CN112237634B - 抗体药物偶联物、其中间体、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗体药物偶联物、其中间体、制备方法及应用。具体地，本发明公开了一种抗体药物偶联物，其结构如式I所示。该抗体药物偶联物具有很强的靶向性，对表达Claudin18.2、CD30、Trop2、Her2等的多种肿瘤细胞具有很好的抑制效果，并且，具有很好的成药性，安全性高。本发明还公开了一种抗体药物偶联物的中间体，其与多种抗体均能够偶联。

Description

抗体药物偶联物、其中间体、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种抗体药物偶联物、其中间体、制备方法及应用。
背景技术
抗体-小分子药物偶联物(Antibody-drug conjugate，ADC)是新一代抗体靶向治疗药物，主要应用于癌症肿瘤的治疗。ADC药物由小分子细胞毒性药物(Drug)、抗体(Antibody)以及连接抗体和细胞毒性药物的连接子(Linker)三部分组成，小分子细胞毒性药物通过化学偶联的方法结合到抗体蛋白上。ADC药物利用抗体特异地识别并引导小分子药物到达表达癌症特异性抗原的癌细胞靶点，并通过细胞内吞效应进入癌细胞。接头部分在胞内低pH值环境或溶酶体蛋白酶的作用下断裂，释放出小分子细胞毒性药物，从而达到特异杀死癌细胞而不损伤正常组织细胞的作用。因此，ADC药物同时结合了抗体的靶向专一性和小分子毒素对癌细胞的高毒性的特点，大大扩展了药物的有效治疗剂量窗口(Therapeutic window)。临床研究已证明，ADC药物的药效高、在血液中相对稳定，能有效地降低小分子细胞毒性药物(化药)本身对循环系统以及健康组织的毒性，是目前国际上抗癌药物的研发热点。
喜树碱(CPT)是从中国喜树树皮、木质和果实中分离得到的一种植物碱，是一种DNA拓扑异构酶I(TOPI)抑制剂，拓扑异构酶I在DNA翻译和转录过程中催化单链DNA断裂和连接，松弛DNA超螺旋，以促进复制和转录，而拓扑异构酶I抑制剂SN38可阻断DNA链再连接，造成DNA损伤，抑制DNA复制和转录，从而诱导细胞凋亡。伊立替康(CPT-11)是目前实体瘤治疗中应用较为广泛的一类喜树碱类衍生物，该药物对胃癌肿瘤细胞有较好的敏感性，在我国，伊立替康已经被批准用于胃癌二线治疗，伊立替康进入体内后，在体内羧基脂酶的作用下分解成为活性代谢物SN38，从而发挥抗肿瘤作用，因此SN38分子可作为抗体偶联药物良好的药物分子。除了胃癌，伊立替康常用于标准方案化疗后复发的转移性大肠癌的治疗，此外，其对肺癌、乳腺癌、卵巢癌等也有一定的疗效。由于伊立替康对多种靶点均表现出抑制作用，其会引起多种副作用，这也限制了伊立替康在临床上的使用。
SN38基本信息如下：
中文化学名：7-乙基-10-羟基喜树碱
英文化学名：7-Ethyl-10-hydroxycamptothecin
化学文摘(CAS)号：86639-52-3
其结构式如下：
2016年6月3日，美国临床肿瘤学会(ASCO)公布了Sacituzumab govitecan(IMMU-132，结构如下所示)治疗复发或难治性三阴乳腺癌(mTNBC)在疗效和安全性方面的研究。IMMU-132是一种抗体偶联药物，其通过蛋白链接技术将单克隆抗体RS7和SN-38连接在一起。RS7靶向人滋养细胞表面抗原Trop-2，该抗原在超过80％的三阴性乳腺癌中大量表达。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的抗体药物偶联物种类单一的缺陷，而提供了一种抗体药物偶联物、其中间体、制备方法及应用。
本发明开发了一类抗体药物偶联物，具有很好的靶向性，对表达Claudin18.2、CD30、Trop2、Her2等的多种肿瘤细胞具有很好的抑制效果，并且，具有很好的成药性，安全性高。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种抗体药物偶联物，其结构如式I所示；
其中，Ab为抗体；
n为2～8；
n1为7～30。
所述的抗体药物偶联物中，所述的抗体为抗肿瘤抗体，例如抗Claudin18.2抗体、抗Trop2抗体、抗CD30抗体或抗Her2抗体。
所述的抗体药物偶联物中，较佳地，所述的抗Claudin18.2抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链，重链为如序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链。
所述的抗体药物偶联物中，较佳地，所述的抗Trop2抗体的轻链为如序列表SEQ IDNO:3所示氨基酸序列的轻链，重链为如序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链。
所述的抗体药物偶联物中，较佳地，所述的抗CD30抗体的轻链为如序列表SEQ IDNO:5所示氨基酸序列的轻链，重链为如序列表SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的重链。
所述的抗体药物偶联物中，较佳地，所述的抗Her2抗体的轻链为如序列表SEQ IDNO:7所示氨基酸序列的轻链，重链为如序列表SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链。
所述的抗体药物偶联物中，较佳地，所述的抗体为单克隆抗体。
所述的抗体药物偶联物中，较佳地，与所述的Ab上的巯基以硫醚的形式相连。例如，/>与所述的Ab中的半胱氨酸残基的连接形式为/>
所述的抗体药物偶联物中，n为整数或非整数，较佳地为4-8，更佳地为6-8，更佳地为7-8，进一步更佳地为7.2-7.8，例如7.3、7.4、7.5、7.6或7.7。
所述的抗体药物偶联物中，n1较佳地为7-23，更佳地为10-22，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22。
本发明一优选实施方案中，所述的抗体药物偶联物为如下任一结构：
