T，但因为重链CDR3的H99位N没有突变，抗体的结合活性从“几乎没有”回复到1.37nM，比正常Ab14减少了近3倍。而Ab56(轻链CDR1 NS-＞NT，重链CDR3 NS-＞NT)的结合活性则和正常分子Ab14一样，其EC50＝0.295nM。
综合表16a结果说明，本发明抗体轻链CDR1的L30A位N和重链CDR3第H99位N对本发明抗体的结合非常重要，这些点的突变(比如变为T)直接导致活性丢失或者完全没有活性。但是轻链的L30B位S和重链CDR3第H100位S突变为T对结合活性没有影响。
表16b数据进一步证明单独轻链的L30B位S突变为T，或者单独重链CDR3的第H100位S突变为T，对结合活性没有影响。
非常意外地，表16b数据表明，Ab30(重链CDR3，NS-＞NT)完全失去了结合活性(EC50＞11nM，即实际上结合曲线已经和阴性对照一样，和抗原没有特异结合作用了)，但Ab34含有同样的重链(CDR3，NS-＞NT)却没有失去活性。这说明Ab30活性的丢失不是由于CDR3，NS-＞NT的变化引起的。鉴于这两个分子唯一的差别是轻链CDR1的不同，即Ab30轻链为L14，其CDR1为KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO：11)；Ab34轻链为L12，其CDR1为KSSQSLLNSGNNKNYLA(SEQ ID NO：12)，划线部分为两个CDR1序列的不同。这一意外的发现表明，当重链CDR3第H100位S突变为T(以避免潜在的脱酰胺基)的时候，轻链的CDR1序列必须是KSSQSLLNSGNNKNYLA(SEQ ID NO：12，即CDR1序列优化的Var3，见表9a)。轻链CDR1如果是KSSQSLLNSGNQKNYLT的话(SEQ ID NO：11，划线部分为两个CDR1序列的差异)，则整个抗分子完全失去了结合活性(Ab30)。这一发现表明，本发明抗体CDR1如果第L30E位是Q和L34位是T(划线标出)则重链第H100位S不能进行突变，如以避免潜在的脱酰胺基H100位S突变为T，否则整个抗体失去结合活性。
为了进一步确认本发明抗体轻链CDR1序列KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO：11，第L30E位Q和L34位T)和人源化优化的CDR1序列KSSQSLLNSGNNKNYLA(SEQ ID NO：12，第L30E位N和L34位A)的不同对本发明抗体轻链CDR1和重链CDR3中NS突变(以避免潜在的脱酰胺基)的影响，我们比较了Ab10(CDR1：KSSQSLLNSGNQKNYLT，SEQ ID NO：11)和Ab6(CDR1：KSSQSLLNSGNNKNYLA，SEQ ID NO：12)，这两个分子唯一的区别在于其轻链CDR1(划线的氨基酸为两者的不同)。以及这两个分子的轻链CDR1和重链CDR3上同时进行NT-＞NS突变，得到的Ab35，Ab36两个抗体。表16c结果表明Ab35完全失去了结合活性(EC50＞62nM)。
这一数据确认了本发明所发现的轻链CDR1序列KSSQSLLNSGNNKNYLA(SEQ ID NO：12)第L30E位是N和L34位是A(划线标出)即CDR1人源化优化的序列不影响轻链CDR1第L30B位S(斜体)，和或重链第H100位S进行突变以避免潜在的脱酰胺基(比如L30B位S突变为T或/和H100位S突变为T)。
如果CDR1序列KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO：11)第L30E位是Q和L34位是T(划线标出)则CDR1第L30B位S(斜体)或重链第H100位S均不能进行突变(比如L30B位S突变为T或H100位S突变为T)，任何这样的突变会让抗体的结合活性消失。
综合上述结果表明，本发明抗体轻链CDR1L30A，L30B位NS；重链CDR3 H99，H100位NS可以通过NS-＞NT之优化突变来降低可能的deamidation风险，但只对CDR1的第L30E位是N，L34位是A(即序列为人源化优化的序列KSSQSLLNSGNNKNYLA，SEQ ID NO：12)时候才可以，如果该区序列为KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO：11)则抗体完全失去活性(划线部分为两者的序列不同)。
实施例8：本发明抗体Fc序列(变体)活性分析
本发明抗体可变区和人抗体不同的轻、重链恒定区，包括但不限于实施例子3所列出的人抗体不同的轻链(κ、λ型轻链等)、重链恒定区(hIgG2、hIgG4、hIgG1)组合，特别是人的IgG1Fc序列变体，比如第356-358位为DEL或EEM的不同形式，可以得到不同抗体变体形式。表17列出了部分本发明抗体和Fc序列的变体形式，包括Fc区序列第356-358位为DEL或EEM。
表17本发明抗体轻重链、重链恒定区不同的抗体
编号 轻链 重链 hIgG1，356-358位
Ab10 L14 H51 DEL
Ab42 L14 H51 EEM
Ab6 L12 H51 DEL
Ab43 L12 H51 EEM
Ab13 L13 H53 DEL
Ab48 L13 H53 EEM
Ab51 L21 H64 DEL
Ab52 L21 H64 EEM
Ab14 L13 H54 DEL
Ab53 L13 H54 EEM
Ab24 L21 H61 DEL
Ab56 L21 H61 EEM
所述Ab42抗体氨基酸序列如下：
轻链：SEQ ID NO：38；重链：SEQ ID NO：46；
上述优选抗体按实施例3方法表达、纯化后用实施例2之方法检测其和人CLDN18.2+cell的结合活性，代表数据如下表18。结果表明，轻、重链恒定区的上述变化，包括hIgG1的356-358位分别是DEL或者EEM不影响本发明抗体的活性。
表18 本发明人源化anti-hCLDN18.2抗体IgG1Fc 356-358位DEL或EEM的结合活性
实施例9：本发明抗体Fc区(人IgG1)针对ADCC，CDC活性的序列优化
本发明抗体特异结合人CLDN18.2用于肿瘤治疗作用机理之一是可以通过抗体Fc介导效应细胞(effectorcells)对肿瘤细胞的杀伤达到治疗肿瘤的目的。本发明抗体人Fc区(hIgG1Fc)介导效应细胞ADCC和CDC作用，能特异增强靶向肿瘤细胞作用，对非特异靶点则导致靶点外的副作用。人抗体Fc区(hIgG1Fc)介导的ADCC和CDC作用有很多研究。本发明对所发现抗体分子的Fc区域针对人血细胞的效应作用(ADCC和CDC)进行了确认。具体地，在本发明抗体的人抗体Fc区域(hIgG1Fc)进行不同的突变，评价这些突变体的ADCC和CDC活性，突变设计见表19，活性数据见表20a，20b。
表19本发明抗体Fc(IgG1)针对ADCC，CDC的活性位点设计
上述优选抗体按实施例子3方法表达、纯化后得到抗体后，分别进行ADCC(抗体依赖性细胞毒性实验)和CDC(补体依赖细胞毒性实验)检测抗体Fc序列优化后的活性。具体地，
ADCC：
实施例1中构建好的hCLDN18.2+细胞，正常培养。培养基为DMEM/F12加10％FBS(上海源培生物科技股份有限公司Cat#L310KJ)，作为本实验ADCC用的靶细胞。
实验前一天，取培养好的hCLDN18.2+细胞，计数5000个/孔铺96-孔板。实验当天，准备PBMC细胞(本发明分离自人体外周血。人体外周血由本公司志愿者捐献)，按照150000cell/50μl浓度将PBMC悬浮于无血清RPMI1640培养基(培源生物，Cat#L210KJ)。待测药物用无血清RPMI1640配制，起始浓度40μg/ml按3倍比例稀释。
取出培养好的靶细胞(hCLDN18.2+细胞)，小心吸取移去上清，加入配制好的PBMC，50μl/孔；同时加入50μl/孔配制好的不同浓度的待测样品，后将靶细胞于37℃，5％CO2培养箱中孵育4小时，检测LDH。
LDH试剂盒为Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST，购自东仁化学科技(上海)有限公司，货号CK12。操作方法按说明书进行，取出孔板，在每孔中加入100μlWorkingSolution，包裹铝箔避光，在室温反应10-40min，MultiskanGO(ThermoFisher)酶标仪490nM读数，每隔10min检测一次，取合适的反应时间数据，用Graphpadprism5分析处理数据。
CDC：
实施例1 中构建好的hCLDN18.2+细胞，作为本实验CDC用靶细胞。hCLDN18.2+细胞正常培养，培养基为DMEM/F12加10％FBS(同ADCC)。实验前一天，收集靶细胞，计数，配制1×105/ml细胞，100μl/孔加入到96孔细胞培养板中。37℃，5％CO2孵育过夜备用。
实验当天，移走96-孔板细胞中的培养基，用PBS洗2遍待用。待测抗体用无血清培养基(RPMI1640)稀释，抗体起始浓度为20μg/ml，按5倍稀释。将50μl/孔稀释抗体加入PBS洗过的靶细胞培养板(0μg/ml抗体孔用新鲜培养基100μl/孔，作为对照孔)，各个浓度点设6个复孔。37℃，5％CO2孵育15min。
准备补体：取新鲜血清于灭菌的离心管中。分取一半血清于56℃水浴锅孵育30分钟灭活补体，作阴性对照。将灭活和没有灭活的血清，分别用RPMI1640培养基配成血清：RPMI1640培养基＝40％：60％，即40％为血清，60％为RPMI1640。
向含不同浓度待测抗体的靶细胞培养板中加入50μl/孔稀释好的血清，即血清终浓度为20％；样品(抗体)的起始浓度为10μg/ml。前3复孔加入有补体的血清，后3复孔加入灭活补体的血清。37℃，5％CO2度培养箱孵育2小时，后取出用LDH试剂盒检测。
LDH试剂盒为Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST，购自东仁化学科技(上海)有限公司，货号CK12。操作方法按说明书进行，取出孔板，在每孔中加入100μl WorkingSolution，包裹铝箔避光，在室温反应，每隔10min检测一次，取合适的反应时间数据，MultiskanGO(ThermoFisher)酶标仪490nM读数，Graphpadprism5分析处理数据。
表20a本发明抗体Fc(IgG1)突变体ADCC活性检测
样品 EC50(μg/ml)
Ab6 1.40
Ab59 检测不到(无结合)
Ab60 0.431
Neg IgG* 检测不到(无结合)
*Neg IgG：为和靶点没有结合的非特异性抗体
表20b 本发明抗体Fc(IgG1)突变体CDC活性检测
样品 EC50(μg/ml)
Ab6 0.290
Ab59 检测不到(无结合)
Ab60 0.973
Ab24 0.255
Ab65 检测不到(无结合)
Ab66 0.927
Neg IgG* 检测不到(无结合)
*Neg IgG：为和靶点没有结合的非特异性抗体
结果表明，本发明抗体如果用hIgG1的形式，其Fc区域第243位F单个位点突变，比如F243L、L234A、L235A、L234A/L235A会完全失去本发明抗体的ADCC和/或CDC活性；如Fc区域第239、330、332三个位点组合突变，比如S239D/A330L/I332E，则本发明抗体CDC活性有所减弱。
实施例10：本发明抗体不同人源化分子ADCC、CDC活性评估
为了评估本发明人源化抗体分子ADCC和CDC活性，用同上述实施例子的方法，和对照分子(Ref)一起，检测了本发明人源化分子的ADCC和CDC活性，结果见下表21a、21b和图3。
表21a本发明抗体不同人源化分子ADCC活性评估
样品 EC50(μg/ml)
Ab10 1.55
Ab6 1.40
Ref 1.39
Neg IgG* 检测不到(无结合)
*Neg IgG：为和靶点没有结合的非特异性抗体，下同
表21b本发明抗体不同人源化分子CDC活性评估
样品 EC50(μg/ml)
Ab10 0.648
Ab35 检测不到(无结合)
Ab6 0.293
Ab36 1.75
Ab14 0.265
Ab24 1.30
Ab13 0.374
Ab51 2.12
Ref 2.31
Neg IgG* 检测不到(无结合)
上述结果表明，本发明人源化抗体ADCC活性和对照抗体(Ref)相当(表21a)。意外地，本发明人源化分子，包括含不同回复突变的人源化分子之间，Ab6，Ab13，Ab14等的CDC活性接近(EC50分别为0.293μg/ml，0.374μg/ml，0.265μg/ml)且比Ab10(0.648μg/ml)好1倍以上，尤为意料之外的是，Ab6、Ab13及Ab14等的CDC活性比对照抗体(EC50＝2.31μg/ml)好近10倍(见表21b、图3)。Ab36、Ab24的CDC活性也都比对照抗体Ref要好。
Ab35(CDR1，CDR3NS突变体，参见实施例子7，表16c)因为失去了结合活性，而检测不到CDC活性。
实施例11：本发明抗体诱导肿瘤细胞(hCLDN18.2+cell)凋亡活性评价
为检测本发明抗体，特别是优选人源化抗体诱导hCLDN18.2+cell(肿瘤细胞)凋亡的作用，我们用本发明实施例1中构建好的hCLDN18.2+cell，检测了本发明抗体诱导肿瘤细胞凋亡活性。hCLDN18.2+cell正常培养(培养基含10％FBS的DMEM/F12，供应商：上海源培生物科技股份有限公司，货号：L310)，作为本实验所用细胞。实验开始，hCLDN18.2+cell铺96-孔板，铺板密度为2×104/孔。37℃，5％CO2培养过夜贴壁。抗体样品准备：用无血清DMEM/F12培养基制备0μg/ml，1μg/ml，3μg/ml，10μg/ml抗体样品。取出过夜贴壁培养的hCLDN18.2+cell，弃培养基，并用PBS洗细胞两次。分别加入准备好的不同浓度的抗体样品，100μl/well。继续培养24h后，检测LDH。
LDH试剂盒为Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST，购自东仁化学科技(上海)有限公司，货号CK12。操作方法按说明书进行，取出孔板，在每孔中加入100μl WorkingSolution，采用包裹铝箔等方法避光，在室温反应，在不同的时间点(10min，20min，30min，40min，50min)，Multiskan GO(ThermoFisher)酶标仪490nM读数，找出最佳的反应时间，取读数值用Graphpad prism 5分析处理数据。
结果见图4a、图4b。图4a、4b结果表明，本发明人源化抗体Ab10，Ab6，Ab14，Ab24，Ab36等诱导肿瘤细胞凋亡的活性都比对照分子(Ref)好，活性好/强3-10倍，这些分子10μg/ml浓度已经比对照分子的30μg/ml活性相当或者甚至比阳性分子30μg/ml活性还强。
具体地，Ab610μg/ml增加肿瘤细胞凋亡活性(46.7％)比阳性对照同浓度(15.3％)好2倍以上；甚至比阳性对照30μg/ml(19.6％)还好1倍以上；而30μg/ml浓度时诱导肿瘤细胞凋亡活性(85.1％)比同浓度下对照抗体(19.6％)的好3倍以上。
更意外地，Ab610μg/ml增加肿瘤细胞凋亡活性(46.7％)比Ab10同浓度(33.2％)好41％；30μg/ml浓度时诱导肿瘤细胞凋亡活性(85.1％)则比同浓度下Ab10(34.7％)的强1倍多。
实施例12：本发明抗体抑制肿瘤细胞(hCLDN18.2+cell)增殖作用
为检测本发明抗体对肿瘤细胞的增殖抑制所用，用实施例子1构建的hCLDN18.2+细胞进行了活性检测。具体地，hCLDN18.2+细胞正常培养(培养基：含10％FBS的DMEM/F12，供应商：上海源培生物科技股份有限公司，货号：L310)。实验开始时，取对数期生长的hCLDN18.2+细胞铺96-孔板，铺板密度为3×103/孔。37℃，5％CO2培养过夜贴壁培养。抗体样品准备：用含10％FBS的DMEM/F12(源培生物)配制1μg/ml，10μg/ml，30μg/ml抗体样品。取出过夜贴壁培养的hCLDN18.2+细胞，弃培养基，并用PBS洗细胞一次，后分别加入准备好的不同浓度的抗体样品，100μl/well。继续培养72h后，用CCK-8试剂盒检测。
CCK-8试剂盒为Cell Counting Kit-8，购自东仁化学科技(上海)有限公司，货号CK04。操作方法按说明书进行，取出96孔板，在每孔中加入10μl CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，否则会影响读数)，将培养板在培养箱中孵育1-4h，找出最优检测时间点，Multiskan GO(ThermoFisher)酶标仪450nM读数，数值用Graphpad prism 5分析处理数据。结果见下表22。
表22本发明优选人源化抗体抑制肿瘤细胞(hCLDN18.2+cell)增殖活性(抑制率％)
样品/浓度 1μg/ml 10μg/ml 30μg/ml
Neg IgG 0 0.34 0.1
Ab10 2.17 2.93 3.16
Ab6 3.29 6.12 6.2
Ref 2.34 2.94 3.9
表22结果表明，阴性抗体1μg/ml，10μg/ml，30μg/ml浓度下抑制肿瘤细胞活性(抑制率)在1％以下，即本底水平。1μg/ml，10μg/ml，30μg/ml Ab10抑制肿瘤细胞活性(抑制率)在2.17％-3.16％，这和Ref的抑制率2.34％-3.9％接近。而Ab6抑制肿瘤细胞活性则比Ref强很多，例如10μg/ml抑制率6.12％是Ref(2.94％)的2倍以上。
实施例13：本发明人源化抗体和鼠CLDN18的结合活性检测
按照前述实施例2之方法，检测了本发明人源化优选抗体和鼠CLDN18.1+cell和鼠CLDN18.2+cell的结合活性。在筛选过程中，我们筛选得到了一个克隆(抗体L180)，该抗体和人和鼠的CLDN18.1均有结合。作为本assay的对照，L180和mCLDN18.1+cell结合活性EC50＝0.48nM，表明本发明构建鼠CLDN18.1+cell和抗CLDN18.1抗体有特异结合。而本发明优选人源化抗体和mCLDN 18.1+cell均没有结合，且都保留了同鼠源抗体mab5b一样的和mCLDN18.2+cell的结合活性，见下表23。
表23 本发明优选人源化抗体和mCLDN18.2+cell的结合活性
样品 EC50(nM) Emax
mab5b 0.375 2.17
Ab10 0.371 2.27
Ab35 ND# ND
Ab6 0.594 2.47
Ab36 0.518 2.18
Ab14 0.399 2.39
Ab24 0.574 2.22
Ab13 0.422 2.37
Ab51 0.474 1.91
Neg IgG* 无结合 0.19(本底)
#：未检测。
上述结果表明，本发明优选人源化抗体都保留了和mCLDN18.2+cell的结合活性。EC50和人源化前的mab5b(同一assay中EC50＝0.375nM)具有相同的结合活性。Emax在1.91(Ab51)-2.47(Ab6)之间，和mab5b(2.17)接近。
实施例14：本发明抗体体内药效活性评估
为了评价本发明抗体的抗肿瘤活性，用BALB/c裸小鼠皮下移植hCLND18.2+细胞(实施例1构建)或者胃癌细胞系NUGC4(上海素尔生物科技有限公司)建立的动物药效模型，进行本发明抗体体内药效评估。
具体地，hCLDN18.2+细胞培养基为DMEM/F12(源培生物)加10％胎牛血清(上海博升生物科技有限公司，货号BS-0002-500)。NUGC4细胞培养基为RPMI1640(源培生物)，加10％胎牛血清。培养条件为37℃，5％CO2。BALB/cNude小鼠，雌性，4周龄，体重18-20g，购自上海西浦尔必凯实验动物有限公司(生产许可证编号：SCXK(京)2012-0001)，室温20-25℃，湿度40-60％，自由进食进水，适应性饲养3-4天。适时更换垫料、洁净笼具。取对数生长期细胞，收集并计数。
对于hCLDN18.2+细胞异体移植模型，取hCLDN18.2+细胞用PBS洗2次后，重悬配成细胞1×108/ml。在小鼠左翼皮下接种0.1ml共1×107细胞/只。挑选肿瘤长至体积约120-180mm3大小小鼠，随机分组，每组5-6只。
对于胃癌NUGC4细胞异体移植模型，取NUGC4细胞用RPMI1640洗2次后，加入Matrigel，使其与RPMI640比例为1∶1，用混合液重悬配成细胞，1×108/ml。在小鼠左翼皮下接种0.1ml共1×107细胞/只。挑选肿瘤长至体积约150-200mm3大小小鼠，随机分组，每组5-6只。
待测样品用PBS配制，无菌。Blank为PBS无样品对照，和靶点无关的抗体，即阴性抗体(Neg IgG)对照。腹腔注射，200μg/100μl/只。2次/周，连续数周。注射样品当天为第0天。每次给药前测量体重，肿瘤体积，记录数据。
肿瘤大小计算公式：肿瘤体积TV(mm3)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径2)。相对肿瘤增长率(T/C％)＝100％*(T-T0)/(C-C0)。抑瘤率(TGI)＝(1-T/C)*100％。其中T0、T分别为样品组实验开始时及实验结束时的肿瘤体积；C0、C分别为对照组实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。
动物体内药效结果见图5a，5b(hCLDN18.2+细胞异体移植模型)和下表24(NUGC4肿瘤细胞异体移植模型)。
用人CLDN18.2高表达细胞(hCLDN18.2+cell)建立的肿瘤异体移植模型中，图5a结果显示，本发明抗体Ab10，Ab6和阳性抗体分子(Ref)一样显示非常好的体内药效活性，抑制肿瘤细胞生长和/或杀死肿瘤细胞(抑制率)达到90％以上；意想不到的是，轻链CDR1和重链CDR3脱氨基敏感位点优化，轻链CDR1人源化优化的优选抗体Ab36完全抑制肿瘤生长，其体内药效明显优于Ab6，Ab10以及对照阳性抗体(Ref)。图5b结果显示，本发明完全人源化抗体(没有回复突变)Ab13，及其轻链CDR1和重链CDR3脱氨基敏感位点优化的完全人源化抗体Ab51，以及轻链CDR1和重链CDR3脱氨基敏感位点优化，重链仅有2个回复突变的人源化抗体Ab24均显示了和对照抗体一样的体内药效。
表24本发明抗体在胃癌细胞系NUGC4肿瘤模型中的药效评价
NA：不适应，即空白对照。
在人胃癌细胞系NUGC4建立的肿瘤模型中，上述结果(表24)表明，本发明人源化优选抗体Ab10，Ab6均显示了一定药效，肿瘤抑制率在10％-20％，并且呈现剂量依赖。而同样的模型中，对照抗体(Ref)则和PBS对照，阴性抗体(Neg IgG)一样，没有抑制肿瘤效果。这一结果表明，本发明抗体具有优于阳性对照抗体的体内药效效果。
实施例15：本发明抗体小鼠药物代谢动力学(PK)评价
如上述实施例子13所述，本发明抗体和小鼠CLDN18.2有很好的结合活性，这为本发明抗体提供了临床前研究非灵长类物种选择。本发明评估了本发明抗体在小鼠体内的药物代谢动力学(PK)特性。
具体地，实验用Balb/c小鼠，雌性，6周龄，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。小鼠购进后，每笼6只，无限量获取饲料和水。实验室环境饲养3天，温度20-25℃；湿度40-60％，12/12小时光/暗周期调节。实验开始前一天，对小鼠进行体重测量，取20-25g小鼠，进行分组编号，3只/组。实验当天，每只小鼠分别皮下注射受试药物Ab10和对照抗体(Ref)，药物给药剂量为10mg/kg，皮下注射100μl/只/次。
注射小鼠后0、1、6、24、26、30、50、55、71、79、98、143、167、191、215、240小时分别眼眶取血。所取血样离心，取上清，-20度保存，待测。等收集完血液样本后，用前述实施例子2之ELISA方法检测血清中的血药浓度。正式检测之前，取一只小鼠血清，进行梯度稀释，确定血清最佳稀释比例。所有样品按照最佳稀释比例进行ELISA检测，检测结果用T1/2计算公式和EXCEL软件对数据进行分析，结果如下表25。
表25本发明抗体在小鼠体内PK评价
上述表25结果表明，本发明抗体Ab10的Cmax比对照抗体(Ref)高57％([407.7-259.3]/259.3)。更加意外的是，本发明抗体Ab10的半衰期T1/2比对照抗体(Ref)要长30.7多个小时(170.1-139.4)，小鼠体内长达30小时的T1/2优势，预期人体内优势会更大。这些结果表明，本发明人源化抗体具有比对照抗体优良的PK性能，特别是半衰期T1/2的显著优势，预期为临床至少可以带来药效(时间长)和成本(给药频率低)等优势。
实施例16：本发明抗体亲和力分析(KinExA)
CLD18.2为细胞跨膜蛋白，四次跨膜，两个胞外区ECL1和2均只有20-50氨基酸长度。本发明抗体特异结合CLDN18.2胞外区。常规表达抗原(20-50氨基酸)和抗体结合的Biacore检测方法不能很好评估本发明抗体和靶蛋白胞外区域特异亲和力。因此，本发明用KinExA方法检测抗体和hCLDN18.2+细胞的亲和力。方法参考KinExA 4000仪器说明书进行，即以待测抗体Ref，Ab10分别为Constant binding Partner(CBP)，以hCLDN18.2+细胞为Titrant。用固定浓度的抗体(CBP)梯度稀释细胞(Titrant)，孵育后通过抗人IgG Fc的柱子捕获未结合细胞的游离抗体(free CBP)，用anti-human Fc Alexa Flour 647获得信号值，通过KinExA自带软件计算获得抗体亲和力。
具体地，为了确定合适的抗体稀释液的浓度，首先根据预估的亲和力推算合理浓度进行信号测试，确定分别以500ul 120pM Ref抗体及100pM Ab10抗体作为Signal 100％，该浓度下获得满意的检测净信号值，PBS空白作为阴性信号值(NSB)。将120pM Ref抗体及100pM Ab10抗体浓度确定为CBP浓度。接下来的平衡实验中，300g离心10分钟分别收集两管hCLDN18.2+细胞，每管细胞数为5×108个(阳性率经FACS检测为100％)。用PBS清洗一次细胞，300g离心10分钟，将细胞分别收集到15ml离心管中。分别准备15ml 120pM Ref及100pMAb10抗体溶液。向5×108个细胞中加120pM Ref抗体溶液至2ml，并以120pM Ref抗体溶液作为缓冲液2倍梯度稀释细胞，起始浓度2.5×108细胞/ml，18个梯度，每个梯度0.6ml。向5×108个细胞中加100pM Ab10抗体溶液至2ml，并以100pM Ab10抗体溶液作为缓冲液2倍梯度稀释细胞，起始浓度2.5×108细胞/ml，18个梯度，每个梯度0.6ml。将细胞与抗体的悬液室温震荡孵育2h。孵育结束后，450g，离心10分钟，取上清。准备1μg/ml anti human Fc AlexaFlour 647溶液。将样品放在管架中相应的位置。用KinExA3200仪器检测信号值并获得亲和力数据。结果如下表所示。结果显示：Ab10的亲和力(13.3pM)比Ref抗体亲和力高10倍以上。
