CN118159300A - 一种抗体及其药物偶联物和用途 - Google Patents

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Abstract

抗体和抗体‑药物偶联物，涉及靶向Claudin18.2(CLDN18.2)的抗体以及抗体‑药物偶联物(ADC)以及含有所述抗体和ADC分子的组合物及其治疗应用。

Description

一种抗体及其药物偶联物和用途 技术领域
本发明涉及抗体以及抗体药物偶联物，更具体地涉及靶向Claudin18.2(CLDN18.2)的抗体及抗体-药物偶联物(ADC)以及含有所述抗体或ADC分子的组合物及其治疗应用。
背景技术
胃癌是全球癌症死亡的第三大主要原因，转移性胃癌及胃食管交界处癌(EGJA)患者的整体5年生存率更是不足20％。尽管相关研究众多，但由于患者群体数量庞大，胃癌治疗的需求仍未被满足。尤其是在缺乏有效靶向治疗方案的HER2阴性患者中，治疗手段比较匮乏，患者生存情况不容乐观。
Claudin18.2是紧密连接蛋白Claudin家族成员，介导细胞与细胞之间的紧密连接。Claudin18.2高表达于胃癌及胰腺癌中，在正常组织中仅有限表达于胃黏膜细胞，不表达于其它正常组织，因此可以作为ADC(抗体-药物偶联物)药物开发的理想靶点。
Claudin18.2属于4次跨膜蛋白，包含2个胞外环和1个胞内环，其序列与同家族蛋白Claudin18.1非常相近，仅在第一个胞外环有8个氨基酸差别。Claudin18.1在肺部特异性表达，因此开发仅识别Claudin18.2不识别Claudin18.1的ADC药物具有较高的难度和挑战。
在2016年ASCO大会上公开的数据中，安斯泰来靶向Claudin18.2的人鼠嵌合抗体IMAB362加化疗方案治疗局部晚期或转移性胃癌患者取得令人瞩目的效果，患者的无进展生存期和总生存期延长了近一半。但目前仍没有靶向Claudin18.2的单抗或ADC药物获批上市。因此，开发具有差异性的、更优的靶向性、且表现出优异的体内肿瘤杀伤效应的抗Claudin18.2抗体及ADC药物，可以为胃癌患者提供更广更优的用药选择。
发明概述
在第一方面，本发明提供了具有下式(I)的抗体-药物偶联物(ADC)或其可药用盐或溶剂化物：
Ab-[L-D] q (I)
其中，
Ab表示抗Claudin18.2抗体，
L表示连接体，
D表示细胞毒性或细胞抑制性药物，例如，拓扑异构酶I抑制剂，且
q＝1至20，例如，q＝1-8、2-8、4-8、或6-8，
其中，所述Ab包含SEQ ID NO:1或3的重链可变区(VH)序列的三个CDR和SEQ ID NO:2的轻链可变区(VL)序列的三个CDR，优选地，其中所述CDR根据Kabat或IMGT或其组合进行定义。
在第二方面，本发明提供了包含本发明ADC或其可药用盐或溶剂化物的组合物。
在第三方面，本发明提供了本发明ADC或其可药用盐或溶剂化物及其组合物在治疗Claudin18.2阳性肿瘤中的用途。
在第四方面，本发明提供了抗Claudin18.2抗体、及其药物组合物和用途。
附图说明
图1A-1I显示，通过FACS技术，采用荧光标记的抗体，检测实施例I-1的不同细胞系的Claudin18.2或Claudin18.1表达阳性率。对照为同种型对照抗体。其中：图1A：采用PE荧光标记的抗人Claudin18.2抗体，检测HEK293T-Claudin18.2(人)稳定细胞系；图1B：采用APC荧光标记的抗人Claudin18.1抗体，检测HEK293T-Claudin18.1(人)稳定细胞系。图1C：采用APC荧光标记的抗人Claudin18.2抗体，检测 L929-Claudin18.2(人)稳定细胞系。图1D：采用APC荧光标记的抗人Claudin18.2抗体，检测CHO-Claudin18.2(人)稳定细胞系。图1E：采用PE荧光标记的抗猴Claudin18.2抗体，检测HEK293T-Claudin18.2(食蟹猴)稳定细胞系。图1F：采用APC荧光标记的抗大鼠Claudin18.2抗体，检测HEK293T-Claudin18.2(大鼠)稳定细胞系。图1G：采用APC荧光标记的抗小鼠Claudin18.2抗体，检测HEK293T-Claudin18.2(小鼠)稳定细胞系。图1H：采用APC荧光标记的抗人Claudin18.2抗体，检测NUGC4-Claudin18.2(人)稳定细胞系。图1I：采用APC荧光标记的抗人Claudin18.2抗体，检测NUGC4肿瘤细胞系。
图2A-2B显示，在细胞ELISA测定中，检测抗人Claudin18.2人源化抗体和参照抗体IMAB362与NUGC4-Claudin18.2(人)(图2A)和NUGC4(图2B)的细胞亲和力。
图3A-3C显示，采用流式细胞技术，检测抗人Claudin18.2人源化抗体和参照抗体IMAB362与HEK293T-Claudin18.2(人)(图3A)、NUGC4-Claudin18.2(人)(图3B)和NUGC4(图3C)的细胞亲和力。
图4A-4C显示，采用流式细胞技术，检测抗人Claudin18.2人源化抗体和参照抗体IMAB362与HEK293T-Claudin18.2(食蟹猴)(图4A)、HEK293T-Claudin18.2(大鼠)(图4B)和HEK293T-Claudin18.2(小鼠)(图4C)的细胞亲和力。
图5显示，抗人Claudin18.2人源化抗体对HEK293T-Claudin 18.2(人)细胞的ADCC杀伤活性测定结果。
图6显示，抗人Claudin18.2人源化抗体对HEK293T-Claudin 18.2(人)细胞的CDC杀伤活性测定结果。
图7显示，抗Claudin18.2人源化抗体的大鼠体内药代动力学检测。
图8A-8B显示，抗Claudin18.2人源化抗体ADC在偶联毒素前后与L929-Claudin18.2细胞(图8A)和NUGC4细胞(图8B)的结合。
图9A-9E显示，在体外试验中，抗Claudin18.2人源化抗体ADC药物对HEK293T-Claudin 18.2细胞(图9A和9B)、HEK293T-Claudin 18.1细胞(图9C和9D)和NUGC4-Claudin 18.2细胞(图9E)的杀伤作用。
图10显示，抗Claudin18.2人源化抗体ADC药物在NUGC-4CDX模型中的肿瘤抑制药效。
图11显示，抗Claudin18.2人源化抗体ADC药物对小鼠体重的影响。
发明详述
定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。
当在本文中使用商品名时，除非上下文另有指出，否则该商品名包括商品名产品的产品配方、通用名药物和活性药物成分。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项的组合。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
在本文中，术语“密蛋白18”或“Claudin 18”或“CLDN18”可互换使用，表示紧密连接蛋白Claudin家族的CLDN18成员。CLDN18是跨膜4次的跨膜蛋白，N端和C端均位于细胞质中，具有胞外环1和胞外环 2，靠近N端的第一胞外环(即，胞外环1)平均由大约53个氨基酸组成，第二胞外环(即，胞外环2)由约30个氨基酸组成。CLDN18包括两种剪接变体，CLDN18.1和CLDN18.2，两者在胞外环1中有8个氨基酸差异；在正常组织中CLDN1的表达局限于肺；CLDN2的表达局限于胃粘膜。
在本文中，术语“CLDN18.1”优选涉及人CLDN18.1，例如具有NCBI_057453.1下的氨基酸序列的人CLDN18.1。该术语也涵盖来自其它物种例如食蟹猴、小鼠和大鼠的Claudin18.1，但在不特别指明的情况下，在本文中，该术语指人的CLDN18.1。
在本文中，术语“CLDN18.2”优选涉及人CLDN18.2，例如具有NCBI_001002026.1下的氨基酸序列的人CLDN18.2。该术语也涵盖来自其它物种的Claudin18.2，例如，食蟹猴Claudin18.2(例如，XP_015300615.1下的氨基酸序列)，小鼠Claudin18.2(例如，NP_001181850.1下的氨基酸序列),大鼠Claudin18.2(例如，NP_001014118.1下的氨基酸序列)。在本文中，在不特别指明的情况下，该术语是指人的CLDN18.2。
在本文中，术语“CLDN18”、“CLDN18.1”和“CLDN18.2”也涵盖翻译后修饰变体和构象变体，以及突变体，尤其是天然存在的变体、等位基因变体、物种同源物。
在本文中，术语“CLDN18.2阳性”细胞是指，呈CLDN18.2细胞表面表达阳性的细胞，例如癌细胞、经改造的癌细胞或经改造的非肿瘤细胞。可以通过本领域已知用于确定细胞表面抗原表达水平的任何常规方法，例如，FACS检测方法或免疫荧光染色方法，确定细胞表面的CLDN18.2表达水平；以及任选地与预定参照值比较，确定呈CLDN18.2细胞表面表达阳性的细胞。优选地，在阳性细胞上的CLDN18.2表达水平测定值，比预定参照值高至少2倍。预定参照值可以由本领域技术人员采用常规方式确定。在一个实施方案中，预定参照值可以为在相同测定方法中在非胃粘膜的正常细胞上测定的CLDN18.2表达水平值。在再一实施方案中，预定参照值可以使用如本申请实施例I-1中所描述的FACS方法，通过比较特异性CLDN18.2抗体相对于同种型对照抗体在细胞上产生的荧光染色强度进行确定，例如，预定参照值可以设定为超出该同种型对照抗体的平均荧光染色强度的至少10倍。
在一些实施方案中，优选地，CLDN18.2阳性细胞在表面表达足够高水平的CLDN18.2，由此在例如免疫荧光染色或FACS的检测方法中，可以被CLDN18.2特异性抗体结合，并产生高于预定参照值的检测信号，和/或产生显著区别于除胃粘膜以外的非癌正常细胞的信号(例如，高至少2倍、或优选地高至少10倍或100倍、或更高)。
在本文中，术语“抗体”是指，至少包含轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽，所述免疫球蛋白可变区特异性识别并结合抗原。该术语涵盖各种抗体结构，包括、但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体或多链抗体、单特异性或多特异性抗体(例如双特异性抗体)、嵌合抗体或人源化抗体、全长抗体和抗体片段，只要它们呈现期望的抗原结合活性即可。
在本文中，“全抗体”(在本文中可与“全长抗体”、“完全抗体”和“完整抗体”互换使用)是指，包含至少两条重链(H)和两条轻链(L)的免疫球蛋白分子。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。可变区是抗体的重链或轻链中参与抗体与其抗原结合的结构域。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出多种效应子功能。抗体的轻链可以基于其恒定区的氨基酸序列归入两种类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))中的一种。抗体的重链可以基于其恒定区的氨基酸序列而划分为主要5种不同的类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类型中的几种可以进一步划分成亚类，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。
在本文中，术语抗体的“抗体片段”和“抗原结合片段”可互换使用，是指并非完整抗体的分子，其包含完整抗体中用于结合该完整抗体所结合的抗原的部分。如本领域技术人员理解的，为实现抗原结合目 的，抗体片段通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗体片段。抗体片段的例子包括但不限于，Fab、scFab、二硫键连接的scFab、Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、scFv、二硫键连接的scFv、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、微型抗体(minibody)。在根据本发明的一些实施方案中，抗体片段包含用于在轻链和重链之间形成链间二硫键的半胱氨酸残基部分，例如，IgG1抗体Fab区和/或铰链区的半胱氨酸残基，以提供可用于巯基偶联化学的氨基酸残基位点。在根据本发明的另一些实施方案中，抗体片段包含引入Fc区的半胱氨酸残基，以提供可用于巯基偶联化学的氨基酸残基位点。
在本文中，术语“免疫球蛋白”指具有天然存在抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是由二硫键键合的两条轻链和两条重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体蛋白。从N端至C端，每条免疫球蛋白重链具有一个重链可变区(VH)，也称作重链可变结构域，随后是三个重链恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。从N端至C端，每条免疫球蛋白轻链具有一个轻链可变区(VL)，也称作轻链可变结构域，随后是一个轻链恒定结构域(CL)。相应地，在本文中，提及一个抗体是IgG抗体，是指该抗体是具有IgG类免疫球蛋白结构的异四聚体蛋白。在IgG抗体中，通常重链的VH-CH1与轻链的VL-CL配对形成特异性结合抗原的Fab片段。因此，一个IgG抗体基本上由借助免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和两个二聚化的Fc区组成。IgG免疫球蛋白可以基于重链恒定区的序列，划分成亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、和γ4(IgG4)。IgG免疫球蛋白的轻链也可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ和λ。在一些实施方案中，根据本发明的抗体是IgG抗体，例如IgG1,IgG2,IgG3或IgG4抗体。在另一些实施方案中，根据本发明的抗体是IgGκ或IgGλ抗体，例如，IgG1κ或IgG1λ抗体。
在本文中，术语“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”可互换使用，是指抗体可变结构域中在序列上高度可变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。在本文中，抗体重链和轻链的CDR从N-端开始顺序编号，通常称作CDR1、CDR2和CDR3。位于抗体重链可变结构域内的CDR也称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR则称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，可以采用本领域公知的多种方案确定其CDR序列。例如，可以在http://www.abysis.org/abysis/，获得给定的轻链可变区或重链可变区中CDR的注释，包括基于Kabat、AbM、Chothia、Contact、IMGT定义的CDR序列。此外，CDR也可以基于与参考CDR序列具有相同的Kabat编号位置而确定。除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的编号位置。
在本文中，“可变区”或“可变结构域”是抗体的重链或轻链中参与抗体与其抗原的结合的结构域。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)可以进一步再划分为高变区(HVR，又称作互补决定区(CDR))，其间插有较保守的区域(即，构架区(FR))。每个VH和VL由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。在一些方面，可以对两个可变区之一或两者(即VH和/或VL)中的一个或多个残基进行修饰，例如，对一个或多个CDR区和/或对一个或多个构架区进行残基修改，尤其是保守残基取代，以获得仍基本上保持改变之前的抗体分子的至少一个生物学特性(例如，抗原结合能力)的抗体变体。在再一些方面，可以通过CDR移植，修饰抗体可变区。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，故可以构建模拟已知抗体的性质的重组抗体变体。在该抗体变体中，来自已知抗体的CDR序列被移植到具有不同性质的不同抗体的构架区上。可以在体外或体内测定试验中评估突变和/修饰后的抗体或包含其的ADC偶联物的性质，例如靶抗原结合性质或其它期望的功能性质，例如 ADC的内吞、药代动力学、和体内肿瘤杀伤活性。
术语“嵌合抗体”是指可变区序列源自一物种、恒定区序列源自另一物种的抗体，例如，其中可变区序列源自小鼠抗体、恒定区序列源自人抗体的抗体。
在本文中，术语“人源化抗体”是指将源自其他哺乳动物物种例如小鼠种系的CDR序列接到人构架序列上的抗体。可以在人构架序列内进行额外的构架区修饰，和/或在CDR序列中进行额外的氨基酸修饰，例如以进行抗体的亲和力成熟。在本文中，在一些实施方案中，本发明抗体为人源化抗体，具有“来源于”特定的人种系序列的构架区序列。在此，“来源于”是指，所述抗体构架区的氨基酸序列与由所述人种系免疫球蛋白基因编码的相应构架区氨基酸序列具有至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少96％、97％、98％或99％同一性，并且所述抗体保持抗原结合活性，例如，与25C7A5-HZ1或-HZ2，或与2D3A11-HZ1或-HZ2具有等同(例如，±10％)的CLDN18结合亲和力。
在本文中，术语“分离的”抗体是已经与它的天然环境中的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，所述纯度可以通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)确定。
术语“表位”是指抗体所结合的抗原区域。表位可以由连续的氨基酸形成或者通过蛋白的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。在本发明中，优选地，根据本发明的抗体结合人Claudin18.2的天然表位，更优选地，结合细胞表面表达的人Claudin18.2的天然表位。因此，在优选的实施方案中，采用基于细胞的试验，检测本发明抗体与人Claudin18.2的天然表位的结合。
在本文中，术语“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的固有结合亲和力。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。用于测量亲和力的一个具体方法是本文中实施例描述的细胞ELISA测定法，另一具体方法是本文中实施例描述的FACS测定法。在一个实施方案中，在基于细胞的测定中，例如按照实施例I所述进行测定时，如果抗体与参照抗体IMAB362具有相当(即，±10％)或更小的EC50值和/或相当(即，±10％)或更高的最大结合信号值时，则抗体被认为对Claudin18.2具有高亲和力。
术语“特异性结合”表示，相对于非目标抗原，抗体选择性地或优先地结合目标抗原。在本文中，如果在抗原结合测定试验中，例如，在诸如实施例中所述的FACS测定法或细胞ELISA法中测定时，抗体与细胞表面表达的人Claudin18.2结合(特别是以高亲和力结合)，但不与细胞表面表达的人Claudin18.1结合或基本不与之结合，则应认为该抗体是“与人Claudin18.2特异性结合”的抗体。可以在细胞ELISA或FACS中测定抗体对细胞表面表达的人Claudin18.2或人Claudin18.1的结合，以确定抗体对Claudin18.2的结合特异性。
在本文中，当在基于细胞的测定中抗体对人Claudin18.1不具有显著亲和力并且不与人Claudin18.1显著地结合，特别是不产生显著区别于背景的可检查信号时，抗体被称作不结合或基本上不结合人Claudin18.1(在本文中，这也称作对人Claudin18.1“无非特异性结合”)。优选地，在本发明中，根据本发明的抗体对Claudin8.1表达细胞的非特异性结合，采用Claudin18.1表达阳性率大于95％或大于98％的重组细胞系(如重组HEK293T稳定细胞系)，通过FACS测定法测定，例如按照实施例I所述进行测定。根据具体选择的测定方法，本领域技术人员可以选择适宜的阴性和/或阳性对照。例如，可以使用同种型对照，用于消除由于抗体非特异性地与细胞结合而产生的背景染色。
然而，如本领域技术人员理解，特异性结合人Claudin18.2且对人Claudin18.1无非特异性结合的抗体，可以与来自其它物种的Claudin18.2蛋白具有交叉反应性。在本文中，术语“交叉反应”是指抗体结合来自不同物种的Claudin18.2的能力。例如，在一些实施方案中，特异于人Claudin18.2的根据本发明的抗体，还可结合来自其它物种的Claudin18.2(例如，食蟹猴、小鼠和/或大鼠Claudin18.2)。测定交叉反应性的方 法包括实施例中所述的方法以及本领域已知的标准测定法，例如通过使用流式细胞术技术或细胞ELISA技术。抗体的物种交叉反应性在一些情况下是有利的。例如，当目标抗体对临床前实验动物，例如小鼠、大鼠或灵长类动物具有物种交叉反应性时，将促进目标抗体及其ADC偶联物在人体治疗或诊断应用之前的临床前安全性和功效评价。
在本文中，术语“同种型”是指由抗体重链恒定区确定的抗体类型。例如，根据本发明的抗体可以是IgA(例如IgA1或IgA2)、IgG1、IgG2(例如IgG2a或IgG2b)、IgG3、IgG4、IgE、IgM和IgD抗体，并具有所述免疫球蛋白类型的重链恒定区。例如本发明的抗体可以是具有人IgG1恒定区的IgG1抗体。此外，本发明不仅考虑采用天然序列恒定区的抗体，也考虑包含变体序列恒定区的抗体。
本文中的术语“Fc区”用于定义含有至少一部分的恒定区的免疫球蛋白重链的C-端区域。该术语包括天然序列Fc-区和变体Fc-区。
在本文中，术语“天然序列Fc区”涵盖天然存在的各种免疫球蛋白Fc区序列，例如各种Ig亚型以及其同种异型的Fc区序列(Gestur Vidarsson等,IgG subclasses and allotypes:from structure to effector functions,20 October 2014,doi:10.3389/fimmu.2014.00520.)。在一些实施方案中，人IgG重链Fc区具有自Cys226或自Pro230延伸至重链羧基端的氨基酸序列。然而，Fc区的C端末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。在再一些实施方案中，人IgG重链Fc区在N端带有天然免疫球蛋白的铰链序列或部分铰链序列，例如根据EU编号，E216到T225的序列或D221到T225的序列。
在本文中，术语“变体序列Fc区”是指，相对于天然序列Fc区多肽包含修饰的Fc区多肽。所述的修饰可以是氨基酸残基的添加，缺失或取代。取代可以包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。修饰的目的可以是旨在改变由Fc区与其受体的结合及其由此引发的效应子功能。
在本文中，术语“效应子功能”指随免疫球蛋白同种型变动的归因于免疫球蛋白Fc区的那些生物学活性。免疫球蛋白效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。根据抗体分子的预期用途，可以相对于具有野生型Fc区的抗体分子，改变目标抗体的效应子功能，例如降低或消除的ADCC活性或CDC活性等。
在本文中，术语“ADCC”是指抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。ADCC在人体中主要由自然杀伤细胞(NK细胞)介导。在ADCC中，抗体与靶细胞表面上展示的抗原结合，NK细胞表面的FcγRIIIA识别抗体的Fc区，从而NK细胞被激活，释放穿孔素和颗粒溶解酶，导致靶细胞的裂解和凋亡。抗体的ADCC活性可以采用诸如实施例I中所述的荧光素报告系统进行评价。在一些情况，当抗体的ADCC效应子活性不被期望时，通过修饰抗体的Fc区，可以去除抗体的ADCC活性。
在本文中，术语“CDC”是指补体依赖性细胞毒性。在CDC中，抗体的Fc区与补体分子C1q结合，继而形成膜攻击复合物，导致靶细胞的清除。IgM是补体激活最有效的同种型。IgG1和IgG3二者在通过经典补体激活途径指导CDC方面也非常有效。抗体的CDC活性可以采用诸如实施例I所述的豚鼠血清杀伤实验进行检测。在一些情况，当抗体的CDC效应子活性不被期望时，通过修饰抗体的Fc区，可以去除抗体的CDC活性。
在本文中，术语“受体介导的内吞”是指，由配体与细胞表面上的相应受体结合所触发的、配体/受体复合物被内化并递送到细胞溶质中或转移至合适的细胞内区室的过程。可以通过例如实施例I中所述的方法测定内吞率，表征抗体所具有的受体介导的内吞活性。如实施例所示，本发明的抗体在与细胞表面表达的Claudin18.2结合后可以引发由Claudin18.2受体介导的内吞，并且具有该内吞性质的本发明抗体在与 药物(例如小分子毒性药物分子)偶联形成ADC后，可以有效地用作运载抗肿瘤药物进入癌细胞中的工具。
