CN117805395A - 一种比较抗体偶联药物和抗体的亲和力的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种比较抗体偶联药物和抗体的亲和力的方法及其应用。所述方法包括：利用生物素标记抗体，得到生物素标记的抗体；取所述生物素标记的抗体分别与所述抗体和含有所述抗体的抗体偶联药物进行竞争ELISA实验，获取吸光值；以浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，拟合构建曲线，得到抗体剂量效应曲线和抗体偶联药物剂量效应曲线，通过比较抗体和抗体偶联药物的半效浓度来比较抗体和抗体偶联药物的亲和力的差异。本发明基于竞争ELISA法有效考察偶联对抗体偶联药物中的抗体亲和力影响，避免常规ELISA方法中酶标二抗受到偶联影响的不足，具备操作简单快速、成本低廉、可以同时检测大量样品，对技术条件和仪器要求较低等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种比较抗体偶联药物和抗体的亲和力的方法及其应用。
背景技术
ADC药物全称为抗体偶联药物(Antibody-drug conjugate,ADC)，是将抗体通过连接子(Linker)与小分子药物(Payload)共价连接的复合物，是一种新兴的靶向治疗手段，在肿瘤治疗领域展现出了优秀的疗效和潜力，成为了药物研发领域的新热点。目前全球已有16款ADC药物获批上市，处于临床研究阶段的ADC候选药物分子超过140个。
大部分的ADC药物由靶向细胞表面受体的抗体、高活性的细胞毒素小分子和连接子3个部分组成。其中，抗体部分负责将ADC药物分子精准运送至靶细胞表面，连接子负责在靶细胞内或表面释放毒素小分子，而高活性的细胞毒素小分子则高效地杀伤肿瘤细胞。理想的ADC药物在血液循环中准确地达到治疗靶点，并最终在靶点(如癌细胞)附近释放细胞毒性药物起到杀伤癌细胞的作用。因此偶联对ADC药物中的抗体亲和力影响有多大，是ADC药物能否起效的重要指标。
目前，针对ADC药物的抗体亲和力测定方法，主要包括酶联免疫吸附试验法(ELISA)、流式细胞仪法、表面等离子共振效价测定法(Surface plasmon resonance,SPR)、生物膜干涉技术(Bio-Layer Interferometry,BLI)等。其中SPR和BLI是最常用最可靠的方法，但均存在试验操作复杂，需要特定的专业技能和仪器设备，价格昂贵等缺点，不易广泛普及。而酶联免疫吸附试验(ELISA)的操作简单快速、成本低廉、可以同时检测大量样品，对技术条件和仪器要求较低。常规的ELISA方法多采用间接法测定ADC亲和力。间接法ELISA需要包被抗原，再孵育ADC药物和抗体，最后孵育anti-IgG/Fc的酶标二抗显色。由于ADC药物中的小分子在抗体上的偶联，可能影响抗体与酶标二抗之间的亲和结合，造成显色结果的差异，从而对抗原-待测物亲和力测定的结果造成干扰，进而存在测定结果不准确的不足。
综上所述，开发能够快速、准确检测ADC药物偶联前后抗体亲和力变化的方法，对于ADC药物研究领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种比较抗体偶联药物和抗体的亲和力的方法及其应用，基于竞争ELISA法有效考察偶联对ADC药物中的抗体亲和力影响。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种比较抗体偶联药物和抗体的亲和力的方法，所述方法包括：
利用生物素标记抗体，得到生物素标记的抗体；
取所述生物素标记的抗体分别与梯度浓度的所述抗体，得到抗体混合液；取所述生物素标记的抗体分别与梯度浓度的含有所述抗体的抗体偶联药物混合，得到抗体偶联药物混合液，分别取所述抗体混合液和抗体偶联药物混合液进行竞争ELISA实验，获取吸光值；
分别以所述抗体或抗体偶联药物的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，拟合构建曲线，得到抗体剂量效应曲线和抗体偶联药物剂量效应曲线，计算出抗体和抗体偶联药物的半效浓度，通过比较抗体和抗体偶联药物的半效浓度来比较抗体和抗体偶联药物的亲和力的差异。
本发明中设计全新的策略，基于竞争ELISA法有效考察偶联对ADC药物中的抗体亲和力影响，有效比较偶联前后抗体的亲和力，而且避免了常规ELISA方法中酶标二抗受到偶联影响的不足，且避免使用SPR和BLI，具有操作简单快速、成本低廉、可以同时检测大量样品，对技术条件和仪器要求较低等优点。具体地，检测原理示意图如图1所示，将生物素标记的抗体分别与抗体或抗体偶联药物混合，进行ELISA实验，抗体或抗体偶联药物会与生物素标记的抗体竞争结合抗原，而随着抗体或抗体偶联药物浓度的增加，生物素标记的抗体的结合会越来越少，通过检测吸光值，拟合出剂量效应曲线，计算抗体和抗体偶联药物的半效浓度IC50，亲和力越高竞争结合能力越强，则IC50越低，因此，可通过比较IC50差异，考察偶联对ADC药物中的抗体亲和力的影响。
