CN114601933A - 抗体药物偶联物、其中间体、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗体药物偶联物、其中间体、制备方法及应用。本发明提供了一种如式I所示的抗体药物偶联物，该类化合物具有很好的靶向性，对阳性表达HER3的肿瘤细胞具有很好的抑制效果，并且，具有很好的成药性，安全性高。该抗体药物偶联物具有HER3的抑制效果，还对SK‑BR‑3和SW620细胞具有抑制效果，且还对22Rv1、LNCaP、NCI‑H820、OVCAR‑8和HCC827细胞中的至少一种有良好的抑制效果。

Description

抗体药物偶联物、其中间体、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种抗体药物偶联物、其中间体、制备方法及应用。
背景技术
HER家族由4个结构相近、功能相关的RTKs组成，分别为HER1(EGFR)、HER2、HER3和HER4，受体间的二聚化是HER家族发挥其功能及信号转导活性的基本条件。受体二聚化后，诱导胞内高度保守的激酶残端发生交联磷酸化，进而招募并激活下游蛋白，引起信号级联反应，调节细胞增殖、生存、迁移、发生、转移等过程。HER3虽可与神经调节蛋白(Neuregulin，NRG)结合，但由于其缺乏内在的酪氨酸激酶活性，只能通过与其他受体形成异二聚体发挥功能。相反，HER2虽具有酪氨酸激酶活性，但并无相应的配体与之结合。HER2胞外区结构为天然的开放构象，此构象使HER2无需配体激活即可与其他受体发生二聚化，因此HER2是HER3首选的二聚化伴侣。
HER2与HER3形成异二聚体，可直接激活PI3K/AKT通路，PI3K/AKT通路是促进肿瘤细胞增殖的最重要的信号通路，参与调节基因表达、细胞代谢、细胞骨架重排等过程，因此HER2-HER3异二聚体被认为是HER家族中信号传导能力最强的二聚体。研究表明，直接或间接抑制PI3K/AKT通路的药物可导致HER3转录增加，通过PI3K/AKT负反馈调节使HER3表达上调及活化，重新激活下游通路而产生耐药，与抗HER2及抗EGFR靶向治疗的耐药相关。此外，HER3的主要配体NRG1可通过旁分泌和自分泌途径参与HER3的信号转导等进而诱导HER3通路活化，也可能参与HER家族靶向治疗的耐药。此外，HER3还可与其他HER家族成员如EGFR，以及非HER家族成员如MET、IGF-1R形成二聚体，参与肿瘤的发生、发展。鉴于HER3可与其他靶点形成异二聚体传递最强的PI3K/AKT，并且由于缺乏酪氨酸激酶活性，因此HER3的治疗药物主要以HER的3胞外区为靶点开发抗体类药物。目前虽有多个单抗药物或双特异抗体药物处于临床研究阶段，但现有数据均表明其临床有效性数据不够显著，后续继续开发的潜力较小。
抗体-小分子药物偶联物(Antibody-drug conjugate，ADC)是新一代抗体靶向治疗药物，主要应用于癌症肿瘤的治疗。ADC药物由小分子细胞毒性药物(Drug)、抗体(Antibody)以及连接抗体和细胞毒性药物的连接子(Linker)三部分组成，小分子细胞毒性药物通过化学偶联的方法结合到抗体蛋白上。ADC药物利用抗体特异地识别并引导小分子药物到达表达癌症特异性抗原的癌细胞靶点，并通过细胞内吞效应进入癌细胞。接头部分在胞内低pH值环境或溶酶体蛋白酶的作用下断裂，释放出小分子细胞毒性药物，从而达到特异杀死癌细胞而不损伤正常组织细胞的作用。因此，ADC药物同时结合了抗体的靶向专一性和小分子毒素对癌细胞的高毒性的特点，大大扩展了药物的有效治疗剂量窗口(Therapeutic window)。临床研究已证明，ADC药物的药效高、在血液中相对稳定，能有效地降低小分子细胞毒性药物(化药)本身对循环系统以及健康组织的毒性，是目前国际上抗癌药物的研发热点。
抗体药物的Fc端含有不同的受体，主要包括Fcγ受体即FcγR、Fc新生儿受体即FcRn以及C型凝集素受体等。FcγR受体存在有多种亚型，不同的FcγR介导不同的效应功能主要包括ADCC、ADCP以及CDC等，是连接细胞免疫与体液免疫的关键因素。在单抗药物中FcγR所介导的效应功能对部分治疗性抗体的有效性发挥起着重要的作用，但在ADC药物中FcγR通过与ADC药物的Fc结合可介导ADC药物在相关细胞的内化、运输以及活性分子释放从而导致严重的毒性事件发生。例如FcγRIIa(即CD32a)可介DM1类ADC药物发生血小板减少等毒性事件的发生，因此降低ADC药物与FcγRIIa的结合，可减少ADC药物对FcγRIIa细胞的杀伤，从而可减少由FcγRIIa介导的毒性事件发生。
基于HER3靶点单抗药物开发临床有效性不足，研究开发基于该靶点的具有更佳有效性的抗体偶联药物或者开发一种可降低同FcγRIIa结合的抗体偶联药物具有很好的临床价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的抗体药物偶联物种类单一的缺陷，而提供了一种抗体药物偶联物、其中间体、制备方法及应用。
本发明开发了一类抗体药物偶联物，具有很好的靶向性，对阳性表达HER3的肿瘤细胞具有很好的抑制效果，并且，具有很好的成药性，安全性高。该抗体药物偶联物具有HER3的抑制效果，还对SK-BR-3和SW620细胞具有抑制效果，且还对22Rv1、LNCaP、NCI-H820、OVCAR-8和HCC827细胞中的至少一种有良好的抑制效果。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐；所述的抗体药物偶联物的结构如式I所示；
Figure BDA0002818489280000021
其中，Ab为HER3抗体或HER3抗体的变体；
所述的HER3抗体中轻链的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，重链的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；
所述的HER3抗体的变体，与HER3抗体相比，至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％以上的同源性；
m为2～8；
D为
Figure BDA0002818489280000022
R2和R5分别独立地为H、C1-C6烷基或卤素；
R3和R6分别独立地为H、C1-C6烷基或卤素；
R4和R7分别独立地为C1-C6烷基；
R1为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基、被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基、C1～C6烷基或C3～C10环烷基；
L1独立地为苯丙氨酸残基、丙氨酸残基、甘氨酸残基、异亮氨酸残基、亮氨酸残基、脯氨酸残基和缬氨酸残基中的一种或多种；p为2～4；
L2为
Figure BDA0002818489280000031
Figure BDA0002818489280000032
其中n独立地为1～12，c端通过羰基与L1相连，f端与所述的L3的d端相连；
L3为
Figure BDA0002818489280000033
其中b端和所述的Ab相连，d端与所述的L2的f端相连。
在本发明一优选实施方案中，上述的抗体偶联药物里，某些基团具有如下定义，未提及的基团的定义如上任一方案所述(本段内容以下简称为“在本发明一优选实施方案中”)：
所述的HER3抗体的变体，所述的HER3抗体的变体中轻链的氨基酸序列优选如序列表SEQ IDNO:1所示。
在本发明一优选实施方案中，所述的HER3抗体的变体中重链的氨基酸序列为如序列表SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列中具有E233P、L234V、L234F、L235A、L235E或P331S中的一个或多个位点突变。例如具有E233P、L234V和L235A的位点突变(即序列表SEQ ID NO:3)、或、具有L234F、L235E和P331S的位点突变(即序列表SEQ ID NO:4)，所述的多个优选两个或三个。
在本发明一优选实施方案中，所述的L3的b端优选为与所述的抗体上的巯基以硫醚的形式相连。以
Figure BDA0002818489280000034
为例，
Figure BDA0002818489280000035
与所述的抗体中的半胱氨酸残基的连接形式为
Figure BDA0002818489280000041
在本发明一优选实施方案中，当所述的R2和R5分别独立地为C1-C6烷基时，所述的C1～C6烷基优选为C1～C4烷基，进一步优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，最优选为甲基。
在本发明一优选实施方案中，当所述的R2和R5分别独立地为卤素时，所述的卤素优选为氟、氯、溴或碘，进一步优选为氟。
在本发明一优选实施方案中，当所述的R3和R6分别独立地为C1-C6烷基时，所述的C1～C6烷基优选为C1～C4烷基，进一步优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，最优选为甲基。
在本发明一优选实施方案中，当所述的R3和R6分别独立地为卤素时，所述的卤素优选为氟、氯、溴或碘，进一步优选为氟。
在本发明一优选实施方案中，当所述的R4和R7分别独立地为C1-C6烷基时，所述的C1～C6烷基优选为C1～C4烷基，进一步优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，最优选为乙基。
在本发明一优选实施方案中，R2和R5分别独立地为C1-C6烷基。
在本发明一优选实施方案中，R3和R6分别独立地为卤素。
在本发明一优选实施方案中，R4和R7为乙基。
在本发明一优选实施方案中，D为
Figure BDA0002818489280000042
在本发明一优选实施方案中，当所述的D为
Figure BDA0002818489280000043
时，所述的抗体药物偶联物可为
Figure BDA0002818489280000051
在本发明一优选实施方案中，当所述的R1为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基时，所述的C1～C6烷基进一步优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，最优选为乙基。
在本发明一优选实施方案中，当所述的R1为被多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基时，所述的多个为两个或三个。
在本发明一优选实施方案中，当所述的R1-1和R1-2各自独立地为C1～C6烷基时，所述的C1～C6烷基优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，最优选为甲基。
在本发明一优选实施方案中，当所述的R1为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基时，所述的-NR1-1R1-2优选为-N(CH3)2。
在本发明一优选实施方案中，当所述的R1为被一个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基时，所述的被一个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基为
Figure BDA0002818489280000052
在本发明一优选实施方案中，当所述的R1为被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基时，所述的C1～C6烷基优选为C1～C4烷基，进一步优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，最优选为乙基。