其中，Ab为抗Claudin18.2抗体、抗Trop2抗体、抗CD30抗体或抗Her2抗体，n为7.3、7.4、7.5或7.7；所述的抗Claudin18.2抗体的轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链；所述的抗Trop2抗体的轻链优选为如序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQID NO:4所示氨基酸序列的重链；所述的抗CD30抗体的轻链优选为如序列表SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的重链；所述的抗Her2抗体的轻链优选为如序列表SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链。
本发明一优选实施方案中，所述的抗体药物偶联物为如下任一结构：
其中，Ab为抗Claudin18.2抗体、抗Trop2抗体、抗CD30抗体或抗Her2抗体；所述的抗Claudin18.2抗体的轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链；所述的抗Trop2抗体的轻链优选为如序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链；所述的抗CD30抗体的轻链优选为如序列表SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的重链；所述的抗Her2抗体的轻链优选为如序列表SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链。
本发明还提供了一种抗体药物偶联物的制备方法，其包括以下步骤：将如式CLB-SN38所示化合物与抗体Ab进行如下所示的偶联反应，即可；
其中，Ab、n和n1的定义同前所述。
所述的如式I所示化合物的制备方法中，所述的偶联反应的条件和操作与本领域该类反应常规的条件和操作相同。
所述的如式I所示化合物的制备方法中，所述的如式CLB-SN38所示化合物的制备方法可包括以下步骤：在有机溶剂中，将如式III所示化合物与如式IV所示化合物进行如下所示的酰胺化反应，即得所述的如式CLB-SN38所示化合物；
其中，n1如前所述。
所述的如式CLB-SN38所示化合物的制备方法中，所述的有机溶剂可为本领域常规的有机溶剂，优选卤代烃类溶剂，例如二氯甲烷。
所述的如式CLB-SN38所示化合物的制备方法中，所述的如式III所示化合物在有机溶剂中的摩尔浓度可为本领域常规的摩尔浓度，优选0.01-0.1mol/L，例如0.05mol/L。
所述的如式CLB-SN38所示化合物的制备方法中，所述的如式IV所示化合物与如式III所示化合物的摩尔比可为本领域常规的摩尔比，优选1:1-2:1，例如1.2:1。
所述的如式CLB-SN38所示化合物的制备方法中，所述的酰胺化反应优选在缩合剂和碱的存在下进行。所述的缩合剂可为本领域常规的缩合剂，例如二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)和1-羟基苯并三氮唑(HOBt)中的一种或多种，又例如HATU。所述的缩合剂与所述的如式III所示化合物的摩尔比可为本领域常规的摩尔比，优选1:1-4:1，例如2:1。所述的碱可为本领域常规的碱，例如三乙胺(TEA)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)中的一种或多种，又例如DIEA。所述的碱与所述的如式III所示化合物的摩尔比可为本领域常规的摩尔比，优选2:1-6:1，例如4:1。
所述的如式CLB-SN38所示化合物的制备方法中，所述的酰胺化反应的温度可为本领域常规的温度，优选20-30℃。
所述的如式CLB-SN38所示化合物的制备方法中，所述的酰胺化反应的进程可通过本领域常规的手段来监控(例如TLC、HPLC或LCMS)，所述的反应的时间优选1-4小时，例如2小时。
所述的如式CLB-SN38所示化合物的制备方法中，所述的酰胺化反应结束后，还可进一步包括后处理步骤，所述的后处理的操作和条件可为本领域该类反应后处理常规的操作和条件，其包括以下步骤：除去溶剂，分离纯化。所述除去溶剂的条件和操作可为本领域常规的条件和操作，例如减压蒸干。所述分离纯化的条件和操作可为本领域常规的条件和操作，例如柱层析分离。
所述的如式CLB-SN38所示化合物的制备方法中，所述的如式III所示化合物的制备方法可包括以下步骤：在溶剂中，将如式V所示化合物进行如下所示的反应，即得所述的如式III所示化合物；
所述的如式III所示化合物的制备方法中，所述的溶剂可为本领域常规使用的溶剂，优选卤代烃类溶剂，例如二氯甲烷。
所述的如式III所示化合物的制备方法中，所述的如式V所示化合物在溶剂中的摩尔浓度可为本领域常规的摩尔浓度，优选0.01-0.2mol/L，例如0.092mol/L。
所述的如式III所示化合物的制备方法中，较佳地，所述的反应在三氟乙酸存在下进行，所述的如式V所示的化合物和所述的三氟乙酸的摩尔体积比可为本领域常规的摩尔体积比，优选0.1-0.4mol/L，例如0.276mol/L。
所述的如式III所示化合物的制备方法中，所述的反应的温度可为本领域常规的温度，优选20-30℃。
所述的如式III所示化合物的制备方法中，所述的反应的进程可通过本领域常规的手段来监控(例如TLC、HPLC或LCMS)，所述的反应的时间优选10-60分钟，例如30分钟。
所述的如式III所示化合物的制备方法中，所述的反应结束后，较佳地，其还可进一步包括后处理步骤，所述后处理的操作和条件可为本领域该类反应常规的操作和条件，其包括以下步骤：将反应液倒入溶剂中，析出固体，洗涤，过滤，即可。所述的溶剂优选醚类溶剂，例如乙醚。所述的洗涤的操作和条件可为本领域常规的操作和条件，所述洗涤的溶剂优选醚类溶剂，例如乙醚。所述的过滤的操作和条件可为本领域常规的操作和条件。
所述的如式III所示化合物的制备方法中，所述的如式V所示的化合物的制备方法还可包括以下步骤：有机溶剂中，将如式VI所示化合物与SMCC{(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯}进行如下所示的取代反应，即得所述的如式V所示的化合物；
所述的如式V所示的化合物的制备方法中，所述的有机溶剂可为本领域常规的有机溶剂，优选卤代烃类溶剂，例如二氯甲烷。
所述的如式V所示的化合物的制备方法中，所述的如式VI所示化合物在溶剂中的摩尔浓度可为本领域常规的摩尔浓度，优选0.01-0.1mol/L，例如0.0464mol/L。
所述的如式V所示的化合物的制备方法中，所述的SMCC与所述的如式VI所示化合物的摩尔比可为本领域常规的摩尔比，优选1:1-4:1，例如2:1。