可以理解，本发明基于抗原抗体结合以及竞争ELISA，能够针对任意的抗体及其抗体偶联药物进行考察。
优选地，所述标记具体包括：
将抗体与缓冲液混合，得到抗体溶液，将生物素与溶剂混合，得到生物素溶液，将所述抗体溶液与生物素溶液混合并孵育，得到所述生物素标记的抗体。
优选地，所述抗体溶液中抗体的浓度为7～9mg/mL，包括但不限于7.2mg/mL、7.4mg/mL、7.5mg/mL、7.8mg/mL、8mg/mL、8.2mg/mL、8.5mg/mL、8.8mg/mL或8.9mg/mL。
优选地，所述生物素溶液中生物素的浓度为9～11mM，包括但不限于9.2mM、9.4mM、9.6mM、9.8mM、10mM、10.2mM、10.4mM、10.6mM、10.8mM或10.9mM。
优选地，所述抗体和所述生物素的摩尔比为1:(7～9)，包括但不限于1:7.2、1:7.4、1:7.6、1:7.8、1:8、1:8.2、1:8.4、1:8.6或1:8.8。
优选地，所述缓冲液包括磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
优选地，所述溶剂包括二甲基乙酰胺。
优选地，所述孵育的温度为20～30℃，包括但不限于21、22、23、24、25、26、27、28或29，时间为1～5h，包括但不限于2h、2.5h、3h、3.5h或4.5h。
优选地，所述竞争ELISA实验具体包括：
将抗原包被在ELISA板上，依次进行洗板、封闭和洗板处理，分别取所述抗体混合液和抗体偶联药物混合液，加入到ELISA板中，进行孵育，依次进行洗板、加入链霉素亲和素-HRP(SA-HRP)、洗板和加入酶底物、显色和加入终止液的步骤，在酶标仪上读取450nm处的吸光值。
优选地，竞争ELISA实验中所述孵育温度为4～37℃，包括但不限于5℃、6℃、7℃、8℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、32℃、34℃、35℃或36℃；时间为1～120min，包括但不限于2min、5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min、105min、110min、115min、118min或119min。
优选地，所述包被使用的缓冲液包碳酸盐缓冲液。
优选地，所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L～0.08mol/L，包括但不限于0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L、0.06mol/L或0.07mol/L。
优选地，所述洗板使用的洗涤液包括PBST和/或PBS。
优选地，所述封闭使用的封闭液包括牛血清白蛋白或脱脂牛奶。
优选地，所述封闭液的浓度为1％～10％，包括但不限于2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％或9％等。
优选地，所述链霉素亲和素-HRP的浓度为0.1μg/mL～10μg/mL，包括但不限于0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.5μg/mL、0.8μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL或9.5μg/mL。
优选地，所述酶底物包括TMB，浓度为1mg/mL～3mg/mL，包括但不限于1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL、2mg/mL、2.2mg/mL、2.5mg/mL、2.8mg/mL或2.9mg/mL。
优选地，所述终止液包括硫酸和/或盐酸，浓度为1mol/L～3mol/L，包括但不限于1.2mol/L、1.4mol/L、1.6mol/L、1.8mol/L、2mol/L、2.2mol/L、2.5mol/L、2.8mol/L或2.9mol/L。
优选地，所述显色的时间为5～15min，包括但不限于6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min或14min等。
优选地，所述拟合构建曲线使用的软件包括SPSS、Matlab、Origin或GraphpadPrism中任意一种。