在本文中，“序列同一性”是指在比较窗中以逐个核苷酸或逐个氨基酸为基础的序列相同的程度。可以通过以下方式计算“序列同一性百分比”：将两条最佳比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同一性百分比。为了确定序列同一性百分数而进行的最佳比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。
在本发明中，就抗体序列而言，氨基酸序列同一性百分数通过将候选抗体序列与给定抗体序列最佳比对后，在一个优选方案中按照Kabat编号规则进行最佳比对后，予以确定。在本文中，在不指定比较窗(即待比较的目标抗体区域)的情况下，将适用于在给定抗体序列的全长上进行比对。在一些实施方案中，就抗体而言，序列同一性可以分布在整个重链可变区和/或整个轻链可变区上，或序列百分数同一性可以仅限定于构架区，而对应CDR区的序列保持100％相同。
在本文中，“参照抗体IMAB362”是指，采用来自于专利CN 101312989 B中公布的175D10单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列构建的抗Claudin18.2抗体。在涉及与参照抗体IMAB362比较的上下文中，所述参照抗体IMAB362将与待比较的抗体在可变区之外的部分具有相同的抗体结构，例如在两者均具有重链和轻链恒定区结构时，具有相同的重链和轻链恒定区序列。
在本申请中，术语“卤素”通常是指氟、氯、溴、碘，例如可以是氟、氯。
本文所用的术语“烷基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的饱和烃基团。具体地，烷基具有1-10个碳原子，例如1至8个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个或1至2个碳原子。例如，如本文中所使用，术语“C 1-C 6烷基”指具有1至6个碳原子的直链或支链的饱和烃基团，其实例例如甲基、乙基、丙基(包括正丙基和异丙基)、丁基(包括正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基)、戊基(包括正戊基、异戊基、新戊基)、己基(包括正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基)，等。
本文所用的术语“烯基”是指由碳原子和氢原子组成的包含至少一个双键的直链或支链的不饱和烃基团。具体地，烯基具有2-8个，例如2至6个、2至5个、2至4个或2至3个碳原子。例如，如本文中所使用，术语“C 2-C 6烯基”指具有2至6个碳原子的直链或支链的烯基，例如乙烯基、丙烯基、烯丙基、1-丁烯基、2-丁烯基、1,3-丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,4-己二烯基等。
本文所用的术语“炔基”是指由碳原子和氢原子组成的包含至少一个叁键的直链或支链的不饱和烃基团。具体地，炔基具有2-8个，例如2至6个、2至5个、2至4个或2至3个碳原子。例如，如本文中所使用，术语“C 2-C 6炔基”指具有2至6个碳原子的直链或支链的炔基，例如乙炔基、丙炔基、炔丙基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-甲基-1-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、5-甲基-2-己炔基、等。
本文所用的术语“亚烷基”是指，从直链或支链的饱和烷烃的相同或两个不同碳原子上移去两个氢原子得到的二价基团。具体地，亚烷基具有1-10个碳原子，例如1至6个、1至5个、1至4个、1至3个或1至2个碳原子。例如，如本文中所使用，术语“C 1-C 6亚烷基”指具有1至6个碳原子的直链或支链的亚烷 基，包括，但不限于，亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基，等。
本文所用的术语“亚烯基”是指，从包含至少一个双键的直链或支链的不饱和烯烃的相同或两个不同碳原子上移去两个氢原子得到的二价基团。具体地，亚烯基具有2-8个，例如2至6个、2至5个、2至4个或2至3个碳原子。例如，如本文中所使用，术语“C 2-C 6亚烯基”指具有2至6个碳原子的直链或支链的亚烯基，例如亚乙烯基、亚丙烯基、亚烯丙基、亚丁烯基、亚戊烯基、和亚己烯基。
本文所用的术语“亚炔基”是指，从包含至少一个叁键的直链或支链的不饱和炔烃的相同或两个不同碳原子上移去两个氢原子得到的二价基团。具体地，亚炔基具有2-8个，例如2至6个、2至5个、2至4个或2至3个碳原子。例如，如本文中所使用，术语“C 2-C 6亚炔基”指具有2至6个碳原子的直链或支链的亚炔基，例如亚乙炔基、亚丙炔基、亚炔丙基、亚丁炔基、亚戊炔基和亚己炔基。
本文所用的术语“环烷基”是指具有指定环原子数的单环、稠合多环、桥接多环或螺环非芳族单价烃环结构，其可以是饱和或不饱和的，例如包含1个或多个双键。环烷基基团在环中可包含3个或更多个例如3-18、3-10、或3-8个碳原子，例如C 3-10环烷基、C 3-8环烷基、C 3-6环烷基、C 5-6环烷基。环烷基基团的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基。
本文所用的术语“杂环”或“杂环基”是指，具有1-4个独立地选自N、O或S的杂原子环成员的5-20元(例如5-14元、5-8元、5-6元)的芳族或非芳族单环、二环、或多环环系。杂环中的一个或多个N、C或S原子可被氧化。优选地，杂环是5-10元环系，为单环或稠合双环。代表性实例包括但不限于吡咯烷、氮杂环丁烷、哌啶、吗啉、四氢呋喃、四氢吡喃、苯并呋喃、苯并噻吩、吲哚、苯并吡唑、吡咯、噻吩(噻吩)、呋喃、噻唑、咪唑、吡唑、嘧啶、吡啶、吡嗪、哒嗪、异噻唑和异噁唑。应该理解，该术语包含本文所定义的杂芳基。
术语"芳基"指在环部分具有6-20例如6-12个碳原子的单环或多环芳香烃基团。优选地，芳基是(C 6-C 10)芳基。非限制性示例包括苯基、联苯基、萘基或四氢萘基，它们各自可以任选被1-4个取代基取代，所述取代基例如烷基、三氟甲基、环烷基、卤素、羟基、烷氧基、酰基、烷基-C(O)-O-、芳基-O-、杂芳基-O-、氨基、巯基、烷基-S-、芳基-S-、硝基、氰基、羧基、烷基-O-C(O)-、氨基甲酰基、烷基-S(O)-、磺酰基、磺酰氨基、杂环基等。
术语"杂芳基"指含有选自N、O或S的1-4个杂原子的5-20元(例如5-14元、5-8元、5-6元)的芳族单环状或多环状环系，其可以是取代的或未取代的。优选地，杂芳基是5-10元环系，为单环或稠合双环。代表性的杂芳基基团包括2-或3-噻吩基、2-或3-呋喃基、2-或3-吡咯基、2-、4-或5-咪唑基、3-、4-或5-吡唑基、2-、4-或5-噻唑基、3-、4-或5-异噻唑基、2-、4-或5-噁唑基、3-、4-或5-异噁唑基、3-或5-1,2,4-三唑基、4-或5-1,2,3-三唑基、四唑基、2-、3-或4-吡啶基、3-或4-哒嗪基、3-、4-或5-吡嗪基、2-吡嗪基、2-、4-或5-嘧啶基。
术语“杂烷基”是指完全饱和或含1至3个不饱和度、由所示数量的碳原子和一至十个、优选一至三个选自O、N、Si和S的杂原子组成的稳定的直链或支链烃，其中的氮和硫原子可任选被氧化并且氮杂原子可任选被季铵化。杂原子O、N、Si和S可位于杂烷基基团的任何内部位置处或位于杂烷基基团与分子的其余部分连接的位置处。杂烷基的代表性实例包括–CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-O-CH3和–CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的，如例如-CH2-NH-OCH3和–CH2-O-Si(CH3)3。通常，C1至C4杂烷基或亚杂烷基具有1至4个碳原子和1或2个杂原子，C1至C3杂烷基或亚杂烷基具有1至3个碳原子和1或2个杂原子。在一些方面，杂烷基和亚杂烷基是饱和的。
除非另外指出，否则本文定义各个基团时所使用的术语“被取代的”，是指相应基团可以被例如但不限于以下的基团取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、卤素、氰基、硝基、叠氮基、羧基、羟基、巯基、氨基、单或二烷基氨基、单或二环烷基氨基、单或二芳基氨基、单或二杂环基氨基、单或二杂芳基氨基、烷基-或环烷基-或杂环基-或杂芳基-或芳基-氧基、烷基-或环烷基-或杂环基-或杂芳基-或芳基-硫基、烷基-或环烷基-或杂环基-或杂芳基-或芳基-酰基、烷基-或环烷基-或杂环基-或杂芳基-或芳基-酰氨基、烷基-或环烷基-或杂环基-或杂芳基-或芳基-酰氧基、烷基-或环烷基-或杂环基-或杂芳基-或芳基-磺酰基、烷基-或环烷基-或杂环基-或杂芳基-或芳基-磺酰氧基、烷基-或环烷基-或杂环基-或杂芳基-或芳基-磺酰氨基、或上述任选取代的氨基-甲酰基，以及其各自被其余可选取代基进一步取代的基团，其中的各类基团如本文所定义。取代基的实例包括但不限于一个或多个独立地选自以下的基团：卤素、OH、SH、CN、NH 2、NHCH 3、N(CH 3) 2、NO 2、N 3、C(O)CH 3、COOH、C(O)-氨基、OCOCH 3、甲基、乙基、丙基、异-丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、氧代基、三氟甲基、二氟甲基、磺酰基氨基、甲磺酰基氨基、SO、SO 2、苯基、哌啶基、哌嗪基和嘧啶基。
本文所用的术语“取代”或“取代的”是指所指定的原子上的一个或多个(例如1、2、3或4个)氢被所指定的基团代替，条件是未超出所指定原子在当前情况下的正常价键并且形成稳定的化合物，取代基和变量的组合仅当这种组合形成稳定的化合物时才是允许的。
在本文中，术语“连接体”是指在药物-抗体偶联物中将药物与抗体相连的双官能部分。本发明的连接体可以具有多个组分(例如，在一些实施方式中具有负责与抗体偶联的连接基；可降解的肽单元；以及任选地间隔基)。
在本文中，术语“PEG单元”是指包含重复的乙烯氧基亚单元(PEG或PEG亚单元)的有机部分，其可以是多分散的、单分散的或离散的(即，具有离散数目的乙烯-氧基亚单元)。多分散PEG为大小和分子量的非均匀混合物，而单分散PEG通常是从非均匀混合物纯化的并因此具有单一的链长和分子量。优选的PEG单元包含离散的PEG，其是以逐步的方式而非经由聚合过程合成的化合物。离散的PEG提供具有限定和指定链长的单一分子。
术语“药学上可接受的盐”表示，能保持本发明的ADC偶联物的生物学效应和性能的盐，并且该盐在生物学上或其它方面不是不被期望的。本发明的ADC偶联物可以以它们的药学上可接受的盐形式存在，包括酸加成盐和碱加成盐。在本发明中，药学上可接受的无毒的酸加成盐表示本发明中的ADC偶联物与有机或无机酸形成的盐，有机或无机酸包括但不限于盐酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸、硝酸、高氯酸、乙酸、草酸、马来酸、富马酸、酒石酸、苯磺酸、甲磺酸、水杨酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸、丙酸、苯甲酸、对甲苯磺酸、苹果酸等。药学上可接受的无毒的碱加成盐表示本发明中的ADC偶联物与有机或无机碱所形成的盐，包括但不限于碱金属盐，例如锂、钠或钾盐；碱土金属盐，例如钙或镁盐；有机碱盐，例如通过与含N基团的有机碱形成的铵盐。
术语“溶剂化物”表示一个或多个溶剂分子与本发明中的ADC偶联物所形成的缔合物。形成溶剂化物的溶剂包括但不限于水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜等。
在根据上下文无矛盾的情况下，本文中“药学上可接受的”和“药用”可互换使用。
术语“药物:抗体比”或“DAR”是指，在ADC偶联物中，偶联于本文所述的Ab部分上的药物部分(D)与Ab部分的比例。在本文所述的一些实施方案中，DAR可由式I中的q确定，例如DAR可以为1至20，例如2-18、4-16、5-12、6-10、2-8、3-8、2-6、4-6、6-10，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。DAR也可被计算为产品中分子群体的平均DAR，即通过检测方法(例如通过常规方法如质谱法、ELISA测定、电泳和/或HPLC)测得的产品中偶联于本文所述的Ab部分的小分子药物部分(D)与Ab 部分的总体比例，此DAR在文中称为平均DAR。在一些实施方案中，本发明偶联物的平均DAR值是1至20，例如2-18、4-16、5-12、6-10、2-8、3-8、2-6、4-6、6-10，例如1.0-8.0，2.0-6.0，例如1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0，以这些数值中的两个作为端点的范围。
本文所述的术语“药物”涵盖在预防或治疗肿瘤，例如癌症中有效的任何物质，包括化疗剂、细胞因子、血管生成抑制剂、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫抑制剂)。
术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂的实例包含但不限于喜树碱类药物、奥瑞他汀、金霉素、美登木素生物碱、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、卡贝塔汀(combrestatin)、倍癌霉素、海兔毒素、多柔比星、道诺霉素、他克唑、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、二羟基蒽二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素(sarcin)、白树毒素、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、伊诺霉素、麻疯树毒素(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonariaofficinalis)抑制剂和糖皮质激素和其它化学治疗剂，以及放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212或213、P32，以及Lu的放射性同位素，包含Lu177。
术语“小分子药物”是指低分子量的能够调节生物过程的有机化合物。“小分子”被定义为分子量小于10kD、通常小于2kD和优选小于1kD的分子。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含无机组分的有机分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模拟物和抗体模拟物。作为治疗剂，小分子可以比大分子更能透过细胞、对降解更不易感和更不易于引发免疫应答。
术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
术语“药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂、载体或稳定剂等。
术语“药物组合”或“组合产品”是指非固定组合产品或固定组合产品，包括但不限于药盒、药物组合物。术语“非固定组合”意指活性成分(例如，(i)本发明的ADC分子或本发明的抗体、以及(ii)其他治疗剂)以分开的实体被同时、无特定时间限制或以相同或不同的时间间隔、依次地施用于患者，其中这类施用在患者体内提供预防或治疗有效水平的两种或更多种活性剂。在一些实施方案中，药物组合中使用的本发明的ADC分子或本发明抗体和其他治疗剂以不超过它们单独使用时的水平施用。术语“固定组合”意指两种或更多种活性剂以单个实体的形式被同时施用于患者。优选对两种或更多种活性剂的剂量和/或时间间隔进行选择，从而使各部分的联合使用能够在治疗疾病或病症时产生大于单独使用任何一种成分所能达到的效果。各成分可以各自呈单独的制剂形式，其制剂形式可以相同也可以不同。
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂或治疗方式(例如放射疗法或手术)以治疗本文所述疾病。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，例如以具有固定比例的活性成分的单一胶囊。或者，这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如片剂、胶囊、粉末和液体)中的共同施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。此外，这种施用还包括以大致相同的时间或在不同的时间以顺序的方式使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将提供药物组合在治疗 本文所述的病症或病状中的有益作用。
在本文中，术语“个体”或“受试者”可互换地使用，是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，受试者是人。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，是指哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。在某些实施方案中，适合于通过本发明的抗体来治疗的癌症包括胃癌、胰腺癌或胃食管交界癌，包括那些癌症的转移性形式。该术语也涵盖所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性的细胞和组织。
术语“抗肿瘤作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。
用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。
用于本文时，“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。
用于本文时，术语“有效量”指本发明的抗体药物偶联物或其组合物或组合的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。
用于本文时，术语“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量也是这样的一个量，其中本发明的抗体药物偶联物或其组合物或组合的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的个体，“治疗有效量”优选地对可度量参数(例如肿瘤体积)实现至少约30％、甚至更优选地至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％甚至100％的抑制。
用于本文时，术语“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。
在本发明中，术语“CLDN18.2阳性”肿瘤是指，肿瘤器官或组织中至少一部分的癌细胞呈CLDN18.2细胞表面表达阳性。在一些实施方案中，CLDN18.2阳性癌细胞在癌组织或癌细胞群中的占比为至少10％或20％，优选地至少30％、40％、50％、60％、70％、75％或80％。在再一些实施方案中，肿瘤组织或器官中至少40％或至少50％，优选60％、70％、80％或90％的癌细胞呈CLDN18.2表面表达阳性。在一些实施方案中，相比于健康受试者的相应组织和器官，根据本发明方法治疗的癌症受试者在病变组织或器官中具有提高的CLDN18.2细胞表面表达水平，例如，提高至少10％，特别地至少20％、至少50％、至少100％、至少200％或更多。在一个实施方案中，CLDN18.2阳性肿瘤选自：胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌，及其转移，特别是胃癌转移。在一个实施方案中，癌症是腺癌，特别是晚期腺癌。特别优选的癌症疾病是胃、食管、胰管、胆管、肺和卵巢的腺癌。在一些实施方案中，根据本发明治疗的癌症为HER阴性。在再一实施方案中，CLDN18.2阳性肿瘤是消化系统癌症或其癌转移。在一个实施方案中，癌症选自胃癌、食管癌(特别是下食管癌)、食管-胃接合部的癌症和胃食管癌。在一个优选实施方案中，癌症是例如CLAUDIN 18.2阳性且HER2阴性胃癌。在另一个优选的实施方案中，癌症是胃食管癌，例如转移性、顽固性或复发性晚期胃食管癌，在再一实施方案中，癌症是转移性胃癌或胃食管交界处癌(EGJA)。
本发明的各方面将在下面各下节中进一步详述。
本发明ADC部分
I.抗体-药物偶联物
在一个方面，本发明提供了具有下式(I)的抗体-药物偶联物(ADC)或其可药用盐或溶剂化物：
Ab-[L-D] q (I)
其中，
Ab表示抗Claudin18.2抗体，
L表示连接体，
D表示细胞毒性或细胞抑制性药物，例如，拓扑异构酶I抑制剂，且
q表示1至20的整数或小数，例如，q＝1-10、1-8、2-8、4-8、或6-8。
以下就本发明ADC偶联物的组件及由其组成的本发明ADC偶联物分别进行详述描述。本领域技术人员可以理解，除非上下文有明确相反指示，这些组件的任何技术特征的任何组合均在本发明考虑范畴之中。并且，本领域技术人员可以理解，除非上下文有明确相反指示，本发明的ADC偶联物可以包含任何这样的组合特征。
抗体Ab单元
本发明人通过深入研究，开发并提供了具有优良性质的人源化抗Claudin18.2单克隆抗体。如实施例所示，本发明的抗体不仅对表面表达人Claudin18.2的细胞(尤其是表面表达丰度低的细胞)展示出高结合亲和力和高特异性，也具有诸如由Claudin18.2抗原介导的内吞活性、稳定性和/或药代动力学性质等有利性质，因此适宜作为分子组件与细胞毒性药物偶联形成抗体-药物偶联物。如实施例所示，由本发明抗体形成的ADC偶联物展示出了有力的体内肿瘤杀伤效应，且同时具有良好的药物耐受性。
因此，在一些方面，本发明提供了抗体-药物偶联物(ADC)，其包含特异性结合Claudin18.2的本发明抗体作为本发明式I偶联物的Ab单元。
在一些实施方案中，本发明式(I)中的Ab包含SEQ ID NO:1或3的重链可变区(VH)序列的三个CDR和SEQ ID NO:2的轻链可变区(VL)序列的三个CDR，且优选地，其中所述CDR根据Kabat或IMGT或其组合进行定义。
在一些实施方案中，本发明式(I)中的Ab包含3个重链互补决定区(HCDR)以及3个轻链互补决定区(LCDR)，其中：
(i)根据IMGT定义，HCDR1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成，HCDR2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由其组成，HCDR3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由其组成，LCDR1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成，且LCDR3包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由其组成；或者
(ii)根据Kabat定义，HCDR1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由其组成，HCDR2包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列或由其组成，HCDR3包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由其组成，LCDR1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由其组成，且LCDR3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，本发明式(I)中的Ab包含本发明示例性抗体25C7A5-HZ1和-HZ2之任一的重链和轻链可变区序列或其变体，例如，具有与所述示例性抗体之一相同的CDR序列，并具有相同或不同 的构架区序列的抗体。
在一个实施方案中，本发明式(I)中的Ab包含重链可变区，其中：所述重链可变区包含：
-SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或者
-SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明式(I)中的Ab包含轻链可变区，其中：所述轻链可变区包含：
-SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些优选的实施方案中，本发明式(I)中的Ab包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:1或3所述的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，且其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗体序列是人源化的。更优选地，所述抗体的重链可变区具有来源于人种系的构架区序列，且优选地在重链可变区中在根据Kabat编号的位置H6具有氨基酸Q或E，优选具有氨基酸Q。
在再一些优选的实施方案中，本发明式(I)中的Ab包含SEQ ID No:1的重链可变区和SEQ ID No:2的轻链可变区。
在再一些优选的实施方案中，本发明式(I)中的Ab包含SEQ ID No:3的重链可变区和SEQ ID No:2的轻链可变区。
在一些实施方案中，本发明式(I)中的Ab优选还包含抗体的重链恒定区和/或轻链恒定区。优选地，所述重链恒定区为来源于人免疫球蛋白的重链恒定区。优选地，所述轻链恒定区为来源于人免疫球蛋白的轻链恒定区。在一些方面，包含在Ab中的重链恒定区可以为任何同种型或亚型，例如IgG1,IgG2，IgG3或IgG4同种型的重链恒定区，且优选IgG1,IgG2或IgG4重链恒定区，尤其是人IgG1重链恒定区。在再一些方面，包含在Ab中的轻链恒定区可以为κ轻链恒定区或λ轻链恒定区，尤其是人κ轻链恒定区。
在一些实施方案中，本发明式(I)中的Ab包含人IgG1重链恒定区。优选地，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:4氨基酸序列包含至少一个，两个或三个，但不超过20个，10个或5个氨基酸改变的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少95-99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明式(I)中的Ab包含人κ轻链恒定区。优选地，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:5的氨基酸序列包含至少一个，两个或三个，但不超过20个，10个或5个氨基酸改变的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少95-99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明式(I)中的Ab是包含重链恒定区和轻链恒定区的全长抗体。在一些实施方案中，本发明式(I)中的Ab具有由两条轻链和两条重链形成的四聚体结构。在再一些实施方案中，本发明式(I)中的Ab是IgG抗体，尤其是IgG1抗体。在进一步的实施方案中，本发明式(I)中的Ab是人源化抗体。
在一些优选的实施方案中，本发明式(I)中的Ab包含重链和轻链，其中：所述重链包含SEQ ID NO:18或19所示的氨基酸序列、或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。在另一些优选实施方案中，本发明式(I)中的Ab包含重链和轻链， 其中：所述轻链包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列、或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些更优选的实施方案中，本发明式(I)中的Ab包含选自以下的重链和轻链：
(a)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链；和
(b)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链。
本发明也考虑上述任何抗体的变体。本发明抗体变体优选保持改变前抗体的至少60％,70％,80％,90％,或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。更优选地，所述改变不导致抗体变体丧失对抗原的结合，但任选地赋予诸如提高的抗原亲和力和不同的效应子功能等性质。可以理解的，抗体的重链可变区或轻链可变区、或各CDR区可以单独改变或组合改变。此外，也可以对抗体的Fc区进行改变。Fc区的改变可以单独进行，或与上述对构架和/或CDR区的改变相组合。可以改变Fc区，例如，以改变抗体的一种或多种功能，例如血清半衰期，补体固定、Fc受体结合、和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，还可以对本发明抗体进行化学修饰(例如，与PEG连接)或改变其糖基化模式。
为形成ADC偶联物，根据本发明的抗体可以利用其上的一些天然连接位点与毒素-连接体偶联。这样的天然连接位点有半胱氨酸的巯基和赖氨酸的氨基。通常，应用抗体的重链和轻链之间的二硫桥可以实现较为确定的药物-抗体比(DAR)。因此，在一个实施方案中，在还原抗体的链间二硫键后，通过巯基化学，将毒素偶联到本发明抗体上，形成式(I)的ADC偶联物。此外，也可以考虑在抗体中引入人工连接位点，实现更为定点的偶联。
药物D单元
抗体-药物偶联物的药物D单元在本文中也称作ADC药物的有效载荷(payload)。可用于本发明ADC中的药物D并无特别限制，可以为任何对细胞具有毒性或抑制性的药物或其前药。本领域技术人员可以根据所需的ADC药物起效机制和细胞杀伤效果，选择合适的药物分子作为ADC的有效载荷。
在一些实施方案中，药物D是细胞毒性剂。在本领域中，已经报道了多种不同机制的适用作有效载荷的细胞毒性剂，包括，但不限于，
(1)微管抑制/破坏剂：例如，但不限于，auristatin类(例如，MMAE或MMAF)，美登素衍生物(例如DM2，DM4)，微管溶素(Tubulysins)，隐粘菌素(Cryptomycins)，抗有丝分裂EG5抑制剂(例如，纺锤体驱动蛋白KSP抑制剂)；
(2)DNA损伤剂：例如，但不限于，吡咯并苯并二氮杂卓类(Pyrrolobenzodiazepines)(例如，吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂卓(PBD))，杜卡霉素,Indolinobenzodiazepine；Duocarmycins；Calicheamicin类；
(3)拓扑异构酶抑制剂：例如，但不限于，喜树碱类(例如，依喜替康及其衍生物Dxd)；
(4)其他：凋亡诱导剂(Bcl-xL抑制剂)，thailanstatin及其类似物，鹅膏毒素，烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)抑制剂，卡马霉素。
本发明式(I)中的药物D可以是选自上述的任何化合物。在一些实施方案中，药物D为选自美登素衍生物、卡里奇霉素衍生物、奥瑞他汀衍生物的抗肿瘤生长抑制剂。在一个实施方案中，药物D为微管蛋白抑制剂/稳定性破坏剂，例如长春花生物碱类、长春新碱、紫杉醇和多西他赛。在一个实施方案中，药物D为DNA合成抑制剂，例如，甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他滨、巯基嘌呤、喷司他丁、氟达拉滨、克拉屈滨。在一个实施方案中，药物D为DNA拓扑异构酶抑制剂，例如，拓扑异构酶I抑制剂(例如，喜树碱类)和拓扑异构酶II抑制剂(例如，放线菌素D、阿霉素、米托蒽醌)。
在一些优选的实施方案中，根据本发明的ADC的药物D为拓扑异构酶I抑制剂。拓扑异构酶I抑制剂的一个典型例子是喜树碱类药物，例如，但不限于,喜树碱(CPT)、羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、 exatecan,topotecan,belotecan,irinotecan，SN-38，和FL118，及其衍生物。参见例如Vesela Kostova等,The Chemistry Behind ADCs，Pharmaceuticals 2021,14,442. https://doi.org/10.3390/ph14050442；和WO2019/195665，所述文献在此并入本文作为参考。
在本发明的一些实施方案中，本发明ADC的药物D为选自以下的喜树碱类药物：
-喜树碱及其衍生物，例如，
其中R A选自例如：氢、任选被取代的烷基，其中取代基包括但不限于羟基、氨基，其中氨基部分或羟基部分可以是取代或未取代的，例如被烷基、烷基酰基、或烷基磺酰基取代；在一个实施方案中，所述药物D为
-10,11-methylenedioxy CPT(也简称为MDCPT或FL118)及其衍生物，例如，
其中R B选自例如：氢、环烷基、苯基、任选被取代的烷基，其中取代基包括但不限于卤素、羟基、任选被取代的烷氧基、环烷基、杂环烷基、苯基、氨基，其中氨基部分可以任选被取代；在一个实施方案中，所述药物D为
-10-hydroxy CPT(也简称为HCPT)及其衍生物，例如，
其中，R C选自例如任选被取代的烷基和环烷基；R’ C选自例如H、烷酰基或任选取代的杂环烷基酰基；在一个实施方案中，所述药物D为7-乙基-10-羟基CPT(SN-38)或其前药伊立替康(irinotecan,CPT-11)，或所述药物D为拓扑替康
-Exatecan及其衍生物，例如，
其中，R D选自例如H、任选被取代的烷基、任选被取代的烷基-C(＝O)-，所述取代基为例如-OH或取代或未取代的氨基；在一个实施方案中，所述药物D为:
Exatecan、Dxd(1)或Dxd(2)；在另一个实施方案中，所述药物D为：
F118((20S)-10,11-methylenedioxy喜树碱)通过高通量筛选化合物文库获得。与其他喜树碱衍生物相比，FL118已经在许多不同的癌症类型中被证实具有高得多的体内和体外抗癌活性。除抑制拓扑异构酶I外，FL118也可以选择性抑制抗凋亡蛋白，例如survivin,XIAP,cIAP2和Mcl-1的基因启动子活性和内源性表达。参见Xiang Ling等,A Novel Small Molecule FL118 That Selectively Inhibits Survivin,Mcl-1,XIAP and cIAP2 in a p53-Independent Manner,Shows Superior Antitumor Activity,PLoS ONE 7(9):e45571.doi:10.1371/journal.pone.0045571。尽管FL118的单独应用由于其极差的水溶性和毒性副作用而受到严重阻碍，但如实施例所示，由该化合物与本发明抗体和连接体组合形成的偶联物，不仅有效地发挥了该化合 物的肿瘤杀死效果，且克服了该化合物的缺陷，所形成的偶联物的聚集度小并具有良好的动物耐受性。
因此，在本发明的一些优选实施方案中，本发明ADC的药物D为FL118衍生物，尤其是7位取代的FL118。
在一些实施方案中，本发明的式(I)中的药物D为包含以下式D结构的喜树碱类药物：
其中，
R x、R y各自独立地选自H、卤素、-OH、C 1-C 6烷基，或者R x和R y与各自连接的碳原子一起形成具有1或2个选自N、S和O的5-6元杂环；
R a选自H、卤素、-OH、任选取代的C 1-C 8烷基或C 3-C 8炔基或C 3-C 8烯基、任选取代的C 1-C 8烷氧基、任选取代的C 3-C 8环烷基、任选取代的苯基、任选取代的杂环烷基、任选取代的杂芳基，
优选地，其中，R a选自：
氢；
C 3-C 8环烷基；
苯基；
任选被选自以下的取代基取代的C 1-C 8烷基或C 3-C 8炔基或C 3-C 8烯基：卤素、羟基、任选被NH 2、NH(C 1-C 4烷基)和N(C 1-C 4烷基) 2取代的C 1-C 4烷氧基、C 3-C 8环烷基、杂环烷基、苯基、和NR 1R 2，
其中R 1和R 2彼此独立地选自
氢；
任选地被选自以下的取代基取代的C 1-C 8烷基：羟基、氨基、被一个或两个C 1-C 4烷基取代的氨基、被一个或两个C 1-C 4羟烷基取代的氨基、被(C 1-C 4羟烷基)和(C 1-C 4烷基)取代的氨基；
被1或2个C 3-C 10环烷基、C 3-C 10杂环烷基、苯基或杂芳基取代的C 1-C 4烷基；
C 3-C 10环烷基；
C 3-C 10杂环烷基
C 2-C 6杂烷基；
杂芳基；
任选卤代的苯基；
任选被羟基或氨基取代的C 1-C 8烷基-C(＝O)-；
或者，R 1和R 2与各自连接的氮原子组合形成具有0至3个取代基的5-、6-或7-元杂环，所述取代基选自卤素、C 1-C 4烷基、OH、C 1-C 4烷氧基、NH 2、NH(C 1-C 4烷基)和N(C 1-C 4烷基) 2，
其中环烷基、杂环烷基、苯基、杂芳基在每次出现时各自独立地任选被0-3个选自以下的取代基取代：OH、C 1-C 4烷基、C 1-C 4烷氧基、NH 2、NH(C 1-C 4烷基)和N(C 1-C 4烷基) 2取代。
在一些优选实施方案中，R x和R y各自独立地为H。在另一些优选实施方案中，R x为F且R y为甲基。在再一些优选实施方案中，R x和R y与各自连接的碳原子一起形成含有2个O的5元杂环。
在一些实施方案中，本发明的式(I)中的药物D为包含以下式D a或式D b结构的喜树碱类药物：
尤其是式(D a)的喜树碱类药物，
其中，R a选自：
氢；
C 3-C 8环烷基；
苯基；
任选被选自以下的取代基取代的C 1-C 8烷基、C 3-C 8炔基或C 3-C 8烯基：卤素、羟基、任选被NH 2、NH(C 1-C 4烷基)和N(C 1-C 4烷基) 2取代的C 1-C 4烷氧基、C 3-C 8环烷基、杂环烷基、苯基、和NR 1R 2，
其中R 1和R 2彼此独立地选自
氢；
任选地被选自以下的取代基取代的C 1-C 8烷基：羟基、氨基、被一个或两个C 1-C 4烷基取代的氨基、被一个或两个C 1-C 4羟烷基取代的氨基、被(C 1-C 4羟烷基)和(C 1-C 4烷基)取代的氨基；
被1或2个C 3-C 10环烷基、C 3-C 10杂环烷基、苯基或杂芳基取代的C 1-C 4烷基；
C 3-C 10环烷基；
C 3-C 10杂环烷基
C 2-C 6杂烷基；
杂芳基；
任选卤代的苯基；
任选被羟基或氨基取代的C 1-C 8烷基-C(＝O)-；
或者，R 1和R 2与各自连接的氮原子组合形成具有0至3个取代基的5-、6-或7-元杂环，所述取代基选自卤素、C 1-C 4烷基、OH、C 1-C 4烷氧基、NH 2、NH(C 1-C 4烷基)和N(C 1-C 4烷基) 2，
其中环烷基、杂环烷基、苯基、杂芳基在每次出现时各自独立地任选被0-3个选自以下的取代基取代：OH、C 1-C 4烷基、C 1-C 4烷氧基、NH 2、NH(C 1-C 4烷基)和N(C 1-C 4烷基) 2取代。
在一些实施方案中，R a是氢。
在一些实施方案中，R a是C 3-C 8环烷基(例如，环丙基，环庚基，环戊基)。
在一些实施方案中，R a是苯基。在另一些实施方案中，R a是被NH 2或NH(C 1-C 4烷基)取代的苯基。
在一些实施方案中，R a是C 1-C 6烷基，例如，甲基，乙基，丙基，2-甲基丙基，丁基，异丁基，2,2-二甲基-丙基，2,2-二甲基-丁基，正己基，正戊基，3-乙基-戊基。
在一些实施方案中，R a是C 1-C 4烷基，其任选地被羟基或C 1-C 4烷氧基取代，其中烷氧基任选地进一步被-NH 2、-NH(C 1-C 4烷基)和-N(C 1-C 4烷基) 2取代。
在一些实施方案中，R a是C 2-C 4烯基或C 2-C 4炔基，其任选地被羟基或氨基取代。
在一些实施方案中，R a是被具有1或2个选自N、S和O的5-6元杂环烷基取代的C 1-C 4烷基，其中杂环烷基部分任选地被C 1-C 4烷基进一步取代，优选地，所述杂环烷基为哌嗪基或吗啉基。
在一些实施方案中，R a是被-NR 1R 2取代的C 1-C 4烷基，尤其是-亚甲基-NR 1R 2，其中R 1和R 2彼此独立地选自：
氢；
-C 1-C 4烷基；
被以下取代基取代的-C 1-C 4烷基：
-OH；-NH 2；-NH(C 1-C 4烷基)；-N(C 1-C 4烷基) 2；-苯基；-亚苯基-NH 2；-亚苯基-C 1-C 4烷氧基；-二苯基；-C 3-C 10环烷基；-C 3-C 10亚环烷基-C 1-C 4烷基；-C 3-C 10杂环烷基，其中所述杂环烷基具有1或2个选自N、S和O的杂原子，优选所述杂环烷基为哌啶基；
苯基；卤代的苯基；
C 3-C 10环烷基；
-C(＝O)-C 1-C 4烷基-OH；-C(＝O)-C 1-C 4烷基-NH 2。
在一些实施方案中，R a是被-NR 1R 2取代的C 1-C 4烷基，尤其是-亚甲基-NR 1R 2，其中R 1和R 2与各自连接的氮原子组合形成5-、6-或7-元杂环烷基环。在一些方面，R 1和R 2与各自连接的氮原子组合形成6-元环。在一些方面，所述6-元环为吗啉基或哌嗪基。
在一些优选实施方案中，R a选自：-C 1-C 4亚烷基-OH、-C 1-C 4亚烷基-O-C 1-C 4亚烷基-NH 2、-C 1-C 4亚烷基-NH 2、-C 1-C 4亚烷基-NH(C 1-C 4羟烷基)、-C 1-C 4亚烷基-N(C 1-C 4羟烷基) 2、-C 1-C 4亚烷基-N(C 1-C 4氨烷基)(C 1-C 4羟烷基)、-C 1-C 4亚烷基-NH(C 1-C 4氨烷基)、-C 1-C 4亚烷基-NH-C(＝O)-C 1-C 4亚烷基-OH；-C 1-C 4亚烷基-NH-C(＝O)-C 1-C 4亚烷基-NH 2、-C 1-C 4亚烷基-N(C 1-C 4烷基)(C(＝O)-C 1-C 4亚烷基-OH)；-C 1-C 4亚烷基-N(C 1-C 4烷基)(C(＝O)-C 1-C 4亚烷基-NH 2)。
在一些再优选的实施方案中，R a为-C 1-C 4亚烷基-NH-C(＝O)-C 1-C 4亚烷基-OH；-C 1-C 4亚烷基-NH-C(＝O)-C 1-C 4亚烷基-NH 2。
在一些再优选的实施方案中，R a为-C 2-C 4亚烯基-NH 2或-C 2-C 4亚烯基-OH，例如，-CH＝CH-CH 2-NH 2或-CH＝CH-CH 2-OH。
在一些再优选的实施方案中，R a为-C 1-C 4亚烷基-OH、-C 1-C 4亚烷基-O-C 1-C 4亚烷基-NH 2、或-C 1-C 4亚烷基-NH 2。
在一些更优选的实施方案中，R a为-C 1-C 4亚烷基-OH。在一些方面，R a为羟甲基。在一些方面，R a为羟乙基。在一些方面，R a为羟丙基。
在另一些更优选的实施方案中，R a为-C 1-C 4亚烷基-NH 2。在一些方面，R a为氨基甲基。在一些方面，R a为氨基乙基。在一些方面，R a为氨基丙基。
优选地，药物D通过其上的游离羟基或氨基基团，与连接体L连接，以偶联到抗体上。更优选地，式D或式D a或D b的药物D通过R a上的羟基或氨基基团，与连接体L连接，以偶联到抗体上。优选地，在与连接体连接后R a具有选自以下的结构：
其中，n为1-4的整数，优选n＝2或3，其中R’为H或C 1-C 4烷基，优选为H，其中，左侧波浪线表示与连接体L连接的位置，右侧星号表示与喜树碱母核连接的位置；
更优选地，与连接体连接后的R a具有选自以下的结构：
最优选地，与连接体连接后的R a具有选自以下的结构：
其中，左侧波浪线表示与连接体L连接的位置，右侧星号表示与喜树碱母核连接的位置。
在一些优选的实施方案中，本发明的式(I)中的L-D单元包含以下结构：
更优选地，式(I)中的L-D单元包含以下结构：
连接体L单元
适用于本发明的连接体L可以是能够实现将本发明抗体与药物偶联的任何连接体。适宜地，连接体的加入应保证本发明的ADC在循环系统中的充分稳定性，同时可以在靶位点(例如肿瘤细胞或肿瘤环境)中提供快速和有效的毒性药物活性形式的释放。
在一些实施方案中，本发明式(I)中的连接体是不可降解型连接体。不可降解型连接体的例子包括，但不限于，N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC)。通常，包含此类连接体的ADC必须被细胞内化，由细胞内溶酶体蛋白酶降解ADC的抗体部分，释放药物活性分子。
在再一些实施方案中，本发明式(I)中的连接体是可降解型连接体。包含此类连接体的ADC的药物释放由连接体中的切割位点的性质触发。因此，可以根据靶治疗位点(例如，肿瘤细胞溶酶体和/或肿瘤环境)的特点，设计此类连接体的切割位点。在大多数情况下，可降解连接体可以由偶联部分、可降解部分、和任选地间隔基部分组成。偶联部分负责抗体与连接体-药物的连接，可以根据期望采用的抗体偶联化学来进行选择。可降解部分在基于酶的释放机制下将包含可被酶识别的肽或肽类似物，例如，可被蛋白水解酶降解的Val-Ala,Val-Cit,Phe-Lys,Gly-Phe-Leu-Gly,Ala-Leu-Ala-Leu,Gly-Gly-Phe-Gly,环丁基-Ala,环丁基-Cit等寡肽或寡肽类似物。在一些情况下，可以通过在连接体中邻近酶切割位点的肽残基位置引入修饰，来改善ADC的性质，例如，ADC在血液循环中的稳定性和/或ADC在靶位点的药效。在一些情况下，也可以根据需要，在连接体的可降解部分与药物D之间引入间隔基，来促进药物活性分子自偶联物的其余部分的释放(尤其是，无痕释放)，例如，在酸性介质中可自发消除的对氨基苄基氨基甲酸酯(PABA)或氨基甲基(-NHCH 2-)间隔基。此外，在药物疏水性高时，在一些情况下，可以考虑(但不是必需)加入诸如PEG单元，来改善ADC的性质，例如减少沉淀和聚集。可适用于本发明的连接体包括但不限于WO2022/170971中公开的连接体(该文献特此并入作为参考)。
在一些实施方案中，本发明式(I)中的连接体L具有以下式(II)的结构：
-Z-Y-M- (II)，
其中
Z为与Ab连接的连接基，
Y是2-5个氨基酸的肽，优选二肽、三肽或四肽，
M不存在，或是用于与药物D连接的间隔基。
Z连接基
通常，抗体半胱氨酸的硫基，以二硫键的形式存在。打开抗体的二硫键，可以提供自由巯基作为偶联位点。通过与抗体巯基进行偶联形成ADC的一种方式是，使抗体上的自由巯基与杂环类(例如马来酰亚胺类)连接体发生Michael加成反应。另一种方式是，使包含离去基团取代的杂芳环的连接体与抗体分子中的自由巯基进行亲核取代反应，来获得抗体-药物偶联物。两种方式均适用于本发明的ADC偶联物。因此，根据本发明的连接体在一些方面可以包含杂环类(例如马来酰亚胺类)或杂芳环类(例如嘧啶类)的Z连接基；并且，在一些情况中，优选包含杂芳环类(例如嘧啶类)连接基，以提供在血液循环中具有更高稳定性的偶联物。
在一些实施方案中，式(II)中的Z具有以下结构：
-Z 1-Z 2-Z 3-Z 4-，
其中Z 1为Ab中的硫原子，
Z 2为5-10元杂环基，优选地含1或2个选自N,S和O的杂原子；
Z 3选自键、-C(＝O)-、-C 1-C 10亚烷基-C(＝O)-、-C 3-C 10亚炔基-C(＝O)-、-C 3-C 10亚烯基-C(＝O)-、-C 1-C 10亚杂烷基-C(＝O)-、-C 3-C 8亚环烷基-C(＝O)-、-O-C 1-C 8亚烷基-C(＝O)-、-亚芳基-C(＝O)-、-C 1-C 10亚烷基-亚芳基-C(＝O)-、-亚芳基-C 1-C 10亚烷基-C(＝O)-、-C 1-C 10亚烷基-C 3-C 8亚环烷基-C(＝O)-、-C 3-C 8亚环烷基-C 1-C 10亚烷基-C(＝O)-、-C 3-C 8亚杂环基-C(＝O)-、-C 1-C 10亚烷基-C 3-C 8亚杂环基-C(＝O)-、-C 3-C 8亚杂环基-C 1-C 10亚烷基-C(＝O)-、-亚杂芳基-C(＝O)-、-C 1-C 10亚烷基-亚杂芳基-C(＝O)-、-亚杂芳基-C 1-C 10亚烷基-C(＝O)-，
Z 4是键或是下式表示的PEG单元，
其中，R 5选自C 1-4亚烷基、-NH-、-NH-C 1-4亚烷基-杂芳基-，其中杂芳基为5元或6元的含氮杂芳基，优选三唑基；R 6为-C(＝O)-、-C 1-4亚烷基、-C 1-4亚烷基-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-(CH 2OCH 2)-C(＝O)-、-C 1-4亚烷基-NH-C(＝O)-(CH 2OCH 2)-C(＝O)-，其中m为2-12的整数，例如m＝2,4,6,或8。
在一个实施方案中，Z 2为5-10元杂芳基。在一个实施方案中，Z 2选自任选被一个或多个独立地选自氢、卤素、硝基、C 1-6烷基和卤代C 1-6烷基取代的嘧啶、噻唑、苯丙噻唑、噁唑、喹唑啉和吡咯并[2,3d]嘧啶。在一些实施方案中，Z 2为选自如下的杂芳基，
其中，Z 2通过与杂原子相邻的碳原子与Z 1连接。在一个优选实施方案中，Z 2为亚嘧啶基，优选 更优选 其中左侧波浪线表示与Z 1连接的位置；右侧波浪线表示与Z 3连接的位置。
在一些实施方案中，Z 2为亚马来酰亚胺基， 其中左侧波浪线表示与Z 1连接的位置；右侧波浪线表示与Z 3连接的位置。
在一些实施方案中，Z 3为-C 3-C 8亚杂环基-C(＝O)-、-C 1-C 10亚烷基-C 3-C 8亚杂环基-C(＝O)-、-C 3-C 8亚杂环基-C 1-C 10亚烷基-C(＝O)-，优选地，其中所述亚杂环基中的杂环是杂芳环，诸如三唑、吡唑、噻唑、噁唑、异噁唑、或哒嗪的杂芳环基。在一些实施方案中，Z 3为-亚杂芳基-C(＝O)-、-C 1-C 10亚烷基-亚杂芳基-C(＝O)-、-亚杂芳基-C 1-C 10亚烷基-C(＝O)-。