表26本发明抗体亲和力(M)检测
样品 Ab10 Ref
KD 1.33×10-11 1.44×10-10
实施例17：本发明抗体内吞活性检测
hCLDN18.2+cell长到90％时，胰酶消化，用FACS buffer(PBS+1％BSA)重悬细胞，终浓度为1x106/ml细胞。加细胞悬液500μl到1.5ml离心管，加带荧光标记的抗体对照抗体(和hCLDN18.2+cell没有结合的抗体)，对照抗体Ref，待测样品(本发明优选人源化抗体)Ab10，Ab6(抗体标记用的是mix-n-stain CF488 antibody labeling kit标记，Sigma-Aldrich，Cat#MX488S100-lkit。或mix-n-stain CF633 antibody labeling kit标记，Sigma-Aldrich，Cat#MX633S100-lkit。标记步骤均按照试剂盒中的说明书进行)，终浓度为1μg/ml或10μg/ml，冰上孵育1小时，用预冷的FACS buffer洗涤三次。取出1/5在冰上放置，作为结合值样品直接用于流式检测。余下的4/5细胞，用37℃预热的1640+10％FBS重悬细胞，分1/4直接放于冰上，做为内吞0小时样品，余下的放在37℃培养箱孵育，分别在1hr，2hr，3hr取出，冰上预冷，终止内吞，4℃1300rpm离心3分钟，弃上清。将0hr，1hr，2hr，3hr加入strip buffer(0.05M glycine，pH2.45+0.1M NaCl)250μl，室温7min，4℃1300rpm离心3分钟，弃上清，FACS buffer洗涤一次。所有样品加入150μl 4％多聚甲醛(生工生物工程Cat#E672002)，4℃固定半小时后，上机检测(Beckman CytoFLEX流式细胞仪)。结果见下表。
表27本发明抗体的内吞活性(FACS荧光强度，CF488标记抗体)
上述结果(用CF488标记待测抗体)表明，在抗体浓度为1μg/ml的时候(上表左半部分)，对照抗体(Ref)的结合荧光强度(1939)和阴性抗体(和hCLDN18.2+细胞没有结合的抗体)的荧光强度值(1747)接近，即本底值。而且，0h，1h，2h，3h荧光强度值(划线数值)也都接近本底(1747)。而本发明抗体Ab10，Ab6的结合值(荧光强度)分别为27200，16300是本底的15倍和9倍，分别是对照抗体的14倍(27200/1939)和8.4倍(16300/1939)。这进一步证明了本发明抗体的结合Emax比对照抗体(Ref)强。
当在抗体浓度增加到10μg/ml的时候(上表右半部分)，阴性抗体(和hCLDN18.2+细胞没有结合的抗体)的荧光强度值，即本底值为1284-3485(划线数字)。对照抗体(Ref)的荧光强度(结合值)为17900，比本底(3485)高出4倍，说明Ref在高达10μg/ml的时候，才检测到荧光标记抗体的特异结合。而同样的浓度下，本发明抗体Ab10，Ab6的结合强度(荧光值)分别为138000，86000，是本底(3485)的39倍和24倍，分别是Ref的7.7倍(138000/17900)和4.8倍(86000/17900)。这进一步说明本发明抗体的结合Emax比对照抗体(Ref)要强得多。这和上述KinExA检测的结果也是一致的。
将上表中的数据按照公式内吞百分比(％)＝(待测时间点荧光强度-0h荧光强度)/结合值，得到如下表数据。
表28本发明抗体(CF488标记)的内吞活性(内吞％)
本底：即读值为本底值，没有内吞；NA：不适用，该时间点没有内吞
上述结果表明，本发明优选抗体Ab10，Ab6在1μg/ml浓度的时候(上表左半部分)，1h，2h，3h均显示了比较好的内吞作用，3h内吞分别为28％和25％。而同等条件下，Ref抗体和阴性对照抗体一样，没有看到内吞。
当抗体的量加大到10μg/ml(上表右半部分)时候，对照抗体仍然只有非常小的内吞(7％-8％)，几乎接近本底，即没有内吞。而本发明抗体Ab10，Ab6内吞仍然随时间延长而增加，到3h，分别为23％和18％。这不及1μg/ml抗体浓度的28％和25％，说明因为本发明抗体结合活性优于Ref很多，10μg/ml对于本发明抗体过饱和而非最优化的抗体内吞浓度。
上述这些结果表明，本发明优选人源化抗体是内吞抗体。而对照抗体(Ref)不是内吞抗体，或者内吞非常微弱。为了进一步证明本发明优选抗体的内吞活性，选用不同于CF488的荧光染料CF633(Sigma-Aldrich，Cat#MX633S100-1kit)进行了标记抗体和内吞活性分析，检测仪器为BD FACS Calibur流式细胞仪。结果如下表。
表29本发明抗体的内吞活性(FACS荧光强度，CF633标记抗体)
上述结果(用CF633标记待测抗体)表明，在抗体浓度为1μg/ml的时候(上表左半部分)，阴性抗体和hCLDN18.2+细胞没有结合的荧光强度值即本底值为23。0h，1h，2h，3h荧光强度值(划线数值)也都接近本底(12.7-13.7，即2倍以内小于100均为本底值)。对照抗体(Ref)的结合荧光强度(62.5)接近本底(阴性抗体，23)，在2倍范围内(62.5/23＝2.7)。而且在0，1，2，3h结合荧光强度值均比较弱(15.5-33.4)，特别是1，2，3h读值没有变化(33.9，33，7，33.4)说明这些数值基本接近本底水平。
而本发明抗体Ab10，Ab6的结合值(荧光强度)分别为854，690是本底的37倍(854/23)和30倍(690/23)，分别是对照抗体的14倍(854/62.5)和11倍(690/62.5)。这进一步证明了本发明抗体的结合Emax比对照抗体(Ref)要强很多。这和上述KinExA的结果也是一致的。
当在抗体浓度增加到10μg/ml的时候(上表右半部分)，阴性抗体(和hCLDN18.2+细胞没有结合的抗体)的荧光强度值，即本底值为23.2-14.9(划线数字)。对照抗体(Ref)的荧光强度(结合值)为198，是本底(23.2)的8.5倍，说明Ref在高达10μg/ml的时候，能检测到荧光标记抗体的特异结合。而同样的浓度下，本发明抗体Ab10，Ab6的结合强度(荧光值)分别为3229和2237，分别是本底(23.2)的139倍和96倍，分别是Ref的16倍(3229/198)和11倍(2237/198)。这进一步说明本发明抗体的结合Emax比对照抗体(Ref)要强很多(荧光读值强10倍以上)。
将上表中的数据按照公式内吞百分比(％)＝(待测时间点荧光强度-0h荧光强度)/结合值，得到如下表数据。
表30本发明抗体(CF633标记)的内吞活性(内吞％)
本底：即读值为本底值，没有内吞；NA：不适用，该时间点没有内吞
上述结果表明，本发明优选抗体Ab10，Ab6在1μg/ml浓度的时候，1h，2h，3h均显示了比较好的内吞作用，3h内吞分别为35.1％和30.4％。而同等条件下，Ref抗体(结合强度在本底2-3倍内)和阴性对照抗体一样，没有内吞作用。
当抗体的量加大到10μg/ml(上表右半部分)时候，对照抗体仍然只有非常小的内吞(5％-8％)，几乎接近本底，即没有内吞。而本发明抗体Ab10，Ab6内吞随时间延长而增加，到3h，分别为27.3％和28.9％(见图6)。这不及1μg/ml抗体浓度的35.1％和30.4％，说明因为本发明抗体结合活性优于Ref很多，10μg/ml对于本发明抗体已是过饱和浓度，而非最优化内吞作用的浓度。
综合上述两个不同荧光染料(CF488和CF633)实验结果表明，本发明优选人源化抗体Ab10，Ab6是内吞抗体。这个完全不同于对照抗体(Ref)。对照抗体没有内吞作用的，或者内吞非常微弱的，接近本底水平。
实施例18：抗CLDN18.2抗体Ab10偶联毒素SMCC-DM1(ADC1)制备
本发明抗CLDN18.2抗体Ab10偶联毒素SMCC-DM1(ADC1)的制备方法参考专利CN106188293A和US2009202536A1所公开的方法，具体地步骤如下。
第1步，制备中间体。将1mg SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯，上海瀚鸿化工科技有限公司，批号BH-4857-111203)溶解于0.55mL乙腈溶液，备用；取Ab10抗体(pH＝6.5，PBS缓冲液)50mg(5ml)加入上述备用的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯的乙腈溶液，于25℃下振荡反应2小时。反应结束后用SephadexG25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)后得到中间体溶液，即上述合成线路中第一步和第二步之间的分子，并浓缩到约8mg/ml后进行下一步反应。
第2步，抗体-毒素偶联。取第1步得到的中间体溶液5mg，加入L-DM1乙醇溶液(3.0mgL-DM1/ml乙醇)。L-DM1可采用公知的方法文献“Journal of MedicinalChemistry.2006，49，4392-4408”制备得到，加入L-DM1的量按照L-DM1：中间体＝3：8mg比例加入。于25℃下振荡反应约4.0小时后，将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，即得本发明抗CLDN18.2抗体Ab10偶联毒素SMCC-DM1产物ADC1溶液。所得ADC1终浓度1.3mg/ml，分装于4℃储存备用。
所得ADC1样品用LC-MS方法检测分析，证明所得样品中没有游离的毒素小分子。用分光光度计(UV方法)检测A252，A280吸收峰，测定所得ADC1毒素和抗体的比例DAR＝4.4。
实施例19：抗CLDN18.2抗体Ab10偶联毒素MC-VC-PAB-MMAF(ADC2)制备
本发明抗CLDN18.2抗体Ab10偶联毒素MC-VC-PAB-MMAF(ADC2)的制备方法参考专利CN106188293A和US20140127211A1所公开的方法，具体地步骤如下。
第1步，制备中间体。取0.7mg硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯溶解于0.9mL乙腈溶液，备用。取Ab10抗体(pH＝4.3的乙酸/乙酸钠缓冲液)50mg(5ml)加入上述备用的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯的乙腈溶液，然后滴加1.0ml的氰基硼氢化钠(14.1mg)水溶液，于25℃下振荡反应2小时。反应结束后，用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)后，得产物1a溶液(见上述线路示意)，将1a浓缩到约10mg/ml进行中间体1b的制备。其中，所述x≤y。
取5ml上述1a溶液，加入0.15ml的2.0M盐酸羟胺溶液，于25℃下振荡反应30分钟后，将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)后，得到上述线路中的中间体1b，即Ab10-丙硫醇溶液。
第2步，抗体-毒素偶联。取1.6mg化合物MC-VC-PAB-MMAF(可采用PCT专利WO2005081711公开的方法制备得到)溶解于0.3ml乙腈中，加入上述制备的中间体Ab10-丙硫醇溶液5mg，于25℃下振荡反应4小时后，将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的含0.05M的PBS溶液)，即得到本发明抗CLDN18.2抗体Ab10偶联毒素MC-VC-PAB-MMAF偶联物ADC2(结构示意如下式)。
所得ADC2的终浓度为1.21mg/ml，分装于4℃储存备用。所得ADC2样品用LC-MS方法检测分析，证明所得样品中没有游离的毒素小分子。用分光光度计(UV方法)检测A252，A280吸收峰，测定所得ADC2毒素和抗体的比例DAR即y＝4.8。
实施例20：抗CLDN18.2抗体Ab10细胞毒性偶联物ADC1，ADC2结合活性检测
用实施例子2所述ELISA方法检测本发明抗体Ab10，以及Ab10抗体细胞毒素偶联物ADC1，ADC2和hCLDN18.2+cel的结合活性，结果见下表。
表31本发明Ab10抗体细胞毒性偶联物ADC1，ADC2结合活性(EC50)
样品 ADC1 ADC2 Ab10
EC50(nM) 0.344 0.310 0.164
上述结果表明，Ab10抗体细胞毒素偶联物ADC1，ADC2和靶细胞(hCLDN18.2+cell)的结合活性(EC50)和抗体Ab10比稍微有点减弱，但在2倍(误差)范围内。
实施例21：抗CLDN18.2抗体Ab10细胞毒性偶联物ADC1，ADC2内吞活性检测
用上述“发明抗体内吞活性检测”(实施例17)同样的方法检测本发明抗体Ab10，以及Ab10抗体细胞毒素偶联物ADC1、ADC2的内吞活性。在上述实施例的基础上，优化标记方法(选用CF633染料)，抗体浓度(2.5μg/ml)和时间(1小时)等内吞检测条件，结果如下表。
表32本发明Ab10抗体细胞毒性偶联物ADC1，ADC2内吞活性检测
样品 结合值1) 内吞前(0h) 内吞后(1h) 内吞比例(％)3)
阴性抗体 932 2) 935 944 NA
Ab10 6135 1191 2055 14.1
ADC1 4136 1200 2119 22.2
ADC2 4254 1788 2754 22.7
1)结合值，内吞前，内吞后数值为CF633标记抗体FACS检测读值；
2)划线数字为本FACS结合的本底值；
3)内吞比例(1小时)＝100*(内吞后-内吞前)/结合值；NA：不适用
上述结果表明本发明Ab10抗体细胞毒素偶联物ADC1，ADC2保留了抗体Ab10的内吞活性。也就是说，连接毒素的抗体Ab10没有影响抗体的内吞活性。
实施例22：抗CLDN18.2抗体Ab10细胞毒性偶联物ADC1、ADC2抑制靶胞增殖活性
为了检测Ab10抗体细胞毒性偶联物ADC1，ADC2抑制靶细胞增殖活性，用CCK8方法(试剂盒购自东仁化学科技(上海)有限公司，货号CK04。按说明书进行操作)检测细胞增殖作用。具体地，用含10％FBS的DMEM/F 12培养基培养hCLDN18.2+细胞(靶细胞)和hCLDN18.1+细胞(非CLDN18.2靶细胞，作为对照细胞)，在培养72小时结束前2小时，每孔加入10ulCCK8，培养箱中继续培养2小时，用Multiskan GO酶标仪获得OD450nM读数，用Graphpadprism 5分析处理数据。细胞增殖抑制百分比(％)＝100*(1-(OD450样品/OD450对照孔))，结果见下表。
表33 本发明Ab10抗体细胞毒性偶联物ADC1，ADC2抑制靶细胞增殖活性(IC50，nM)
上述结果，本发明Ab10抗体细胞毒素偶联物ADC1和ADC2分子可以显著抑制靶点特异性细胞(hCLDN18.2+cell)的增殖，IC50分别为11.2nM和0.71nM。ADC1对于非靶点细胞(本实验用的是和Ab10抗体没有结合的hCLDN18.1+细胞)没有抑制作用，安全窗口高达3000。ADC2在极高的浓度(IC50为18.5nM)看到对非靶点特异细胞的抑制，这种抑制是因为高剂量(高达10-100nM)直接导致的非靶向毒性。这和ADC2所连的MMAF的高毒性特点一致。ADC2的安全窗口达到了26。
实施例23：抗CLDN18.2抗体Ab10细胞毒性偶联物靶向细胞毒性活性检测
为检测本发明Ab10抗体细胞毒素偶联物特异靶向CLDN18.2+细胞毒性，本实施例以ADC1为例子，通过检测细胞上清中LDH的释放评价本发明抗CLDN18.2抗体Ab10细胞毒性偶联物靶细胞毒性活性。
具体地，用含10％FBS的DMEM/F12培养基培养hCLDN18.2+细胞(靶细胞)和hCLDN18.1+细胞(非CLDN18.2靶细胞，作为对照细胞)至对数生长期。实验前一天，取培养好的hCLDN18.2+细胞和hCLDN18.1+细胞，用含10％FBS的DMEM/F12培养基重悬细胞，调整细胞浓度为4×104/ml细胞，100μl/孔加入到96孔细胞培养板中；37℃，5％CO2孵育过夜；实验当天，移走96孔板细胞中的培养基，每孔加入含2％FBS的DMEM/F12培养基待用；用含2％FBS的DMEM/F12培养基配制梯度稀释的待测药物ADC1，0μg/ml抗体孔用新鲜培养基，作为对照孔；向细胞中加入准备好的不同浓度的抗体样品，每孔50μl，每个浓度三个复孔；37℃，5％CO2度培养箱孵育72小时后取出上清用LDH试剂盒(购自东仁化学科技(上海)有限公司，货号CK12)检测LDH的释放。检测方法按照说明书进行。用Multiskan GO酶标仪490nM读数，Graphpad prism 5分析处理数据。细胞杀伤百分比(％)＝100*(OD490待测样品-OD490对照孔)/(OD490细胞全部裂解-OD490对照孔)。实验结果如下表所示。
表34本发明Ab10抗体细胞毒性偶联物ADC1靶向细胞毒性(EC50，nM)评价
上述结果表明，本发明Ab10抗体细胞毒性偶联物特异靶向hCLDN18.2+阳性细胞毒性强，EC50在1nM以下。而针对非靶向细胞(本实验用的是和Ab10抗体没有结合的hCLDN18.1+细胞)的细胞毒性作用弱(没有细胞毒性)。特别地，ADC1在靶向特异细胞和非特异细胞之间的毒性(EC50)的比率高达156。这一特异性窗口(安全窗口)显示该分子的非靶向毒性很弱，安全性可靠。
实施例24：抗CLDN18.2抗体Ab10细胞毒性偶联物的体内药效
用同实施例子14的方法中的BALB/c裸小鼠皮下移植hCLND18.2+细胞动物模型和试验方法，用ADC1为例子，评价了本发明抗体Ab10抗体细胞毒性偶联物体内药效。结果见表35。
表35本发明抗体偶联药物ADC1在肿瘤模型中的药效评价
NA：不适应，即空白对照。
表35结果表明，本发明抗体毒素偶联药物ADC1在低浓度(2mg/kg)，仅4次给药，2周(14天)就看到了非常好的肿瘤抑制效果，46％抑制率，和对照组差异极显著(P value＜0.001)。
用同实施例14方法中，将其中的肿瘤细胞，用胃癌细胞系NUGC-4过表达hCLDN18.2的细胞系接种BALB/c裸小鼠，评估本发明ADC2的动物药效。具体地，胃癌细胞系NUGC-4细胞购自中科院细胞所。用实施例1方法构建hCDLN18.2过表达细胞系NUGC-4-802。NUGC-4-802培养于含10％胎牛血清(上海博升生物科技有限公司，货号：BS-0002-500)的RPMI1640培养基中(上海源培生物科技股份有限公司，货号：L210KJ)，在含5％CO2的37℃的细胞培养箱中连续培养。待NUGC-4-802细胞长至对数生长期(汇合率在80％-90％)时，用0.25％胰酶消化，收集细胞，并用无血清的RPMI1640培养基洗涤两次，重悬计数，调整细胞浓度为5×107细胞/ml。接种5×106个/100μl于BALB/c-裸鼠，右肋部皮下，挑选肿瘤细胞长至体积约120-150mm3大小后随机分组，每组6只。
待测样品ADC2、Ab10用PBS配制，无菌。Blank组为PBS。给药剂量为5mg/kg，静脉注射。2次/周，连续2周。各注射样品给药当天为第0天。每次给药前测量体重，肿瘤体积，记录数据。数据统计分析方法同前述实施例14。本次实验实际给药周期2周。结果见表35b。
表35b本发明抗体偶联药物ADC2在肿瘤模型中的药效评价
表35b结果表明，本发明抗体毒素偶联药物ADC2在5mg/kg，仅4次给药，2周(14天)在NUGC-4-802肿瘤模型上就看到了非常好的肿瘤抑制效果，抑制率达62％，和对照组PBS差异显著(P value＜0.05)。特别意想不到的是，该模型中，同样浓度的抗体Ab10抑瘤效果很弱(仅10％)。这一意想不到的结果表明本发明抗体毒素偶联药物ADC2有突出优于单独抗体(裸抗)的抑瘤效果。
实施例25 双特异性抗体中抗原、抗体的克隆、表达和纯化
本发明所用的人CLDN18.2设计见上述实施例；PD-1、PD-L1细胞外区-人IgG1 Fc融合蛋白、-histag蛋白、单克隆抗体及设计的不同结构的双特异抗体等或由本发明克隆、表达纯化得到，或购自北京百普赛斯生物科技有限公司和北京义翘神州科技有限公司(Sinobiological)。
抗原序列由NCBI数据库查询得到。本发明所用抗体，包括重组抗体、双特异性抗体。除本发明所发现的抗体人CLDN18.2抗体序列外，其它序列均能从公开的文献中得到，包括抗PD-1抗体Nivo，Pem，Ba08(序列来自专利WO2016015685A1)；抗PD-L1抗体Atezo(Atezolizumab/Tecentriq)、Avel(Avelumab/Bavencio)、Durv(Durvalumab/imfinzi)；抗CD47抗体hu5F9，iMab，Blincyto，AMG420中抗CD3抗体轻、重链可变区序列。比如，PD-1抗体Nivo(Nivolumab/Opidivo)序列来自公开文献，如www.drugbank.ca，或WO2013019906。PD-1抗体Pem(Pembrolizumab/Keytruda)序列来自www.drugbank.ca(。PD-1抗体Ba08序列来自专利WO2016015685A1。Atezo序列，Avel序列，Durv序列(AccessionNumber，DB11714)均可从www.drugbank.ca直接查询到。CD47抗体hu5F9的轻链序列为US9382320B2_42，重链序列为US9382320B2_37。iMab轻链为WO2018075857_4，1F8；重链为WO2018075857_3，1F8。CD3抗体来自blincyto的抗CD3抗体的轻链、重链可变区。Blincyto序列为www.drugbank.ca公开之序列。另一CD3抗体序列来自AMG420中的抗CD3抗体序列的轻重链可变区。AMG420序列来自WO2014140248_340。Tim3的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别见CN201710348699.4中的SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：36；该专利已公开；LAG3的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别见CN201810917684X中的SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：44。TGFβ受体II(TGFβRII)序列来自UniProtKB/Swiss-Prot：P37173.2的胞外区(在本发明序列表中为SEQ ID NO：1)；IL10序列来自NCBI号NP_000563.1(在本发明序列表中为SEQ ID NO：2)。CD47配体SIRPα序列来自NCBI号NP_001035111.1。
所有抗原、抗体，包括单独抗体，双特异抗体，抗体-受体(Trap)，抗体-细胞因子等的通过基因合成得到合成片段，其设计、克隆表达、纯化均由本发明完成。具体同前述
实施例3。
His Tagged蛋白纯化：将样品高速离心去除杂质。平衡镍柱(Ni smart beads 6FF常州天地人和生物科技有限公司Cat#SA036010)：用含有10mM咪唑0.5M NaCl的PBS pH7.4溶液平衡镍柱，2-5倍柱体积冲洗。将样品上清过柱。漂洗杂蛋白：使用含有10mM咪唑0.5MNaCl的PBS pH7.4溶液冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。用含有250mM咪唑0.5MNaCl的PBS(pH为7.4)洗脱目的蛋白。Buffer置换：将洗脱的目的蛋白过超滤管12000g离心10min(超滤管MerckMilliporeCat#UFC500308)，再补加1ml PBS，测定浓度，分装、储存备用。TGFβ1，TGFβ2，TGFβ3和IL10均购自Peprotech。
人抗体轻链恒定区序列Lc(κ链)，Lc(λ链)：现有技术；人抗体重链恒定区序列hIgG4或Hc(hIgG4)；hIgG1或Hc(hIgG1)；hIgG1p或Hc(hIgG1p)，即第356-358位为EEM的hIgG1的另外一种形式，均为现有技术。除上述所列序列外，重链恒定区也可以是hIgG2或hIgG3。
表36双特异性抗体技术方案部分克隆表达的单克隆抗体(对照用)编号、轻重链序列及说明
实施例26抗体和T细胞(CD3)结合实验(FACS)
用流式细胞术(FACS)检测本发明设计的带有CD3靶向的双特异抗体的CD3结合活性。具体地，取健康人外周血单核细胞(PBMC)经Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Gibco，11131D)活化三天。将活化细胞用FACS buffer(PBS，0.5％FBS)洗一次(800g，3分钟离心)后重悬到FACSbuffer中，细胞密度为4×106/ml，每样品25μl备用。待测样品用FACSbuffer梯度稀释，最高浓度250nM，向下5倍稀释，8个浓度，体积25μl；将稀释好的样品25μl加入25μl细胞悬液中，轻轻混匀后，室温孵育20分钟；用大于5倍染色体积的FACS buffer清洗细胞后加入二抗(anti-hFc-PE，Biolegend，409304)，室温染色二十分钟后，清洗，重悬，用流式细胞仪检测(Beckman，CytoFLEX流式细胞仪)。用FlowJo软件分析所测样品平均荧光信号MFI。MFI和浓度做曲线，Graphpad Prism 5软件计算EC50。
实施例27激活PBMC靶细胞杀伤实验
针对本发明靶向CD3的双特异抗体，用本实验评价其功能。用上述实施例1中构建好的hCLDN18.2+细胞作为靶细胞，hCLDN18.1+细胞作为阴性对照细胞(构建hCLDN18.1+细胞方法同实施例1，即同样的构建步骤，将hCLDN18.2换成hCLDN18.1质粒)。取健康人外周血单个核细胞(PBMC)作为效应细胞。具体地，分别收集hCLDN18.2+细胞和hCLDN18.1+细胞，调整细胞密度为2×105/ml于1640完全培养基中(RPMI1640，10％FBS)，每孔100μl加入96孔板中备用。PBMC调整细胞密度为4×106/ml于1640完全培养基中，每孔50μl分别加入hCLDN18.2+细胞或hCLDN18.1+细胞中。用1640完全培养基配置梯度稀释的待测样品，浓度为4、0.4、0.04、0.004μg/ml、每孔50μl加入细胞中，其终浓度为1、0.1、0.01、0.001μg/ml。三个复孔。于37℃，5％CO2培养箱中孵育48小时后，取上清用LDH试剂盒(上海同仁生物科技有限公司，目录号：CK12)检测LDH的释放，反应靶细胞的杀伤。操作方法按说明书，用Multiskan GO酶标仪490nM读数，用Graphpad prism 5分析处理数据。
细胞杀伤百分比(％)＝100*(OD490某药物浓度-OD490对照孔)/(OD490细胞全部裂解-OD490对照孔)
实施例28本发明双特异抗体稳定性评价