在本发明一优选实施方案中，当所述的R1为被多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基时，所述的多个为两个或三个。
在本发明一优选实施方案中，当所述的R1-3为C1～C6烷基时，所述的C1～C6烷基优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，最优选为甲基。
在本发明一优选实施方案中，当所述的R1为被一个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基时，所述的被一个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基为
Figure BDA0002818489280000061
在本发明一优选实施方案中，当所述的R1为C1～C6烷基时，所述的C1～C6烷基优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，最优选为甲基。
在本发明一优选实施方案中，所述的m为整数(例如2、3、4、5、6、7或8)或非整数，优选为4-8，更优选为6-8，进一步优选为7-8，再进一步优选地为7.4-7.85，例如7.49、7.56、7.59、7.60、7.63、7.65、7.67、7.72、7.78、7.81、7.82或7.83。
在本发明一优选实施方案中，所述的L1优选为苯丙氨酸残基、丙氨酸残基、甘氨酸残基和缬氨酸残基中的一种或多种，进一步优选为缬氨酸残基和/或丙氨酸残基，所述的多种优选为两种或三种，所述的p优选为2。
在本发明一优选实施方案中，所述的(L1)p进一步优选为
Figure BDA0002818489280000062
其中g端通过羰基和所述的L2的c端相连。
在本发明一优选实施方案中，所述的n优选为8～12，例如8、9、10、11和12，再例如8或12。
在本发明一优选实施方案中，当所述的R1-1、R1-2和R1-3独立地优选为C1～C6烷基时，所述的C1～C6烷基优选C1～C4烷基，进一步优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，最优选为甲基。
在本发明一优选实施方案中，所述的R1优选为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基、被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基、或、C1～C6烷基，进一步优选为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基、或、被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基，最优选为被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基。
在本发明一优选实施方案中，所述的如式I所示的化合物为如下任一方案：
方案一：
所述的Ab为HER3抗体或HER3抗体的变体，所述的HER3抗体的变体中轻链的氨基酸序列优选如序列表SEQ ID NO:1所示；所述的HER3抗体的变体中重链的氨基酸序列为如序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中具有E233P、L234V、L234F、L235A、L235E或P331S中的一个或多个位点突变，例如具有E233P、L234V和L235A的位点突变(即序列表SEQ ID NO:3)、或、具有L234F、L235E和P331S的位点突变(即序列表SEQ ID NO:4)；
所述的R2和R5分别独立地为C1-C6烷基；所述的R3和R6分别独立地为卤素；D优选为
Figure BDA0002818489280000071
所述的R1为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基、被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基、或、C1～C6烷基；
方案二：
所述的Ab为HER3抗体或HER3抗体的变体，所述的HER3抗体的变体中轻链的氨基酸序列优选如序列表SEQ ID NO:1所示；所述的HER3抗体的变体中重链的氨基酸序列为如序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中具有E233P、L234V、L234F、L235A、L235E或P331S中的一个或多个位点突变，例如具有E233P、L234V和L235A的位点突变(即序列表SEQ ID NO:3)、或、具有L234F、L235E和P331S的位点突变(即序列表SEQ ID NO:4)；
所述的R2和R5分别独立地为C1-C6烷基；所述的R3和R6分别独立地为卤素；D优选为
Figure BDA0002818489280000072
所述的m为7～8，
所述的R1为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基、被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基、或、C1～C6烷基；
所述的L1独立地为缬氨酸残基和/或丙氨酸残基；
方案三：
所述的Ab为HER3抗体或HER3抗体的变体，所述的HER3抗体的变体中轻链的氨基酸序列优选如序列表SEQ ID NO:1所示；所述的HER3抗体的变体中重链的氨基酸序列为如序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中具有E233P、L234V、L234F、L235A、L235E或P331S中的一个或多个位点突变，例如具有E233P、L234V和L235A的位点突变(即序列表SEQ ID NO:3)、或、具有L234F、L235E和P331S的位点突变(即序列表SEQ ID NO:4)；
所述的D为
Figure BDA0002818489280000081
所述的R1为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基、被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基、或、C1～C6烷基；
方案四：
所述的Ab为HER3抗体或HER3抗体的变体，所述的HER3抗体的变体中轻链的氨基酸序列优选如序列表SEQ ID NO:1所示；所述的HER3抗体的变体中重链的氨基酸序列为如序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中具有E233P、L234V、L234F、L235A、L235E或P331S中的一个或多个位点突变，例如具有E233P、L234V和L235A的位点突变(即序列表SEQ ID NO:3)、或、具有L234F、L235E和P331S的位点突变(即序列表SEQ ID NO:4)；
所述的D为
Figure BDA0002818489280000082
所述的m为7～8，
所述的R1为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基、被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基、或、C1～C6烷基；
所述的L1独立地为缬氨酸残基和/或丙氨酸残基。
在本发明一优选实施方案中，所述的抗体药物偶联物优选为
Figure BDA0002818489280000083
Figure BDA0002818489280000091
在本发明一优选实施方案中，所述的L2优选为
Figure BDA0002818489280000092
在本发明一优选实施方案中，所述的抗体药物偶联物中的抗体优选为HER3抗体或HER3抗体的变体，所述的HER3抗体的变体中轻链的氨基酸序列为如序列表SEQ ID NO:1所示，重链选自如序列表SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；D为
Figure BDA0002818489280000093
L1为缬氨酸残基和/或丙氨酸残基，p为2，(L1)p优选为
Figure BDA0002818489280000094
R1为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基、被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基或C1～C6烷基，优选为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基、或、被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基，进一步优选为被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基；所述的R1-1、R1-2和R1-3独立地为C1～C4烷基，优选为甲基；所述的被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基优选为
Figure BDA0002818489280000095
所述的被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基优选为
Figure BDA0002818489280000101
L2为
Figure BDA0002818489280000102
L3为
Figure BDA0002818489280000103
在本发明一优选实施方案中，所述的抗体药物偶联物优选为如下所示的任一化合物：
Figure BDA0002818489280000104
Figure BDA0002818489280000111
Figure BDA0002818489280000121
其中，Ab为HER3抗体或HER3抗体的变体，m为7.49、7.56、7.59、7.60、7.63、7.65、7.67、7.72、7.78、7.81或7.83；所述的HER3抗体的变体中轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，重链优选为选自如序列表SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在本发明一优选实施方案中，所述的抗体药物偶联物优选为如下所示的任一化合物：
Figure BDA0002818489280000122
Figure BDA0002818489280000131
Figure BDA0002818489280000141
Figure BDA0002818489280000151
其中，Ab为HER3抗体或HER3抗体的变体；所述的HER3抗体的变体中轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，重链优选为选自如序列表SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在本发明一优选实施方案中，所述的抗体药物偶联物优选为如下所示的任一化合物：
Figure BDA0002818489280000152
Figure BDA0002818489280000161
其中，Ab为HER3抗体或HER3抗体的变体；m为7.56、7.59、7.63、7.67、7.72、7.81或7.83；所述的HER3抗体的变体中轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，重链优选为选自如序列表SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在本发明一优选实施方案中，所述的抗体药物偶联物优选为如下所示的任一化合物：