所述的如式V所示的化合物的制备方法中，较佳地，所述的取代反应在碱的存在下进行，所述的碱可为本领域常规的碱，例如DBU。所述的碱与所述的如式VI所示化合物的摩尔比可为本领域常规的摩尔比，优选3:1-7:1，例如5:1。
所述的如式V所示的化合物的制备方法中，所述的取代反应的温度可为本领域常规的温度，优选20-30℃。
所述的如式V所示的化合物的制备方法中，所述的取代反应的进程可通过本领域常规的手段来监控(例如TLC、HPLC或LCMS)，所述的反应的时间优选0.5-2小时，例如1小时。
所述的如式V所示的化合物的制备方法中，所述的取代反应结束后，还可进一步包括后处理步骤，所述的后处理的操作和条件可为本领域该类反应后处理常规的操作和条件，其包括以下步骤：除去溶剂，分离纯化。所述除去溶剂的条件和操作可为本领域常规的条件和操作，例如减压蒸干。所述分离纯化的条件和操作可为本领域常规的条件和操作，例如柱层析分离。
本发明还提供了一种如式CLB-SN38、如式II’所示化合物或其盐，其结构如下所示：
其中，n1如前任一方案所述。
较佳地，所述的如式II’所示化合物的盐为三氟醋酸盐，例如如式II所示化合物，
本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述的抗体药物偶联物和药用辅料。
所述的药物组合物中，所述的上述的抗体药物偶联物的用量可为治疗有效量。
所述的药用辅料可为药物生产领域中广泛采用的辅料。辅料主要用于提供一个安全、稳定和功能性的药物组合物，还可以提供方法，使受试者接受给药后活性成分以所期望速率溶出，或促进受试者接受组合物给药后活性成分得到有效吸收。所述的药用辅料可以是惰性填充剂，或者提供某种功能，例如稳定该组合物的整体pH值或防止组合物活性成分的降解。所述的药用辅料可包括下列辅料中的一种或多种：缓冲剂、螯合剂、防腐剂、助溶剂、稳定剂、赋形剂和表面活性剂着色剂、矫味剂和甜味剂。
本发明还提供了一种上述的抗体药物偶联物或上述的药物组合物在制备药物中的应用。
本发明还提供了一种上述的抗体药物偶联物或上述的药物组合物在制备药物中的应用，所述的药物可用于治疗肿瘤，所述的肿瘤具有所述的Ab所针对的抗原。所述的肿瘤优选Claudin18.2阳性、Trop2阳性、Her2阳性或CD30阳性肿瘤。
本发明还提供了一种上述的抗体药物偶联物或上述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用，所述的肿瘤具有所述的Ab所针对的抗原。所述的肿瘤优选Claudin18.2阳性、Trop2阳性、Her2阳性或CD30阳性肿瘤。
所述的应用中，所述的Claudin18.2阳性肿瘤优选Claudin18.2阳性的胃癌、胃食管交接部癌、胰腺癌和非小细胞肺癌中的一种或多种。
所述的应用中，所述的Trop2阳性肿瘤优选Trop2阳性的乳腺癌、胃癌、肺癌、胰腺癌和非小细胞肺癌中的一种或多种。
所述的应用中，所述的Her2阳性肿瘤优选Her2阳性的乳腺癌、胃癌、膀胱癌和结直肠癌中的一种或多种。
所述的应用中，所述的CD30阳性肿瘤优选CD30阳性的经典型霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤中的一种或多种。
在本发明某些实施例中，HEK293细胞为人胚肾细胞，其可为Claudin18.2阳性；
MDA-MB-468细胞为乳腺癌细胞，其可为Trop2阳性；
NCI-N87细胞为人胃癌细胞，其可为NCI-N87阳性或Her2阳性；
L428细胞为霍奇金淋巴瘤细胞，其可为CD30阳性；
Karpas299细胞为人间变性大细胞淋巴瘤细胞，其可为CD30阳性；
SK-BR-3细胞为人乳腺癌细胞，其可为Her2阳性。
为更清楚地了解本发明，定义以下术语。
天然或者天然序列的Claudin18.2、Trop2、Her2或CD30可以分离自大自然，也可以用重组DNA技术、化学合成法，或以上及类似技术的联合制得。
抗体在此取其最广义的解释，其可透过位于该免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原辨认区特异性地与目标结合，诸如碳水化合物、多核苷酸、脂肪、多肽等。具体包括完整的单克隆抗体，多克隆抗体，双特异抗体以及抗体片段，只要他们具有所需的生物活性。本发明的抗体包含其变体，变体是指氨基酸序列突变体，以及天然多肽的共价衍生物，条件是保留了与天然多肽相当的生物活性。氨基酸序列突变体与天然氨基酸序列的差异一般在于天然氨基酸序列中的一个活多个氨基酸被取代或在多肽序列中缺失和/或插入一个或多个氨基酸。缺失突变体包括天然多肽的片段和N端和/或C端截短突变体。通常氨基酸序列突变体与天然序列相比至少具有70％(例如70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％)的同源性。
单克隆抗体或单抗指的是该抗体来自一群基本均一抗体，即构成该集群的各抗体完全相同，除了可能存在的少量天然突变或在抗体表达制备过程中产生的异构体。单克隆抗体具有针对单一抗原的高度特异性。而多克隆抗体则包含了针对不同决定簇的不同抗体，每个单克隆抗体只针对抗原的一个决定簇。
本发明中，单克隆抗体还特别包含嵌合抗体及其片段，即抗体的重链和/或轻链的一部分来自于某种、某类或某亚类，其余部分则与另一种、类或亚类。
本发明的抗体可利用该领域广为周知的技术制备，例如杂交瘤方法、重组DNA技术、噬菌体展示技术、合成技术或该等技术的组合、或该领域己知的其它技术。
关于术语“药物抗体偶联比率”(drug-antibody ratio，即DAR)的说明。L-D是和抗体上的缀合点具反应性的基团，L是连接子，D是在连接L的抗体上进一步缀合的细胞毒剂，在本发明中D为SN38，每个抗体最终缀合D的DAR数目用n表示。在一些实施方式中，与每个抗体缀合的细胞毒剂的DAR实际上为介于2至8、4至8或6至8的平均值；在一些实施方式中，2、4、6、或8的平均值；在其它实施方式中，n为2、3、4、5、6、7或8的平均值。
连接子是指抗体与药物间的直接或间接连接。将连接子连接至mAb可经由许多方式完成，诸如经由表面赖氨酸、还原偶合至经氧化的碳水化合物、及经由还原链间二硫键所释放的半胱氨酸残基。多种ADC连接系统是该领域所知，包括以腙、双硫及肽为基底的连接。