本发明设计双特异抗体，统一用Protein A重力柱纯化。纯化样品置换到pH 7.4的PBS buffer中，1mg/ml。于不同条件保存，包括-80℃保存60天以上，4℃保存14或30天，37℃保存7天，37℃保存14天等。不同条件保存的样品经电泳(PAGE)评价样品的降解程度。通过检测结合活性评价不同保存条件对样品活性是否受到影响。同样检测条件下，检测出的活性值(EC50)和-80℃保存的样品所检测到的活性值比较，如果比值变化超出2倍范围，可以认为保存条件对样品稳定性/活性产生了影响。
实施例29 针对CLDN18.2和PD-1双靶点的双特异性抗体设计和活性评价
本发明针对CLDN18.2和PD-1两个靶点设计了不同序列结构的双特异抗体，见下表。
表37a 针对CLDN18.2和PD-1双靶点设计的双特异抗体
*：κ链表示轻链为人IgG的κ型轻链恒定区。#：IgG的C末端连接连接子的时候，其最末端氨基酸K突变为A。以下重链C末端引入scFv的设计均将最末端K突变为A。本发明中的“含重(轻)链的序列”，其除了包括正常的重(轻)链外连接有一个或多个scFv。
按本发明实施例25的方法分别克隆表达、纯化上述双特异抗体，用前述实施例子方法分别检测这些设计的双特异分子和人CLDN18.2以及PD-1的结合活性，结果如下表。
表37b 针对CLDN18.2和PD-1双靶点设计的双特异抗体的结合活性
#：括号里面的数值为同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体(对照抗体)的结合活性EC50。*：同样实验条件下，双特异抗体和对应的单克隆抗体的结合活性EC50的比值。
比值越大，说明所设计的双特抗体对单靶点的结合力减弱越多，比如比值为2，则说明所设计的双特异抗体对靶点结合活性和对应的单克隆抗体相比减弱了1倍。比值在2以内，说明结合活性没有受到影响；比值在2至5之间，说明结合活性略微有影响，此时应考量另一靶点的比值，若另一靶点比值较小例如在1以内，则该双特异性抗体仍有一定的应用价值。
上表结果分别显示了LB302、LB301、LB308和LB309的人CLDN18.2的结合活性检测结果(图7A-7D，a)、人PD-1的结合活性检测结果(图7A-7D，b)和双特异性抗体的结构示意图(图7A-7D，c)。LB302(Ab10 scFv在NivoVH Hc的N末端)，LB301(Ab10 scFv在PemVH Hc的N末端)，LB307(Ab10 scFv在Ba08VH Hc的N末端)，各自对PD-1的结合活性影响分别是0.68、2.1、1.5倍的改变；对CLDN18.2的结合活性影响分别为1.18、3.2、6.1。LB302保持了其和人CLDN18.2以及PD-1的结合活性，而LB307对人CLDN18.2的结合活性影响最大，减弱了5.1倍(6.1-1＝5.1)。也就是说，在同样的类似IgG结构的双特异设计分子中，虽然LB302、LB301、LB307同时抗PD-1，但PD-1抗体Nivo、Pem、Ba08的序列不同，因此造成其抗CLDN18.2的效果也不一样。意外的发现，本发明抗体Ab10的scFv和Nivolumab(Nivo)设计的双特异抗体LB302对双靶点CLDN18.2和PD-1的结合活性没有受到影响。
这些数据表明，本发明anti-CLDN18.2抗体序列和不同的PD-1抗体序列设计的序列特异的IgG结构类似的双特异抗体(Sequence-based IgG like bispecific antibody，本发明简称SBody)，其活性和序列以及scFv所在的位置相关。SBody因序列组合、scFv所在的位置产生意想不到的的针对双靶点的活性。
比如，LB309(Ab10 scFv在NivoVH-Hc C末端)，LB308(Ab10 scFv在Pem VH-Hc C末端)，LB310(Ab10 scFv在Ba08 VH-Hc C末端)，各自对PD-1的结合活性影响分别是1.33、0.93、0.56倍的改变；对CLDN18.2的结合活性影响分别为4.2、6.5、7.3倍。也就是说，同样的设计方式，三个PD-1抗体序列不同的双特异抗体分子对PD-1结合活性几乎没有影响。但对CLDN18.2结合活性影响很大，Ab10 scFv在和NivoVH-Hc C末端设计(LB309)中活性更优。
比较LB302/LB301/LB307和LB309/LB308/LB310活性数据，发现同样的序列，scFv的位置在Hc N末端比C末端对活性影响更小，针对本发明CLDN18.2抗体序列和PD-1抗体序列的双特异抗体设计，scFv位置在HcN末端为更优化的双特异抗体设计。
比较LB301和LB156，发现本发明设计的双特异抗体，scFv不同，但位置相同(均在重链N末端)，如果scFv是针对PD-1，其(LB156)对PD-1的结合活性没有减弱(活性改变0.34倍，即活性增强)，但对CLDN18.2活性改变4.8倍，即减弱3.8倍。如果N末端scFv是针对CLDN18.2，其(LB301)对PD-1的结合改变3.2倍，即减弱2.2倍；对CLDN18.2的结合活性改变2.1倍，即减弱1.1倍。这种结构对活性的影响和LB156差别很大。
比较LB302和LB309，发现同样靶点的scFv，比如都是针对CLDN18.2的scFv，其位置不同，对活性影响也意外地差别很大。LB302对PD-1的结合活性改变0.68倍(接近1，即没有影响)，对CLDN18.2的结合活性改变1.18倍(没有影响)。LB309对PD-1的结合活改变4.2倍，即活性减弱3.2倍，对CLDN18.2的结合活性几乎没有影响(活性改变1.33倍)。也就是说，scFv在重链N末端的比在C末端更优。
比较LB312和LB313，发现针对同样靶点的scFv，比如都是Ab10 scFv和PD-1抗体(Pem)设计的双特异抗体，Ab10 scFv均连接PD-1抗体的轻链上，但位置不同，对活性影响也意外地差别很大。LB312的Ab10 scFv在Pem Lc的N末端，LB313的Ab10scFv在Pem Lc的C末端。LB313对CLDN18.2的结合活减弱了10倍多，LB312则减弱1.6倍。两者对PD-1结合活性影响接近。也就是说，Ab10 scFv在轻链N末端的比在C末端更优。
在PD-1抗体重链C末端增加1个copy的Ab10 scFv(LB314)，意外发现，这样并没有能提高对CLDN18.2的结合活性(和LB302比较)，而且减弱了PD-1的结合活性，改变倍数为5.2倍。也就是说，在Nivo重链的C末端增加一个copy的Ab10 scFv对双靶点的结合活性均有减弱甚至阻碍作用。
此外，为了更加准确评估本发明双特异抗体的结合力，用Biacore检测了LB302、LB301对PD-1的亲和力。具体地，用Biacore T200，GE Healthcare仪器测定LB302vs Nivo(L101)，LB301vs Pem(L105)和人PD-1-his(本发明实施例1方法表达)的亲和力。用pH 7.4的运行缓冲液HBS-EP+(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA和0.05％的P20)，先将ProteinA(ThermoPierce，Cat#21181)偶联到生物传感芯片CM5(Cat.#BR-1005-30，GE)上，将芯片用新配制的50mMNHS(N-hydroxysuccinimide)和200mMEDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)激活，然后注入pH4.010mM NaAC配制的10μg/ml的Protein A。用运行缓冲液稀释待测样品浓度为1μg/ml，捕获信号在50RU左右，抗原PD-1-his浓度梯度从100nM开始，3倍稀释，流速30μl/分钟，结合时间180秒，解离时间300秒。实验后，用10mMGlycine-HCl，pH 1.5，30μl/min，30s清洗芯片。实验数据用Biacore T200evaluation version 3.0(GE)软件以1∶1 Langmuir模型进行拟合，得出亲和力数值KD。结果：LB302，10.4nMvs L101，8.6nM；LB301，6.5nMvsL105，4.4nM。该Biacore测得的亲和力(KD)和前述ELISA结果一致，即本发明SBody分子LB302、LB301保持了和对应抗体接近的和PD-1的结合活性。
基于Ab6序列设计的LB3022、LB3012活性(见上表)和LB302、LB301相似。
这些数据说明，基于本发明抗体Ab10、Ab6等设计的类似IgG结构的双特异抗体(抗CLDN18.2和人PD-1)SBody是序列依赖和序列位置依赖性的。比如说，基于Ab10序列特定的、设计的双特异抗体能得到意想不到的效果，即优选设计，比如LB302很好保留了双靶点的结合活性。
用前述实施例子方法评价本发明设计优选分子诱导细胞凋亡活性(％)来比较抗CLDN18.2功能活性。细胞凋亡活性用Ab10抗体在同样条件、同等浓度(本实验用150nM)作为对照。检测阻止PD-1抗原和配体PD-L1结合活性(IC50)来评价抗PD-1的功能活性，结果如下表。
表38a 本发明优选双特异抗体功能活性评估
#：括号里面的数值为同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体阻断抗原和配体结合活性IC50。*：IC50改变倍数，即双特异抗体和对应的单克隆抗体(对照抗体)的IC50的比值。比值越大，说明所设计的双特抗体对单靶点的功能活性减弱越多，比如比值为2，则说明所设计的双特异抗体对靶点功能活性和对应的单克隆抗体相比减弱了1倍。比值在2以内为实验误差范围，即活性没有受到影响。NA：Ab10不适用PD-1功能活性检测，因为Ab10无PD-1功能活性。
上述结果表明，LB302、LB308、LB310都保留了抗PD-1抗体的功能活性没有减弱，相反还有增强(LB310)。活性增强可能反应了序列设计相关产生的协同作用。
Anti-CLDN18.2的功能活性数据表明，Ab10 scFv在重链N末端(LB302、LB301、LB307)对Anti-CLDN18.2细胞活性有增强/协同(和Ab10抗体比较)作用，且不同PD-1抗体(Pem、Nivo、Ba08)都是如此。而Ab10 scFv在重链C末端(LB309、LB308、LB310)保留了Anti-CLDN18.2细胞活性。这些数据表明，本发明基于Ab10抗体设计的双特异抗体(SBody)因设计不同，产生意想不到的活性效果。
稳定性评价发现(方法见前述实施例)，双特异抗体(SBody)LB302、LB309、LB156、LB301、LB308、LB307、LB310、LB312、LB313、LB314、LB3022、LB3012在37℃保存14天后，均出现不同程度降解，对PD-1和CLDN18.2的结合活性有所减弱，有些减弱10倍以上。在-80℃保存60天，4℃保存14天活性没有改变，表明这些双特异分子-80℃，4℃能稳定保存。
表38b 针对CLDN18.2和PD-1双靶点设计的双特异抗体的表达水平
上述结果表明，本发明设计双特异抗体，同样Ab10抗体scFv序列和PD-1抗体位置的不同(LB302 vs LB309、LB301 vs LB308、LB307 vs LB310)，同样Ab10序列scFv序列位置和不同PD-1抗体(LB302 vs LB301 vs LB307、LB309 vs LB308 vs LB310)，相同的Ab10和PD-1抗体scFv或者Ab10 scFv序列和PD-1抗体(LB156vs LB301)，意外地发现不同设计，表达量和序列相关，差别很大。产量最高LB309比产量最低LB156高67倍(28.7/0.42)。同样的Ab10 scFv在同样的PD-1抗体(Pem)轻链的N末端(LB312)和C末端(LB313)表达量也有差别。增加一个copy的Ab10 scFv(LB314)其表达量比单copy Ab10 scFv(LB302)表达量降低12倍(2.57/0.2＝12.9)。这些数据表明，基于本发明anti-CLDN18.2抗体所设计的双特异抗体(SBody)表达产量是序列特异的。Ab 10抗体在双特异抗体设计中序列位置，结构等都和表达产量相关。
LB302轻链序列：SEQ ID NO：53；含重链的序列：SEQ ID NO：54。
实施例30 针对CLDN18.2和PD-L1双靶点的双特异性抗体设计和活性评价
本发明针对CLDN18.2和PD-L1两个靶点设计了不同序列结构的双特异抗体，见下表。
表39 针对CLDN18.2和PD-L1双靶点设计的双特异抗体
*此处的hIgG1恒定区序列和对应的PD-L1抗体hIgG1序列相同。例如和Atezo的Fc相同，带有N297A突变
按本发明实施例25的方法分别克隆表达、纯化上述双特异抗体，用前述实施例方法分别检测这些双特异分子和人CLDN18.2以及PD-L1的结合活性，结果如下表。
表40 针对CLDN18.2和PD-L1双靶点设计的双特异抗体的结合活性
#：括号里面的数值为同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体的结合活性EC50。*：同样实验条件下，双特异抗体和对应的单克隆抗体的结合活性EC50的比值。比值越大，说明所设计的双特抗体对单靶点的结合力减弱越多，比如比值为2，则说明所设计的双特异抗体对靶点结合活性和对应的单克隆抗体相比减弱了1倍。比值在2以内，说明结合活性没有受到影响。
比较LB157和LB305发现，本发明抗体Ab10和PD-L1抗体Atezo设计成类似IgG结构的双特异抗体，意想不到的是，重链N末端不管是Ab10 scFv或者Atezo scFv都不影响所得到的双特异抗体对CLDN18.2和PD-L1的结合活性。不仅如此，稳定性实验结果表明，LB157和LB305在37℃保存14天，活性没有变化，而且电泳(PAGE)分析显示抗体没有见到明显的降解。说明本发明抗体Ab10和Atezo序列组合设计成的类似IgG结构的双特异抗体能够保留对两个靶点的结合活性，用常规抗体纯化方法Protein A纯化即可得到，工艺简单，并且稳定性好。
LB311数据表明，Ab10 scFv连在PD-L1抗体Atezo重链C末端得到的SBody不影响对hCLDN18.2和PD-L1的结合活性。
LB316、LB317数据表明，Ab10 scFv和PD-L1抗体Avel设计的SBody中，Ab10 scFv在Avel重链的N末端效果更优，而Ab10 scFv在Atezo重链的两端的效果均优。
LB319、LB320数据表明，Ab10 scFv和PD-L1抗体Durv设计的SBody中，Ab10 scFv在Durv重链的N末端对CLDN18.2，PD-L1的结合活性均没有影响。Ab10 scFv在Durv重链的C末端对CLDN18.2结合活性稍有影响，对PD-L1的结合活性没有影响。
这些数据说明3个PD-L1抗体和Ab10 scFv所设计的SBody中，对双靶点的结合活性序列之间存在差别。即SBody的活性是序列依赖的。Ab10 scFv和Atezo设计的SBody出乎意料之外，表现最优。
此外，为了更加准确评估本发明双特异抗体的结合力，用Biacore检测了LB157、LB305vs LB185(Atezo)同PD-L1的亲和力。Biacore方法同前述LB302所述方法。用PD-L1-his(购自Sino biological，Cat#：10084-H08H)代替PD-1-his。所得亲和力(KD)结果：LB157为5.22nM，LB305为3.08nM，LB185为1.97nM。该结果说明，本发明anti-CLDN18.2和PD-L1(atezo)设计的SBody中Ab10 scFv对atezo结合活性几乎没有影响(LB305vs LB185)，atezoscFv在Ab10重链N末端稍微减弱了其对PD-L1的结合力(LB157vsLB185)。这和上述ELISA检测结果基本一致，即本发明优化设计SBodyLB157、LB305保留其对双靶点的结合活性。
此外，基于Ab6序列，设计的LB1572、LB3052对CLDN18.2和PD-L1活性几乎都没有影响。
对上述双特异抗体进行功能评估，包括针对CLDN18.2的CDC细胞活性，阻断PD-1/PD-L1结合活性，其结果见下表。
表41本发明针对CLDN18.2和PD-L1设计优选双特异抗体功能活性评估
#：括号里面的数值为同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体的活性EC50或IC50。*：同样实验条件下，双特异抗体和对应的单克隆抗体活性比值。比值在2(实验误差范围)以内表明活性没有差别。##：LB305w重链恒定区没有LB305重链恒定区的突变，以便评估该分子对CLDN18.2+细胞的CDC活性。
用C57BL/6cnc品系小鼠(购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证编号：SCXK(浙)2018-0001)建立动物药效模型，对本发明双特异抗体LB157，LB305进行了体内药效评估。
用MC38细胞(购自中科院细胞所)构建本实验所需的稳定表达细胞系MC38-804(构建方法同前述实施例1，将CHO-K1替代MC38)。MC38-804培养于含10％胎牛血清(上海博升生物科技有限公司，货号：BS-0002-500)，1％Hepes(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号：15630080)的DMEM/高糖培养基中(上海源培生物科技股份有限公司，货号：L110KJ)，在含5％CO2的37℃的细胞培养箱中连续培养。C57BL/6cnc雌性小鼠，6周龄，5只/笼饲养于SPF级环境，温度20-25℃；湿度40％-60％，自由进食进水，定期更换垫料。
待MC38-804细胞长至对数生长期(汇合率在80％-90％)时，用0.25％胰酶消化，收集细胞，并用无血清的DMEM/高糖培养基洗涤细胞两次，最后用无血清的DMEM/高糖培养基重悬，细胞计数，用基质胶(购自碧迪医疗器械上海有限公司，货号：354234)按1∶1的比例调整细胞浓度为1×107细胞/ml，用于接种。接种MC38-804细胞悬液(1×106个)100μl于小鼠右肋部皮下，挑选肿瘤细胞长至体积约120-150mm3大小后随机分组，每组6只。
待测样品与阳性对照用PBS配制，无菌。Blank组为PBS。PD-L1抗体LB185+Ab10为联合用药对照组。LB157，LB305为各自双特异抗体药物待测组。给药方式为腹腔注射，LB185+Ab10联合用药对照组小鼠给药剂量为每种抗体各20μg，200μl/只。LB157小鼠给药剂量为26μg/200μl/只，LB305给小鼠药剂量为26μg/200μl/只(和联合组的LB185，Ab10为等摩尔剂量)。各组给药频率均为2次/周，连续1.5周。
各注射样品给药当天为第0天。每次给药前测量体重，肿瘤体积，记录数据。本次实验实际给药周期1.5周，测量周期21天。
肿瘤大小计算公式：肿瘤体积TV(mm3)＝0.5x(肿瘤长径x肿瘤短径2)；肿瘤相对体积(RTV)＝T/T0或者C/C0。相对肿瘤增长率(T/C％)＝100％*(T-T0)/(C-C0)；抑瘤率(TGI)＝(1-T/C)*100％；其中T0，T分别为样品组实验开始时及实验结束时的肿瘤体积；CO，C分别为对照组实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。
结果见下表。
表41b 本发明针对CLDN18.2和PD-L1设计优选双特异抗体体内药效
上述结果表明，本发明针对CLDN18.2和PD-L1的双特异抗体LB157和同摩尔剂量的两个单抗联合产生同样的药效，第21天抑瘤率分别为54％和52％。非常意外地，LB305的抑瘤率第21天达到80％，显著好于个单抗联合产生抑瘤率52％。
LB305轻链序列：SEQ ID NO：55；含重链的序列：SEQ ID NO：56；
实施例31 针对CLDN18.2和CD47双靶点的双特异性抗体设计和活性评价
本发明针对CLDN18.2和CD47两个靶点设计了不同序列结构的双特异抗体，见下表。
表42 针对CLDN18.2和CD47双靶点设计的双特异抗体
按本发明实施例25的方法分别克隆表达、纯化上述双特异抗体，用前述实施例子方法分别检测这些双特异分子和人CLDN18.2以及CD47的结合活性，结果如下表。
表43针对CLDN18.2和CD47双靶点设计的双特异抗体的结合活性(ELISA，nM)
#：括号里面的数值为同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体的结合活性EC50。*：同样实验条件下，双特异抗体和对应的单克隆抗体的结合活性EC50的比值。比值越大，说明所设计的双特抗体对单靶点的结合力减弱越多，比如比值为2，则说明所设计的双特异抗体对靶点结合活性和对应的单克隆抗体相比减弱了1倍。比值在2以内，说明结合活性没有受到影响。
上述结果(LB158和LB304)表明，本发明抗体Ab10和CD47抗体Hu5F9设计成类似IgG结构的形式，所设计的双特异抗体Ab10 scFv在N末端的时候(LB304)，对Ab10的结合活性影响很大，EC50减弱了7.5倍(8.5-1＝7.5，见上表)。同样的序列组合，不同的位置，比如当Hu5F9 scFv在所述双特异抗体N末端的时候(LB158)，对CLDN18.2和CD47的结合活性影响小，EC50减弱在1倍左右(见上表)。
LB158功能活性检测结果表明，其阻止CD47和配体SIRPα活性IC50为113nM，比CD47单克隆抗体Hu5F9 LB157的IC50＝2.37nM增强了1.1倍，即功能活性没有减弱。CLDN18.2功能活性用诱导肿瘤细胞凋亡评估，LB158诱导肿瘤细胞凋亡11％，同条件，同浓度的Ab10诱导肿瘤细胞凋亡为10.3％。即LB158anti-CLDN18.2的功能活性没有减弱。
稳定性检测结果表明，LB158在-80℃保存60天，4℃保存14天，37℃保存7天、14天，电泳(PAGE)分析没有发现降解。活性检测结果表明这4份样品对CLDN18.2的结合活性为分别为0.68nM、0.98nM、0.67nM、0.73nM。对CD47的结合活性分别为0.08nM、0.12nM、0.16nM、0.10nM。说明LB158在这些保存条件下，不仅分子稳定(电泳结果)，而且活性也稳定。
LB321结果表明，本发明抗CLDN18.2抗体和另一CD47抗体(iMab)设计成的双特异抗体(iMab scFv在Ab10的重链N末端)保留了anti-CLDN18.2的结合活性，且CD47的结合活性增加了1.5倍(EC50为0.484nM vs 1.38nM)。功能活性检测结果表明，LB321阻止CD47和配体SIRPα活性IC50和LS956(iMab)改变了1.64倍。说明LB321的抗CD47抗体功能活性没有受到影响。
稳定性检测结果表明，LB321在-80℃保存60天，4℃保存14天和CLDN18.2、CD47的结合活性均没有改变；37℃保存14天其和CLDN18.2的结合活性EC50由0.99nM变为10.1nM，活性减弱近10倍；和CD47的结合活性由0.77nM变为12.3nM，活性减弱15倍。说明LB321在4℃或4℃以下保存稳定。同时说明同样设计的SBody因CD47抗体序列的差别，比如在稳定性方面，LB158的稳定性优于LB321。
比较表本发明设计的双特异抗体表达量结果见下表。
表44a 针对CLDN18.2和CD47双靶点设计的双特异抗体的表达水平
上述结果表明，本发明设计双特异抗体，同样的序列，位置的不同(LB158vsLB304)，同样条件下表达产量有很大差别。LB158比LB304产量高1倍多。LB158 vs LB321说明不同序列(针对同一个靶点)以同样的方式和Ab10设计的双特异抗体，同样条件下表达产量也有比较大的差别(37.9 vs 13.6)。
这些结果说明本发明抗体Ab10和CD47抗体通过优化设计(包括序列组成，和scFv位置等)得到的优化双特异分子能同时保留对两靶点的结合活性，而且稳定性好。类似IgG结构，可以像常规IgG一样的工艺纯化，让后续开发变得更加简单，易行。
实施例32 针对CLDN18.2和CD3双靶点的双特异性抗体设计和活性评价
本发明针对CLDN18.2和CD3两个靶点设计了不同序列结构的双特异抗体，见下表。
表45 针对CLDN18.2和CD3双靶点设计的双特异抗体
按本发明实施例25的方法分别克隆表达、纯化上述双特异抗体，用前述实施例子方法分别检测这些双特异分子和人CLDN18.2+细胞结合(ELISA)以及CD3(T细胞)FACS的结合活性，结果如下表。
表46 针对CLDN18.2和CD3双靶点设计的双特异抗体的结合活性
#：括号里面的数值为同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体(Ab10)的结合活性EC50。*：同样实验条件下，双特异抗体和对应的单克隆抗体(Ab10)结合活性(ELISA)EC50的比值。比值越大，说明所设计的双特抗体对CLDN18.2的结合力减弱越多，比如比值为2，则说明所设计的双特异抗体对CLDN18.2结合活性和Ab10相比减弱了1倍。比值在2以内，说明结合活性受到影响不大(1倍实验误差范围)。##：括号里面的数值为同实验条件下，LB155的结合EC50(FACS)值。**：同样条件下双特异抗体和LB155结合活性的比值。该比值反应不同的CD3抗体，不同的结构如VH-linker-VL，VL-linker-VH之间对结合活性的差异。
上述结果(LB155，LB195；LB194，LB193)表明，本发明抗体Ab10和CD3抗体设计成类似IgG结构双特异抗体，CD3 scFv(来自Blincyto或AMG420)在N端对Ab10和CLDN18.2的结合活性都有比较大的影响，其中AMG420 scFv和Ab10设计的双特异抗体LB194对CLDN18.2的影响最大，EC50减弱了6.2倍(7.2-1＝6.2)。LB195比LB155，LB194比LB195结果说明，对于CD3抗体和本发明Ab10设计的双特异抗体中，CD3scFv在N末端的情况下，VH-Linker-VL比VL-linker-VH更好地保留了双靶点的结合活性。
此外，比较LB155、LB195、LB194、LB193和LB303结果说明，Ab10 scFv和CD3抗体设计的类似IgG结构的双特异抗体比CD3 scFv和Ab10抗体组成的双特异抗体更好保留了双特异抗体结合活性。
LB196结果说明CD3 scFv在C-末端对CD3的结合活性没有影响(活性改变倍数0.77(小于1)，但对CLDN18.2的结合活性的影响比较大。同条件下，LB196对CLDN18.2的结合活性比Ab10和CLDN18.2的结合活性减弱2.5倍(3.5-1＝2.5)。说明，同样是CD3 scFv和Ab10抗体组成的双特异抗体，CD3 scFv在N端能更好保留双靶点的结合活性。
基于Ab6和CD3抗体设计的双特异抗体中，优选分子LB1952基本上保留了和CLDN18.2和CD3的结合活性。