Figure BDA0002818489280000162
Figure BDA0002818489280000171
Figure BDA0002818489280000181
其中，Ab为HER3抗体或HER3抗体的变体；所述的HER3抗体的变体中轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，重链优选为选自如序列表SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在本发明一优选实施方案中，所述的抗体药物偶联物优选为如下所示的任一化合物：
Figure BDA0002818489280000182
Ab为HER3抗体，m优选为7.56；
Figure BDA0002818489280000183
Ab为HER3抗体的变体；所述的HER3抗体的变体轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的重链，m优选为7.67；
Figure BDA0002818489280000184
Ab为HER3抗体的变体；所述的HER3抗体的变体轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链，m优选为7.72；
Figure BDA0002818489280000191
Ab为HER3抗体，m优选为7.63；
Figure BDA0002818489280000192
Ab为HER3抗体的变体；所述的HER3抗体的变体轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的重链，m优选为7.59；
Figure BDA0002818489280000193
Ab为HER3抗体的变体；所述的HER3抗体的变体轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链，m优选为7.67；
Figure BDA0002818489280000194
Ab为HER3抗体，m优选为7.81；
Figure BDA0002818489280000195
Ab为HER3抗体的变体；所述的HER3抗体的变体轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的重链，m优选为7.63；
Figure BDA0002818489280000201
Ab为HER3抗体的变体；所述的HER3抗体的变体轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链，m优选为7.82；
Figure BDA0002818489280000202
Ab为HER3抗体，m优选为7.56；
Figure BDA0002818489280000203
Ab为HER3抗体，m优选为7.83；
Figure BDA0002818489280000204
Ab为HER3抗体，m优选为7.49；
Figure BDA0002818489280000205
Ab为HER3抗体，m优选为7.60；
Figure BDA0002818489280000211
Ab为HER3抗体，m优选为7.78；
Figure BDA0002818489280000212
Ab为HER3抗体，m优选为7.65；
Figure BDA0002818489280000213
Ab为HER3抗体m优选为7.83；或
Figure BDA0002818489280000214
Ab为HER3抗体，m优选为7.82。
本发明还提供了一种抗体，所述的抗体中轻链的氨基酸序列优选如序列表SEQ IDNO:1所示；所述的抗体中重链的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供了一种上述抗体药物偶联物的制备方法，其包括以下步骤：将如式II所示的化合物与Ab-氢进行如下所示的偶联反应即可；
Figure BDA0002818489280000221
其中，所述的L1、L2、L3、R1、p和Ab的定义如上所述。
本发明中，所述的偶联反应的条件和操作可为本领域该偶联反应常规的条件和操作。
本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述的物质X和药用辅料；所述的物质X为如上所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐。
所述的药物组合物中，所述的上述的物质X的用量可为治疗有效量。
本发明还提供了一种上述的物质X或上述的药物组合物在制备HER3蛋白抑制剂中的应用。
本发明还提供了一种上述的物质X或上述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用，所述的肿瘤优选HER3阳性肿瘤。
所述的应用中，所述的HER3阳性肿瘤优选HER3阳性肺癌、卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌和胃癌中的一种或多种。
在本发明某些实施例中，在所述的前列腺癌中，前列腺癌细胞为22Rv1细胞。
在本发明某些实施例中，在所述的前列腺癌中，前列腺癌细胞为LNCaP细胞。
在本发明某些实施例中，在所述的结直肠癌中，结直肠癌细胞为SW620细胞。
在本发明某些实施例中，在所述的肺癌中，肺癌细胞为NCI-H820细胞。
在本发明某些实施例中，在所述的卵巢癌中，卵巢癌细胞为OVCAR-8细胞。
在本发明某些实施例中，在所述的肺癌中，肺癌细胞为HCC827细胞。
在本发明某些实施例中，在所述的乳腺癌中，乳腺癌细胞为SK-BR-3细胞。
除非另有说明，在本发明说明书和权利要求书中出现的以下术语具有下述含义：
所述的药用辅料可为药物生产领域中广泛采用的辅料。辅料主要用于提供一个安全、稳定和功能性的药物组合物，还可以提供方法，使受试者接受给药后活性成分以所期望速率溶出，或促进受试者接受组合物给药后活性成分得到有效吸收。所述的药用辅料可以是惰性填充剂，或者提供某种功能，例如稳定该组合物的整体pH值或防止组合物活性成分的降解。所述的药用辅料可包括下列辅料中的一种或多种：缓冲剂、螯合剂、防腐剂、助溶剂、稳定剂、赋形剂和表面活性剂着色剂、矫味剂和甜味剂。
术语“药学上可接受的”是指盐、溶剂、辅料等一般无毒、安全，并且适合于患者使用。所述的“患者”优选哺乳动物，更优选为人类。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物与相对无毒的、药学上可接受的酸或碱制备得到的盐。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的药学上可接受的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括但不限于：锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、铝盐、镁盐、锌盐、铋盐、铵盐、二乙醇胺盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的药学上可接受的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。所述的药学上可接受的酸包括无机酸，所述无机酸包括但不限于：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、磷酸、亚磷酸、硫酸等。所述的药学上可接受的酸包括有机酸，所述有机酸包括但不限于：乙酸、丙酸、草酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、异烟酸、酸式柠檬酸、油酸、单宁酸、泛酸、酒石酸氢、抗坏血酸、龙胆酸、富马酸、葡糖酸、糖酸、甲酸、乙磺酸、双羟萘酸(即4,4’-亚甲基-双(3-羟基-2-萘甲酸))、氨基酸(例如谷氨酸、精氨酸)等。当本发明的化合物中含有相对酸性和相对碱性的官能团时，可以被转换成碱加成盐或酸加成盐。具体可参见Berge et al.,"Pharmaceutical Salts",Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19(1977)、或、Handbook of PharmaceuticalSalts:Properties,Selection,and Use(P.Heinrich Stahl and Camille G.Wermuth,ed.,Wiley-VCH,2002)。
天然或者天然序列的HER3可以分离自大自然，也可以用重组DNA技术、化学合成法，或以上及类似技术的联合制得。
抗体在此取其最广义的解释，其可透过位于该免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原辨认区特异性地与目标结合，诸如碳水化合物、多核苷酸、脂肪、多肽等。具体包括完整的单克隆抗体，多克隆抗体，双特异抗体以及抗体片段，只要他们具有所需的生物活性。本发明的抗体的变体是指氨基酸序列突变体，以及天然多肽的共价衍生物，条件是保留了与天然多肽相当的生物活性。氨基酸序列突变体与天然氨基酸序列的差异一般在于天然氨基酸序列中的一个活多个氨基酸被取代或在多肽序列中缺失和/或插入一个或多个氨基酸。缺失突变体包括天然多肽的片段和N端和/或C端截短突变体。通常氨基酸序列突变体与天然序列相比至少具有70％(例如70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％)的同源性。
单克隆抗体或单抗指的是该抗体来自一群基本均一抗体，即构成该集群的各抗体完全相同，除了可能存在的少量天然突变或在抗体表达制备过程中产生的异构体。单克隆抗体具有针对单一抗原的高度特异性。而多克隆抗体则包含了针对不同决定簇的不同抗体，每个单克隆抗体只针对抗原的一个决定簇。
本发明中，单克隆抗体还特别包含嵌合抗体及其片段，即抗体的重链和/或轻链的一部分来自于某种、某类或某亚类，其余部分则与另一种、类或亚类。
本发明的抗体可利用该领域广为周知的技术制备，例如杂交瘤方法、重组DNA技术、噬菌体展示技术、合成技术或该等技术的组合、或该领域己知的其它技术。
关于术语“药物抗体偶联比率”(drug-antibody ratio，即DAR)的说明。L-D是和抗体上的缀合点具反应性的基团，L是连接子，D是在连接L的抗体上进一步缀合的细胞毒剂，在本发明中D为Dxd，每个抗体最终缀合D的DAR数目用m表示或者m也可表示单个抗体缀合D的数量。在一些实施方式中，m实际上为介于2至8、4至8或6至8的平均值，或m为2、3、4、5、6、7或8中的某个整数；在一些实施方式中，m为2、4、6、或8的平均值；在其它实施方式中，m为2、3、4、5、6、7或8的平均值。
连接子是指抗体与药物间的直接或间接连接。将连接子连接至mAb可经由许多方式完成，诸如经由表面赖氨酸、还原偶合至经氧化的碳水化合物、及经由还原链间二硫键所释放的半胱氨酸残基。多种ADC连接系统是该领域所知，包括以腙、双硫及肽为基底的连接。
术语“治疗”或它的同等表达当用于例如癌症时，指用来减少或消除患者体内癌细胞数目或减轻癌症的症状的程序或过程。癌症或另外的增生性障碍的“治疗”不一定指癌症细胞或其它障碍会实际上被消除，细胞或障碍的数目会实际上被减少或者癌症或其它障碍的症状会实际上被减轻。通常，即使只具有低的成功可能性也会进行治疗癌症的方法，但是考虑到患者的病史和估计的生存预期，其仍然被认为诱导总体有益的作用过程。
术语“预防”是指获得或发生疾病或障碍的风险降低。