在一些实施方案中，Z 3为-C 3-C 8亚杂芳基-C 1-C 10亚烷基-C(＝O)-，尤其是，
其中n’为1-6，优选地，Z 3为 更优选
其中左侧波浪线表示与Z 2连接的位置，右侧波浪线表示与Z 4连接的位置，且其中优选地，Z 2为亚嘧啶基。
在一些实施方案中，Z 3为亚芳基-或亚杂芳基-C(＝O)-,尤其是，
其中Z 3通过-C-(＝O)-与Z 4连接，且其中优选地，Z 2为亚嘧啶基。
在另一些实施方案中，Z 3为-(C≡C)-C 1-5亚烷基-C(＝O)-,-(CH＝CH)-C 1-5亚烷基-C(＝O)-,-C 1-6亚烷基-C(＝O)-，或-C 3-8亚环烷基-C(＝O)-，其中Z 3通过-C-(＝O)-与Z 4连接。
在一些优选实施方案中，Z 2为亚嘧啶基，Z 3为-C(＝O)-。
在一些优选实施方案中，Z 2为亚嘧啶基，Z 3为-(C≡C)-C 1-5亚烷基-C(＝O)-或-(CH＝CH)-C 1-5亚烷基-C(＝O)-，尤其是-(C≡C)-C 1-5亚烷基-C(＝O)-。
在一些优选实施方案中，Z 2为亚马来酰亚胺基，Z 3为-C 1-6亚烷基-C(＝O)-，或-C 3-8亚环烷基-C(＝O)-。
在一些实施方案中，Z 4为键，Z 3与式(II)中的Y直接连接。
在一些实施方案中，Z 4为包含2-12个PEG的单元。在一些实施方案中，Z 4为 其中m＝1-8,例如，2,3,4,5,6,7或8。
在一些实施方案中，Z 4选自：
其中左侧波浪线表示与Z 3连接的位置；右侧波浪线表示与式II中的Y连接的位置。
在一些实施方案中，本发明式(I)中的Z具有以下结构：
其中，x 1＝1-8，例如,x 1＝3。
在一些实施方案中，本发明式(I)中的Z具有以下结构：
其中，x 2＝1-6。
在一些优选的实施方案中，本发明式(I)中的Z具有以下结构：
其中S为Ab中的硫原子，且R b为未取代的或取代的-C 3-10炔基-C(＝O)-或-C 3-10烯基-C(＝O)-或-亚杂芳基-C 1-C 10亚烷基-C(＝O)-，
优选地，R b是
其中，左侧波浪线表示与嘧啶基连接的位置；右侧波浪线表示与Y连接的位置；
更优选地，Z具有结构：
在一些实施方案中，本发明式(I)中的Z具有以下结构：
其中R E是氢、C 1-6烷基、C 1-6氨基烷基、C 1-6卤代烷基、C 1-6羟基烷基，其中y＝0-4,例如,0,2,或5，其中烷基、氨基和羟基部分任选地被取代；在一些实施方案中，R E是任选被取代的氨基烷基，例如被-C 1-4亚烷基-NH 2、-C 1-4亚烷基NHR F和-C 1-4亚烷基N(R F) 2所取代，其中每个R F独立地选自C 1-6烷基和C 1-6卤代烷基，或者两个R F基团与它们所附连的氮组合形成氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基团。
在一些实施方案中，本发明式(I)中的Z具有以下结构：
Y含肽单元
出于限制或最小化ADC的非靶向毒性，同时保证毒素分子在靶肿瘤位置释放的目的，在一些方面，有利的是，设计抗体-药物偶联物，以使其在高选择性地靶向肿瘤细胞的同时，能够被肿瘤细胞或环境中的蛋白水解酶(尤其是，相对于血液，在肿瘤细胞和/或肿瘤环境中具有显著更高活性的酶)降解。为此，可以在此类ADC偶联物的连接体中包含可以被此类蛋白水解酶识别和切割的寡肽或寡肽类似物。
在一个实施方案中，因此，作为本发明连接体一部分的Y单元是含肽的可降解部分，例如，含有两个或更多个(例如,2-12，例如2,3,4,5,或6个)连续或不连续的氨基酸的可降解肽接头。含肽单元的每个氨基酸可以彼此独立地选自天然氨基酸或非天然氨基酸，例如选自：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、取代的赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、硒代半胱氨酸、鸟氨酸、β-丙氨酸、瓜氨酸、及其衍生物。在一些实施方式中，每个氨基酸独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸及其衍生物。在一些实施方式中，每个氨基酸独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸、N-甲基甘氨酸、β-丙氨酸、及其衍生物。在一些方面，ADC在内化进入肿瘤细胞中后，Y单元中的酰胺键将被肿瘤细胞溶酶体中的酶识别并降解，释放出药物部分D。在另一些方面，Y单元中的酰胺键可以被肿瘤环境中的酶识别并降解，释放出药物部分D。通过设计偏向肿瘤分布的抗体-药物偶联物，具有此类Y含肽单元的连接体将促进毒素分子在肿瘤细胞和环境中的释放。
在一些实施方案中，Y为包含选自以下的单元：Val-Cit,Phe-Lys,Val-Ala,Val-Lys-Gly,Ala-Ala-Ala,Val-Ala,Gly-Phe-Leu-Gly,Ala-Leu-Ala-Leu,Gly-Gly-Phe-Gly,环丁基-Ala,环丁基-Cit。在一些实施方案中，Y为包含选自以下的单元：Val,Cit,Phe,Lys,D-Val,Leu,Gly,Ala,Asn,Cit-Val,Val-Ala,Lys-Val,Val-Lys(Ac),Phe-Lys,Phe-Lys(Ac),D-Val-Leu-Lys,Gly-Gly-Arg,Ala-Ala-Asn。
在一些优选的实施方案中，Y为包含取代的赖氨酸的二肽、三肽、四肽或五肽。在一个实施方案中，所述取代的赖氨酸为：
其中，R 3和R 4彼此独立地选自：H，C 1-6烷基，-CO-NH 2,-CONH(C 1-6烷基)，和-CONH(C 1-6烷基) 2，其中所述烷基任选地被选自以下的基团取代：卤素、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、C 3-6环烷基、6-10元芳基和5-14元杂芳基。
在一些优选实施方案中，Y为从N端到C端具有下式氨基酸序列的肽；
Xaa 1-Xaa 2-Xaa 3-Xaa 4-Xaa 5，
其中Xaa 1不存在，或为选自缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸的氨基酸；
Xaa 2为选自苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸和缬氨酸的氨基酸，优选缬氨酸；
Xaa 3为未取代的或取代的赖氨酸；
Xaa 4为选自亮氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸；
Xaa 5不存在，或为选自甘氨酸和丙氨酸的氨基酸；
其中，所述氨基酸序列的N端与连接体的Z单元连接，且C端与M单元连接或与药物D直接连接，
优选地，Xaa 3为ε-氨基被C 1-C 3烷基单取代或二取代的赖氨酸，
再优选地，Y为选自以下的肽：Phe-Lys-Gly、Leu-lys-Gly、Gly-Val-Lys-Gly、Val-Lys-Gly-Gly、Val-Lys-Gly、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Leu，其中Lys残基为未取代的或被C 1-C 3烷基单取代或二取代的赖氨酸。
M间隔基
在一些实施方式中，本发明的ADC偶联物在可释放的含肽单元(Y)与药物(D)之间具有间隔基(M)。间隔基可以是促进含肽单元(Y)与药物D连接的官能团，或者可以提供附加的结构组分以进一步促进药物D从偶联物的其余部分释放(例如，自消解基团，如对氨基苄基(PAB)组分)。
在一些实施方案中，连接Y和药物D单元之间的M间隔基可以选自：
且优选为
其中左侧波浪线表示与Y连接，右侧波浪线表示与药物D单元连接。
在另一些实施方案中，M为共价键，式I中的Y和药物D之间直接连接，如通过酰胺键连接。
在一个优选实施方案中，连接体L中的Y-M单元包含以下结构：
且优选地，所述Y-M单元与如下Z单元连接：
示例性连接体L
在一些优选的实施方案中，本发明式(I)中的L为包含如下结构的连接体：
其中，R 3和R 4各自独立地选自甲基、乙基、丙基。在一些更优选的实施方案中，R 3和R 4均为甲基；或R 3和R 4均为乙基；或R 3和R 4均为丙基。
在一些实施方案中，本发明式I的L-D单元通过与Ab的轻链和/或重链的自由半胱氨酸的巯基形成硫 醚键，从而与抗体连接。
示例性ADC偶联物
在一些实施方案中，本发明提供了具有以下结构的ADC偶联物或其可药用盐或溶剂化物：
其中，q表示1-20的平均DAR值，例如大约2、4、6和8的平均DAR值。
在一些实施方案中，根据本发明的ADC具有至少一项或多项以下优点：
-相对于ADC的血液循环中分布，显著地促进ADC向肿瘤环境的分布和富集；
-有效地限制了有效载荷在血浆中的过早释放，具有较高的血液循环稳定性，
-能在肿瘤环境中提供有效的毒性药物活性形式释放；
-赋予高效的动物体内肿瘤杀伤效果；和
-良好的动物耐受性。
在再一些实施方案中，根据本发明的ADC还可以具有至少一项或多项以下优点：
-毒素-连接体的加入不诱导聚集，并可以实现高的载药量，DAR可以高达8；和
-可接受的PK特性。
II.抗体-药物偶联物制备
抗体-药物偶联物的生成可以通过本领域的技术人员已知的任何技术来完成。在一些方面，通过与抗体的氨基酸残基反应来完成药物-连接体与抗体的偶联。在一些实施方案中，应用带离去基团的杂芳基连接体L，将药物D偶联到抗体的半胱氨酸残基上，以制备本发明式I的偶联物。在一些实施方案中，可以通过控制以还原剂例如三(2-羟乙基)膦(TCEP)处理抗体的条件，破坏抗体的链间二硫键并暴露自由巯基用于与杂芳基连接体-药物偶联。对于IgG1型抗体，至多可以还原四个链接二硫键，从而生成至多8个反应性巯基基团用于偶联。通过此方法制备的偶联物可以在每个抗体分子中含有零个、一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个药物。
在制备的偶联物是具有不同药物偶联位点和/或个数的偶联物的组合物时，偶联物的载药量由平均DAR表示，其为平均每抗体的药物分子数。可以通过常规手段，例如质谱、ELISA测定和HPLC，表征制备产生的抗体-药物偶联物组合物的平均每抗体的药物数。在另一些实施方案中，也可以确定抗体-药物偶联物以q表示的定量分布。可以通过如反相HPLC或电泳等手段实现其中q为某一值的同质抗体-药物偶联物与具有其它载药量的抗体-药物偶联物的分离、纯化和表征。
因此，在本发明的一个方面，q表示偶联在一个单独的抗体(Ab)上的药物-连接体(L-D)部分的数目，并且优选为1至16、1至12、1至10、或1至8的整数。在此情况下，单独的ADC偶联物也可称为ADC化合物。在任何本文的实施方式中，在根据本发明的ADC化合物上，可以有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个药物连接体部分偶联到一个单独的抗体上。
在本发明的另一个方面，q表示制备的偶联物组合物的平均DAR。在此情况下中，q可以为在1至约16、1至约12、1至约10、或1至约8、2至约16、2至约12、2至约10、或2至约8的范围内的整数或小数。在一些方面，q表示约6的平均DAR。在一些方面，q表示约8的平均DAR。
III.药物组合物
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何ADC或其可药用盐或溶剂化物的组合物，优选地组合物为药物组合物或药物制剂。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用辅料。在一个实施方案中，组合物，例如，药物组合物，包含本发明的ADC或其可药用盐或溶剂化物，以及一种或多种其它治疗剂的组合。
本发明还包括包含本发明的ADC或其可药用盐或溶剂化物的组合物(包括药物组合物)。这些组合物还可以包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。
如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。
对于药用辅料的使用及其用途，亦参见“Handbook of Pharmaceutical Excipients”,第八版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。
本发明的组合物可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如液态溶液剂(例如，可注射用溶液剂和可输注溶液剂)、散剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。
可以通过将具有所需纯度的本发明的ADC或其可药用盐或溶剂化物与一种或多种任选的药用辅料混合来制备包含本文所述的ADC的药物，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。
本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它治疗剂，包括化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂或激动剂)等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所 述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
IV.药物组合和药盒
在一些实施方案中，本发明还提供了药物组合或药物组合产品，其包含本发明的ADC或其可药用盐或溶剂化物，以及一种或多种其它治疗剂(例如治疗剂，包括化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂或激动剂)等)。
本发明的另一个目的是提供一种成套药盒，其包含本发明的药物组合，优选地所述药盒为药物剂量单元形式。由此可以依据给药方案或药物施用间隔提供剂量单元。
在一个实施方案中，本发明的成套药盒在同一包装内包含：
-含有包含本发明的ADC或其可药用盐或溶剂化物的药物组合物的第一容器；
-含有包含其它治疗剂的药物组合物的第二容器。
V.用途和方法
本发明一方面提供了在受试者中预防或治疗肿瘤(例如癌症)的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的ADC或其可药用盐或溶剂化物、药物组合物、药物组合或药盒。
CLDN18.2在多种来源的癌组织细胞表面选择性表达，因此是适用于开发癌症免疫疗法的合适靶点。已经发现，CLDN18.2在诸如胰腺癌、食管癌、胃癌等消化系统癌症中高度选择性的表达。因此，在一个方面，本发明提供了本发明抗体在受试者中预防和/或治疗CLAUDIN 18.2阳性肿瘤中的用途，包括以预防和/或治疗有效量施用本发明的抗体药物偶联物。在一些实施方案中，本发明的抗体药物偶联物可以作为唯一活性剂，或可以与其它疗法或治疗剂联合施用。所述的其它疗法和治疗剂包括，例如，靶向肿瘤细胞表面的抗原，通过结合和/或阻断这些分子而消灭肿瘤的药物；激活受试者的免疫系统，促使其自发消灭肿瘤的药物。
在一些实施方案中，根据本发明治疗的肿瘤可以是处于早期、中期或晚期或是转移性的癌。在一些实施方案中，根据本发明治疗的肿瘤是先前接受过治疗而发生免疫逃逸的肿瘤。
在本发明的方法中，本发明抗体-药物偶联物的施用可以包括1)治疗性措施，该措施治愈、减缓、减轻经诊断的病理状况或疾患的症状及/或停止该经诊断的病理状况或疾患的进展；或2)预防性或防范性措施，该措施预防及/或减缓病理状况或疾患的发展。在一些实施方案中，在本发明的方法中，个体将受益于所述的治疗性措施或预防性措施，并相比于未接受所述处理的个体，表现出在疾病、病症、病状、和/或症状的发生、复发或发展上的减轻或改善。在一些实施方案中，在接受本发明方法治疗之前，所述受试者正在接受或已经接受过其它治疗，例如化疗治疗和/或放射疗法、或其他免疫疗法。
在一个具体的实施方案中，本发明的抗体-药物偶联物能够杀伤CLDN18.2阳性肿瘤细胞，和/或抑制CLDN18.2阳性肿瘤细胞增殖。
本发明的抗体药物偶联物可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肿瘤内给药和鼻内给药。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体药物偶联物的合适剂量(当单独或与一种或多种其他的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体药物偶联物的具体类型、疾病的严重性和进程、治疗目的、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗体药物偶联物的应答，和主治医师的判断力。本发明的抗体药物偶联物可以以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。
在一些实施方案中，本发明也提供本发明抗体药物偶联物在制备用于前述治疗和预防方法的药物中 的用途。
本发明抗体部分
本发明也提供具有多种优良性质的人源化抗Claudin18.2单克隆抗体、其编码核酸、包含所述核酸的载体和宿主细胞、以及包含所述抗体的免疫缀合物、多特异性抗体、药物组合物和用途。本发明的抗体不仅对表面表达人Claudin18.2的细胞(尤其是表面表达丰度低的细胞)展示出高结合亲和力和高特异性，也具有诸如ADCC和/或CDC活性、由Claudin18.2抗原介导的内吞活性、稳定性和/或药代动力学性质等有利性质，因此适宜单独或与其他抗癌药物组合用于癌症治疗、也适宜作为分子组件用于形成靶向癌症组织的新抗癌分子，例如与细胞毒性药物缀合形成抗体-药物偶联物。
I..本发明抗体
本发明提供特异性地结合Claudin18.2，优选人Claudin18.2蛋白质(例如NM_001002026的人Claudin18.2序列)的抗体或其抗原结合片段，尤其是人源化抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，根据本发明的抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段包含：
(i)如SEQ ID NO:1或3所示的重链可变区的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区的LCDR1、2和3序列，或者
(ii)如SEQ ID NO:21所示的重链可变区的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:22所示的轻链可变区的LCDR1、2和3序列，或者
(iii)如SEQ ID NO:23所示的重链可变区的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:24所示的轻链可变区的LCDR1、2和3序列，或者
(iv)如SEQ ID NO:38或40所示的重链可变区的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:39所示的轻链可变区的LCDR1、2和3序列，或者
(v)如SEQ ID NO:44所示的重链可变区的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:45所示的轻链可变区的LCDR1、2和3序列，或者
(vi)如SEQ ID NO:46所示的重链可变区的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:47所示的轻链可变区的LCDR1、2和3序列，或者
(vii)如SEQ ID NO:48所示的重链可变区的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:49所示的轻链可变区的LCDR1、2和3序列，或者
(viii)如SEQ ID NO:50所示的重链可变区的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:51所示的轻链可变区的LCDR1、2和3序列，或者
(ix)如SEQ ID NO:52所示的重链可变区的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:53所示的轻链可变区的LCDR1、2和3序列。优选地，所述CDR根据Kabat或IMGT或其组合进行定义。
在一些实施方案中，优选地，本发明提供了结合Claudin18.2的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区的3个互补决定区HCDR，以及轻链可变区的3个互补决定区LCDR，其中：
(i)根据Kabat定义，HCDR1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由其组成，HCDR2包含SEQ ID NO:13或25的氨基酸序列或由其组成，HCDR3包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由其组成，LCDR1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由其组成，且LCDR3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由其组成；或者
(ii)根据IMGT定义，HCDR1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成，HCDR2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由其组成，HCDR3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由其组成，LCDR1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成，且LCDR3包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)根据Kabat定义，HCDR1包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或由其组成，HCDR2包含SEQ ID NO:27或37的氨基酸序列或由其组成，HCDR3包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由其组成，LCDR1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或由其组成，且LCDR3包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或由其组成，
(iv)根据Kabat定义，HCDR1包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或由其组成，HCDR2包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或由其组成，HCDR3包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或由其组成，LCDR1包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或由其组成，且LCDR3包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或由其组成。
本发明也考虑包含上述(i)-(iv)的CDR序列组合之一的变体的抗体。优选地，所述变体在6个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)，且优选地重链CDR3保持不变。
在再一些实施方案中，本发明提供了抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段，其包含选自以下的重链可变区和轻链可变区：
(i)如SEQ ID NO:1或3所示的重链可变区或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区或与其具有至少至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或者
(ii)如SEQ ID NO:21所示的重链可变区或与其具有至少至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:22所示的轻链可变区或与其具有至少至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或者
(iii)如SEQ ID NO:23所示的重链可变区或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:24所示的轻链可变区或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或者
(iv)如SEQ ID NO:38或40所示的重链可变区或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:39所示的轻链可变区或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或者