功能活性分析表明，LB195、LB193激活CDC活性(用前述实施例方法评价anti-CLDN18.2功能)相对Ab10活性(EC50)改变倍数分别为1.7、2.2倍。这些改变倍数在实验误差范围内，也就是说LB195、LB193保持了其对CLDN18.2的功能活性。激活PBMC杀伤靶细胞的活性(方法见前述实施例子)检测发现，LB195、LB193活性相当，对靶细胞的特异杀伤作用呈量效关系，在0.1μg/ml浓度下有30％-40％靶细胞裂解。
稳定性分析结果表明，LB195和LB193在-80℃保存60天，4℃保存14天，37℃保存7天，37℃保存14天等条件下，仪37℃、14天在电泳(PAGE)上发现少许降解，其它的均稳定未见降解，而且活性都没有明显改变。
这些说明基于anti-CD3 scFv和Ab10的双特异设计优选分子LB195、LB193保留了对双靶点的结合活性和功能活性。能够通过常规IgG纯化方法得到，且能稳定保存。
表47a针对CLDN18.2和CD3双靶点设计的双特异抗体的表达水平
上述结果表明，本发明基于Ab10和CD3抗体设计双特异抗体表达产量最优为LB196。
代表序列LB193的轻链序列：SEQ ID NO：38，其为Ab10轻链，参见实施例6；含重链的序列：SEQ ID NO：4。
实施例33针对CLDN18.2和TGFβ双靶点的双特异性抗体设计和活性评价
本发明针对CLDN18.2和TGFβ两个靶点设计了不同序列类似IgG结构的双特异抗体，具体地，在本发明抗体Ab10，Ab6的轻链、重链N或者C末端，优选重链C末端融合TGFβ受体II，所得分子(TRAP)能和CLDN18.2结合，同时能TGFβ1、2、3结合，设计见下表。
表48针对CLDN18.2和TGFβ双靶点设计的双特异抗体
*：hIgG1的重链C末端K突变为A。**：LB824为对照分子。序列源于WO2015118175_1(λ链)和WO2015118175_3。是PD-L1抗体Avel和TGFβ受体II(TGFβRII)组成的Trap分子。其TGFβRII结合活性可作为本发明分子LB401的对照。
按本发明实施例25的方法分别克隆表达、纯化上述双特异抗体，用前述实施例方法分别检测这些双特异分子和人CLDN18.2以及TGFβ的结合活性，结果如下表。
表49针对CLDN18.2和TGFβ设计的双特异抗体(TRAP)的结合活性(ELISA，nM)
#：同样实验条件下Ab10的EC50＝0.157nM，即LB401重链C末端加入TGFβRII没有影响其对CLDN18.2结合活性。NA：不适应，该分子不针对CLDN18.2。
上述LB401结合活性结果表明，本发明抗体Ab10重链C末端连接TGFβRII不仅保留了其对人CLDN18.2的结合活性，而且保留了其对TGFβI结合活性，以及对TGFβII和TGFβIII的高度选择性。此外，比较LB401和LB824对TGFβ的结合活性，发现本发明抗体Ab10融合TGFβRII得到LB401对TGFβ1、2、3的结合活性和由PD-L1抗体融合TGFβRII的Trap(LB824)结合特性(Profile)一致。
Ab6代替Ab10得到LB4012同样保留对双靶点的结合活性。
稳定性分析结果表明，LB401在-80℃保存60天，4℃保存30天，37℃保存7天，37℃保存14天等条件下稳定，电泳(PAGE)分析发现37℃保存14天出现降解，TGFβI、II、III结合活性减弱，CLDN18.2的结合活性没有受到影响，见图8。因此，LB401在-80℃或4℃保存稳定。
此外，对LB401和LB824平行进行了血清稳定性评估。具体地，取C57BL/6小鼠(六周龄雌性，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)血液，12000rpm，离心10分钟，取血清备用。取3μl样品(1μg/μl，pH7.4PBS)用上述血清27μl稀释，终浓度为0.1μg/ml。分别于37℃处理0h，24h和72h后检测其与人CLDN18.2+细胞及TGFβI的结合活性。结果如下。
表50a针对CLDN18.2和TGFβ设计的双特异抗体(TRAP)的血清稳定性实验(ELISA，EC50，nM)
#NA：不适应。
上述结果表明，LB401在血清中孵育24小时，对CLDN18.2和TGFβI的结合活性均没有影响。72小时，对CLDN18.2的结合活性减弱了2倍多(0.424vs 0.11)；对TGFβI的结合活性也有减弱，这和目前的临床试验同类型分子LB824稳定性相似。
用前述实施例30相同的动物模型(MC38-804)和方法对本发明针对CLDN18.2和TGFβ设计的双特异抗体(TRAP)进行了体内药效评估。待测样品与阳性对照用PBS配制，无菌。Blank组为PBS。Ab10为单独用药对照组，LB824为双特异抗体药物对照组。LB401为本发明优选双特异抗体药物待测组。给药方式为腹腔注射，Ab10给药剂量为120μg/200μl/只，LB824、LB401给药剂量为160μg/200μl/只。各组给药频率均为2次/周，连续3周。结果见下表。
表50b本发明针对CLDN18.2和TGFβ设计的双特异抗体(TRAP)体内药效
上述结果表明，在这个动物模型中，Ab10单独药效很弱，第24天仅显示12％的肿瘤抑制率。针对PD-L1和TGFβ分子LB824(作为药效模型对照分子)第24天显示56％的抑瘤率。非常意外地，本发明设计针对CLDN18.2和TGFβ的双特异抗体(TRAP)LB401在和Ab10同摩尔剂量下，第24天抑瘤率达到61％，比LB824(56％)好，显著优于单独Ab10(12％)。
上述结果表明，本发明anti-CLDN18.2抗体和TGFβRII优化设计双特异分子保留很好的对双靶点的活性，动物药效显著，而且分子稳定，纯化工艺(ProteinA结合)简单易行。
LB401轻链序列(SEQ ID NO：38)，其为Ab10轻链，参见实施例6。
LB401含重链的序列(SEQ ID NO：57)：
实施例34针对CLDN18.2和IL10双靶点的双特异性抗体设计和活性评价
本发明针对CLDN18.2和IL10两个靶点设计了Ab10抗体和细胞因子融合分子。具体地，在本发明抗体Ab10、Ab6的轻链、重链N和/或C末端，优选重链C末端和N末端融合了IL10分子，设计见下表。
表51针对CLDN18.2和IL10双靶点设计的双特异抗体
*：hIgG1重链的C末端K突变为A。#LB4333同LB433除了其Fc区第L234突变为A；#LB4334同LB433除了其Fc区第L235突变为A；#LB4335同LB433除了其Fc区第L234，L235均突变为A
按本发明实施例25的方法分别克隆表达、纯化上述双特异抗体，用前述实施例方法分别检测这些双特异分子和人CLDN18.2以及IL10的结合活性，结果如下表。
表52针对CLDN18.2和IL10双靶点设计的双特异抗体的结合活性(nM)
#：括号里面的数值为同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体(Ab10)的结合活性EC50。*：同样实验条件下，双特异抗体和对应的单克隆抗体(Ab10)结合活性(ELISA)EC50的比值。比值越大，说明所设计的双特抗体对CLDN18.2的结合力减弱越多，比如比值为2，则说明所设计的双特异抗体对CLDN18.2结合活性和Ab10相比减弱了1倍。比值在2以内，说明结合活性受到影响不大(1倍实验误差范围)。
上述结合活性结果显示，本发明抗体Ab10和细胞因子IL10设计的双特异分子LB432和LB433，LB4332和CLDN18.2的结合活性同Ab10，Ab6(活性改变在2倍左右)。和IL10的结合活性用抗原包被ELISA和夹心法ELISA进行了评估。具体地，抗原包被ELISA检测方法见前述实施例3。结果LB432、LB433和LB4332的EC50分别为0.34、0.14和0.2nM。活性相差在2倍左右，接近实验误差范围。
同样条件下，ELISA检测到IL10(Peprotech，Cat#：200-10)的结合活性EC50＝4.53nM。也就是说本发明双特异分子LB432、LB433和LB4332的IL10结合活性比重组IL10结合活性强。
夹心法ELISA方法：取实施例2构建人CLDN18.2+，按10x104/孔铺96-well plate(Corning，Cat#CLS3599-100EA)，37℃培养箱过夜孵育后去除上清，用免疫染色固定液(上海碧云天生物技术有限公司，Cat#P0098)100μl/孔室温固定半小时。PBS洗一遍后230μl5％牛奶37℃封闭2小时，PBST洗3遍。加入50μl/孔用1％BSA 5倍连续稀释的待测样品，37℃孵育1小时，PBST洗板5次，加入50μl/孔1：400稀释的HRP标记兔抗人IL10(sinobiological，Cat#SEKA10947)，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，52-00-03)，室温孵育5-10min，加入50μl/孔1MH2SO4终止反应，用MMLTISKAN Go酶标仪(ThermoFisher，51119200)在450nm处读取吸收值，根据OD值计算EC50。夹心法ELISA结果表明，LB432的结合活性(11.3nM)显著弱于LB433(0.77nM)。说明同样的IL10序列在Ab10的N末端或者C末端，其分别结合CLDN18.2和IL10活性影响不大，但是LB432结合CLDN18.2后，再结合IL10的活性和LB433比减弱了10倍以上(11.3nM vs 0.77nM)。
也就是说，LB432的N末端连接了IL10存在“位阻效应”，即所得双特异分子单独结合两个靶点活性不受影响，但是结合了其中一个则阻止/影响该分子再结合另外一个靶点。在本发明的其它双特异分子SBody中，包括LB302、LB301、LB157、LB305、LB158、LB195、LB196、LB401等做过夹心法ELISA的检测，都没有发现其中任一靶点的结合影响另一靶点的结合(位阻效应)。
上述数据表明，本发明意外发现，抗体Ab10和IL10设计双特异抗体优化序列为LB433，即IL10融合到Ab10的重链C末端为最优。
稳定性分析结果表明，LB432和LB433在-80℃保存60天，4℃保存30天，37℃保存7天，37℃保存14天等条件下稳定，电泳(PAGE)分析没有发现明显降解，表明LB432和LB433稳定性好。
此外，对LB432和LB433进行了血清稳定性评估。具体地，取C57BL/6小鼠(六周龄雌性，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)血液，12000rpm，离心10分钟，取血清备用。取3μl样品(1μg/μl，pH7.4 PBS)用上述血清27μl稀释，终浓度为0.1μg/ml。分别于37℃处理0h，24h和72h后检测其与人CLDN18.2+细胞及IL10抗体的结合活性。结果如下。
表53a针对CLDN18.2和IL10双靶点设计的双特异抗体的血清稳定性实验(ELISA，EC50，nM)
上述血清稳定性结果表明，LB433血清孵育72h后，和CLDN18.2的结合活性改变1.64倍(0.264/0.161)，同条件下LB432为3.4(1.2/0.357)；和IL10的结合活性，LB433改变0.67倍(0.113/0.168)，同条件下LB432为1.4(0.115/0.083)。说明LB433的血清稳定性比LB432要好。
表53b针对CLDN18.2和IL10双靶点设计的双特异抗体Fc突变体的结合活性(nM)
#说明同表52：
上述结果表明，LB4331，LB4333，LB4334，LB4335结合活性(CLDN18.2，IL10)和LB433接近。这些分子和LB433的不同在于其对CD64(FcγR I)的结合活性显著减弱。
用前述实施例30相同的动物模型(MC38-804)和方法对本发明针对CLDN18.2和和IL10设计的双特异抗体进行体内药效评估。待测样品与阳性对照用PBS配制，无菌。Blank组为PBS。Ab10为单独用药对照组。LB433为双特异抗体药物待测组。给药方式为腹腔注射，Ab10给药剂量为60μg/200μl/只，LB433给药剂量为80μg/200μl/只。各组给药频率均为2次/周，连续1.5周。结果见下表。
表53c本发明针对CLDN18.2和IL10设计的双特异抗体体内药效
上述结果表明，在这个动物模型中，Ab10单独药效很弱，第21天仅显示4％的肿瘤抑制率，即看不到动物药效。非常意外地，本发明设计针对CLDN18.2和IL10设计的双特异抗体LB433在和Ab10同摩尔剂量下，第21天抑瘤率达到81％，显著优于单独Ab10(4％)，Ttest分析Pvalue＜0.05。
LB433轻链序列(SEQ ID NO：38)，其为Ab10轻链，参见实施例6；
LB433含重链的序列(SEQ ID NO：58)：
LB4333轻链序列(SEQ ID NO：38)；LB4333含重链的序列(SEQ ID NO：59)；
LB4331轻链序列(SEQ ID NO：38)；LB4331含重链的序列(SEQ ID NO：60)；
LB4335轻链序列(SEQ ID NO：38)；LB4335含重链的序列(SEQ ID NO：61)：
实施例35针对CLDN18.2和LAG3，CLDN18.2和Tim3双靶点的双特异性抗体设计和活性评价
本发明针对CLDN18.2和LAG3两个靶点，以及CLDN18.2和Tim3两个靶点分别设计了双特异抗体，见下表。
表54针对CLDN18.2和LAG3双靶点，CLDN18.2和Tim3双靶点设计的双特异抗体
按本发明实施例25的方法分别克隆表达、纯化上述双特异抗体，用前述ELISA方法分别检测这些双特异分子和人CLDN18.2以及LAG3，Tim3的结合活性，结果如下表。
表55针对CLDN18.2和LAG3，CLDN18.2和Tim3双特异抗体的结合活性(ELISA，nM)
#：括号里面的数值为同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体(Ab10)的结合活性EC50。*：同样实验条件下，双特异抗体和对应的单克隆抗体(Ab10)结合活性(ELISA)EC50的比值。比值越大，说明所设计的双特抗体对CLDN18.2的结合力减弱越多，比如比值为2，则说明所设计的双特异抗体对CLDN18.2结合活性和Ab10相比减弱了1倍。比值在2以内，说明结合活性受到影响不大(实验误差范围)。**：同样实验条件下，双特异抗体和对应的单克隆抗体结合活性ELISA(LAG3抗体EC50：0.39nM；Tim3抗体EC50：0.06nM)EC50的比值。LAG3抗体序列及其它信息见专利号：201810917684.X。Tim3抗体序列及其它信息见专利申请号：201710348699.4。
上述结果表明，本发明抗体Ab10和LAG3，Tim3抗体设计成的类似IgG结构的双特异抗体分子(scFv在Ab10重链N末端)能保留对CLDN18.2和LAG3、Tim3的结合活性，且能够稳定表达纯化。
实施例36CLDN18.2分别和PD-1，PD-L1，CD47双靶点抗体DVD结构设计和评价
本发明针对CLDN18.2和PD-1，PD-L1，CD47分别以DVD形式设计了双特异抗体，见下表。
表56针对CLDN18.2/PD-1，CLDN18.2/PD-L1，CLDN18.2/CD47双靶点的DVD形式的双特异抗体设计
按本发明实施例25的方法分别克隆表达、纯化上述双特异抗体，凝胶电泳(PAGE)结果表明，这些抗体轻、重链均易出现linker间断裂现象。而以scFv的形式将一个靶点抗体连接在另一个靶点抗体的轻链或重链的N或C末端，通过筛选得到设计优化的双特异抗体，可以避免/减少linker间断裂(见前述实施例)，并且保留对双靶点的结合活性，功能活性。优选双特异抗体(本发明称之为SBody)不仅稳定，而且因其类似常规IgG结构，纯化工艺简单，这为后期开发过程中的工艺、纯化都提供了极大便捷。
实施例37针对CLDN18.2的CAR分子设计
本发明针对CLDN18.2的新的CAR分子设计参考之前公开专利CN106755107A。
具体地，本发明设计的CAR分子其核酸构建体的通式为CAR-[(IRES)-f]q。该通式中，CAR表示嵌合抗原受体，包括，scFv-H-TM-S-CD3ζ，其中scFv(single chain Fv)为特异性靶向CLDN18.2抗原的单链可变片段，或称单链抗体、单链可变区。其序列为本发明所发现抗CLDN18.2抗体(见前述实施例)的可变区序列组成。其结构为VL-Linker-VH或VH-Linker-VL，Linker优选(G4S)w，w为0、1、2、3、4；优选w＝3或w＝4。H为绞链结构域，TM为跨膜结构域，S为共刺激信号传导区域。所述共刺激信号传导区包括源自CD28的共刺激分子，和/或源自4-1BB的共激分子。通式中CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列(胞内区)。
IRES表示内部核糖体进入位点序列(Internal ribosome entry site，IRES)；f表示编码功能性蛋白F，q为0或非0自然数。所述功能性蛋白包括细胞因子IL10、IL15或其活性片段，和/或所述细胞因子的受体如IL15受体或其活性片段，和/或细胞因子如IL10、IL15或其活性片段与IL15受体sushi+片段的融合片段。
如果所设计的CAR分子结构中没有f部分，则该CAR分子也没有IRES序列。此外，IRES和(IRES)代表相同的含义，当IRES外含括号“()”时，意指IRES序列仅存在于核酸构建体中，当含IRES序列的核苷酸用于编码蛋白时，该IRES序列不编码对应的蛋白，从而IRES序列之前与其后的核苷酸序列分别编码不同的蛋白质片段(即CAR和f)，且不同的蛋白质片段之间各自是分离的。
上述CAR或者CAR-(IRES)-f分子中，根据抗CLDN18.2抗体序列的可变区设计的scFv的序列为本发明的新抗体序列，见上述实施例。scFV处也可以是Fab或单结构域抗体(sdFv)结构。其它序列(scFv以外的序列)可以从美国国立医学图书馆网站http：//www.pubmed.com，GenBank数据库中搜索得到，包括人CD8α信号肽、人CD8α铰链区、CD8α跨膜区、人CD28胞内区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、内部核糖体进入元件(IRES elements)、人IL15(同专利CN106755107A中的SEQ ID NO.22)，人IL15受体alpha(IL15Rα)野生型和突变/sushi部分(US2014/01314；WO2007/046006)，人IL10(SEQ ID NO：2)蛋白序列等。所有构建到克隆中的碱基序列均根据蛋白质序列进行密码子优化，以保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。
IL10的核苷酸序列例如GenBank登录号NM_000572所示的序列。
具体地，本发明代表性CAR分子构建参考公开号为CN106755107A的专利申请中所述的方法。将该专利实施例3，JX005质粒(来源于pBABEpuro)中编码c-Met抗体scFv替换为本发明Ab10 scFv，即得到本发明CAR新分子CARla的质粒JXla。质粒JXla所编码的CARla的氨基酸序列为：
其中，第1-246位为结合Ab10的scFv编码序列；第247-293位为人CD8α铰链区编码序列(下划线部分)；第294-315位为人CD8α跨膜区编码序列；第316-357位为4-1BB胞内区编码序列；第358-469位为CD3zeta(ζ)胞内信号区编码序列。
其中，第1到63个核苷酸(下划线部分)为信号肽编码区。第64-801位为结合CLDN18.2的Ab10抗体的的scFv编码序列；第802-942位为人CD8α铰链区编码序列；第943-1008位为人CD8α跨膜区编码序列；第1009-1134位为4-1BB胞内区编码序列；第1135-1470位为CD3zeta(ζ)胞内信号区编码序列。
将公开号为CN106755107A的专利申请中实施例5构建的JX007质粒中编码c-Met抗体scFv替换为本发明Ab10 scFv(方法同本发明JXla构建方法)，即得到本发明CAR新分子CAR3ab的所用的质粒JX3ab。质粒JX3ab编码的氨基酸序列同上述JXla的编码序列，此外，还编码细胞因子IL15活性片段(野生型)。IL15活性片段的核苷酸序列可为任何现有技术中用于编码其的序列，例如CN106755107A的SEQ ID NO：31的第699-1040位核苷酸序列。
将上述构建的质粒JX3ab中的编码IL15的序列(例如CN106755107A的SEQ IDNO：31的第699-1040位核苷酸序列)用编码IL10的序列(例如GenBank登录号NM_000572所示的序列)替代，得到本发明新的CAR分子CAR3ab10的质粒JX3ab10。
上述质粒JX3ab10编码如下IL10蛋白序列：
将专利CN106755107A实施例6构建的JX008质粒中编码c-Met抗体scFv替换为本发明Ab10 scFv(方法同本发明JX1a构建方法)，即得到本发明CAR新分子CAR4a所用质粒JX4a。JX4a编码的氨基酸序列除上述CAR1a的编码序列外，还编码细胞因子IL15活性片段(突变型)与IL15Rα(sushi+)的融合蛋白；sushi+则意指除了sushi片段以外，还包括了其它多肽片段。
用上述同样的方法，将Ab6抗体序列的scFv代替Ab10抗体的scFv构建得到CAR新分子CAR1a.2、CAR3ab.2、CAR3ab10.2和CAR4a.2对应的质粒JX1a.2、JX3ab.2、JX3ab10.2和JX4a.2。
实施例38针对CLDN18.2设计的CAR分子鉴定
病毒包装，制备和浓缩：病毒制备方法参考专利CN106755107A所用方法，用三质粒病毒包装系统pGag-Po1、pVSVG及本发明各个新CAR分子表达质粒pBABEpuro(均购自优宝生物)，例如JX1a、JX3ab、JX3ab10或者JX4a共转染293细胞获得病毒上清，超速离心浓缩获得浓缩的病毒。
具体地，取包装质粒pGag-Pol、pVSVG及表达质粒JX1a、JX3ab、JX3ab10或JX4a各6μg，PEI(Polysciences，Inc，Cat#：23966-2)36μg，混匀，室温静置5min，加入293(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。培养48h，收第1次上清；次日，即培养72h，收第2次上清。合并两次上清，加入3毫升20％的蔗糖溶液，将病毒上清小心铺到蔗糖溶液的上面，125000g，离心1.5小时，PBS低温重悬沉淀，分装，-80℃冻存。病毒分别记为1a、3ab、3ab10、4a。超速离心机型号Beckman Coulter Optima XPN-100；转子型号SW32i，超离管Beckman 344058。
病毒滴度检测：采用梯度稀释的病毒感染293细胞，48小时后通过Protein L染色确定表达scFv的细胞阳性率的方法来确定病毒滴度。具体地，分别取20μl病毒(1a、3ab、3ab10、4a)，用RPMI 1640培养基(培源生物，Cat#L210KJ)含10％FBS(Gibco，Cat#：10099141)、0.8μg polybrene(上海翊盛生物科技有限公司Cat#：40804ES76)5倍梯度稀释，终体系250μl。加入预先铺板的293中，总培养体系500μl/孔，2935×104个/孔。48h后收集细胞，biotin-protein L(金斯瑞，货号M00097)标记293，1μl/样本。室温孵育20min后，加入FACS buffer 1ml，离心清洗细胞。FACS buffer 100μl重悬，加入PE标记的Strepavidin(eBioscience，货号12-4317-87)0.4μl/样本，室温孵育20min后，加入FACS buffer 1ml，离心清洗细胞。FACS检测阳性细胞比例，选取阳性比例在10％时的样品计算病毒滴度，滴度(IU/ml)＝阳性率*293细胞数*稀释倍数/病毒液体积。结果表明，本次所得1a、3ab、3ab10和4a病毒的滴度分别为9.2、1.3、3.2和1.5×106IU/ml。
CART细胞的制备：取健康志愿者新鲜外周血，用专利CN106755107A中相同的方法分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。PBMC用偶联抗人CD3、CD28抗体的磁珠(Gibco，货号11131D)活化40-48h后分别加入病毒1a、3a、3ab10、4a(MOI在0.05-5范围)、polybrene(终浓度8μg/ml)。感染3h，补液至1ml，过夜换液，培养基为RPMI1640含10％FBS、500IU/mL IL2(北京四环生物制药有限公司，Cat#：S20040007)。每隔一天换液并1∶2扩大培养体积，直到获得足够的细胞进行体内外实验。感染后各个CAR分子的T细胞(CART细胞)分别记为CART1a、CART3ab、CART3ab10和CART4a细胞；未感染的T细胞(空载体)作为阴性细胞(对照)。
本发明CART分子Ab10抗体scFv表达鉴定：上述各个CART细胞通过ProteinL染色以确定CART分子scFv的表达和感染细胞的阳性率。具体地，收集感染后的T细胞(CART细胞)2×105个，biotin-proteinL(南京金斯瑞生物科技有限公司，货号M00097)标记细胞(标记方法同前述病毒滴度检测)。用FACS检测CART阳性细胞比例，用阴性细胞作为对照。阳性率＝CART细胞FACS(％)-阴性细胞(对照)FACS(％)，结果见下表57a。
以上述同样的方法制备CART1a.2、CART3ab.2、CART3ab10.2和CART4a.2。检测其Ab6抗体scFv的阳性率与CART1a、CART3ab、CART3ab10和CART4a接近，见表57b。
表57a本发明CART细胞表达Ab10抗体scFv的阳性率
表57b本发明CART细胞表达Ab6抗体scFv的阳性率
CART细胞 阳性率(％)
CART1a.2 34.2
CART3ab.2 23.3
CART3ab10.2 27.5
CART4a.2 20.9
上述结果表明，本次实验4种CART细胞(包括Ab10和Ab6scFv)的阳性率为20％-47％，确认了所得的CART细胞都正常表达了Ab10或Ab6抗体的scFv。以下用CART1a、CART3ab、CART3ab10和CART4a为例评估本发明CAR细胞的活性和功能。