术语“环烷基”是指具有三到二十个碳原子的饱和的环烃原子团(例如C3-C6环烷基)，包括单环环烷基和多环环烷基。环烷基包含3至20个碳原子，优选包含3至10个碳原子，更优选包含3至6个碳原子。环烷基的实例包括但不仅限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基和环癸基。
术语“烷基”是指具有指定的碳原子数的直链或支链烷基。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、异戊基、正己基、正庚基、正辛基及其类似烷基。
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
术语“杂芳基”是指含有1、2、3或4个独立选自N、O和S的杂原子的芳基(或芳环)，其可以是单环、双环或三环的芳香体系，例如呋喃基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、噻吩基、异唑基、噁唑基、二唑基、咪唑基、吡咯基、吡唑基、三唑基、四唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、苯并咪唑基、吲哚基、吲唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并唑基、苯并异唑基、喹啉基、异喹啉基等。
术语“芳基”是指任何稳定的的单环或者双环碳环，其中所有环均为芳香环。上述芳基单元的实例包括苯基或萘基。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
如无特殊说明，本发明中的室温是指20-30℃。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1.本发明提供的包含有HER3抗体的抗体药物偶联物，具有很好的靶向性，对表达HER3等的多种肿瘤细胞具有很好的抑制效果。
2.体内研究表明，本发明的抗体药物偶联物具有更佳的体外细胞毒性、体内抗肿瘤活性。
3.本发明的抗体药物偶联物溶解性好，具有很好的成药性，偶联制备过程无沉淀等异常现象发生，非常利于抗体药物偶联物的制备。
附图说明
图1为抗体的轻、重链表达载体构建，其中Ab-L为抗体的轻链，Ab-H为抗体的重链。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
缩写说明：
PCR 聚合酶链反应
CHO 中国仓鼠卵巢细胞
HTRF 均相时间分辨荧光
PB 磷酸缓冲液
EDTA 乙二胺四乙酸
TECP 三(2-羧乙基)膦
DMSO 二甲基亚砜
DMF N,N-二甲基甲酰胺
HATU 2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
v/v V/V，体积比
UV 紫外可见光
ELISA 酶联免疫吸附试验
BSA 牛血清白蛋白
rpm 转/每分钟
FBS 胎牛血清
实施例1：HER3抗体的制备
本发明中选取高亲和力并特异性靶向HER3的单克隆抗体FDA026，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。FDA026其轻重链核苷酸序列通过全基因合成(苏州金唯智)方式获得。通过EcoR I和Hind III(购于TAKARA)双酶切分别单独构建至pV81载体中(如图1)，通过连接转化至Trans 1-T1感受态细胞(购自北京全式金生物，货号：CD501-03)中，从中挑取克隆进行PCR鉴定并送检、测序确认，培养扩增阳性克隆进行质粒中抽，从而获得抗体轻链真核表达质粒FDA026-L/pV81和抗体重链真核表达质粒FDA026-H/pV81，对这两个质粒使用XbaⅠ(购自Takara，货号：1093S)进行酶切线性化，轻、重链真核表达质粒比例1.5/1，通过电击转化至已适应悬浮生长的CHO细胞中(购于ATCC)，将电击后细胞以2000-5000细胞/孔接至96孔板中，培养3周后使用HTRF法(均相时间分辨荧光)测定表达量，从中挑选表达量前十的细胞池扩增后冻存。复苏一支细胞至125ml摇瓶中(培养体积30ml)，37℃，5.0％CO2，130rpm震荡培养，3天后扩至1000ml摇瓶中(培养体积300ml)，37℃，5.0％CO2，130rpm震荡培养，第四天开始隔天补加起始培养体积5-8％的补料培养基，培养至10-12天结束培养，收获液9500rpm离心15min，去除细胞沉淀，收集上清液，再用0.22μm滤膜过滤处理，处理好的样品使用MabSelect亲和层析柱(购于GE公司)进行纯化得到抗体FDA026。
采用上述相同制备方法制备了具有Fc突变(即E233P、L234V、L235A)的HER3抗体FDA028，其轻链氨基酸如SEQ ID NO:1所示，其重链序列如SEQ ID NO:3所示；和具有Fc突变(即L234F、L235E、P331S)的HER3抗体FDA029，其轻链氨基酸如SEQ ID NO:1所示，其重链序列如SEQ ID NO:4所示。
FDA026、FDA028和FDA029的轻链序列如下所示：
SEQ ID NO:1：
DIEMTQSPDS LAVSLGERAT INCRSSQSVL YSSSNRNYLA WYQQNPGQPP 50
KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQQYYST 100
PRTFGQGTKV EIKRTVAAPS VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA 150
KVQWKVDNAL QSGNSQESVT EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC 200
EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC 220
FDA026的重链序列如下所示：
SEQ ID NO:2：
QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS GYYWSWIRQP PGKGLEWIGE 50
INHSGSTNYN PSLKSRVTIS VETSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCARDKW 100
TWYFDLWGRG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF 150
PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC 200
NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT 250
LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY 300
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT 350
LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 400
DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK 447
FDA028的重链序列如下所示：
SEQ ID NO:3FDA028重链
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVETSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDKWTWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
FDA029的重链序列如下所示：
SEQ ID NO:4FDA029重链
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVETSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDKWTWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
实施例2：连接基-药物偶联物的合成
实施例2-1：LE12的合成
Figure BDA0002818489280000281
中间体2的合成：
将(S)-2-叠氮丙酸(10g，86.9mmol)与4-氨基苄醇(21.40g，173.8mmol)溶于300mL二氯甲烷和甲醇混合溶剂中(体积比2:1)，加入2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(21.49g，86.9mmol)，室温反应5小时后，减压蒸干溶剂，然后，所得粗品用硅胶柱层析[二氯甲烷：乙酸乙酯＝1:1(v/v)]纯化得到中间体2(16.3g，收率85％)，ESI-MS m/z：221(M+H)。
中间体3的合成：
将中间体2(15g，68.2mmol)与二(对硝基苯)碳酸酯(22.82g，75.02mmol)混合溶于200mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入25mL三乙胺，室温反应2小时。通过液质联用色谱监测原料反应完毕后，加入甲胺盐酸盐(6.91g，102.3mmol)，继续室温反应1小时。反应完毕减压蒸馏去除大部分溶剂，然后加入200mL水，200mL乙酸乙酯，分液后收集有机相，有机相经干燥后浓缩，所得粗品经过硅胶柱层析[二氯甲烷：乙酸乙酯＝10:1(v/v)]纯化得到中间体3(18.9g，收率100％)，ESI-MS m/z：278(M+H)。
中间体5的合成：
将中间体3(10g，36.1mmol)与多聚甲醛(1.63g，54.2mmol)混合溶于150mL无水二氯甲烷中，慢慢加入三甲基氯硅烷(6.28g，57.76mmol)，室温反应2小时得到中间体4的粗品溶液，通过取样加甲醇淬灭后液质联用监测反应，待反应完毕将反应液过滤然后向滤液中加入羟基乙酸叔丁酯(9.54g，72.2mmol)和三乙胺(10mL，72.2mmol)，继续室温反应2小时。反应完毕减压蒸馏去除大部分溶剂，所得粗品经过硅胶柱层析[石油醚：乙酸乙酯＝3:1(v/v)]纯化得到中间体5(11.2g，收率74％)，ESI-MS m/z：422(M+H)。
中间体6的合成：
将中间体5(10g，23.8mmol)溶于80mL无水四氢呋喃中，加入80mL水，然后加入三(2-羧乙基膦)盐酸盐(13.6g，47.6mmol)，室温反应4小时。反应完毕减压蒸馏去除四氢呋喃，然后加乙酸乙酯萃取，所得有机相经干燥后减压蒸除溶剂，经硅胶柱层析[二氯甲烷：甲醇＝10:1(v/v)]纯化得到中间体6(8.1g，收率86％)，ESI-MS m/z：396(M+H)。
中间体8的合成：
将的中间体6(5g，12.7mmol)溶于60mL二氯甲烷和甲醇混合溶剂中(v/v＝2：1)中，慢慢加入三氟乙酸3mL，室温反应30分钟。反应完毕加等体积水和乙酸乙酯，有机相干燥后浓缩，所得粗品直接用于下一步。
将上述步所获得的粗品溶于50mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入Fmoc-缬氨酸羟基琥珀酰亚胺酯(8.3g，19.1mmol)，三乙胺(5mL)，室温反应2小时。反应完毕，减压蒸馏去除大部分溶剂，所得粗品经硅胶柱层析[二氯甲烷：甲醇＝10:1(v/v)]纯化得到中间体8(5.4g，收率64％)，ESI-MSm/z：661(M+H)。
中间体9的合成：
将中间体8(1g，1.5mmol)与Exatecan甲磺酸盐(0.568g，1mmol)混合于30mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(1.14g，3.0mmol)，三乙胺2mL，室温反应2h。反应完毕，减压蒸馏去除溶剂，所得粗品经硅胶柱层析[氯仿：甲醇＝10:1(v/v)]纯化得到中间体9(0.94g，收率87％)，ESI-MS m/z：1078(M+H)。