(v)如SEQ ID NO:44所示的重链可变区或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:45所示的轻链可变区或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或者
(vi)如SEQ ID NO:46所示的重链可变区或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:47所示的轻链可变区或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或者
(vii)如SEQ ID NO:48所示的重链可变区或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:49所示的轻链可变区或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或者
(viii)如SEQ ID NO:50所示的重链可变区或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:51所示的轻链可变区或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或者
(ix)如SEQ ID NO:52所示的重链可变区或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:53所示的轻链可变区或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，优选地，本发明的抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段包含本发明示例性抗体25C7A5及其人源化抗体(HZ1和HZ2)和2D3A11及其人源化抗体(HZ1和HZ2)之任一的重链和轻链可变区序列或其变体，例如，具有与所述示例性抗体之一相同的CDR序列，并具有相同或不同的构架区序列的抗体。
在一些优选的实施方案中，所述抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:21所述的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，且其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列、或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:21的重链可变区和SEQ ID No:22的轻链可变区。
在再一些优选实施方案中，所述抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:1或3所述的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，且其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗体为人源化抗体。更优选地，所述抗体的重链可变区具有来源于人种系的构架区序列，且优选地在重链可变区中在根据Kabat编号的位置H6具有氨基酸Q或E，优选具有氨基酸Q。
在再一些优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:1的重链可变区和SEQ ID No:2的轻链可变区。
在再一些优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:3的重链可变区和SEQ ID No:2的轻链可变区。
在一些优选的实施方案中，所述抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，且其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列、或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:23的重链可变区和SEQ ID No:24的轻链可变区。
在再一些优选实施方案中，所述抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:38或40所述的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，且其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列、或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗体为人源化抗体。更优选地，所述抗体的重链可变区具有来源于人种系的构架区序列，且优选地在重链可变区中在根据Kabat编号的位置H6具有氨基酸Q或E，优选具有氨基酸Q。
在再一些优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:38的重链可变区和SEQ ID No:39的轻链可变区。
在再一些优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:40的重链可变区和SEQ ID No:39的轻链可变区。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以包含重链恒定区和/或轻链恒定区。优选地，所述重链恒定区为来源于人免疫球蛋白的重链恒定区。优选地，所述轻链恒定区为来源于人免疫球蛋白的轻链恒定区。
包含在本发明抗体中的重链恒定区可以为任何同种型或亚型，例如IgG1,IgG2，IgG3或IgG4同种型的重链恒定区。在一些实施方案中，因此，本发明提供了抗Claudin18.2抗体，其包含IgG1,IgG2，IgG3或IgG4重链恒定区，优选地IgG1重链恒定区，尤其是人IgG1重链恒定区。
包含在本发明抗体中的轻链恒定区可以为κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。在一些实施方案中，因此，本发明提供了包含κ轻链恒定区或λ轻链恒定区的抗Claudin18.2抗体，优选地本发明抗体包含人κ轻链恒定区。
在一些实施方案中，根据本发明的抗体是IgG1抗体，更特别地IgG1κ或IgG1λ同种型。再优选地，根据本发明的抗体为人IgG1κ抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗Claudin18.2抗体包含人IgG1重链恒定区。优选地，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:4氨基酸序列包含至少一个，两个或三个，但不超过20个，10个或5个氨基酸改变的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少95-99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的抗Claudin18.2抗体包含人κ轻链恒定区。优选地，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:5的氨基酸序列包含至少一个，两个或三个，但不超过20个，10个或5个氨基酸改变的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少95-99％同一性的序列。
在一些优选的实施方案中，本发明的抗体包含选自以下的重链序列和轻链序列：
(a)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链序列；
(b)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链序列；
(c)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链序列；
(d)包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链序列。本发明也提供包含上述(a)-(d)之任一项的抗体的变体，其中所述变体在重链序列和/或轻链序列上具有氨基酸改变。优选地，所述变体在重链序列或轻链序列或两者上，与对应的抗体相比，包含至少一个，两个或三个，但不超过20个，10个或5个氨基酸改变的氨基酸序列，或具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。优选地，氨基酸改变不发生在CDR区，更优选地不发生在可变区。
本发明也提供在本文中所述及的任何抗体的变体，尤其是本发明示例性抗体25C7A5及其人源化抗体(HZ1和HZ2)和2D3A11及其人源化抗体(HZ1和HZ2)之任一的变体。本发明抗体变体优选保持改变前抗体的至少60％,70％,80％,90％,或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。更优选地，所述改变不导致抗体变体丧失对抗原的结合，但任选地赋予诸如提高的抗原亲和力和不同的效应子功能等性质。可以理解的，抗体的重链可变区或轻链可变区、或各CDR区可以单独改变或组合改变。此外，也可以对抗体的Fc区进行改变。Fc区的改变可以单独进行，或与上述对构架和/或CDR区的改变相组合。可以改变Fc区，例如，以改变抗体的一种或多种功能，例如血清半衰期，补体固定、Fc受体结合、和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，还可以对本发明抗体进行化学修饰(例如，与PEG连接)或改变其糖基化模式。
在一些实施方案中，本发明的抗体优选是单特异性抗体。但在一些实施方案中，本发明的抗体也可以是多特异性抗体，包含针对Claudin18.2的第一结合特异性以及针对另一抗原的结合特异性，例如，针对肿瘤细胞表面上表达的另一抗原的第二和/或第三结合特异性。
在一些实施方案中，本发明的抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段具有以下一个或多个特性：
(i)以高亲和力与细胞表面表达的人Claudin18.2结合，但不结合或基本不结合人Claudin18.1；
(ii)具有与食蟹猴、小鼠或大鼠Claudin18.2的交叉反应性；
(iii)杀伤表面表达Claudin18.2的细胞，所述细胞尤其是肿瘤细胞例如胃癌细胞；
(iv)具有ADCC活性；
(v)具有CDC活性；
(vi)具有Claudin18.2受体介导的内吞活性。
在一些实施方案中，本发明的抗体对Claudin18.2具有高结合亲和力和高结合特异性。在本文中，优选地，通过FACS或细胞ELSA测定(例如实施例I-7中所述的测定)，确定本发明的抗体对Claudin18.2和/或对Claudin18.1的结合亲和力和结合特异性。在一个实施方案中，在基于细胞的测定中，本发明抗体对Claudin18.1的结合亲和力，相对于所述抗体对Claudin 18.2的结合亲和力，低至少10倍、100倍、10 3倍、10 4倍、10 5倍或10 6倍。在一个实施方案中，优选地，本发明抗体对Claudin18.1表达细胞不结合或基本不结合。
在一个实施方案中，在基于细胞的测定中，例如在采用人Claudin18.2表达阳性率大于95％或大于98％的重组细胞系进行的细胞ELISA测定中，本发明抗体表现出对人Claudin 18.2的高结合亲和力，具有小于300ng/ml，尤其是小于大约100ng/ml，例如大约1ng/ml-50ng/ml且优选地小于大约20ng/ml的EC50值。优选地，所述测定按照实施例I-7中描述的细胞ELISA测定方法进行。优选地，在测定中使用稳定表达人Claudin18.2的重组HEK-293T细胞系进行。
在再一个实施方案中，在基于细胞的测定中，相对于参照抗体IMAB362，本发明抗体对人Claudin 18.2具有相当或更强的结合亲和力。在一些实施方案中，与参照抗体IMAB362相比，在人Claudin 18.2表面表达高阳性率的细胞(例如阳性率大于95％)的细胞上，本发明抗体展现出相当的细胞结合亲和力；在另一些实施方案中，在人Claudin 18.2表面表达中低阳性率(例如阳性率小于50％，如大约2-30％)的细胞上，本发明抗体表现更强的细胞结合亲和力。在所述测定中，可以使用重组表达人Claudin18.2的哺乳动物细胞系，例如HEK29或L929或NUGC4细胞；也可以使用内源性表达人Claudin18.2的肿瘤细胞系，例如NUGC4细胞。优选地，使用细胞ELISA测定方法，按照实施例I-7所述进行；或者使用FACS测定方法，按照实施例I-8所述进行。优选地，本发明抗体相比参照抗体IMAB362，对于细胞表面Claudin18.2表达水平平均较低的细胞，例如内源性表达人Claudin18.2的NUGC4细胞，展示更强的细胞结合活性。
在一个实施方案中，在基于细胞的测定中，本发明抗体表现出对Claudin 18.1无特异性结合。抗体对Claudin18.1表达细胞的此结合性质，可以在FACS测定中，任选地相对于阴性和/或阳性对照，进行测定。优选地，在所述测定方法中，确定抗体的阳性细胞染色百分比和/或细胞的荧光染色强度值。在一个实施方案中，采用人Claudin18.1表达阳性率大于95％或大于98％的重组细胞系，本发明抗体的阳性细胞率不足3％(更优选地不足2％，更优选地不足1％，再优选地不足0.7％)且优选地，由本发明抗体产生的中位和/或平均荧光信号强度与同种型对照抗体产生的中位/平均信号相当(例如，±20％，或优选地±10％)。优选地，所述测定按照实施例I-10中描述的FACS测定方法进行。优选地，在测定中使用稳定表达人Claudin18.1的重组HEK-293T细胞系进行。
在一个实施方案中，本发明抗体具有ADCC活性。可以按照实施例I-11所述测定本发明抗体的ADCC活性。优选地，在所述测定中，本发明抗体表现出小于大约100ng/ml，例如80-50ng/ml，或更优选地小于大约50ng/ml的EC50值。
在再一些实施方案中，本发明抗体具有CDC活性。可以按照实施例I-12所述测定本发明抗体的CDC活性。优选地，在所述测定中，本发明抗体表现出小于约5μg/ml，例如大约1-4μg/ml的CDC活性。
在再一些实施方案中，本发明抗体在与细胞膜表面的受体Claudin18.2结合后具有内吞活性。可以按照实施例I-13所述测定本发明抗体的内吞活性。优选地，在所述内吞活性评价测定试验中，本发明抗体的内吞率为，例如，37℃4小时的内吞率为至少10％，例如，10-25％，优选地，至少20％。
在再一实施方案中，本发明的抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段还具有以下一个或多个特性：(vii)良好的稳定性；和(viii)有利的药代动力学性质。
在一个实施方案中，可以按照实施例I-14中所述的方法测定本发明抗体的稳定性。优选地，在加速稳定性测定中，在37℃放置3-14天后，抗体的SEC-HPLC纯度不小于95％，优选不小于97％；和/或非还原CE-SDS纯度不小于90％，优选地不小于93％，和/或还原型CE-SDS纯度不小于90％，优选地不小于95％。再优选地，在反复冻融测定中，在-80℃反复冻融4次或8次后，抗体的SEC-HPLC纯度不小于95％，优选地不小于97％。
在另一实施方案中，可以按照实施例I-15中所述的方法测定本发明抗体的药代动力学性质。
II.多核苷酸、载体和宿主
再一方面，本发明提供编码以上任何抗Claudin18.2抗体或其片段的核酸。还提供包含所述核酸的载体；和包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，本发明提供包含本发明核酸的一个或多个载体，包括克隆载体和表达载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。可用于本发明的载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。
在一个实施方案中，本发明提供包含本发明载体的宿主细胞。用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别当不需要糖基化和Fc效应子功能时。在细菌例如大肠杆菌中表达后，抗体可以从可溶级分中的细菌细胞糊状物分离，并且可以进一步纯化。在再一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例包括，用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293HEK或293细胞)；中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR -CHO细胞；以及骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。
III.抗体的制备
在再一方面，本发明提供了制备本发明抗Claudin18.2抗体的方法。在一个实施方案中，本发明的方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码本发明抗体的核酸的宿主细胞，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。为了重组产生抗Claudin18.2抗体，可以将分离的或人工合成的或重组合成的编码抗体(例如上文所描述的抗体)的核酸，插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。使用常规程序，可以容易地对此类核酸进行分离和测序，例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针，自杂交瘤细胞分离。
IV..免疫缀合物
再一方面，本发明提供通过将本发明抗体缀合于异源分子而产生的免疫缀合物。在一个实施方案中，在免疫缀合物中，本发明的抗体(或其抗原结合片段)与治疗剂或诊断剂或可检测剂缀合。在一些实施方案中，本发明抗体可以以全长抗体或抗体片段的形式与异源分子缀合。在缀合物中，可以使用接头来共价连接缀合物的不同实体。适宜的接头包括化学接头或肽接头。有利地的是，接头是利于多肽在递送至靶位点后释放的“可裂解接头”。例如，可以使用酸不稳定性接头、肽酶敏感性接头、光不稳定性接头、二甲基接头或含二硫化物的接头。
在与治疗剂缀合的实施方案中，适用于缀合物的治疗剂包括但不限于细胞毒素(例如细胞生长抑制 剂或细胞杀伤剂)，药物或放射性同位素。在与诊断剂或可检测剂缀合的实施方案中，这类缀合物可以作为临床检验方法的部分(如确定特定疗法的效力)，用于监测或预测疾病或病症的发作、形成、进展和/或严重性。可以通过将抗体与可检测剂偶联实现这类诊断和检测，所述可检测剂包括但不限于多种酶，例如辣根过氧化物酶；辅基，例如链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光物质；发光物质；放射性物质；和用于各种正电子发射成像术中的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。
V.药物组合物和药物制剂
本发明还包括包含抗Claudin18.2抗体或其免疫缀合物的组合物(包括药物组合物或药物制剂)和包含编码抗Claudin18.2抗体或其免疫缀合物的多核苷酸的组合物。这些组合物还可以任选地包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。对于赋形剂的使用及其用途，可参见“Handbook of Pharmaceutical Excipients”,第五版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。在一些实施方案中，可以通过将具有所需纯度的本发明的抗Claudin18.2抗体或免疫缀合物，与一种或多种任选的药用辅料(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合，来制备包含本发明的药物制剂。
在本发明的药物组合物和药物制剂中，本发明的抗体可以是唯一的活性剂，或可以与其它治疗剂联合。可以与本发明抗体联合的治疗剂包括但不限于对于待治疗的疾病和/或病症具有有益治疗功效的治疗剂。例如，所述活性成分可以是被治疗的特定适应症所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。例如，可以提供抗癌活性的其它药物成分。本发明抗体与活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在于药物组合物和药物制剂中。
VI.组合产品
在再一方面，本发明还提供了组合产品，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂(例如化疗剂、其他抗体、细胞毒性剂、抗肿瘤药等)。构成组合产品的各组分，例如本发明抗体与其他治疗剂，可以分别配制在不同的制剂中，并优选地容纳在不同的容器中。根据待治疗的疾病以及个体状况等因素，本领域技术人员可以确定组合成品之各组分的施用方式和施用顺序。本发明的组合产品可用于本发明的治疗方法中。在一些实施方案中，本发明提供组合产品，其中所述其它治疗剂为例如有效刺激免疫反应从而进一步增强、刺激或上调受试者的免疫反应的治疗剂如抗体。在一些实施方案中，所述组合产品用于预防或治疗Claudin18.2阳性肿瘤。
VII.方法和用途
在一方面，本发明提供应用本发明Claudin18.2抗体或其抗原结合片段的方法和用途，例如，体内和体外用于：
(1)靶向性结合表面表达CLAUDIN 18.2的肿瘤细胞；和/或
(2)引发针对表面表达CLAUDIN 18.2的肿瘤细胞的ADCC活性和/或CDC活性，以及
(3)抑制和/或杀伤表面表达CLAUDIN 18.2的肿瘤细胞。
在一些实施方案中，本发明的方法和用途涉及在受试者个体的疾病治疗。在另一些实施方案中，本发明的方法和用途涉及在来自例如受试者的样品中检测Claudin18.2的存在。在再一些实施方案中，本发明也提供本发明抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段在制备用于上述用途的产品(例如药物组合物或药物产品或组合产品或检测产品)中的用途。
治疗方法和用途
在一个方面，本发明提供了本发明抗体在受试者中预防和/或治疗CLAUDIN 18.2阳性肿瘤中的用途，包括以预防和/或治疗有效量施用本发明的抗体。
在本发明的方法中，本发明抗体的施用可以包括1)治疗性措施，该措施治愈、减缓、减轻经诊断的病理状况或疾患的症状及/或停止该经诊断的病理状况或疾患的进展；或2)预防性或防范性措施，该措施预防及/或减缓病理状况或疾患的发展。因此，在本发明的方法中，受试者可以是，已罹患疾患的个体、易于罹患疾患的个体，或欲预防疾患的个体。所述个体将受益于所述的治疗性措施或预防性措施，并相比于未接受所述处理的个体，表现出在疾病、病症、病状、和/或症状的发生、复发或发展上的减轻或改善。在一些实施方案中，本发明涉及疾病或病症的治疗；在另一些实施方案中，本发明涉及疾病或病症的预防。
在一些实施方案中，用于本发明方法的本发明抗体包含引起免疫效应子功能的Fc区，并在与表面表达CLDN18.2的细胞(例如癌细胞)结合后诱导免疫效应，例如，ADCC和/或CDC活性。因此，在本发明治疗方法的一个实施方案中，本发明的抗体或其融合物、缀合物或组合物通过诱导CDC介导的细胞裂解、或ADCC介导的细胞裂解、或两者来介导癌细胞杀伤。
本发明的抗体(以及包含其的药物组合物或免疫缀合物，以及任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肿瘤内给药和鼻内给药。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。
检测应用
本发明也提供检测样品中Claudin18.2的方法和试剂盒，其中所述方法包括：(a)将所述样品与本发明抗体或其抗原结合片段或免疫缀合物接触；和(b)检测所述抗体或其抗原结合片段或免疫缀合物和Claudin18.2蛋白之间复合物的形成。在一些实施方案中，样品来自癌症患者，例消化系统癌症患者，例如胃癌、胰腺癌、食道癌患者。所述检测可以是体外的或体内的。
术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测，示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法、PCR-技术(例如，RT-PCR)。在某些实施方案中，生物样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。在一些实施方案中，生物样品来自过度增生性或癌性病灶。在某些实施方案中，待检测的Claudin18.2是人Claudin18.2。