术语“治疗”或它的同等表达当用于例如癌症时，指用来减少或消除患者体内癌细胞数目或减轻癌症的症状的程序或过程。癌症或另外的增生性障碍的“治疗”不一定指癌症细胞或其它障碍会实际上被消除，细胞或障碍的数目会实际上被减少或者癌症或其它障碍的症状会实际上被减轻。通常，即使只具有低的成功可能性也会进行治疗癌症的方法，但是考虑到患者的病史和估计的生存预期，其仍然被认为诱导总体有益的作用过程。在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
如无特殊说明，本发明中的室温是指20-30℃。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1.本发明的化合物CLB-SN38结构新颖，与多个靶点的抗体均能偶联。
2.本发明的化合物与IMAB362、RS7、CAC10以及Trastuzumab连接后制得的抗体药物偶联物，具有很好的靶向性，对表达Claudin18.2、CD30、Trop2、Her2等的多种肿瘤细胞具有很好的抑制效果。
3.体内研究表明，本发明的抗体药物偶联物相比于传统的SN-38类抗体药物偶联物(例如IMMU-132)具有更佳的体外细胞毒性、体内抗肿瘤活性。
4.本发明的抗体药物偶联物溶解性好，具有很好的成药性，偶联制备过程无沉淀等异常现象发生，非常利于抗体药物偶联物的制备。
附图说明
图1为抗体的轻、重链表达载体构建。
Ab-L：抗体的轻链
Ab-H：抗体的重链
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：抗Claudin18.2抗体IMAB362、抗Trop2抗体RS7、抗CD30抗体CAC10和抗Her2抗体Trastuzumab的制备
本发明中选取高亲和力并特异性靶向Claudin18.2的单克隆抗体IMAB362，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。IMAB362轻重链核苷酸序列通过全基因合成(苏州金唯智)方式获得，通过EcoR I和Hind III(购于TAKARA)双酶切分别单独构建至pV81载体中(如图1)，通过连接转化至Trans 1-T1感受态细胞(购自北京全式金生物，CD501-03)中，从中挑取克隆进行PCR鉴定并送检、测序确认，培养扩增阳性克隆进行质粒中抽，从而获得抗体轻链真核表达质粒IMAB362-L/pV81和抗体重链真核表达质粒IMAB362-H/pV81，对这两个质粒使用XbaⅠ(购自Takara，1093S)进行酶切线性化，轻、重链真核表达质粒比例1.5/1，通过电击转化至已适应悬浮生长的CHO细胞中(购于ATCC)，将电击后细胞以2000-5000细胞/孔接至96孔板中，培养3周后使用HTRF法(均相时间分辨荧光)测定表达量，从中挑选表达量Top10的cell pool(细胞池)扩增后冻存。复苏一支cell pool至125ml摇瓶中(培养体积30ml)，37℃，5.0％CO2，130rpm震荡培养，3天后扩至1000ml摇瓶中(培养体积300ml)，37℃，5.0％CO2，130rpm震荡培养，第四天开始隔天流加起始培养体积5-8％的补料培养基，培养至10-12天结束培养，收获液9500rpm离心15min，去除细胞沉淀，收集上清液，再用0.22μm滤膜过滤处理，处理好的样品使用MabSelect亲和层析柱(购于GE公司)进行纯化制备抗体IMAB362。
采用上述同种方法分别制备了抗Trop2抗体RS7，其轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
抗CD30抗体CAC10，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
抗Her2抗体Trastuzumab，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
实施例2：化合物CLB-SN38的合成
步骤A：
SN38(购自百灵威)10g(25.5mmol)混悬于200mL无水二氯甲烷中，加入吡啶5mL，Boc-酸酐11.3g(51mmol)，室温反应过夜。反应完毕减压蒸除溶剂得淡黄色固体，用石油醚洗涤得终产物9.8g，收率78％。MS[M+H]+：493.2。
步骤B：
化合物Boc-SN38 5g(10.1mmol)溶于100mL无水二氯甲烷中，加入吡啶2mL，DMAP2.47g(20.2mmol)，降温至0℃，然后将三光气1.5g(5.0mmol)溶于二氯甲烷中缓慢加入，0度反应1h，加入原料VII(购自苏州联宁生物)11.3g(20.0mmol)，升至室温反应5h。反应完毕减压蒸干溶剂，柱层析分离得到化合物VI，7.1g淡黄色固体，收率65％。MS[M+H]+：1077.3。
步骤C：
化合物VI取5g(4.64mmol)溶于100mL无水二氯甲烷，加入DBU 3.5mL(23.2mmol)，室温反应30min，然后加入SMCC(购自博瑞生物)3.1g(9.28mmol)，继续室温反应1h。反应完毕减压蒸干溶剂，柱层析得到化合物V，淡黄色固体2.58g，收率51％。MS[M+H]+：1089.7。
步骤D：
化合物V 3g(2.76mmol)溶于30mL无水二氯甲烷，加入10mL三氟乙酸，室温反应30分钟，反应完毕溶液倒入100mL无水乙醚中，析出黄色固体，用乙醚洗涤得终产物淡黄色固体1.65g，粗品直接用于下一步反应。
步骤E：
E1：CLB-SN38-1的制备(n1＝22)
化合物III 1g(1.0mmol)溶于无水二氯甲烷20mL，加入m-PEG24-COOH 1.34g(1.2mmol)，HATU 0.76g(2.0mmol)，DIEA695μL(4.0mmol)，室温反应2h。反应完毕，减压蒸干溶剂，粗品经柱层析得化合物CLB-SN38，0.9g淡黄色油状物。收率45％。MS[M+H]+：1988.26。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ9.83(s,1H),8.45(s,1H),8.05-8.03(m,1H),7.61-7.59(m,1H),7.44-7.38(m,5H),7.04(s,1H),6.72(s,2H),6.35(s,1H),5.74-5.70(m,1H),5.43-5.31(m,5H),5.19(s,2H),4.92-4.89(m,1H),4.31(s,1H),3.79-3.76(m,3H),3.75-3.58(m,99H),3.56-3.49(m,7H),3.41-3.36(m,6H),3.15-3.07(m,3H),2.60-2.51(m,2H),2.26-1.80(m,7H).