化合物LE12的合成：
将中间体9(1g，0.929mmol)溶于20mL无水DMF中，加入0.5mL 1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯，室温反应1小时。待原料反应完毕，直接加入6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(428.5mg，1.39mmol)，室温搅拌1小时。减压馏去溶剂，所得粗品经硅胶柱层析[氯仿：甲醇＝8:1(v/v)]纯化得到标题化合物(0.7g，收率73％)，ESI-MS m/z：1035(M+H)。
实施例2-2：化合物LE13的合成
Figure BDA0002818489280000301
中间体14的合成
将市售的中间体12(267mg，0.8mmol)与多聚甲醛(50mg，1.6mmol)混合溶于20mL无水二氯甲烷中，慢慢加入三甲基氯硅烷(0.3mL，3.4mmol)，加料完毕后室温反应2小时。然后通过取样加甲醇淬灭后液质联用监测反应，待反应完毕后将反应液过滤，然后向滤液中加入羟基乙酸叔丁酯(211mg，1.6mmol)和潘必啶0.5mL，继续室温反应约2小时，反应完后减压蒸馏去除大部分溶剂，所得粗品经过硅胶柱层析[二氯甲烷：甲醇＝20:1(v/v)]纯化得到中间体14(260mg，收率68％)，ESI-MS m/z：479(M+H)。
中间体15的合成
将中间体14(238mg,0.50mmol)溶于6mL二氯甲烷和甲醇混合溶剂中(v/v＝2：1)中，慢慢加入三氟乙酸0.3mL，室温反应30分钟。反应完毕加等体积水和乙酸乙酯，有机相干燥后浓缩，所得粗品直接用于下一步。
中间体16的合成
将上述步骤所获得的粗品与Exatecan甲磺酸盐(170mg，0.30mmol)混合于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(341mg，0.90mmol)，三乙胺0.60mL，室温反应2h。反应完毕，减压蒸馏去除溶剂，所得粗品经硅胶柱层析[氯仿：甲醇＝10:1(v/v)]纯化得到中间体16(210mg,83％)，ESI-MS m/z：840(M+H)。
中间体17的合成
将中间体16(100mg，0.12mmol)溶于15mL无水四氢呋喃中，加入3mL水，然后加入1摩尔/升的三乙基膦水溶液0.3mL，室温反应4小时。监测反应完毕后将反应液减压蒸馏去除四氢呋喃，向所余水溶液中加碳酸氢钠调节pH至中性，然后加二氯甲烷萃取，所得有机相干燥后减压蒸除溶剂，所得粗品经硅胶柱层析[二氯甲烷：甲醇＝10:1(v/v)]纯化得到中间体17(69mg，收率71％)，ESI-MS m/z：814(M+H)。
化合物LE13的合成
按照上步合成方法得到的中间体17(120mg，0.15mmol)与市售的原料MC-V(102mg，0.33mmol)混合于40mL二氯甲烷中，加入缩合剂2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(82mg，0.33mmol)，室温反应过夜，反应完毕减压蒸干溶剂，所得粗品经硅胶柱层析[二氯甲烷：甲醇＝10:1(v/v)]纯化得到化合物LE13(116mg，收率70％)，ESI-MS m/z：1106.5(M+H)。
实施例2-3：化合物LE14的合成
Figure BDA0002818489280000311
中间体19的合成
将市售的中间体18(300mg，0.8mmol)与多聚甲醛(50mg，1.6mmol)混合溶于20mL无水二氯甲烷中，慢慢加入三甲基氯硅烷(0.3mL，3.4mmol)，室温反应2小时，通过取样加甲醇淬灭后液质联用监测反应。待反应完毕将反应液过滤，然后向滤液中加入羟基乙酸叔丁酯(211mg，1.6mmol)和三乙胺(0.22m，1.6mmol)，继续室温反应约2小时，反应完后减压蒸馏去除大部分溶剂，所得粗品经过硅胶柱层析[二氯甲烷：甲醇＝20:1(v/v)]纯化得到中间体19(349mg，收率85％)，ESI-MSm/z：514(M+H)，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.13(s,1H),7.56(d,J＝7.5Hz,2H),7.35(s,2H),5.14(s,2H),4.91(s,2H),4.25(q,J＝7.1Hz,1H),3.99(d,J＝42.5Hz,2H),3.85(t,J＝6.2Hz,2H),3.40(dd,J＝18.5,7.6Hz,2H),2.89(d,J＝48.6Hz,3H),1.65(d,J＝6.8Hz,3H),1.46(s,9H)。
中间体20的合成
将中间体19(257mg,0.50mmol)溶于6mL二氯甲烷和甲醇混合溶剂中(v/v＝2：1)中，慢慢加入三氟乙酸0.3mL，室温反应30分钟。反应完毕加等体积水和乙酸乙酯，有机相干燥后浓缩，所得粗品直接用于下一步。
将所得粗品与Exatecan甲磺酸盐(170mg，0.30mmol)混合于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(341mg，0.90mmol)，三乙胺0.60mL，室温反应2h。反应完毕，减压蒸馏去除溶剂，所得粗品经过硅胶柱层析[二氯甲烷：甲醇＝20:1(v/v)]纯化得到中间体20(212mg，收率81％)，ESI-MS m/z：875(M+H)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.27(d,J＝34.7Hz,1H),7.63–7.35(m,5H),7.21–7.10(m,1H),5.71–5.48(m,2H),5.24–4.95(m,3H),4.95–4.72(m,4H),4.45(s,1H),4.33–3.97(m,3H),3.75(s,2H),3.39–2.99(m,4H),2.76(d,J＝15.3Hz,3H),2.43–2.15(m,5H),2.04(s,1H),1.94–1.75(m,2H),1.62(d,J＝6.6Hz,3H),1.11–0.89(m,3H)。
中间体21的合成
将中间体20(77mg，0.09mmol)溶于12mL无水四氢呋喃中，加入3mL水，然后加入1摩尔/升的三乙基膦水溶液0.3mL，室温反应4小时。反应完毕减压蒸馏去除四氢呋喃，向所余水溶液中加碳酸氢钠调节pH至中性，然后加二氯甲烷萃取，所得有机相干燥后减压蒸除溶剂，所得粗品经硅胶柱层析[二氯甲烷：甲醇＝10:1(v/v)]纯化得到中间体21(53mg，收率69％)，ESI-MS m/z：849(M+H)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.52(s,1H),7.79(d,J＝10.8Hz,1H),7.67–7.55(m,2H),7.47–7.21(m,3H),6.51(s,1H),5.60(s,1H),5.52–5.32(m,2H),5.30–5.11(m,2H),5.11–4.94(m,2H),4.94–4.74(m,2H),4.02(s,2H),3.81–3.66(m,2H),3.60–3.35(m,4H),3.24–3.08(m,2H),2.94(d,J＝30.8Hz,3H),2.39(s,3H),2.28–2.04(m,2H),2.00–1.73(m,2H),1.22(d,J＝6.6Hz,3H),0.96–0.70(m,3H)。
化合物LE14的合成
中间体21(134mg，0.16mmol)与市售的原料MC-V(102mg，0.33mmol)混合于40mL二氯甲烷中，加入缩合剂2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(82mg，0.33mmol)，室温反应过夜，反应完毕减压蒸干溶剂，所得粗品经硅胶柱层析[二氯甲烷：甲醇＝10:1(v/v)]纯化得到化合物LE14(137mg，收率75％)，ESI-MS m/z：1141.4(M+H)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.97(s,1H),8.52(s,1H),8.27–8.09(m,1H),7.88–7.70(m,2H),7.63–7.51(m,2H),7.28(s,3H),6.99(s,2H),6.51(s,1H),5.59(s,1H),5.50–5.32(m,2H),5.17(s,2H),4.98(s,2H),4.85(d,J＝17.3Hz,2H),4.43–4.33(m,1H),4.21–4.12(m,1H),4.03(s,2H),3.74–3.64(m,2H),3.20–3.03(m,3H),3.02–2.84(m,4H),2.36(s,3H),2.23–2.09(m,4H),2.01–1.90(m,1H),1.90–1.78(m,2H),1.55–1.39(m,4H),1.30(d,J＝6.7Hz,3H),1.23–1.11(m,2H),0.93–0.77(m,9H)。
实施例2-4：化合物LE15-LE20的合成
Figure BDA0002818489280000331
中间体VI可以以Fmoc-L-缬氨酸-L-丙氨酸为起始原料，参照实施例2-1中中间体3的合成方法中的步骤a和b，将其中步骤b中的甲胺盐酸盐替换为相应的市售可得的氨基化合物制备而得。后续步骤从中间体VI出发，按照与实施例2-1中的步骤c、d、f和h相同的方法，得到与中间体9相似的中间体IX，然后按照实施例6中的步骤i和j相同的步骤处理，脱除氨基保护基，然后与市售可得的不同马来酰亚胺缩合得到终产物。所用氨基化合物及马来酰亚胺结构见表1。化合物LE15：灰白色固体，ESI-MS m/z：1121.2(M+H)；化合物LE16：淡黄色固体，ESI-MS m/z：1167.1(M+H)；化合物LE17：黄色固体，ESI-MS m/z：1132.3(M+H)；化合物LE18：淡黄色固体，ESI-MS m/z：1305.4(M+H)；化合物LE19：淡黄色固体，ESI-MS m/z：1307.4(M+H)；化合物LE20：淡黄色固体，ESI-MS m/z：1337.6(M+H)。
表1.合成LE15-LE20所用的中间体
Figure BDA0002818489280000341
Figure BDA0002818489280000342
Figure BDA0002818489280000351
实施例2-5：化合物LE21与LE22的合成
Figure BDA0002818489280000361
化合物DXD-1的合成
市售的Exatecan甲磺酸盐(0.568g，1mmol)与市售的2-(叔丁基二甲基硅氧)乙酸(CAS：105459-05-0，0.38g，2mmol)混合溶于20mL无水二氯甲烷中，加入缩合剂HATU(0.76g，2mmol)和1mL吡啶，室温搅拌2小时。待反应完毕后，减压蒸干溶剂，所得粗品经柱层析[二氯甲烷：甲醇＝50:1(v/v)]纯化得到标题化合物DXD-1(0.55g，收率90％)，ESI-MS m/z：608.1(M+H)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.73(d,J＝10.5Hz,1H),7.64(s,1H),7.05(d,J＝9.2Hz,1H),5.80–5.62(m,2H),5.41–5.14(m,4H),4.29–4.15(m,2H),4.08-4.03(m,1H),3.27–3.07(m,2H),2.45(s,3H),2.38–2.28(m,2H),1.96–1.81(m,2H),1.04(t,J＝7.4Hz,3H),0.80(s,9H),0.11(s,3H),0.03(s,3H).