在一个实施方案中，抗Claudin18.2抗体被用于选择适合利用抗Claudin18.2抗体治疗的受试者。在再一个实施方案中，可以使用本发明抗体诊断癌症或肿瘤，例如评价(例如监测)受试者中本文所述疾病(例如，过度增生性或癌性疾病)的治疗或进展、其诊断和/或分期。
在某些实施方案中，提供标记的抗Claudin18.2抗体。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。
本发明的这些以及其它方面和实施方案在附图(附图简述紧随其后)和以下的发明详述中得到描述并且示例于以下实施例中。上文以及整个本申请中所描述的任何或所有特征可以在本发明的各种实施方案中组合。以下实施例进一步说明本发明，然而，应理解实施例以举例说明为目的，不应理解为构成任何限制。
实施例
实施例I抗Claudin18.2制备和表征
实施例1 Claudin18.2和Claudin18.1表达细胞系的构建与鉴定
人Claudin18.2的氨基酸序列参考NCBI的蛋白数据库中的NP_001002026.1。人Claudin18.1的氨基酸序列参考NCBI的蛋白数据库中的NP_057453.1。食蟹猴Claudin18.2的氨基酸序列参考NCBI的蛋白数据库中的XP_015300615.1。小鼠Claudin18.2的氨基酸序列参考NCBI的蛋白数据库中的NP_001181850.1。大鼠Claudin18.2的氨基酸序列参考NCBI的蛋白数据库中的NP_001014118.1。以上氨基酸序列经由金斯瑞公司进行密码子优化，合成于慢病毒载体pLVX上或者pCDNA3.4载体上。
通过慢病毒包装系统制备病毒，获得病毒后分别感染HEK293T、L929、CHO细胞，通过嘌呤霉素筛选，获得CHO-Claudin18.2(人)、HEK293T-Claudin18.1(人)、HEK293T-Claudin18.2(人)、L929-Claudin18.2(人)、HEK293T-Claudin18.2(食蟹猴)、HEK293T-Claudin18.2(大鼠)、HEK293T-Claudin18.2(小鼠)稳定细胞系。
NUGC4为内源性表达Claudin18.2胃癌肿瘤细胞系，选用NUGC4用于后续实验(购自南京科佰，CBP60493)；同时购得重组过表达人Claudin18.2的NUGC4-Claudin18.2(人)稳定细胞系(北京康源博创，KC-1471)用于后续实验。
通过流式细胞技术(FACS)检测确定Claudin18.2的阳性率。实验步骤如下：消化贴壁培养的细胞，离心收集细胞，预冷PBS洗三次；用1％BSA(在PBS中)重悬细胞，在96孔尖底板中每孔加入3×10 5个细胞，体积为50μl；用1％BSA(在PBS中)稀释IMAB362抗体(序列来自于专利：CN 101312989B，抗体175D10的重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:135和轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:142经安徽通用生物合成后，通过293E细胞进行表达纯化获得)至40μg/mL，取50μl/孔加入细胞中，使抗体终浓度为20μg/mL，混匀，4℃孵育1小时；离心收集细胞，预冷PBS洗三次，用50μl 1％BSA(在PBS中)重悬细胞，每孔加入1μl抗人荧光二抗(APC：Biolegend-410712或者PE：BioLegend-410708)，混匀，4℃孵育0.5小时；离心收集细胞，预冷PBS洗三次，用200μl PBS重悬细胞，上机检测(流式细胞仪型号：索尼-LE-SA3800GA或者Beckman-Cytoflex)，获取APC荧光信号值和阳性染色的细胞百分数(阳性率％)。
通过同样的方法用免疫后小鼠血清确定Claudin18.1细胞的阳性率。
流式检测阳性率结果如图1A-1I所示，所有上述稳定细胞系的阳性率均较高(＞95％)，而NUGC4细胞的Claudin18.2表达阳性率为23.8％。
实施例2抗人Claudin18.2鼠源单克隆抗体的制备
选用Balb/C,KM以及CD01 3个品系24只周龄5-6周的野生型小鼠，采用pCDNA3.4-Claudin18.2质粒、CHO-Claudin18.2(人)细胞、L929-Claudin18.2(人)细胞进行免疫，经过3-4次免疫后，采用流式细胞技术检测血清效价。实验步骤如下：消化离心收集贴壁培养的HEK293T-Claudin18.1(人)、HEK293T-Claudin18.2(人)细胞，然后用预冷PBS洗三次，PBS(含1％BSA)重悬细胞，每孔3×10 5个细胞铺至96孔尖底板中，加入梯度稀释血清4℃孵育1小时，预冷PBS洗三次后每孔加入1μl抗小鼠IgG荧光二抗，4℃孵育0.5小时，预冷PBS洗三次后重悬，流式细胞仪上机检测。选取与HEK293T-Claudin18.2(人)亲和力高且与HEK293T-Claudin18.1(人)亲和力低的小鼠作为融合的候选，候选小鼠编号分别为：61、64、79、89、91。
取小鼠脾脏、淋巴结制备细胞悬液，与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞1：1比例进行混合，采用细胞电融合缓冲液进行重悬，使用BTX-ECM2001细胞电融合仪进行电融合反应。电融合反应后，用完全融合培养基(RPMI1640+20％FBS+1×HAT)重悬，按照每孔20000-25000个细胞分至96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养。经过培养后，通过使用L929-Claudin18.2(人)的细胞ELISA法筛选与人Claudin18.2亲和力较高 的杂交瘤母克隆，并通过流式细胞技术(FACS)排除其中能够与Claudin18.1结合的母克隆，用于亚克隆。经过2轮融合筛选，共挑选出52个母克隆进行亚克隆。每个母克隆取75个细胞分至1块96孔细胞培养板中，采用筛选培养基(RPMI1640+20％FBS+1×HT)进行亚克隆培养；取亚克隆上清，通过细胞ELISA和流式细胞技术筛选亲和力较高且不与Claudin18.1结合的单克隆进行放大培养。采用无血清培养基培养杂交瘤细胞，收集的单克隆上清，通过抗体纯化介质ProA(GE,Mabselect XL)填料进行纯化，获得鼠源抗体。
实施例3抗人Claudin18.2鼠源抗体的评价
通过细胞ELISA评价抗人Claudin18.2鼠源单克隆抗体的亲和力。实验步骤如下：实验前一天将HEK293T-Claudin18.2(人)细胞铺至96孔板中，每孔5×10 4细胞；实验当天去除上清，每孔用300μl PBS洗一次，每孔加入100μl 4％多聚甲醛室温固定20分钟；去除多聚甲醛，每孔用300μl PBS洗两次，每孔加入100μl 2％BSA(在PBS中)，37℃封闭2小时；去除封闭液，将梯度稀释的抗体(用2％BSA(在PBS中)稀释抗体，10μg/mL起始，3倍梯度稀释，共11个浓度点)，以100μl/孔加入板中，37℃孵育2小时；去除上清，每孔用300μl PBST洗三次，每孔加入100μl在2％BSA中的抗小鼠IgG HRP二抗(Jackson，货号：115-035-003)，37℃孵育1小时；去除二抗，每孔用300μl PBST洗五次，随后每孔加入100μl TMB底物(湖州英创)，显色5-20分钟；每孔加入50μl 2N HCl终止反应，酶标仪(厂家：MD，型号：SpectraMax)读取OD 450nm数值，将数值代入GraphPad Prism作图，计算EC50值。
通过流式细胞技术(FACS)评价抗人Claudin18.2鼠源单克隆抗体的特异性。实验步骤如下：消化贴壁培养的HEK293T-Claudin18.1(人)细胞，离心收集细胞，预冷PBS洗三次；用1％BSA(在PBS中)重悬细胞，在96孔尖底板中每孔加入3×10 5个细胞，体积为50μl；用1％BSA(在PBS中)稀释待测抗体至100μg/mL，取50μl/孔加入细胞中，使抗体终浓度为50μg/mL，混匀，4℃孵育1小时；离心收集细胞，预冷PBS洗三次，用50μl 1％BSA(in PBS)重悬细胞，每孔加入1μl荧光二抗(Biolegend，货号：405308)，混匀，4℃孵育0.5小时；离心收集细胞，预冷PBS洗三次，用200μl PBS重悬细胞，上机检测(流式细胞仪型号：索尼-LE-SA3800GA)，获取APC荧光信号值，并以同型对照抗体作为阴性对照抗体设门，获取阳性染色的细胞百分数(阳性率％)。
实验结果如表1所示，选取与HEK293T-Claudin18.2亲和力较高且与HEK293T-Claudin18.1无非特异结合的克隆进行测序，克隆标号如下：1A6G10、2D3A11、25C7A5、40G11H2、8H11A10、、23F2F2、32F7A6。
表1鼠源抗体评价结果汇总表
实施例4抗人Claudin18.2鼠源单克隆抗体的测序
上述候选杂交瘤细胞收集约1×10 5个，通过Trizol(Invitrogen，15596026)提取RNA，然后使用PrimeScript RT reagent(TAKARA，RR047A)试剂盒通过PolyA进行反转录获得cDNA；分别于重链、轻链上游设计上游引物，重链CH1区域、轻链CL区域设计下游引物。通过PCR(金牌MIX，擎科生物，TSE101)扩增产物，通过琼脂糖胶回收试剂盒进行片段回收；送样北京擎科生物技术有限公司进行测序，通过IMGT网址分析，测得鼠源抗体序列。候选鼠源抗体序列如表2所示。
表2候选鼠源抗体序列表
通过已获得序列进行专利分析及检索，确认25C7A5和2D3A11为具有独特序列的候选抗体，然后对其进行人源化设计。
实施例5抗人Claudin18.2鼠源抗体的人源化
采用CDR grafting的方法，首先通过常规BLAST方法，找到同原始鼠源序列同源性最高的人germline序列，作为模板；将鼠源抗体的CDR移植到人源模板上，构建成嵌合体；根据结构分析鼠源抗体中能保留其原始构象的FR氨基酸，将嵌合体中相应的氨基酸回复突变为鼠源氨基酸以保持原有亲和力；将构建的人源化抗体进行计算及免疫原性分析，找到高免疫原性片段，进行低免疫原性片段的替换。获得人源化抗体，25C7A5-HZ1和25C7A5-HZ2，以及2D3A11-HZ1和2D3A11-HZ2，其人源化序列如表3所示。
表3候选人源化抗体序列表
实施例6抗人Claudin18.2人源化抗体的制备
将人源化抗体25C7A5-HZ1(重链可变区序列SEQ ID NO:1和轻链可变区序列SEQ ID NO:2)、25C7A5-HZ2(重链可变区序列SEQ ID NO:3和轻链可变区序列SEQ ID NO:2)、以及参照抗体IMAB362的可变区氨基酸序列(序列来自于专利：CN 101312989B，抗体175D10的重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:135和轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:142)，进行密码子优化后进行基因合成(安徽通用生物)，构建到PTT5载体上。质粒合成好后，直接摇菌提取，通过PEImax(Polysciences，24765-1)转染HEK293E细胞， 表达7天左右，离心收集上清。上清采用MabSelectSure蛋白A亲和填料(GE)进行纯化。表达的参照抗体与人源化抗体具有相同的人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:4)和人Kappa轻链恒定区(SEQ ID NO:5)。纯化好的抗体全部超滤到PBS缓冲液，测定浓度，-20度保存。
实施例7抗人Claudin18.2人源化抗体的细胞ELISA亲和力检测
通过细胞ELISA法测定抗人Claudin18.2人源化单克隆抗体的亲和力。细胞ELISA实验步骤如实施例I-3所述，细胞选用经转染而稳定表达人Claudin18.2的L929-Claudin18.2(人)、HEK293T-Claudin18.2细胞(人)、NUGC4-Claudin18.2(人)细胞及内源性表达人Claudin18.2的NUGC4细胞。
1)对于L929-Claudin18.2和HEK293T-Claudin18.2两种细胞，实验结果如表4所示，2D3A11-HZ1、2D3A11-HZ2、25C7A5-HZ1和25C7A5-HZ2与两者均有较高亲和力。
表4抗Claudin18.2人源化抗体细胞ELISA亲和力
注：N＝2表示2次独立重复实验
2)对于NUGC4-Claudin18.2细胞，实验结果如表5以及图2A所示。25C7A5-HZ1与NUGC4-Claudin18.2结合EC50值为107.6ng/mL，IMAB362的EC50值为109.1ng/mL；25C7A5-HZ1与NUGC4-Claudin18.2结合最大信号值为1.284，明显高于IMAB362的最大信号值0.591，表明25C7A5-HZ1与NUGC4-Claudin18.2亲和力优于IMAB362。
3)对于NUGC4细胞，实验结果如表5及图2B所示。2D3A11-HZ1、25C7A5-HZ1、25C7A5-HZ2与NUGC4有较高亲和力，而IMAB362与NUGC4细胞亲和力较弱(未到达最大信号值)，表明2D3A11-HZ1、25C7A5-HZ1、25C7A5-HZ2与NUGC4亲和力优于IMAB362。
表5抗Claudin18.2人源化抗体细胞ELISA亲和力
实施例8抗人Claudin18.2人源化抗体的细胞FACS亲和力检测
通过流式细胞技术检测抗人Claudin18.2人源化抗体的亲和力。实验步骤如下：消化贴壁培养的HEK293T-Claudin18.2(人)、NUGC4-Claudin18.2(人)、NUGC4细胞，离心收集细胞，预冷PBS洗三次；用1％BSA(在PBS中)重悬细胞，在96孔尖底板中加入细胞，每孔加入3×10 5个细胞，体积为50μl；用1％BSA(在PBS中)稀释待测抗体，100μg/mL起始，3倍梯度稀释，10个浓度点；取梯度稀释的待测抗体以50μl/孔加入细胞中，混匀，4℃孵育1小时；离心收集细胞，预冷PBS洗三次，用50μl 1％BSA(在PBS中)重悬细胞，每孔加入1μl荧光二抗(Biolegend-410712)，混匀，4℃孵育0.5小时；离心收集细胞，预冷PBS洗三次，用200μl PBS重悬细胞，上机检测。
实验结果如图3A-3C及表6所示。对于HEK293T-Claudin18.2细胞(图3A)，2D3A11-HZ1、25C7A5-HZ1、25C7A5-HZ2与其均有较高亲和力；对于NUGC4-Claudin18.2细胞(图3B)，25C7A5-HZ1的亲和力EC50值为3192ng/mL，IMAB362为6668ng/mL，且25C7A5-HZ1最大信号值明显高于IMAB362，表明25C7A5-HZ1的亲和力优于IMAB362；对于NUGC4细胞(图3C)，25C7A5-HZ1与NUGC4有明显结合，而IMAB362与NUGC4结合极弱，也表明25C7A5-HZ1的亲和力优于IMAB362。
表6抗Claudin18.2人源化抗体细胞FACS亲和力
实施例9抗人Claudin18.2人源化单克隆抗体的种属亲和力评价
通过流式细胞技术(FACS)测定抗人Claudin18.2人源化单克隆抗体与不同种属Claudin18.2的亲和力。实验步骤如下：消化离心收集HEK293T-Claudin18.2(食蟹猴)细胞、HEK293T-Claudin18.2(小鼠)细胞及HEK293T-Claudin18.2(大鼠)细胞，预冷PBS洗三次，1％BSA(在PBS中)重悬细胞，每孔3×10 5个细胞铺至96孔尖底板中，加入梯度稀释抗体4℃孵育1h，预冷PBS洗三次后每孔加入1μl荧光二抗(APC：Biolegend-410712)，4℃孵育0.5h；预冷PBS洗三次后重悬细胞，流式细胞仪上机检测。
实验结果如图4A-4C及表7所示，2D3A11-HZ1、25C7A5-HZ1、25C7A5-HZ2以及IMAB362与食蟹猴Claudin18.2均具有较高的亲和力(图4A)；25C7A5-HZ1以及IMAB362与大鼠Claudin18.2(图4B)、小鼠Claudin18.2(图4C)也具有较好的种属结合。
表7抗Claudin18.2人源化抗体细胞FACS亲和力
实施例10抗人Claudin18.2人源化单克隆抗体的特异性评价
通过流式细胞技术(FACS)测定抗人Claudin18.2人源化单克隆抗体的特异性。实验步骤如下：消化离心收集HEK293T-Claudin18.1(人)细胞，预冷PBS洗三次，1％BSA(在PBS中)重悬细胞，每孔3×10 5个细胞铺至96孔尖底板中，加入终浓度为50μg/mL待检测抗体4℃孵育1h，预冷PBS洗三次后每孔加入1μl荧光二抗(APC：Biolegend-410712；或者PE：BioLegend-410708)，4℃孵育0.5h，预冷PBS洗三次后重悬 细胞，流式细胞仪上机检测。作为参照，在实验中包括抗人Claudin18.1阳性对照抗体，阳性对照抗体-1和阳性对照抗体-2。阳性对照抗体选用实施例I-3中与HEK293T-Claudin18.1(人)细胞有明显结合的抗体，抗体克隆编号分别为：13A6D2(阳性对照抗体-1)和15C12A2(阳性对照抗体-2)。
实验结果如表8所示，2D3A11-HZ1、2D3A11-HZ2、25C7A5-HZ1及25C7A5-HZ2均不会非特异识别人Claudin18.1。
表8抗Claudin18.2人源化抗体非特异性检测
抗体名称 中位APC荧光信号值 平均APC荧光信号值 阳性率(％)
2D3A11-HZ1 233 281 0.69
2D3A11-HZ2 329 382 1
阳性对照抗体-1 726 979 16.2
抗体名称 中位PE荧光信号值 平均PE荧光信号值 阳性率(％)
25C7A5-HZ1 504 583 0.54
25C7A5-HZ2 471 559 0.55
阳性对照抗体-2 1055 1231 6.78
阴性对照抗体(NC) 385 448 0.32
实施例11抗人Claudin18.2人源化单克隆抗体的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)活性评价
通过荧光素报告系统检测抗人Claudin18.2人源化单克隆抗体的ADCC活性。采用 Bio-Glory One-Step Firefly Luciferase Assay试剂盒(苏州瑞安，RA-GL04)，按照厂商说明书进行。实验步骤如下：消化离心收集HEK293T-Claudin18.2(人)细胞，用DMEM+1％FBS重悬细胞后每孔铺50000个细胞；离心收集Jurkat-NFAT-CD16a细胞，用1640+1％FBS重悬细胞后每孔铺100000个细胞；加入梯度稀释的待检测抗体37℃孵育5h；每孔加入50μl Bio-Glory One-Step荧光素酶底物，通过酶标仪(MD，SpectraMax i3x)读数。
实验结果如图5所示，2D3A11-HZ1、25C7A5-HZ1及25C7A5-HZ2均有较强的ADCC活性，其EC50分别为47.91ng/mL、46.49ng/mL和48.75ng/mL。
实施例12抗人Claudin18.2人源化单克隆抗体的补体依赖的细胞毒性(CDC)活性评价
通过豚鼠血清杀伤实验检测抗人Claudin18.2人源化单克隆抗体的CDC活性。实验步骤如下：消化离心收集HEK293T-Claudin18.2(人)细胞，每孔铺50000个细胞过夜；弃上清，每孔加入100μl经DMEM+20％豚鼠血清(北京博尔西，BM361Y)梯度稀释的待检测抗体，37℃孵育5h，每孔加入20μl CCK8试剂(苏州瑞安，QDY-003-D)，反应1-4小时，酶标仪450nm读数。
实验结果如图6所示，2D3A11-HZ1、25C7A5-HZ1及25C7A5-HZ2均有较强的CDC活性，其EC50分别为1904ng/mL、3137ng/mL和3283ng/mL。
实施例13抗人Claudin18.2人源化单克隆抗体的内吞活性评价
通过流式细胞技术(FACS)检测抗人Claudin18.2人源化单克隆抗体的内吞活性。实验步骤如下：消化离心收集HEK293T-Claudin18.2细胞，用浓度为10ug/mL的待检测抗体4℃孵育1小时，PBS洗3次，用DMEM+10％FBS重悬细胞，分成4份分别在37℃孵育0、1、2、4小时，PBS洗三次后加入1μl荧光二抗(Biolegend，410712)，4℃孵育0.5h，PBS洗三次后重悬细胞上机。按照以下公式计算内吞率：内吞率(％)＝【1-(该时间点检测样品平均荧光值-该时间点阴性对照样品平均荧光值)/(0小时检测样品平均荧光值-0小时阴性对照样品平均荧光值)】*100。阴性抗体为同型对照抗体。
实验结果显示，25C7A5-HZ1及25C7A5-HZ2均有内吞活性，两者在4小时的内吞率均在12％以上。
实施例14抗人Claudin18.2人源化抗体的加速稳定性检测
通过以下方法检测抗人Claudin18.2人源化单克隆抗体的加速稳定性：将待检测抗体超滤置换至PBS(PH＝7.4)中，浓度为4.7mg/Ml,过滤除菌，分别在37℃放置0、3、7、14天、或在-80℃反复冻融4次、8次，随后通过检测样品的SEC-HPLC纯度及CE-SDS纯度。以37℃放置0天为对照，检查抗体在加速稳定性试验中的稳定性变化。
SEC-HPLC检测方法如下：
仪器：Waters Alliance e2695HPLC；
色谱柱：Thermo MabPac SEC-1，5um，7.8*300mm；
流动相：61mmol/L Na2HPO4，39mmol/L NaH2PO4，200mmol/L NaCl，5％IPA；
仪器参数：样品室温度：8℃；柱温：30℃；流速：0.5ml/min；进样量：20μg；检测波长：280nm；等度运行：30min。
CE-SDS检测方法如下：采用超纯水将样品稀释至4mg/ml。取25μl于离心管中，加入75μl预混液(SDS Sample buffer+碘乙酰胺)，混匀，10000g离心1分钟。70℃处理5分钟。取出后，室温放冷，10000g离心1分钟，混匀后转移至进样瓶中。
采用SCIEX的PA800plus毛细管电泳仪，进行采用分析，仪器参数设定如下：
毛细管：30.2cm*50μm(裸管)，有效长度：20cm
毛细管柱温：25℃，样品盘温度：15℃
检测波长设置：220nm；采集频率：4Hz。
实验结果显示，本发明25C7A5人源化抗体在加速及反复冻融情况下拥有良好的稳定性，SEC纯度均在95％以上，CE-SDS非还原纯度在90％以上，CE-SDS还原纯度在95％以上。
实施例15抗人Claudin18.2人源化抗体的大鼠体内药代检测
按照如下方式检查抗人Claudin18.2人源化抗体在体内的代谢情况。将待检测样品，人源化抗体以及IMAB362抗体，通过尾静脉注射给予雄性大鼠(成都达硕)，每组3只，给药剂量为10mg/kg；给药后采集30min、1h、2h、6h、24h、48h、96h、168h血清样品。通过L929-Claudin18.2细胞ELISA(方法如实施例3中所述)检测血药浓度。结果显示，本发明25C7A5的人源化抗体与参照抗体IMAB362具有相当的大鼠体内半衰期。
实施例II抗体-偶联药物的制备和表征
实施例1抗体偶联药物(ADC)的制备
实施例1.1：在“药物-连接体化合物”合成中使用的中间体的合成
实施例1.1.1：(S)-7-乙基-7-羟基-14-(3-羟基丙基)-10,13-二氢-11H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮(A1)的合成
步骤一：(S)-7-乙基-7-羟基-14-(3-氯丙基)-10,13-二氢-11H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7] 吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮(A1B)的合成
冰浴条件下，向化合物(S)-7-乙基-7-羟基-10,13-二氢-11H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮(A1A，Cas No.：151636-76-9，500mg)的75％硫酸溶液(5mL)中，加入七水合硫酸亚铁(570mg七水合硫酸亚铁溶于1mL水中)和4,4-二甲氧基氯丁烷(3.89g)，反应液搅拌三分钟后滴加双氧水(29％，2.5mL)。反应液在0℃下搅拌反应5分钟后升至室温，并搅拌反应3小时。反应液加入水(50mL)稀释，乙酸乙酯(80mL×2)萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗产品。粗产品用C18柱(乙腈/0.05％甲酸的水溶液：5％-60％)进一步纯化，得到目标化合物A1B(黄色固体，400mg，收率：67％)。
LCMS(ESI)[M+H] +：468.9；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.65(s,1H),7.51(s,1H),7.24(s,1H),6.50(s,1H),6.30(s,2H),5.42(s,2H),5.26(s,2H),3.81(d,J＝5.9Hz,2H),3.22(s,2H),1.98(d,J＝6.7Hz,4H),0.88(t,J＝7.2Hz,3H)。