E2：化合物CLB-SN38-2(即n1＝10)
合成方法参照步骤E1，化合物III与相应的聚乙二醇羧酸缩合得到。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ9.83(s,1H),8.45(s,1H),8.05-8.03(m,1H),7.61-7.59(m,1H),7.44-7.38(m,5H),7.04(s,1H),6.72(s,2H),6.35(s,1H),5.74-5.70(m,1H),5.43-5.31(m,5H),5.19(s,2H),4.92-4.89(m,1H),4.31(s,1H),3.79-3.76(m,3H),3.75-3.58(m,51H),3.56-3.49(m,7H),3.41-3.36(m,6H),3.15-3.07(m,3H),2.60-2.51(m,2H),2.26-1.80(m,7H).MS[M+H]+：1459.1。
E3：化合物CLB-SN38-3(即n1＝16)
合成方法参照步骤E1，化合物III与相应的聚乙二醇羧酸缩合得到。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ9.83(s,1H),8.45(s,1H),8.05-8.03(m,1H),7.61-7.59(m,1H),7.44-7.38(m,5H),7.04(s,1H),6.72(s,2H),6.35(s,1H),5.74-5.70(m,1H),5.43-5.31(m,5H),5.19(s,2H),4.92-4.89(m,1H),4.31(s,1H),3.79-3.76(m,3H),3.75-3.58(m,83H),3.56-3.49(m,7H),3.41-3.36(m,6H),3.15-3.07(m,3H),2.60-2.51(m,2H),2.26-1.80(m,7H).MS[M+H]+：1722.9。
实施例3：抗体药物偶联物的制备
A：IMAB362-CLB-SN38-1偶联物
IMAB362抗体溶液，浓度15mg/ml，TECP(购于Sigma-Aldrich)加入12当量，于37℃搅拌1个小时，以使抗体链间二硫键完全打开，然后经G25脱盐柱去除过量TCEP。使用DMSO溶解12当量的化合物CLB-SN38-1，逐滴至还原后的抗体溶液中，并补加DMSO至其终浓度为10％(v/v)，在密封条件下，25℃搅拌反应1个小时，反应完成后，使用0.22μm膜过滤样品。使用TFF(切向流超滤系统)纯化去除未偶联小分子，缓冲液为50mM PB，1.0mM EDTA溶液(pH6.0)，置换体积15倍体积，纯化后添加终浓度6％蔗糖放置于-20℃冰箱中保存备用；
采用上述相同的偶联条件，分别制备了IMAB362-CLB-SN38-2偶联物和IMAB362-CLB-SN38-3偶联物。
B：RS7-CLB-SN38-2偶联物
RS7抗体溶液，浓度10mg/ml，TECP(购于Sigma-Aldrich)加入10当量，于37℃搅拌2个小时，以使抗体链间二硫键完全打开，然后经G25脱盐柱去除过量TCEP。使用DMSO溶解12当量的化合物CLB-SN38，逐滴至还原后的抗体溶液中，并补加DMSO至其终浓度为10％(v/v)，在密封条件下，25℃搅拌反应0.5个小时，反应完成后，使用0.22μm膜过滤样品。使用TFF(切向流超滤系统)纯化去除未偶联小分子，缓冲液为50mM PB，1.0mM EDTA溶液(pH 6.0)，置换体积15倍体积，纯化后添加终浓度6％蔗糖放置于-20℃冰箱中保存备用。
C：CAC10-CLB-SN38-1偶联物
CAC10抗体溶液，浓度12mg/ml，TECP(购于Sigma-Aldrich)加入15当量，于37℃搅拌2个小时，以使抗体链间二硫键完全打开，然后经G25脱盐柱去除过量TCEP。使用DMSO溶解12当量的化合物CLB-SN38，逐滴至还原后的抗体溶液中，并补加DMSO至其终浓度为10％(v/v)，在密封条件下，25℃搅拌反应1个小时，反应完成后，使用0.22μm膜过滤样品。使用TFF(切向流超滤系统)纯化去除未偶联小分子，缓冲液为50mM PB，1.0mM EDTA溶液(pH 6.0)，置换体积15倍体积，纯化后添加终浓度6％蔗糖放置于-20℃冰箱中保存备用。
D：Trastuzumab-CLB-SN38-1偶联物
Trastuzumab抗体溶液，浓度10mg/ml，TECP(购于Sigma-Aldrich)加入15当量，于37℃搅拌2个小时，以使抗体链间二硫键完全打开，然后经G25脱盐柱去除过量TCEP。使用DMSO溶解12当量的化合物CLB-SN38，逐滴至还原后的抗体溶液中，并补加DMSO至其终浓度为10％(v/v)，在密封条件下，25℃搅拌反应0.5个小时，反应完成后，使用0.22μm膜过滤样品。使用TFF(切向流超滤系统)纯化去除未偶联小分子，缓冲液为50mM PB，1.0mM EDTA溶液(pH 6.0)，置换体积15倍体积，纯化后添加终浓度6％蔗糖放置于-20℃冰箱中保存备用。
实施例4：DAR值等基本理化性质测试
(1)DAR检测
DAR检测是以抗体Ab和小分子SN38的紫外吸收测定和计算偶联度的，通过测定366nm和280nm处的吸光度来测定每个抗体分子平均连接的SN38个数即得。紫外/可见分光光度法(UV/Vis)是一种简单方便的方法，可用于测定蛋白浓度，以及抗体偶联药物(ADC)中抗体所偶联药物的平均数。通过使用ADC吸光度测量值，以及相应抗体和药物的消光系数，可确定DAR。
当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后，可用同样条件将该供试样品配成溶液，测定其吸光度，即可用下列公式计算出该物质的含量：A＝E×c×l，其中A为吸光度，E为吸收系数，c为蛋白质含量，l为液层厚度(cm)。此公式也适用于多组分体系，如这些组分有不同吸收光谱且组分之间无相互作用，这种情况下，样品溶液的这些组分的光吸收可加成。此时的吸光度Aλ＝(E1λ×c1+E2λ×c2+……+Enλ×cn)×l，n为不同吸收组分的数量，Enλ为第n种组分的消光系数；cn为第n种组分的浓度。
例如已知ADC样品在紫外光区内有发色基团，IMAB362单抗(下式中标记为mab)在280nm±3nm处有明显最大吸收值，药物(SN38，下式中标记为drug)在366nm±3nm处有最大吸收值，且药物存在不影响抗体的光吸收特性。故适用上述公式可得：
为降低系统误差，所测得的A280和A252的值都减去参比波长A320的值后，代入上述公式，再结合上面两个方程式可得到抗体和药物的浓度：
则平均药物抗体偶联比率(DAR)计算公式如下：
采用如上方式单克隆抗体IMAB362、RS7、CAC10和Trastuzumab在280nm±3nm的吸收系数分别为：240360L/mol·cm、226380L/mol·cm、234400L/mol·cm和215380L/mol·cm；在366m±3nm的吸收系数/>均为0L/mol·cm。
利用上述方法，测试实施例3中合成的IMAB362-CLB-SN38-1偶联物、IMAB362-CLB-SN38-2偶联物、IMAB362-CLB-SN38-3偶联物、RS7-CLB-SN38-1偶联物、RS7-CLB-SN38-2偶联物、CAC10-CLB-SN38-1偶联物、Trastuzumab-CLB-SN38-1偶联物的DAR值，其结果如下表1所示：
表1.抗体药物偶联物的DAR值
抗体药物偶联物 DAR值
IMAB362-CLB-SN38-1偶联物 7.3
IMAB362-CLB-SN38-2偶联物 7.4
IMAB362-CLB-SN38-3偶联物 7.3
RS7-CLB-SN38-1偶联物 7.6
RS7-CLB-SN38-2偶联物 7.7
CAC10-CLB-SN38-1偶联物 7.5
Trastuzumab-CLB-SN38-1偶联物 7.4
经LC-MS分析其不同偶联物的DAR值分布如下表2所示：
表2偶联物的DAR值分布情况
抗体药物偶联物 DAR6 DAR7 DAR8 DAR
IMAB362-CLB-SN38-1偶联物 20％ 35％ 45％ 7.25
IMAB362-CLB-SN38-2偶联物 14％ 35％ 51％ 7.37
IMAB362-CLB-SN38-3偶联物 21％ 26％ 53％ 7.3
RS7-CLB-SN38-1偶联物 5％ 30％ 65％ 7.6
RS7-CLB-SN38-2偶联物 5％ 15％ 80％ 7.75
CAC10-CLB-SN38-1偶联物 10％ 30％ 60％ 7.5
Trastuzumab-CLB-SN38-1偶联物 16％ 24％ 60％ 7.4
通过LC-MS获得了不同DAR分布所占比例再乘以相应的DAR值，最后相加获得了各ADC的平均DAR值。DAR值分布：注DAR0-DAR5均为0，故未列出。