中间体V的制备
中间体V可以参照实施例2-1中化合物4的制备方法，将其中步骤b中的甲胺盐酸盐替换为相应的市售可得的氨基化合物制备而得。
LE21-LE22的合成
中间体V与DXD-1反应，后续经过10％三氟乙酸/二氯甲烷溶液处理得到中间体X，然后中间体X参照实施例2-1中化合物5的后续步骤e、g、i和j进行反应：中间体X经过还原得到氨基化合物，所得氨基化合物和Fmoc-缬氨酸羟基琥珀酰亚胺酯缩合，然后脱去所得产物中氨基的Fmoc保护基，所得氨基产物再和6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯反应得到最终产物。化合物LE21：黄色固体，ESI-MS m/z：1141.2(M+H)；化合物LE22：黄色固体，ESI-MSm/z：1106.6(M+H)。
Figure BDA0002818489280000371
实施例2-6：化合物LS13的合成
参照实施例2-4中LE15的合成方法，SN-38(7-乙基-10-羟基喜树碱)与中间体VII(R1为甲砜乙基)反应后，经脱保护，缩合等步骤得到化合物LS13：1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.92(d,J＝22.4Hz,1H),8.14(s,1H),8.08(d,J＝9.1Hz,1H),7.81(d,J＝8.0Hz,1H),7.70–7.50(m,3H),7.47(d,J＝7.2Hz,1H),7.34(d,J＝7.2Hz,1H),7.27(s,1H),7.20(s,1H),6.98(s,2H),6.51(s,1H),5.61(s,2H),5.48–5.35(m,2H),5.27(s,2H),5.10(d,J＝20.6Hz,2H),4.36(s,1H),4.21–4.07(m,1H),3.84(s,2H),3.48(s,2H),3.21–2.92(m,6H),2.25–2.04(m,2H),2.04–1.78(m,3H),1.55–1.36(m,4H),1.36–1.10(m,9H),0.95–0.71(m,10H)。
Figure BDA0002818489280000372
实施例2-7：化合物GGFG-Dxd的合成
化合物GGFG-Dxd参照WO2015146132A1报道的已知的合成方法制备而得。ESI-MSm/z：1034.5(M+H)，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.61(t,J＝6.4Hz,1H),8.50(d,J＝8.5Hz,1H),8.28(t,J＝5.1Hz,1H),8.11(d,J＝7.5Hz,1H),8.05(t,J＝5.7Hz,1H),7.99(t,J＝5.9Hz,1H),7.77(d,J＝11.0Hz,1H),7.31(s,1H),7.25–7.16(m,5H),6.98(s,2H),6.51(s,1H),5.59(dt,J＝7.4,4.1Hz,1H),5.41(s,2H),5.20(s,2H),4.64(d,J＝6.1Hz,2H),4.53–4.40(m,1H),4.02(s,2H),3.74–3.37(m,8H),3.18–3.00(m,2H),3.04–2.97(m,1H),2.77(dd,J＝13.5,9.4Hz,1H),2.38(s,3H),2.19(dd,J＝14.9,8.5Hz,2H),2.11–2.05(m,2H),1.86(dd,J＝14.0,6.7Hz,2H),1.45(s,4H),1.20–1.14(m,2H),0.87(t,J＝7.1Hz,3H).
Figure BDA0002818489280000381
实施例3：抗体药物偶联物的制备
将按照实施例1方法制备得到的HER3的抗体FDA026和FDA028和FDA029分别使用G25脱盐柱将其置换至50mM PB/1.0mM EDTA缓冲液中(pH 7.0)，加入12当量TECP，于37℃搅拌2个小时，以使抗体链间二硫键完全打开，随后使用磷酸将还原后的抗体溶液pH调至6.0，并将水浴温度降至25℃，以备偶联反应。将按照上述实施例2方法制备得到的连接基-药物偶联物LE12-LE22、LS13和GGFG-Dxd分别用DMSO溶解，从中吸取12当量连接基-药物偶联物逐滴加至还原后的抗体溶液中，并补加DMSO至其终浓度为10％(v/v)，25℃搅拌反应0.5个小时，反应完成后，使用0.22um膜过滤样品。使用切向流超滤系统纯化去除未偶联小分子，缓冲液为50mM PB/1.0mM EDTA溶液(pH 6.0)，纯化后添加终浓度6％蔗糖放置于-20℃冰箱中保存。使用UV法分别在280nm和370nm下测定其吸光度值，计算DAR值，结果见下表2。
按照与本实施例以上同样的操作步骤进行偶联反应，样品均按照最高DAR制备(即过量偶联)，观察各偶联反应发生时沉淀的产生情况，并计算各偶联反应完成后的聚体比例和回收率，所得结果同样见表2。
表2制备不同抗体药物偶联物(ADC)的偶联情况
Figure BDA0002818489280000382
Figure BDA0002818489280000391
“/”表示未计算回收率
在实际研究中发现连接基-药物偶联物GGFG-Dxd与其他抗体偶联时会产生沉淀，且聚体比例较高，不具有普适性。而本技术方案中的连接基-药物偶联物尝试与不同的抗体偶联时，未产生沉淀，且聚体比例在正常范围，表明本发明提供的连接基-药物偶联物具有更好的理化性质。
效果例1：抗体药物偶联物与抗原的结合能力评价
采用竞争ELISA方法评价FDA026抗体与连接基-药物偶联物LE12-LE22偶联前后对Her3抗原的结合能力是否有变化，具体方法如下：100ng/ml的HER3抗原(购自北京义翘，货号：10201-H8H)以100μl/孔包被亲水酶标板条，3％BSA室温静置封闭2小时。将33ng/ml生物素标记的FDA026抗体(DAR-2.82)分别与系列终浓度(100000、10000、1000、400、160、64、3.2和0.16ng/ml)的FDA026抗体以及实施例3制备得到的抗体药物偶联物进行1:1的预混，然后加入包被Her3抗原的酶标板中，室温条件下200rpm水平振摇1个小时，100μl/孔加入PierceTMHigh Sensitivity Streptavidin-HRP,Pre-Diluted酶联抗体(Thermo，货号：21134)(稀释比例为1:500)，Sigma的TMB显色液(Sigma，货号：T0440)显色25分钟后1mol/LH2SO4终止。酶标仪650nm参比波长，450nm处测定吸光度读数，结果(如表3所示)显示：FDA026抗体与连接基-药物偶联物偶联前后对HER3抗原结合活性无差异。用同样的方法分别评价抗体FDA028和FDA029与连接基-药物偶联物偶联前后对Her3抗原的结合能力是否有变化，结果(如表3所示)显示：抗体FDA028和FDA029与连接基-药物偶联物偶联前后对HER3抗原结合活性无差异。
表3.HER3抗体与连接基-药物偶联物偶联前后与HER3结合活性数据
Figure BDA0002818489280000392
Figure BDA0002818489280000401
效果实施例2：抗体药物偶联物的体外杀伤活性评价
选择SK-BR-3(ATCC)细胞作为实验体外活性检测用细胞株，每孔2000个细胞接种于96孔细胞培养板中，培养20-24小时。将按照实施例3方法制备的抗体药物偶联物使用含10％FBS的L15细胞培养基配制成1000、166.7、55.6、18.6、6.17、2.06、0.69、0.23、0.08、0.008和0nM共11个浓度梯度的供试品溶液，取稀释好的供试品溶液100μl/孔加入到接种细胞的培养板内，置于37℃，5％CO2培养箱培养144小时后加入
Figure BDA0002818489280000403
LuminescentCell Viability Assay Reagent(50μl/孔)，500rpm室温振荡10分钟混匀，SpectraMaxL酶标仪读取数据(OD570nm，2s间隔读数)后计算IC50结果见表4。
利用上述同样的方法，分别测试各抗体药物偶联物对购自ATCC的22Rv1、LNCaP、SW620、NCI-H820、OVCAR-8和HCC827多个肿瘤细胞的细胞毒杀伤活性，结果如表4所示。从表4的结果可以看出，本发明提供的抗体药物偶联物对SK-BR-3、22Rv1、LNCaP、SW620、NCI-H820、OVCAR-8和HCC827等细胞都具有极佳的体外杀伤活性。
表4.抗体药物偶联物的体外杀伤活性
Figure BDA0002818489280000402
Figure BDA0002818489280000411
效果实施例3：抗体药物偶联物中抗体Fc端突变对表达CD32a受体细胞结合活性及细胞毒的影响
效果实施例3-1：抗体药物偶联物中抗体Fc端突变对表达CD32a受体细胞结合活性的影响
利用HTRF法分析所制备的ADC同表达CD32a细胞的结合能力，取HEK293细胞(ATCC)于37℃水浴锅中快速摇晃复苏细胞，离心后移去上清，并加入1.1mL 1X Tag-lite buffer重悬，每孔10μL细胞接种于384孔板中，然后在加入细胞的孔内，将预先制备好的FDA026-LE14、FDA028-LE14以及FDA029-LE14等抗体药物偶联样品按照系列稀释浓度(100000、3333.33、1111.11、370.37、123.46、41.15、13.72、4.57和1.52nM)以5μL/每孔加入384孔板中，最后向上述孔板中各加入5μL d2标记免疫球蛋白IgG-d2 conjugate，该IgG-d2conjugate可与CD32a结合，室温避光孵育3h，会产生FRET信号。上述ADC样品加入孔板后，ADC样品可与标记过的IgG竞争性地与CD32a结合，使其FRET信号降低。使用SpectraMaxParadigm酶标仪进行读数，以340nm为激发波长，616nm为参比波长，665nm为特征发射波长，测定吸光度，计算其IC50值，结果见表5。各抗体药物偶联物与CD32的结合能力，如表5所示；经过Fc端氨基酸改造的FDA028-LE14以及FDA029-LE14与CD32的结合能力相比未经改造的FDA026-LE14而言其结合能力较弱(～10％)；表明经Fc端氨基酸改造的抗体药物偶联物与CD32a的结合较弱。
表5.抗体药物偶联物Fc端氨基酸改造前后与CD32a的结合能力
Figure BDA0002818489280000421
效果实施例3-2：抗体药物偶联物中抗体Fc端突变对表达CD32a受体细胞的细胞毒的影响
选择阳性表达FcγRIIa的K562(ATCC)细胞(注该细胞不表达Her3抗原)作为实验体外活性检测用细胞株，每孔5000个细胞接种于96孔细胞培养板中，培养16-20小时。将按照上述所制备的抗体药物偶联物FDA026-LE14、FDA028-LE14以及FDA029-LE14，使用含10％FBS的L15细胞培养基配制成1000、166.7、55.6、18.6、6.17、2.06、0.69、0.23、0.08、0.008和0nM共11个浓度梯度的供试品溶液，取稀释好的供试品溶液100μl/孔加入到接种细胞的培养板内，置于37℃，5％CO2培养箱培养144小时后加入
Figure BDA0002818489280000423
Luminescent CellViability Assay Reagent(50μl/孔)，500rpm室温振荡10分钟混匀10分钟，SpectraMaxL酶标仪读取数据(OD570nm，2s间隔读数)后计算IC50结果见表5，结果显示：未经Fc改造的FDA026-LE14偶联药物对K562细胞均有一定的杀伤作用，而经Fc改造的ADC药物FDA028-LE14和FDA029-LE14对K562细胞的杀伤活性显著降低。
采用上述K562细胞系的同种实验方法，选择分化4天的HSC细胞(购自stem cell公司，货号：70008.1)给药处理6天进行细胞毒活性检测，抗体药物偶联物处理6天后经流式分析HSC细胞其表面抗原丰度(即binding ratio，CD32a 7.4；Her3抗原0.8；CD34 69.0)显示其CD32高表达，Her3抗原几乎不表达，其测活结果表6所示，未经Fc改造的FDA026-LE14偶联药物对HSC细胞均有一定的杀伤作用，而经Fc改造的ADC药物FDA028-LE14和FDA029-LE14对HSC细胞的杀伤活性显著降低。
表6.抗体药物偶联物Fc端氨基酸改造前后对K562和HSC细胞的杀伤活性评价
Figure BDA0002818489280000422
效果实施例4：体外血浆稳定性试验
本实施例评价按照实施例3方法制得的抗体偶联药物在人血浆中的稳定性。具体而言，在本实施例中，将实施例3的抗体偶联药物加入人血浆中，37℃水浴中放置1、3、7、14、21、28天加内标(依喜替康作为内标物质)并进行萃取然后通过高效液相色谱法检测游离药物的释放量，结果如表7所示。
表7.不同ADC在人血浆中的稳定性评价
Figure BDA0002818489280000431