优选地，所述拟合构建曲线使用Graphpad Prism中[Inhibitor]vs.response--Variable slope方程拟合，曲线公式为Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+((IC50/X)^HillSlope)，拟合出效应曲线的四个参数Top，Bottom，IC50和HillSlope。
作为优选的技术方案，所述比较抗体偶联药物和抗体的亲和力的方法包括以下步骤：
(1)将抗体与缓冲液混合，得到抗体溶液，将生物素与溶剂混合，得到生物素溶液，将所述抗体溶液与生物素溶液混合并孵育，得到所述生物素标记的抗体；
(2)取所述生物素标记的抗体分别与梯度浓度的所述抗体，得到抗体混合液；取所述生物素标记的抗体分别与梯度浓度的含有所述抗体的抗体偶联药物混合，得到抗体偶联药物混合液，将抗原包被在ELISA板上，依次进行洗板、封闭和洗板处理，分别取所述抗体混合液和抗体偶联药物混合液，加入到ELISA板中，进行孵育，依次进行洗板、加入链霉素亲和素-HRP、洗板、加入酶底物、显色和加入终止液的步骤，在酶标仪上读取450nm处的吸光值；
(3)分别以所述抗体或抗体偶联药物的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，使用Graphpad Prism中[Inhibitor]vs.response--Variable slope方程拟合，曲线公式为Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+((IC50/X)^HillSlope)，拟合出效应曲线的四个参数Top，Bottom，IC50和HillSlope，得到抗体和抗体偶联药物的半效浓度IC50，通过比较抗体和抗体偶联药物的半效浓度来比较抗体和抗体偶联药物的亲和力的差异。
第二方面，本发明提供第一方面所述的比较抗体偶联药物和抗体的亲和力的方法在评估和/或筛选抗体偶联药物中的应用。
第三方面，本发明提供一种评估和/或筛选抗体偶联药物的方法，所述方法包括；用第一方面所述的比较抗体偶联药物和抗体的亲和力的方法评估抗体被制备成抗体偶联药物前后亲和力的变化，筛选亲和力降低最小的抗体偶联药物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明中设计全新的策略，基于竞争ELISA法有效考察偶联对ADC药物中的抗体亲和力影响，有效比较偶联前后抗体的亲和力，而且避免了常规ELISA方法中酶标二抗受到偶联影响的不足，且避免使用SPR和BLI，具有操作简单快速、成本低廉、可以同时检测大量样品，对技术条件和仪器要求较低等优点。
附图说明
图1为本发明检测原理示意图；
图2为实施例1曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-DM4偶联药物的亲和力结果图；
图3为实施例2曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-MMAE偶联药物的亲和力结果图；
图4为实施例3曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-SN38偶联药物的亲和力结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例比较曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-DM4偶联药物的亲和力。
1.生物素标记抗体
将曲妥珠单抗(Trastuzumab，Roche,Trastuzumab)换液到PBS缓冲液(buffer)中，并稀释到8mg/mL。取少量用DMA溶解成10mM的Biotin-PEG4-NHS(Thermofisher,A39259)，与1mL抗体混匀，混合摩尔比例为：生物素:抗体＝8:1。22℃旋转孵育3h。用超滤管将反应液换液成PBS，pH 7.2，重新对标记抗体的浓度进行测定。最后分装避光-80℃保存。
2.竞争性结合实验
(1)将Her2抗原用包被缓冲液包被在酶标孔板上。包被缓冲液为0.05MpH 9.6的碳酸盐缓冲液，即1升溶液中含1.59gNa2CO3，2.93g NaHCO3，包被量为每孔1μg；37℃包被1h。
(2)洗涤液(PBS)洗板5次，甩干，每孔加100μL封闭液。封闭液为牛血清白蛋白(BSA)，浓度是10％；37℃封闭1h。
(3)用含有1％BSA且浓度为50ng/mL的生物素化抗体溶液分别与曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-DM4(T-DM4，参照Ado-trastuzumab Emtansine(T-DM1):AnAntibody-DrugConjugate(ADC)forHER2-Positive Breast Cancer文献(J.Med.Chem.2014,57,16,6949–6964，发表时间：June 26,2014，作者：JohnM.Lambert和Ravi V.J.Chari)中的第3页第2段中的工艺进行制备得到)配置待测样品的浓度梯度，设置8个浓度点，最高浓度点的浓度为1mg/mL，分别稀释6倍，36倍，216倍，1296倍，7776倍，46656倍，279936倍，1679616倍。
(4)吸去步骤(2)中的孔板液体，洗涤液洗板5次，甩干，每孔加100μL步骤(3)制备得到的浓度梯度，每个浓度点3个复孔，37℃孵育1h；
(5)洗涤液洗板5次，甩干，每孔加100μL 1/5000稀释的SA-HRP，22℃孵育1h；
(6)洗涤液洗板5次，甩干，每孔加100μL酶底物(TMB，1mg/mL)，避光显色10min，每孔加入100μL终止液(H2SO4，1mol/L)，利用酶标仪在450nm测定吸收值。
3.以抗体或ADC药物浓度为横坐标，以450nm吸光值为纵坐标，利用统计软件GraphPad Prism 6用选用[Inhibitor]vs.response--Variable slope方程拟合步骤(6)的实验数据，得到剂量效应曲线及曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-DM4亲和力(IC50)结果，如图2所示，进而比较两者的亲和力差异。
实施例2
本实施例比较曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-MMAE偶联药物的亲和力。
1.生物素标记抗体
将曲妥珠单抗换液到PBS缓冲液(buffer)中，并稀释到8mg/mL。取少量用DMA溶解成10mM的Biotin-PEG4-NHS，与1mL抗体混匀，混合摩尔比例为：生物素:抗体＝8:1。22℃旋转孵育3h。用超滤管将反应液换液成PBS，pH7.2，重新对标记抗体的浓度进行测定。最后分装避光-80℃保存。
2.竞争性结合实验
(1)将Her2抗原用包被缓冲液包被在酶标孔板上。包被缓冲液为0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液，即1升溶液中含1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3，包被量为每孔1μg；4℃包被18h。
(2)洗涤液(PBST)洗板5次，甩干，每孔加100μL封闭液。封闭液为脱脂牛奶，浓度是10％；37℃封闭1h。
(3)用含有1％BSA且浓度为50ng/mL的生物素化抗体溶液分别与曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-MMAE(T-MMAE，参照Development and biological assessment ofMMAE-trastuzumab antibody–drug conjugates(ADCs)文献(Breast Cancer.2021Jan；28(1):216-225，发表时间：2020Sep 5，作者：SajadYaghoubi,Tohid Gharibi,Mohammad HosseinKarimi,Muhammad Sadeqi Nezhad,Alexander Seifalian,Reza Tavakkol,NaderBagheri,Asiyeh Dezhkam,Meghdad Abdollahpour-Alitappeh)中的第3页第1段中的工艺进行制备得到)配置待测样品的浓度梯度，设置8个浓度点。最高浓度点的浓度为1mg/mL，分别稀释6倍，36倍，216倍，1296倍，7776倍，46656倍，279936倍，1679616倍。
(4)吸去步骤(2)中的孔板液体，洗涤液洗板5次，甩干，每孔加100μL步骤(3)制备得到的浓度梯度，每个浓度点3个复孔，37℃孵育1h；
(5)洗涤液洗板5次，甩干，每孔加100μL 1/5000稀释的SA-HRP，22℃孵育1h；
(6)洗涤液洗板5次，甩干，每孔加100μL酶底物(TMB，2mg/mL)，避光显色5min，每孔加入100μL终止液(H2SO4，2mol/L)。利用酶标仪在450nm测定吸收值。
3.以抗体或ADC药物浓度为横坐标，以450nm吸光值为纵坐标，利用统计软件GraphPad Prism 6用选用[Inhibitor]vs.response--Variable slope方程拟合步骤(6)的实验数据，得到剂量效应曲线及曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-MMAE亲和力(IC50)结果，结果如图3所示，进而比较两者的亲和力差异。
实施例3
本实施例比较曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-SN38偶联药物的亲和力。
1.生物素标记抗体
将曲妥珠单抗换液到PBS缓冲液(buffer)中，并稀释到8mg/mL。取少量用DMA溶解成10mM的Biotin-PEG4-NHS，与1mL抗体混匀，混合摩尔比例为：生物素:抗体＝8:1。22℃旋转孵育3h。用超滤管将反应液换液成PBS，pH7.2，重新对标记抗体的浓度进行测定。最后分装避光-80℃保存。
2.竞争性结合实验
(1)将Her2抗原用包被缓冲液包被在酶标孔板上。包被缓冲液为0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液，即1升溶液中含1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3，包被量为每孔1μg；37℃包被1h。
(2)洗涤液(PBS)洗板5次，甩干，每孔加100μL封闭液。封闭液为BSA，浓度是5％；37℃封闭1h。
(3)用含有1％BSA且浓度为50ng/mL的生物素化抗体溶液分别与曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-SN38(T-SN38，参照Synthesis,characterization and targetingchemotherapy for ovarian cancer oftrastuzumab-SN-38conjugates文献(J ControlRelease.2015Dec 28；220(PtA):5-17.，发表时间：2015Oct 9，作者：YuqinYao,Lin Yu,Xiaolan Su,Yuxi Wang,Wenting Li,Yangpin Wu,Xiangzheng Cheng,Hang Zhang,XianWei,Hao Chen,Rundong Zhang,Lantu Gou,Xiaoxin Chen,Yongmei Xie,Bo Zhang,Yonghui Zhang,JinliangYang,Yuquan Wei)中的第4页第2段中的工艺进行制备得到)配置待测样品的浓度梯度，设置8个浓度点。最高浓度点的浓度为1mg/mL，分别稀释6倍，36倍，216倍，1296倍，7776倍，46656倍，279936倍，1679616倍。
(4)吸去步骤(2)中的孔板液体，洗涤液洗板5次，甩干，每孔加100μL步骤(3)制备得到的浓度梯度，每个浓度点3个复孔，37℃孵育1h；
(5)洗涤液洗板5次，甩干，每孔加100μL 1/5000稀释的SA-HRP，22℃孵育1h；
(6)洗涤液洗板5次，甩干，每孔加100μL酶底物(TMB，3mg/mL)，避光显色15min，每孔加入100μL终止液(H2SO4，3mol/L)。利用酶标仪在450nm测定吸收值。
3.以抗体或ADC药物浓度为横坐标，以450nm吸光值为纵坐标，利用统计软件GraphPad Prism 6用选用[Inhibitor]vs.response--Variable slope方程拟合步骤(6)的实验数据，得到剂量效应曲线及曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-SN38亲和力(IC50)结果，结果如图4所示，进而比较两者的差异。
综上所述，本发明设计全新的策略，基于竞争ELISA法有效考察偶联对ADC药物中的抗体亲和力影响，有效比较偶联前后抗体的亲和力，而且避免了常规ELISA方法中酶标二抗受到偶联影响的不足，且避免使用SPR和BLI，具有操作简单快速、成本低廉、可以同时检测大量样品，对技术条件和仪器要求较低等优点。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种比较抗体偶联药物和抗体的亲和力的方法，其特征在于，所述方法包括：
利用生物素标记抗体，得到生物素标记的抗体；
取所述生物素标记的抗体分别与梯度浓度的所述抗体，得到抗体混合液；取所述生物素标记的抗体分别与梯度浓度的含有所述抗体的抗体偶联药物混合，得到抗体偶联药物混合液，分别取所述抗体混合液和抗体偶联药物混合液进行竞争ELISA实验，获取吸光值；
分别以所述抗体或抗体偶联药物的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，拟合构建曲线，得到抗体剂量效应曲线和抗体偶联药物剂量效应曲线，计算出抗体和抗体偶联药物的半效浓度，通过比较抗体和抗体偶联药物的半效浓度来比较抗体和抗体偶联药物的亲和力的差异。
2.根据权利要求1所述的比较抗体偶联药物和抗体的亲和力的方法，其特征在于，所述标记具体包括：
将抗体与缓冲液混合，得到抗体溶液，将生物素与溶剂混合，得到生物素溶液，将所述抗体溶液与生物素溶液混合并孵育，得到所述生物素标记的抗体。
3.根据权利要求2所述的比较抗体偶联药物和抗体的亲和力的方法，其特征在于，所述抗体溶液中抗体的浓度为7～9mg/mL；
优选地，所述生物素溶液中生物素的浓度为9～11mM；
优选地，所述抗体和所述生物素的摩尔比为1:(7～9)。
4.根据权利要求2或3所述的比较抗体偶联药物和抗体的亲和力的方法，其特征在于，所述缓冲液包括PBS缓冲液；
优选地，所述溶剂包括二甲基乙酰胺；
优选地，所述孵育的温度为20～30℃，时间为1～5h。
5.根据权利要求1-4任一项所述的比较抗体偶联药物和抗体的亲和力的方法，其特征在于，所述竞争ELISA实验具体包括：
将抗原包被在ELISA板上，依次进行洗板、封闭和洗板处理，分别取所述抗体混合液和抗体偶联药物混合液，加入到ELISA板中，进行孵育，依次进行洗板、加入链霉素亲和素-HRP、洗板、加入酶底物、显色和加入终止液的步骤，在酶标仪上读取450nm处的吸光值。
6.根据权利要求5所述的比较抗体偶联药物和抗体的亲和力的方法，其特征在于，所述包被使用的缓冲液包碳酸盐缓冲液；
优选地，所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L～0.08mol/L；
优选地，所述洗板使用的洗涤液包括PBST和/或PBS；
优选地，所述封闭使用的封闭液包括牛血清白蛋白或脱脂牛奶；
优选地，所述封闭液的浓度为1％～10％；
优选地，所述孵育的温度为4～37℃，时间为1～120min；
优选地，所述链霉素亲和素-HRP的浓度为0.1μg/mL～10μg/mL；
优选地，所述酶底物包括TMB，浓度为1mg/mL～3mg/mL；
优选地，所述终止液包括硫酸和/或盐酸，浓度为1mol/L～3mol/L；
优选地，所述显色的时间为5～15min。
7.根据权利要求1-6任一项所述的比较抗体偶联药物和抗体的亲和力的方法，其特征在于，所述拟合构建曲线使用的软件包括SPSS、Matlab、Origin或Graphpad Prism中任意一种；
优选地，所述拟合构建曲线使用Graphpad Prism中[Inhibitor]vs.response--Variable slope方程拟合，曲线公式为Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+((IC50/X)^HillSlope)，拟合出效应曲线的四个参数Top，Bottom，IC50和HillSlope。
8.根据权利要求1-7任一项所述的比较抗体偶联药物和抗体的亲和力的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将抗体与缓冲液混合，得到抗体溶液，将生物素与溶剂混合，得到生物素溶液，将所述抗体溶液与生物素溶液混合并孵育，得到所述生物素标记的抗体；
(2)取所述生物素标记的抗体分别与梯度浓度的所述抗体，得到抗体混合液；取所述生物素标记的抗体分别与梯度浓度的含有所述抗体的抗体偶联药物混合，得到抗体偶联药物混合液，将抗原包被在ELISA板上，依次进行洗板、封闭和洗板处理，分别取所述抗体混合液和抗体偶联药物混合液，加入到ELISA板中，进行孵育，依次进行洗板、加入链霉素亲和素-HRP、洗板、加入酶底物、显色和加入终止液的步骤，在酶标仪上读取450nm处的吸光值；
(3)分别以所述抗体或抗体偶联药物的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，使用Graphpad Prism中[Inhibitor]vs.response--Variable slope方程拟合，曲线公式为Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+((IC50/X)^HillSlope)，拟合出效应曲线的四个参数Top，Bottom，IC50和HillSlope，得到抗体和抗体偶联药物的半效浓度IC50，通过比较抗体和抗体偶联药物的半效浓度来比较抗体和抗体偶联药物的亲和力的差异。
9.权利要求1-8任一项所述的比较抗体偶联药物和抗体的亲和力的方法在评估和/或筛选抗体偶联药物中的应用。
10.一种评估和/或筛选抗体偶联药物的方法，其特征在于，所述方法包括；用权利要求1-8任一项所述的比较抗体偶联药物和抗体的亲和力的方法评估抗体被制备成抗体偶联药物前后亲和力的变化，筛选亲和力降低最小的抗体偶联药物。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120171120A1 (en) * | 2010-11-30 | 2012-07-05 | Genentech, Inc. | Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor |
| US20170219582A1 (en) * | 2014-07-31 | 2017-08-03 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Antibodies With High Affinity For Alpha-Klotho |
| CA3145278A1 (en) * | 2019-07-26 | 2021-02-04 | Vanderbilt University | Human monoclonal antibodies to enterovirus d68 |
| CN114601933A (zh) * | 2020-12-04 | 2022-06-10 | 上海复旦张江生物医药股份有限公司 | 抗体药物偶联物、其中间体、制备方法及应用 |
| CN115677857A (zh) * | 2021-07-28 | 2023-02-03 | 上海复旦张江生物医药股份有限公司 | 一种Dxd抗体或其抗原结合片段及其应用 |
| CN117110612A (zh) * | 2022-05-17 | 2023-11-24 | 天士力生物医药股份有限公司 | 一种抗体亲和力高通量筛选方法 |
-
2023
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120171120A1 (en) * | 2010-11-30 | 2012-07-05 | Genentech, Inc. | Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor |
| US20170219582A1 (en) * | 2014-07-31 | 2017-08-03 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Antibodies With High Affinity For Alpha-Klotho |
| CA3145278A1 (en) * | 2019-07-26 | 2021-02-04 | Vanderbilt University | Human monoclonal antibodies to enterovirus d68 |
| CN114601933A (zh) * | 2020-12-04 | 2022-06-10 | 上海复旦张江生物医药股份有限公司 | 抗体药物偶联物、其中间体、制备方法及应用 |
| CN115677857A (zh) * | 2021-07-28 | 2023-02-03 | 上海复旦张江生物医药股份有限公司 | 一种Dxd抗体或其抗原结合片段及其应用 |
| CN117110612A (zh) * | 2022-05-17 | 2023-11-24 | 天士力生物医药股份有限公司 | 一种抗体亲和力高通量筛选方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 王亚聪: "C-糖苷NKT细胞激动剂的合成和免疫活性研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑, no. 02, 15 February 2022 (2022-02-15), pages 54 * |
| 王兰等: "抗体偶联药物质量控制和临床前评价专家共识", 中国药事, vol. 32, no. 07, 20 July 2018 (2018-07-20), pages 999 * |
| 王清印: "《中国海水养殖科技进展 2014》", 31 October 2015, 海洋出版社, pages: 447 - 448 * |
| 许绍芬: "《神经生物学》", vol. 2, 29 February 2004, 复旦大学出版社, pages: 271 - 272 * |
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