(2)对IMAB362-CLB-SN38-1偶联物、IMAB362-CLB-SN38-2偶联物、IMAB362-CLB-SN38-3偶联物的理化性质进行测试，其中，抗体回收率计算如下所示：
其中，p表示抗体回收率，C1表示偶联反应前投入的抗体浓度，V1表示偶联反应前投入抗体的体积，C2表示偶联完成并纯化后所得样品抗体浓度，V1表示偶联完成并纯化后所得样品的体积。
聚体检测如下方法：SEC色谱柱TSKgelG3000SWXL(TOSOH公司)；柱尺寸为7.8mm(直径)*300mm(长度)；流动相为0.3M磷酸氢二钾，15％乙腈，pH 6.5；在280波长下检测。
测试结果如下表3所示。IMAB362-CLB-SN38-1偶联物、IMAB362-CLB-SN38-2偶联物、IMAB362-CLB-SN38-3偶联物在制备过程中溶液保持澄清，未出现沉淀现象，抗体回收率高达78％以上，偶联后DAR值稳定在7.3或7.4，且该偶联物被浓缩至60mg/ml浓度下依然可以保持澄清。
表3.偶联物基本理化性
实施例5：抗体偶联CLB-SN38-1前后与抗原的结合能力评价
(1)IMAB362-CLB-SN38偶联物
鉴于Claudin18.2位四次跨膜糖蛋白，无法用蛋白水平表征抗体偶联SN38后的结合活性差异，因此采用Cell-based-ELISA方法评价抗体IMAB362偶联化合物CLB-SN38-1前后对Claudin18.2抗原的结合能力是否有变化，具体方法如下：将处于对数生长期HEK293-Claudin18.2(HEK293细胞稳定转染Claudin18.2高丰度抗原表达)以7*104个细胞/孔加入96孔板中，过夜培养，随后加入0.25％戊二醛固定细胞贴壁，并添加10％脱脂奶粉封闭孔板1个小时，分别将系列终浓度(0、0.7、2.1、6.2、19、56、167和500ng/ml)抗体IMAB362和IMAB362-CLB-SN38-1、IMAB362-CLB-SN38-2、IMAB362-CLB-SN38-3偶联物加入反应体系，4℃下静置1个小时，使用洗板机洗板后，加入二抗Goat anti human IgG(Fc)-HRP(购自Thermo，21134)(稀释比例为1:2500)，再置于4℃下反应1个小时，洗板机洗板后加入TMB试剂(Sigma，T0440)显色，酶标仪读数，结果如下表所示，抗体IMAB362偶联CLB-SN38-1、CLB-SN38-2和CLB-SN38-3前后对Claudin18.2的结合能力没有显著性差异。其结果如下表4所示：
表4.IMAB362偶联前后与Claudin18.2结合活性数据
(2)RS7-CLB-SN38-2偶联物
采用竞争ELISA方法评价RS7抗体偶联CLB-SN38-2前后对Trop2抗原的结合能力是否有变化，具体方法如下：100ng/ml的Trop-2抗原(购自北京义翘，10428-H08H)以100μl/孔包被亲水酶标板条，3％BSA室温静置封闭2小时。将33ng/ml生物素标记的RS7抗体(DAR-2.82)分别与系列终浓度(100000、10000、1000、400、160、64、3.2和0.16ng/ml)RS7抗体和RS7-CLB-SN38-2偶联物进行1：1的预混，然后加入包被Trop2抗原的酶标板中，室温条件下200rpm水平振摇1个小时，100μl/孔加入PierceTMHigh Sensitivity Streptavidin-HRP,Pre-Diluted酶联抗体(Thermo，21134)(稀释比例为1:500)，Sigma的TMB显色液(Sigma，T0440)显色25分钟后1mol/L H2SO4终止。酶标仪650nm参比波长，450nm处测定吸光度读数，结果如下表5所示，RS7抗体偶联CLB-SN38-2前后对Trop2抗原结合活性无差异。
表5.RS7偶联前后与Trop2结合活性数据
(3)CAC10-CLB-SN38-1、Trastuzumab-CLB-SN38-1偶联物
同样抗CD30抗体CAC10和抗Her2抗体Trastuzumab偶联CLB-SN38-1后分别与CD30(购自R&D Systems)、Her2(购自苏州瑞安生物科技有限公司)抗原进行偶联前后结合活性评价，结果如下表6和7所示表明各抗体偶联CLB-SN38-1前后对抗原结合活性均无差异。
表6.CAC10偶联前后与CD30结合活性数据
表7.Transtuzumab偶联前后与Her2结合活性数据
效果实施例1：IMAB362-CLB-SN38-1偶联物的体外杀伤活性评价
选择稳定转染高表达Claudin18.2的HEK293细胞作为本次实验体外活性检测用细胞株，观察系列浓度SN38、IMAB362抗体、IMAB362-CLB-SN38-1偶联物、IMAB362-CLB-SN38-2偶联物和IMAB362-CLB-SN38-3偶联物对细胞杀伤的量效情况。初步选择每种细胞的种板密度：2×103cells/孔，16～24小时后进行细胞毒活性测定；其次测试药物加样后终浓度设定5000nM为起始浓度，5000～0.006nM设计系列10个浓度(4-10倍比稀释)，观察72小时的杀伤(或抑制)变化，CellTiter-Luminescent Cell Viability Assay化学发光染色。
结果如表8所示，抗体IMAB362对HEK293-Claudin18.2细胞基本无抑制作用，而SN38、IMAB362-CLB-SN38-1偶联物、IMAB362-CLB-SN38-2偶联物和IMAB362-CLB-SN38-3偶联物对HEK293-Claudin18.2杀伤作用明显，其中，SN38和IMAB362-CLB-SN38-1偶联物的IC50分别约为4.3nM和6.3nM。
表8.IMAB362-CLB-SN38-1偶联物、IMAB362-CLB-SN38-2偶联物、IMAB362-CLB-SN38-3偶联物、SN38和抗体IMAB362对HEK293-Claudin18.2的细胞毒活性
效果实施例2：RS7-CLB-SN38-2偶联物的体外杀伤活性评价
选择MDA-MB-468细胞，每孔2000个细胞接种于96孔细胞培养板中，培养20-24小时。使用含10％FBS的L15细胞培养基稀释RS7-CLB-SN38-2偶联物和SN38至1000、166.7、55.6、18.6、6.17、2.06、0.69、0.23、0.08、0.008和0nM制备11个浓度梯度，将稀释好的供试品100μl/孔加入到接种细胞的培养板内，置于37℃，5％CO2培养箱培养96小时后加入CellTiter-Luminescent Cell Viability Assay Reagent，50μl/孔，500rpm室温振荡混匀10分钟，SpectraMaxL酶标仪读数，OD570nm，2s间隔读数。
利用上述同样的方法，测试了RS7-CLB-SN38-2偶联物、SN38对NCI-N87细胞毒活性。结果如表9和表10所示，RS7-CLB-SN38-2偶联物对MDA-MB-468(乳腺癌)、NCI-N87(人胃癌细胞)细胞具有极佳的体外杀伤活性。
表9.RS7-CLB-SN38-2偶联物、SN38对MDA-MB-468细胞毒活性
表10.RS7-CLB-SN38-2偶联物、SN38对NCI-N87细胞毒活性
效果实施例3：CAC10-CLB-SN38-1偶联物的体外杀伤活性评价
采用同样方法表征了所制备的CAC10-CLB-SN38-1偶联物对霍奇金淋巴瘤细胞L428以及人间变性大细胞淋巴瘤细胞Karpas299的体外杀伤评价，结果如表11所示，所制备的CAC10-CLB-SN38-1偶联物对靶点阳性的细胞株具有较佳的杀伤活性。
表11.CAC10-CLB-SN38-1偶联物、SN38对Karpas299细胞毒活性
效果实施例4：Trastuzumab-CLB-SN38-1偶联物的体外杀伤活性评价
采用同样方法表征了所制备的Trastuzumab-CLB-SN38-1偶联物对NCI-N87胃癌细胞(Her2阳性)以及SK-BR-3细胞(Her2阳性)的体外杀伤评价，结果如表12和表13所示，所制备的ADC药物均对靶点阳性的细胞株具有较佳的杀伤活性。
表12.Trastuzumab-CLB-SN38-1偶联物、SN38对NCI-N87细胞毒活性
表13.Trastuzumab-CLB-SN38-1偶联物、SN38对SK-BR-3细胞毒活性
效果实施例5：RS7-CLB-SN38-2偶联物在Capan-1人胰腺癌模型中、抗肿瘤活性测试