血浆稳定性结果表明采用新技术方案得到的ADC稳定性不劣于FDA026-1402，而且部分更优，同时上述活性测试结果也证明部分新获得的ADC活性优于FDA026-1402。
效果实施例5：连接基-药物偶联物的体外酶切实验
连接基-药物偶联物(LE14和GGFG-Dxd)与组织蛋白酶B在三个不同pH(5.0，6.0，7.0)缓冲液中共孵育，不同时间点取样进入高效液相色谱-质谱联用仪，外标法(以DXD为外标)确定药物的释放百分比。实验结果(如表8所示)表明GGFG-Dxd在所用的pH范围内酶切速度较慢，而本发明的LE14在pH 5.0至pH 7.0的范围内都能快速的酶切。
表8.LE14和GGFG-Dxd体外在不同pH的酶切情况
Figure BDA0002818489280000432
效果实施例6：FDA026-LS13的体外酶切实验
选择SK-BR-3细胞株作为实验细胞株，样品在组织蛋白酶B体系(100mM醋酸钠-醋酸缓冲液，4mM二硫苏糖醇，pH 5.0)中37℃孵育4小时后，所得样品用培养基稀释至不同浓度，按照SN-38浓度70nM-0.003nM设定8个浓度(1.5-10倍稀释)，观察144小时对细胞株的杀伤(抑制)能力变化，并通过
Figure BDA0002818489280000441
Luminescent Cell Viability Assay化学发光染色，读取荧光数据后计算IC50数值。
将以上在组织蛋白酶B体系中37℃孵育4小时所得的酶切样品经过适量乙醇沉淀去除蛋白，通过高效液相色谱检测释放产生的小分子化合物，并以等量SN-38作为参比，测定4小时释放率，结果显示释放率达到99％。
实验结果(如表9所示)显示，FDA026-LS13经过酶切处理后细胞毒活性与等当量的SN-38几乎相同，也表明FDA026-LS13在组织蛋白酶B作用下几乎完全释放出了SN-38并发挥作用，而FDA026-LS13内吞进入溶酶体则可能发生了不可预知的变化导致SN-38不能有效发挥作用。
表9.FDA026-LS13被组织蛋白酶B体系酶切前后对NCI-N87细胞株的杀伤活性变化
Figure BDA0002818489280000442
效果实施例7：测试FDA026-LE14在SW620人结直肠癌模型中的抗肿瘤活性
选择6-8周大的雌性Balb/c nude小鼠右侧颈背部皮下注射溶于100ul PBS溶液的5×106人源结直肠癌细胞(SW620)，待肿瘤生长至平均体积150-200mm3时，根据肿瘤大小和小鼠体重随机分成8组，每组6只动物，分别为空白对照组、100mg/kg的盐酸伊立替康组、以及抗体药物偶联物FDA026-1402、FDA028-LE14和FDA026-LE14各分别两个剂量组即5.0mg/kg和10.0mg/kg，腹腔给药，每周给药一次。每周两次测量实验动物体重和肿瘤体积并观察实验过程中动物生存状态。结果如表9所示，盐酸伊利替康(100mg/kg)治疗组在结束给药后第14天(即观察的第46天，下同)平均肿瘤体积为1120.09mm3，空白对照组小鼠在结束给药后时平均肿瘤体积为2074.5mm3。测试药5.0mg/kg的FDA026-1402治疗组在结束给药后第14天平均肿瘤体积为260.87mm3，10mg/kg的FDA026-1402治疗组在结束给药后第14天平均肿瘤体积为0.00mm3。测试药5.0mg/kg的FDA026-LE14治疗组在结束给药后第14天平均肿瘤体积为13.79mm3，10mg/kg的FDA026-LE14治疗组在结束给药后第14天平均肿瘤体积为0.00mm3。测试药5.0mg/kg的FDA028-LE14治疗组在结束给药后第14天平均肿瘤体积为9.86mm3，10mg/kg的FDA028-LE14治疗组在结束给药后第14天平均肿瘤体积为0.00mm3。实验结果显示FDA026-LE14和FDA028-LE14均具有较好的体内抗肿瘤活性，同时所有实验小鼠无死亡情况，无体重减轻情况，表明FDA026-LE14具有很好的安全性。
表10.FDA026-LE14在SW620人结直肠癌模型中的抗肿瘤活性
Figure BDA0002818489280000451
注：01组为空白对照组；02组为5mg/kg的FDA026-LE14组；03组为10mg/kg的FDA026-LE14组；04组为5mg/kg的FDA026-1402组；05组为10mg/kg的FDA026-1402组；06组为5mg/kg的FDA028-LE14组；07组10mg/kg的FDA028-LE14组；08组为100mg/kg的盐酸伊立替康组。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海复旦张江生物医药股份有限公司
<120> 抗体药物偶联物、其中间体、制备方法及应用
<130> P20017229C
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 220
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Glu Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
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Claims (13)

1.一种抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐；所述的抗体药物偶联物的结构如式I所示；
Figure FDA0002818489270000011
其中，Ab为HER3抗体或HER3抗体的变体；
所述的HER3抗体中轻链的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，重链的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；
所述的HER3抗体的变体，与HER3抗体相比，至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％以上的同源性；
m为2～8；
D为
Figure FDA0002818489270000012
R2和R5分别独立地为H、C1-C6烷基或卤素；
R3和R6分别独立地为H、C1-C6烷基或卤素；
R4和R7分别独立地为C1-C6烷基；
R1为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基、被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基、C1～C6烷基或C3～C10环烷基；
L1独立地为苯丙氨酸残基、丙氨酸残基、甘氨酸残基、异亮氨酸残基、亮氨酸残基、脯氨酸残基和缬氨酸残基中的一种或多种；p为2～4；p为2～4；
L2为
Figure FDA0002818489270000013
Figure FDA0002818489270000014
其中n独立地为1～12，c端通过羰基与L1相连，f端与所述的L3的d端相连；
L3为
Figure FDA0002818489270000015
其中b端和所述的Ab相连，d端与所述的L2的f端相连。
2.如权利要求1所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的HER3抗体的变体中轻链的氨基酸序列优选如序列表SEQ ID NO:1所示；
和/或，所述的HER3抗体的变体中重链的氨基酸序列为如序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中具有E233P、L234V、L234F、L235A、L235E或P331S中的一个或多个位点突变；
和/或，所述的L3的b段和所述的抗体上巯基以硫醚键的形式相连；
和/或，当所述的R2和R5分别独立地为C1-C6烷基时，所述的C1～C6烷基为C1～C4烷基；
和/或，当所述的R2和R5分别独立地为卤素时，所述的卤素为氟、氯、溴或碘；
和/或，当所述的R3和R6分别独立地为C1-C6烷基时，所述的C1～C6烷基为C1～C4烷基；
和/或，当所述的R3和R6分别独立地为卤素时，所述的卤素为氟、氯、溴或碘；
和/或，当所述的R4和R7分别独立地为C1-C6烷基时，所述的C1～C6烷基为C1～C4烷基；
和/或，当所述的R1为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基时，所述的C1～C6烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，优选为乙基；
和/或，当所述的R1为被多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基时，所述的多个为两个或三个；
和/或，当所述的R1-1和R1-2各自独立地为C1～C6烷基时，所述的C1～C6烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，优选为甲基；
和/或，当所述的R1为被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基时，所述的C1～C6烷基为C1～C4烷基，优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，最优选为乙基；
和/或，当所述的R1为被多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基时，所述的多个为两个或三个；
和/或，当所述的R1-3为C1～C6烷基时，所述的C1～C6烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，优选为甲基；
和/或，当所述的R1为C1～C6烷基时，所述的C1～C6烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，优选为甲基；
和/或，所述的m为整数或非整数，优选为4～8，进一步优选为7～8；
和/或，所述的p为2；
和/或，所述的n为8～12；
和/或，当所述的R1-1、R1-2和R1-3独立地为C1～C6烷基时，所述的C1～C6烷基为C1～C4烷基。
3.如权利要求2所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的HER3抗体的变体中重链的氨基酸序列为如序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中具有E233P、L234V和L235A的位点突变或具有L234F、L235E和P331S的位点突变；
和/或，当所述的R2和R5分别独立地为C1-C6烷基时，所述的C1～C6烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，优选为甲基；
和/或，当所述的R2和R5分别独立地为卤素时，所述的卤素为氟；
和/或，当所述的R3和R6分别独立地为C1-C6烷基时，所述的C1～C6烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，优选为甲基；
和/或，当所述的R3和R6分别独立地为卤素时，所述的卤素为氟；
和/或，当所述的R4和R7分别独立地为C1-C6烷基时，所述的C1～C6烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，优选为乙基；
和/或，当所述的R1为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基时，所述的-NR1-1R1-2为-N(CH3)2；
和/或，当所述的R1为被一个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基时，所述的被一个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基为
Figure FDA0002818489270000031
和/或，当所述的R1为被一个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基时，所述的被一个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基为
Figure FDA0002818489270000032
和/或，m为7.49、7.56、7.59、7.60、7.63、7.65、7.67、7.72、7.78、7.81、7.82或7.83；
和/或，所述的(L1)p为
Figure FDA0002818489270000033
其中g端通过羰基和所述的L2的c端相连；
和/或，所述的n为8、9、10、11和12；
和/或，当所述的R1-1、R1-2和R1-3独立地优选为C1～C6烷基时，所述的C1～C6烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，优选为甲基。