步骤二：(S)-7-乙基-7-羟基-14-(3-羟基丙基)-10,13-二氢-11H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮(A1)的合成
将化合物(S)-7-乙基-7-羟基-14-(3-氯丙基)-10,13-二氢-11H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮(100mg，0.213mmol)溶于10％硫酸(5mL)溶液中，反应在110℃下反应48小时。向反应液中加入饱和碳酸氢钠(30mL)溶液，用二氯甲烷(10mL×5)萃取，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩得到粗产品。经高效液相制备纯化(乙腈/水含0.05％甲酸)，得到(S)-7-乙基-7-羟基-14-(3-羟基丙基)-10,13-二氢-11H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮(A1，1.78mg)。
LCMS(ESI)[M+H] +：451.0；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.63(s,1H),7.50(s,1H),7.24(s,1H),6.48(s,1H),6.28(s,2H),5.47–5.37(m,2H),5.32–5.19(m,2H),3.51–3.46(m,2H),3.17–3.13(m,2H),1.92–1.76(m,4H),0.90–0.84(m,3H)。
实施例1.1.2：(S)-2-氨基-N-((3-(7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氢-10H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)丙氧基)甲基)乙酰胺(B1)的合成
步骤一：化合物(B1A)(Cas No.：1599440-06-8，368mg)、化合物(A1)(440mg)和对甲苯磺酸吡啶盐(PPTS)(25mg)在二氯甲烷(20ml)中回流20小时，然后用碳酸氢钠水溶液和盐酸水溶液分别洗涤，减压除去有机溶剂，得到粗产物。粗产品经柱层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝10/1)，得到目标化合物B1B(240mg)。
LCMS(ESI)[M+H] +：759.5。
步骤二：B1B(240mg)溶于DMF(5ml)，加入哌啶(1ml)，化合物搅拌20分钟，溶液减压除去低 沸点组分，残留物直接用于下步合成。少量粗产物经反相色谱(乙腈/0.05％FA的水溶液:5％到50％)纯化后得目标化合物B1。
ESI-MS(m/z):537.4[M+H] +；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.13(t,1H),8.04(br,2H),7.58(s,1H),7.51(s,1H),7.25(s,1H),6.29(s,2H),5.43(S,2H),5.21(s,2H),4.65(d,2H),3.63(m,2H),3.53(m,2H),3.11(m,2H),1.87(m,4H),0.88(t,3H)。
实施例1.1.3：N 6,N 6-二甲基-N 2-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰基)-L-缬氨酸)-L-赖氨酸(C1)
将6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸(268mg，Cas No.2356229-58-6)、化合物C1A(328mg)、三乙胺(322mg)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)。然后再加入1-羟基苯并三唑(HOBT，162mg)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，229mg),反应液室温搅拌16小时。反应液直接经过C18柱反相(乙腈和0.05％的甲酸水溶液体系)提纯，得到目标化合物N 6,N 6-二甲基-N 2-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰基)-L-缬氨酸)-L-赖氨酸(C1，白色固体，327mg)。
LCMS(ESI)[M+H] +：524.4。
1H NMR(400MHz,)δ9.13(s,2H),7.95(t,J＝8.8Hz,2H),4.21(dd,J＝8.8,6.9Hz,1H),4.08–4.03(m,1H),3.41(s,3H),2.55(t,J＝7.0Hz,2H),2.42–2.32(m,4H),2.27(s,6H),1.98(dd,J＝13.6,6.8Hz,1H),1.86–1.77(m,2H),1.74–1.55(m,2H),1.47–1.37(m,2H),1.31–1.23(m,2H),0.85(dd,J＝12.8,6.8Hz,6H)。
实施例1.1.4：N 6,N 6-二乙基-N 2-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰基)-L-缬氨酸)-L-赖氨酸(C2)
步骤一：
将化合物C2A(5.0g,12.05mmol，Cas No.：1872-06-8)溶在二氯甲烷(100mL)中，向反应液中加 入乙醛(3.2g,72.3mmol)，室温下搅拌反应10分钟，再向反应液中加入三乙酰氧基硼氢化钠(12.8g,60.25mmol)，反应在室温下搅拌反应1小时。LCMS显示反应完全。向反应液中加入氯化铵饱和水溶液搅拌一个小时，旋干，过滤后滤液用C18柱反向分离纯化(乙腈比0.05％的甲酸水溶液:5％到55％)，得到目标化合物C2B(4.57g,收率82.0％)为白色固体。
LCMS(ESI)[M+H] +＝436.4；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.70(d,J＝7.0Hz,1H),7.41(d,J＝9.0Hz,1H),7.38–7.26(m,5H),5.08–4.99(m,2H),4.00(dd,J＝12.6,6.5Hz,1H),3.86(dd,J＝8.6,6.8Hz,1H),2.74(dd,J＝14.0,6.9Hz,4H),2.64–2.54(m,2H),2.05–1.94(m,1H),1.72–1.52(m,2H),1.52–1.38(m,2H),1.38–1.18(m,2H),1.04(t,J＝7.1Hz,6H),0.87–0.81(m,6H)。
步骤二：
室温下，将化合物C2B(1.6g，3.68mmol)溶于甲醇(80mL)中，然后向反应液中加入Pd/C(0.16g)，氢气下室温下搅拌反应12小时。LCMS显示反应完成。将反应液过滤，滤液减压浓缩得到目标化合物C2C(900mg,收率82％)，为米白色固体。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(br s,1H),4.02–3.99(m,1H),3.10(d,J＝4.5Hz,1H),2.65(q,J＝7.1Hz,4H),2.55–2.51(m,2H),2.06–1.93(m,1H),1.73–1.54(m,2H),1.47–1.38(m,2H),1.30–1.21(m,2H),1.01(t,J＝7.1Hz,6H),0.89(d,J＝6.9Hz,3H),0.79(d,J＝6.8Hz,3H)。
步骤三：
将化合物6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸(268mg,1mmol)溶于DMF(8mL)中，依次加入HATU(380mg,1mmol)和三乙胺(322mg,2.5mmol)，室温搅拌20分钟后加入化合物C2C(301mg,1mmol)，室温继续搅拌30分钟。LCMS检测反应完成后，反应液直接经过C18柱反相(乙腈和0.05％的甲酸水溶液体系)提纯得到目标化合物C2(280mg，收率51％)，为白色固体。
LCMS(ESI)[M+H] +＝552.3；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.13(s,2H),7.95(d,J＝8.9Hz,1H),7.86(d,J＝7.2Hz,1H),4.18(dd,J＝8.8,6.8Hz,1H),4.02(dd,J＝12.8,7.2Hz,1H),3.41(s,3H),2.74–2.69(m,4H),2.62–2.52(m,4H),2.44–2.29(m,2H),2.04–1.94(m,1H),1.86–1.77(m,2H),1.72–1.54(m,2H),1.51–1.39(m,2H),1.33–1.23(m,2H),1.02(t,J＝7.2Hz,6H),0.87–0.82(m,6H)。
实施例1.1.5：N 6,N 6-二正丙基-N 2-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰基)-L-缬氨酸)-L-赖氨酸(C3)
步骤一：
将化合物C2A(5.0g，12mmol)溶在二氯甲烷(100mL)中，向反应液中加入正丙醛(4.2g，72.3mmol)，室温下搅拌反应10分钟，再向反应液中加入三乙酰氧基硼氢化钠(12.8g，60.25mmol)，反应在室温下搅拌反应1小时。LCMS显示反应完全。向反应液中加入氯化铵饱和水溶液搅拌一个小时，旋干，过滤后滤液用C18柱反向分离纯化(乙腈比0.05％的甲酸水溶液:5％到55％)得到目标化合物C3A(4.57g,收率82.0％)，为白色固体。
LCMS(ESI)[M+H] +＝464.0；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.81(d,J＝7.3Hz,1H),7.38–7.28(m,5H),5.04(d,J＝1.7Hz,2H),4.12–4.02(m,1H),3.94–3.82(m,1H),2.65–2.52(m,6H),2.06–1.94(m,1H),1.76–1.64(m,1H),1.64–1.53(m,1H),1.52–1.40(m,6H),1.34–1.18(m,2H),0.92–0.80(m,12H)。
步骤二：
室温下，将化合物C3A(2.0g，4.32mmol)溶于甲醇(80mL)中，然后向反应液中加入Pd/C(0.16g)，氢气下室温下搅拌反应12小时。LCMS显示反应完成。将反应液过滤，滤液减压浓缩得到目标化合物C3B(1.2g,收率85.5％)，为白色固体。
步骤三：
将化合物6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸(100mg,0.373mmol)，溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL),然后加入HATU(142mg,0.373mmol)和N,N-二异丙基乙胺(120mg,0.93mmol)，该体系搅拌30分钟，然后加入化合物C3B(122mg，0.371mmol)，反应液室温搅拌1小时。LCMS检测反应完成后，反应液直接经过C18柱反相(乙腈和0.05％的甲酸水溶液体系)提纯得到目标化合物N 6,N 6-二正丙基-N 2-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰基)-L-缬氨酸)-L-赖氨酸(C3，50mg，收率28％)，为淡黄色固体。
LCMS(ESI)[M+H] +＝580.0；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.24(s,2H),7.98–7.93(m,2H),4.24–4.16(m,1H),4.10(d,J＝5.2Hz,1H),3.41(s,3H),2.79–2.64(m,6H),2.55(t,J＝7.1Hz,2H),2.45–2.26(m,2H),2.06–1.91(m,1H),1.89–1.78(m,2H),1.76–1.66(m,1H),1.64–1.57(m,1H),1.57–1.42(m,6H),1.37–1.24(m,2H),0.93–0.78(m,12H)。
实施例1.2药物-连接体化合物的合成
实施例1.2.1：N-((11S,14S)-11-(4-(二正丙基氨基)丁基)-1-((S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氢-10H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧杂-6,9,12-三氮杂十六烷-14-基)-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰胺(DL-01)
将化合物C3(43mg,0.074mmol)、化合物B1(40mg，0.075mmol)，溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)，然后依次加入HBTU(28mg,0.075mmol)和N,N-二异丙基乙胺(24mg,0.187mmol)，反应液室温搅拌1小时。LCMS检测反应完成后，反应液直接经制备色谱(0.01％三氟乙酸水溶液,乙腈)纯化得到目标化合物 (DL-01，8.5mg,收率10％)，为黄色固体。
LCMS(ESI)[M+H] +＝1098.6；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.10(s,2H),9.03(s,1H),8.64(t,J＝6.4Hz,1H),8.19(t,J＝5.9Hz,1H),8.08(d,J＝7.4Hz,1H),7.92(d,J＝8.5Hz,1H),7.59(s,1H),7.51(s,1H),7.24(s,1H),6.49(s,1H),6.29(s,2H),5.42(s,2H),5.24(s,2H),4.66–4.52(m,2H),4.31–4.21(m,1H),4.19–4.10(m,1H),3.74(d,J＝5.5Hz,2H),3.49–3.48(m,2H),3.40(s,3H),3.15–3.06(m,2H),3.02–2.95(m,6H),2.59–2.52(m,3H),2.41–2.29(m,2H),2.05–1.90(m,2H),1.91–1.77(m,6H),1.63–1.57(m,6H),1.31–1.29(m,2H),0.92–0.80(m,15H)。
实施例1.2.2：N-((11S,14S)-11-(4-(二乙基氨基)丁基)-1-((S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氢-10H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧杂-6,9,12-三氮杂十六烷-14-基)-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰胺(DL-02)
将化合物C2(40mg,0.075mmol)、化合物B1(41mg,0.075mmol)溶于DMF(1mL)，然后再加入HOBt(15.2mg,0.113mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(21.5mg,0.113mmol)，然后再加入三乙胺(23mg,0.225mmol)，加完后反应液室温搅拌16小时。LCMS检测反应完成后，将反应液浓缩得粗产品。粗产品经制备色谱(0.01％TFA水溶液,乙腈)纯化得到目标化合物(DL-02,16mg,收率20％)，为黄色固体。
LCMS(ESI)[M+H] +＝1070.6；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.13–9.08(m,2H),9.01(s,1H),8.64(t,J＝6.5Hz,1H),8.20(t,J＝5.7Hz,1H),8.09(d,J＝7.4Hz,1H),7.92(d,J＝8.4Hz,1H),7.59(s,1H),7.51(s,1H),7.24(s,1H),6.50(s,1H),6.29(s,2H),5.43(s,2H),5.24(s,2H),4.65–4.53(m,2H),4.26(d,J＝6.5Hz,1H),4.20–4.10(m,1H),3.74(d,J＝5.5Hz,2H),3.50(t,J＝5.8Hz,2H),3.41(s,3H),3.14–3.07(m,6H),2.98(s,2H),2.55(d,J＝7.3Hz,2H),2.41–2.29(m,2H),2.03–1.89(m,2H),1.89–1.77(m,7H),1.61–1.56(m,2H),1.32(s,2H),1.16(t,J＝7.2Hz,6H),0.91–0.78(m,9H)。
实施例1.2.3：N-((11S,14S)-11-(4-(二甲基氨基)丁基)-1-((S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氢-10H-[1,3]二氧杂环戊烷并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧杂-6,9,12-三氮杂十六烷-14-基)-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰胺(DL-03)
将化合物B1(100mg,0.186mmol)和化合物N 6,N 6-二甲基-N 2-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰基)- L-缬氨酸)-L-赖氨酸(C1，100mg，0.191mmol)溶于DMF(2mL)。然后再加入1-羟基苯并三唑(38mg,0.280mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(53mg,0.280mmol),然后再加入三乙胺(56mg,0.559mmol)，加完后反应液室温搅拌16小时。LCMS检测反应完成后，将反应液经制备色谱(0.01％TFA水溶液,乙腈)纯化得到目标化合物(DL-03，20mg,收率10％)，为黄色固体。
LCMS(ESI)[M+H] +＝1042.5；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.28(s,1H,TFA),9.10(s,2H),8.64(br s,1H),8.19(br s,1H),8.09(d,J＝6.4Hz,1H),7.92(d,J＝7.8Hz,1H),7.59(s,1H),7.51(s,1H),7.24(s,1H),6.50(s,1H),6.29(s,2H),5.43(s,2H),5.24(s,2H),4.67–4.52(m,2H),4.30–4.10(m,2H),3.74(br s,2H),3.50(br s,2H),3.41(s,3H),3.17–3.07(m,2H),3.04–2.91(m,2H),2.75(s,6H),2.46–2.24(m,3H),2.04–1.66(m,9H),1.63–1.46(m,3H),1.32–1.29(m,2H),0.87–0.82(m,9H)。
实施例1.3抗CLDN18.2抗体-药物偶联物的制备
Ab为抗体。
1.3.1 CLDN18.2-ADC(DAR8)样品制备
将抗CLDN18.2抗体30mg，用稀释液(20mM PB，pH 7.5)稀释，加入终浓度为5mM的依地酸钠溶液，混匀；加入抗体6.0倍当量的TCEP溶液，混匀，室温放置60分钟；向上述溶液体系加入抗体12倍当量的溶解于二甲基亚砜中的DL-01，混匀，室温静置1小时，得到偶联后样品，反应结束后使用30KDa的超滤管将样品置换到pH为5.5的10mM组氨酸缓冲液中并去除低分子物质，最后将样品浓缩以获得含有抗CLDN18.2抗体-ADC组合物的溶液CLDN18.2-ADC(DAR8)。利用实施例3.4的质谱法测定DAR值为8.0。
1.3.2 CLDN18.2-ADC(DAR2)样品制备
将抗CLDN18.2抗体30mg，用稀释液(20mM PB，pH 7.5)稀释，加入终浓度为5mM的依地酸钠溶液，混匀；加入抗体6.0倍当量的TCEP溶液，混匀，室温放置60分钟；向上述溶液体系加入抗体2.5倍当量的溶解于二甲基亚砜中的DL-01，混匀，室温静置1小时，得到偶联后样品，反应结束后使用30KDa的超滤管将样品置换到pH为5.5的10mM组氨酸缓冲液中并去除低分子物质，最后将样品浓缩以获得含有抗CLDN18.2抗体-ADC组合物的溶液CLDN18.2-ADC(DAR2)。质谱法测定DAR值为1.7。
1.3.3 CLDN18.2-ADC(DAR4)样品制备
将抗CLDN18.2抗体30mg，用稀释液(20mM PB，pH 7.5)稀释，加入终浓度为5mM的依地酸钠溶液，混匀；加入抗体6.0倍当量的TCEP溶液，混匀，室温放置60分钟；向上述溶液体系加入抗体4.5倍当量的溶解于二甲基亚砜中的DL-01，混匀，室温静置1小时，得到偶联后样品，反应结束后使用30KDa的超滤管将样品置换到pH为5.5的10mM组氨酸缓冲液中并去除低分子物质，最后将样品浓缩以获得含有抗CLDN18.2抗体-ADC组合物的溶液CLDN18.2-ADC(DAR4)。质谱法测定DAR值为4.0。
1.3.4 CLDN18.2-ADC(DAR6)样品制备
将抗CLDN18.2抗体30mg，用稀释液(20mM PB，pH 7.5)稀释，加入终浓度为5mM的依地酸钠溶液，混匀；加入抗体6.0倍当量的TCEP溶液，混匀，室温放置60分钟；向上述溶液体系加入抗体7.0倍当量的溶解于二甲基亚砜中的DL-01，混匀，室温静置1小时，得到偶联后样品，反应结束后使用30KDa的超滤管将样品置换到pH为5.5的10mM组氨酸缓冲液中并去除低分子物质，最后将样品浓缩以获得含有抗CLDN18.2抗体-ADC组合物的溶液CLDN18.2-ADC-07(DAR6)。质谱法测定DAR值为5.6。
实施例1.4采用质谱法进行偶联后样品的DAR值测定
对CLDN18.2-ADC-07(DAR8)进行LC-MS分子量和DAR值分析，条件如下：
色谱条件：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH200 SEC 1.7μm,4.6×150mm
流动相A：0.1％FA/H 2O；流动相B：0.1％FA/ACN
柱温：30℃
样品室温度：8℃
流速：0.3ml/min
进样量：1μl
时间(min) 1 5 7 7.1 10
流动相A 90 40 10 90 90
流动相B 10 80 80 10 10
样品处理：分别取样品50μg，加入1M DTT 2μl，加超纯水至50μl稀释至约1.0mg/ml浓度，混匀，室温还原30min。
LC/MS型号：AB SCIEX X500 Q-TOF
质谱条件：Gas1:45；Gas2:45；CUR：30；TEM：450；ISVF：5000；DP：120；CE：12；质量数范围：600-4000
结果如下表9所示：
表9：理论分子量及实测分子量
表9中，mAb表示未偶联的单克隆抗体；LC代表抗体轻链；HC代表抗体重链；DAR1代表包含轻链或重链偶联1个毒素分子的偶联物；DAR2代表包含轻链或重链偶联2个毒素分子的偶联物；DAR3代表包含轻链或重链偶联3个毒素分子的偶联物；其中，单抗理论分子量以G0F糖型计算。下文中mAb、LC、HC、DAR1、DAR2、DAR3如上说明。
检测结果显示，CLDN18.2-ADC(DAR8)上抗体轻链偶联0～1个毒素分子(LC，DAR1比例分别为 0％，100％)、重链偶联0～3个毒素分子(mAb、DAR1、DAR2、DAR3的比例分别为0％，0％，0％，100％)，由此计算CLDN18.2-ADC(DAR8)的药物抗体偶联比(DAR值)为8.0。
类似地，可以利用质谱法测得其他偶联后样品的的药物抗体偶联比(DAR值)。
实施例2抗Claudin18.2抗体ADC偶联及评价
实施例2.1抗Claudin18.2抗体ADC偶联
按照与实施例1所述的ADC制备方法，使用25C7A5-HZ1、25C7A5-HZ2和同种型对照IgG抗体，构建ADC。
1)抗体预处理：按照抗体体积的1％加入0.1M EDTA母液，然后用1M磷酸氢二钠母液调节样品pH为7.7±0.2。
2)配制TCEP母液：称量一定质量的TCEP-HCL，加入80％的TCEP溶剂，随后使用0.5M氢氧化钠调节pH至7.7±0.2，最后用TCEP溶剂定容，使TCEP浓度为20mM。
3)还原：将预处理抗体按照1：4.4(抗体：TCEP摩尔比)加入TCEP母液，混匀室温反应0.5h。
4)偶联：在还原后的抗体中按照1:12(抗体：毒素摩尔比)加入毒素连接子，混匀室温反应≥2h。
5)超滤：使用超滤管将反应液置换至超滤缓冲液(10mM Hcl-His，PH 5.5)中(浓缩后每次加入4倍体积以上的缓冲液，换液3次以上)，然后用少量buffer润洗超滤膜回收样品。
偶联后样品检测浓度、纯度、DAR。结果如表10所示，抗体与ADC偶联后未发现明显聚集，SEC-HPLC测定的纯度高于98％。