本发明设计CART细胞表达分泌细胞因子鉴定：本发明设计的新CART细胞CART3ab，CART4a表达分泌细胞因子IL15、IL15/IL15R；CART3ab10表达分泌细胞因子IL10。为鉴定所述CART细胞表达并分泌所述因子，取CART细胞培养上清，用ELISA试剂盒(北京义翘神州生物技术有限公司，货号SEKA10947、SEK10360)分别检测IL10，IL15表达。结果发现仅CART3ab10上清中可检测出2256pg/ml和844pg/ml(重复制备不同供体PBMC来源T细胞感染得到的CART细胞)，同时制备的CART1a上清只检测到背景值为13.7pg/ml和5.3pg/ml(重复制备不同供体PBMC来源T细胞感染得到的CART细胞)。该数据表明，本发明设计CART3ab10特异表达并分泌了细胞因子IL10。ELISA方法没有能检测到CART3ab、CART4a上清中IL15、IL15/IL15Rα表达和分泌，说明培养的CART3ab、CART4a所分泌的细胞因子IL15和IL15/IL15Rα量偏低。
鉴于细胞培养上清没有能检测到IL15和IL15/IL15Rα的表达，将所生产的4个CART细胞分别注射小鼠体内。取Balb/c裸鼠，静脉注射给予1×106CART细胞。注射后的第7天和第14天分别取血清，ELISA检测血清中IL10和IL15的水平。结果见下表。
表58本发明CART细胞小鼠血清中细胞因子表达量评估
*：不适应
上述结果表明，CART3ab10在小鼠体内第7天的时候，IL10表达量达到5154.7pg/ml。第14天，IL10表达量下降到350.7pg/ml。CART1a，CART(空)作为对照样品均没有检测到IL10表达，检测值14、152.7和128.7pg/ml均为背景值。CART3ab在第14天检测到IL15活性片段表达，表达量为118.8pg/ml。CART4a则在第7天检测到IL15/IL15Rα表达，表达量206.4pg/ml。CART1a和CART(空)作为对照样品均没有检测到IL15表达，读数值为0(背景)。
上述结果表明本发明所设计的CAR转染的T细胞CART3ab、CART4a细胞表达分泌了IL15活性片段。CART3ab10细胞表达分泌了IL10。
实施例39针对CLDN18.2设计的CAR细胞活性
为了评价本发明CART细胞的体外活性，用人CLDN18.2高表达细胞(hCLDN18.2+细胞)作为靶细胞，用人CLDN18.1高表达细胞(hCLDN18.1+细胞)作为对照阴性靶细胞，比较CART细胞对两种细胞杀伤后，靶细胞存活比例来评价CART细胞的特异性体外杀伤活性。具体地，用CFSE(Biolegend，货号423801)标记hCLDN18.2+细胞。配制靶细胞悬液，hCLDN18.1+细胞与CFSE标记的hCLDN18.2+细胞等比例混合，各1.5×105个/ml。于24孔板进行靶细胞杀伤实验，靶细胞悬液每孔100μl。CART1a、CART3ab、CART3ab10、CART4a细胞及阴性细胞(空载体)分别用同样培养基进行稀释，形成不同的CART细胞和靶细胞比例，分别为20∶1，10∶1，3∶1和1∶1。另设未杀伤组，即无CART细胞，仅上述靶细胞组。CART细胞与靶细胞共培养16小时后，弃上清，用PBS轻轻洗掉残余的CART细胞和被杀死的靶细胞，胰酶消化并收集贴壁的靶细胞，用7AAD(Biolegend：420404)染色后，FACS检测7AAD阴性CFSE标记hCLDN18.2+/hCLDN18.1+细胞的比例。
靶细胞特异裂解(杀伤)率＝1-[CART细胞7AAD阴性hCLDN18.2+/hCLN18.1+]/[阴性对照(空载体)细胞7AAD阴性hCLDN18.2+/hCLN18.1+]。靶细胞特异裂解(杀伤)率高，即CART细胞的特异杀伤作用强，以下是CART细胞和靶细胞为10∶1时CART1a杀伤率的计算结果。阴性对照CART细胞结果的数据显示，活细胞CLDN18.1：CLDN18.2为50.5％vs 48.6％，接近1∶1，表明阴性对照CART细胞对非靶细胞和靶细胞均没有杀伤作用。CAR1a细胞结果的数据显示，活细胞CLDN18.1：CLDN18.2为57.5％vs 37.5％，表明CART1a细胞对非靶细胞没有杀伤作用(接近50％)，但对靶细胞(CLDN18.2)有杀伤作用(由50％减少至37.5％)。杀伤率(％)计算方法为：1-[(37.5％/57.5％)/(48.6％/50.5％)]＝32.2％。各结果见下表。
表59本发明CART细胞的体外细胞活性(靶细胞特异杀伤率，％)
上述结果(三次以上重复实验，且每次实验阴性对照CART细胞对非靶细胞和靶细胞均没有杀伤作用)表明，本发明4种CART细胞对靶细胞在20∶1的时候，都显示杀伤作用，杀伤率为19.8％-34.8％。随着CART细胞：靶细胞比例下降，对靶细胞的杀伤效应减弱，减弱最快的是CART4a、CART3ab10和CART3a。这3个CART细胞在3∶1，1∶1的比例时候，基本看不到对靶细胞的杀伤作用了。这说明本发明的CART设计和细胞功能相关，产生的效果随设计的不同显示意想不到的效果。
实施例40针对CLDN18.2设计的CART细胞动物体内药效
取Ba1b/c裸鼠，皮下接种hCLDN18.2+细胞建立肿瘤模型，静脉注射CART细胞，测量肿瘤体积(TV)、体重(BW)来评价CART细胞的抗肿瘤作用及其安全性。具体地，hCLDN18.2+细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中，在含5％CO2的37℃的细胞培养箱中连续培养至对数生长期(汇合率在80％-90％)时，胰酶消化，收集细胞，并用无血清的DMEM/F12洗涤细胞二次，PBS重悬，计数，调整细胞浓度为1×108/ml。Balb/c裸小鼠，每只接种hCLDN18.2+细胞悬液100ul，右肋部皮下。三周后，挑选肿瘤体积80-130mm3的小鼠，分组(2只/组)静脉注射CART细胞2×106/只。给药当天为第0天。之后每周测2次瘤体积，称量体重，记录数据。
肿瘤大小计算公式：肿瘤体积TV(mm3)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径2)；相对肿瘤体积(RTV)＝TV/TV0，其中TV0为起始时(Day 0)的肿瘤体积，设置为1。TV为检测时的肿瘤体积。相对肿瘤体积(RTV)即为各检测时间点肿瘤体积增长倍数。相对肿瘤增长率(T/C％)＝100％*(T-T0)/(C-C0)；抑瘤率(TGI)＝(1-T/C)*100％。其中T0、T分别为样品组实验开始时及实验结束时的肿瘤体积；C0、C分别为对照组实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。
结果表明，注射CART两周后，各小鼠体重没有明显变化，表明CART细胞没有显著的安全性问题。药效方面，CART(空载体)注射小鼠第13天到第19天，肿瘤体积持续增大，增加倍数(相对肿瘤体积)从14持续到39倍(图9)。而注射CART1a、CART3ab、CART3ab10和CART4a细胞的小鼠肿瘤体积增加均在10倍以下(抑瘤率为40％-90％)。特别地，注射CART3ab10和CART4a细胞的小鼠肿瘤体积在第13天到第17天时间段维持几乎没有增长，达到持续抑制(接近100％抑制)效果。这一结果表明，本发明抗CLND18.2抗体设计不同CAR分子产生的CART细胞显示了意想不到的动物药效效果。
实施例40针对CLDN18.2设计的CAR转染NK细胞得到的CARNK细胞活性
取处于对数生长期状态良好的NK92(购自商城北纳创联生物科技有限公司)细胞中分别加入病毒1a、3a、3ab10、4a(MOI在0.5-5范围)、polybrene(终浓度8μg/mL)。感染3h，补液至1mL，过夜换液，培养基为NK92专用培养基(商城北纳创联生物科技有限公司)。每隔一天换液并1∶2扩大培养体积，直到获得足够的细胞进行体内外实验。感染后的NK92细胞分别记为CARNK1a、CARNK3a、CARNK3ab10、CARNK4a细胞；未感染的NK92细胞记为CARNK(空载体)，作为阴性对照。感染7天后，用同上实施例38的方法检测CARNK细胞表面的表达，结果如下表所示。
表60本发明抗CLDN18.2抗体构建CARNK细胞表达抗体scFv的阳性率
CARNK细胞 阳性率(％)
CARNK1a 21
CARNK3a 22
CARNK3ab10 30
CARNK4a 41
上述结果表明，本发明新设计的CAR在NK细胞里面也能很好地表达抗体Ab10的scFv并识别人hCLDN18.2。
实施例41针对CLDN18.2设计的CARNK细胞动物体内药效
同上述实施例7的同样的动物模型评价本发明CARNK细胞的动物药效。取制备好的CARNK(空载体)对照、CARNK1a、CARNK3ab、CARNK3ab10、CARNK4a细胞2×105/只，2只每组，Day 0和Day 3各注射一次。后每周2两次检测肿瘤大小，结果见下表61。
表61本发明抗CLDN182抗体构建CARNK细胞体内药效
表61结果表明，本发明抗CLDN18.2抗体构建CARNK细胞体内第11、第13天持续显示抑制肿瘤效果。抑瘤率在16.5％-60.7％范围。其中，CARNK3ab10显示动物体内药效最优。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海健信生物医药科技有限公司
<120> 靶向CLDN18.2的抗体、双特异性抗体、ADC和CAR及其应用
<130> P20114649CP
<150> CN201810610790.3
<151> 2018-06-17
<150> CN201811295845.2
<151> 2018-11-01
<150> CN201910108951.3
<151> 2019-02-03
<150> CN201910276473.7
<151> 2019-04-08
<160> 61
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 137
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TGFβRII
<400> 1
Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val
1 5 10 15
Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys
20 25 30
Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn
35 40 45
Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala
50 55 60
Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His
65 70 75 80
Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser
85 90 95
Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe
100 105 110
Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser
115 120 125
Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
130 135
<210> 2
<211> 160
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL10
<400> 2
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 3
<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR1a蛋白
<400> 3
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
130 135 140
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
145 150 155 160
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
165 170 175
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
180 185 190
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
245 250 255
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
260 265 270
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
275 280 285
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
290 295 300
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
305 310 315 320
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
325 330 335
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
340 345 350
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
355 360 365
Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
370 375 380
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
385 390 395 400
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
405 410 415
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
420 425 430
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
435 440 445
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
450 455 460
Ala Leu Pro Pro Arg
465
<210> 4
<211> 712
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB193含重链的序列
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
260 265 270
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
275 280 285
Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala
290 295 300
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly
305 310 315 320
Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala
325 330 335
Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
340 345 350
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser
355 360 365
Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
370 375 380
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
385 390 395 400
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
405 410 415
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
420 425 430
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
435 440 445
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
450 455 460
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
465 470 475 480
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
485 490 495
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
500 505 510
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
515 520 525
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
530 535 540
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
545 550 555 560
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
565 570 575
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
580 585 590
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
595 600 605
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
610 615 620
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
625 630 635 640
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
645 650 655
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
660 665 670
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
675 680 685
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
690 695 700
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
705 710
<210> 5
<211> 530
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-hCLDN18.2单克隆抗体轻链核苷酸序列
<400> 5
taatgggctt caagatgaag tcacagtttc tggtcctcat gtccctgctg ttctgggtat 60
ctggtacctg tggggacatt gtgatgacac agtctccatc ctccctgact gtgacagcag 120
gagagaaggt cactatgagt tgcaagtcca gtcagagtct gttaaacagt ggaaatcaaa 180
agaactactt gacctggtac cagcagaaac cagggcagcc tcctaaactg ttgatctact 240
gggcatccac tagggaatct ggggtccctg atcgcttcac aggcagtgga tctggaacac 300
atttcactct caccatcagc agtgtgcagg ctgaagacct ggcagtttat tactgtcaga 360
atgattattt ttatccattc acgttcggct cggggacaaa gttggaaaaa aaacgggctg 420
atgctgcacc aactgtatcc atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg 480
cctcagtcgt gtgcttctga acaactctac cccaaagacc atccatgccc 530
<210> 6
<211> 528
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-hCLDN18.2单克隆抗体重链核苷酸序列
<400> 6
taatgggatg gaccgggatc tttatctttc tcctgtcagt aactgcaggt gttcactccc 60
aggtccagct gcagcagtct ggagctgagc tgataggacc tgggacttca gtgaaggtgt 120
cctgcaaggc ctctggatac gccttcagta attacttgat agaatgggta aaacagaggc 180
ctgaacaggg ccttgagtgg attggtttga ttaatcctgg aagtggtggc actaactaca 240
atgagaagtt caagggcaag gcaacactga ctgcagacaa atcctccagc actgcctaca 300
tgcaactcag cagcctgaca tctgatgact ctgcggtcta cttctgtgca agggtctact 360
atggtaactc ctttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct gcagccaaaa 420
cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact aactccatgg 480
tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt accgagcaag aaatgtcg 528
<210> 7
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mab5b轻链可变区
<400> 7
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Lys
100 105 110
Lys
<210> 8
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mab5b重链可变区
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ile Gly Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 9
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mab5b轻链
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Lys
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 10
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mab5b重链
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ile Gly Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链CDR1
<400> 11
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化轻链CDR1
<400> 12
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链CDR2
<400> 13
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链CDR3
<400> 14
Gln Asn Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链CDR1
<400> 15
Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr Leu Ile Glu
1 5 10
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链CDR2
<400> 16
Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链CDR3
<400> 17
Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr
1 5
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链CDR1(Kabat定义)
<400> 18
Asn Tyr Leu Ile Glu
1 5
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链CDR1(AbM定义)
<400> 19
Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn
1 5 10
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链CDR1(Chothia定义)
<400> 20
Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
1 5
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链CDR2(Chothia定义)
<400> 21
Asn Pro Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链CDR1(Contact定义)
<400> 22
Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr
1 5 10