4.如权利要求1所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，R2和R5分别独立地为C1-C6烷基；
和/或，R3和R6分别独立地为卤素；
和/或，R4和R7为乙基；
和/或，所述的R1被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基、被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基、或、C1～C6烷基，优选为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基、或、被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基；
和/或，所述的L1为苯丙氨酸残基、丙氨酸残基、甘氨酸残基和缬氨酸残基中的一种或多种，优选为缬氨酸残基和/或丙氨酸残基；
所述的D优选为
Figure FDA0002818489270000034
5.如权利要求1～4任一项所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的抗体偶联药物为如下任一方案：
方案一：
所述的Ab为HER3抗体或HER3抗体的变体，所述的HER3抗体的变体中轻链的氨基酸序列优选如序列表SEQ ID NO:1所示；所述的HER3抗体的变体中重链的氨基酸序列为如序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中具有E233P、L234V、L234F、L235A、L235E或P331S中的一个或多个位点突变，例如具有E233P、L234V和L235A的位点突变、或、具有L234F、L235E和P331S的位点突变；
所述的R2和R5分别独立地为C1-C6烷基；所述的R3和R6分别独立地为卤素；D优选为
Figure FDA0002818489270000041
所述的R1为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基、被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基、或、C1～C6烷基；
方案二：
所述的Ab为HER3抗体或HER3抗体的变体，所述的HER3抗体的变体中轻链的氨基酸序列优选如序列表SEQ ID NO:1所示；所述的HER3抗体的变体中重链的氨基酸序列为如序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中具有E233P、L234V、L234F、L235A、L235E或P331S中的一个或多个位点突变，例如具有E233P、L234V和L235A的位点突变、或、具有L234F、L235E和P331S的位点突变；
所述的R2和R5分别独立地为C1-C6烷基；所述的R3和R6分别独立地为卤素；D优选为
Figure FDA0002818489270000042
所述的m为7～8，
所述的R1为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基、被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基、或、C1～C6烷基；
所述的L1独立地为缬氨酸残基和/或丙氨酸残基；
方案三：
所述的Ab为HER3抗体或HER3抗体的变体，所述的HER3抗体的变体中轻链的氨基酸序列优选如序列表SEQ ID NO:1所示；所述的HER3抗体的变体中重链的氨基酸序列为如序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中具有E233P、L234V、L234F、L235A、L235E或P331S中的一个或多个位点突变，例如具有E233P、L234V和L235A的位点突变、或、具有L234F、L235E和P331S的位点突变；
所述的D为
Figure FDA0002818489270000051
所述的R1为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基、被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基、或、C1～C6烷基；
方案四：
所述的Ab为HER3抗体或HER3抗体的变体，所述的HER3抗体的变体中轻链的氨基酸序列优选如序列表SEQ ID NO:1所示；所述的HER3抗体的变体中重链的氨基酸序列为如序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中具有E233P、L234V、L234F、L235A、L235E或P331S中的一个或多个位点突变，例如具有E233P、L234V和L235A的位点突变、或、具有L234F、L235E和P331S的位点突变；
所述的D为
Figure FDA0002818489270000052
所述的m为7～8，
所述的R1为被一个或多个-NR1-1R1-2取代的C1～C6烷基、被一个或多个R1-3S(O)2-取代的C1～C6烷基、或、C1～C6烷基；
所述的L1独立地为缬氨酸残基和/或丙氨酸残基。
6.如权利要求1所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的抗体偶联药物为如下所示的任一化合物：
Figure FDA0002818489270000053
Figure FDA0002818489270000061
Figure FDA0002818489270000071
其中，Ab为HER3抗体或HER3抗体的变体，m为7.49、7.56、7.59、7.60、7.63、7.65、7.67、7.72、7.78、7.81或7.83；所述的HER3抗体的变体中轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，重链优选为选自如序列表SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
7.如权利要求6所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的抗体偶联药物为以下任一方案：
方案A：
Figure FDA0002818489270000081
Figure FDA0002818489270000091
Figure FDA0002818489270000101
Figure FDA0002818489270000111
其中，Ab为HER3抗体或HER3抗体的变体；所述的HER3抗体的变体中轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，重链优选为选自如序列表SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
方案B：
Figure FDA0002818489270000112
Figure FDA0002818489270000121
其中，Ab为HER3抗体或HER3抗体的变体；m为7.56、7.59、7.63、7.67、7.72、7.81或7.83；所述的HER3抗体的变体中轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，重链优选为选自如序列表SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
方案C：
Figure FDA0002818489270000122
Figure FDA0002818489270000131
其中，Ab为HER3抗体或HER3抗体的变体；所述的HER3抗体的变体中轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，重链优选为选自如序列表SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的抗体偶联药物为以下任一化合物：
Figure FDA0002818489270000141
Ab为HER3抗体，m优选为7.56；
Figure FDA0002818489270000142
Ab为HER3抗体的变体；所述的HER3抗体的变体轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的重链，m优选为7.67；
Figure FDA0002818489270000143
Ab为HER3抗体的变体；所述的HER3抗体的变体轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链，m优选为7.72；
Figure FDA0002818489270000144
Ab为HER3抗体，m优选为7.63；
Figure FDA0002818489270000151
Ab为HER3抗体的变体；所述的HER3抗体的变体轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的重链，m优选为7.59；
Figure FDA0002818489270000152
Ab为HER3抗体的变体；所述的HER3抗体的变体轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链，m优选为7.67；
Figure FDA0002818489270000153
Ab为HER3抗体，m优选为7.81；
Figure FDA0002818489270000154
Ab为HER3抗体的变体；所述的HER3抗体的变体轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的重链，m优选为7.63；
Figure FDA0002818489270000155
Ab为HER3抗体的变体；所述的HER3抗体的变体轻链优选为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链，重链优选为如序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链，m优选为7.82；
Figure FDA0002818489270000161
Ab为HER3抗体，m优选为7.56；
Figure FDA0002818489270000162
Ab为HER3抗体，m优选为7.83；
Figure FDA0002818489270000163
Ab为HER3抗体，m优选为7.49；
Figure FDA0002818489270000164
Ab为HER3抗体，m优选为7.60；
Figure FDA0002818489270000165
Ab为HER3抗体，m优选为7.78；
Figure FDA0002818489270000171
Ab为HER3抗体，m优选为7.65；
Figure FDA0002818489270000172
Ab为HER3抗体m优选为7.83；或
Figure FDA0002818489270000173
Ab为HER3抗体，m优选为7.82。
9.一种抗体，所述的抗体中轻链的氨基酸序列优选如序列表SEQ ID NO:1所示；所述的抗体中重链的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
10.一种如权利要求1～8中任一项所述的抗体药物偶联物的制备方法，其包括以下步骤：将如式II所示的化合物与Ab-氢进行如下所示的偶联反应即可；
Figure FDA0002818489270000174
11.一种药物组合物，其包括物质X和药用辅料，所述的物质X为如权利要求1～8中任一项所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐。
12.一种物质X或如权利要求11所述的药物组合物在制备HER3蛋白抑制剂中的应用，所述的物质X为如权利要求1～8中任一项所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐。
13.一种物质X或如权利要求11所述的药物组合物制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用，所述的物质X为如权利要求1～8中任一项所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，所述的肿瘤优选HER3阳性肿瘤；所述的HER3阳性肿瘤优选肺癌、卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌和胃癌中的一种或多种；前列腺癌细胞优选为22Rv1细胞和/或LNCaP细胞；结直肠癌细胞优选为SW620细胞；肺癌细胞优选为NCI-H820细胞和或HCC827细胞；卵巢癌细胞优选为OVCAR-8细胞；乳腺癌细胞优选为SK-BR-3细胞。
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