选择6-8周大的雌性Balb/c nude小鼠颈背部皮下注射溶于100ul PBS溶液的5×106人源胰腺癌细胞(Capan-1)。将所述裸鼠随机分成6组，每组6只动物，分别为空白对照组、6.7mg/kg的盐酸伊立替康组、IMMU-132组设置两个剂量即3.5mg/kg和10mg/kg、以及RS7-CLB-SN38-2偶联物即RS7-ADC两个剂量组即3.5mg/kg和10mg/kg，腹腔给药，每周给药两次。每周两次测量实验动物体重和肿瘤体积并观察实验过程中动物生存状态。结果如表14所示，盐酸伊利替康(6.7mg/kg)治疗组在结束给药后第14天平均肿瘤体积为38mm3，空白对照组小鼠在结束给药后第14天平均肿瘤体积为1400mm3。测试药3.5mg/kg的IMMU-132治疗组在结束给药后第14天平均肿瘤体积为1299mm3，10mg/kg的IMMU-132治疗组在结束给药后第14天平均肿瘤体积为1018mm3。而3.5mg/kg的RS7-CLB-SN38-2偶联物治疗组在结束给药后第14天平均肿瘤体积为1221mm3，10mg/kg的RS7-CLB-SN38-2偶联物治疗组在结束给药后第14天平均肿瘤体积为675mm3，其抑制肿瘤的效果均明显优于同剂量组的IMMU-132，提示所制备的RS7-CLB-SN38-2偶联物具有更优的抗肿瘤活性。
表14.RS7-CLB-SN38-2偶联物抗肿瘤活性测试结果
对比实施例1：CL2-SN38和CL2A-SN38的合成
CL2-SN38和CL2A-SN38的合成制备则参考文献(Moon SJ等J.Med.Chem.2008,51,6916-26)，其分子结构式如下图所示。
对比实施例2：MCC-VC-MMAE-SN38和GGFG-Dxd-SN38的合成
MC-vc-PAB-MMAE购于苏州联宁生物，GGFG-Dxd合成方法具体参考专利CN104755494B制备所得，其结构如下所示：
对比实施例3：CLB-SN38-4、CLB-SN38-5的合成
化合物CLB-SN38-4(即n1＝2)
合成方法参照实施例2，化合物III与相应的聚乙二醇羧酸缩合得到。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ9.83(s,1H),8.45(s,1H),8.05-8.03(m,1H),7.61-7.59(m,1H),7.44-7.38(m,5H),7.04(s,1H),6.72(s,2H),6.35(s,1H),5.74-5.70(m,1H),5.43-5.31(m,5H),5.19(s,2H),4.92-4.89(m,1H),4.31(s,1H),3.79-3.76(m,3H),3.75-3.58(m,19H),3.56-3.49(m,7H),3.41-3.36(m,6H),3.15-3.07(m,3H),2.60-2.51(m,2H),2.26-1.80(m,7H).MS[M+H]+：1107.1。
化合物CLB-SN38-5(即n1＝6)
合成方法参照实施例2，化合物III与相应的聚乙二醇羧酸缩合得到。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ9.83(s,1H),8.45(s,1H),8.05-8.03(m,1H),7.61-7.59(m,1H),7.44-7.38(m,5H),7.04(s,1H),6.72(s,2H),6.35(s,1H),5.74-5.70(m,1H),5.43-5.31(m,5H),5.19(s,2H),4.92-4.89(m,1H),4.31(s,1H),3.79-3.76(m,3H),3.75-3.58(m,35H),3.56-3.49(m,7H),3.41-3.36(m,6H),3.15-3.07(m,3H),2.60-2.51(m,2H),2.26-1.80(m,7H).MS[M+H]+：1283.6。
对比实施例4：抗体偶联药物的制备
除药物接头不同外，其余条件和操作均同实施例3。按照实施例4中的方法测试了制得的抗体药物偶联物的理化性质，实验结果如下表15所示。抗体IMAB362还原后偶联CL2-SN38和CL2A-SN38时均出现大量淡黄色絮状沉淀，纯化后抗体蛋白回收率较低，即有大量抗体蛋白沉淀析出。当抗体分别偶联MCC-VC-MMAE和GGFG-Dxd-SN38时，均出现了严重的白色絮状沉淀，抗体回收率极低。抗体偶联CLB-SN38-4，CLB-SN38-5的制备中过程有明显的浑浊或沉淀产生。
表15.制备的抗体偶联物基本理化性质
沉淀明显是指在偶联反应时生成的偶联产物出现了明显的絮状沉淀物。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海复旦张江生物医药股份有限公司
<120> 抗体药物偶联物、其中间体、制备方法及应用
<130> P19010842C
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IMAB362轻链序列
<400> 1
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 2
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IMAB362重链序列
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 3
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RS7轻链序列
<400> 3
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 4
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RS7重链序列
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 5
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAC10轻链序列
<400> 5
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 6
<211> 446
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAC10重链链序列
<400> 6
Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile Thr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Asn Tyr Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 7
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Trastuzumab轻链序列
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 8
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Trastuzumab重链序列
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450

Claims (22)

1.一种抗体药物偶联物，其特征在于，其结构如式I所示；
其中，Ab为抗体；所述的抗体为抗Claudin18.2抗体、抗Trop2抗体、抗CD30抗体或抗Her2抗体；
n为2～8；
n1为10-22。
2.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，
n为4～8；
和/或，与所述的Ab上的巯基以硫醚的形式相连；
和/或，所述的抗体为单克隆抗体。
3.如权利要求2所述的抗体药物偶联物，其特征在于，n为6～8。
4.如权利要求3所述的抗体药物偶联物，其特征在于，n为7～8。
5.如权利要求4所述的抗体药物偶联物，其特征在于，n为7.2～7.8。
6.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗Claudin18.2抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链，重链为如序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链。
7.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗Trop2抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链，重链为如序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链。
8.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗CD30抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的轻链，重链为如序列表SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的重链。
9.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗Her2抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链，重链为如序列表SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链。
10.如权利要求1-9中任一项所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物为如下任一结构：
其中，Ab为抗Claudin18.2抗体、抗Trop2抗体、抗CD30抗体或抗Her2抗体，n为7.3、7.4、7.5、7.6或7.7。
11.如权利要求10所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗Claudin18.2抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链，重链为如序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链。
12.如权利要求10所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗Trop2抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链，重链为如序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链。
13.如权利要求10所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗CD30抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的轻链，重链为如序列表SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的重链。
14.如权利要求10所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗Her2抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链，重链为如序列表SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链。
15.如权利要求1-9中任一项所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物为如下任一结构：
其中，Ab为抗Claudin18.2抗体、抗Trop2抗体、抗CD30抗体或抗Her2抗体。
16.如权利要求15所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物为如下任一结构：
其中，Ab为抗Claudin18.2抗体、抗Trop2抗体、抗CD30抗体或抗Her2抗体，所述的抗Claudin18.2抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链，重链为如序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链；所述的抗Trop2抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链，重链为如序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链；所述的抗CD30抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的轻链，重链为如序列表SEQ IDNO:6所示氨基酸序列的重链；所述的抗Her2抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链，重链为如序列表SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链。
17.一种如权利要求1-16中任一项所述的抗体药物偶联物的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：将如式CLB-SN38所示化合物与Ab进行如下所示的偶联反应，即可；
其中，Ab、n和n1的定义如权利要求1-16中任一项所述。
18.一种如式CLB-SN38所示化合物或其盐，其结构如下所示：
其中，n1如权利要求1-9中任一项所述。
19.一种药物组合物，其特征在于，其包括如权利要求1-16中任一项所述的抗体药物偶联物和药用辅料。
20.一种如权利要求1-16中任一项所述的抗体药物偶联物或权利要求19所述的药物组合物在制备药物中的应用。
21.如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述的药物用于治疗肿瘤，所述的肿瘤具有如权利要求1-16中任一项所述的Ab所针对的抗原。
22.如权利要求21所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为Claudin18.2阳性、Trop2
阳性、Her2阳性或CD30阳性肿瘤。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115721732A (zh) * 2021-08-27 2023-03-03 上海复旦张江生物医药股份有限公司 抗体偶联药物的药物组合物、制剂及其制备方法、用途
CN118159300A (zh) * 2021-09-27 2024-06-07 苏州信诺维医药科技股份有限公司 一种抗体及其药物偶联物和用途
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CN115728297B (zh) * 2022-11-18 2024-07-02 杭州皓阳生物技术有限公司 一种精准控制抗体偶联药物放大过程dar值的方法
WO2024114667A1 (zh) * 2022-11-30 2024-06-06 正大天晴药业集团股份有限公司 抗cldn18.2抗体药物偶联物及其药物组合物和用途
CN116178386A (zh) * 2022-12-30 2023-05-30 上海复旦张江生物医药股份有限公司 一种连接基药物偶联物的制备方法及其中间体

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106916227A (zh) * 2015-12-24 2017-07-04 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种tpbg抗体及其制备方法、其偶联物和应用
CN108727499A (zh) * 2018-04-24 2018-11-02 四川百利药业有限责任公司 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106916227A (zh) * 2015-12-24 2017-07-04 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种tpbg抗体及其制备方法、其偶联物和应用
CN108727499A (zh) * 2018-04-24 2018-11-02 四川百利药业有限责任公司 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Antibody-drug conjugates targeting TROP-2 and incorporating SN-38:A case study of anti-TROP-2 sacituzumab govitecan;David M. Goldenberg et al.;MABS;第11卷(第6期);第987-995页 *

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