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化轻链CDR1(Contact定义)
<400> 23
Leu Asn Ser Gly Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr
1 5 10
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链CDR2(Contact定义)
<400> 24
Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu
1 5 10
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链CDR3(Contact定义)
<400> 25
Gln Asn Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe
1 5
<210> 26
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链CDR1(Contact定义)
<400> 26
Ser Asn Tyr Leu Ile Glu
1 5
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链CDR2(Contact定义)
<400> 27
Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn
1 5 10
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链CDR3(Contact定义)
<400> 28
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链可变区序列L14
<400> 29
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 30
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链可变区序列L11
<400> 30
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 31
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链可变区序列L12
<400> 31
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 32
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链可变区序列L13
<400> 32
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 33
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 轻链可变区序列L15
<400> 33
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 34
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链可变区序列H51
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链可变区序列H52
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链可变区序列H53
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链可变区序列H54
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ab10/8/30/42抗体轻链
<400> 38
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 39
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ab10/7/6/15抗体重链
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 40
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ab7/9抗体轻链
<400> 40
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 41
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ab8/9抗体重链
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 42
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ab6/11/12/34/43抗体轻链
<400> 42
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 43
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ab11/13抗体重链
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 44
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ab12/14抗体重链
<400> 44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 45
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ab13/14/15抗体轻链
<400> 45
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 46
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ab42/43抗体重链
<400> 46
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 脱酰胺基敏感位点轻链突变设计1
<400> 47
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Thr Ser Gly Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 脱酰胺基敏感位点轻链突变设计2
<400> 48
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Thr Gly Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 脱酰胺基敏感位点重链突变设计1-1
<400> 49
Val Tyr Tyr Gly Thr Ser Phe Ala Tyr
1 5
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 脱酰胺基敏感位点重链突变设计1-2
<400> 50
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Thr Ser Phe Ala
1 5 10
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 脱酰胺基敏感位点重链突变设计2-1
<400> 51
Val Tyr Tyr Gly Asn Thr Phe Ala Tyr
1 5
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 脱酰胺基敏感位点重链突变设计2-2
<400> 52
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Thr Phe Ala
1 5 10
<210> 53
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB302轻链序列
<400> 53
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 54
<211> 701
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB302含重链的序列
<400> 54
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
130 135 140
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
145 150 155 160
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
165 170 175
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
180 185 190
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
260 265 270
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile
275 280 285
Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
290 295 300
Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr
305 310 315 320
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
325 330 335
Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
340 345 350
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
355 360 365
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
370 375 380
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
385 390 395 400
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
405 410 415
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
420 425 430
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
435 440 445
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
450 455 460
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
465 470 475 480
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
485 490 495
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
500 505 510
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
515 520 525
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
530 535 540
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
545 550 555 560
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
565 570 575
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
580 585 590
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
595 600 605
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
610 615 620
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
625 630 635 640
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
645 650 655
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
660 665 670
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
675 680 685
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
690 695 700
<210> 55
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB305轻链序列
<400> 55
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 56
<211> 709
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB305含重链的序列
<400> 56
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
130 135 140
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
145 150 155 160
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
165 170 175
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
180 185 190
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
260 265 270
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
275 280 285
Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
290 295 300
Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
325 330 335
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
340 345 350
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
355 360 365
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
370 375 380
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
385 390 395 400
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
405 410 415
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
420 425 430
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
435 440 445
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
450 455 460
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
465 470 475 480
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
485 490 495
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
500 505 510
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
515 520 525
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
530 535 540
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser
545 550 555 560
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
565 570 575
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
580 585 590
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
595 600 605
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
610 615 620
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
625 630 635 640
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
645 650 655
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
660 665 670
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
675 680 685
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
690 695 700
Leu Ser Pro Gly Lys
705
<210> 57
<211> 600
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB401含重链的序列
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
465 470 475 480
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
485 490 495
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
500 505 510
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
515 520 525
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
530 535 540
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
545 550 555 560
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
565 570 575
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
580 585 590
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
595 600
<210> 58
<211> 623
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB433含重链的序列
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
450 455 460
Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly
465 470 475 480
Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val
485 490 495
Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys
500 505 510
Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu
515 520 525
Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu
530 535 540
Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn
545 550 555 560
Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro
565 570 575
Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn
580 585 590
Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile
595 600 605
Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
610 615 620
<210> 59
<211> 623
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB4333含重链的序列
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
450 455 460
Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly
465 470 475 480
Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val
485 490 495
Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys
500 505 510
Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu
515 520 525
Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu
530 535 540
Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn
545 550 555 560
Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro
565 570 575
Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn
580 585 590
Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile
595 600 605
Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
610 615 620
<210> 60
<211> 623
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB4331含重链的序列
<400> 60
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Ala Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro Gly Gln
450 455 460
Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro
465 470 475 480
Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe
485 490 495
Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu
500 505 510
Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met
515 520 525
Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp
530 535 540
Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr
545 550 555 560
Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn
565 570 575
Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln
580 585 590
Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn
595 600 605
Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
610 615 620
<210> 61
<211> 623
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB4335含重链的序列
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
450 455 460
Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly
465 470 475 480
Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val
485 490 495
Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys
500 505 510
Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu
515 520 525
Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu
530 535 540
Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn
545 550 555 560
Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro
565 570 575
Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn
580 585 590
Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile
595 600 605
Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
610 615 620

Claims (73)

1.一种双特异性抗体，其包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，其特征在于，所述第一蛋白功能区为靶向CLDN18.2的抗体；所述第二蛋白功能区为靶向非CLDN18.2抗原的抗体，或所述第二蛋白功能区为细胞因子和细胞因子受体或它们的片段；
所述靶向CLDN18.2的抗体包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述VL包含以下的互补决定区CDR序列：
如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的VL CDR1氨基酸序列；如SEQ ID NO:13所示的VL CDR2氨基酸序列；如SEQ ID NO:14所示的VL CDR3氨基酸序列；
所述VH包含以下的CDR序列：
如SEQ ID NO:15所示的VH CDR1氨基酸序列；如SEQ ID NO:16所示的VH CDR2氨基酸序列；如SEQ ID NO:17所示的VH CDR3氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述靶向CLDN18.2的抗体的CDR突变序列为CDR区发生脱氨基化敏感位点突变的序列；所述CDR区发生脱氨基化敏感位点突变为：
所述轻链CDR1第L30B位的氨基酸残基由S突变为T，且前提是轻链CDR1第L30E位为N和第L34位为A；和/或，
所述重链CDR3第H100位的氨基酸残基由S突变为T，且前提是轻链CDR1第L30E位为N和第L34位为A；
所述靶向CLDN18.2的抗体的CDR序列按照CCG编号规则定义。
3.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述靶向CLDN18.2的抗体为鼠源抗体。
4.如权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，所述鼠源抗体的VL为如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；和/或，所述鼠源抗体的VH为如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
5.如权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，所述靶向CLDN18.2的抗体包含鼠源抗体的可变区和鼠或人抗体恒定区；所述鼠源抗体的恒定区包括鼠IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区，所述人抗体恒定区包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区。
6.如权利要求5所述的双特异性抗体，其特征在于，所述靶向CLDN18.2的抗体为鼠源抗体的可变区和人抗体恒定区组合成的嵌合抗体。
7.如权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，所述嵌合抗体的轻链氨基酸序列为如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；和/或，所述嵌合抗体的重链氨基酸序列为如
SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述靶向CLDN18.2的抗体为人源化抗体。
9.如权利要求8所述的双特异性抗体，其特征在于，所述人源化抗体包含序列为SEQ IDNO:29所示的氨基酸序列的轻链可变区和序列为SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的重链可变区；
所述人源化抗体包含序列为SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的轻链可变区和序列为SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的重链可变区；
所述人源化抗体包含序列为SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的轻链可变区和序列为SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的重链可变区；
所述人源化抗体包含序列为SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的轻链可变区和序列为SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列的重链可变区；
所述人源化抗体包含序列为SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的轻链可变区和序列为SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列的重链可变区；
所述人源化抗体包含序列为SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的轻链可变区和序列为SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的重链可变区；
所述人源化抗体包含序列为SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的轻链可变区和序列为SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的重链可变区；
所述人源化抗体包含序列为SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的轻链可变区和序列为SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的重链可变区；
所述人源化抗体包含序列为SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的轻链可变区和序列为SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的重链可变区；或，
所述人源化抗体包含序列为SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的轻链可变区和序列为SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的重链可变区。
10.如权利要求8所述的双特异性抗体，其特征在于，所述靶向CLDN18.2的抗体的轻链包含选自人抗体κ或λ型轻链恒定区或其突变；和/或，所述靶向CLDN18.2的抗体的重链包含选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区或其突变。
11.如权利要求10所述的双特异性抗体，其特征在于，所述重链恒定区或其突变，包含人IgG1 Fc区第234位、第235和第243位，或第239、第330和第332位突变。
12.如权利要求10所述的双特异性抗体，其特征在于，所述重链恒定区或其突变，包含人IgG1 Fc区第356-358位为EEM或DEL的突变。
13.如权利要求8所述的双特异性抗体，其特征在于，所述靶向CLDN18.2的抗体包含以下轻链和重链：
所述重链如SEQ ID NO:39的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ ID NO:38的氨基酸序列所示；
所述重链如SEQ ID NO:39的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ ID NO:42的氨基酸序列所示；
所述重链如SEQ ID NO:39的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ ID NO:40的氨基酸序列所示；
所述重链如SEQ ID NO:41的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ ID NO:38的氨基酸序列所示；
所述重链如SEQ ID NO:41的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ ID NO:40的氨基酸序列所示；
所述重链如SEQ ID NO:43的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ ID NO:42的氨基酸序列所示；
所述重链如SEQ ID NO:44的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ ID NO:42的氨基酸序列所示；
所述重链如SEQ ID NO:43的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ ID NO:45的氨基酸序列所示；
所述重链如SEQ ID NO:44的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ ID NO:45的氨基酸序列所示；或，
所述重链如SEQ ID NO:39的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQ ID NO:45的氨基酸序列所示。
14.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述靶向CLDN18.2的抗体为免疫球蛋白、Fab、Fab’、F(ab’)2或Fv。
15.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述靶向CLDN18.2的抗体为scFv。
16.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述非CLDN18.2抗原为免疫检查点抗原或肿瘤治疗靶点。
17.如权利要求16所述的双特异性抗体，其特征在于，所述免疫检查点抗原包括PD-1、PD-L1、Tim3、LAG3或CD47，所述肿瘤治疗靶点包括SIRPα。
18.如权利要求17所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二蛋白功能区为抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗Tim3抗体、抗LAG3抗体、抗CD47抗体、抗CD3抗体或抗CSF-1R抗体。
19.如权利要求18所述的双特异性抗体，其特征在于，所述抗PD-1抗体为Nivolumab、Pembrolizumab或者Ba08，所述抗PD-L1抗体为Atezolumab、Avelumab或者Durvalumab，所述抗CD47抗体为hu5F9或iMab，所述抗CD3抗体为Blincyto或AMG420中由结合CD3的轻、重链可变区序列构建的抗体；
或，所述细胞因子包括TGFβ、IL10和CSF-1，所述细胞因子受体包括TGFβRII、IL10受体和CSF-1R。
20.如权利要求16所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为一个或多个scFv、细胞因子或它的片段、或细胞因子受体或它的片段；或者，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白，所述的第一蛋白功能区为一个或多个scFv；其中，所述scFv包括重链可变区与轻链可变区，所述重链可变区与轻链可变区通过连接子连接；所述scFv、细胞因子或它的片段、或细胞因子受体或它的片段通过连接子与所述免疫球蛋白连接。
21.如权利要求20所述的双特异性抗体，其特征在于，所述连接子为(G4S)w。
22.如权利要求21所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的w为0～10之间的整数。
23.如权利要求22所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的w为整数1、2、3或者4。
24.根据权利要求20所述的双特异性抗体，其特征在于，所述scFv的结构为轻链可变区-连接子-重链可变区，其轻链可变区N末端或重链可变区C末端分别通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端；或所述scFv的结构为重链可变区-连接子-轻链可变区，其重链可变区N末端或者轻链可变区C末端分别通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端。
25.如权利要求24所述的双特异性抗体，其特征在于，所述连接子为(G4S)3，和/或，所述scFv的数量为两个且对称地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链。
26.如权利要求25所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的双特异性抗体选自以下任一种：
(1)所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包括轻链如SEQ ID NO:38所示、重链如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；所述第二蛋白功能区为scFv；其中，
两个scFv的重链可变区的C末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条
重链的N末端；且，所述scFv的轻链可变区为Atezolumab的轻链可变区，所述scFv的重链可变区为Atezolumab的重链可变区；或，
两个scFv的重链可变区的C末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链可变区的N末端；且，所述scFv的轻链可变区为Hu5F9的轻链可变区，所述scFv的重链可变区为Hu5F9的轻链可变区；或，
两个scFv的重链可变区的N末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的C末端；且，所述scFv的轻链可变区为AMG420的轻链可变区，所述scFv的重链可变区为AMG420的重链可变区；
(2)所述第一蛋白功能区为scFv，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白；两个scFv的重链可变区的C末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的N末端；所述scFv的轻链可变区的序列如SEQ ID NO:29所示，所述scFv的重链可变区的序列如SEQ ID NO:34所示；其中，
所述免疫球蛋白包括Nivolumab的轻链可变区、轻链恒定区为κ链、Nivolumab的重链可变区以及重链恒定区为hIgG4的氨基酸序列；或，
所述免疫球蛋白包括Pembrolizumab的轻链可变区、轻链恒定区为κ链、Pembrolizumab的重链可变区以及重链恒定区为hIgG4的氨基酸序列；或，
所述免疫球蛋白包括Atezolumab的轻链可变区、轻链恒定区为κ链、Atezolumab的重链可变区以及重链恒定区为hIgG1的氨基酸序列。
27.根据权利要求20所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为细胞因子或它的片段、或细胞因子受体或它的片段；所述第二蛋白功能区通过连接子对称地与所述免疫球蛋白两条轻链和/或两条重链的C末端和/或N末端连接。
28.如权利要求27所述的双特异性抗体，其特征在于，所述细胞因子或它的片段、或细胞因子受体或它的片段的数量为两个或四个；和/或，所述连接子为(G4S)3。
29.如权利要求27所述的双特异性抗体，其特征在于，所述免疫球蛋白包括轻链如SEQID NO:38所示；重链如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；其中，
所述细胞因子或它的片段、或细胞因子受体或它的片段为TGFβRII，其序列如SEQ IDNO:1所示，且数量为两个；所述TGFβRII对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的C末端，其C末端氨基酸由K突变为A；或，
所述细胞因子或它的片段、或细胞因子受体或它的片段为IL10，其序列如SEQ ID NO:2所示，且数量为两个；所述IL10对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的C末
端，其C末端氨基酸由K突变为A。
30.如权利要求24～29任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的双特异性抗体包括以下轻链氨基酸序列和含重链的氨基酸序列：
如SEQ ID NO:53所示的轻链氨基酸序列，如SEQ ID NO:54所示的含重链的氨基酸序列；或，如SEQ ID NO:55所示的轻链氨基酸序列，如SEQ ID NO:56所示的含重链的氨基酸序列；或，如SEQ ID NO:38所示的轻链氨基酸序列，如SEQ ID NO:57所示的含重链的氨基酸序列；或，如SEQ ID NO:38所示的轻链氨基酸序列，如SEQ ID NO:58所示的含重链的氨基酸序列；或，如SEQ ID NO:38所示的轻链氨基酸序列，如SEQ ID NO:59所示的含重链的氨基酸序列；或，如SEQ ID NO:38所示的轻链氨基酸序列，如SEQ ID NO:60所示的含重链的氨基酸序列；或，如SEQ ID NO:38所示的轻链氨基酸序列，如SEQ ID NO:61所示的含重链的氨基酸序列；或，如SEQ ID NO:38所示的轻链氨基酸序列，如SEQ ID NO:4所示的含重链的氨基酸序列。
31.一种分离的核酸，其编码如权利要求1-30中任一项所述的双特异性抗体。
32.一种抗体药物偶联体，其结构如下式I所示：
Ab-[(L2)n-L1–D]y式I
其中，D为具有细胞毒性的小分子药物，L1和L2为分别连接所述药物和所述抗体的接头；n为0或1；y表示偶联于Ab的D的平均数，且0<y≤10；
所述Ab为如权利要求1-15中任一项所述的双特异性抗体中所定义的靶向CLDN18.2的抗体，或所述Ab为如权利要求1–30中任一项所述的双特异性抗体。
33.如权利要求32所述的抗体药物偶联体，其特征在于，所述y的值为2≤y≤7。
34.如权利要求32所述的抗体药物偶联体，其特征在于，所述y的值为3≤y≤6。
35.如权利要求32所述的抗体药物偶联体，其特征在于，所述y的值为4.4或4.8。
36.如权利要求32所述的抗体药物偶联体，其特征在于，所述小分子药物为MMAE、MMAF、DM1、DM3和DM4中的一种或多种；所述接头为SPP、SIAB、SMCC、MP、VC、ala-phe、PAB和MC-VC-PAB中的一种或多种。
37.如权利要求32所述的抗体药物偶联体，其特征在于，所述L2为下式II所示的化合物：
其中，X1选自氢原子、卤素、羟基和氰基；X2选自烷基、环烷基和杂环基；m为0-5；S为硫原子。
38.如权利要求37所述的抗体药物偶联体，其特征在于，当X1为氢原子、X2为烷基、m为1时，式II所示的化合物为硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯。
39.如权利要求32所述的抗体药物偶联体，其特征在于，所述小分子药物为DM1，所述接头L1为SMCC，n为0，由此形成如下式III所示的抗体药物偶联体：
式III
或，所述小分子药物为MMAF，所述接头L1为MC-VC-PAB，L2为硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯，n为1，由此形成如下式IV所示的抗体药物偶联体：
式IV
40.如权利要求32-38中任一项所述的抗体药物偶联体，其为如下式V所示的抗体药物偶联体：
式V
或，如下式VI所示的抗体药物偶联体：
式VI
或，如下式VII所示的抗体药物偶联体：
式VII
或，如下式VIII所示的抗体药物偶联体：
式VIII
其中，所述Ab10包含如SEQ ID NO:38所示的轻链和如SEQ ID NO:39所示的重链；所述Ab6包含如SEQ ID NO:42所示的轻链和如SEQ ID NO:39所示的重链。
41.一种如权利要求32-40中任一项所述的抗体药物偶联体的制备方法，其特征在于，
当n为1时，所述制备方法包括以下步骤：
(1)制备中间体1：取所述抗体与所述接头L2在溶液中混合，反应后纯化即得含中间体1的溶液，所述中间体1如下式IX所示：
其中，X1选自氢原子、卤素、羟基和氰基；X2选自烷基、环烷基和杂环基；m为0-5；S为硫原子；
(2)制备中间体2：取所述接头L1与所述药物制备成中间体2：L1-D；
(3)将步骤(1)获得的含中间体1的溶液，与步骤(2)获得的含中间体2的溶液混合，反应后纯化即得含抗体药物偶联体的溶液；
当n为0时，所述制备方法包括以下步骤：
(1)制备中间体3：取所述抗体与所述接头L1在溶液中混合，反应后纯化即得含中间体3的溶液；
(2)将步骤(1)获得的含中间体3的溶液，与含所述药物的溶液混合，反应后纯化即得含抗体药物偶联体的溶液。
42.如权利要求41所述的制备方法，其特征在于，X1为氢原子，X2为烷基，m为1，即L2为硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯。
43.如权利要求41所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和/或(2)中，所述反应温度为25℃；所述反应时间为2～4小时；和/或，所述纯化为用凝胶过滤纯化。
44.如权利要求43所述的制备方法，其特征在于，所述纯化为Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化。
45.一种CAR，其特征在于，所述CAR包括：(a)特异性识别CLDN18.2的胞外结合结构域scFv；(b)铰链结构域；(c)跨膜结构域；(d)共刺激胞内结构域；(e)信号传导结构域；所述胞外结合结构域包括如权利要求1-15中任一项所述的双特异性抗体中所定义的靶向CLDN18.2的抗体的轻链可变区和重链可变区。
46.如权利要求45所述的CAR，其特征在于，
(1)所述铰链结构域选自一种或多种以下分子的铰链区：CD8α、CD28、CD152、PD1和IgG1重链；
(2)所述跨膜结构域选自一种或多种以下分子的跨膜区：TCR的α、β、ζ链，CD3ε，CD3ζ，CD8α，CD16，CD28，CD33，CD64，CD80，CD86，CD134，4-1BB，CD152，和PD1；
(3)所述共刺激胞内结构域选自一种或多种以下分子的胞内区：CD27、CD28、CD30、CD40、OX40、CD134、4-1BB、CD150、CD223、PD-L2、PD-L1、NKD2C和FcεRIγ；和/或，
(4)所述信号传导结构域选自一种或多种以下分子的胞内区：Igα、Igβ、TCRξ、FcR1γ、FcR1β、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD28、CD79a、CD79b和CD3ζ。
47.如权利要求46所述的CAR，其特征在于，所述共刺激胞内结构域为CD28胞内区和/或4-1BB胞内区；和/或，所述信号传导结构域为CD3ζ胞内区。
48.如权利要求45～47任一项所述的CAR，其特征在于，所述铰链结构域为CD8α铰链区，所述跨膜结构域为CD8α跨膜区，所述共刺激胞内结构域为CD28胞内区和/或4-1BB胞内区，所述信号传导结构域为CD3ζ胞内区。
49.如权利要求48所述的CAR，其特征在于，所述CD8α铰链区为人CD8α铰链区；所述CD8α跨膜区为人CD8α跨膜区；所述CD28胞内区为人CD28胞内区；所述4-1BB胞内区为人4-1BB胞内区；和/或，所述CD3ζ胞内区为人CD3ζ胞内区。
50.如权利要求49所述的CAR，其特征在于，所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
51.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体具有如式car-[(IRES)-f]q所示的结构，其中，IRES为内部核糖体进入位点序列；f编码功能性蛋白F，q为0或1；car编码如权利要求45-50中任一项所述的CAR。
52.如权利要求51所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体中，当q为1时，所述功能性蛋白F包括：
(1)细胞因子或其活性片段；
(2)细胞因子受体或其活性片段；或，
(3)细胞因子受体或其活性片段与细胞因子的融合蛋白。
53.如权利要求52所述的核酸构建体，其特征在于，
所述细胞因子或其活性片段为IL10或IL15或其活性片段；
所述细胞因子受体或其活性片段为IL15Rα或其片段或IL15Rα片段sushi或IL15Rα片段sushi+；或，