表10.抗Claudin18.2人源化抗体ADC检测结果
No.* 样品名 SEC(％) DAR
1 25C7A5-HZ1-B82 98.85 6.82
2 25C7A5-HZ2-B82 99.34 7.10
3 IgG-B81 98.4 8.00
4 25C7A5-HZ1-B81 98.4 7.97
*：样品1-2和样品3-4为分别制备的两批制备物。
实施例2.2抗Claudin18.2人源化抗体及ADC亲和力检测
按照与实施例2.2所述相似的方法，检测抗体在偶联毒素前后的细胞结合亲和力。胰酶消化离心收集L929-claudin 18.2(人)或NUGC4细胞，预冷PBS洗三次，重悬细胞，每孔5×10 4个细胞铺至96孔板中过夜，4％多聚甲醛固定细胞，2％BSA(在PBS中)37℃封闭2小时，加入梯度稀释的ADC药物或抗体，37℃孵育2小时，加入HRP标记的抗人二抗(Jackson，109-035-088)，37℃孵育1小时，加入TMB底物显色，用2M HCl终止后，酶标仪读取450nM吸光值。
实验结果如图8A和8B所示，25C7A5-HZ1、25C7A5-HZ2在偶联前后对细胞的亲和力无明显变化。
实施例2.3 ADC体外杀伤活性检测
胰酶消化收集HEK293T-claudin 18.2(人)、HEK293T-claudin 18.1(人)细胞、和NUGC4-Claudin18.2细胞，用DEME+2％FBS重悬细胞，每孔铺10000个细胞；用DEME+2％FBS梯度稀释待测抗体ADC药物加入板中，37℃孵育72小时；孵育完成后，加入CCK8试剂，20uL/孔，反应2-4小时，酶标仪450nm 读数并导入Graphpad Prism进行曲线拟合。
实验结果图9A-9E所示，25C7A5-HZ1、25C7A5-HZ2偶联后形成的ADC均能够有效杀伤HEK293T-claudin18.2细胞以及NUGC-4-Claudin18.2细胞；同时25C7A5-HZ1、25C7A5-HZ2偶联后基本不杀伤HEK293T-claudin18.1细胞，表明偶联后的ADC不会非特异识别claudin18.1且稳定性较好。
实施例2.4 ADC体内药效
为验证抗Claudin18.2人源化ADC药物的体内药效，评价受试药物在人胃癌细胞NUGC-4(南京科佰)皮下异种移植雌性Balb/c Nude小鼠模型中的抗肿瘤作用。
购买5-6周龄的雌性Balb/c Nude小鼠(维通利华)。将生长至对数生长期的NUGC4细胞采用EDTA消化及PBS重悬，每只小鼠皮下接种5*10 6细胞。待肿瘤生长至100-200m 3大小，采用静脉给药，每周一次，每次10mg/kg，给药ADC药物，具体方案如下表7。本实验的主要观察指标为：1)相对肿瘤增殖率，T/C(％)，即在某一时间点，治疗组和对照组相对肿瘤体积或瘤重的百分比值。计算公式为：T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：治疗组平均RTV；CRTV：对照组平均RTV；RTV＝Vt/V0，V0为分组时该动物的瘤体积，Vt为治疗后该动物的瘤体积)；或T/C％＝TTW/CTW×100％(TTW：治疗组实验终结时平均瘤重；CTW：对照组实验终结时平均瘤重)。2)相对肿瘤抑制率，TGI(％)，计算公式为：TGI(％)＝(1-T/C)×100％(T和C分别为治疗组和对照组在某一特定时间点的相对肿瘤体积(RTV)或瘤重(TW))。3)试验终点肿瘤体积大小照片、肿瘤重量。4)ADC药物对小鼠体重的影响。
表11.抗Claudin18.2人源化抗体ADC体内药效实验方案
实验结果如图10和图11表明：25C7A5-hz1-B81在NUGC-4CDX模型中有显著的药效(图10)；而且整体小鼠耐受性良好，无不良反应(图11)。
序列表：

Claims (28)

  1. 具有下式(I)的抗体-药物偶联物(ADC)或其可药用盐或溶剂化物：
    Ab-[L-D] q (I)
    其中，
    Ab表示抗Claudin18.2抗体，
    L表示连接体，
    D表示细胞毒性或细胞抑制性药物，例如，拓扑异构酶I抑制剂，且
    q＝1-20，例如，q＝1-10、1-8、2-8、4-8、或6-8，
    其中，所述Ab包含SEQ ID NO:1或3的重链可变区(VH)序列的三个CDR和SEQ ID NO:2的轻链可变区(VL)序列的三个CDR，优选地，其中所述CDR根据Kabat或IMGT或其组合进行定义。
  2. 根据权利要求1的抗体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂化物，其中，所述Ab包含3个重链互补决定区(HCDR)以及3个轻链互补决定区(LCDR)，其中：
    (i)根据IMGT定义，HCDR1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成，HCDR2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由其组成，HCDR3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由其组成，LCDR1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成，且LCDR3包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由其组成；或者
    (ii)根据Kabat定义，HCDR1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由其组成，HCDR2包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列或由其组成，HCDR3包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由其组成，LCDR1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由其组成，且LCDR3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由其组成。
  3. 根据权利要求1-2任一项的抗体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂化物，其中，所述Ab包含：
    -SEQ ID NO:1或3的重链可变区序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或
    -SEQ ID NO:2的轻链可变区序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，
    优选地，所述Ab为IgG1抗体。
  4. 根据权利要求1-3任一项的抗体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂化物，其中，D表示喜树碱类药物，优选地，FL118或其衍生物，例如，包含以下结构的喜树碱类药物：
    其中，R a选自：
    氢；
    C 3-C 8环烷基；
    苯基；
    任选被选自以下的取代基取代的C 1-C 8烷基：卤素、羟基、任选地被NH 2、NH(C 1-C 4烷基)和N(C 1-C 4烷基) 2取代的C 1-C 4烷氧基、C 3-C 8环烷基、杂环烷基、苯基、NR 1R 2，
    其中R 1和R 2彼此独立地选自
    氢；
    任选地被选自以下的取代基取代的C 1-C 8烷基：羟基、氨基、被一个或两个C 1-C 4烷基取代的氨基、被一个或两个C 1-C 4羟烷基取代的氨基、被(C 1-C 4羟烷基)和(C 1-C 4烷基)取代的氨基；
    被1或2个C 3-C 10环烷基、C 3-C 10杂环烷基、苯基或杂芳基取代的C 1-C 4烷基；
    C 3-C 10环烷基；
    C 3-C 10杂环烷基
    C 2-C 6杂烷基；
    杂芳基；
    任选卤代的苯基；
    任选被羟基或氨基取代的C 1-C 8烷基-C(＝O)-；
    或者，R 1和R 2与各自连接的氮原子组合形成具有0至3个取代基的5-、6-或7-元杂环，所述取代基选自卤素、C 1-C 4烷基、OH、C 1-C 4烷氧基、NH 2、NH(C 1-C 4烷基)和N(C 1-C 4烷基) 2，
    其中环烷基、杂环烷基、苯基、杂芳基在每次出现时各自独立地任选被0-3个选自以下的取代基取代：OH、C 1-C 4烷基、C 1-C 4烷氧基、NH 2、NH(C 1-C 4烷基)和N(C 1-C 4烷基) 2取代，
    优选地，R a为-C 1-C 4烷基-OH、-C 1-C 4烷基-O-C 1-C 4烷基-NH 2、或-C 1-C 4烷基-NH 2，
    其中，优选地，所述药物D单元通过其上存在的羟基或氨基基团，与连接体L单元连接。
  5. 根据权利要求1-3任一项的抗体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂化物，其中，式(I)中的L-D单元包含以下结构：
    优选地，式(I)中的L-D单元包含以下结构：
  6. 根据权利要求1-5任一项的抗体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂化物，其中，L为含肽连接体，并包含以下式(II)的结构：
    -Z-Y-M-，
    其中
    Z为与Ab连接的连接基，
    Y是2-5个氨基酸的肽，优选二肽、三肽或四肽，
    M不存在，或是用于与药物D连接的间隔基。
  7. 根据权利要求6的抗体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂化物，其中，Y为从N端到C端具有下式氨基酸序列的肽；
    Xaa 1-Xaa 2-Xaa 3-Xaa 4-Xaa 5，
    其中Xaa 1不存在，或为选自缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸的氨基酸；
    Xaa 2为选自苯丙氨酸、亮氨酸、和缬氨酸的氨基酸，优选缬氨酸；
    Xaa 3为未取代的或取代的赖氨酸；
    Xaa 4为选自亮氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸；
    Xaa 5不存在，或为选自甘氨酸和丙氨酸的氨基酸；
    其中，所述氨基酸序列的N端与Z连接，且C端与M连接(如果M存在的话)或直接与药物D连接，
    优选地，Xaa 3为ε-氨基被C 1-C 3烷基单取代或二取代的赖氨酸，
    再优选地，Y为选自以下的肽：Phe-Lys-Gly、Leu-lys-Gly、Gly-Val-Lys-Gly、Val-Lys-Gly-Gly、Val-Lys-Gly、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Leu，其中Lys残基为未取代的或被C 1-C 3烷基单取代或二取代的赖氨酸。
  8. 根据权利要求6-7任一项的抗体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂化物，其中，Y为
    其中，R 3和R 4各自独立地选自甲基、乙基和丙基，
    优选地，R 3和R 4相同，更优选地，R 3和R 4各自独立地为丙基，
    其中，左侧波浪线表示与Z连接的位置；右侧波浪线表示与M连接的位置。
  9. 根据权利要求6-8的抗体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂化物，其中，Z具有以下结构：
    -Z 1-Z 2-Z 3-Z 4-，
    其中Z 1为Ab中的硫原子，
    Z 2为5-10元杂环基，优选地含1或2个选自N,S和O的杂原子；
    Z 3选自键、-C(＝O)-、-C 1-C 10亚烷基-C(＝O)-、-C 3-C 10亚炔基-C(＝O)-、-C 3-C 10亚烯基-C(＝O)-、-C 1-C 10亚杂烷基-C(＝O)-、-C 3-C 8亚环烷基-C(＝O)-、-O-C 1-C 8亚烷基-C(＝O)-、-亚芳基-C(＝O)-、-C 1-C 10亚烷基-亚芳基-C(＝O)-、-亚芳基-C 1-C 10亚烷基-C(＝O)-、-C 1-C 10亚烷基-C 3-C 8亚环烷基-C(＝O)-、- C 3-C 8亚环烷基-C 1-C 10亚烷基-C(＝O)-、-C 3-C 8亚杂环基-C(＝O)-、-C 1-C 10亚烷基-C 3-C 8亚杂环基-C(＝O)-、-C 3-C 8亚杂环基-C 1-C 10亚烷基-C(＝O)-，
    Z 4是键或是下式表示的PEG单元，
    其中，R 5选自C 1-4亚烷基、-NH-、-NH-C 1-4亚烷基-杂芳基-，其中杂芳基为5元或6元的含氮杂芳基，优选三唑基；R 6为-C(＝O)-、C 1-4亚烷基、C 1-4亚烷基-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-(CH 2OCH 2)-C(＝O)-、C 1-4亚烷基-NH-C(＝O)-(CH 2OCH 2)-C(＝O)-，其中m为2-12的整数，例如m＝2,4,6,或8，
    优选地，Z具有以下结构：
    其中,R b是亚炔基-C(＝O)-或亚烯基-C-(＝O)-、
    优选地，R b是
    其中，左侧波浪线表示与抗体(Ab)连接的位置；右侧波浪线表示与Y连接的位置；
    更优选地，Z具有结构：
  10. 根据权利要求6-9的抗体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂化物，其中，M不存在、或是氨基-C 1-C 3亚烷基，例如，-NH-CH 2-，或氨基-苯基-C 1-C 3亚烷基-O-C(＝O)-，优选地M为：
    其中左侧波浪线表示与Y连接，右侧波浪线表示与药物D单元连接。
  11. 根据权利要求6-10的抗体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂化物，其中，L为包含如下结构的连接体：
    其中，R 3和R 4各自独立地选自甲基、乙基、丙基。
  12. 根据权利要求11的抗体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂化物，其中，R 3和R 4均为甲基；或R 3和R 4均为乙基；或R 3和R 4均为丙基。
  13. 权利要求1的抗体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂化物，其中，所述式I的L-D单元通过与Ab的轻链和/或重链的半胱氨酸的巯基形成硫醚键，从而与抗体连接。
  14. 根据权利要求1的抗体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂化物，其中，所述ADC选自：
    其中，q为1-8的平均DAR值，优选地，q为大约2，大约4，大约6，大约7或大约8。
  15. 药物组合物，其包含前述权利要求1-14任一项的抗体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂化物以及任选地药用辅料。
  16. 结合CLAUDIN 18.2的抗体或其抗原结合片段，其包含
    (i)如SEQ ID NO:1或3所示的重链可变区的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区的LCDR1、2和3序列，或者
    (ii)如SEQ ID NO:21所示的重链可变区的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:22所示的轻链可变区的LCDR1、2和3序列，或者
    (iii)如SEQ ID NO:23所示的重链可变区的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:24所示的轻链可变区的LCDR1、2和3序列，或者
    (iv)如SEQ ID NO:38或40所示的重链可变区的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:39所示的轻链可变区的LCDR1、2和3序列，或者
    (v)如SEQ ID NO:44所示的重链可变区的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:45所示的轻链可变区的LCDR1、2和3序列，或者
    (vi)如SEQ ID NO:46所示的重链可变区的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:47所示的轻链可变区的LCDR1、2和3序列，或者
    (vii)如SEQ ID NO:48所示的重链可变区的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:49所示的轻链可变区的LCDR1、2和3序列，或者
    (viii)如SEQ ID NO:50所示的重链可变区的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:51所示的轻链可变区的LCDR1、2和3序列，或者
    (ix)如SEQ ID NO:52所示的重链可变区的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:53所示的轻链可变区的LCDR1、2和3序列，
    优选地，其中所述CDR根据Kabat或IMGT或其组合进行定义。
  17. 权利要求16的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
    (i)重链可变区包含如SEQ ID NO:1或3所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及轻链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或者
    (ii)重链可变区包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及轻链可变区包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或者
    (iii)重链可变区包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及轻链可变区包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或者
    (iv)重链可变区包含如SEQ ID NO:38或40所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及轻链可变区包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或者
    (v)重链可变区包含如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及轻链可变区包含如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或者
    (vi)重链可变区包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及轻链可变区包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或者
    (vii)重链可变区包含如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及轻链可变区包含如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或者
    (viii)重链可变区包含如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及轻链可变区包含如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或者
    (ix)重链可变区包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及轻链可变区包含如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
    优选地，
    其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的重链可变区和轻链可变区：
    (i)包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区，或者
    (ii)包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区，或者
    (iii)包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的轻链可变区，
    或者，
    其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的重链可变区和轻链可变区：
    (iv)包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的轻链可变区，或者
    (v)包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的轻链可变区，或者
    (vi)包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的轻链可变区。
  18. 权利要求16-17任一项的抗体或其抗原结合片段，其中
    所述抗体是IgG1,IgG2,IgG3或IgG4抗体，优选具有人IgG1重链恒定区和人Kappa轻链恒定区；或者
    所述抗原结合片段是选自以下的抗体片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体、scFv、scFab、二硫键连接的scFv,二硫键连接的scFab或(Fab’) 2片段。
  19. 权利要求16-18任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是鼠源抗体、或嵌合抗体、或人源化抗体，优选地为人源化抗体。
  20. 一种分离的核酸，其编码权利要求16-19任一项的抗CLAUDIN 18.2抗体或其抗原结合片段。
  21. 一种载体，其包含权利要求20的核酸，优选地所述载体是表达载体。
  22. 一种宿主细胞，其包含权利要求20的核酸或权利要求21的载体，优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
  23. 免疫缀合物，其包含与治疗剂或诊断剂缀合的前述权利要求16-19中任一项的抗体或其抗原结合片段。
  24. 前述权利要求16-19任一项的抗体或其抗原结合片段的用途，所述用途选自在体内或在体外用于：
    (1)靶向性结合表面表达CLAUDIN 18.2的肿瘤细胞；和/或
    (2)引发针对表面表达CLAUDIN 18.2的肿瘤细胞的ADCC活性和/或CDC活性，以及
    (3)抑制和/或杀伤表面表达CLAUDIN 18.2的肿瘤细胞，
    或用于制备在前述任一项中使用的药物。
  25. 药物组合物，其包含前述权利要求16-19任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求23的免疫缀合物，以及任选地药用辅料。
  26. 在受试者中预防或治疗CLAUDIN 18.2阳性肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的前述权利要求1-14任一项的抗体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂化物、或权利要求16-19任一项的抗体或其抗原结合片段，优选地，所述肿瘤是消化系统肿瘤或其转移瘤，例如胃癌、胰腺癌、食管癌、结肠癌、胆囊癌，肝癌，尤其是胃癌，例如，HER2阴性胃癌。
  27. 权利要求26的方法，其中CLAUDIN 18.2阳性肿瘤为晚期或转移性胃癌、或胃食管交界处癌(EGJA)。
  28. 检测样品中CLAUDIN 18.2的方法，所述方法包括
    (a)将样品与前述权利要求16-19中任一项的抗体或其抗原结合片段接触；和
    (b)检测所述抗体或其抗原结合片段和CLAUDIN 18.2间的复合物的形成；任选地，抗体是被可检测地标记的。
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