所述细胞因子受体或其活性片段与细胞因子的融合蛋白为IL15Rα或其片段或IL15Rαsushi或IL15Rαsushi+与IL15的融合片段。
54.如权利要求53所述的核酸构建体，其特征在于，所述IL10的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
55.如权利要求51～54任一项所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的结构为：
(1)scFv-人CD8α铰链区-人CD8α跨膜区-人4-1BB胞内区-人CD3ζ胞内区；
(2)scFv-人CD8α铰链区-人CD8α跨膜区-人4-1BB胞内区-人CD3ζ胞内区-(IRES)-IL15；
(3)scFv-人CD8α铰链区-人CD8α跨膜区-人4-1BB胞内区-人CD3ζ胞内区-(IRES)-IL10；或，
(4)scFv-人CD8α铰链区-人CD8α跨膜区-人4-1BB胞内区-人CD3ζ胞内区-(IRES)-IL15Rαsushi+-IL15。
56.一种表达载体，其包含如权利要求31所述的分离的核酸，或权利要求51-55中任一项所述的核酸构建体。
57.如权利要求56所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。
58.一种基因修饰的细胞，其特征在于，其转染有如权利要求56或57所述的表达载体。
59.如权利要求58所述的基因修饰的细胞，其特征在于，所述基因修饰的细胞为真核细胞。
60.如权利要求58所述的基因修饰的细胞，其特征在于，所述基因修饰的细胞为分离的人细胞。
61.如权利要求58所述的基因修饰的细胞，其特征在于，所述基因修饰的细胞为免疫细胞。
62.如权利要求58所述的基因修饰的细胞，其特征在于，所述基因修饰的细胞为T细胞，或NK细胞。
63.如权利要求58所述的基因修饰的细胞，其特征在于，所述基因修饰的细胞为NK92细胞系。
64.一种制备基因修饰的细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将权利要求56或57所述的表达载体转入待修饰的细胞内即得。
65.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述基因修饰的细胞为真核细胞。
66.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述基因修饰的细胞为分离的人细胞。
67.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述基因修饰的细胞为免疫细胞。
68.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述基因修饰的细胞为T细胞或NK细胞。
69.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述基因修饰的细胞为NK92细胞系。
70.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1-30中任一项所述的双特异性抗体、权利要求32-42中任一项所述的抗体药物偶联体或权利要求58-63任一项所述的基因修饰的细胞以及药学上可接受的载体。
71.如权利要求70所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括免疫检查点抗体。
72.一种如权利要求1-30中任一项所述的双特异性抗体、权利要求32-42中任一项所述的抗体药物偶联体、权利要求45-50中任一所述的CAR、权利要求51-55中任一所述的核酸构建体、权利要求56或57所述的表达载体、权利要求58-63任一项所述的基因修饰的细胞或权利要求70或71所述的药物组合物在制备治疗CLDN18.2阳性肿瘤的药物中的应用。
73.如权利要求72所述的应用，其特征在于，所述CLDN18.2阳性肿瘤为胃癌、食管癌、肺癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤或者白血病。
CN201980019477.5A 2018-06-17 2019-06-06 靶向cldn18.2的抗体、双特异性抗体、adc和car及其应用 Active CN111867630B (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2018106107903 2018-06-17
CN201810610790.3A CN110606891B (zh) 2018-06-17 2018-06-17 一种针对人cldn18.2的抗体分子，抗原结合片段及其医药用途
CN2018112958452 2018-11-01
CN201811295845.2A CN111110862A (zh) 2018-11-01 2018-11-01 抗cldn18．2抗体的药物偶联体及其制备方法和用途
CN2019101089513 2019-02-03
CN201910108951.3A CN111518214B (zh) 2019-02-03 2019-02-03 靶向cldn18.2的双特异性抗体及其制备方法和应用
CN201910276473.7A CN111848809A (zh) 2019-04-08 2019-04-08 靶向Claudin18.2的CAR分子、其修饰的免疫细胞及用途
CN2019102764737 2019-04-08
PCT/CN2019/090255 WO2019242505A1 (zh) 2018-06-17 2019-06-06 靶向cldn18.2的抗体、双特异性抗体、adc和car及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111867630A CN111867630A (zh) 2020-10-30
CN111867630B true CN111867630B (zh) 2023-10-13

Family

ID=68983259

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980019477.5A Active CN111867630B (zh) 2018-06-17 2019-06-06 靶向cldn18.2的抗体、双特异性抗体、adc和car及其应用

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11912763B2 (zh)
EP (1) EP3808376A4 (zh)
JP (1) JP7468903B2 (zh)
CN (1) CN111867630B (zh)
WO (1) WO2019242505A1 (zh)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11629340B2 (en) 2017-03-03 2023-04-18 Obsidian Therapeutics, Inc. DHFR tunable protein regulation
CN111518214B (zh) * 2019-02-03 2023-09-22 上海健信生物医药科技有限公司 靶向cldn18.2的双特异性抗体及其制备方法和应用
US20230192840A1 (en) * 2018-12-28 2023-06-22 Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd. Antibody and use thereof
CN111434692B (zh) * 2019-01-15 2021-12-31 浙江道尔生物科技有限公司 抗cld18a2纳米抗体及其应用
WO2020160560A2 (en) 2019-02-01 2020-08-06 Novarock Biotherapeutics, Ltd. Anti-claudin 18 antibodies and methods of use thereof
WO2021024020A1 (en) * 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
CN118403182A (zh) * 2019-12-12 2024-07-30 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗密蛋白抗体药物偶联物及其医药用途
MX2022007791A (es) * 2019-12-27 2022-10-03 Nanjing Legend Biotech Co Ltd Partes de unión a claudin18.2 y usos de estas.
JP7483896B2 (ja) * 2020-01-17 2024-05-15 エショー バイオセラピー， インク． オフターゲット毒性を低下させるプロ抗体
EP4090687A4 (en) * 2020-01-19 2024-02-21 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. MULTI-SPECIFIC ANTI-CLAUDINE-18.2 CONSTRUCTS AND THEIR USES
KR20220140786A (ko) * 2020-02-10 2022-10-18 상하이 에스쿠겐 바이오테크놀로지 컴퍼니 리미티드 클라우딘18.2 항체 및 그것의 사용
CN113637082A (zh) * 2020-04-27 2021-11-12 启愈生物技术(上海)有限公司 一种靶向人claudin和人PDL1蛋白的双特异抗体及其应用
WO2021231447A1 (en) * 2020-05-12 2021-11-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Novel il10 agonists and methods of use thereof
CN113754778A (zh) * 2020-06-05 2021-12-07 上海交通大学 靶向cldn18.2的嵌合抗原受体及其用途
CN114222761B (zh) * 2020-07-14 2024-02-20 浙江道尔生物科技有限公司 一种抗cld18a2的单域抗体
KR20230070203A (ko) * 2020-08-06 2023-05-22 에이비프로 코퍼레이션 항-클라우딘 18.2 다중 특이적 항체 및 이의 용도
WO2022037582A1 (zh) * 2020-08-18 2022-02-24 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗cd3和抗cldn-18.2双特异性抗体及其用途
CN112480248B (zh) * 2020-11-24 2023-05-05 三优生物医药(上海)有限公司 与cld18a2特异性结合的分子
WO2022122709A1 (en) 2020-12-07 2022-06-16 Sotio Biotech A.S. Antibody-drug conjugates based on humanized cldn18.2 antibodies
JP2024500242A (ja) 2020-12-23 2024-01-05 ソティオ バイオテック エイ．エス． 腫瘍特異的クローディン１８．２抗体と薬物との複合体
CN114685682B (zh) * 2020-12-31 2023-11-10 上海莱馥医疗科技有限公司 一种靶向表达cldn 18.2的细胞的嵌合抗原受体
CN113354739B (zh) * 2021-01-11 2022-08-23 上海莱馥医疗科技有限公司 一种靶向表达Claudin18.2细胞的嵌合抗原受体及其应用
CN114805571B (zh) * 2021-01-28 2023-08-25 广西鹭港生物医药科技有限公司 抗cldn18.2抗体及其应用
AU2022232375A1 (en) 2021-03-09 2023-09-21 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
WO2022211508A1 (ko) * 2021-03-30 2022-10-06 주식회사 레고켐바이오사이언스 인간 cldn18.2에 대한 항체를 포함하는 항체 약물 접합체 및 이의 용도
CN117098782A (zh) * 2021-04-02 2023-11-21 原启生物科技(上海)有限责任公司 靶向cldn18.2的抗原结合蛋白及其用途
CN113416260B (zh) * 2021-04-14 2022-02-01 南京凯地医疗技术有限公司 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
CN117157105A (zh) * 2021-05-08 2023-12-01 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 一种抗Claudin18.2抗体及其抗体药物偶联物
KR20240007766A (ko) * 2021-05-31 2024-01-16 쉬지아주앙 일링 파머서티컬 컴퍼니 리미티드 CLDN18.2에 대한 단클론 항체 및 이의 Fc 조작된 형태
JP2024523166A (ja) * 2021-06-15 2024-06-28 ゼンコア インコーポレイテッド クローディン１８．２及びｃｄ３に結合するヘテロ二量体抗体
WO2023274355A1 (zh) * 2021-07-02 2023-01-05 上海交通大学 改造的间充质干细胞和免疫效应细胞联合治疗肿瘤
CN118215686A (zh) * 2021-08-27 2024-06-18 三优生物医药(上海)有限公司 靶向pd-l1和cldn18.2的双特异性抗体及其制备方法和应用
KR20240049843A (ko) * 2021-09-03 2024-04-17 풀몬진 (홍콩) 씨오., 리미티드 이중기능성 융합 단백질 및 이의 용도
CN118159300A (zh) * 2021-09-27 2024-06-07 苏州信诺维医药科技股份有限公司 一种抗体及其药物偶联物和用途
AU2022371521A1 (en) * 2021-10-19 2024-05-02 Biosion Inc. Antibodies binding cldn18.2 and uses thereof
CN115991784A (zh) * 2021-10-19 2023-04-21 宝船生物医药科技(上海)有限公司 抗cd47-cldn18.2双特异性抗体及其用途
WO2023078386A1 (zh) * 2021-11-05 2023-05-11 正大天晴药业集团股份有限公司 抗cldn18.2抗体及其用途
CN116102649A (zh) * 2021-11-11 2023-05-12 上海生物制品研究所有限责任公司 抗cldn18.2单克隆抗体及其应用
TW202333785A (zh) * 2021-11-16 2023-09-01 中國大陸商蘇州創勝醫藥集團有限公司 Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２拮抗劑和ｐｄ－１／ｐｄ－ｌ１軸抑制劑的組合療法
WO2023141478A2 (en) * 2022-01-18 2023-07-27 Senti Biosciences, Inc. Cytokine-immunoreceptor fusion proteins and uses thereof
WO2023213280A1 (zh) * 2022-05-06 2023-11-09 上海先博生物科技有限公司 靶向cldn18.2的嵌合抗原t细胞受体及其应用
CN117279949B (zh) * 2022-05-27 2024-08-02 苏州易慕峰生物科技有限公司 包含cldn18.2单域抗体的嵌合抗原受体及其应用
CN117229398A (zh) * 2022-06-15 2023-12-15 中山康方生物医药有限公司 抗cldn18.2抗体、其药物组合物及用途
CN115960229B (zh) * 2022-09-28 2024-02-09 华润生物医药有限公司 一种cldn18.2抗体及其应用
WO2024067759A1 (zh) * 2022-09-29 2024-04-04 北京诺诚健华医药科技有限公司 一种能够结合cldn18.2的抗体或其抗原结合片段及其应用
KR20240101987A (ko) * 2022-12-23 2024-07-03 주식회사 와이바이오로직스 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의 용도
CN117701719B (zh) * 2024-02-04 2024-05-31 北京肿瘤医院(北京大学肿瘤医院) 肿瘤靶向cldn18.2治疗耐药标志物及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016180468A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes
CN108047331A (zh) * 2012-05-09 2018-05-18 加尼梅德药物公司 用于癌症诊断的针对密蛋白18.2的抗体

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
BRPI0510883B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
CA2580141C (en) 2004-09-23 2013-12-10 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
EP1777294A1 (en) 2005-10-20 2007-04-25 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) IL-15Ralpha sushi domain as a selective and potent enhancer of IL-15 action through IL-15Rbeta/gamma, and hyperagonist (IL15Ralpha sushi -IL15) fusion proteins
US7750116B1 (en) 2006-02-18 2010-07-06 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugate metabolites
PT2569013T (pt) 2010-05-14 2017-02-08 Univ Leland Stanford Junior Anticorpos monoclonais humanizados e quiméricos para cd47
PE20190262A1 (es) 2011-08-01 2019-02-25 Genentech Inc Metodos para tratar el cancer por el uso de antagonistas de union al eje pd-1 e inhibidores de mek
CN103517604B (zh) 2012-06-29 2016-08-10 国网山东省电力公司东营供电公司 理线装置
AU2013343045A1 (en) 2012-11-07 2015-05-21 Pfizer Inc. Anti-Notch3 antibodies and antibody-drug conjugates
AR095374A1 (es) 2013-03-15 2015-10-14 Amgen Res (Munich) Gmbh Moléculas de unión para bcma y cd3
WO2014146672A1 (en) 2013-03-18 2014-09-25 Ganymed Pharmaceuticals Ag Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
MX2016010067A (es) 2014-02-10 2016-10-07 Merck Patent Gmbh INHIBICION DIRIGIDA DEL FACTOR DE CRECIMIENTO TRANSFORMADOR ß (TGF ß).
CN105315375B (zh) 2014-07-17 2021-04-23 恺兴生命科技(上海)有限公司 靶向cld18a2的t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN105330740B (zh) 2014-07-30 2018-08-17 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗pd-1抗体及其应用
WO2016165762A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2
CN106188293A (zh) 2015-04-17 2016-12-07 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗c-Met抗体和抗c-Met抗体-细胞毒性药物偶联物及其医药用途
WO2018054484A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Biontech Ag Bispecific trivalent antibodies binding to claudin 6 or claudin18.2 and cd3 for treatment of claudin expressing cancer diseases
CN114773471A (zh) 2016-10-20 2022-07-22 天境生物科技(上海)有限公司 新的cd47单克隆抗体及其应用
CN106755107B (zh) 2016-11-22 2019-10-01 上海健信生物医药科技有限公司 一种car新分子及其在肿瘤治疗中的应用
CN108948193B (zh) 2017-05-18 2022-12-09 上海健信生物医药科技有限公司 针对tim-3的抗体分子,抗原结合片段及其医药用途
CN110172099B (zh) 2018-08-16 2020-03-03 上海健信生物医药科技有限公司 抗lag-3人源化单克隆抗体分子，抗原结合片段及其医药用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108047331A (zh) * 2012-05-09 2018-05-18 加尼梅德药物公司 用于癌症诊断的针对密蛋白18.2的抗体
WO2016180468A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
左忠林 ; 陈鹏 ; 陈小龙 ; 夏冬 ; .Claudin-18在胃癌中的临床表达关系与治疗.中华临床医师杂志(电子版).2018,(03),第173-176页. *

Also Published As

Publication number Publication date
US20210230272A1 (en) 2021-07-29
US11912763B2 (en) 2024-02-27
EP3808376A4 (en) 2021-09-01
JP2021527441A (ja) 2021-10-14
WO2019242505A1 (zh) 2019-12-26
EP3808376A1 (en) 2021-04-21
CN111867630A (zh) 2020-10-30
JP7468903B2 (ja) 2024-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111867630B (zh) 靶向cldn18.2的抗体、双特异性抗体、adc和car及其应用
CN110606891B (zh) 一种针对人cldn18.2的抗体分子，抗原结合片段及其医药用途
CN111518214B (zh) 靶向cldn18.2的双特异性抗体及其制备方法和应用
CN114502592B (zh) 靶向cldn18.2的抗体及其制备方法和应用
TWI841790B (zh) 靶向cd3的抗體、雙特異性抗體及其用途
CN110462038A (zh) 抗gprc5d抗体和包含所述抗体的分子
CN116333133A (zh) 抗-gprc5d抗体、结合gprc5d和cd3的双特异性抗原结合分子及其用途
CN109535253B (zh) 新型抗cd19抗体
CN113853388B (zh) 抗-egfrviii抗体及其抗原结合片段
US20230071422A1 (en) ANTI-CD3 and ANTI-CD123 Bispecific Antibody and Use Thereof
US20220340657A1 (en) Antibody and bispecific antibody targeting lag-3 and use thereof
CN110172099B (zh) 抗lag-3人源化单克隆抗体分子，抗原结合片段及其医药用途
IL294368A (en) Means and method for modulating mixed effects in immune cells
CN114981301A (zh) Pd1和vegfr2双结合剂
JP2022537703A (ja) 抗体および使用方法
JP2021501583A (ja) 抗体および使用方法
CN116355095A (zh) 靶向tigit的抗体和双特异性抗体及其应用
US20230134183A1 (en) Cldn18.2-targeting antibody, bispecific antibody and use thereof
TWI833227B (zh) 靶向pd-l1和cd73的特異性結合蛋白及其應用
CN114773485B (zh) 抗人PD-L1抗体和TGFβRII的双功能融合蛋白分子
RU2791445C2 (ru) Новые анти-cd19-антитела

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant